CN102559539A - 嗜酸乳杆菌及其应用与饲料添加剂和预混料 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,涉及一株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)及其应用与其饲料添加剂和预混料。本发明的嗜酸乳杆菌抗逆性强,可以耐受人工胃液,人工胆盐,因此在经过动物胃肠道环境后,能够保证大量活菌可以顺利进入动物的肠道,在肠道中发挥益生功能,提高动物免疫力,降低养殖成本。本发明的嗜酸乳杆菌经过培养和高密度发酵及添加的保护剂等,得到的产品嗜酸乳杆菌活菌含量高,可作为生物饲料添加剂添加到养殖动物的饮水或者饲料中,可制备成预混料等饲料,减少抗生素的添加,真正改善动物肠道健康,提升动物免疫力,增加动物的生产性能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)及其应用与其饲料添加剂和预混料。
背景技术
在动物的肠道内栖息着各种细菌,根据与宿主的作用关系可分为有益菌、中性菌和致病菌。在健康动物的肠道内,各种菌群维持一个相对稳定的状态,但是当某些环境改变时,肠道内的致病菌会大量繁殖并同时产生细菌毒素,引起动物疾病,如细菌性痢疾等。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)是动物肠道的常驻菌群之一,其能够在胃液中存在并分泌乳酸、乙酸等促进胃部的消化能力;另外,嗜酸乳杆菌能够调整肠道菌群平衡,抑制肠道不良微生物的增殖,嗜酸乳杆菌能分泌抗生物素类物质(嗜酸乳菌素(acidolin)、嗜酸杆菌素(acidophilin)、乳酸菌素(laetocidon)),对肠道致病菌产生拮抗作用。但由于目前动物饲养过程中长期、大量使用抗生素,使致病菌耐药性增强、动物肠道菌群失调、免疫力下降。
发明内容
本发明的目的在于提供一株抗逆性强、产酸能力强、益生功能优秀的益生菌---嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),此菌具有良好的产酸功能和益生功能:耐人工胃酸、耐胆汁液、对大肠杆菌K88、痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌有较强抑制作用。
本发明的另一目的在于提供该菌在制备禽畜或水产养殖饲料添加剂中的应用。
本发明还提供了包含该嗜酸乳杆菌的饲料添加剂和其预混料。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
本发明提供一株新的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),其保藏编号为CGMCCNo.5093。
进一步,该菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID No:1所示。
本发明的嗜酸乳杆菌可用于制备禽畜或水产养殖的饲料添加剂。
本发明还提供了包含所述的嗜酸乳杆菌的饲料添加剂,其特征在于饲料添加剂中嗜酸乳 杆菌的活菌数为109-1010cfu/g。
其中,本发明的饲料添加剂中的嗜酸乳杆菌为经如下工艺制备而成:(1)高密度发酵培养,培养条件为:35-40℃、罐压为0.03-0.05Mpa,搅拌转速为60-100rpm,每30-60分钟搅拌一次,每次搅拌时间为10-20分钟,得嗜酸乳杆菌发酵液;所用的发酵培养基的成分及质量体积比为:蔗糖1-2%,大豆蛋白胨1-2%,酵母膏1-2%,硫酸铵0.5-1.0%,磷酸二氢钾0.2-0.5%、柠檬酸钠0.2-0.8%,硫酸镁0.01-0.05%;(2)将得到的嗜酸乳杆菌发酵液3500-5000rpm离心,得到菌泥,加入与菌泥的重量体积比为15-20%的冻干保护剂,混匀,于-25℃--45℃冷冻干燥,至水分含量小于5%;所述的冻干保护剂的组成成分及质量体积比为:脱脂牛奶5-10%、麦芽糊精5-15%、海藻糖5-15%、维生素C 0.5-2.5%谷氨酸钠0.5-2.5%、硫酸锰0.4-1%、甘油2-5%。
进一步,嗜酸乳杆菌高密度发酵的培养条件为37℃、罐压为0.05Mpa,搅拌转速为60rpm,每45分钟搅拌一次,每次搅拌时间为15分钟;所用的发酵培养基的成分及质量体积比为:蔗糖2%,大豆蛋白胨1.5%,酵母膏1.5%,硫酸铵0.8%,磷酸二氢钾0.4%,柠檬酸钠0.6%,硫酸镁0.01-0.05%;所述的冻干保护剂的组成成分及质量体积比为:脱脂牛奶8%、麦芽糊精8%、海藻糖10%、维生素C 0.8%、谷氨酸钠2%、硫酸锰0.8%、甘油2%。
本发明也提供了包含所述的嗜酸乳杆菌的饲料添加剂的预混料,其特征在于预混料中饲料添加剂的添加质量体积比为0.5-10‰,预混料中嗜酸乳杆菌的活菌数为106-108cfu/g。
本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为申请人从猪粪便中分离得到,其生物学特征如下:菌落圆整,表面光滑,不透明,乳白色,边缘光滑,革兰氏阳性菌;单个菌体为杆状。本发明的嗜酸乳杆菌经过人工胃液、胆汁液及抗逆性的筛选;可以耐受pH2.0,1%胃蛋白酶的人工胃液,可以耐受0.3%的人工胆汁液,也可以抑制致病性大肠杆菌K88,痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌,具有较强的产酸和抑菌能力。本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)申请人已于2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.5093。
有益效果
(1)本发明的嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093的抗逆性强,可以耐受人工胃液,人工胆盐,因此在经过动物胃肠道环境后,能够保证大量活菌可以顺利进入动物的肠道,在肠道中发挥益生功能,提高动物免疫力,降低养殖成本。
(2)本发明的嗜酸乳杆菌可以有效抑制动物肠道内常见致病菌大肠杆菌K88,痢疾杆菌 和金黄色葡萄球菌。
(3)本发明的嗜酸乳杆菌可以大量的产酸,能够降低肠道内的pH抑制有害菌的生长和繁殖,同时也有助于消化。
(4)本发明的嗜酸乳杆菌经过培养和高密度发酵及添加的保护剂等,得到的产品嗜酸乳杆菌活菌含量高,可作为生物饲料添加剂添加到养殖动物的饮水或者饲料中,可制备成预混料等饲料,减少抗生素的添加,真正改善动物肠道健康,提升动物免疫力,增加动物的生产性能。
附图说明
图1:嗜酸乳杆菌抑菌试验结果。
通过下列实施例将更具体的说明本发明,但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明,而不是以任何方式限制本发明的范围。
具体实施方式:
实施例1嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093的筛选与鉴定
1、初筛
取新鲜猪粪便样品各5g,浸泡于20ml无菌0.85%生理盐水中,震荡打散样品,使样品充分与生理盐水接触,将离心后的菌体沉淀加入10ml人工胃液中,37℃静置2h,然后离心,收集菌体后,将菌体沉淀加入10ml人工胆盐中,37℃静置4h,收集菌体,稀释涂布于LB培养基。37℃培养箱培养12-24h后,对菌落进行纯化分离。对得到的菌进行保存,并进一步复筛。
菌落形态:菌落圆整,表面光滑,不透明,乳白色,边缘光滑,革兰氏阳性菌;经革兰氏染色后在显微镜下观察,单个菌体为细长杆状。
生理盐水的配制方法是:0.85%氯化钠溶液,高压灭菌后备用。
2、复筛
将1中挑出来的菌落进行进一步分离纯化,并将活化后菌落分别划线至含有2%CaCO3的MRS固体培养基的平皿上,37℃,恒温培养箱进行培养,24h后,挑取钙圈较大的菌落,进行进一步的保存和鉴定。
3、嗜酸乳杆菌的分子鉴定
利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定:按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上游引物5’-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,见SEQID No.2和下游引物5’-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3,见SEQ ID No.3扩增细菌16s rRNA基因片段。经过测序进一步鉴定该菌为嗜酸乳杆菌,扩增片段的测序结果见SEQ ID No.1。
实施例2嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093的益生功能及抗逆性能实验
利用MRS培养基,对得到的嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093进行了耐酸性、耐胆盐和抑菌活性实验。
(1)嗜酸乳杆菌耐酸性试验
人工胃液的配制:人工胃液的配制方法是:1%胃蛋白酶,0.85%氯化钠,用浓盐酸调pH值到2.0、3.0、4.0,经细菌过滤器过滤除菌后备用;试验结果如表1。
表1嗜酸乳杆菌耐酸性试验结果
(2)嗜酸乳杆菌耐胆汁液试验:人工胆盐的配制方法是:在液体肉汤中分别添加0.1%、0.2%、0.3%的猪胆盐(分析纯),115℃高压灭菌后备用;试验结果如表2。
表2嗜酸乳杆菌耐胆盐性试验结果
(3)抑菌试验:将大肠杆菌K88、痢疾杆菌和金黄葡萄球菌用肉汤液体培养基进行过夜培养,然后利用10级稀释涂布法分别将三种菌在LB固体培养基上进行稀释涂布,而后将浸过嗜酸乳杆菌的发酵培养液的滤纸片,转移到涂布好的平板上培养,37℃恒温培养箱培养24h,测
量抑菌圈直径的大小。结果如表3所示,其中嗜酸乳杆菌抑菌试验结果如图1所示。
表3嗜酸乳杆菌抑菌性试验结果
其中,LB固体培养基的配制方法(g/l):蛋白胨10,酵母膏5,氯化钠10,琼脂1.5,pH7.0,高压灭菌后备用;肉汤培养基的制备方法:(g/l)蛋白胨10.0、氯化钠5.0、葡萄 糖5.0、牛肉浸粉3.0、pH值7.2。
实施例3嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093饲料添加剂的制备
1)平板培养复壮:将嗜酸乳杆菌菌种接种于MRS平板培养基上,于37℃培养24h,使嗜酸乳杆菌复壮,并形成单菌落,挑取单菌落于接种培养基上,37℃培养24h;
2)一级种子的制备:将步骤(1)培养的嗜酸乳杆菌菌种转接装有300mlMRS液态培养基1L摇瓶里,37℃静置培养24h,至对数后期,得一级种子;
3)二级种子的制备:将步骤2)制备的一级种子转接到装有80LMRS种子培养基的100L种子罐中,温度37℃,转60rpm,每45分钟搅拌一次,每次搅拌时间为15分钟,培养20h,得二级种子液。
4)嗜酸乳杆菌发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子液按照1%的接种量接种到0.8m3发酵培养基的发酵罐中,37℃、罐压为0.05Mpa,搅拌转速为60rpm,每45分钟搅拌一次,每次搅拌时间为15分钟。培养20h终止发酵;得到活菌数为3.61×109cfu/ml的嗜酸乳杆菌发酵液。
嗜酸乳杆菌发酵培养基为:蔗糖2%,大豆蛋白胨1.5%,酵母膏1.5%,硫酸铵0.8%,磷酸二氢钾0.4%、柠檬酸钠0.6%,硫酸镁0.03%。
5)嗜酸乳杆菌饲料添加剂的制备:
将步骤4)制备的发酵液,4500rpm离心,得到菌泥,加入冻干保护剂,混匀,于-40℃冷冻干燥,得到水分含量小于4.25%的嗜酸乳杆菌饲料添加剂,添加剂中的活菌数为3.67×1010cfu/g。
其中冻干保护剂加入嗜酸乳杆菌发酵液后,冻干保护剂所占比例31.6%,其中保护剂中各成分所占比例为:脱脂牛奶8%、麦芽糊精8%、海藻糖10%、维生素C 0.8%、谷氨酸钠2%、硫酸锰0.8%、甘油2%。
实施例4嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093饲料添加剂的制备
1)平板培养复壮:将嗜酸乳杆菌菌种接种于MRS平板培养基上,于35℃培养20h,使嗜酸乳杆菌复壮,并形成单菌落,挑取单菌落于接种培养基上,37℃培养20h;
2)一级种子的制备:将步骤(1)培养的嗜酸乳杆菌菌种转接装有200mlMRS液态培养基1L摇瓶里,37℃静置培养20h,至对数后期,得一级种子;
3)二级种子的制备:将步骤2)制备的一级种子转接到装有70LMRS种子培养基的100L种子罐中,温度35℃,转80rpm,每30分钟搅拌一次,每次搅拌时间为10分钟,培养18h,得二级种子液。
4)嗜酸乳杆菌发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子液按照1.5%的接种量接种到0.5m3发酵培养基的发酵罐中,35℃、罐压为0.04Mpa,搅拌转速为80rpm,每30分钟搅拌一次,每次搅拌时间为10分钟。培养18h终止发酵;得到活菌数为2.84×109cfu/ml的嗜酸乳杆菌发酵液。
嗜酸乳杆菌发酵培养基为:蔗糖1.2%,大豆蛋白胨0.8%,酵母膏1%,硫酸铵0.35%,磷酸二氢钾0.3%、柠檬酸钠0.4%,硫酸镁0.02%。
5)嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093饲料添加剂的制备
将步骤4)制备的发酵液,3500rpm离心,得到菌泥,加入冻干保护剂,混匀,于-40℃冷冻干燥,得到水分含量为3.5%的嗜酸乳杆菌菌剂,嗜酸乳杆菌菌剂的活菌数为1.67×1010fu/g。
其中冻干保护剂加入嗜酸乳杆菌发酵液后,冻干保护剂所占比例38.1%,其中保护剂中各成分所占比例为:脱脂牛奶10%、麦芽糊精10%、海藻糖12%、维生素C 1%、谷氨酸钠3%、硫酸锰0.6%、甘油1.5%;
实施例5嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093饲料添加剂的制备
1)平板培养复壮:将嗜酸乳杆菌菌种接种于MRS平板培养基上,于40℃培养24h,使嗜酸乳杆菌复壮,并形成单菌落,挑取单菌落于接种培养基上,40℃培养24h;
2)一级种子的制备:将步骤(1)培养的嗜酸乳杆菌菌种转接装有300mlMRS液态培养基1L摇瓶里,40℃静置培养24h,至对数后期,得一级种子;
3)二级种子的制备:将步骤2)制备的一级种子转接到装有80LMRS种子培养基的100L种子罐中,温度40℃,转100rpm,每60分钟搅拌一次,每次搅拌时间为20分钟,培养16h,得二级种子液。
4)嗜酸乳杆菌发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子液按照2%的接种量接种到0.8m3发酵培养基的发酵罐中,40℃、罐压为0.02Mpa,搅拌转速为100rpm,每60分钟搅拌一次,每次搅拌时间为20分钟。培养16h终止发酵;得到活菌数为1.71×109cfu/ml的嗜酸乳杆菌发酵液。
嗜酸乳杆菌发酵培养基为:蔗糖1.5%,大豆蛋白胨1%,酵母膏1.5%,硫酸铵0.2%,磷酸二氢钾0.5%、柠檬酸钠0.8%,硫酸镁0.05%。
5)嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093饲料添加剂的制备
将步骤4)制备的发酵液,5000rpm离心,得到菌泥,加入冻干保护剂,混匀,于-40℃冷冻干燥,得到水分含量为4.6%的嗜酸乳杆菌菌剂,嗜酸乳杆菌菌剂的活菌数为1.82×1010fu/g。
其中冻干保护剂加入嗜酸乳杆菌发酵液后,冻干保护剂所占比例43.1%,其中保护剂中各 成分所占比例为:脱脂牛奶15%、麦芽糊精15%、海藻糖5%、维生素C 0.5%、谷氨酸钠4%、硫酸锰0.6%、甘油3%。
实施例6实施例3制备的嗜酸乳杆菌发酵液饲喂小鼠试验
选用6-8周龄,体重20g左右的BALB/C纯种雄性小白鼠60只,随机分2组;空白组a和嗜酸乳杆菌对照组b,饲喂方式为自由采食8mm×20mm颗粒饲料,饲料配方及营养含量见表4;饮水方式采用瓶式自动饮水器,自由饮用凉开水。
表4小鼠饲料配方
表5小鼠分组和饲喂情况
饲养室温度为20±2℃,湿度为60%,每日采光时间为14h,白天每隔2h通风一次,夜间隔4h通风一次。用不锈钢食盒及塑料饮水瓶分笼饲养,每笼4-5只,每天早晚各添加饲料一次,实验开始和结束时各称体重一次。试验结束后,对小白鼠进行摘眼球取血,制备血清,测定免疫指标-白细胞介素-2(interleuki-2,IL-2),IL-6,IL-8,肿瘤坏死因子(TNF),IgA,IgG,IgM,补体C3,补体C4;实验结果如表6所示。
表6免疫指标的测量结果
※同行数据角标完全不同表示差异显著,检验误差在0.05水平,括号内标注的为0.01水平。
结果表明:嗜酸乳杆菌发酵液饲喂小鼠能够增强小鼠血液中IgA,IgG,IgM,C3,C4,IL-2,IL-8等的含量(p<0.05),从而说明嗜酸乳杆菌对小鼠免疫功能有提高作用。
实施例7嗜酸乳杆菌对肉鸡免疫力的影响
试验选用肉鸡一日龄600羽,分为3组,每组200只肉鸡,分为4个重复,每个重复50只鸡,喂以3种不同的日粮,A组空白对照组,B组抗生素组,C组为添加嗜酸乳杆菌制剂(选用实施例3得到的饲料添加剂)0.1%组。分别在7日龄和14日龄注射牛血清蛋白抗原,以备检测免疫学指标。试验期7周,3周龄时检测淋巴细胞增殖活力、牛血清白蛋白抗体水平,结果见表7和表8。
表7嗜酸乳杆菌制剂对鸡血淋巴细胞增殖活力(细胞免疫)的影响
表8嗜酸乳杆菌制剂对鸡血牛血清白蛋白抗体滴度(体液免疫)的影响
表8嗜酸乳杆菌制剂对鸡血牛血清白蛋白抗体滴度(体液免疫)的影响
从表7和表8可以看出,本发明提供的嗜酸乳杆菌制剂添加到饲料中可以明显增强T细胞活力,也可以明显增强抗体滴度水平。说明本发明提供的嗜酸乳杆菌制剂可以明显提高动物的细胞免疫功能和体液免疫功能。
实施例8嗜酸乳杆菌作为饲料添加剂饲喂仔猪试验
试验动物:选用35日龄断奶,体重在9KG左右的”杜长白”仔猪做为试验动物300头,一批选齐,出生日期相差不超过7天。试验期为30天,预饲期为7天。饲养采用地面平养饲养,各组除日粮不同外,其他条件完全一致,按常规进行,人工投料、自由采食、自由饮水、保持猪舍清洁。
饲喂方法:将三百头仔猪分为三个组,分别为对照组I:只饲喂基础日粮,对照组II:基 础日粮+金霉素(100g)/t;试验组III,基础日粮+1‰的嗜酸乳杆菌菌剂(实施例3中的饲料添加剂)。
测试指标及方法:在试验开始和结束时早晨空腹对猪只进行称重,分别以重复组为单位进行全群称重、计算耗料量、日增重、料肉比、腹泻率等指标,并进行差异性显著检验,试验结果如下:
表9嗜酸乳杆菌菌剂添加到饲料中饲喂仔猪试验结果
从表9中可看出,基础日粮中添加了抗生素金霉素的对照组II和添加了嗜酸乳杆菌菌剂的试验组III中的日均增重比只饲喂基础日粮的对照组I的仔猪要多,而料肉比比较低,同时仔猪的腹泻率也大大改善,表明了嗜酸乳杆菌菌剂可以部分替代抗生素的使用。
实施例9本发明的嗜酸乳杆菌饲喂蛋鸡试验
用日龄相同的产蛋后期海兰褐蛋鸡900只,分三组,每幢一组300只,分3个重复,每个重复100只。分组情况如下:
A组,空白对照组,饲喂蛋鸡基础日粮;B组,在蛋鸡基础日粮中添加抗生素(金霉素)80g/t;C组,在蛋鸡基础日粮中添加嗜酸乳杆菌菌饲料添加剂0.18%(实施例4制备的饲料添加剂)。
前7天为预试期,后28天为试验期,并按上述分组重复试验3次,测定鸡舍内NH3、H2S浓度、鸡蛋破损率、哈夫单位、产蛋率、蛋重、死淘率、蛋壳光洁度、抗体水平等指标。结果列于表10。
表10对蛋鸡生产性能、蛋白质、死淘率的影响
注:蛋壳光洁度用+的多少表示,越多代表光洁度越好。
从表结果可以看出,虽然添加了嗜酸乳杆菌饲料添加剂一组的蛋重、产蛋率等指标不如抗生素组好,但却显著降低了鸡舍的氨气、硫化氢等有害气体、降低死淘率、抗体水平也得到了较大的提高,有着良好的经济效益和生态效益,同时也有助于降低药物残留问题,从而提高食品的安全性。
Claims (7)
1.一株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),其保藏编号为CGMCC No.5093。
2.权1所述的嗜酸乳杆菌,其特征在于该菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID No:1所示。
3.权1所述的嗜酸乳杆菌在制备禽畜或水产养殖饲料添加剂中的应用。
4.一种包含权1所述的嗜酸乳杆菌的饲料添加剂,其特征在于饲料添加剂中嗜酸乳杆菌的活菌数为109-1010cfu/g。
5.权4所述的嗜酸乳杆菌的饲料添加剂,其特征在于饲料添加剂中的嗜酸乳杆菌为经如下工艺制备而成:(1)高密度发酵培养,培养条件为:35-40℃、罐压为0.03-0.05Mpa,搅拌转速为60-100rpm,每30-60分钟搅拌一次,每次搅拌时间为10-20分钟,得嗜酸乳杆菌发酵液;所用的发酵培养基的成分及质量体积比为:蔗糖1-2%,大豆蛋白胨1-2%,酵母膏1-2%,硫酸铵0.5-1.0%,磷酸二氢钾0.2-0.5%、柠檬酸钠0.2-0.8%,硫酸镁0.01-0.05%;(2)将得到的嗜酸乳杆菌发酵液3500-5000rpm离心,得到菌泥,加入与发酵液的重量体积比为15-20%的冻干保护剂,混匀,于-25℃--45℃冷冻干燥,至水分含量小于5%;所述的冻干保护剂的组成成分及质量体积比为:脱脂牛奶5-10%、麦芽糊精5-15%、海藻糖5-15%、维生素C 0.5-2.5%谷氨酸钠0.5-2.5%、硫酸锰0.4-1%、甘油2-5%。
6.权5所述的嗜酸乳杆菌的饲料添加剂,其特征在于:培养条件为37℃、罐压为0.05Mpa,搅拌转速为60rpm,每45分钟搅拌一次,每次搅拌时间为15分钟;所用的发酵培养基的成分及质量体积比为:蔗糖2%,大豆蛋白胨1.5%,酵母膏1.5%,硫酸铵0.8%,磷酸二氢钾0.4%,柠檬酸钠0.6%,硫酸镁0.01-0.05%;所述的冻干保护剂的组成成分及质量体积比为:脱脂牛奶8%、麦芽糊精8%、海藻糖10%、维生素C 0.8%、谷氨酸钠2%、硫酸锰0.8%、甘油2%。
7.一种包含权4-6任一项所述的嗜酸乳杆菌的饲料添加剂的预混料,其特征在于预混料中饲料添加剂的添加质量体积比为0.5-10‰,预混料中嗜酸乳杆菌的活菌数为106-108cfu/g。
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