CN106635886A - 一种利用产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌降低鸡蛋胆固醇的方法 - Google Patents

一种利用产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌降低鸡蛋胆固醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1活菌制剂降低鸡蛋胆固醇的方法，适用于家禽畜牧业中生产低胆固醇鸡蛋。本发明利用筛选自藏灵菇中的产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌KL1菌株，经过活化、扩大培养、高密度发酵、离心浓缩、加入冻干保护剂、预冻和冷冻干燥等工序制备活菌制剂；再将活菌数量为1010CFU/g以上的该活菌制剂添加到饲养蛋鸡基础日粮中，添加量为每只蛋鸡每日摄入106CFU和107CFU，饲喂含菌剂饲料至8～10周，可以降低鸡蛋黄中的胆固醇含量近11％，同时具有提高蛋鸡的产蛋率、蛋壳质量和蛋黄相对重量，以及减轻蛋鸡脂肪肝的作用。本发明操作简单，成本低廉，适合规模化养殖生产低胆固醇鸡蛋。

Description

一种利用产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌降低鸡蛋胆固醇的 方法
技术领域
本发明涉及微生物活菌制剂应用领域，具体涉及副干酪乳杆菌KL1活菌制剂应用于生产低胆固醇鸡蛋。
背景技术
本发明涉及的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1是从藏灵菇中分离筛选出来的一种具有降低胆固醇作用的益生乳酸菌。
藏灵菇(又称开菲尔粒)，是传统乳制品开菲尔的发酵剂，它是由多种微生物通过共生作用形成的特殊粒状或片状结构，这些微生物主要是乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等。用开菲尔乳饮品具有改善机体消化能力，提高钙的利用率，调节免疫、调节血脂和胆固醇、抗癌症、抗氧化等作用。近年来，研究者已从藏灵菇中分离鉴定出副干酪乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种等菌属，这些菌都不同程度的具有降低胆固醇的作用。
本发明从藏灵菇中分离纯化得到的副干酪乳杆菌KL1，在生长代谢过程中产生大量高活力的胆盐水解酶，经过体外牛津杯试验和动物实验证明有降低机体血清总胆固醇含量的功效。
本发明将副干酪乳杆菌KL1的活菌制剂添加到蛋鸡饲料中，达到降低鸡蛋胆固醇的目的。目前，国内申请关于降低鸡蛋胆固醇饲料添加剂的专利也有很多，但这些饲料添加剂大多是中草药成分，而微生物方法降低鸡蛋胆固醇的专利较少，如青岛农业大学的朱连勤等申请的“一种低胆固醇鸡蛋的生产方法(CN104171582A)”是先将按1∶1混合的植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵饲料，再将发酵的饲料饲喂给蛋鸡，达到降低鸡蛋胆固醇的目的；王冰申请的“一种低胆固醇鸡蛋的生产方法(CN105230563A)”是在蛋鸡饲料中加入本地土著益生菌及本地中药成分，抑制鸡体内胆固醇的产生和沉积。与以上专利不同的是，本专利是用纯粹一种产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌直接添加到饲料中降低鸡蛋胆固醇的方法，即饲料不用乳酸菌发酵，也不与中药成分复配，就能达到降低鸡蛋胆固醇的效果。因此本专利操作简单，成本低廉，适合规模化养殖生产低胆固醇鸡蛋。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够降低鸡蛋胆固醇含量的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
所述方法中，提供的菌种是：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1，分离筛选自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)，并已于2015年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.11533(菌株KL1)。
所述方法中，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1在含有碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基上，菌株的菌落大小2～3mm，表面粗糙如雪花状，边缘不规则，无光泽，扁平，灰白色，半透明，菌落有较高黏性；个体形态呈杆状，长短不等，短链状排列，有时菌体呈球形，G+无芽孢杆菌。
为了确定副干酪乳杆菌在生产低胆固醇鸡蛋中的作用，将该菌制成活菌制剂进行动物试验。
所述方法中，选择体重相近、健康无病的30周龄的120只农大3号矮小蛋鸡，随机分为4组，每组设3个重复，每个重复有蛋鸡10只；空白对照组不添加副干酪乳杆菌KL1活菌制剂，只饲喂基础日粮；试验组在基础日粮中添加活菌数为5.4×1010CFU/g以上的副干酪乳杆菌KL1活菌制剂，并按低、中、高剂量活菌制剂，每个试验组每只蛋鸡摄入副干酪乳杆菌KL1的活菌数分别为105CFU/d、106CFU/d、107CFU/d，饲喂添加菌剂饲料的时间为每天上午8:00～9:00，提前将120只鸡禁食1h，确保其尽快将含菌饲料摄入，避免菌体在饲料中繁殖，以保证每日菌剂摄入量一致。采用三层阶梯式单鸡笼养鸡舍饲养蛋鸡，高床平养，每日光照16h。控温风机纵向负压通风，饮水器为***式，人工喂料和捡蛋，自由采食、自由饮水。动物试验进行11周，期间测定鸡蛋胆固醇含量和血清中胆固醇含量。
所述方法中，动物试验结果表明，将活菌数为5.4×1010CFU/g以上的副干酪乳杆菌KL1活菌制剂添加到蛋鸡基础日粮中，添加量为每只蛋鸡每日摄入106CFU、107CFU，饲喂含菌剂饲料至8～10周，能够显著降低蛋黄胆固醇含量，降低鸡蛋黄中的胆固醇含量近11％。
所述方法中，所得产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌活菌制剂的活菌数量可达5.4×1010CFU/g以上。由于此种活菌制剂活菌含量较高，作为蛋鸡生物饲料添加剂，既可提高蛋鸡的产蛋率、蛋壳质量和蛋黄相对重量，又可利用副干酪乳杆菌产生胆盐水解酶的特性，达到降低鸡蛋胆固醇含量的目的。本发明不仅具有提高蛋鸡生产性能的效果，而且具有增强蛋鸡抗氧化力，减轻蛋鸡脂肪肝的作用，同时操作简单，成本低廉，适合规模化养殖生产低胆固醇鸡蛋。
上述方法，利用高活菌数产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌KL1活菌制剂降低鸡蛋胆固醇的方法与专用生产菌株属于本发明保护范围。
具体实施方式
下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积分数。
1、菌种的活化和扩大培养
将甘油冷冻保藏管保种的副干酪乳杆菌KL1菌种，以改良MRS液体培养基于37℃培养12～14h，活化2～3代，冷藏备用；将活化好的菌液以2％的接种量移种至改良培养基中，于37℃培养12～14h，得到扩大培养液。
改良MRS培养基成分：葡萄糖10g、大豆蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母干粉5g、柠檬酸二铵2g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.58g、四水合硫酸锰0.25g、吐温-80 1mL、蒸馏水1 000mL，调节pH为6.4，115℃灭菌20min。
2、高密度发酵
将2L改良MRS培养基加入到5L全自动发酵罐中，利用发酵罐灭菌***于115℃灭菌15min，利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将KL1菌株扩大培养液按3％(V/V，体积分数)的接种量移种至改良MRS培养基中，于40℃发酵20h，发酵过程中以流加10％(W/V，质量体积比浓度)的灭菌Na2CO3溶液控制发酵液pH6.4，搅拌转速为55r/min，采用改良MRS琼脂培养基以倾注平板培养法检测发酵液中的活菌数量，每个稀释度设3次重复，测定发酵液中KL1菌株活菌数为(8.0～8.2)×109CFU/mL。
3、活菌制剂的制备
取1L副干酪乳杆菌KL1发酵液于4℃、5000r/min离心15min，弃上清液，收集菌泥；将冻干保护剂分装于600mL的冻干瓶中，每个冻干瓶装量为100mL；每瓶加入1L发酵液离心所得的菌泥(即冻干保护剂∶离心前发酵液＝1∶10体积)，混合均匀后，得到浓缩活菌制剂；将浓缩活菌制剂于-34℃低温冰箱中预冻15h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。利用6LLABCONCO真空冷冻干燥机(美国)将预冻活菌制剂于-55℃、真空度0.16mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干活菌制剂，于-35℃低温保藏待用。
以改良MRS琼脂培养基倾注平板培养法测定冻干菌粉的活菌数量，取10-7、10-8、10-9三个稀释度设3次重复，37℃恒温箱培养24～36h，计数活菌制剂中KL1菌株的活菌数为5.4×1010CFU/g。
4、动物试验
选择体重相近、健康无病的30周龄的120只农大3号矮小蛋鸡，随机分为4组，每组设3个重复，每个重复有蛋鸡10只；空白对照组不添加副干酪乳杆菌KL1活菌制剂，只饲喂基础日粮；试验组在基础日粮中添加活菌数为5.4×1010CFU/g以上的副干酪乳杆菌KL1活菌制剂，并按低、中、高剂量活菌制剂，每个试验组每只蛋鸡摄入副干酪乳杆菌KL1的活菌数分别为105CFU/d、106CFU/d、107CFU/d，饲喂添加菌剂饲料的时间为每天上午8:00～9:00，提前将120只蛋鸡禁食1h，确保其尽快将含菌饲料摄入，避免菌体在饲料中繁殖，以保证每日菌剂摄入量一致。
试验采用三层阶梯式单鸡笼养鸡舍饲养蛋鸡，高床平养，每日光照16h。控温风机纵向负压通风，饮水器为***式，人工喂料和捡蛋，自由采食、自由饮水。正式试验期为11周。每两周采集鸡蛋样品，测定其蛋黄胆固醇含量。采集血清样品，测定其血清胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量。试验结果如下：
(1)蛋黄胆固醇含量
表1 副干酪乳杆菌KL1对蛋黄中胆固醇含量的影响(n＝15)(mg/g蛋黄)
注：*代表与空白对照组比较P＜0.05，差异显著；**代表与空白对照组比较P＜0.01，差异极显著。
由表1可见，随着饲喂副干酪乳杆菌KL1活菌制剂的周期时间延长，各试验组蛋鸡的蛋黄胆固醇含量呈下降趋势。至8～10周，低、中、高剂量试验组蛋黄中的胆固醇含量极显著低于空白对照组(P＜0.01)，最终趋于一个近似值。其中，中、高剂量试验组蛋黄中的胆固醇含量降低了近11％，表明蛋鸡日粮中添加量为每只鸡每日摄入106、107CFU时，能够显著降低鸡蛋黄胆固醇含量。
(2)蛋鸡血清胆固醇、甘油三酯、高密度胆固醇、低密度胆固醇含量
1)副干酪乳杆菌KL1对血清总胆固醇(TC)的影响
表2 副干酪乳杆菌KL1对血清总胆固醇含量的影响(n＝12)(mmol/L)
注：*代表与空白对照组比较P＜0.05，差异显著；**代表与空白对照组比较P＜0.01，差异极显著。
由表2可知，随着饲喂副干酪乳杆菌KL1活菌制剂的周期时间延长，蛋鸡血清总胆固醇明显呈下降趋势。至10周，高、中、低剂量试验组极显著低于空白对照组(P＜0.01)。试验最后阶段，低、中、高剂量3个试验组蛋鸡血清总胆固醇含量相对于空白对照组分别降低了32.9％、30.6％、32.9％。
2)副干酪乳杆菌KL1对血清甘油三酯(TG)的影响
表3 副干酪乳杆菌KL1对血清甘油三酯含量的影响(n＝12)(mmol/L)
注：*代表与空白对照组比较P＜0.05，差异显著；**代表与空白对照组比较P＜0.01，差异极显著。
由表3可见，随着饲喂副干酪乳杆菌KL1活菌制剂的周期时间延长，蛋鸡血清甘油三酯明显呈下降趋势。至10周，高、中、低剂量试验组极显著低于空白对照组(P＜0.01)。试验最后阶段，低、中、高剂量3个试验组蛋鸡血清甘油三酯含量相对于空白对照组分别降低了36.5％、34.0％、39.2％。
3)副干酪乳杆菌KL1对血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的影响
表4 副干酪乳杆菌KL1对血清高密度脂蛋白胆固醇含量的影响(n＝12)(mmol/L)
注：*代表与空白对照组比较P＜0.05，差异显著；**代表与空白对照组比较P＜0.01，差异极显著。
由表4可知，随着饲喂副干酪乳杆菌KL1活菌制剂的周期时间延长，试验组蛋鸡血清高密度脂蛋白胆固醇基本呈增长趋势。至10周，高剂量试验组极显著高于空白对照组(P＜0.01)，中剂量试验组显著高于空白对照组(P＜0.05)。试验最后阶段，低、中、高剂量3个试验组蛋鸡血清高密度脂蛋白胆固醇含量相对于空白对照组分别提高了8.3％、12.5％、19.4％。
4)副干酪乳杆菌KL1对血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的影响
表5 副干酪乳杆菌KL1对低密度脂蛋白胆固醇含量的影响(n＝12)(mmol/L)
注：*代表与空白对照组比较P＜0.05，差异显著。
由表5可见，随着饲喂副干酪乳杆菌KL1活菌制剂的周期时间延长，试验组蛋鸡血清低密度脂蛋白胆固醇基本呈下降趋势。至10周，高剂量试验组显著低于空白对照组(P＜0.05)。试验最后阶段，低、中、高剂量3个试验组蛋鸡血清低密度脂蛋白胆固醇含量相对于空白对照组分别降低了11.9％、22.0％、23.7％。
综上所述，动物试验结果表明，本发明将活菌数为5.4×1010CFU/g以上的副干酪乳杆菌KL1活菌制剂添加于蛋鸡基础日粮中，添加量为106CFU/(只·d)、107CFU/(只·d)，饲喂含菌剂饲料至8～10周，能够显著降低蛋黄胆固醇含量，降低鸡蛋黄中的胆固醇含量近11％。显示本发明所述副干酪乳杆菌KL1活菌制剂具有良好降低蛋黄胆固醇作用，对生产低胆固醇鸡蛋具有较大的经济效益和社会效益。
本专利所属项目1：转基因生物新品种培育重大专项“抗病转基因羊新品种培育”
项目编号：2014ZX08008-005
项目起止时间：2014.01-2015.12
项目负责人：刘慧
本专利所属项目2：北京市自然科学基金“藏灵菇益生菌产生物活性物质及生理功能的研究”
项目编号：5062006
项目起止时间：2006.01-2008.12
项目负责人：刘慧

Claims (2)

1.副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1 CGMCC No.11533。
2.一种利用产胆盐水解酶副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1CGMCCNo.11533菌株降低鸡蛋胆固醇的方法，其特征在于：选择体重相近、健康无病的30周龄的农大3号矮小蛋鸡，在基础日粮中添加活菌数为5.4×1010CFU/g以上的副干酪乳杆菌KL1活菌制剂，添加量为每只蛋鸡每日摄入106CFU和107CFU，饲喂含菌剂饲料至8～10周，可以降低鸡蛋黄中的胆固醇含量近11％；饲喂添加菌剂饲料的时间为每天上午8:00～9:00，并提前将蛋鸡禁食1h，确保其尽快将含菌饲料摄入，以保证每日菌剂摄入量一致；采用三层阶梯式单鸡笼养鸡舍饲养蛋鸡，高床平养，每日光照16h，控温风机纵向负压通风，饮水器为***式，人工喂料和捡蛋，自由采食、自由饮水。
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