CN102260635B

CN102260635B - 一种冷冻干燥保护剂、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102260635B
Application number: CN 201010185602
Authority: CN
Inventors: 刘先; 龄南; 康小红; 生庆海; 刘卫星
Original assignee: Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Current assignee: Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2030-05-28
Also published as: CN102260635A

Abstract

一种冷冻干燥保护剂，100份冷冻干燥保护剂由如下组分按照重量份制备而成：脱脂乳粉12份-20份，谷氨酸钠0.5份-3份，抗坏血酸钠0.1份-0.5份，甘油0.5份-3份，胱氨酸0.05份-0.3份，海藻糖10份-20份，其它由水补足。一种制备冷冻干燥保护剂的方法，将所述的组分混合，经过30分钟温度为100℃的灭菌制备而成。此种冷冻干燥保护剂应用于微生物特别是乳酸杆菌的冷冻干燥。最大限度地发挥了冷冻干燥保护剂的保护功能，减少菌体在冷冻干燥过程中的死亡，大大提高了菌体的存活率。

Description

一种冷冻干燥保护剂、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种冷冻干燥保护剂，具体来说，本发明涉及一种乳酸杆菌的冷冻干燥保护剂、制备方法及其应用。

背景技术

冷冻干燥是将湿物料在较低温度下冻结成固态，然后在高度真空下，将其中固态水分直接升华为气态而除去的干燥过程，也称升华干燥。在冷冻干燥过程中，冷冻和干燥两个过程会造成部分微生物细胞的损伤、死亡及其某些酶蛋白分子的钝化。如果冻干工艺中保护剂选择不当，则发酵活力下降。

乳酸杆菌为乳品工业微生物中重要的菌种资源之一，具有良好的发酵特性以及改善或调节肠道微生物菌群的平衡、增强机体免疫力、降低胆固醇水平、缓解乳糖不耐症以及抑制肿瘤细胞形成等功效。乳酸杆菌已广泛应用于食品、酿造等行业。如何更好地将生产中选育到的优良乳酸杆菌保存下来，选择合适的冷冻干燥保护剂尤为重要。

各种微生物的种类和其本身结构（如细菌有无囊膜、荚膜等）不同、培养方法也有差异，为了使冷冻干燥过程中微生物的损伤和死亡尽量降低，各种微生物的冷冻干燥保护剂的配方也不尽相同。常用的保护剂主要为牛奶、蔗糖、明胶等，组方简单，保护功能差。如果在2℃-8℃条件下，保存期只有4-6月，多需要在-15℃以下保存。加上传统的生物制品保护剂的研制相对滞后，使成品的长期保存和运输受限。所以，研究一种效果较好的冷冻干燥保护剂十分迫切。

发明内容

本发明的目的是提供具有较佳效果的冷冻干燥保护剂。此种冷冻干燥保护剂在微生物尤其是乳酸杆菌的冷冻干燥中，保护效果有显著的提高，大大提高了菌体的成活率。

本发明提供了一种冷冻干燥保护剂，100份冷冻干燥保护剂由如下重量份的组分制备而成：

脱脂乳粉12份-20份，

谷氨酸钠0.5份-3份，

抗坏血酸钠0.1份-0.5份，

甘油0.5份-3份，

胱氨酸0.05份-0.3份，

海藻糖10份-20份，

其它由水补足。

在冷冻干燥保护剂的常见组分中，甘油可促进冷冻干燥处理中过氧化氢酶复性，且当甘油浓度上升至0.8%，过氧化氢酶可复性完全。脱脂奶粉可促进升华。与蔗糖相比，海藻糖的玻璃化温度更高，吸湿度更低，无还原性，能够形成一种弱玻璃而具有很好的保护作用。糖对蛋白质的保护作用与其浓度有关，通常在某个浓度范围内，糖的保护作用随着浓度的升高而增大；当达到某一浓度时，保护作用达到最大值；此后再增大糖的浓度，保护效果无显著增加，有时反而会降低。氨基酸是常见的蛋白质保护剂之一，可防止有效组分随水蒸气一起升华逸散。

在冷冻过程中，结晶型氨基酸能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质结构的破坏。吐温80、十二烷基磺酸钠及抗坏血酸等一些表面活性剂或还原剂对冷冻干燥过程中的蛋白质也起到一定的保护作用。此外，产品的自身氧化可消耗冻干样品内部和环境中的氧；放入电子或氢离子，如抗坏血酸等，可阻断冻干样品中氧化链式反应，抑制氧化酶活性，防止样品在冷冻干燥及储藏过程中氧化变质。

发明人在对冷冻保护剂的筛选过程中，首先进行了单因素试验，其中CK为不添加任何保护剂的对照组，列1中脱脂乳粉5%是指100克冷冻干燥保护剂中有5克是脱脂奶粉、95克是水；以此类推。试验结果如表2，表2中列出了添加不同保护剂条件下的活菌数。

表1 单因素试验因素水平表

冷冻干燥保护剂	CK	1	2	3
					脱脂乳粉	0	5%	10%	20%
谷氨酸钠	0	0.5%	1.5%	3%
					抗坏血酸钠	0	0.1%	0.3%	0.5%
甘油	0	0.5%	1.5%	3%
					胱氨酸	0	0.1%	0.2%	0.3%
海藻糖	0	10%	15%	20%

表2 冷冻干燥保护剂单因素试验结果（×10⁹cfu/g）

冷冻干燥保护剂	CK	1	2	3
					脱脂乳粉	0.142	6.35	6.40	6.51
谷氨酸钠	0.142	6.08	6.12	6.33
					抗坏血酸钠	0.142	6.43	6.48	6.56
甘油	0.142	6.12	6.23	6.44
					胱氨酸	0.142	6.40	6.52	6.58
海藻糖	0.142	6.59	6.66	6.78

试验结果表明，6种不同的保护剂组分对于菌体均有保护作用，添加保护剂的样品中活菌数大大高于未添加保护剂的空白对照。而且，胱氨酸，抗坏血酸钠和海藻糖在冷冻干燥过程中对于菌体的保护作用明显强于其他成分。基于此，选择该三个因素进行正交试验，进一步确定最佳的保护剂配方。正交试验结果见表3：

表3 乳酸杆菌冻干保护剂正交试验结果

试验号	胱氨酸A	抗坏血酸钠B	海藻糖C	空列D	活菌数（×10⁹cfu/g）
						1	0.1%	0.1%	10%	1	6.08
2	0.1%	0.3%	15%	2	6.15
						3	0.1%	0.5%	20%	3	6.88
4	0.2%	0.1%	15%	3	6.33
						5	0.2%	0.3%	20%	1	7.03
6	0.2%	0.5%	10%	2	6.23
						7	0.3%	0.1%	20%	2	6.76
8	0.3%	0.3%	10%	1	6.07
						9	0.3%	0.5%	15%	3	6.12
K1	6.370	6.390	6.127	6.410
						K2	6.530	6.417	6.200	6.380
K3	6.317	6.410	6.890	6.427
						R	0.213	0.027	0.763	0.047

由以上正交分析结果可知，海藻糖的影响极为显著，为最主要因素。抗坏血酸钠的影响最小，不显著。因此三因素的影响大小依次为：海藻糖>胱氨酸>抗坏血酸钠。此三因素的最佳水平组合为：A2B2C3，此条件下冷冻干燥后菌体存活数为7.03×10⁹cfu/g。

发明人经过多次试验发现，本发明提供的冷冻干燥保护剂中的各个组分均发挥了各自的作用，同时相互协同作用，最大限度地发挥了冷冻干燥保护剂的保护功能，减少菌体在冷冻干燥过程中的死亡。与现有的冻干保护剂配方相比，本发明中添加的海藻糖和胱氨酸对菌体的存活率有显著的提高作用。

本发明提供了一种制备冷冻干燥保护剂的方法，将脱脂乳粉12份-20份、谷氨酸钠0.5份-3份，抗坏血酸钠0.1份-0.5份，甘油0.5份-3份，胱氨酸0.05份-0.3份，海藻糖10份-20份溶于水中，经过30分钟温度为100℃的灭菌制备而成。

本发明还提供了一种冷冻干燥保护剂在微生物冷冻干燥中的应用。

进一步，本发明提供了一种冷冻干燥保护剂在乳酸杆菌中的应用。以上的冷冻干燥保护剂对乳酸杆菌在冷冻干燥过程中具有较佳的保护效果。

利用本发明中的冷冻干燥保护剂可以制成乳酸杆菌冷冻干燥发酵剂，制备方法包括如下步骤：将乳酸杆菌经过离心富集，按质量比1:1的比例与冷冻干燥保护剂在无菌状态下混合均匀；将得到的菌剂在储藏温度为4℃的环境中储藏12小时以增强菌体细胞的抗冻能力，增强乳酸杆菌在冷冻干燥过程中的存活率。

采用上述冷冻干燥保护剂生产的乳酸杆菌冷冻干燥发酵剂接种于灭菌的牛乳中，在43℃的条件下进行发酵实验，发酵4.5-5h，滴定酸度≥65°T，pH≤4.70，感官风味俱佳。

按照1:10（w/v）将乳酸杆菌冷冻干燥发酵剂溶解于灭菌（121℃，15min）的童汉氏蛋白胨水中，然后做适当的稀释，倾注于灭菌（115℃，15min）的MRS培养基上，37℃培养48-72h后，经检测菌体浓度均大于1.0×10⁹cfu/g。

其中，以上的乳酸杆菌可以为保加利亚乳杆菌亚种，分离自内蒙古传统乳制品中，内蒙古传统乳制品可以通过商购或到牧区采集获得。

具体实施方式

下面将结合具体实施方案对本发明的方法做更详细的说明。本领域技术人员应当理解，下述实施例均用于对本发明所要求保护的范围进行实例性的描述，以此概括本发明的各参数的相对范围，因而不能将之理解为对本发明的一种具体限制。

表4. 冷冻干燥保护剂配方

组分（单位：克）	配方1	配方2	配方3
				脱脂乳粉	15±1	19±1	13±1
谷氨酸钠	2.5±0.5	0.6±0.1	0.7±0.1
				抗坏血酸钠	0.15±0.05	0.4±0.1	0.3±0.1
甘油	2.5±0.5	1.5±0.5	0.6±0.1
				胱氨酸	0.25±0.05	0.2±0.05	0.1±0.05
海藻糖	15±1	19±1	11±1
				水	64.6±1	59.3±1	74.3±1

表4配方中的±号，仅代表试验中允许的误差范围。

实施例1

冷冻干燥保护剂的组分如表4中配方1所示，

制备方法以下步骤：

1）按照上述的配方1的组分混合；

2）将上述冷冻干燥保护剂进行灭菌，灭菌的温度是100℃，时间为30分钟。

将上述制备好的冷冻干燥保护剂应用在乳酸杆菌中，对乳酸杆菌在冷冻干燥过程中具有较佳的保护效果。

制备具有上述冷冻干燥保护剂的乳酸杆菌发酵剂：首先将离心富集到的保加利亚乳杆菌按质量比1:1的比例加入到上述冷冻干燥保护剂中，在无菌状态下将两者混合均匀。然后将制备好的保加利亚乳杆菌增殖培养基储藏于4℃环境中储藏12小时。

采用上述冷冻干燥保护剂生产的保加利亚乳杆菌冷冻干燥发酵剂接种于灭菌的干物质含量为11.5%的鲜乳中在43℃的条件下进行发酵实验，发酵4.5-5小时，滴定酸度≥65°T，pH≤4.70，感官风味俱佳。

按照1:10（w/v）将保加利亚乳杆菌冻干发酵剂溶解于灭菌（121℃，15 分钟）的童汉氏蛋白胨水中，然后做适当的稀释，在乳酸菌培养基（MRS培养基）上37℃培养48-72小时后，经检测菌体浓度为2.7×10⁹cfu/g。

实施例2

冷冻干燥保护剂的组分如表4中配方2所示，

制备方法以下步骤：

1）按照上述的配方2的组分混合；

采用上述冷冻干燥保护剂生产的保加利亚乳杆菌冻干发酵剂以适量接种于灭菌的干物质含量为11.5%的全脂乳中在43℃的条件下进行发酵实验，发酵4.5-5小时，滴定酸度≥65°T，pH≤4.70，感官风味俱佳。

按照1:10（w/v）将保加利亚乳杆菌发酵剂溶解于灭菌（121℃，15分钟）的童汉氏蛋白胨水中，然后做适当的稀释，在乳酸菌培养基（MRS培养基）上37℃培养48-72小时，菌体浓度为6.7×10⁹cfu/g。

实施例3

冷冻干燥保护剂的组分如表4中配方3所示，

制备方法以下步骤：

1）按照上述的配方3的组分混合；

制备具有上述冷冻干燥保护剂的乳酸杆菌发酵剂：首先将离心富集到的保加利亚乳杆菌按质量比1:1的比例加入到上述冷冻干燥保护剂中，在无菌状态下将两者混合均匀。然后将制备好的乳酸杆菌增殖培养基储藏于4℃环境中储藏12小时。

采用上述冷冻保护剂生产的乳酸杆菌冻干发酵剂以适量接种于灭菌的干物质含量为11.5%的鲜乳或全脂乳中在43℃的条件下进行发酵实验，发酵4.5-5小时，滴定酸度≥65°T，pH≤4.70，感官风味俱佳。按照1:10（w/v）将保加利亚乳杆菌发酵剂溶解于灭菌（121℃，15分钟）的童汉氏蛋白胨水中，然后做适当的稀释，在乳酸菌培养基（MRS培养基）上37℃培养48-72小时，菌体浓度为4.3×10⁹cfu/g。

本发明的冻干保护剂具有安全、成本低且原料易于获得的优点。采用该保护剂对乳酸杆菌进行冷冻干燥时，可以提高乳酸杆菌在冷冻过程中的存活率，使冻干后的乳酸杆菌发酵剂仍能保持较高的发酵活力，因此更适合大规模的工业化生产。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种冷冻干燥保护剂，其特征是100份所述冷冻干燥保护剂由如下重量份的组分制备而成：

脱脂乳粉19份，

谷氨酸钠0.6份，

抗坏血酸钠0.4份，

甘油1.5份，

胱氨酸0.2份，

海藻糖19份，和

水59.3份。

2.一种制备冷冻干燥保护剂的方法，其特征在于：将权利要求1中所述的组分混合，经过30分钟温度为100℃的灭菌制备而成。

3.如权利要求1所述的冷冻干燥保护剂在微生物冷冻干燥中应用。

4.如权利要求3所述的应用，其中，所述微生物是乳酸杆菌。