CN113956996A - 一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，其工艺流程包括嗜酸乳杆菌发酵培养、发酵液分离、菌泥乳化和乳化液真空冷冻干燥，其特征在于菌种发酵培养：将嗜酸乳杆菌菌种接入三角瓶液体培养基中35～40℃下培养16～24小时；再接入液体发酵罐35～40℃下发酵培养16～24小时；115℃灭菌30分钟；还有菌种发酵罐扩增培养8～24小时，发酵液恒定pH值为5.5±0.1；乳化液真空冷冻干燥：先在‑55～‑45℃预冻4～8小时，后在‑35℃、0.5～1.5pa真空度下真空冷冻干燥40～60小时。本发明方法生产的嗜酸乳杆菌冻干菌粉活性在2.0×1011cfu/g以上。
Description
技术领域
本发明公开一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，应用于食品生物技术领域。
背景技术
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为乳杆菌属 (Lactobacillus)，革兰氏阳性，不产芽抱，不运动，无鞭毛、荚膜、芽孢的细长杆菌，不运动，以单个、成双或短链的形式存在，可发酵糖产生乳酸、乙醇、过氧化氢等的厌氧或兼性厌氧的微生物。最适pH 5.5～ 6.0，最适生长温度35 ～ 38℃，20℃以下基本不生长，耐热性差，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进行同型发酵，产生 DL型乳酸。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)是人体肠道中的重要微生物，最初是从婴儿的粪便中分离出来的，能改善或调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症以及抑制肿瘤细胞的形成等，起到健康促进效果。嗜酸乳杆菌具有较强的耐酸及耐胆汁盐能力，是少有的能顺利通过胃肠道环境，并能发挥益生保健作用的益生菌，其制品在欧美、日本等国家被广泛开发利用，一直备受欢迎。
近年来，随着人们健康意识的逐步增强，益生菌及其制品逐渐成为食品上今后发展的重点。嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中极为重视研究与开发的菌种之一，被视为第三代乳酸发酵剂菌种，嗜酸乳杆菌是人体肠道中的重要微生物，与人体健康息息相关。当其达到一定数量时，可以起到健康促进效果。作为益生制品中常用的主要菌种之一，嗜酸乳杆菌培养的研究极具意义的。
美国科学家 Sellars 早在 1981 年就预言，在今后的二三十年，嗜酸乳杆菌的开发、研究及其应用将具有强大的生命力，随着人们生活水平的提高，健康意识的逐步增强，益生菌的微生态制剂正作为一个新的领域被研究和开发。目前，含有益生含有菌的产品市场十分活跃，品种越来越多，包括食品、胶囊、片剂、粉剂及口服液等多种投放形式。嗜酸乳杆菌作为目前乳酸菌家族中极为重视研究和开发价值的益生菌，被视为第三代乳酸发酵剂菌种，是经美国食品药物管理局和我国***正式认可、批准的益生菌之一。
乳酸菌活菌制剂是以其所含活菌的积极生命活动而达到调节其宿主微生态平衡的，活菌含量的高低始终是评定产品质量的一项关键指标。国内外学者都把维持菌的稳定和存活作为评价菌质量的标准。研究发现，要获得所期望的治疗效果，益生菌的数量必须达到足够的数量。要产生疗效作用的益生菌数必须达到106 cfu/ml，也有其他研究结果认为≥107cfu/ml 和108cfu/ml 是一个理想的水平，这一水平被称为“最低疗效量”，即消费者每天应有最少108cfu/ml的摄入量。对于治疗用的活菌制剂，在有效期应保证活菌含量不低于109cfu/g。目前在国外已经有商业化产品出现，其活菌含量高达1010cfu/g以上，配方组成属于商业机密，国内益生菌制品活菌数始终是个难题，提高嗜酸乳杆菌益生制品活菌数，优化嗜酸乳杆菌增菌培养及完成高活菌冻干菌粉的生产方法，将是一项十分重要的基础研究工作。
发明内容
本发明的目的是公开一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，通过 35 ～ 40℃、8～ 24小时高密度培养使发酵液菌体浓度达1.0×109cfu/ml以上，通过高效发酵液分离技术使菌泥浓度达1.0×1010cfu/g以上，通过高活性乳化及真空冷冻干燥等优化工艺后得到2.0×1011cfu/ml以上的嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，生产出高密度高稳定性高活性的嗜酸乳杆菌冻干菌粉。
本发明是在对嗜酸乳杆菌菌株特性研究的基础上，对其高密度高活性发酵培养，高稳定性高活性分离、乳化、冻干等技术和工艺，抗冻保护剂的组成及浓度进行了优化，以期最大限度地获得较高密度的发酵培养和活性稳定性保护功能，减少菌体在生产过程中死亡，提高细胞的存活率，为高效冻干菌粉的生产提供技术和工艺。
本发明采用的技术方案为：
一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，其工艺流程包括嗜酸乳杆菌发酵培养、发酵液分离、菌泥乳化和乳化液真空冷冻干燥，其特征在于 ：所述菌种发酵工艺是将嗜酸乳杆菌菌种接入三角瓶液体培养基中进行培养，培养基中接入的菌种重量百分含量为 1.0％～ 2.0％，35 ～ 40℃培养 16 ～ 24 小时，所述三角瓶液体培养基的重量百分比组成为 ：大豆蛋白胨 0.5 ～ 1.0％、葡萄糖 2.0 ～ 3.0％，酵母浸粉 0.8 ～ 1.5％，牛肉浸粉0.8 ～ 1.2％，硫酸镁 0.02％，硫酸锰 0.005％，乙酸钠 0.5％，柠檬酸氢二胺 0.2％，磷酸二氢钾 0.2％，吐温-80 0.1％，L-半胱氨酸盐酸盐 0.05%，其余为水，用2.5mol/L食品级氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.2 ～ 6.4，115℃灭菌30分钟。再接入液体发酵罐进行发酵培养，培养基中的接种重量百分含量为 5％～ 10％，35 ～ 40℃培养8 ～ 30 小时，所述的液体发酵罐发酵培养基的重量百分比组成为 ：大豆蛋白胨 0.5 ～ 1.0％、葡萄糖2.0 ～ 3.0％，蔗糖 0.5 ～ 1.0％，低聚半乳糖 0.5%，酵母浸粉 0.8 ～ 1.5％，牛肉浸粉0.8 ～ 1.2％，硫酸镁 0.02％，硫酸锰 0.005％，乙酸钠 0.5％，柠檬酸氢二胺 0.2％，磷酸二氢钾 0.2％，吐温-80 0.1％，L-半胱氨酸盐酸盐 0.05%，其余为水，115℃灭菌 30 分钟。接种前补加2.5mol/L食品级氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.5后再接入三角瓶菌种，待发酵液pH值下降0.5后，再通过补加食品级氢氧化钠溶液维持菌液的恒pH为5.5±0.1，OD600 值停止增长或呈负增长，镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂菌，终止发酵。
所述的发酵液分离方法，以 6000 ～ 13000rpm 条件下进行以管式或碟片式离心机分离菌体，并以无菌水洗涤 1 ～ 2 次，得到菌泥。
所述的菌泥乳化工艺，按照活菌菌泥∶菌泥保护剂＝ 10 ～ 1 ∶ 1 ～ 2 的比例将菌泥与菌泥保护剂混合乳化，菌泥保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠 0.5 ～2.0％、乳糖 0.1 ～ 0.5％、海藻糖 8 ～ 12％、抗坏血酸钠 0.5 ～ 1％、脱脂奶粉 10 ～20％、吐温-80 0.5 ～ 2.0％，其余为水，菌泥保护剂在115℃条件下灭菌 30分钟后冷却至5 ～ 20℃备用。
所述的菌泥乳化工艺，菌泥和保护剂在乳化罐中进行乳化均质，乳化罐乳化电机转速为1000 ～ 2000rpm，低速搅拌电机转速为80 ～ 100rpm。乳化时间20 ～ 30min，乳化结束后4℃低温静置30～50min。
所述的乳化液真空冷冻干燥工艺，其特征在于干燥条件为 ：在 -55 ～ -45℃预冻4 ～ 8 小时后真空冷冻干燥，冷冻干燥温度为 -35℃，真空度为 0.5 ～ 1.5pa，真空冷冻干燥 40 ～ 60小时；干燥后得到活菌数大于2.0×1011cfu/g 的嗜酸乳杆菌冻干菌粉。
所述三角瓶液体菌种制备、发酵液分离和菌泥乳化的操作环境条件要求为在温度低于 25 度、湿度 RH ＜ 35％的10万级净化环境中进行。
与现有技术相比 ,本发明具有以下突出的优点:
1、本发明为实现嗜酸乳杆菌的增殖培养、富集高活菌数的菌体用于生产作为食品添加剂的冻和干粉的目的，针对嗜酸乳杆菌纯化培养和菌种发酵分别采用了不同的更适于菌体不同生长阶段的基础培养基和优化培养基，并且培养基采用的组分原料均为食品级。
2、在本发明中，用乳化罐对菌泥和保护剂进行乳化均质，让保护剂充分和菌泥包裹混匀，增强在冻干机中的抗冻能力，乳化完成后通过乳化罐夹套进低温冷却循环水让乳化液中的活菌休眠，增强抗冻能力的同时，提高冻干机冻干能力。
3、通过流加食品级氢氧化钠溶液来控制发酵过程中pH值恒定,在短时间里得到大量的菌体,并且菌种稳定,变异、退化少。
4、本发明采用管式离心机或碟式离心机分离收集嗜酸乳杆菌菌泥，管式离心机菌泥收率可达到2.0%以上，菌泥活菌数高达1010cfu/g以上，并且管式离心机的转鼓可用蒸汽灭菌或者干热灭菌，有效地防止了在离心过程中染菌。但管式离心机由于其内部管径大小受限，如果对大型液体发酵罐进行离心，需要多台管式离心机一起工作，操作人员和设备投入成本较高；而碟式离心机其分离能力远超管式离心机，可实现定时排渣，而且不用像管式离心机一样转鼓菌泥满了后要拆卸取菌泥，但碟式离心机成本较管式离心机高。两种分离设备各有优缺点，可以根据实际情况灵活选择离心方式。
5、利用冷冻干燥技术生产活菌制剂有许多突出的优点：由于在低温下干燥,微生物不会失去生物活性；在低温干燥过程中,微生物的生长和酶的作用几乎无法进行,能最好地保持被冻干物质的原来性状；干燥后体积形状基本不变；四被冻干制品呈海绵状，不干缩，因而溶解时与水接触面大,能迅速恢复原来的性状；能除去物质中95% ～ 99%的水分，延长制品的保存期。
6、为避免在冷冻干燥过程造成菌细胞膜的损伤,加入冻干保护剂 ,在冻干保护剂中脱脂奶粉主要在细胞表面起保护层作用；海藻糖在冷冻干燥过程中形成一种玻璃态 ,在玻璃态下黏度极高,因而分子扩散系数很低，使大分子物质运动受阻，细胞壁的通透性降低,从而起到保护作用；抗坏血酸钠是一种水溶性极强的抗氧化剂,能使嗜酸乳杆菌在冻干过程中免遭氧气的影响,保持细胞活性并提高稳定性；糖类保护剂由于具有多个羟基，可与和蛋白质形成氧键以取代水，保证蛋白质的稳定性。复配保护剂体系中每种保护剂成分在冷冻干燥过程中都发挥各自的作用，同时相互间又具有协同作用。
7、本发明技术制备的嗜酸乳杆菌冻干粉，活菌数高，存活率高。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明保护的范围，本发明保护的范围以本发明申请的权利要求书说阐述的为准。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量单位，除非特别说明。
实施例 1 ：
将筛选出的嗜酸乳杆菌菌种先接入三角瓶液体培养基，后接入发酵罐中分别在37℃下培养8 ～ 24 小时进行逐级扩增发酵培养，三角瓶液体菌种培养基的重量百分比组成为：大豆蛋白胨 0.5％、葡萄糖 2.0％，酵母浸粉 1.5％，牛肉浸粉 0.8％，硫酸镁 0.02％，硫酸锰 0.005％，乙酸钠 0.5％，柠檬酸氢二胺 0.2％，磷酸二氢钾 0.2％，吐温-800.1％，L-半胱氨酸盐酸盐 0.05%，其余为水，用 2.5mol/L食品级氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.4，115℃灭菌 30分钟。
液体发酵罐发酵培养基的重量百分比组成为：大豆蛋白胨 0.6％、葡萄糖 2.5%，蔗糖 0.5％，低聚半乳糖 0.5%，酵母浸粉 1.2％，牛肉浸粉 0.8％，硫酸镁 0.02％，硫酸锰0.005％，乙酸钠 0.5％，柠檬酸氢二胺 0.2％，磷酸二氢钾 0.2％，吐温-80 0.1％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05%，其余为水，115 ℃灭菌 30 分钟。接种前补加 2.5mol/L食品级氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.5后再接入三角瓶菌种，待发酵液pH值下降0.5后，再通过补加食品级氢氧化钠溶液维持菌液的恒pH为5.5±0.1，OD600 值停止增长或呈负增长，镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂菌，终止发酵。通过13000 rpm的管式离心机过滤分离菌体，得到菌泥。菌泥通过无菌水洗涤1次后待用。
菌泥保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠 1.0％、乳糖 0.1％、海藻糖 8％、抗坏血酸钠 0.5％、脱脂奶粉 12％、吐温-80 0.5％，其余为水，菌泥保护剂在115℃条件下灭菌 30分钟后冷却至 5℃备用。
按照活菌菌泥∶菌泥保护剂＝ 1:1 的比例将菌泥与菌泥保护剂混合乳化。乳化时乳化罐乳化电机转速为1200rpm，低速搅拌电机转速为100rpm。乳化时间30min，乳化结束后4℃低温静置30min。
在 -55℃预冻 4 小时后真空冷冻干燥，冷冻干燥温度为 -35℃，真空度为0.8pa，真空冷冻干燥46小时条件下干燥后得到高活性嗜酸乳杆菌冻干菌粉。
三角瓶液体菌种制备、发酵液分离和菌泥乳化的操作环境条件要求为在温度低于25℃、湿度RH ＜ 35％的10万级净化环境中进行。
生产得到的产品中活菌数为2.2×1011cfu/g，用双铝膜密封真空包装，每袋1000g或根据客户要求包装。
实施例 2 ：
将筛选出的嗜酸乳杆菌菌种先接入三角瓶液体培养基，后接入发酵罐中分别在37℃下培养8 ～ 24 小时进行逐级扩增发酵培养，三角瓶液体菌种培养基的重量百分比组成为：大豆蛋白胨 1.0％、葡萄糖 2.0％，酵母浸粉 1.0％，牛肉浸粉 1.2％，硫酸镁 0.02％，硫酸锰 0.005％，乙酸钠 0.5％，柠檬酸氢二胺 0.2％，磷酸二氢钾 0.2％，吐温-800.1％，L-半胱氨酸盐酸盐 0.05%，其余为水，用 2.5mol/L食品级氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.4，115℃灭菌 30分钟。
液体发酵罐发酵培养基的重量百分比组成为：大豆蛋白胨 1.0％、葡萄糖 2.0%，蔗糖 1.0％，低聚半乳糖 0.5%，酵母浸粉 1.5％，牛肉浸粉 0.8％，硫酸镁 0.02％，硫酸锰0.005％，乙酸钠 0.5％，柠檬酸氢二胺 0.2％，磷酸二氢钾 0.2％，吐温-80 0.1％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05%，其余为水，115 ℃灭菌 30 分钟。接种前补加 2.5mol/L食品级氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.5后再接入三角瓶菌种，待发酵液pH值下降0.5后，再通过补加食品级氢氧化钠溶液维持菌液的恒pH为5.5±0.1，OD600 值停止增长或呈负增长，镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂菌，终止发酵。通过6500 rpm的碟式离心机过滤分离菌体，得到菌泥。菌泥通过无菌水洗涤2次后待用。
菌泥保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠 2.0％、乳糖 0.5％、海藻糖10％、抗坏血酸钠 0.5％、脱脂奶粉 15％、吐温-80 1.5％，其余为水，菌泥保护剂在115℃条件下灭菌 30分钟后冷却至 5℃备用。
按照活菌菌泥∶菌泥保护剂＝ 10:1 的比例将菌泥与菌泥保护剂混合乳化。乳化时乳化罐乳化电机转速为2000rpm，低速搅拌电机转速为80rpm。乳化时间30min，乳化结束后4℃低温静置50min。
在 -45℃预冻 6 小时后真空冷冻干燥，冷冻干燥温度为 -35℃，真空度为1.2pa，真空冷冻干燥60小时条件下干燥后得到高活性嗜酸乳杆菌冻干菌粉。
三角瓶液体菌种制备、发酵液分离和菌泥乳化的操作环境条件要求为在温度低于25℃、湿度 RH＜35％的10万级净化环境中进行。
生产得到的产品中活菌数为3.0×1011cfu/g，用双铝膜密封真空包装，每袋500g或根据客户要求包装。
本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，本发明提供的具体实施例仅作为进一步说明本发明的例子，本领域技术人员参照本案说明书的描述可以很容易对本发明作出多种改进及组份的替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，其工艺流程包括嗜酸乳杆菌发酵培养、发酵液分离、菌泥乳化和乳化液真空冷冻干燥，其特征在于 ：所述菌种发酵工艺是将嗜酸乳杆菌菌种接入三角瓶液体培养基中进行培养，培养基中接入的菌种重量百分含量为 1.0％～2.0％，35 ～ 40℃培养 16 ～ 24 小时，所述三角瓶液体培养基的重量百分比组成为 ：大豆蛋白胨 0.5 ～ 1.0％、葡萄糖 2.0 ～ 3.0％，酵母浸粉 0.8 ～ 1.5％，牛肉浸粉 0.8～ 1.2％，硫酸镁 0.02％，硫酸锰 0.005％，乙酸钠 0.5％，柠檬酸氢二胺 0.2％，磷酸二氢钾 0.2％，吐温-80 0.1％，L-半胱氨酸盐酸盐 0.05%，其余为水，用2.5mol/L食品级氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.2 ～ 6.4，115℃灭菌30分钟；再接入液体发酵罐进行发酵培养，培养基中的接种重量百分含量为 5％～ 10％，35 ～ 40℃培养8 ～ 24 小时，所述的液体发酵罐发酵培养基的重量百分比组成为 ：大豆蛋白胨 0.5 ～ 1.0％、葡萄糖 2.0 ～3.0％，蔗糖 0.5 ～ 1.0％，低聚半乳糖 0.5%，酵母浸粉 0.8 ～ 1.5％，牛肉浸粉 0.8 ～1.2％，硫酸镁 0.02％，硫酸锰 0.005％，乙酸钠 0.5％，柠檬酸氢二胺 0.2％，磷酸二氢钾0.2％，吐温-80 0.1％，L-半胱氨酸盐酸盐 0.05%，其余为水，115℃灭菌 30 分钟；接种前补加2.5mol/L食品级氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.5后再接入三角瓶菌种，待发酵液pH值下降0.5后，再通过补加食品级氢氧化钠溶液调节维持菌液的恒pH为5.5±0.1。
2.根据权利要求 1 所述的一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，其特征在于 ：所述液体发酵罐发酵培养，OD600 值停止增长或呈负增长，镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂菌，终止发酵。
3.根据权利要求 1 所述的一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，其特征在于 ：所述的发酵液分离方法，是以 6000 ～ 13000rpm 条件下进行以管式或碟片式离心机分离菌体，并以无菌水洗涤 1 ～ 2 次，得到菌泥。
4.根据权利要求 1 所述的一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，其特征在于 ：所述的菌泥乳化工艺，是按照活菌菌泥∶菌泥保护剂＝ 10 ～ 1 ∶ 1 ～ 2 的比例将菌泥与菌泥保护剂混合乳化，菌泥保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠 0.5 ～ 2.0％、乳糖0.1 ～ 0.5％、海藻糖 8 ～ 12％、抗坏血酸钠 0.5 ～ 1％、脱脂奶粉 10 ～ 20％、吐温-80 0.5 ～ 2.0％，其余为水，菌泥保护剂在115℃条件下灭菌 30分钟后冷却至 5 ～ 20℃备用。
5.根据权利要求 1 所述的一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，其特征在于 ：所述的菌泥乳化工艺，菌泥和保护剂在乳化罐中进行乳化均质，乳化罐乳化电机转速为1000 ～2000rpm，低速搅拌电机转速为80 ～ 100rpm，乳化时间20 ～ 30min，乳化结束后4℃低温静置30～50min。
6.根据权利要求 1 所述的一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，其特征在于：所述的乳化液真空冷冻干燥工艺，其特征在于干燥条件为 ：在 -55 ～ -45℃预冻4 ～ 8 小时后真空冷冻干燥，冷冻干燥温度为 -35℃，真空度为 0.5 ～ 1.5pa，真空冷冻干燥 40 ～ 60小时；干燥后得到活菌数大于2.0×1011cfu/g 的嗜酸乳杆菌冻干菌粉。
7.根据权利要求1 、 3 、4和5所述的一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的生产方法，其特征在于：所述三角瓶液体菌种制备、发酵液分离和菌泥乳化的操作环境条件要求为在温度低于25 ℃、湿度 RH＜ 35％的10万级净化环境中进行。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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