CN101402929A - 一株耐碱纤维堆囊菌及其在制备埃博霉素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐碱纤维堆囊菌，名为纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157－2，该菌株已于2008年5月27日保藏于"中国典型培养物保藏中心(CCTCC)"，其保藏编号为：CCTCC NO：M 208078。本发明还公开了所述耐碱纤维堆囊菌在制备埃博霉素中的应用。本发明的耐碱纤维堆囊菌发酵生成埃博霉素产率高，菌种发酵性能稳定，不易发生杂菌污染，发酵周期短，且不产生埃博霉素C，D，E和F等同系物，极大地降低了后续的分离提纯难度，是一株极具研究开发价值的埃博霉素生产菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一株纤维堆囊菌及其应用，尤其涉及一株可高产埃博霉素的耐碱纤维堆囊菌菌株及其在制备埃博霉素中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
促微管聚合类化合物紫杉醇(Paclitaxel，
)及其类似物Docetaxel(
)是目前临床上最为成功的抗肿瘤化疗药物，被用于卵巢癌、胸腺癌、结肠癌、肺癌和肝癌等实体癌的治疗，是美国食品与药物监督局(U.S.Food and DrugAdministration，FDA)认定的实体瘤化疗的首选药物。在与紫杉醇具有相同或相似生物学功能的多种天然化合物中，只有埃博霉素(Epothilones)，[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*]]-7，11-二羟基-8，8，10，16-四甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-4-噻唑基)乙烯基]-4-氮杂-17-氧杂双环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮)，来源于微生物的发酵产物，并被认为是紫杉醇的更新换代产品，是更好的抗癌药物。至今，已有五种埃博霉素类化合物进入了不同阶段的临床试验，包括Bristol-Myers Squibb公司(BMS)的埃博霉素B的两个半合成类似物BMS-247550和BMS-310705；Novartis公司的埃博霉素B(patupilone)；Roche公司的埃博霉素D(KOS-862)；以及最近刚刚进入临床试验的Berlex公司的ZK-EPO。它们均为粘细菌(myxobacteia)中纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)的发酵产物或者发酵后的简单化学衍生物。美国食品与药物监督局于2007年10月批准了Bristol-Myers Squibb公司的
(ixabepilone，BMS-247550)作为治疗乳腺癌的药品上市。
目前，埃博霉素的制备方法主要有化学合成法，生物合成法和化学修饰法三类。埃博霉素的化学全合成路线有十几种，如埃博霉素A的合成路线有6种，埃博霉素B有11种，埃博霉素C和D的全合成路线有2种。但是由于埃博霉素化学全合成步骤繁多，得率较低，与其它方法相比尚不具备优势，没有工业化生产的前景。通过对发酵生产的天然埃博霉素进行化学修饰形成多种埃博霉素类似物，展现出了很好的应用前景。但是，这种方法也必须依赖于生物合成法提供大量的前体原料才能够实施。因此，生物合成法制备埃博霉素成为埃博霉素生产制备技术研究的主流方向。
粘细菌是一类可滑动的单细胞革兰氏阴性细菌，具有特殊的社会学行为特征和复杂的发育生活史。通过滑动运动，它可以在固体培养基上，特别是贫瘠的培养基上发育形成薄的膜状扩展菌落。在一定条件下，粘细菌的营养细胞可以聚集并形成子实体结构一由坚硬度不同的分化的细胞和粘孢子组成的简单或复杂的休眠体。埃博霉素的产生菌是属于粘细菌的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)，它是粘细菌中的唯一能够降解纤维素类底物的类群，但迄今从粘细菌中分离到的新型活性化合物接近一半来源于这个类群，且纤维堆囊菌产生的次级代谢产物具有较强的菌株特异性，而不仅仅是种属特异性。堆囊菌属于化能异养型好氧细菌，一些常用培养基，如玉米粉，大豆粉，酵母细胞，可溶性淀粉，脱脂奶粉，各种各样的蛋白胨，都是比较好的营养原料。发酵时细胞浓度每毫升可以达到109到1010个，细胞干重每升约1-3克，发酵的温度范围为28-30℃，pH为6.8-7.8。但是，作为细菌中的特例，利用纤维堆囊菌进行发酵制备埃博霉素仍面临着许多亟待解决的问题。
1.纤维堆囊菌生长速度十分缓慢，代时达16个小时以上(是目前所有粘细菌中代时最长的类群)，因此发酵周期较长，在液态培养时容易造成染菌，例如埃博霉素发酵的周期通常在14天左右；
2.野生纤维堆囊菌次级代谢产物的产量比较低，一般为0.5-20mg/L，例如，利用纤维堆囊菌So ce90菌株发酵埃博霉素A的产量约为23mg/L；
3.通过克隆埃博霉素合成酶基因簇并将其在其它宿主中表达从而发酵生产埃博霉素也是一个研究的重要方向。但是，以天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)作为宿主的试验，由于埃博霉素对于宿主的细胞毒性而结果不理想。2002年，Julien又将埃博霉素的合成酶基因簇转移到黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)中进行表达产生埃博霉素D，该基因工程菌M.xanthus K111-40-1发酵合成埃博霉素的产量为：分批发酵14天最高达30mg/L，连续发酵30天最高产量达80mg/L，半连续发酵22天最高产量为85mg/L。2004年Boddy等报道将埃博霉素合成基因的后四个模块在大肠杆菌中成功表达产生埃博霉素C，但是必须给宿主菌外供人工化学合成的复杂底物(C9-C21片断的N-乙酰基-半胱氨酸硫酯，SNAC)。2006年，Mutka SC等报道了将整个埃博霉素NRPS/PKS基因簇在大肠杆菌中表达产生了埃博霉素C和D，但产量只是LC-MS刚能够检测到的水平。这些工作所面临的一个巨大的难题在于：埃博霉素对于非纤维堆囊菌宿主具有强烈的细胞毒活性，而埃博霉素的抗性机理不明确，相关基因没有找到，使得异源表达产量较低；
4.在埃博霉素的分离纯化过程中，遇到的另一个问题是同系物过多，例如So ce90菌株在发酵过程中可以产生接近50种结构类似的埃博霉素，其中，只有少数是具备较好活性可以被开发成为药物。
所以，目前对于埃博霉素生物合成的各种尝试，要解决的核心问题均在于如何提高产量，降低成本，实现工业化的大规模生物制备。
一般认为，粘细菌是一类嗜中性pH的细菌，其生长pH范围一般在6.5-8.0。在伯杰细菌鉴定手册(第八版)中，纤维堆囊菌的最适生长pH被定为6.8-7.2(此时该菌被命名为纤维多囊菌，Polyangium cellulosum)；在原核生物(III)一书中，推荐的纤维堆囊菌的培养条件(如VY/2培养基)均为中性pH(一般为pH7.2)；在伯杰细菌***学手册(第二版)中，认为纤维堆囊菌可以忍受较低的pH培养条件(5.8-6.2)。从微生物生态角度出发，人们从少数偏酸性环境(pH 3.7、5.0甚至2.5)中分离得到了部分种类的粘细菌，如粘球菌(Myxococcus)，珊瑚球菌(Corallococcus)和多囊菌(Polyangium)等。在碱性环境下，只是在pH8.1-8.2的环境样品中分离得到了粘球菌(Myxococcusfulvus和Myxococcus stipitatus)，没有鉴定它们是否能在碱性环境下生长。同时，在弱碱性环境中(pH 7.9-8.1)也可检测到囊球菌(Angiococcus disclformis)的存在。但是，关于耐碱纤维堆囊菌未见任何报道。
利用耐碱纤维堆囊菌作为发酵菌株，可以克服现有技术方法的一些弊端，实现埃博霉素的高产。然而经过文献和专利的检索，国内外利用这一思路的相关技术和方法至今未见文献或专利报道。
参考文献：
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发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株可高产埃博霉素的耐碱纤维堆囊菌菌株及其在制备埃博霉素中的应用。利用本发明所述菌株可有效地发酵合成埃博霉素类化合物，缩短发酵周期，减少杂菌污染，提高发酵产量并且减少同系物的产生，实现通过微生物发酵法获高效制备埃博霉素的愿望。
本发明所述高产埃博霉素的耐碱纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)是分离纯化自云南程海湖岸边土壤样品并经随后的选育获得的纤维堆囊菌菌株So0157-2，该菌株已于2008年5月27日保藏于“中国典型培养物保藏中心(CCTCC)”，其保藏编号为：CCTCCNO：M 208078。
上述耐碱纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078的生物学特征是：革兰氏阴性好氧细菌，营养细胞为较硬的短杆状6-7×1-1.2μm，两端钝圆(图1-A)，在固体表面能够进行典型的滑动运动(A和S运动)(图1-B)，并且能够利用纤维素类底物作为唯一碳源进行生长(图1-C)，最是生长温度为28-32℃。该菌株可以在pH 5-14的培养条件下生长(图2)，是一株耐碱(兼性嗜碱)细菌。随着培养条件(主要是pH)的不同，其细胞行为和形态特征发生明显变化。在pH值为7.0-8.0时，在仅含滤纸的无机盐培养基(CNST培养基)上，营养细胞在生长初期表现出强烈的扩展能力(图1-D)，菌落边缘呈淡黄色，细胞扩展接触到的滤纸几乎完全降解，而比邻的细胞未接触到的滤纸纤维保持完整。到培养后期，营养细胞在菌落中央堆积形成类似子实体的细胞堆(图1-E)，呈现淡粉色，但没有成熟的子实体出现。在pH值为9.0-12.0时，在仅含滤纸的无机盐培养基(CNST培养基)上，营养细胞同样表现出很强的扩展能力，并且在培养后期，当细胞接触到的滤纸被利用殆尽时，细胞的生长也就停止了，并进入后续的分化发育阶段，能形成典型的橙色子实体结构(图1-F)。其子实体为许多小孢囊的堆积产物，孢囊为球形(图1-G)，直径20-30μm，孢囊堆外没有粘液包被，孢囊内有大量粘孢子(图1-H)存在，形状与营养细胞类似，大小为2-3×1μm，将其置于无菌蒸馏水中55℃水浴加热处理10min，接种培养平板(CNST培养基)，能观察到孢子的萌发并形成细胞堆团(图1-I)，证明是具有抗逆性状的成熟粘孢子。
本发明所述菌株耐碱纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M208078的G+C含量为69.31mol％，测定16S rRNA的基因序列的结果显示，其基因序列长度为1555bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
通过使用美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)BLASTN程序比对，本发明的CCTCC NO：M 208078菌株16S rRNA的基因序列与NCBI注册的多株纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)16S rRNA的基因序列具有较高的同源性(98-99％)。进一步通过绘制进化树(图3)进行***发生分析发现，虽然本发明的CCTCCNO：M 208078菌株应当归类为纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)，但是其与其它纤维堆囊菌菌株的进化距离均大于2.0％，例如与Sorangium cellulosum Soce26的进化距离为2.8％，与Sorangium cellulosum So9741的进化距离为4.3％，同时考虑到该菌株的耐碱生长特性，判定本发明的耐碱纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078菌株可能是纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)的一个新类别。
上述用于菌体形态观察和生长分析的培养基组成：KNO3 0.5g/L，Na2HPO4 0.25g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，FeCl3 0.01g/L，琼脂1.6％，直径6厘米圆形滤纸一张，TE溶液1.0ml/L，视要求调至不同pH；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 220mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L。
上述形态特征观测的实验方法参考Garrity GM，et al.Bergey’s Manual ofSystematic Bacteriology(2nd edition)，2001，2，1132-1136。
上述16s rRNA基因***发生分析方法参考C.
et al.The correlationbetween morphological and phylogenetic classification of myxobacterial，Int.J.Syst.Bacteriol.1999，49，1255-1262。
本发明所述高产埃博霉素的耐碱纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078菌种分离纯化和诱导驯化的基本方法是：
分离的土壤样品来自于云南省丽江市永胜县中部的程海湖岸边土壤，采样地海拔1503米，平均气温18.7℃，全年无霜，水质碱性(pH8.6)，光照充足，土壤样品pH为9.2风干备用。将无菌滤纸铺在CNST平板上，培养基pH为7.2，并添加了浓度为25μg/ml的过滤除菌放线菌酮，30℃正置培养，2天后每天在解剖镜下观察粘细菌的扩展情况，并挑接出现的粘细菌扩展摸至新鲜CNST培养基上培养纯化，此时将培养基pH调至10.0。30℃正置培养，5天后出现子实体结构，再将长出来的子实体接种到加有250ug/ml硫酸卡那霉素的WCX平板中已灭菌的大肠杆菌的菌线上，以除去大多数细菌，最后将群落边缘的纤维素堆囊菌转接到CNST(pH 10.0)平板的滤纸上，完成纯化。将平板上已成熟的纯化粘细菌子实体刮下，转到1.5×3cm大小的无菌滤纸上，再将滤纸放于无菌的菌种保藏管内，干燥保存。按照此流程，获得了能够产生埃博霉素的耐碱纤维堆囊菌0157作为后续菌种选育的出发菌株。
以一株产生埃博霉素的耐碱纤维堆囊菌0157为出发菌株，通过反复的固体-液体连续间隔培养进行菌株的诱导驯化。具体做法是：先将菌株在pH 9.0的固体CNST培养基上进行30℃倒置培养，7天后可观察到子实体形成，挑取菌落边缘较为新鲜的细胞接种于100ml体积的液体VY/2培养基，30℃，200rpm震荡培养5天，然后取10ml发酵液接种于90ml体积的液体VY/2培养基，30℃，200rpm震荡培养5天，再取10ml发酵液接种于90ml体积的液体VY/2培养基，30℃，200rpm震荡培养5天，完成一个诱导驯化的培养流程。将最后一次培养的发酵液1ml接种于pH 9.0的固体CNST培养基上进行30℃倒置培养，开始第二个培养流程。按照此方法重复多个流程，将获得的菌株进行摇瓶发酵，通过评估其生长状态和测定埃博霉素的产量筛选目的菌株，最终筛选获得高产埃博霉素的纤维堆囊菌菌株。
上述用于菌株分离和诱导驯化的CNST培养基组成为：KNO3 0.5g/L，Na2HPO4 0.25g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，FeCl3 0.01g/L，TE溶液1.0ml/L，琼脂16g/L，视要求调至不同pH；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 220mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L。
上述用于菌株纯化的WCX培养基组成为：CaCl2·2H2O 1.5g/L；琼脂16g/L；KOH调至pH7.0。灭菌后，按25μg/ml量加入过滤除菌的放线菌酮。倒制平板后，在培养基表面密集划线大肠杆菌活菌体作为粘细菌子实体形成的诱饵。大肠杆菌由LB培养基制备。
上述用于菌株诱导驯化的VY/2培养基组成为：活性酵母5g/L；CaCl2 0.8g/L；VB120.5μg/ml；pH 9.0。
本发明所述耐碱纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078在制备埃博霉素中的应用。
其中，所述应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用本发明所述纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，28-32℃条件下，静止培养96-168小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环将一个斜面的全部菌体刮下，接种于装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为35mm的摇床上，28-32℃培养72-120小时，得种子液；
(4)发酵培养：
摇瓶发酵：以10-20％的体积比的接种量，将种子液接种于装有80-120mL发酵培养基的500mL摇瓶中，28-32℃，转速为160-200转/分钟，摇瓶发酵168-288小时，当发酵液中菌体颜色由深变浅时，停止发酵；
5L发酵罐发酵：以15-25％的体积比的接种量将种子液接种于全自动磁力搅拌5升玻璃发酵罐中，自动监测发酵液溶氧、温度、pH值、搅拌转速，装液量3L，通风量1.0-2.0L/min，48小时内搅拌转速180-220rpm，48h以后搅拌转速控制在90-120rpm，通过自动流加5mol/L的KOH或HCl使pH值恒定在8.0-10.0；为了缩短菌体的生长期，尽早的进入次级代谢阶段，可以在发酵进行到25-35小时开始以1.8-2.2g/L的流速向培养基中补加葡萄糖来加速菌体生长，在发酵进行到65-75小时候停止流加葡萄糖；总的发酵时间为168-220小时，发酵过程中间隔定时取样测定发酵液中的埃博霉素浓度，当发酵液中埃博霉素浓度不再上升时，结束发酵；
(5)产物检测：取上述发酵液以100目筛砂芯漏斗过滤收集Amberl ite XAD-16大孔吸附树脂(Rohm and Haas公司)，树脂用2～4倍体积蒸馏水洗涤三次，自然干燥；将干燥后的发酵树脂用8～10倍体积甲醇振荡浸提；浸提结束后，弃树脂，甲醇浸提液定容；取200μl上述甲醇浸提液用0.22μm的微孔过滤膜过滤后作为高效液相色谱分析的样品，以高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)-质谱检测器(MS)联用测定发酵液中各种埃博霉素类化合物的种类(图4)和含量。
上述斜面培养基组成为：土豆淀粉8g/L，大豆蛋白胨2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏2g/L，MgSO4 1g/L，CaCL2 1g/L，TE溶液1.0ml/L，琼脂1.5％，pH 8.0；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述液体种子培养基组成：马铃薯淀粉2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨1g/L，玉米浆1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.15g/L，FeCl3-EDTA 0.02g/L，TE溶液1ml/L，HEPES 1％，Amberlite XAD-16大孔吸附树脂2％(v/v)，用氢氧化钾溶液调pH到8.0，121℃灭菌；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述发酵培养基的组成为：马铃薯淀粉4g/L，葡萄糖2g/L，蛋白胨4g/L，豆饼粉2g/L，脱脂奶粉1g/L，Na2HPO4 0.15g/L，K2HPO4 0.15g/L，MgSO4 1.5g/L，CaCl21.5g/L，FeCl3-EDTA 0.01g/L，Thr 5mg/L，VB12 1mg/L，初始pH调整到9.0。
上述的应用中，步骤(2)、(3)、(4)所述培养温度优选30℃±0.2℃。
上述的应用中，步骤(2)所述培养时间优选120小时。
上述的应用中，步骤(3)所述培养基用量优选40mL(250mL三角瓶)
上述的应用中，步骤(3)所述摇床的旋转转速优选200转/分钟。
上述的应用中，步骤(3)所述培养时间优选96小时。
上述的应用中，步骤(4)所述摇瓶发酵时种子液的接种量优选15％体积比。
上述的应用中，步骤(4)所述摇瓶发酵时发酵培养基用量优选100mL(500mL三角瓶)。
上述的应用中，步骤(4)所述摇瓶发酵时摇床的旋转转速优选180转/分钟。
上述的应用中，步骤(4)所述摇瓶发酵时培养时间优选216小时。
上述的应用中，步骤(4)所述5L发酵罐发酵时种子液的接种量优选20％体积比。
上述的应用中，步骤(4)所述5L发酵罐发酵时通风量优选1.5L/min。
上述的应用中，步骤(4)所述5L发酵罐发酵时48小时内的搅拌转速优选200转/分钟。
上述的应用中，步骤(4)所述5L发酵罐发酵时48小时后的搅拌转速优选100转/分钟。
上述的应用中，步骤(4)所述5L发酵罐发酵时发酵过程中的发酵液pH优选9.0±0.3。
上述的应用中，步骤(4)所述5L发酵罐发酵时发酵过程中流加葡萄糖的开始时间优选发酵进行到30小时。
上述的应用中，步骤(4)所述5L发酵罐发酵时发酵过程中流加葡萄糖的结束时间优选发酵进行到70小时。
上述的应用中，步骤(4)所述5L发酵罐发酵时发酵过程中流加葡萄糖的流速优选2.0g/L。
上述的应用中，步骤(4)所述5L发酵罐发酵时总发酵时间优选192小时。
上述发酵液中埃博霉素的种类和浓度按下述方法测定：
利用高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)-质谱检测器(MS)联用对于埃博霉素类化合物进行定性与定量分析。
HPLC分析条件：色谱柱为Shim-pack VP-ODS，4.6×250mm，4.60±0.3μm；上样量为10μl；流动相为甲醇和0.2％乙酸水溶液(65∶35，v∶v)；流速为1.0ml/min；柱温为28℃。
DAD检测条件：将检测波长为249nm，可以测定埃博霉素类化合物的滞留时间(Rt)，并同标准品进行对比用以初步定性：埃博霉素A的滞留时间为12.6分钟左右，埃博霉素B的流出时间为15.2分钟左右(图5A)。利用外标法，使用标准配绘制标准曲线，可以利用发酵液在249nm下的色谱图中相关化合物峰的面积对埃博霉素类化合物进行定量分析。同时，可以利用DAD检测器的全波长扫描功能，获取化合物的紫外谱图(UV Spectra)用来进一步定性：埃博霉素类化合物在200-400nm范围内均有两个吸收峰，峰1的λmax为210nm，logε＝4.17；峰2的λmax为249nm，logε＝3.97(图5B，C)。
MS检测条件：采用单极四极杆质谱，利用电喷雾源(ESI)与LC连接，测定埃博霉素类化合物的质谱谱图用来进行完全定性，分析条件为：ESI探针温度500℃；椎孔电压为30V；氮气流速为1ml/min；质量扫描范围m/z为100-1000，正离子模式。得到的谱图结果应当为：埃博霉素A的分子离子峰为[M+Na]+516m/Z(图5D)；埃博霉素B的分子离子峰为[M+Na]+530m/Z(图5E)。
本发明所述耐碱纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078可发酵生成目的埃博霉素(主要是埃博霉素A和B，图4A-B)，单位体积发酵液中埃博霉素产率高，菌种发酵性能稳定，不易发生杂菌污染，发酵周期短，且不产生埃博霉素C，D，E和F等同系物(图4C-D)，极大地降低了后续的分离提纯难度，是一株极具研究开发价值的埃博霉素生产菌株。
经实验证实：利用本发明所述耐碱纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078发酵，500ml三角瓶进行摇瓶发酵经过216小时埃博霉素A产量最高可达98mg/L以上，埃博霉素B产量最高可达52mg/L以上；5L发酵罐发酵经过196小时埃博霉素A产量最高可达117mg/L以上，埃博霉素B产量最高可达61mg/L以上。
本发明人未检索到有利用耐碱纤维堆囊菌以生产埃博霉素为目的产物的文献报道，也未检索到纤维囊菌产生埃博霉素与本发明所述耐碱纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078菌株相同的高产量、短周期及纯度高的文献报道。
附图说明
本发明提供的菌株纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2已于2008年5月27日保藏于“中国典型培养物保藏中心(CCTCC)”，保藏地址：武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮政编码：430072，其保藏编号为：CCTCC NO：M 208078。
图1示纤维堆囊菌CCTCC NO：M 208078的基本形态学特征。其中A图示CCTCC NO：M 208078菌株的营养细胞形态(×5000)；B图示CCTCC NO：M 208078菌株的细胞运动过程(×320)；C图示CCTCC NO：M 208078菌株细胞对于滤纸介质的降解能力(×5000)；D图示CCTCC NO：M 208078菌株在CNST培养基上的扩展情况(×6)；E图示CCTCC NO：M 208078菌株在pH 7的CNST培养基上形成的细胞堆团和菌落(×4)；F图示CCTCC NO：M 208078菌株在pH 9的CNST培养基上形成的子实体结构(×20)；G图示CCTCC NO：M208078菌株在pH 9的CNST培养基上形成的子实体结构中的小孢囊(×800)；H图示CCTCCNO：M 208078菌株在pH 9的CNST培养基上形成的子实体结构中的粘孢子(×5000)；I图示CCTCC NO：M 208078菌株的粘孢子重新萌发时形成的细胞堆团(×40)。
图2示纤维堆囊菌CCTCC NO：M 208078在pH 4-14的CNST培养基上30℃培养10天后的生长情况。
图3示基于16s rRNA基因数列绘制的进化树，表明了纤维堆囊菌CCTCC NO：M 208078与其它粘细菌的关系。标尺为进化距离单位，分支上的数字表示了从2000个样品中的支持嵌套数。
图4示几种主要的埃博霉素类化合物的化学结构。其中A图示埃博霉素A的化学结构；其中B图示埃博霉素B的化学结构；其中C图示埃博霉素C的化学结构；其中D图示埃博霉素D的化学结构；其中E图示埃博霉素E的化学结构；其中F图示埃博霉素F的化学结构。
图5示纤维堆囊菌CCTCC NO：M 208078发酵产物的HPLC-DAD-MS分析结果。其中图A示HPLC分析结果，检测波长为249nm，埃博霉素A的滞留时间为12.6分钟，埃博霉素B的滞留时间为15.2；图B示利用DAD检测器的全波长扫描功能获取的埃博霉素A的紫外谱图，在200-400nm范围内均有两个吸收峰(210nm和249nm)；图C示利用DAD检测器的全波长扫描功能获取的埃博霉素B的紫外谱图，在200-400nm范围内均有两个吸收峰(210nm和249nm)；图D示利用MS检测器测定埃博霉素A的质谱图，分子离子峰为[M+Na]+516.3m/Z；图D示利用MS检测器测定埃博霉素B的质谱图，分子离子峰为[M+Na]+530.3m/Z。
具体实施方式
实施例1利用诱导驯化获得高产埃博霉素的耐碱纤维堆囊菌菌株
出发菌株的分离和纯化：分离的土壤样品来自于云南省丽江市永胜县中部的程海湖岸边土壤，采样地海拔1503米，平均气温18.7℃，全年无霜，水质碱性(pH8.6)，光照充足，土壤样品pH为9.2风干备用。将无菌滤纸铺在CNST平板上，培养基pH为7.2，并添加了浓度为25μg/ml的过滤除菌放线菌酮，30℃正置培养，2天后每天在解剖镜下观察粘细菌的扩展情况，并挑接出现的粘细菌扩展摸至新鲜CNST培养基上培养纯化，此时将培养基pH调至10.0。30℃正置培养，5天后出现子实体结构，再将长出来的子实体接种到加有250ug/ml硫酸卡那霉素的WCX平板中已灭菌的大肠杆菌的菌线上，以除去大多数细菌，最后将群落边缘的纤维素堆囊菌转接到CNST(pH 10.0)平板的滤纸上，完成纯化。将平板上已成熟的纯化粘细菌子实体刮下，转到1.5×3cm大小的无菌滤纸上，再将滤纸放于无菌的菌种保藏管内，干燥保存。按照此流程，获得了能够产生埃博霉素的耐碱纤维堆囊菌0157作为后续菌种选育的出发菌株。
以一株产生埃博霉素的耐碱纤维堆囊菌0157为出发菌株，通过反复的固体-液体连续间隔培养进行菌株的诱导驯化。
具体做法是：先将菌株在pH 9.0的固体CNST培养基斜面上进行30℃倒置培养，7天后可观察到子实体形成，挑取菌落边缘较为新鲜的细胞接种于100ml体积的液体VY/2培养基(500ml三角瓶)，30℃，200rpm震荡培养5天，然后取10ml发酵液接种于90ml体积的液体VY/2培养基(500ml三角瓶)，30℃，200rpm震荡培养5天，再取10ml发酵液接种于90ml体积的液体VY/2培养基(500ml三角瓶)，30℃，200rpm震荡培养5天，完成一个诱导驯化的培养流程。将最后一次培养的发酵液1ml接种于pH 9.0的固体CNST培养基(9cm平板)上进行30℃倒置培养，7天后可观察到子实体形成，挑取菌落边缘较为新鲜的细胞接种于100ml体积的液体VY/2培养基(500ml三角瓶)，30℃，200rpm震荡培养5天，然后取10ml发酵液接种于90ml体积的液体VY/2培养基(500ml三角瓶)，30℃，200rpm震荡培养5天，再取10ml发酵液接种于90ml体积的液体VY/2培养基(500ml三角瓶)，30℃，200rpm震荡培养5天，完成一个诱导驯化的培养流程。将最后一次培养的发酵液1ml接种于pH 9.0的固体CNST培养基(9cm平板)上进行30℃倒置培养，开始第三个培养流程。按照此方法重复多个流程，将获得的菌株进行摇瓶发酵，通过评估其生长状态和测定埃博霉素的产量筛选目的菌株。
初始0157菌株埃博霉素A的产量为9.2mg/L，埃博霉素B的产量为2.7mg/L；进行了第10个驯化流程后，获得菌株0157-1-10埃博霉素A的产量为15.9mg/L，埃博霉素B的产量为8.3mg/L；直到进行了21个诱导驯化流程后，测定发现菌株的发酵速率大大加快，埃博霉素产量明显增高，最终发明人从中筛选获得了一株高产埃博霉素的纤维堆囊菌菌株So0157-2，其埃博霉素A的产量为30mg/L以上，埃博霉素B的产量为12mg/L以上，进行后续诱导驯化流程并没有使菌株的埃博霉素产生能力再次提高；所述菌株So0157-2已于2008年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为：纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078。
上述耐碱纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078的生物学特征是：革兰氏阴性好氧细菌，营养细胞为较硬的短杆状6-7×1-1.2μm，两端钝圆(图1-A)，在固体表面能够进行典型的滑动运动(A和S运动)(图1-B)，并且能够利用纤维素类底物作为唯一碳源进行生长(图1-C)，最是生长温度为28-32℃。该菌株可以在pH 5-14的培养条件下生长(图2)，是一株耐碱(兼性嗜碱)细菌。随着培养条件(主要是pH)的不同，其细胞行为和形态特征发生明显变化。在pH值为7.0-8.0时，在仅含滤纸的无机盐培养基(CNST培养基)上，营养细胞在生长初期表现出强烈的扩展能力(图1-D)，菌落边缘呈淡黄色，细胞扩展接触到的滤纸几乎完全降解，而比邻的细胞未接触到的滤纸纤维保持完整。到培养后期，营养细胞在菌落中央堆积形成类似子实体的细胞堆(图1-E)，呈现淡粉色，但没有成熟的子实体出现。在pH值为9.0-12.0时，在仅含滤纸的无机盐培养基(CNST培养基)上，营养细胞同样表现出很强的扩展能力，并且在培养后期，当细胞接触到的滤纸被利用殆尽时，细胞的生长也就停止了，并进入后续的分化发育阶段，能形成典型的橙色子实体结构(图1-F)。其子实体为许多小孢囊的堆积产物，孢囊为球形(图1-G)，直径20-30μm，孢囊堆外没有粘液包被，孢囊内有大量粘孢子(图1-H)存在，形状与营养细胞类似，大小为2-3×1μm，将其置于无菌蒸馏水中55℃水浴加热处理10min，接种培养平板(CNST培养基)，能观察到孢子的萌发并形成细胞堆团(图1-I)，证明是具有抗逆性状的成熟粘孢子。
上述用于菌株分离和诱导驯化的CNST培养基组成为：KNO3 0.5g/L，Na2HPO4 0.25g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，FeCl3 0.01g/L，TE溶液1.0ml/L，琼脂1.6％，视要求调至不同pH；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L。
上述用于菌株纯化的WCX培养基组成为：CaCl2·2H2O 0.15％；琼脂1.6％；KOH调至pH7.0。灭菌后，按25μg/ml量加入过滤除菌的放线菌酮。倒制平板后，在培养基表面密集划线大肠杆菌活菌体作为粘细菌子实体形成的诱饵。大肠杆菌由LB培养基制备。
上述用于菌株诱导驯化的VY/2培养基组成为：活性酵母0.5％；CaCl2 0.08％；VB120.5μg/ml；pH 9.0。
实施例2纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078菌株16S rRNA基因的测序
将实施例1诱导驯化得到的高产埃博霉素的耐碱纤维堆囊菌So0157-2，即CCTCC NO：M 208078菌株委托上海生工生物工程技术服务有限公司(Shanghai Sangon BiologicalEngineering Technology and Service Co.，Ltd.)进行16S rRNA基因测序。
实验方法是：将CCTCC NO：M 208078菌株的菌体用转瓶打匀，离心，并用STE溶液悬浮(大约每0.1g菌体用0.5ml STE溶液悬浮)；将0.5ml菌体加入5ml的离心管中，用振荡器混匀，加400μl 10％SDS，30μl 20mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，37℃保温1小时；加0.4ml 5M NaCl，混匀后静置10分钟，然后加0.4ml CTAB/NaCl，混匀，65℃保温20分钟；取出离心管并用等体积(2.4ml)的酚-氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提0.5-1小时，7000rpm离心10min，上清转至干净的离心管；重复上述氯仿/异戊醇抽提，7000rpm离心10min。将上清转至干净的离心管；加入2倍体积的无水乙醇(或1倍体积的异丙醇)，颠倒混匀，室温静置10分钟，5000rpm离心20min，弃上清；稍稍空干后，将DNA溶于500μl SSC液(SSC液的制备：1.5ml的Eppendorf管中，加入50μl 的20×SSC液、950μl的ddH2O，混匀)中，加入2％体积RNA酶(1mg/ml，终浓度至50μg/ml-10μg/ml)，37℃水浴作用1-2小时；加入等体积的氯仿/异戊醇抽提，30min。7000rpm离心10min。将上清转至干净的Eppendorf管；加入1/10体积3M NaAc，2倍体积的无水乙醇(或1倍体积的异丙醇)，5000rpm离心20min；去上清，用70％乙醇洗涤，5000rpm离心10min，室温干燥至乙醇完全挥发，将染色体DNA溶于80-100μlddH2O中，-20℃保存。
提取的基因组DNA进行电泳检测及浓度纯度分析：取3μl DNA样品进行琼脂糖电泳检测，使用0.8％的琼脂糖凝胶，每厘米电压不超过2伏。
利用PCR方法扩增菌株16S rRNA基因序列，并对基因进行序列测定：要求染色体DNA模板长度大于20kb，25μl体系模板量为10-100ng左右；所用引物为细菌16S rRNA基因通用扩增引物GAGTTTGATCCTGGCTCAG (F引物)和AGAAAGGAGGTGATCC AGCC(R引物)反应体系为：
反应过程：
96℃，3min
72℃，10min
4℃，hold
取PCR反应产物5μl进行电泳检测，0.8％的琼脂糖凝胶，100V电泳。所得PCR产物用Omega Gel extraction kit切胶回收测序，测序引物F和R。
测定16S rRNA的基因序列的结果显示，其基因序列长度为1555bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
通过使用美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)BLASTN程序比对，本发明的CCTCC NO：M 208078菌株16S rRNA的基因序列与NCBI注册的多株纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)16S rRNA的基因序列具有较高的同源性(98-99％)。进一步通过绘制进化树(图3)进行***发生分析发现，虽然本发明的CCTCCNO：M 208078菌株应当归类为纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)，但是其与其它纤维堆囊菌菌株的进化距离均大于2.0％，例如与Sorangium cellulosum Soce26的进化距离为2.8％，与Sorangium cellulosum So9741的进化距离为4.3％，同时考虑到该菌株的耐碱生长特性，判定本发明的CCTCC NO：M 208078菌株可能是纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)的一个新类别。
上述16s rRNA基因***发生分析方法参考C.
et al.The correlationbetween morphological and phylogenetic classification of myxobacterial，Int.J.Syst.Bacteriol.1999，49，1255-1262.
实施例3纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078在制备埃博霉素中的应用
(1)菌种选择：选用本发明所述纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCCNO：M 208078；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，32℃条件下，静止培养96小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环将一个斜面的全部菌体刮下，接种于50mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为180转/分钟、旋转半径为35mm的摇床上，32℃培养72小时，得种子液；
(4)发酵培养：
摇瓶发酵：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于装有120mL(500mL三角瓶)发酵培养基的摇瓶中，32℃，转速为160转/分钟，摇瓶发酵168小时，当发酵液中菌体颜色由深变浅时，停止发酵；
(5)产物检测：取上述发酵液以100目筛砂芯漏斗过滤收集Amberlite XAD-16大孔吸附树脂(Rohm and Haas公司)，树脂用3倍体积蒸馏水洗涤三次，自然干燥。将干燥后的发酵树脂用10倍体积甲醇振荡浸提。浸提结束后，弃树脂，甲醇浸提液定容。取200μl上述甲醇浸提液用0.22μm的微孔过滤膜过滤后作为高效液相色谱分析的样品，利用高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)-质谱检测器(MS)联用测定发酵液中埃博霉素A的含量为62mg/L，埃博霉素B的含量为27mg/L。
上述斜面培养基组成为：土豆淀粉8g/L，大豆蛋白胨2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏2g/L，MgSO4 1g/L，CaCL2 1g/L，TE溶液1.0ml/L，琼脂15g/L，pH 8.0；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl220mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述液体种子培养基组成：马铃薯淀粉2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨1g/L，玉米浆1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.15g/L，FeCl3-EDTA 0.02g/L，TE溶液1ml/L，HEPES 1％，Amberl ite XAD-16大孔吸附树脂2％(v/v)，用氢氧化钾溶液调pH到8.0，121℃灭菌；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl220mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述发酵培养基的组成为：马铃薯淀粉4g/L，葡萄糖2g/L，蛋白胨4g/L，豆饼粉2g/L，脱脂奶粉1g/L，Na2HPO4 0.15g/L，K2HPO4 0.15g/L，MgSO4 1.5g/L，CaCl21.5g/L，FeCl3-EDTA 0.01g/L，Thr 5mg/L，VB12 1mg/L，初始pH调整到9.0。
实施例4纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078在制备埃博霉素中的应用
(1)菌种选择：选用本发明所述纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCCNO：M 208078；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，28℃条件下，静止培养168小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环将一个斜面的全部菌体刮下，接种于30mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为220转/分钟、旋转半径为35mm的摇床上，28℃培养100小时，得种子液；
(4)发酵培养：
摇瓶发酵：以20％的体积比的接种量，将种子液接种于装有100mL(500mL三角瓶)发酵培养基的摇瓶中，28℃，转速为200转/分钟，摇瓶发酵288小时，当发酵液中菌体颜色由深变浅时，停止发酵；
(5)产物检测：取上述发酵液以100目筛砂芯漏斗过滤收集Amberlite XAD-16大孔吸附树脂(Rohm and Haas公司)，树脂用3倍体积蒸馏水洗涤三次，自然干燥。将干燥后的发酵树脂用10倍体积甲醇振荡浸提。浸提结束后，弃树脂，甲醇浸提液定容。取200μl上述甲醇浸提液用0.22μm的微孔过滤膜过滤后作为高效液相色谱分析的样品，利用高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)-质谱检测器(MS)联用测定发酵液中埃博霉素A的含量为79.5mg/L，埃博霉素B的含量为46mg/L。
上述斜面培养基组成为：土豆淀粉8g/L，大豆蛋白胨2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏2g/L，MgSO4 1g/L，CaCL2 1g/L，TE溶液1.0ml/L，琼脂1.5％，pH 8.0；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述液体种子培养基组成：马铃薯淀粉2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨1g/L，玉米浆1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.15g/L，FeCl3-EDTA 0.02g/L，TE溶液1ml/L，HEPES 1％，Amberlite XAD-16大孔吸附树脂2％(v/v)，用氢氧化钾溶液调pH到8.0，121℃灭菌；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述发酵培养基的组成为：马铃薯淀粉4g/L，葡萄糖2g/L，蛋白胨4g/L，豆饼粉2g/L，脱脂奶粉1g/L，Na2HPO4 0.15g/L，K2HPO4 0.15g/L，MgSO4 1.5g/L，CaCl21.5g/L，FeCl3-EDTA 0.01g/L，Thr 5mg/L，VB12 1mg/L，初始pH调整到9.0。
实施例5纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078在制备埃博霉素中的应用
(1)菌种选择：选用本发明所述纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCCNO：M 208078；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，30℃条件下，静止培养120小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环将一个斜面的全部菌体刮下，接种于40mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为200转/分钟、旋转半径为35mm的摇床上，30℃培养96小时，得种子液；
(4)发酵培养：
摇瓶发酵：以15％的体积比的接种量，将种子液接种于装有100mL(500mL三角瓶)发酵培养基的摇瓶中，30℃，转速为180转/分钟，摇瓶发酵216小时，当发酵液中菌体颜色由深变浅时，停止发酵；
(5)产物检测：取上述发酵液以100目筛砂芯漏斗过滤收集Amberlite XAD-16大孔吸附树脂(Rohm and Haas公司)，树脂用3倍体积蒸馏水洗涤三次，自然干燥。将干燥后的发酵树脂用10倍体积甲醇振荡浸提。浸提结束后，弃树脂，甲醇浸提液定容。取200μl上述甲醇浸提液用0.22μm的微孔过滤膜过滤后作为高效液相色谱分析的样品，利用高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)-质谱检测器(MS)联用测定发酵液中埃博霉素A的含量为98mg/L，埃博霉素B的含量为52mg/L。
上述斜面培养基组成为：土豆淀粉8g/L，大豆蛋白胨2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏2g/L，MgSO4 1g/L，CaCL2 1g/L，TE溶液1.0ml/L，琼脂1.5％，pH 8.0；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI20mg/L；
上述液体种子培养基组成：马铃薯淀粉2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨1g/L，玉米浆1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.15g/L，FeCl3-EDTA 0.02g/L，TE溶液1ml/L，HEPES 1％，Amberlite XAD-16大孔吸附树脂2％(v/v)，用氢氧化钾溶液调pH到8.0，121℃灭菌；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述发酵培养基的组成为：马铃薯淀粉4g/L，葡萄糖2g/L，蛋白胨4g/L，豆饼粉2g/L，脱脂奶粉1g/L，Na2HPO4 0.15g/L，K2HPO4 0.15g/L，MgSO4 1.5g/L，CaCl21.5g/L，FeCl3-EDTA 0.01g/L，Thr 5mg/L，VB12 1mg/L，初始pH调整到9.0。
实施例6纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078在制备埃博霉素中的应用
(1)菌种选择：选用本发明所述纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCCNO：M 208078；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，32℃条件下，静止培养96小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环将一个斜面的全部菌体刮下，接种于50mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为180转/分钟、旋转半径为35mm的摇床上，32℃培养72小时，得种子液；
(4)发酵培养：
5L发酵罐发酵：以15％接种量将种子培养液接种于全自动磁力搅拌5升玻璃发酵罐中，自动监测发酵液溶氧、温度、pH值、搅拌转速。装液量3L，通风量1.0L/min，48小时内搅拌转速180rpm，48h以后搅拌转速控制在90rpm，通过自动流加5mol/L的KOH或HCl使pH值恒定在8.0。总的发酵时间为168小时，发酵过程中间隔定时取样测定发酵液中的埃博霉素浓度，当发酵液中埃博霉素浓度不再上升时，结束发酵；
(5)产物检测：取上述发酵液以100目筛砂芯漏斗过滤收集Amberlite XAD-16大孔吸附树脂(Rohm and Haas公司)，树脂用3倍体积蒸馏水洗涤三次，自然干燥。将干燥后的发酵树脂用10倍体积甲醇振荡浸提。浸提结束后，弃树脂，甲醇浸提液定容。取200μl上述甲醇浸提液用0.22μm的微孔过滤膜过滤后作为高效液相色谱分析的样品，利用高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)-质谱检测器(MS)联用测定发酵液中埃博霉素A的含量为57mg/L，埃博霉素B的含量为26mg/L。
上述斜面培养基组成为：土豆淀粉8g/L，大豆蛋白胨2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏2g/L，MgSO4 1g/L，CaCL2 1g/L，TE溶液1.0ml/L，琼脂1.5％，pH 8.0；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述液体种子培养基组成：马铃薯淀粉2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨1g/L，玉米浆1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.15g/L，FeCl3-EDTA 0.02g/L，TE溶液1ml/L，HEPES 1％，Amberlite XAD-16大孔吸附树脂2％(v/v)，用氢氧化钾溶液调pH到8.0，121℃灭菌；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述发酵培养基的组成为：马铃薯淀粉4g/L，葡萄糖2g/L，蛋白胨4g/L，豆饼粉2g/L，脱脂奶粉1g/L，Na2HPO4 0.15g/L，K2HPO4 0.15g/L，MgSO4 1.5g/L，CaCl21.5g/L，FeCl3-EDTA 0.01g/L，Thr 5mg/L，VB12 1mg/L，初始pH调整到9.0。
实施例7纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078在制备埃博霉素中的应用
(1)菌种选择：选用本发明所述纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCCNO：M 208078；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，28℃条件下，静止培养168小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环将一个斜面的全部菌体刮下，接种于30mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为220转/分钟、旋转半径为35mm的摇床上，28℃培养120小时，得种子液；
(4)发酵培养：
5L发酵罐发酵：以25％接种量将种子培养液接种于全自动磁力搅拌5升玻璃发酵罐中，自动监测发酵液溶氧、温度、pH值、搅拌转速。装液量3L，通风量2.0L/min，48小时内搅拌转速220rpm，48h以后搅拌转速控制在120rpm，通过自动流加5mol/L的KOH或HCl使pH值恒定在10.0。为了缩短菌体的生长期，尽早的进入次级代谢阶段，可以在发酵进行到25小时开始以2.2g/L的流速向培养基中补加葡萄糖来加速菌体生长，在发酵进行到75小时候停止流加葡萄糖。总的发酵时间为220小时，发酵过程中间隔定时取样测定发酵液中的埃博霉素浓度，当发酵液中埃博霉素浓度不再上升时，结束发酵；
(5)产物检测：取上述发酵液以100目筛砂芯漏斗过滤收集Amberlite XAD-16大孔吸附树脂(Rohm and Haas公司)，树脂用3倍体积蒸馏水洗涤三次，自然干燥。将干燥后的发酵树脂用10倍体积甲醇振荡浸提。浸提结束后，弃树脂，甲醇浸提液定容。取200μl上述甲醇浸提液用0.22μm的微孔过滤膜过滤后作为高效液相色谱分析的样品，利用高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)-质谱检测器(MS)联用测定发酵液中埃博霉素A的含量为91mg/L，埃博霉素B的含量为53mg/L。
上述斜面培养基组成为：土豆淀粉8g/L，大豆蛋白胨2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏2g/L，MgSO4 1g/L，CaCL2 1g/L，TE溶液1.0ml/L，琼脂1.5％，pH 8.0；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述液体种子培养基组成：马铃薯淀粉2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨1g/L，玉米浆1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.15g/L，FeCl3-EDTA 0.02g/L，TE溶液1ml/L，HEPES 1％，Amberlite XAD-16大孔吸附树脂2％(v/v)，用氢氧化钾溶液调pH到8.0，121℃灭菌；其中TE溶液的组成为MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述发酵培养基的组成为：马铃薯淀粉4g/L，葡萄糖2g/L，蛋白胨4g/L，豆饼粉2g/L，脱脂奶粉1g/L，Na2HPO4 0.15g/L，K2HPO4 0.15g/L，MgSO4 1.5g/L，CaCl21.5g/L，FeCl3-EDTA 0.01g/L，Thr 5mg/L，VB12 1mg/L，初始pH调整到9.0。
实施例8纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078在制备埃博霉素中的应用
(1)菌种选择：选用本发明所述纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCCNO：M 208078；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，30℃条件下，静止培养120小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环将一个斜面的全部菌体刮下，接种于40mL(250mL三角瓶)液体种子培养基中，置旋转转速为200转/分钟、旋转半径为35mm的摇床上，30℃培养96小时，得种子液；
(4)发酵培养：
5L发酵罐发酵：以20％接种量将种子培养液接种于全自动磁力搅拌5升玻璃发酵罐中，自动监测发酵液溶氧、温度、pH值、搅拌转速。装液量3L，通风量1.5L/min，48小时内搅拌转速200rpm，48h以后搅拌转速控制在100rpm，通过自动流加5mol/L的KOH或HCl使pH值恒定在9.0。为了缩短菌体的生长期，尽早的进入次级代谢阶段，可以在发酵进行到30小时开始以2.0g/L的流速向培养基中补加葡萄糖来加速菌体生长，在发酵进行到70小时候停止流加葡萄糖。总的发酵时间为192小时，发酵过程中间隔定时取样测定发酵液中的埃博霉素浓度，当发酵液中埃博霉素浓度不再上升时，结束发酵；
(5)产物检测：取上述发酵液以100目筛砂芯漏斗过滤收集Amberlite XAD-16大孔吸附树脂(Rohm and Haas公司)，树脂用3倍体积蒸馏水洗涤三次，自然干燥。将干燥后的发酵树脂用10倍体积甲醇振荡浸提。浸提结束后，弃树脂，甲醇浸提液定容。取200μl上述甲醇浸提液用0.22μm的微孔过滤膜过滤后作为高效液相色谱分析的样品，以高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)-质谱检测器(MS)联用测定发酵液中埃博霉素A的含量为117mg/L，埃博霉素B的含量为61mg/L。
上述斜面培养基组成为：土豆淀粉0.8％，大豆蛋白胨0.2％，葡萄糖0.2％，酵母膏0.2％，MgSO40.1％，CaCL20.1％，TE溶液1.0ml/L，琼脂1.5％，pH 8.0；
上述液体种子培养基组成：马铃薯淀粉0.2％，葡萄糖0.2％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.1％，玉米浆0.1％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.15％，FeCl3-EDTA 0.002％，TE溶液1ml/L，HEPES 1％，Amberlite XAD-16大孔吸附树脂2％(v/v)，用氢氧化钾溶液调pH到8.0，121℃灭菌；
上述发酵培养基的组成为：马铃薯淀粉0.4％，葡萄糖0.2％，蛋白胨0.4％，豆饼粉0.2％，脱脂奶粉0.1％，Na2HPO4 0.015％，K2HPO4 0.015％，MgSO4 0.15％，CaCl2 0.15％，FeCl3-EDTA0.001％，Thr 5mg/L，VB12 1mg/L，初始pH调整到9.0。
上述实施例所述埃博霉素的种类和浓度按下述方法测定：
利用高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)-质谱检测器(MS)联用对于埃博霉素类化合物进行定性与定量分析。
HPLC分析条件：色谱柱为Shim-pack VP-ODS，4.6×250mm，4.60±0.3μm；上样量为10μl；流动相为甲醇和0.2％乙酸水溶液(65∶35，v∶v)；流速为1.0ml/min；柱温为28℃。
DAD检测条件：将检测波长为249nm，可以测定埃博霉素类化合物的滞留时间(Rt)，并同标准品进行对比用以初步定性：埃博霉素A的滞留时间为12.6分钟左右，埃博霉素B的流出时间为15.2分钟左右(图5A)。利用外标法，使用标准配绘制标准曲线，线性回归方程为：
埃博霉素A的浓度＝1.31471×10-7×埃博霉素A的峰面积R2＝0.998528
埃博霉素B的浓度＝1.23976×10-7×埃博霉素B的峰面积R2＝0.994916
从而可以利用发酵液在249nm下的色谱图中相关化合物峰的面积对埃博霉素类化合物进行定量分析。
同时，可以利用DAD检测器的全波长扫描功能，获取化合物的紫外谱图(UV Spectra)用来进一步定性：埃博霉素类化合物在200-400nm范围内均有两个吸收峰，峰1的λmax为210nm，log＝4.17；峰2的λmax为249nm，logε＝3.97(图5B，C)。
MS检测条件：采用单极四极杆质谱，利用电喷雾源(ESI)与LC连接，测定埃博霉素类化合物的质谱谱图用来进行完全定性，分析条件为：ESI探针温度500℃；椎孔电压为30V；氮气流速为1ml/min；质量扫描范围m/z为100-1000，正离子模式。
得到的谱图结果应当为：埃博霉素A的分子离子峰为[M+Na]+516.3m/Z(图5D)；埃博霉素B的分子离子峰为[M+Na]+530.3m/Z(图5E)。
序列表
<110>山东大学
<120>一株耐碱纤维堆囊菌及其在制备埃博霉素中的应用
<141>2008-9-21
<160>1
<210>1
<211>1555
<212>DNA
<213>纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)
<221>纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC NO：M 208078
16S rRNA基因
<222>(1)…(1555)
<400>1
gagtttgatc ctggctcaga acgaacgtta gcggcgcgct taacacatgc aagtcgagcg 60
agaaagggct tcggccccgg taaagcggcg cacgggtgag taacacgtag gtaatctgcc 120
cccaggtggt ggataacgtt ccgaaaggag cgctaataca gcatgagacc acgtcttcga 180
aagaggatga ggtcaaagcc ggcctcttca cgaaagctgg cgccagggga tgagcctgcg 240
gcccatcagc tagttggtag ggtaatggcc taccaaggcg aagacgggta gctggtctga 300
gaggatgatc agccacactg gaactgagac acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt 360
ggggaatctt gcgcaatggg cgaaagcctg acgcagcgac gccgcgtgag tgatgaaggc 420
cttcgggttg taaagctctg tggaggggga cgaataaggg ttggctaaca tccagctcga 480
tgacggtacc cctttagcaa gcacccggct aactttgtcc caccagccgc ggtaagacag 540
agggtgcaaa cgttgttcgg aattactggg cgtaaagcgc atgtagccgg tttcgtaaag 600
tcaaaatgtg aaagcccctg ggcttaaccc aggaagtgca tttgaaactc acgaactcga 660
gtcccggaga ggaaggcgga attctcggtg tagaggtgaa attcgtagat atcgagagga 720
acatcggtgg cgaaggcggc cttctggacg gtgactgacg ctgagatgcg aaagcgtggg 780
gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgggtg ctaggtgtcg 840
cgggctttga ctcctgcggt gccgtagcta acgcattaag caccccgcct ggggagtacg 900
gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 960
ttcaattcga cgcaacgcgc agaaccttac ctgggctaga aaatgcagga acctggttga 1020
aagatcgggg tgctcttcgg agaacctgta gttaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 1080
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccctatcgtt agttgccagc 1140
ggttcggccg ggcactctag cgagactgcc gatatttaaa tcggaggaag gtggggatga 1200
cgtcaagtcc tcatggccct tatgtccagg gctacacacg tgctacaatg ggcggtacag 1260
acggtcgcga acccgcgagg ggaagccaat ccgaaaaaac cgtcctcagt acggataaga 1320
gtctgcaact cgactctttg aagttggaat cgctagtaat ccctgatcag caggcagggg 1380
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtc gattgctcca 1440
gaagtggctg cgccaacccg caagggaggc aggcccccaa ggagtggttg gtaactgggg 1500
tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggggaa cctgcggctg gatcacctcc tttct 1555
Claims (8)
1.一株耐碱纤维堆囊菌，其特征在于：该菌株名为纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2，该菌株已于2008年5月27日保藏于“中国典型培养物保藏中心(CCTCC)”，其保藏编号为：CCTCC NO：M 208078。
2.如权利要求1所述的耐碱纤维堆囊菌，其生物学特征是：革兰氏阴性好氧细菌，营养细胞为较硬的短杆状6-7×1-1.2μm，两端钝圆；在固体表面能够进行典型的滑动运动，并且能够利用纤维素类底物作为唯一碳源进行生长，最适生长温度为28-32℃；该菌株能在pH 5-14的培养条件下生长，是一株耐碱细菌，即兼性嗜碱细菌；随着培养条件的不同，其细胞行为和形态特征发生明显变化，在pH值为7.0-8.0时，在仅含滤纸的无机盐培养基上，营养细胞在生长初期表现出强烈的扩展能力，菌落边缘呈淡黄色，细胞扩展接触到的滤纸几乎完全降解，而比邻的细胞未接触到的滤纸纤维保持完整；到培养后期，营养细胞在菌落中央堆积形成类似子实体的细胞堆，呈现淡粉色，但没有成熟的子实体出现；在pH值为9.0-12.0时，在仅含滤纸的无机盐培养基上，营养细胞同样表现出很强的扩展能力，并且在培养后期，当细胞接触到的滤纸被利用殆尽时，细胞的生长也就停止了，并进入后续的分化发育阶段，能形成典型的橙色子实体结构；其子实体为许多小孢囊的堆积产物，孢囊为球形，直径20-30μm，孢囊堆外没有粘液包被，孢囊内有大量粘孢子存在，形状与营养细胞类似，大小为2-3×1μm，将其置于无菌蒸馏水中55℃水浴加热处理10min，接种培养平板，能观察到孢子的萌发，证明是具有抗逆性状的成熟粘孢子；所述菌株的G+C含量为69.31mol％；16S rRNA的基因序列长度为1555 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述耐碱纤维堆囊菌在制备埃博霉素中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2 CCTCC NO：M208078；
(2)斜面培养活化：将菌种接种于斜面培养基，28-32℃条件下，静止培养96-168小时，备用；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环将一个斜面的全部菌体刮下，接种于装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为35mm的摇床上，28-32℃培养72-120小时，得种子液；
(4)发酵培养：
摇瓶发酵：以10-20％的体积比的接种量，将种子液接种于装有80-120mL发酵培养基的500mL摇瓶中，28-32℃，转速为160-200转/分钟，摇瓶发酵168-288小时，当发酵液中菌体颜色由深变浅时，停止发酵；
5L发酵罐发酵：以15-25％的体积比的接种量将种子液接种于全自动磁力搅拌5升玻璃发酵罐中，自动监测发酵液溶氧、温度、pH值、搅拌转速，装液量3L，通风量1.0-2.0L/min，48小时内搅拌转速180-220rpm，48h以后搅拌转速控制在90-120rpm，通过自动流加5mol/L的KOH或HCl使pH值恒定在8.0-10.0；在发酵进行到25-35小时开始以1.8-2.2g/L的流速向培养基中补加葡萄糖来加速菌体生长，在发酵进行到65-75小时候停止流加葡萄糖；总的发酵时间为168-220小时，发酵过程中间隔定时取样测定发酵液中的埃博霉素浓度，当发酵液中埃博霉素浓度不再上升时，结束发酵；
(5)产物检测：取步骤(4)发酵液以100目筛砂芯漏斗过滤收集Amberlite XAD-16大孔吸附树脂，树脂用2～4倍体积蒸馏水洗涤三次，自然干燥；将干燥后的发酵树脂用8～10倍体积甲醇振荡浸提；浸提结束后，弃树脂，甲醇浸提液定容；取200μl上述甲醇浸提液用0.22μm的微孔过滤膜过滤后作为高效液相色谱分析的样品，以高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱检测器联用测定发酵液中各种埃博霉素类化合物的种类和含量；
上述斜面培养基组成为：土豆淀粉8g/L，大豆蛋白胨2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏2g/L，MgSO4 1g/L，CaCL2 1g/L，TE溶液1.0ml/L，琼脂15g/L，pH8.0；
上述液体种子培养基组成：马铃薯淀粉2g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨1g/L，玉米浆1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙1.5g/L，FeCl3-EDTA 0.02g/L，TE溶液1ml/L，HEPES 10g/L，Amberlite XAD-16大孔吸附树脂2％(v/v)，pH 8.0；
上述TE溶液的组成为：MnCl2·4H2O 100mg/L，CoCl2 20mg/L，CuSO4 10mg/L，Na2MoO4·2H2O10mg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl 5mg/L，SnCl2·2H2O 5mg/L，H3BO3 10mg/L，KBr 20mg/L，KI 20mg/L；
上述发酵培养基的组成为：马铃薯淀粉4g/L，葡萄糖2g/L，蛋白胨4g/L，豆饼粉2g/L，脱脂奶粉1g/L，Na2HPO4 0.15g/L，K2HPO4 0.15g/L，MgSO4 1.5g/L，CaCl21.5g/L，FeCl3-EDTA 0.01g/L，Thr 5mg/L，VB12 1mg/L，初始pH调整到9.0。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述斜面培养活化温度为30±0.2℃，静止培养时间为120小时。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述种子培养是将步骤(2)培养的菌株接种于装有40mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，置旋转转速为200转/分钟、旋转半径为35mm的摇床上，30±0.2℃培养96小时，得种子液。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述摇瓶发酵是以15％的体积比的接种量，将种子液接种于装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中，30±0.2℃，转速为180转/分钟，摇瓶发酵216小时。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述5L发酵罐发酵是以20％的体积比的接种量将种子液接种于全自动磁力搅拌5升玻璃发酵罐中，装液量3L，通风量1.5L/min，48小时内搅拌转速200rpm，48h以后搅拌转速控制在100rpm，通过自动流加5mol/L的KOH或HCl使pH值恒定在9.0±0.3；在发酵进行到30小时开始以2.0g/L的流速向培养基中补加葡萄糖来加速菌体生长，在发酵进行到70小时候停止流加葡萄糖；总的发酵时间为192小时。
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