CN102174426A - 一种纤维堆囊菌高密度发酵与埃博霉素产物分离偶联的生产工艺 - Google Patents
一种纤维堆囊菌高密度发酵与埃博霉素产物分离偶联的生产工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种纤维堆囊菌高密度发酵与埃博霉素产物分离偶联的生产工艺，是通过流加碳氮源物质和前体物质实现纤维堆囊菌的高密度发酵，同时使用可以多次循环利用的吸附树脂实现埃博霉素产物的分离，并将高密度发酵与产物分离偶联，解除了埃博霉素对纤维堆囊菌的反馈抑制，提高了埃博霉素的产量。本发明具有节约成本、工艺简单、操作方便、生产效率高的技术特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种纤维堆囊菌高密度发酵与埃博霉素产物分离偶联的生产工艺，属于发酵工程技术领域。
背景技术
1993年，德国国家生物技术中心(GBF)的G.
等人报道了他们从粘细菌的纤维堆囊菌So.ce 90菌株的发酵液中，分离出来具有抑制真菌活性和细胞毒活性的Epothilone A和B(图1)。1995年，默克研究院的D.M.Bollag等在大规模筛选微管抑制剂时发现一株纤维堆囊菌SMP 44的发酵提取物具有抑制微管蛋白解聚、破坏有丝***的活性，经分析鉴定该活性组份为Epothilone A和B，它与紫杉醇具有相同的抑制肿瘤细胞生长的作用机制，并且比紫杉醇具有更多优点。2007有一种埃博霉素类B的衍生物伊沙皮龙经美国FDA批准上市，目前有六种埃博霉素类化合物进入了临床研究，埃博霉素类化合物在当今抗癌药物领域异军突起，该类化合物的大规模生产技术研究迫在眉睫。
但是，埃博霉素的产生菌纤维堆囊菌的代时长，生长缓慢，营养摄取率很低，氧的消耗比较少，发酵周期长，发酵时细胞浓度较低，野生型菌株发酵液中每毫升细胞数不大于109个。国内外对纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素的研究较少。Gerth等1996年报道So ce90菌株发酵产生埃博霉素的检测产量为22mg/L，埃博霉素A和B的比例大约为2∶1。Gerth等还通过同位素标记的底物方法，阐述了埃博霉素的碳骨架的组成，并研究了几种主要天然埃博霉素之间的关系，为埃博霉素发酵过程中前体物质的添加，以及进一步阐明原始菌株中埃博霉素的代谢途径打下了基础。国内仅有零星几个专利报道过纤维堆囊菌发酵产生埃博霉素的技术(ZL02110068.3、ZL02110067.5、ZL200510100338.5)，但没有针对纤维堆囊菌高密度发酵和埃博霉素产物分离偶联生产工艺的报道。
发明内容
本发明针对当前纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素工艺中的不足，公开了一种纤维堆囊菌高密度发酵与埃博霉素产物分离偶联的生产工艺。
本发明的技术方案如下：
通过流加碳氮源物质和前体物质实现纤维堆囊菌的高密度发酵，使用可以多次循环利用的吸附树脂，实现埃博霉素产物分离，并将高密度发酵与产物分离偶联，解除终产物埃博霉素对纤维堆囊菌的反馈抑制，提高埃博霉素的产量。
具体工艺步骤为：
1.纤维堆囊菌菌种制备：埃博霉素生产菌株纤维堆囊菌So0157-2，由山东大学微生物技术国家重点实验室李越中教授提供，保藏于中国典型微生物保藏中心，编号CCTCC NO.M208078。菌种使用前经固态活化培养基在28-32℃培养5-7天活化，经液态种子培养基在30-32℃培养3-5天，当细胞量达到1010时接种发酵培养基，发酵罐装液系数70％，接种量为5-10％(V/V)，发酵周期7-9天。
如1所述的固态活化培养基为：土豆淀粉0.1-3％，大豆蛋白胨0.1-2％，葡萄糖0.1-2％，酵母膏0.2-1％，MgSO40.1-1％，CaCL20.1-1％；TE 1.0-2.0ml/L；pH7.0-8.0。加0.5-1.5％琼脂，121℃灭菌20min使用。
如1所述的液态种子培养基为：土豆淀粉0.1-3％，大豆蛋白胨0.1-2％，葡萄糖0.1-2％，酵母膏0.2-1％，MgSO40.1-1％，CaCL20.1-1％；TE 1.0-2.0ml/L；pH7.0-8.0。121℃灭菌20min使用。
如1所述的发酵培养基为：马铃薯淀粉0.1-4％、葡萄糖0.1-3％、蛋白胨0.1-2％、豆饼粉0.1-2％和脱脂奶粉0.1-2％，Na2HPO40.01-1％、K2HPO40.01-1％、MgSO40.1-1％、CaCl20.1-1％、FeCl3-EDTA0.001-0.01％，pH调整7.0-9.0。121℃灭菌20min使用。
2.流加补料发酵：从发酵开始后的第30-70h补加浓度为2g/L的葡萄糖，每小时流加原始发酵液体积的0.01-0.1％。从发酵过程中的第70-120h添加前体营养物质混合液。该混合液放入发酵罐补料瓶内，灭菌后采用蠕动泵自动流加，每小时流加原始发酵液体积的0.01-0.05％。
如2所述的前体物质混合液配方为：苏氨酸5mg/L、丝氨酸(Ser)5mg/L、蛋氨酸和半胱氨酸各2mg/L、乙酸钠20mg/L、丙酮酸30mg/L、VB121mg/L、玉米浆2g/L。葡萄糖和前体物质混合液使用前用去离子水配制，121℃灭菌20min使用。
3.吸附埃博霉素树脂的分离：通过与发酵偶联的吸附树脂柱连续吸附发酵液中的埃博霉素，具体工艺流程如图2所示：发酵液→蠕动泵→树脂柱→发酵液回流至发酵罐。
如3所述的吸附树脂用量为原始发酵液体积的0.5-3％；使用前树脂柱及管路要灭菌，树脂柱启用时间为发酵开始后的第48小时，发酵液循环速度为每分钟10-100mL，循环吸附72h更换树脂柱，2-4个树脂柱轮流使用，当树脂吸附72h后，通过树脂体积6-10倍的甲醇洗脱收集埃博霉素，并用6-10倍的去离子水依次洗涤树脂，实现树脂再生，灭菌后继续循环使用。
本发明生产工艺具有以下优点：
1、通过补料工艺实现了纤维堆囊菌的高密度发酵，发酵液中最大细胞密度每毫升达到1012个。
2、通过流加葡萄糖高密度发酵、流加合成埃博霉素所需前体物质、发酵偶联的埃博霉素分离三方面的措施，解除了埃博霉素终产物的反馈抑制，实现了埃博霉素的高产，每升发酵液中埃博霉素A产量达到127mg/L，埃博霉素B产量达到53mg/L。
3、吸附树脂经装柱使用能保护树脂颗粒不被发酵搅拌打碎，比直接将树脂加入发酵液中吸附的方法节约成本，另外，本发明具有工艺简单、操作方便、生产效率高的技术特点。
附图说明
图1为埃博霉素epothilone A/B化合物结构式；
图2为发酵和产物分离偶联示意图；其中：1.发酵液采集滤网；2.蠕动泵；3.吸附树脂柱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但保护范围不限于此。
实施例1
1.纤维堆囊菌菌种制备：埃博霉素生产菌株纤维堆囊菌So0157-2，中国典型微生物保藏中心保藏，编号NO.M208078。菌种使用前经固态活化培养基在28℃培养5天活化，液态种子培养基在30℃培养3天，细胞量达到1010时接种发酵培养基，发酵罐装液系数70％，接种量为5％(V/V)，发酵周期7天。
如1所述的固态活化培养基为：土豆淀粉0.5％，大豆蛋白胨1％，葡萄糖1％，酵母膏0.5％，MgSO40.5％，CaCL20.5％；TE 1.0ml/L；pH7.0。加0.8％琼脂，121℃灭菌20min使用。
如1所述的液态种子培养基为：土豆淀粉0.5％，大豆蛋白胨1％，葡萄糖1％，酵母膏0.5％，MgSO40.5％，CaCL20.5％；TE 1.0ml/L；pH7.0。121℃灭菌20min使用。
如1所述的发酵培养基为：马铃薯淀粉0.5％、葡萄糖1％、蛋白胨0.5％、豆饼粉0.5％和脱脂奶粉0.5％，Na2HPO40.01％、K2HPO40.01％、MgSO40.5％、CaCl20.5％、FeCl3-EDTA 0.001％，pH调整7.0。121℃灭菌20min使用。
2.流加补料发酵：从发酵的第30-70h内连续补加浓度为2g/L的葡萄糖，每小时流加原始发酵液体积的0.01％。从发酵过程中的第70-120h添加前体营养物质混合液。该混合液放入发酵罐补料瓶内，灭菌后采用蠕动泵自动流加，每小时流加原始发酵液体积的0.01％。
如2所述的前体物质混合液为：苏氨酸5mg/L、丝氨酸(Ser)5mg/L、蛋氨酸和半胱氨酸各2mg/L、乙酸钠20mg/L、丙酮酸30mg/L、VB121mg/L、玉米浆2g/L。葡萄糖和前体物质混合液使用前用去离子水配制，121℃灭菌20min使用。
3.吸附埃博霉素树脂的分离：通过与发酵偶联的吸附树脂柱吸附发酵液中的埃博霉素，具体工艺流程如图2所示：发酵液→蠕动泵→树脂柱→发酵液回流至发酵罐。
如3所述的吸附树脂用量为原始发酵液体积的0.5％；使用前树脂柱及管路要灭菌，树脂柱启用时间为发酵开始48小时后，发酵液循环速度为每分钟10mL，循环吸附72h更换树脂柱，2个树脂柱轮流使用，循环吸附间隙，通过树脂体积6倍的甲醇洗脱和6倍的去离子水依次洗涤树脂，实现树脂再生，灭菌后继续循环使用。
经检测发酵液中最大细胞密度每毫升达到3*1012个。每升发酵液中埃博霉素A产量达到108mg/L，埃博霉素B产量达到46mg/L。
实施例2
1.纤维堆囊菌菌种制备：埃博霉素生产菌株纤维堆囊菌So0157-2，中国典型微生物保藏中心保藏，编号NO.M208078。菌种使用前经固态活化培养基在30℃培养6天活化，液态种子培养基在31℃培养4天，细胞量达到1010时接种发酵培养基，发酵罐装液系数70％，接种量为10％(V/V)，发酵周期8天。
如1所述的固态活化培养基为：土豆淀粉1％，大豆蛋白胨1.5％，葡萄糖1.5％，酵母膏0.8％，MgSO40.7％，CaCL20.7％；TE 1.5ml/L；pH7.5。加1％琼脂，121℃灭菌20min使用。
如1所述的液态种子培养基为：土豆淀粉2％，大豆蛋白胨1.5％，葡萄糖1.5％，酵母膏0.8％，MgSO40.7％，CaCL20.7％；TE 1.5ml/L；pH7.5。121℃灭菌20min使用。
如1所述的发酵培养基为：马铃薯淀粉2％、葡萄糖2％、蛋白胨1.5％、豆饼粉1.5％和脱脂奶粉1.5％，Na2HPO40.5％、K2HPO40.5％、MgSO40.8％、CaCl20.8％、FeCl3-EDTA0.005％，pH调整8.0。121℃灭菌20min使用。
2.流加补料发酵：从发酵开始30-70h补加浓度为2g/L的葡萄糖，每小时流加原始发酵液体积的0.05％。从发酵过程中的第70-120h添加前体营养物质混合液。该混合液放入发酵罐补料瓶内，灭菌后采用蠕动泵自动流加，每小时流加原始发酵液体积的0.03％。
如2所述的前体物质混合液为：苏氨酸5mg/L、丝氨酸(Ser)5mg/L、蛋氨酸和半胱氨酸各2mg/L、乙酸钠20mg/L、丙酮酸30mg/L、VB121mg/L、玉米浆2g/L。葡萄糖和前体物质混合液使用前用去离子水配制，121℃灭菌20min使用。
3.吸附埃博霉素树脂的分离：通过与发酵偶联的吸附树脂柱吸附发酵液中的埃博霉素，具体工艺流程如图2所示：发酵液→蠕动泵→树脂柱→发酵液回流至发酵罐。
如3所述的吸附树脂用量为原始发酵液体积的1.5％；使用前树脂柱及管路要灭菌，树脂柱启用时间为发酵开始48小时后，发酵液循环速度为每分钟50mL，循环吸附72h更换树脂柱，3个树脂柱轮流使用，循环吸附间隙，通过树脂体积8倍的甲醇洗脱和8倍的去离子水依次洗涤树脂，实现树脂再生，灭菌后继续循环使用。
经检测发酵液中最大细胞密度每毫升达到4*1012个。每升发酵液中埃博霉素A产量达到116mg/L，埃博霉素B产量达到51mg/L。
实施例3
1.纤维堆囊菌菌种制备：埃博霉素生产菌株纤维堆囊菌So0157-2，中国典型微生物保藏中心保藏，编号NO.M208078。菌种使用前经固态活化培养基在32℃培养7天活化，液态种子培养基在32℃培养5天，细胞量达到1010时接种发酵培养基，发酵罐装液系数70％，接种量为5％(V/V)，发酵周期9天。
如1所述的固态活化培养基为：土豆淀粉3％，大豆蛋白胨2％，葡萄糖2％，酵母膏1％，MgSO41％，CaCL21％；TE 2.0ml/L；pH8.0。加1.5％琼脂，121℃灭菌20min使用。
如1所述的液态种子培养基为：土豆淀粉3％，大豆蛋白胨2％，葡萄糖2％，酵母膏1％，MgSO41％，CaCL21％；TE 2.0ml/L；pH8.0。121℃灭菌20min使用。
如1所述的发酵培养基为：马铃薯淀粉4％、葡萄糖3％、蛋白胨2％、豆饼粉2％和脱脂奶粉2％，Na2HPO40.8％、K2HPO40.8％、MgSO41％、CaCl21％、FeCl3-EDTA 0.01％，pH调整9.0。121℃灭菌20min使用。
2.流加补料发酵：从发酵开始30-70h补加浓度为2g/L的葡萄糖，每小时流加原始发酵液体积的0.1％。从发酵过程中的第70-120h添加前体营养物质混合液。该混合液放入发酵罐补料瓶内，灭菌后采用蠕动泵自动流加，每小时流加原始发酵液体积的0.05％。
如2所述的前体物质混合液为：苏氨酸5mg/L、丝氨酸(Ser)5mg/L、蛋氨酸和半胱氨酸各2mg/L、乙酸钠20mg/L、丙酮酸30mg/L、VB121mg/L、玉米浆2g/L。葡萄糖和前体物质混合液使用前用去离子水配制，121℃灭菌20min使用。
3.吸附埃博霉素树脂的分离：通过与发酵偶联的吸附树脂柱吸附发酵液中的埃博霉素，具体工艺流程如图2所示：发酵液→蠕动泵→树脂柱→发酵液回流至发酵罐。
如3所述的吸附树脂用量为原始发酵液体积的3％；使用前树脂柱及管路要灭菌，树脂柱启用时间为发酵开始48小时后，发酵液循环速度为每分钟100mL，循环吸附72h更换树脂柱，3个树脂柱轮流使用，循环吸附间隙，通过树脂体积10倍的甲醇洗脱和10倍的去离子水依次洗涤树脂，实现树脂再生，灭菌后继续循环使用。
经检测发酵液中最大细胞密度每毫升达到7*1012个。每升发酵液中埃博霉素A产量达到127mg/L，埃博霉素B产量达到53mg/L。
Claims (4)
1.一种纤维堆囊菌高密度发酵与埃博霉素产物分离偶联的生产工艺，其特征在于：通过流加工艺，包括碳氮源物质和前体物质，实现纤维堆囊菌的高密度发酵；同时使用可以多次循环利用的吸附树脂，实现埃博霉素产物分离，并将高密度发酵与产物分离偶联。
2.如权利要求1所述的流加工艺，其特征在于从发酵开始后的第30-70h补加浓度为2g/L的葡萄糖，每小时流加原始发酵液体积的0.01-0.1％。从发酵过程中的第70-120h添加前体营养物质混合液。该混合液放入发酵罐补料瓶内，灭菌后采用蠕动泵自动流加，每小时流加原始发酵液体积的0.01-0.05％。
如2所述的前体物质混合液配方为：苏氨酸5mg/L、丝氨酸(Ser)5mg/L、蛋氨酸和半胱氨酸各2mg/L、乙酸钠20mg/L、丙酮酸30mg/L、VB121mg/L、玉米浆2g/L。葡萄糖和前体物质混合液使用前用去离子水配制，121℃灭菌20min使用。
3.如权利要求1所述的发酵和产物分离偶联工艺，其特征在于：通过与发酵偶联的吸附树脂柱连续吸附发酵液中的埃博霉素，具体工艺流程为：
发酵液→蠕动泵→树脂柱→发酵液回流至发酵罐。
如3所述的吸附树脂用量为原始发酵液体积的0.5-3％；使用前树脂柱及管路要灭菌，树脂柱启用时间为发酵开始后的第48小时，发酵液循环速度为每分钟10-100mL，循环吸附72h更换树脂柱，2-4个树脂柱轮流使用，当树脂吸附72h后，通过树脂体积6-10倍的甲醇洗脱收集埃博霉素，并用6-10倍的去离子水依次洗涤树脂，实现树脂再生，灭菌后继续循环使用。
4.如权利要求1所述的一种纤维堆囊菌高密度发酵与埃博霉素产物分离偶联的生产工艺在纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素类化合物方面的应用。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110907 |