JPH0698010B2 - 免疫抑制剤の新規な製造方法 - Google Patents
免疫抑制剤の新規な製造方法Info
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- JPH0698010B2 JPH0698010B2 JP2062847A JP6284790A JPH0698010B2 JP H0698010 B2 JPH0698010 B2 JP H0698010B2 JP 2062847 A JP2062847 A JP 2062847A JP 6284790 A JP6284790 A JP 6284790A JP H0698010 B2 JPH0698010 B2 JP H0698010B2
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
- C12R2001/55—Streptomyces hygroscopicus
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はストレプトマイセス・ハイグロスコピカス・亜
種・アスコマイセティカス（Streptomyces hygroscopic
us subsp.ascomyceticus）（MA 6475）、ATCC No.14891
の代謝系遮断変異株である新規な変異株微生物ストレプ
トマイセス・ハイグロスコピカス・亜種・アスコマイセ
ティカス（Streptomyces hygroscopicus subsp.ascomyc
eticus）（MA 6646）、ATCC No.53855を使用する免疫抑
制剤Ｌ−683,742の新規な製造方法に関する。この方法
は窒素栄養源を含む水性炭水化物培地中で好気的発酵条
件下で新規な微生物を培養することを含む。
種・アスコマイセティカス（Streptomyces hygroscopic
us subsp.ascomyceticus）（MA 6475）、ATCC No.14891
の代謝系遮断変異株である新規な変異株微生物ストレプ
トマイセス・ハイグロスコピカス・亜種・アスコマイセ
ティカス（Streptomyces hygroscopicus subsp.ascomyc
eticus）（MA 6646）、ATCC No.53855を使用する免疫抑
制剤Ｌ−683,742の新規な製造方法に関する。この方法
は窒素栄養源を含む水性炭水化物培地中で好気的発酵条
件下で新規な微生物を培養することを含む。
当該技術分野における開示の簡単な説明 1983年、米国特許FDAは臓器移植外科領域に革命をもた
らした極めて有効な免疫抑制剤であるシクロスポリンを
認可した。この薬品は体の免疫系が移植物の外来蛋白質
を拒絶するためにその天然の保護剤の巨大な武器庫を動
員するのを阻害することにより作用する。
らした極めて有効な免疫抑制剤であるシクロスポリンを
認可した。この薬品は体の免疫系が移植物の外来蛋白質
を拒絶するためにその天然の保護剤の巨大な武器庫を動
員するのを阻害することにより作用する。
薬品が移植拒絶との戦いに有効であればあるほど、腎不
全、肝臓損害及び潰瘍を起こす欠点に苦しみ、それらは
多くの場合極めて重くなる可能性がある。
全、肝臓損害及び潰瘍を起こす欠点に苦しみ、それらは
多くの場合極めて重くなる可能性がある。
Fujisawaの欧州特許出願公開第0184162号はシクロスポ
リンより100培強力と称せられる新規なマクロライド免
疫抑制剤FK−506を記述しており、前記文献は参考例と
してここに組み入れる。このマクロライドは構造が類似
するFK−525と同様にストレプトマイセス・ツクバエン
シス（Streptomyces tsukubaensis）の特別な株の発酵
により生産される。又、エス・ハイグロスコピカス・亜
種・ヤクシマエンシス（Ｓ・hygroscopicussubsp.yakus
himaensis）により生産される密接に関連するマクロラ
イド免疫抑制剤FK−520及びFK−523についても記述して
いる。
リンより100培強力と称せられる新規なマクロライド免
疫抑制剤FK−506を記述しており、前記文献は参考例と
してここに組み入れる。このマクロライドは構造が類似
するFK−525と同様にストレプトマイセス・ツクバエン
シス（Streptomyces tsukubaensis）の特別な株の発酵
により生産される。又、エス・ハイグロスコピカス・亜
種・ヤクシマエンシス（Ｓ・hygroscopicussubsp.yakus
himaensis）により生産される密接に関連するマクロラ
イド免疫抑制剤FK−520及びFK−523についても記述して
いる。
T.Araiの米国特許第3,244,592号は抗カビ物質「アスコ
マイシン（ascomycin）を生産するストレプトマイセス
・ハイグロスコピカス・バラエティ・アスコマイセティ
カスの培養について記述している。
マイシン（ascomycin）を生産するストレプトマイセス
・ハイグロスコピカス・バラエティ・アスコマイセティ
カスの培養について記述している。
S.T.Cheh、E.S.Inamine、B.H.Arison、L.S.Wickerによ
る米国特許願第213,025号（事件第17767号）（Merck ＆
Co.Inc.に譲渡）はＬ−683,590の存在下で微生物アク
チノプラナセート種（Actinoplanacete sp.）（MA 655
9）、ATCC No.53771を培養してＬ−683,590を生変換さ
せることにより生産されるＬ−683,590（FK−520）のＣ
−31デメチルアナログである新規な免疫抑制剤「デメチ
ムノマイシン（demethimmunomycin）」、Ｌ−683,742を
開示しており、前記文献は参考例としてここに組み入れ
る。
る米国特許願第213,025号（事件第17767号）（Merck ＆
Co.Inc.に譲渡）はＬ−683,590の存在下で微生物アク
チノプラナセート種（Actinoplanacete sp.）（MA 655
9）、ATCC No.53771を培養してＬ−683,590を生変換さ
せることにより生産されるＬ−683,590（FK−520）のＣ
−31デメチルアナログである新規な免疫抑制剤「デメチ
ムノマイシン（demethimmunomycin）」、Ｌ−683,742を
開示しており、前記文献は参考例としてここに組み入れ
る。
しかしながら、Ｌ−683,590出発物質の存在を必要とし
ないで微生物の発酵により直接免疫抑制剤Ｌ−683,743
を生産することについて記載された文献はない。
ないで微生物の発酵により直接免疫抑制剤Ｌ−683,743
を生産することについて記載された文献はない。
これに関する新規な方法の探索がこの分野で絶えず行わ
れている。
れている。
発明の要約 免疫抑制剤Ｌ−683,742は、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンで変異処理することによっ
て、ATCC No.14891（MA 6475）から誘導される、変異株
微生物ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス・亜種
・アスコマイセティカス（MA 6646）、ATCC No.53855の
発酵により直接得られることを発見した。この発酵は、
1988年６月29日出願され同じ譲受人を持つ特許願第213,
025号（事件第17767号）に記載されているように、マク
ロライド免疫抑制剤Ｌ−683,590の存在を必要とせず、
窒素栄養源を含む水性炭水化物培地中で液中好気的条件
下で、8.0以下例えば約７のpHでＬ−683,590（イムノマ
イシン）のモノ−Ｃ−31デメチル体であるＬ−683,742
（デメチムノマイシン）を生産するに十分な時間を行う
ものであり、前記文献はこの特別な目的のために参考例
としてここに組み入れる。他のＬ−683,590型マクロラ
イドのＣ−31デメチル誘導体もここに記述した発明の方
法により生産される発酵液中に存在するものと当然思わ
れる。
−Ｎ−ニトロソグアニジンで変異処理することによっ
て、ATCC No.14891（MA 6475）から誘導される、変異株
微生物ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス・亜種
・アスコマイセティカス（MA 6646）、ATCC No.53855の
発酵により直接得られることを発見した。この発酵は、
1988年６月29日出願され同じ譲受人を持つ特許願第213,
025号（事件第17767号）に記載されているように、マク
ロライド免疫抑制剤Ｌ−683,590の存在を必要とせず、
窒素栄養源を含む水性炭水化物培地中で液中好気的条件
下で、8.0以下例えば約７のpHでＬ−683,590（イムノマ
イシン）のモノ−Ｃ−31デメチル体であるＬ−683,742
（デメチムノマイシン）を生産するに十分な時間を行う
ものであり、前記文献はこの特別な目的のために参考例
としてここに組み入れる。他のＬ−683,590型マクロラ
イドのＣ−31デメチル誘導体もここに記述した発明の方
法により生産される発酵液中に存在するものと当然思わ
れる。
結果として得られるＬ−683,742は免疫抑制活性すなわ
ち、カルシウム・イオン透過担体（イオノマイシン）
（ionomyycin））とフォルボール・ミリステート・アセ
テート（PMA）との組合せにより誘導されるＴ細胞刺激
検定法によって証明されるようなＴ細胞活性化の陽性阻
害を示し、前記検定法をここでは「Ｔ細胞増殖検定法」
と称する。この検定法の原理はイオノマイシンとPMAと
の組合せにより促進されるマウスＴリンパ球の増殖を測
定することである。この検定法で陽性の試料はＴ細胞の
増殖を阻害し、それはトリチウム化チミジン取込みの減
少により示される。
ち、カルシウム・イオン透過担体（イオノマイシン）
（ionomyycin））とフォルボール・ミリステート・アセ
テート（PMA）との組合せにより誘導されるＴ細胞刺激
検定法によって証明されるようなＴ細胞活性化の陽性阻
害を示し、前記検定法をここでは「Ｔ細胞増殖検定法」
と称する。この検定法の原理はイオノマイシンとPMAと
の組合せにより促進されるマウスＴリンパ球の増殖を測
定することである。この検定法で陽性の試料はＴ細胞の
増殖を阻害し、それはトリチウム化チミジン取込みの減
少により示される。
この発明により、液中好気的発酵条件下窒素栄養源を含
む水性炭水化物培地中でpH8.0以下でＣ−31デメチル免
疫抑制剤を生産するに十分な時間Ｌ−683,590型マクロ
ライドのＣ−31デメチル誘導体を産生するストレプトマ
イセスの変異株を培養する工程からなるＬ−683,590型
マクロライドのＣ−31デメチル誘導体と確認された免疫
抑制剤の新規な製造方法が提供される。
む水性炭水化物培地中でpH8.0以下でＣ−31デメチル免
疫抑制剤を生産するに十分な時間Ｌ−683,590型マクロ
ライドのＣ−31デメチル誘導体を産生するストレプトマ
イセスの変異株を培養する工程からなるＬ−683,590型
マクロライドのＣ−31デメチル誘導体と確認された免疫
抑制剤の新規な製造方法が提供される。
更に、液中好気的発酵条件下窒素栄養源を含む水性炭水
化物培お中でＬ−683,742を産生するに十分な時間スト
レプトマイセス・ハイグロスコピカス・亜種・アスコマ
イセティカス（MA 6646）、ATCC No.53855の一株を培養
する工程からなるＬ−683,742と確認された免疫抑制剤
の新規な製造方法が提供される。
化物培お中でＬ−683,742を産生するに十分な時間スト
レプトマイセス・ハイグロスコピカス・亜種・アスコマ
イセティカス（MA 6646）、ATCC No.53855の一株を培養
する工程からなるＬ−683,742と確認された免疫抑制剤
の新規な製造方法が提供される。
又、上述の方法により生産される発酵液が提供される。
更に、新規な変異株微生物ストレプトマイセス・ハイグ
ロスコピカス・亜種・アスコマイセティカス、ATCC No.
53855が提供される。
ロスコピカス・亜種・アスコマイセティカス、ATCC No.
53855が提供される。
発明の詳細な説明と好ましい具体化 本発明はＬ−683,742を生産するためのストレプトマイ
セス・ハイグロスコピカス・亜種・アスコマイセティカ
ス、ATCC No.53855の発酵を含む、この微生物は、メリ
ーランド（Maryland）、ロックビル（Rockville）、パ
ークローン・ドライブ（Parklawn Drive）12301に存在
するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）にATCC No.5385
5として、及びニュー・ジャージー（New Jersey）、ロ
ーウェー（Rahway）に存在するメルク・カルチャー・コ
レクション（Merck Culture Collection）にMA6646とし
て1989年１月12日提出され、現在制限された寄託がなさ
れている。生態学的、培養的、生物学的及び生理学的特
徴を含む物理学的特徴及び分類を以下に簡単に説明す
る。
セス・ハイグロスコピカス・亜種・アスコマイセティカ
ス、ATCC No.53855の発酵を含む、この微生物は、メリ
ーランド（Maryland）、ロックビル（Rockville）、パ
ークローン・ドライブ（Parklawn Drive）12301に存在
するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）にATCC No.5385
5として、及びニュー・ジャージー（New Jersey）、ロ
ーウェー（Rahway）に存在するメルク・カルチャー・コ
レクション（Merck Culture Collection）にMA6646とし
て1989年１月12日提出され、現在制限された寄託がなさ
れている。生態学的、培養的、生物学的及び生理学的特
徴を含む物理学的特徴及び分類を以下に簡単に説明す
る。
MA 6646株 顕微鏡観察 直径が0.6ミクロンの分岐した繊維状菌糸。担胞子体は
短く、緻密な螺旋状外観を呈する。
短く、緻密な螺旋状外観を呈する。
オートミール寒天 栄養発育：裏面は灰白色 気中増殖：豊富でマット状、灰色〜黒色 可溶性色素：なし グリセリン−アスパラギン 栄養発育：裏面は灰白色透明、表面は灰白色透明で浸食
された縁辺部 気菌糸：まばらで灰白色、粉状 可溶性色素：なし 無機塩澱粉寒天 栄養発育：裏面はクリーム色 気中増殖：豊富でビロード状、淡灰色〜黒色 気菌糸：白色ビロード状 可溶性色素：なし 酵母エキス−麦芽エキス寒天 栄養発育：裏面は灰黄色 気中増殖：豊富で淡灰〜灰色、マット状、綿状 可溶性色素：なし 炭水化物利用パターン ｄ−グルコース ＋＋ ｄ−アラビノース ＋／− １−アラビノース ＋／− ｄ−フラクトース ＋＋ １−グルコース − イノシトール ＋／− ｄ−マルトース ＋ ｄ−マンニトール ＋＋ ｄ−マンノース ＋＋ １−マンノース − ｄ−ラフィノース − １−ラムノース ＋＋ スクロース − ｄ−キシロース ＋＋ １−キシロース − α−ｄ−ラクトース ＋＋ β−ｄ−ラクトース ＋＋ 上表で＋＋は相当な発育、＋は適度な発育、＋／−は僅
かな発育、−は発育のないことを示す。
された縁辺部 気菌糸：まばらで灰白色、粉状 可溶性色素：なし 無機塩澱粉寒天 栄養発育：裏面はクリーム色 気中増殖：豊富でビロード状、淡灰色〜黒色 気菌糸：白色ビロード状 可溶性色素：なし 酵母エキス−麦芽エキス寒天 栄養発育：裏面は灰黄色 気中増殖：豊富で淡灰〜灰色、マット状、綿状 可溶性色素：なし 炭水化物利用パターン ｄ−グルコース ＋＋ ｄ−アラビノース ＋／− １−アラビノース ＋／− ｄ−フラクトース ＋＋ １−グルコース − イノシトール ＋／− ｄ−マルトース ＋ ｄ−マンニトール ＋＋ ｄ−マンノース ＋＋ １−マンノース − ｄ−ラフィノース − １−ラムノース ＋＋ スクロース − ｄ−キシロース ＋＋ １−キシロース − α−ｄ−ラクトース ＋＋ β−ｄ−ラクトース ＋＋ 上表で＋＋は相当な発育、＋は適度な発育、＋／−は僅
かな発育、−は発育のないことを示す。
本発明の方法は変異株ストレプトマイセス・ハイグロス
コピカス・亜種・アスコマイセティカスの任意の「Ｃ−
31デメチル」株により実施することができ、特にATCC N
o.53855株が好ましい。
コピカス・亜種・アスコマイセティカスの任意の「Ｃ−
31デメチル」株により実施することができ、特にATCC N
o.53855株が好ましい。
一般に、Ｌ−683,742株は上述の変異株を、同化性炭素
源及び窒素源を含む水性栄養培地中で、好ましくは液中
好気的発酵条件（例えば振盪培養、液中培養など）下で
培養（発酵）することにより生産することができる。水
性培地は発酵の開始期と終期（収穫）においては約７の
pHに維持するのが好ましい。これより高いpHは生成物の
相当な及び／又は全部の喪失につながる。望ましいpHは
モノホリノエタンスルホン酸（MES）、モノホリノプロ
パンスルホン酸（MOPS）などのような緩衝剤を使用する
か、又は以下に記述する生産培地のような本来緩衝性を
持つ栄養源材料を選択することにより維持することがで
きる。
源及び窒素源を含む水性栄養培地中で、好ましくは液中
好気的発酵条件（例えば振盪培養、液中培養など）下で
培養（発酵）することにより生産することができる。水
性培地は発酵の開始期と終期（収穫）においては約７の
pHに維持するのが好ましい。これより高いpHは生成物の
相当な及び／又は全部の喪失につながる。望ましいpHは
モノホリノエタンスルホン酸（MES）、モノホリノプロ
パンスルホン酸（MOPS）などのような緩衝剤を使用する
か、又は以下に記述する生産培地のような本来緩衝性を
持つ栄養源材料を選択することにより維持することがで
きる。
栄養培地中の好ましい炭素源はグルコース、キシロー
ス、ガラクトース、グリセリン、澱粉、デキストリンな
どのような炭水化物である。含有させることができる他
の炭素源にはマルトース、ラムノース、ラフィノース、
アラビノース、マンノース、サリシン、コハク酸ナトリ
ウムなどが含まれる。
ス、ガラクトース、グリセリン、澱粉、デキストリンな
どのような炭水化物である。含有させることができる他
の炭素源にはマルトース、ラムノース、ラフィノース、
アラビノース、マンノース、サリシン、コハク酸ナトリ
ウムなどが含まれる。
好ましい炭素源は酵母エキス、肉エキス、ペプトン、グ
ルテンミール、綿実ミール、大豆ミール及び他の植物性
ミール（部分脱脂又は完全脱脂）、カゼイン加水分解
物、大豆加水分解物及び酵母加水分解物、コーンスティ
ープリカー、乾繰酵母、水麦胚芽、フェザーミール、落
花生粉、蒸留器可溶分（dustillers solubles）など、
並びにアンモニウム塩（例えば硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウムなど）、尿素、アミ
ノ酸などのような無機及び有機窒素化合物である。
ルテンミール、綿実ミール、大豆ミール及び他の植物性
ミール（部分脱脂又は完全脱脂）、カゼイン加水分解
物、大豆加水分解物及び酵母加水分解物、コーンスティ
ープリカー、乾繰酵母、水麦胚芽、フェザーミール、落
花生粉、蒸留器可溶分（dustillers solubles）など、
並びにアンモニウム塩（例えば硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウムなど）、尿素、アミ
ノ酸などのような無機及び有機窒素化合物である。
炭素源と窒素源は組み合わせて好便に使用されるが、そ
れらは純粋な形体で使用する必要はなく、なんとなれば
微量の成長因子及び相当量の鉱物質栄養源を含む、より
純度の低い材料も使用に適しているからである。所望に
より、炭酸ナトリウム又はカルシウム、リン酸ナトリウ
ム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、ヨウ化
ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム塩、銅塩、コ
バルト塩などのような鉱物質塩を培地に添加することが
できる。必要により、特に培地が著しく泡立つ場合は流
動パラフィン、動物油、植物油、鉱物油又はシリコンの
ような消泡剤を添加することができる。
れらは純粋な形体で使用する必要はなく、なんとなれば
微量の成長因子及び相当量の鉱物質栄養源を含む、より
純度の低い材料も使用に適しているからである。所望に
より、炭酸ナトリウム又はカルシウム、リン酸ナトリウ
ム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、ヨウ化
ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム塩、銅塩、コ
バルト塩などのような鉱物質塩を培地に添加することが
できる。必要により、特に培地が著しく泡立つ場合は流
動パラフィン、動物油、植物油、鉱物油又はシリコンの
ような消泡剤を添加することができる。
Ｌ−683,742を大量に生産する存在としては液中好気的
培養条件が好ましい。少量の生産にはフラスコ、びん又
は培養皿による振盪又は表面培養を用いる。更に大型槽
で増殖を行う場合、Ｌ−683,742の生産工程における発
育の遅延を避けるため微生物の栄養形態を生産槽への植
菌に使用するのが望ましい。従って、「斜面」中に生産
された微生物の胞子又は菌糸を比較的少量の培地に植菌
し、前記植菌した培地（これを「植菌培地」と称するこ
ともある）を培養し、次いで培養した栄養種菌を無菌的
に大型槽に移植することにより微生物の栄養種菌を生産
することが第一に望ましいことである。種菌が生産され
る発酵培地はＬ−683,742の生産に使用する培地と実質
的に同一か又は相違し、一般に植菌前培地を殺菌するた
めオートクレーブで加熱する。培地のpHは、一般にオー
トクレーブ殺菌前、酸又は塩基を好ましくは緩衝液の形
態で適当に添加することにより約7.0に調節する。
培養条件が好ましい。少量の生産にはフラスコ、びん又
は培養皿による振盪又は表面培養を用いる。更に大型槽
で増殖を行う場合、Ｌ−683,742の生産工程における発
育の遅延を避けるため微生物の栄養形態を生産槽への植
菌に使用するのが望ましい。従って、「斜面」中に生産
された微生物の胞子又は菌糸を比較的少量の培地に植菌
し、前記植菌した培地（これを「植菌培地」と称するこ
ともある）を培養し、次いで培養した栄養種菌を無菌的
に大型槽に移植することにより微生物の栄養種菌を生産
することが第一に望ましいことである。種菌が生産され
る発酵培地はＬ−683,742の生産に使用する培地と実質
的に同一か又は相違し、一般に植菌前培地を殺菌するた
めオートクレーブで加熱する。培地のpHは、一般にオー
トクレーブ殺菌前、酸又は塩基を好ましくは緩衝液の形
態で適当に添加することにより約7.0に調節する。
培養混合物の撹拌と通気は種々な方法で達成することが
できる。撹拌はプロペラ又は類似の機械的撹拌装置によ
り、発酵槽を回転又は振盪することにより、種々なポン
プ装置により、又は培地に無菌空気を通過させることに
より行うことができる。通気は発酵混合物に無菌空気を
通過させることにより行うことができる。
できる。撹拌はプロペラ又は類似の機械的撹拌装置によ
り、発酵槽を回転又は振盪することにより、種々なポン
プ装置により、又は培地に無菌空気を通過させることに
より行うことができる。通気は発酵混合物に無菌空気を
通過させることにより行うことができる。
発酵は通常約20℃と40℃の間の温度好ましくは25〜35℃
で約48時間〜96時間行うが、この条件は発酵の条件とス
ケールにより変動させることができる。好ましくは、生
産培養は220rpmで稼働する回転振盪機上で27℃で約96時
間定温保持し、この場合発酵培地のpHは終期まで7.0に
維持する。
で約48時間〜96時間行うが、この条件は発酵の条件とス
ケールにより変動させることができる。好ましくは、生
産培養は220rpmで稼働する回転振盪機上で27℃で約96時
間定温保持し、この場合発酵培地のpHは終期まで7.0に
維持する。
発酵を行うための好ましい培養／生産培地は下表の通り
である。。植菌培地Ａ g/ グルコース 20.0 Difco酵母エキス 20.0 Hycase SF 20.0 KNO3 2.0 FeSO4・7H2O 0.025 NaCl 0.5 MgSO4・7H2O 0.5 MnSO4・7H2O 0.005 ZnSO4・7H2O 0.01 CaCl2・2H2O 0.02 生産培地Ｂ g/ グルコース 22 グリセリン 25 コーンスティープリカー 10 Difco酵母エキス 15 乳酸 2 Ｌ−チロシン 4 MOPS 10 CaCO3 0.25 pH6.8に調節 生産されたＬ−683,742は他の既知の生物学的活性物質
の回収に一般に使用される通常の方法により培地から回
収することができる。生産されたＬ−683,742物質は培
養菌体と濾液中に存在し、従って、培養液を濾過又は遠
心分離して得られる菌体と濾液から、減圧下での濃縮、
凍結乾繰、メタノールなどのような通常の溶媒による抽
出、pH調節、通常の樹脂（例えばアニオン又はカチオン
交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）による処理、通常
の吸着剤（例えば活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロ
ース、アルミナなど）による処理、結晶化、再結晶など
の通常の方法により分離し精製することができる。好ま
しい方法は溶媒抽出であり、特にメタノールを使用する
のが好ましい。
である。。植菌培地Ａ g/ グルコース 20.0 Difco酵母エキス 20.0 Hycase SF 20.0 KNO3 2.0 FeSO4・7H2O 0.025 NaCl 0.5 MgSO4・7H2O 0.5 MnSO4・7H2O 0.005 ZnSO4・7H2O 0.01 CaCl2・2H2O 0.02 生産培地Ｂ g/ グルコース 22 グリセリン 25 コーンスティープリカー 10 Difco酵母エキス 15 乳酸 2 Ｌ−チロシン 4 MOPS 10 CaCO3 0.25 pH6.8に調節 生産されたＬ−683,742は他の既知の生物学的活性物質
の回収に一般に使用される通常の方法により培地から回
収することができる。生産されたＬ−683,742物質は培
養菌体と濾液中に存在し、従って、培養液を濾過又は遠
心分離して得られる菌体と濾液から、減圧下での濃縮、
凍結乾繰、メタノールなどのような通常の溶媒による抽
出、pH調節、通常の樹脂（例えばアニオン又はカチオン
交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）による処理、通常
の吸着剤（例えば活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロ
ース、アルミナなど）による処理、結晶化、再結晶など
の通常の方法により分離し精製することができる。好ま
しい方法は溶媒抽出であり、特にメタノールを使用する
のが好ましい。
発酵からの生産物Ｌ−683,742は、「Ｔ細胞増殖検定
法」で陽性の免疫抑制活性を示し、これに基づく有用性
を持つ。
法」で陽性の免疫抑制活性を示し、これに基づく有用性
を持つ。
次の実施例は本発明を例証するために示すのであり、本
発明の範囲又は思想を限定するためのものと解すべきで
はない。
発明の範囲又は思想を限定するためのものと解すべきで
はない。
実施例１ 変異処理及び培養条件 MA6475の胞子をベネツト（Bennett）寒天（Difco酵母エ
キス0.1％、肉エキス0.1％、Ｎ−Z Amine typeA0.2％、
グルコース１％、寒天1.5％）から調製し、TM緩衝液
（0.05M Tris、0.05Mマレイン酸、NaOHでpH9に調節）中
2mg/mlの濃度にしたＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンで、室温でおだやかに攪拌しながら30
分間処理した。処理した胞子をベネット寒天上で単一コ
ロニーに平板培養した。これらのコロニーの発酵液のメ
タノール抽出液について、変異株のフェノタイプを薄層
クロマトグラフィー（TLC）で試験した。主題の変異株M
A 6646をクロロホルム：メタノール（9:1）の溶媒系で
主要親化合物（Ｌ−683,590）よりも極性の強い主要成
分を生産する分離株として確認した。HPLCプロフィール
は、親培養にあるFK−523に相当するピークはなく、親
培養にある主要なFK−520ピークに相当するピークは僅
かに認められ、又（FK−520及びFK−523より）早いリテ
ンションタイムの２つの新しいピークが現れることを示
した。
キス0.1％、肉エキス0.1％、Ｎ−Z Amine typeA0.2％、
グルコース１％、寒天1.5％）から調製し、TM緩衝液
（0.05M Tris、0.05Mマレイン酸、NaOHでpH9に調節）中
2mg/mlの濃度にしたＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンで、室温でおだやかに攪拌しながら30
分間処理した。処理した胞子をベネット寒天上で単一コ
ロニーに平板培養した。これらのコロニーの発酵液のメ
タノール抽出液について、変異株のフェノタイプを薄層
クロマトグラフィー（TLC）で試験した。主題の変異株M
A 6646をクロロホルム：メタノール（9:1）の溶媒系で
主要親化合物（Ｌ−683,590）よりも極性の強い主要成
分を生産する分離株として確認した。HPLCプロフィール
は、親培養にあるFK−523に相当するピークはなく、親
培養にある主要なFK−520ピークに相当するピークは僅
かに認められ、又（FK−520及びFK−523より）早いリテ
ンションタイムの２つの新しいピークが現れることを示
した。
元の変異株「断片（patch）」の12の再分離株の発酵、
抽出及びTLCとHPLC分析により変異株のフェノタイプの
確認を行った。この発酵はKNO30.2％、Hycase SF2％、D
ifco酵母エキス２％、グルコース２％、FeSO4・7H2O 0.
025％、Nacl0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、MnSO4・7H2O
0.0005％、ZnSO4・7H3 0.001％、及びCal2・2H2O 0.00
2％から成り、蒸溜水で調製し、オートクレープ殺菌し
た植菌培地の44mlを含む250ml邪魔板付きエルレンマイ
ヤーフラスコへの植菌を含む。植菌培地はベネット培地
からの胞子を植菌し、220rpmで稼働する回転振盪機上
で、27℃で42〜48時間定温保持した。得られる植菌培養
の1.0mlを、グリセリン2.5％、グルコース2.2％、コー
ンスティープリカー1.5％、Difco酵母エキス1.5％、乳
酸0.2（v/v）、Ｌ−チロシン0.4％、MOPS 1％、及びCaC
O3 0.025％から成り、蒸溜水で調製し、オートクレープ
殺菌前NaOHでpH6.8に調節した生産培地を含む250mlの邪
魔板のないエルレンマイヤーフラスコに植菌するのに用
いた。生産培養は220rpmで稼働する回転振盪機上で27℃
で96時間定温保持した。培養液に等量のメタノールを添
加し、Eberbach往復振盪機上で高速で20分間撹拌し、次
いで遠心分離することによりメタノール抽出を行った。
水性メタノール抽出液をTLCとHPLCにより分析した。
抽出及びTLCとHPLC分析により変異株のフェノタイプの
確認を行った。この発酵はKNO30.2％、Hycase SF2％、D
ifco酵母エキス２％、グルコース２％、FeSO4・7H2O 0.
025％、Nacl0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、MnSO4・7H2O
0.0005％、ZnSO4・7H3 0.001％、及びCal2・2H2O 0.00
2％から成り、蒸溜水で調製し、オートクレープ殺菌し
た植菌培地の44mlを含む250ml邪魔板付きエルレンマイ
ヤーフラスコへの植菌を含む。植菌培地はベネット培地
からの胞子を植菌し、220rpmで稼働する回転振盪機上
で、27℃で42〜48時間定温保持した。得られる植菌培養
の1.0mlを、グリセリン2.5％、グルコース2.2％、コー
ンスティープリカー1.5％、Difco酵母エキス1.5％、乳
酸0.2（v/v）、Ｌ−チロシン0.4％、MOPS 1％、及びCaC
O3 0.025％から成り、蒸溜水で調製し、オートクレープ
殺菌前NaOHでpH6.8に調節した生産培地を含む250mlの邪
魔板のないエルレンマイヤーフラスコに植菌するのに用
いた。生産培養は220rpmで稼働する回転振盪機上で27℃
で96時間定温保持した。培養液に等量のメタノールを添
加し、Eberbach往復振盪機上で高速で20分間撹拌し、次
いで遠心分離することによりメタノール抽出を行った。
水性メタノール抽出液をTLCとHPLCにより分析した。
逆相HPLC（Whatman Partisil 5 ODS−３、0.1％H3PO4水
溶液:CH3CN（40:60）、1ml/分）によると、すべての分
離株の主要成分のリテンションタイムはFK−520の7.97
分に対して5.97分であった。この成分は31−デスメチル
−Ｌ−683,590（Ｌ−683,742）とHPLCのリテンションタ
イム及びTLCのＲｆが同一であった。
溶液:CH3CN（40:60）、1ml/分）によると、すべての分
離株の主要成分のリテンションタイムはFK−520の7.97
分に対して5.97分であった。この成分は31−デスメチル
−Ｌ−683,590（Ｌ−683,742）とHPLCのリテンションタ
イム及びTLCのＲｆが同一であった。
構造決定のため、化合物を半調製用逆相オクタデシルC
18HPLCカラム（Whatman Magnum 9,Partisil 10 DS−
３）で単離した。変異株の４つの振盪フラスコ培養を等
量のメタノールで抽出し、遠心分離し、上澄液を蒸発し
てメタノールを除いた。得られた水層を二塩化メチレン
で２回抽出し、窒素気流下で蒸発乾繰した。残留物をメ
タノールに再懸濁し、その1mlを半調製用カラムに注入
した。溶媒系はH2O:CH3CN（40:60）であり、流速は3ml/
分であった。9.4分と12分の間に溶離する幅広いピーク
を集め、窒素気流下で蒸発し、1mlのメタノールに再懸
濁した。試料の濃度を分析用HPLCで測定すると約4.5mg/
mlであった。この試料の希釈液をIL−２検定に当てた。
その結果希釈した試料は陽性の免疫抑制活性を示した。
NMR分析は変異株により生産される化合物がＬ−683,742
と同一であることを決定した。
18HPLCカラム（Whatman Magnum 9,Partisil 10 DS−
３）で単離した。変異株の４つの振盪フラスコ培養を等
量のメタノールで抽出し、遠心分離し、上澄液を蒸発し
てメタノールを除いた。得られた水層を二塩化メチレン
で２回抽出し、窒素気流下で蒸発乾繰した。残留物をメ
タノールに再懸濁し、その1mlを半調製用カラムに注入
した。溶媒系はH2O:CH3CN（40:60）であり、流速は3ml/
分であった。9.4分と12分の間に溶離する幅広いピーク
を集め、窒素気流下で蒸発し、1mlのメタノールに再懸
濁した。試料の濃度を分析用HPLCで測定すると約4.5mg/
mlであった。この試料の希釈液をIL−２検定に当てた。
その結果希釈した試料は陽性の免疫抑制活性を示した。
NMR分析は変異株により生産される化合物がＬ−683,742
と同一であることを決定した。
Ｃ−31 Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の変異が
イムノマイシンＣ−31 Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
を不活性化し、その結果Ｌ−683,742の効率的な生産に
つながると考えることは合理的である。更に、この変異
はＣ−13とＣ−15のＯ−メチル化に影響せず、このこと
は異なる蛋白質又は複数の蛋白質がＬ−683,742とＬ−6
83,590のこれらの位置のＯ−メチル化に対応することを
示していることに注意すべきである。
イムノマイシンＣ−31 Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
を不活性化し、その結果Ｌ−683,742の効率的な生産に
つながると考えることは合理的である。更に、この変異
はＣ−13とＣ−15のＯ−メチル化に影響せず、このこと
は異なる蛋白質又は複数の蛋白質がＬ−683,742とＬ−6
83,590のこれらの位置のＯ−メチル化に対応することを
示していることに注意すべきである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:55） (72)発明者 スーザン ジエー．ダニス アメリカ合衆国，07436 ニユージヤーシ イ，オークランド，ヒアワサ ブールヴア ード 73
Claims (6)
- 【請求項１】構造式 の免疫抑制剤を製造するための方法において、 前記免疫抑制剤を生産するストレプトマイセスの変異株
を、8.0以下のpHで窒素栄養源を含む水性炭水化物培地
中で液中好気的発酵条件下で前記免疫抑制剤を生産する
に十分な時間培養することを特徴とする方法。 - 【請求項２】構造式 のＬ−683,742として同定される免疫抑制剤を製造する
ための方法において、 Ｌ−683,742生産性ストレプトマイセス ハイグロスコ
ピカス 亜種 アスコマイセティカスである変異株を、
8.0以下のpHで窒素栄養源を含む水性炭水化物培地中で
液中好気的発酵条件下でＬ−683,742を生産するに十分
な時間培養することを特徴とする方法。 - 【請求項３】前記微生物変異株がATCC No.53855である
請求項２記載の製造方法。 - 【請求項４】Ｔ細胞活性化を阻害する請求項２記載の製
造方法で製造される発酵液。 - 【請求項５】微生物変異株であるストレプトマイセス
ハイグロスコピカス 亜種 アスコマイセティカス、AT
CC No.53855。 - 【請求項６】生物学的に純粋な形態である請求項５記載
の変異株微生物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US32365389A | 1989-03-15 | 1989-03-15 | |
| US323653 | 1989-03-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03201992A JPH03201992A (ja) | 1991-09-03 |
| JPH0698010B2 true JPH0698010B2 (ja) | 1994-12-07 |
Family
ID=23260133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2062847A Expired - Lifetime JPH0698010B2 (ja) | 1989-03-15 | 1990-03-15 | 免疫抑制剤の新規な製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0388152B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0698010B2 (ja) |
| CA (1) | CA2012274A1 (ja) |
| DE (1) | DE69013189T2 (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5208228A (en) * | 1989-11-13 | 1993-05-04 | Merck & Co., Inc. | Aminomacrolides and derivatives having immunosuppressive activity |
| CA2051872A1 (en) * | 1990-09-24 | 1992-03-25 | Kevin M. Byrne | Directed biosynthesis process for prolyl-immunomycin |
| US5143918A (en) * | 1990-10-11 | 1992-09-01 | Merck & Co., Inc. | Halomacrolides and derivatives having immunosuppressive activity |
| CA2054128A1 (en) * | 1990-10-29 | 1992-04-30 | Kevin M. Byrne | Process for the production of analogues of immunomycin |
| US5162334A (en) * | 1991-05-13 | 1992-11-10 | Merck & Co., Inc. | Amino O-alkyl, O-alkenyl and O-alkynlmacrolides having immunosuppressive activity |
| US5565560A (en) * | 1991-05-13 | 1996-10-15 | Merck & Co., Inc. | O-Aryl,O-alkyl,O-alkenyl and O-alkynylmacrolides having immunosuppressive activity |
| US5250678A (en) | 1991-05-13 | 1993-10-05 | Merck & Co., Inc. | O-aryl, O-alkyl, O-alkenyl and O-alkynylmacrolides having immunosuppressive activity |
| US5273979A (en) * | 1991-08-01 | 1993-12-28 | Merck & Co., Inc. | C-31 desmethyl FR-900520 cyclic hemiketal immunosuppressant agent |
| US5189042A (en) * | 1991-08-22 | 1993-02-23 | Merck & Co. Inc. | Fluoromacrolides having immunosuppressive activity |
| US5208241A (en) * | 1991-09-09 | 1993-05-04 | Merck & Co., Inc. | N-heteroaryl, n-alkylheteroaryl, n-alkenylheteroaryl and n-alkynylheteroarylmacrolides having immunosuppressive activity |
| US5221625A (en) * | 1992-01-10 | 1993-06-22 | Merck & Co., Inc. | Cyclcic FR-900520 microbial biotransformation agent |
| US5284840A (en) * | 1992-06-12 | 1994-02-08 | Merck & Co., Inc. | Alkylidene macrolides having immunosuppressive activity |
| US5284877A (en) * | 1992-06-12 | 1994-02-08 | Merck & Co., Inc. | Alkyl and alkenyl macrolides having immunosuppressive activity |
| US5264355A (en) * | 1992-07-02 | 1993-11-23 | Merck & Co., Inc. | Methlating enzyme from streptomyces MA6858 |
| US5268282A (en) * | 1992-09-28 | 1993-12-07 | Merck & Co., Inc. | Cyclic FR-900520 microbial biotransformation agent |
| US5268281A (en) * | 1992-09-28 | 1993-12-07 | Merck & Co., Inc. | Cyclic FR-900520 microbial biotransformation agent |
| US5283183A (en) * | 1992-09-28 | 1994-02-01 | Merck & Co., Inc. | Cyclic FR-900520 microbial biotransformation agent |
| US5290689A (en) * | 1992-09-28 | 1994-03-01 | Merck & Co., Inc. | New cyclic FR-900520 microbial biotransformation agent |
| US5693648A (en) * | 1994-09-30 | 1997-12-02 | Merck & Co., Inc. | O-aryl, O-alkyl, O-alkenyl and O-alkynyl-macrolides having immunosuppressive activity |
| WO2000040219A1 (en) | 1998-12-30 | 2000-07-13 | Dexcel Ltd. | Dispersible concentrate for the delivery of cyclosporin |
| US7732404B2 (en) | 1999-12-30 | 2010-06-08 | Dexcel Ltd | Pro-nanodispersion for the delivery of cyclosporin |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4894366A (en) * | 1984-12-03 | 1990-01-16 | Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. | Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same |
| DE68921934T2 (de) * | 1988-06-29 | 1995-10-19 | Merck & Co Inc | Immunsuppressives Agens. |
| DE68925080T2 (de) * | 1988-08-01 | 1996-05-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | FR-901154- und FR-901155-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung |
-
1990
- 1990-03-13 EP EP90302669A patent/EP0388152B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-13 DE DE69013189T patent/DE69013189T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-15 CA CA002012274A patent/CA2012274A1/en not_active Abandoned
- 1990-03-15 JP JP2062847A patent/JPH0698010B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03201992A (ja) | 1991-09-03 |
| DE69013189D1 (de) | 1994-11-17 |
| EP0388152B1 (en) | 1994-10-12 |
| EP0388152A3 (en) | 1991-05-15 |
| EP0388152A2 (en) | 1990-09-19 |
| DE69013189T2 (de) | 1995-05-11 |
| CA2012274A1 (en) | 1990-09-15 |
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