CN113174344B - 一种产膜海鞘素b的菌种及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)HDCC00053，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22003。所述的运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)HDCC00053(CGMCC NO.22003)为一株全新的膜海鞘素B产生菌，生产能力高，其产生膜海鞘素B的能力比现有技术中其他菌种有了大幅度的提高，膜海鞘素B的效价可达到在300mg/L以上，有利于实现工业化生产。

Description

一种产膜海鞘素B的菌种及其应用

技术领域

本发明涉及工业微生物发酵技术领域，具体涉及一种产膜海鞘素B的菌种及其应用。

背景技术

膜海鞘素B(didemnin B)源于美国伊利诺州立大学Rinehart教授小组于1981年从加勒比海域生息的一种进化较低的原索动物Didemnum solidum体内发现。膜海鞘素B属于环状缩酚酸肽类化合物，于1984年进入I期临床实验阶段(由辉瑞开发，曾处于临床二期，用于治疗脑肿瘤，恶性肿瘤和非霍奇金淋巴瘤)，是第1个在美国进入临床研究的海洋天然产物。体内筛选结果显示，膜海鞘素B具有强烈的抗P388白血病和B16黑色素瘤活性，可诱导HL-60肿瘤细胞的迅速凋亡以及许多转化细胞的凋亡，进一步药理研究表明，该化合物对L1210白血病细胞的IC50为2ng/mL。目前该化合物及更多的衍生物正在进行一系列的研究中，有望发现疗效更好、毒副作用更低的抗肿瘤药物。

由于膜海鞘素B所具有的生物学和化学特性，在开展相关的抗肿瘤生物活性检测实验及得到更多的衍生物中，需要大量制备相应的膜海鞘素B样品，以满足各种临床前的活性研究，而现目前，已报道的关于膜海鞘素B的制备方法主要有化学合成法和微生物发酵法，其中文献Efficient Total Synthesis of Didemnins A and B和文献TotalSynthesis of Didemnins A,B,and C报道了化学合成方法，但合成方法仅停留在实验室阶段，且化学合成存在反应步骤长，收率低的问题。现有技术报道的微生物发酵产膜海鞘素B的效价水平普遍较低，JP2012240974A报道了运动型Citrella mobilis YIT12409(FERMAP-22080)的菌株，该菌株具有生产膜海鞘素B的能力，其效价通过计算得出约为20mg/L。文献Bacterial Production of the Tunicate-Derived Antitumor Cyclic DepsipeptideDidemnin B中报道的α-proteobacterium Tistrella mobilis产膜海鞘素B的效价约为3.2mg/L；文献Bacterial Biosynthesis and Maturation of the Didemnin Anti-cancerAgents也报道了通过微生物T.mobilis KA081020-065发酵得到0.2mg/L产量低。

综上所述，针对现有技术中发酵获得膜海鞘素B存在发酵产量低，而化学合成制备工艺中存在的合成步骤长、收率低，较不安全等一系列的问题，因此，本发明寻求一种新的微生物，并可通过简单的发酵即可获得较高发酵产量的膜海鞘素B，从而实现膜海鞘素B较低的生产成本。

发明内容

为了解决膜海鞘素B现有制备方法不足的问题，本发明的目的之一在于提供一种新的膜海鞘素B生产菌，该菌为运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)HDCC00053，于2021年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.22003，并登记在册，证明存活。

本发明所述的菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的目的还在于提供了一种运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)HDCC00053(CGMCC NO.22003)在制备膜海鞘素B中的应用。

本发明还提供了一种膜海鞘素B的制备方法，该方法包括采用运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)HDCC00053(CGMCC NO.22003)在含有碳源、氮源和无机盐的营养培养基里，进行有氧发酵得到。

本发明所述的实施方案中，所述的碳源选自甘油、糊精、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇或任意几种的组合，进一步优选为甘油、糊精、淀粉、乳糖或任意几种的组合，更优选为甘油、糊精或它们的组合。

在优选的实施方案中，所述的氮源选自酵母类氮源(包括但不限于酵母粉、酵母浸粉、酵母膏、酵母蛋白胨)、蛋白胨(包括植物蛋白胨或动物源蛋白胨)、酪蛋白、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豌豆蛋白、酪氨酸、黄豆(饼)粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉、花生饼粉、尿素、(亚)硝酸盐、铵盐或任意几种的组合；优选为酵母类氮源(包括但不限于酵母粉、酵母浸粉、酵母膏、酵母蛋白胨)、蛋白胨(包括植物蛋白胨和动物源蛋白胨)、酪蛋白、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豌豆蛋白、酪氨酸或任意几种的组合；更优选为酵母类氮源(包括但不限于酵母粉、酵母浸粉、酵母膏、酵母蛋白胨)、蛋白胨(包括植物蛋白胨或动物源蛋白胨)、酪氨酸或任意几种的组合。

在优选的实施方案中，所述无机盐选自海水晶、氯化钠、醋酸盐、硫酸盐、硝酸盐以及镁、钴、锌、(亚)铁、锰、铜、钼酸根离子或任意几种的组合；优选为海水晶、氯化钠、醋酸盐、硫酸盐以及镁、钴、锌离子或任意几种的组合；更优选为海水晶、氯化钠、醋酸钠、硫酸镁、硫酸锌、氯化钴或任意几种的组合。

在优选的实施方案中，所述营养培养基包含或由以下重量百分含量的组分组成：乳糖2～7％，葡萄糖0～2％，甘油1～10％，糊精0～8％，酵母抽提粉0.5～3％，蛋白胨0.5～4％，硫酸镁0.05～0.4％，氯化钠0.2～3％，海水晶0～3％，酪氨酸0.1～2％，氯化钴0～0.001％，硫酸锌0～0.001％，消泡剂0～0.1％，余量为水；进一步优选为：乳糖4％，葡萄糖1％，甘油2％，酵母抽提粉1％，蛋白胨1.5％，硫酸镁0.2％，氯化钠2％，氯化钴0.0005％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％，余量为水；所述的葡萄糖、糊精、海水晶、氯化钴、硫酸锌、消泡剂可取0。

在优选的实施方案中，所述的发酵温度25～32℃，进一步优选为28～30℃；溶氧5～40％，进一步优选为5～15％；pH控制在6.8～8.8，进一步优选为7.0～7.8；所述发酵培养时间为3～14天，进一步优选为3～7天。

在优选的实施方案中，发酵过程第2天开始，当甘油浓度低于1.0％或溶铵低于400ppm时向发酵培养基中添加补料碳源和氮源；作为进一步优选，补料碳源(包括不限于甘油、乳糖或其组合)的日均补料浓度为1～3％，补料氮源(包括不限于酵母抽提粉、蛋白胨或其组合)的日均补料浓度为0.3～1.5％。

在优选的实施方案中，所述的发酵培养是将运动替斯崔纳菌(Tistrellamobilis)HDCC00053(CGMCC NO.22003)在种子培养后，接种到发酵培养基进行发酵培养。

在优选的实施方案中，所述发酵的菌种接种量为2～20％，进一步优选为4～10％。

在优选的实施方案中，所述的种子培养基包含或者组成为碳源、氮源和无机盐。

在优选的实施方案中，所述的碳源选自半乳糖、甘油、糊精、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇或任意几种的组合，进一步优选甘油、糊精、乳糖或任意几种的组合，更优选为甘油、乳糖或它们的组合。

在优选的实施方案中，所述的氮源选自酵母类氮源(包括酵母粉、酵母浸粉、酵母膏、酵母蛋白胨)、蛋白胨(包括植物蛋白胨和动物源蛋白胨)、酪蛋白、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豌豆蛋白或任意几种的组合，优选为酵母类氮源(包括酵母粉、酵母浸粉、酵母膏、酵母蛋白胨)、蛋白胨(包括植物蛋白胨和动物源蛋白胨)或任意几种的组合，更优选为酵母浸粉、蛋白胨或它们的组合。

在优选的实施方案中，所述无机盐选自氯化钠(或其等效替代物，包括但不限于海盐、海水晶)、醋酸钠或它们的组合。

在优选的实施方案中，所述种子培养基包含或由其组成：甘油0～3％，葡萄糖0～1.5％，乳糖0～1.5％，酵母类有机氮源0.2～2％，蛋白胨0～2％，氯化钠0.1～2％，醋酸钠0～1％；进一步优选为：乳糖1.2～1.8％，葡萄糖0.4～0.8％，酵母抽提粉0.6％，蛋白胨1％，氯化钠2％，消泡剂0～0.1％，余量为水。

在优选的实施方案中，所述的种子培养基包括一级种子培养基和二级种子培养基，所述一级培养基与二级培养基可以相同或不同；进一步所述的一级种子培养基优选为乳糖1.2％，葡萄糖0.4％，酵母抽提粉0.6％，蛋白胨1％，氯化钠2％，余量为水；进一步，所述的二级种子培养基乳糖1.8％，葡萄糖0.8％，酵母抽提粉0.5％，蛋白胨1.5％，氯化钠2％，消泡剂0.05％，余量为水。

在优选的实施方案中，所述的一级种子培养过程中：接种量≥1％，进一步优选为4％；温度25～34℃，进一步优选为28～30℃；装量50～1000ml，进一步优选为400～700ml；转速≥200rpm，进一步优选为220～270rpm；培养周期20～54h，进一步优选为40～48h。

在优选的实施方案中，所述的二级种子培养过程中：接种量≥0.03％，进一步优选为0.1～0.5％；温度25～34℃，进一步优选为28～30℃；溶氧≥25％，进一步优选为≥35％；pH≥6.5，进一步优选为6.8～7.8；培养周期20～54h，进一步优选为20～48h。

进一步，较为具体的，所述的种子运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)HDCC00053(CGMCC NO.22003)在种子培养前通过接种到斜面培养活化(25～34℃，2～5d)，用无菌水将菌苔洗下，打散，制备成菌悬液。

所述的斜面(固体)培养基可以为乳糖、甘油、葡萄糖、酵母类有机氮源、蛋白胨、氯化钠(或其等效替代物)、琼脂的组合，例如乳糖0.4％，甘油0.4％，酵母抽提粉0.6％，蛋白胨1％，氯化钠2％，琼脂1.8％。pH7.0，灭菌条件121℃、30min。

本发明所述的菌株运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)HDCC00053的特性：菌落约3-5mm，呈白色或灰白色，不透明，表面光滑湿润或极少许褶皱，圆形且边缘规则，革兰氏染色阴性。

本发明所保护的膜海鞘素B生产菌株运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)HDCC00053(CGMCC NO.22003)为一株全新的膜海鞘素B产生菌，生产能力高，其产生膜海鞘素B的能力比现有技术中其他菌种有了大幅度的提高，膜海鞘素B的效价可达到在300mg/L以上，有利于实现工业化生产。

附图说明

图1为CGMCC NO.22003菌株能力鉴定发酵液HPLC图谱；

图2为CGMCC NO.22003菌株能力鉴定发酵液LCMS图谱；

图3为CGMCC NO.22003菌株优化工艺摇瓶发酵液HPLC图谱；

图4为CGMCC NO.22003菌株优化工艺罐发酵液HPLC图谱。

具体实施方式

下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下述实施例中LCMS、HPLC方法检测发酵液中膜海鞘素B，均以星膜海鞘素B标准品作为对照，LCMS的检测条件：

设备：LC-1260-MS-6540QTOF

色谱柱：C18，150×4.6mm，1.8μm

波长：210nm

柱温：40℃

流速：1ml/min

进样量：5μl

运行：10min

流动相：59％乙腈

HPLC检测条件如下：

色谱柱：C18，50×4.6mm，1.8μm

波长：210nm

柱温：40℃

流速：1ml/min

进样量：5μl

运行：5min

流动相：59％乙腈

实施例1菌株来源

从浙江省舟山市东极岛附近海域，用多管采样器分别采集到表面海水、深层海水(约50m)、底部海水、海底沉积物(淡黄色)样品共34个。每个样品取5ml(g)接种到富集培养基，28℃、220rpm避光振荡培养5d，用无菌生理盐水梯度稀释后涂布到2216E海洋琼脂培养基，置于28℃、70％湿度条件下避光培养3d，选取表面灰白色、光滑、无褶皱、规则圆形的菌落，分别保种，同时采用液体2216E海洋培养基于28℃220rpm条件下扩培54h，然后接种到摇瓶初筛培养基(1％半乳糖，1.5％蛋白胨，1％葡萄糖，0.2％酵母抽提粉)，28℃、220rpm培养，不同培养周期的样品预处理后采用HPLC进行检测，以对照品进行比对。结果发现TM264、TM887号菌株培养4～7d的发酵液中均检测到了与对照品相对保留时间吻合的组分，经LCMS测定分子量与对照品吻合，均为1112。从发酵效价评定，TM887号菌株的生产能力明显高于TM264菌株，故选定TM887号为生产菌株，赋予原始编号HDCC00053，接种斜面后置于28℃、55％湿度恒温箱内培养3天后收集菌体进行16S rRNA测序，结果发现该菌种与运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis KA081020-065)16S rRNA序列同源性达到99％，确定为运动替斯崔纳菌。将原始编号HDCC00053菌种斜面于2021年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22003。保藏斜面培养基组成为：乳糖0.4％，甘油0.4％，酵母抽提粉0.6％，蛋白胨1％，氯化钠2％，琼脂1.8％。

实施例2CGMCC NO.22003菌株生理生化试验

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》、《常见细菌***鉴定手册》等参考书中的方法进行生理生化实验。本实施例中除温度试验外，其他试验均为28℃培养3～10天。

形态特征：

将CGMCC NO.22003菌种甘油管悬液梯度稀释到10^-5，分离涂布接种到改良平板培养基，置于28℃、55％湿度恒温箱内培养5天，观察菌落形态特征。最终发现成熟菌落大小约3-5mm，呈白色或灰白色，不透明，表面光滑湿润或极少许褶皱，圆形且边缘规则，革兰氏染色阴性。

平板培养基配方组成：乳糖0.4％，甘油0.4％，酵母抽提粉0.6％，蛋白胨1％，氯化钠2％，琼脂1.8％。pH7.0，灭菌条件121℃、30min。

生理生化特征：详见表1～表5。

表1 CGMCC NO.22003菌株的碳源和氮源利用情况

表2 CGMCC NO.22003菌株主要的生理生化特征

试验项目	结果	试验项目	结果
				明胶液化	+	牛奶胨化	-
淀粉水解	+	硝酸盐还原	+
				精氨酸水解	+	吲哚	+
氧化酶	+	V.P实验	+
				过氧化氢酶	+	M.R实验	-
β-半乳糖苷酶	+	/	/

表3 CGMCC NO.22003菌株生长pH试验

pH	2.0	3.0	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0	9.0
									生长情况	0	0	1	1	2	4	4	3

表4 CGMCC NO.22003菌株生长温度试验

温度(℃)	7	14	25	28	37	45
							生长情况	0	0	3	4	4	0

表5 CGMCC NO.22003菌株对NaCl的耐受性

NaCl浓度	1％	4％	7％	10％
					菌株生长情况	3	2	0	0

*注：0，无生长；1，生长很弱；2，能生长；3，生长良好；4，生长最好；+，阳性；-，阴性；w，弱。

实施例3 CGMCC NO.22003菌株生产膜海鞘素B能力确认

1)取分离纯化后的CGMCC NO.22003菌株工作菌种甘油管，解冻后用无菌生理盐水梯度稀释至10^-2，吸取0.1ml稀释液接种到2216E海洋琼脂培养基斜面并涂布均匀，置于28℃、70％相对湿度条件下避光培养3d，获得斜面菌苔。

2)取培养成熟的斜面，加入10ml无菌生理盐水，将菌苔刮下，打散，获得菌悬液。

3)吸取菌悬液8ml，接种到含有400ml摇瓶发酵培养基的2800ml三角瓶中，包扎好后置于25℃，140rpm的摇床上振荡培养至14天。

其中，摇瓶发酵培养基配方组成为：0.1％半乳糖，0.1％明胶蛋白胨，0.1％甘油，0.15％酵母抽提粉，0.5％蛋白胨，3％XAD-7树脂。

4)摇瓶发酵结束后，将400ml摇瓶发酵液离心，收集菌体和XAD-7树脂，用200ml无水甲醇振荡浸泡2h，离心，收集上清液，菌渣和树脂再用200ml新鲜无水甲醇继续振荡浸泡2h，离心，收集上清液。将两次上清液合并后，旋转蒸发浓缩至膏状，然后加入200ml乙酸乙酯复溶后分离获得乙酸乙酯相，再次旋转蒸发浓缩干，然后用40ml无水甲醇复溶。取复溶液2ml，采用0.45μm滤膜过滤后采用HPLC和LCMS进行分析检测。

5)HPLC和LCMS检测图谱分别如附图1、附图2所示。HPLC和LCMS分析确认该发酵液中包含膜海鞘素B(精确分子量1111.64)，通过对照品换算后，膜海鞘素B的含量为10.3μg/ml。

实施例4摇瓶发酵制备膜海鞘素B

1)取分离纯化后的CGMCC NO.22003菌株工作菌种甘油管，解冻后用无菌生理盐水梯度稀释至10^-2，吸取0.1ml稀释液接种到改良的斜面培养基涂布均匀，置于28℃、70％相对湿度条件下避光培养3d，获得斜面菌苔。

2)取培养成熟的斜面，加入10ml无菌生理盐水，将菌苔刮下，打散，获得菌悬液。

3)吸取菌悬液10ml，接种到含有500ml优化的摇瓶种子培养基中，包扎好后置于30℃，220rpm的摇床上振荡培养至2天。

其中，优化的摇瓶种子培养基配方组成为：乳糖1.2％，葡萄糖0.4％，酵母抽提粉0.6％，蛋白胨1％，氯化钠2％。

4)种子培养成熟后，吸取种子培养液4ml，接种到含有100ml优化的摇瓶发酵培养基中，包扎好后置于30℃，220rpm的摇床上振荡培养至7天。

其中，优化的摇瓶发酵培养基配方组成为：乳糖5％，葡萄糖2％，淀粉1.5％，酵母抽提粉1％，蛋白胨1％，醋酸钠0.5％，硫酸镁0.2％，氯化钠2％，氯化钴0.0005％，硫酸锌0.0004％。

5)摇瓶发酵结束后，取发酵液1ml，加入3ml无水甲醇，混匀后超声处理2h，再次混匀后14000rpm离心10min，用0.45μm滤膜过滤后采用HPLC进行定量分析，测得该发酵液中膜海鞘素B的含量为307μg/mL，该发酵液HPLC图谱如附图4所示。

实施例5罐发酵制备膜海鞘素B

1)取分离纯化后的CGMCC NO.22003菌株工作菌种甘油管，解冻后用无菌生理盐水梯度稀释至10^-2，吸取0.1ml稀释液接种到改良的斜面培养基涂布均匀，置于28℃、70％相对湿度条件下避光培养3d，获得斜面菌苔。

2)取培养成熟的斜面，加入10ml无菌生理盐水，将菌苔刮下，打散，获得菌悬液。

3)吸取菌悬液10ml，接种到含有500ml优化的一级摇瓶种子培养基中，包扎好后置于30℃，220rpm的摇床上振荡培养至2天。

其中，优化的一级摇瓶种子培养基配方组成为：乳糖1.2％，葡萄糖0.4％，酵母抽提粉0.6％，蛋白胨1％，氯化钠2％。

4)一级种子培养成熟后，取种子培养液50ml，接种到含有10L优化的二级种子培养基(种子罐)中，培养温度28～30℃，溶氧控制≥35％，pH控制6.8～7.8，培养周期42h。

其中，优化的二级种子培养基配方组成为：乳糖1.8％，葡萄糖0.8％，酵母抽提粉0.5％，蛋白胨1.5％，氯化钠2％，消泡剂0.05％。

5)二级种子培养成熟后，将二级种液按照10％的比例接种到优化的罐发酵培养基中，发酵温度28～30℃，起始搅拌150rpm，空气流量0.5vvm，溶氧联动控制范围5～15％，pH酸碱联合控制7.0～7.8。发酵培养2天后，开始流加补料，碳源(甘油、乳糖混合)的日均补料浓度为1～3％，蛋白胨的日均补料浓度为0.3～1.5％，发酵培养至7天结束。

其中，优化的罐发酵培养基配方组成为：乳糖4％，葡萄糖1％，甘油2％，酵母抽提粉1％，蛋白胨1.5％，硫酸镁0.2％，氯化钠2％，氯化钴0.0005％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。优化的补料培养基配方组成为：30％甘油、10％乳糖，15％蛋白胨。

6)罐发酵结束后，取发酵液1ml，加入3ml无水甲醇，混匀后超声处理2h，再次混匀后14000rpm离心10min，用0.45μm滤膜过滤后采用HPLC进行定量分析，测得该发酵液中膜海鞘素B的含量为242μg/mL，该发酵液HPLC图谱如附图4所示。

序列表

<110> 浙江珲达生物科技有限公司

<120> 一种产膜海鞘素B的菌种及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1360

<212> DNA/RNA

<213> Tistrella mobilis

<400> 1

ctgcctccct tacgggtcag ctcaccggct tcgggtaaac caactcccat ggtgtgacgg 60

gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgttccgc gattactagc 120

gattccgact tcatgcactc gagttgcaga gtacaatccg aactgagacg actttttgag 180

attagcttca cctcgcgatg tcgctgccca ctgtagtcgc cattgtagca cgtgtgtagc 240

ccagcccata agggccatga ggacttgacg tcatccccac cttcctccgg cttatcaccg 300

gcagtttccc tagagtgccc agccgaactg atggcaacta aggatgaggg ttgcgctcgt 360

tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtgt 420

gacgtccggc cgaaccgaaa accccgtctc cagggtcgcg acgtccatgt caagggctgg 480

taaggttctg cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540

tcaattcctt tgagttttaa ccttgcggcc gtactcccca ggcggagtgc ttaacgcgtt 600

agctacgaca ctgcgatact aagtatccca acgtccagca ctcatcgttt acggcgtgga 660

ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg tgcctcagcg tcagtttcgg 720

gccaggcagc cgccttcgcc accggtgttc ttcccaatat ctacgaattt cacctctaca 780

ctgggaattc cactaccctc tcccgaactc cagcctacca gtctcaaaag cagttccgga 840

gttgagcccc gggctttcac ttctgacttg ataagccgcc tacgcacgct ttacgcccag 900

taaatccgaa caacgctagc ccccttcgta ttaccgcggc tgctggcacg aagttagccg 960

gggcttcttc tacgggtacc gtcattatct tccccgtcga aagagcttta caatccgaag 1020

accttcatca ctcacgcggc attgctggat caggctttcg cccattgtcc aatattcccc 1080

actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggct gatcatcctc 1140

tcagaccagc taccgatcgt cgccttggta ggccgttacc ccaccaacta gctaatcgga 1200

cgcgggctca tccatctacg gccgaagcct ttcccccgaa gggcgtatgc ggtattagct 1260

gcagtttccc gcagttattc cccatagatg ggcagattcc cacgtgttac tcacccgtgc 1320

gccacgtaag ccggaaccga agttccgacc ccgtcgactg 1360

Claims (33)

1.一种运动替斯崔纳菌(Tistrellamobilis)HDCC00053，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.22003，保藏日期为2021年3月12日。

2.一种如权利要求1所述的运动替斯崔纳菌(Tistrellamobilis)HDCC00053 (CGMCCNO.22003)在制备膜海鞘素B中的应用。

3.一种膜海鞘素B的制备方法，其特征在于：所述的包括采用权利要求1所述的运动替斯崔纳菌(Tistrellamobilis)HDCC00053在包含碳源、氮源和无机盐的营养培养基里，进行有氧发酵得到。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的碳源选自甘油、糊精、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇或任意几种的组合。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的碳源选自甘油、糊精、淀粉、乳糖或任意几种的组合。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的碳源选自甘油、糊精或两者组合。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的氮源选自酵母类氮源、蛋白胨、酪蛋白、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豌豆蛋白、酪氨酸、黄豆饼、黄豆粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉、花生饼粉、尿素、亚硝酸盐、硝酸盐、铵盐或任意几种的组合。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的氮源选自酵母类氮源、蛋白胨、酪蛋白、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豌豆蛋白、酪氨酸或任意几种的组合。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的氮源选自酵母类氮源、蛋白胨、酪氨酸或任意几种的组合。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的氮源选自酵母粉、酵母浸粉、酵母膏、酵母蛋白胨。

11.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选自海水晶、氯化钠、醋酸盐、硫酸盐、硝酸盐或镁、钴、锌、铁、亚铁、锰、铜、钼酸根离子或任意几种的组合。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述无机盐选自海水晶、氯化钠、醋酸盐、硫酸盐以及镁、钴、锌离子或任意几种的组合。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述无机盐选自海水晶、氯化钠、醋酸钠、硫酸镁、硫酸锌、氯化钴或任意几种的组合。

14.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述营养培养基包含或由其组成：乳糖2~7%，葡萄糖0~2%，甘油1~10%，糊精0~8%，酵母抽提粉0.5~3%，蛋白胨0.5~4%，硫酸镁0.05~0.4%，氯化钠0.2~3%，海水晶0~3%，酪氨酸0.1~2%，氯化钴0~0.001%，硫酸锌0~0.001%，消泡剂0~0.1%。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述营养培养基包含或由其组成：乳糖4%，葡萄糖1%，甘油2%，酵母抽提粉1%，蛋白胨1.5%，硫酸镁0.2%，氯化钠2%，氯化钴0.0005%，硫酸锌0.0004%，消泡剂0.05%。

16.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的发酵温度为25~32℃；溶氧5~40%；pH控制在6.8~8.8；所述发酵培养时间为3~14天。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于：所述的发酵温度为28~30℃；溶氧为5~15%；pH控制在7.0~7.8；所述发酵培养时间为3~7天。

18.如权利要求3所述的方法，其特征在于：还包括发酵过程向发酵培养基中添加补料碳源和氮源。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于：所述的补料碳源的日均补料浓度为1~3%，所述的补料碳源为甘油、乳糖或其组合；所述的补料氮源的日均补料浓度为0.3~1.5%，所述的补料氮源为酵母抽提粉、蛋白胨或其组合。

20.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的运动替斯崔纳菌(Tistrellamobilis)HDCC00053 (CGMCC NO.22003)是通过种子液接种到发酵培养基进行发酵培养；所述的种子液是将权利要求1所述的运动替斯崔纳菌(Tistrellamobilis)HDCC00053 (CGMCC NO.22003)在种子培养基中进行种子培养得到。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述的种子培养基包含或者组成为碳源、氮源和无机盐；所述的碳源选自半乳糖、甘油、糊精、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇或任意几种的组合；所述的氮源选自酵母类氮源、蛋白胨、酪蛋白、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豌豆蛋白或任意几种的组合。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述的碳源选自甘油、糊精、乳糖或任意几种的组合；所述的氮源选自酵母类氮源、蛋白胨或任意几种的组合。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于：所述的碳源选自甘油、乳糖或两者的组合；所述的氮源选自酵母浸粉、蛋白胨或两者的组合。

24.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选自氯化钠、海盐、海水晶、醋酸钠或任意几种的组合。

25.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述种子培养基包含或由其组成：甘油0~3%，葡萄糖0~1.5%，乳糖0~1.5%，酵母类有机氮源0.2~2%，蛋白胨0~2%，氯化钠0.1~2%，醋酸钠0~1%。

26.如权利要求24所述的方法，其特征在于：所述种子培养基包含或由其组成：乳糖1.2~1.8%，葡萄糖0.4~0.8%，酵母抽提粉0.6%，蛋白胨1%，氯化钠2%，消泡剂0~0.1%。

27.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述的种子培养基包括一级种子培养基和二级种子培养基，所述一级培养基与二级培养基可以相同或不同；

所述的一级种子培养基为乳糖1.2%，葡萄糖0.4%，酵母抽提粉0.6%，蛋白胨1%，氯化钠2%；所述的二级种子培养基为乳糖1.8%，葡萄糖0.8%，酵母抽提粉0.5%，蛋白胨1.5%，氯化钠2%，消泡剂0.05%。

28.如权利要求26所述的方法，其特征在于：所述的一级种子培养过程中：接种量≥1%，温度25~34℃，转速≥200rpm；培养周期20~54h；

所述的二级种子培养过程中：接种量≥0.03%；温度25~34℃；pH≥6.5；培养周期20~54h。

29.如权利要求27所述的方法，其特征在于：所述的一级种子培养过程中：接种量为4%，温度为28~30℃，转速为220~270rpm，培养周期为40~48h。

30.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述的二级种子培养过程中：接种量为0.1~0.5%；温度为28~30℃；pH为6.8~7.8；培养周期为20~48h。

31.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的运动替斯崔纳菌(Tistrellamobilis)HDCC00053 (CGMCC NO.22003)在种子培养前先接种到斜面培养活化。

32.如权利要求30所述的方法，其特征在于：所述的斜面培养基为乳糖、甘油、葡萄糖、酵母类有机氮源、蛋白胨、氯化钠、琼脂的组合。

33.如权利要求31所述的方法，其特征在于：所述的斜面培养基为乳糖0.4%，甘油0.4%，酵母抽提粉0.6%，蛋白胨1%，氯化钠2%，琼脂1.8%，pH7.0。

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