CN112831583A - 一种鉴定海洋沉积物中休眠体的方法 - Google Patents

一种鉴定海洋沉积物中休眠体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种检测或鉴定海洋沉积物中休眠体的方法。由目标藻种的特定区域获得特异性探针及引物，利用荧光原位杂交对沉积物中目标藻种休眠体进行检测，随后根据形态学观察定性筛选沉积物中经探针杂交标记的休眠体，将筛选的休眠体再经单细胞聚合酶链式反应进一步获知其种类。本方法既实现对休眠体的形态学观察，又可对目标休眠体的种类进行判决性鉴定，解决了判别某种藻类在自然界是否存在新型休眠体(即某种已知目标种类是否在自然条件下产生休眠体为未知，也未知可能的休眠体的形态特征)的难题，对于未知藻种，在未知区域的检测仍然有效。

Description

一种鉴定海洋沉积物中休眠体的方法
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种检测或鉴定海洋沉积物中休眠体的方法。
背景技术
某些微藻和浮游动物的生活史过程中常存在一个重要阶段，即休眠体时期(Resting stage)，或称休眠孢囊(Resting cyst)、休眠孢子(Spore)及休眠细胞(Restingcell)等(Dale,1983；Anderson,2012)。常见的能形成休眠体的微藻种类包括甲藻、硅藻、绿藻、针胞藻等(Cain et al.,1976；Dale,1983；Nakamura,1990；Mcquoid et al.,1996；Liet al.,1997)，及可形成休眠体的浮游动物如纤毛虫(Benitez et al.,1997；Zhan etal.,2017)。休眠体是应对不良生存环境发生的一种有效的生理反应机制，可为藻种提供保护，使得种群保存和延续，还能够潜在维持或提高藻类个体或种群生物遗传多样性。而且，对于一些海洋有害藻华(Harmful algal blooms)或赤潮(Red tide)原因种来说，休眠体不但可为藻华的年际爆发与复发提供种源，而且还能通过自然和人为传播方式实现地理扩散甚至生物入侵(Anderson,1988；Hallegraeff and Bolch,1991；Bravo and Figueroa,2014)。然而，仍有许多浮游生物未可知其是否可以产生休眠体，例如甲藻已知约2400种，但仅约10％的种类被证明可以产生休眠孢囊。因此，鉴定某一目标藻种在海洋环境中是否会产生休眠体(即新型休眠体，其从未被报道，且形态未知)，对其生理生态学、种下进化、种群动力学及藻华生态学等研究具有重要意义。
目前，休眠体的鉴定主要分为传统形态学观察和分子生物学鉴定两种手段。(1)形态学方法主要利用光学或扫描电子显微镜对休眠体及萌发后营养细胞的形态进行鉴定和分类(Matsuoka and Fukuyo,2000；王朝晖,2007；魏洪祥等,2011；王朝晖等,2011；Zonneveld and Pospelocva,2015)。然而，该方法往往首先依赖于已有文献资料和图谱，还取决于研究者根据自身知识和经验积累做出的判断，因而有时可能会对休眠体进行错误鉴定。但是对于新型休眠体来说，因为没有合适的图谱则无法明确鉴定。特别是那些丰度较低、细胞结构脆弱的休眠体，在传统方法处理过程中很容易丢失、破坏或者漏检，而那些体积较小和形态结构高度简单的休眠体，利用形态学鉴定往往因为鉴别特征的缺乏和难以清晰观察从而很难甚至不可能准确鉴别(唐赢中等,2016)。此外，即使基于休眠体萌发后对营养细胞的形态学鉴定，大多数也因为同属不同种之间的形态相似性而仅能鉴定到属水平，只有少数能鉴定到种水平。(2)分子生物学技术常用rDNA序列作为分子标记。基于该分子标记，常见的方法有普通PCR和实时荧光定量PCR技术、高通量测序技术、荧光原位杂交技术(Park et al.,2010；Portune,2008；Zhan et al.,2018；Dzhembekova et al.,2018)。然而，基于单一PCR类的技术往往无法获得新型休眠体形态学信息，而且死亡营养细胞或沉积物中残留的DNA有时会被检测出，进而影响结果的准确性。单一荧光原位杂交类技术有时因目标休眠体所带的自发荧光或探针的非特异性结合，会导致假阳性结果的产生(Kasai andKawamoto,1995)。(3)只有二种技术组合的方法仍然存在一些弊端。如荧光原位杂交和光学显微镜的形态学观察结合的手段无法完全排除探针非特异性结合或自发荧光的干扰；荧光原位杂交技术和环境DNA-PCR检测相结合的手段无法完全排除探针非特异性结合、自发荧光和环境DNA残留的干扰(Hattenrath-Lehmann et al.,2017)；环境DNA-PCR检测和形态学观察结合的手段依赖研究者对休眠体形态学背景知识，容易对休眠体进行错误鉴定或者完全无法鉴定(理由前已述及)，且环境DNA-PCR检测无法排除沉积物中DNA碎片干扰(Thohaet al,2019)。因此，一种休眠体特别是新型休眠体的特异性鉴定方法仍需被建立，要求既能获得休眠体形态学特征，又能准确获取其分类学信息(即身份鉴定)。
发明内容
针对背景技术中存在的问题及不足，本发明的目的在于提供一种鉴定、检测海洋沉积物中休眠体的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种鉴定海洋沉积物中休眠体的方法，由目标藻种特定区域(核糖体基因的特定区域)获得特异性探针及引物，利用荧光原位杂交鉴定沉积物中是否存在目标藻种休眠体，随后根据形态学观察定性筛选沉积物中经探针杂交标记的休眠体，将筛选的休眠体再经单细胞聚合酶链式反应和测序进一步获知其种类。
所述目标藻种的特定区域获得特异性探针及引物的获得为在核糖体基因大亚基(28S rDNA)高可变区D2区域设计目标种的特异性探针及引物，对设计的探针采用至少一种颜色的荧光染料分别标记。
所述特异性探针及引物为获取目标藻种及其他同属或异属的28S rDNA序列，在D2区域设计目标种特异性探针，并在探针5’端添加异硫氰酸荧光素(FITC)或花青类(Cy3)荧光基团。
将待鉴定沉积物样品根据密度梯度离心原理，使用多聚钨酸钠溶液(SPT)对沉积物样品进行离心和休眠体富集，而后加入双色荧光基团的探针和引物进行杂交，杂交后在暗室内使用荧光显微镜进行观察，筛选出杂交产物中经探针标记的休眠体，待用。
所述形态学观察时显微镜荧光设置为450–480nm激发波长，大于515nm的发射波长，视野下被探针标记的休眠体呈现黄绿色；设置为530–550nm激发波长，大于575nm的发射波长，视野下被探针标记的休眠体呈现橘红色；即，筛选出同时被两种颜色探针杂交上的休眠体并拍照记录其形态特征。
所述检测：获取目标藻种及其他同或异属的28S rDNA序列，在D2区域设计目标种特异性探针，并在探针5’端添加异硫氰酸荧光素(FITC)或花青类(Cy3)荧光基团。探针的荧光效果根据与目的种营养细胞杂交后的结果进行判断筛选，或对未知种类同时设计二个以上探针以保证检测成功率。探针的特异性根据与同属其他种进行FISH杂交以及NCBI数据库比对的结果进行筛选和判断，若无与其他藻种杂交，且不与目标藻种外其他物种序列高度匹配(即Coverage＝100％,Identity＝100％)，则为合格探针。对于营养细胞无法获得的种类，FISH检测之后的单细胞PCR和测序将排除假阳性检测结果。最后将合格探针同时添加上述两种颜色荧光基团，存于-20℃保存。FISH实验前，根据密度梯度离心原理，使用多聚钨酸钠溶液(SPT)对沉积物样品中的休眠体进行富集，并短暂存于黑暗4℃条件下。
具体为：
在上述准备工作完成后，进行FISH杂交实验，具体流程为：
1)使用4％多聚甲醛在4℃黑暗条件下处理样品，并放置12-16h。
2)离心弃上清，并加入适量无水乙醇在冰上处理数分钟。随后，离心弃上清，室温下倒置晾干数分钟。
3)使用终浓度0.5％的Triton X-100solution在37℃下处理15min，离心弃上清，使用浓度为1μg/mL的蛋白酶K在37℃下处理1h。
4)离心弃上清，加入适量预热杂交液(0.9M NaCl,0.1％sodium dodecylsulfate,20mM Tris-HCl,pH 7.2)，随后加入双色探针(终浓度2μM)，并用锡箔纸包好放于合适温度下的水浴锅中杂交3h。
5)杂交完成后，离心弃上清，加入无探针预热杂交液，洗脱数次。最后，加入适量1×PBS溶液，在暗室内使用荧光显微镜进行观察。FITC使用的显微镜荧光设置为450–480nm激发波长，>515nm发射波长，视野下被探针标记的休眠体呈现黄绿色。Cy3使用的显微镜荧光设置为530–550nm激发波长，>575nm发射波长，视野下被探针标记的休眠体呈现橘红色。
所述形态学观察具体内容为：
于显微镜形态学观察以获得对新型休眠体形态特征的认识和记录。在观察到目标休眠体并拍照记录后，将视野从荧光场切换至明场，结合目标藻种营养细胞大小以及一般休眠体形态特征规律，筛除非生物颗粒、非休眠体类细胞以及尺寸大小不合适的休眠体细胞。
所述筛选出杂交产物中经二种荧光探针标记的休眠体，再利用特定区域获得特异性引物进行单细胞聚合酶链式反应，反应产物经测序后与参考序列进行比对获知单细胞休眠体物种的种属信息。
所述单细胞聚合酶链式反应具体内容为：
由于某些底栖生物营养细胞、休眠体和非生物颗粒有时存在绿色自发荧光以及实验中叶绿素未处理干净时所发出的红色自发荧光，二者可能对杂交的检测产生干扰，尽管自发荧光强度通常弱于被探针杂交上的荧光强度。因此，为进一步确认上述形态学观察和FISH相结合方法结果的准确性，从中随机挑选出若干休眠体细胞，通过单细胞聚合酶链式反应进行验证，具体流程如下：
1)用毛细管技术挑取上述被探针标记的休眠体于载玻片上，使用无菌水清洗数遍。
2)将休眠体转移至放有适量体积无菌无核酸污染的TE buffer(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0)的盖玻片小碎片上，随后在该碎片上面再放置一片大小合适的玻璃碎片压碎休眠体。
3)玻璃碎片连同休眠体破碎液一同转移至合适体积离心管中，加入100μL蛋白酶K溶(10μg/mL)，55℃孵育2h，随后立即96℃孵育5min。
4)加入等体积氯仿，离心10min，水相层转移至新离心管。
5)加入2倍体积的无水乙醇，放置-20℃处理2h。
6)离心10min，弃上清，超净台内室温通风晾干15min，底部沉淀物即为休眠体DNA。
7)使用针对真核生物28S rDNA D1-D2的通用或特异性引物进行PCR实验(可选择一步PCR或巢式PCR。PCR反应体系和PCR程序条件可能需根据休眠体种类进行优化和设置)。
8)使用琼脂糖凝胶电泳检测特异性扩增片段，并使用相关试剂盒回收胶体中DNA片段，使用合适的分光光度计检测DNA浓度与纯度。
9)利用8)中回收的DNA片段，构建克隆文库，将阳性克隆子进行测序。
10)获得测序结果后，使用NCBI数据库和已知参考序列进行比对获得相关休眠体物种的种属信息。
所述方法适用于各类海洋、淡水的沉积物或船舶压载舱底泥中各种休眠体的检测鉴定。
本发明所具有的优点：
本发明鉴定方法可有效判别某种藻类在自然界中是否存在休眠体，其极大地提高了检测结果的准确性，既能获得休眠体的形态学特征，又可以决定性的完成种类鉴定，解决了以往使用单一或双重组合方法无法准确从海洋沉积物中检测或鉴定新型休眠体的难题，同时也适用于已知休眠体和淡水种类的检测，为海洋沉积物及船舶压舱底泥中休眠体的鉴定提供了可行的技术手段；并且可为建立海洋微藻休眠体的图谱图鉴和丰度检测提供一种重要的技术支持。
附图说明
图1为本发明实例提供的米氏凯伦藻探针荧光效果检测图(比例尺＝20μm)。(A-B)探针Probe 1与营养细胞杂交后在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(C-D)探针Probe 2与营养细胞杂交后在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(E-F)探针Probe 3与营养细胞杂交后在光学显微镜和荧光显微镜下观察。
图2为本发明实例提供的米氏凯伦藻探针特异性检测图(比例尺＝20μm)。(A-B)探针Probe 1与Karlodinium veneficum杂交情况在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(C-D)探针Probe 1与Gymnodinium aureolum杂交情况在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。
图3为本发明实例提供的米氏凯伦藻休眠体在海洋沉积物中的检测图(比例尺＝20μm)。(A,D,G,J)休眠体在显微镜明场下的观察。(B,E,H,K)休眠体在荧光显微镜下的观察(Cy3)。(C,F,I,L)休眠体在荧光显微镜下的观察(FITC)。
图4为本发明实例提供的东海原甲藻探针荧光效果检测图(比例尺＝20μm)。(A-B)探针PDprobe 1与营养细胞杂交后在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(C-D)探针PDprobe 2与营养细胞杂交后在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(E-F)探针PDprobe 4与营养细胞杂交后在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(G-H)探针PDprobe 7与营养细胞杂交后在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(I-J)探针PDprobe 8与营养细胞杂交后在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。
图5为本发明实例提供的东海原甲藻探针特异性检测图(比例尺＝20μm)。(A-B)探针PDprobe 8与Karenia mikimotoi杂交情况在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(C-D)PDprobe 8与Karlodinium veneficum杂交情况在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(E-F)PDprobe 8与Prorocentrum minimum杂交情况在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。
图6为本发明实例提供的东海原甲藻休眠体在海洋沉积物中的检测图(比例尺＝20μm)。(A,D,G,J)休眠体在显微镜明场下的观察。(B,E,H,K)休眠体在荧光显微镜下的观察(Cy3)。(C,F,I,L)休眠体在荧光显微镜下的观察(FITC)。
图7为本发明实例提供的剧毒卡尔藻探针荧光效果检测图(比例尺＝20μm)。(A-B)探针KVprobe 1与营养细胞杂交后在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(C-D)探针KVprobe 2与营养细胞杂交后在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(E-F)探针KVprobe 3与营养细胞杂交后在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。
图8为本发明实例提供的剧毒卡尔藻探针特异性检测图(比例尺＝20μm)。(A-B)探针KVprobe 2与Karenia mikimotoi杂交情况在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。(C-D)探针KVprobe 2与Prorocentrum donghaiense杂交情况在光学显微镜和荧光显微镜下的观察。
图9为本发明实例提供的剧毒卡尔藻休眠体在海洋沉积物中的检测图(比例尺＝20μm)。(A,D,G,J)休眠体在显微镜明场下的观察。(B,E,H,K)休眠体在荧光显微镜下的观察(Cy3)。(C,F,I,L)休眠体在荧光显微镜下的观察(FITC)。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。对于相关专业领域的研究人员，本发明不限于仅适用上述示范性实例，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
利用本发明方法能够在待检测沉积物中通过目标藻营养细胞的核糖体基因序列的特定区域并结合荧光原位杂交技术和单细胞测序技术来确定是否形成休眠体，进一步确定所形成的休眠体是否为已知种类或是新种类。
本方法既实现对休眠体的形态学观察，又可对目标休眠体的种类进行判决性鉴定，解决了判别某种藻类在自然界是否存在新型休眠体(即某种已知目标种类是否在自然条件下产生休眠体为未知，也未知可能的休眠体的形态特征)的难题，对于未知藻种，在未知区域的检测仍然有效，同时也适用于已知休眠体种类的检测。从而，可做为海洋沉积物和船舶压载舱底泥中休眠体的检测/鉴定的有效标准方法，为建立海洋微藻休眠体的图谱图鉴和丰度检测提供了一种重要的技术支持。本发明在核糖体基因大亚基(28S rDNA)高可变区D2区域设计目标种的特异性探针及引物，对设计的探针采用二种颜色荧光染料分别标记，再运用FISH方法对沉积物中目标休眠体进行检测，随后结合形态学观察采用毛细管技术挑选出被探针特异性标记的休眠体，最后使用单细胞PCR技术及测序对被探针标记休眠体的种类加以确认。
实施例1
目标藻种：米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)
1)特异性探针设计于28S rDNA D2区。参与设计探针的同属或异属的藻种包括Karenia mikimotoi,Karenia papilionacea,Karenia brevis,Karenia umbella,Kareniaselliformis,Gymnodinium aureolum,Karlodinium veneficum,Akashiwo sanguinea,Takayama acrotrocha,Levanderina fissa,Karlodinium gentienii,Takayamatasmanic,Takayama helix,Alexandrium tamarense,Prorocentrum micans,Prorocentrum donghaiense,Prorocentrum minimum。共设计出三条探针：Probe-1,
5’-GTTCAACTGAGGACATTCAGTCACT；Probe-2,
5’-GAAGATCGCAGGCAAGCACATGAAG；Probe-3,
5’-CTCCTGGCACCAACAACCTTCA。探针5’端添加FITC或Cy3荧光基团。与目的种营养细胞杂交结果显示，Probe-1荧光效果最好(图1A-B)。与其他近缘种的杂交结果及表明，Probe-1探针未与其他藻种杂交(图2)。NCBI数据库比对结果表明，该探针序列和米氏凯伦藻序列高度匹配(Coverage＝100％,Identity＝100％)。因此，Probe-1探针5’端同时添加FITC和Cy3荧光基团用于沉积物中休眠体检测。2)取藻华发生地的沉积物，经多聚钨酸钠溶液(SPT)进行富集处理(Bolch,C.J.S.,1997.The use of sodium polytungstate for theseparation and concentration of living dinoflagellate cysts from marinesediments.Phycologia,36,472–478.)，休眠体富集后，上述使用双色Probe-1探针(即，Probe-1,5’-GTTCAACTGAGGACATTCAGTCACT的5’端添加FITC和Cy3荧光基团)在沉积物中对米氏凯伦藻休眠体进行检测，并结合形态学观察筛选出该藻休眠体(图3)。其休眠体呈圆形，细胞大小约26.4–38.3μm，细胞表面光滑，细胞内部有贮藏体和一些颗粒状细胞内容物。
3)利用上述步骤1)中引物设计原则所获得引物进行Single-cell PCR；共使用三对特异性引物：KM313F,5’-GTCTTGAGATGTGTTACCAACGGAG和KM313R,5’-GACAACACCAATACTCACCAAGAAC；2)KM243F,5’-GTTCTTGGTGAGTATTGGTGTTGT和KM243R 5’-ATCGCAGGCAAGCACATGAA；3)KM243F,5’-GTTCTTGGTGAGTATTGGTGTTGT和28S-R,5’-ACGAACGATTTGCACGTCAGTA(Litaker et al.,2003)。PCR反应体系如表1所示。PCR扩增程序：94℃5min→变性94℃30s，退火51℃30s(三对引物)，延伸72℃30s(35个循环)，延伸72℃10min。图3A和图3D两颗休眠体成功扩增出特异性片段，经克隆测序、NCBI比对后发现，该序列为米氏凯伦藻特异性序列(如下)。
>米氏凯伦藻(Coverage＝100％,Identity＝99.65％)
GTCTTGAGATGTGTTACCAACGGAGGCGCAGATGTAAGCCTCTTGGAAAAGAGCGTCAGGGAGGGTGAGAGTCCCGTATGTCATCTGCAGTTCTCTGTGCACGGTGCATGTTCTAAGAGTCACGTTCCTCGGGATTGGAGCGCAAATTGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATATTGGTTCGAGACCGATAGCAAACAAGTACCATGAGGGAAAGGTGAAAAGGACTTTGAAAAGAGAGTTAAAAGTGCCTGAAATTGCTGAAAGGGAAGCGAATGGAACCAGTTGTTCTTGGTGAGTATTGGTGTTGTCTAAAGTGATGGCTYGCCACTTCAACGCAAGTGTGGTGGCAGGTTTTGATCTGGATGCGATACTGCTTCTCGCCTTGCATGTCAACRTCAGTTCATAATTGAGGAAAACTCTAAGGACATGGTAATTCGCTTCCGAGTGACTGAATGTCCTCAGTTGAACTCATTTTTGAACTGCTCTCTGTGTGTCTGGTAGCACTGCTTCATGTGCTTGCCTGCGATCTTCTGCTCTGCATGAAGGTTGTTGGTGCCAGGAGCATGTCCTTGACATTAGAACGATGACGAAATGGTTTTATTCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATATGTGCAAGTTCACGGGCGGGAAAACCTGCTTGCGCAATGAAAGTGACTGCTGGGATTTTTGCACCAGCAACCGACCAATCAATTGTGAGAGGTTTGAGTATGAGCATATCTGTTAGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGAGAAGGGTGAAGTCAGGGGAAACWCTGATGGAGGCTCGTAGCGATACTGACGTGCAAATCGTTCGT
表1 PCR反应体系(25μL)
Figure BDA0002636076000000081
实施例2
目标藻种：东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)
1)特异性探针设计于28S rDNA D2区。参与设计探针的同属或异属的藻种包括Karenia mikimotoi,Karenia papilionacea,Karenia brevis,Karenia umbella,Kareniaselliformis,Gymnodinium aureolum,Karlodinium veneficum,Akashiwo sanguinea,Takayama acrotrocha,Levanderina fissa,Karlodinium gentienii,Takayamatasmanic,Takayama helix,Alexandrium tamarense,Prorocentrum micans,Prorocentrum donghaiense,Prorocentrum minimum。共设计出8条探针：PDprobe-1,5’-GAGATCTCCAAGGTGCCAAAG；PDprobe-2,5’-CTTTGCGTCAGGGAAATGCCCA；PDprobe-3,5’-ACTGTGGCAGGCCAAGCCGAGAT；PDprobe-4,5’-AGGCAGGAGACGATCAGGA；PDprobe-5,5’-CACCCGACAATCCTGCCAAGCAAC；PDprobe-6,5’-CCAAGCCGAGATCTCCAAGG；PDprobe-7,5’-AGCGTCATGCACCCGACAATCC；PDprobe-8,5’-GCTATTCACTCACCCGAAGACAA。PDProbe-5、PDProbe-7、PDProbe-8探针荧光强度效果最好(图4,仅展示部分结果)。特异性检测中，PDProbe-5、PDProbe-7与Prorocentrum minimum营养细胞发生结合，故这两条序列不能使用。而PDProbe-8探针均未与P.minimum、K.mikimotoi和K.veneficum的营养细胞杂交(图5)，且仅和东海原甲藻序列高度匹配(Coverage＝100％,Identity＝100％)。因此，PDprobe-8探针5’端被添加上双色荧光基团(FITC和Cy3)用于沉积物中休眠体的检测。
2)取藻华发生地的沉积物，经多聚钨酸钠溶液(SPT)进行富集处理，富集休眠体后，使用双色PDProbe-8探针在沉积物中对东海原甲藻休眠体进行检测，并结合形态学观察筛选出该藻休眠体(图6)。其休眠体呈圆形或椭圆，大小通常在10-20μm，细胞壁相对较厚，细胞表面光滑，细胞内部有贮藏体和一些颗粒状细胞内容物。
3)利用上述步骤1)中引物设计原则所获得引物进行Single-cell PCR；共使用二对特异性引物：LSUF1,5’-CAAGTACCATGAGGGAAA和LSUR1,5’-ACGAACGATTTGCACGTCAGTA(Litaker et al.,2003)；2)PD201F,5’-CAGGATTGTCGGGTGCATGA和PD201R,5’-TGGCAGGCCAAGCCGAGAT。PCR反应体系如实例1中表1所示。PCR扩增程序：第一轮扩增，巢式PCR扩增程序：第一轮，94℃5min→变性94℃30s，退火51℃30s(LSUF1-LSUR1)，延伸72℃30s(35个循环),延伸72℃10min。第二轮扩增，94℃5min→变性94℃30s，退火51℃30s(PD201F-PD201R)，延伸72℃30s,延伸72℃10min。图6A和图6D两颗休眠体成功扩增出特异性片段，经克隆测序、NCBI比对后发现，该序列为东海原甲藻特异性序列(如下)。
>东海原甲藻(Coverage＝100％,Identity＝99.65％)
CAGGATTGTCGGGTGCATGACGCTCCTGATCGTCTCCTGCCTTGTGTGTCAACGCCAGTTCGCGATCGAGGAAAACTCCAGGGTCATGGTAGCTTGTCTTCGGGTGAGTGAATAGCCTTGGCAGAACTCATTCGCGGACTGTTTCTTTCGTGTCTGGTTGCAGTGTCTTTGGCACCTTGGAGATCTCGGCTTGGCCTGCCA
实施例3
目标藻种：剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum)
1)特异性探针设计于28S rDNA D2区。参与设计探针的同属或异属的藻种包括Karenia mikimotoi,Karenia papilionacea,Karenia brevis,Karenia umbella,Kareniaselliformis,Gymnodinium aureolum,Karlodinium veneficum,Akashiwo sanguinea,Takayama acrotrocha,Levanderina fissa,Karlodinium gentienii,Takayamatasmanic,Takayama helix,Alexandrium tamarense,Prorocentrum micans,Prorocentrum donghaiense,Prorocentrum minimum。共设计出3条探针:KVprobe-1,5’-CCGCTGGCAATGCCATCGAA；KVprobe-2,5’-TAGAAAGCACACCGTAAACAGAGGA；KVprobe-3,5’-TGAAGCAGAAAGCAATCACAAT。KVprobe-2探针荧光强度效果最好(图7)。特异性检测中，KVprobe-2探针未与其他种营养细胞杂交(图8)。最后，经NCBI数据库比对，该探针序列仅和剧毒卡尔藻序列高度匹配(Coverage＝100％,Identity＝100％)。因此，KVprobe-2探针5’端被添加上双色荧光基团(FITC和Cy3)用于沉积物中休眠体的检测。
2)取藻华发生地的沉积物，经多聚钨酸钠溶液(SPT)进行富集处理，休眠体富集后，使用双色KVProbe-2探针在沉积物中对东海原甲藻休眠体进行检测，并结合形态学观察筛选出该藻休眠体(图9)。其休眠体呈圆形或椭圆，大小通常在9.6–17.2μm，其孢囊呈圆形，细胞壁相对较厚(2层)，细胞颜色呈褐色或浅灰色，细胞表面光滑，细胞内部有明显红体和一些颗粒状细胞内容物。
3)利用上述步骤1)中引物设计原则所获得引物进行Single-cell PCR；共使用二对特异性引物:LSUF1,5’-CAAGTACCATGAGGGAAA和LSUR1,5’-ACGAACGATTTGCACGTCAGTA(Litaker et al.,2003)；2)KV158F,5’-CTTCTTGGTGAGATTGTTGTGCGC和KV282R,5’-AGAAGCCCGCGACGAGTAACAGAA。PCR反应体系如实例1中表1所示。PCR扩增程序：第一轮扩增，94℃5min→变性94℃30s，退火51℃30s(LSUF1-LSUR1)，延伸72℃30s(35个循环)，延伸72℃10min。第二轮扩增，94℃5min→变性94℃30s，退火54℃30s(KV185F-KV282R)，延伸72℃30s，延伸72℃10min。图9J休眠体成功扩增出特异性片段，经克隆测序、NCBI比对后发现，该序列为剧毒卡尔藻特异性序列(如下)。
>剧毒卡尔藻(Coverage＝100％,Identity＝100％)
CTTCTTGGTGAGATTGTTGTGCGCTATTGTGATTGCTTTCTGCTTCAACGCAAGTGTTGCAGTGGGTTTTGAGCATGACGCGCACTTTGTTTCTCACCTCGTGTGTCAACGTCGGTTCAGATTTGAGGAAAACTCTAGGGACATGGTTAATTGCTCGCGAGTGATTGAATGTGCCTGGTAGAACTCATGTCTAAACTGATTTCCGCATGTCTGGTCGCAGTGTTCTCATTACCTGCGTCTGGGTTCGTGGCTTGTAGCTTCTGTTACTCGTCGCGGGCTTCT
从上述三个实施案例中可以明显看出本发明的实用有效性，该发明提供了实例中三种甲藻新型休眠体的形态及身份信息，完成了其在海洋沉积物中的鉴定。该创造性组合方法解决了判别某种藻类在自然界是否存在新型休眠体的难题，但同时也适用于已知休眠体种类(但已知其至少部分28S rDNA序列)的检测。本方法既实现对休眠体的形态学观察，又可对目标休眠体的种类进行判决性鉴定，可做为海洋沉积物和船舶压载舱底泥中休眠体的检测/鉴定的有效标准方法，为建立海洋微藻休眠体的图谱图鉴和丰度检测提供一种重要的技术支持。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种鉴定海洋沉积物中休眠体的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 853
<212> DNA
<213> 米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)
<400> 1
gtcttgagat gtgttaccaa cggaggcgca gatgtaagcc tcttggaaaa gagcgtcagg 60
gagggtgaga gtcccgtatg tcatctgcag ttctctgtgc acggtgcatg ttctaagagt 120
cacgttcctc gggattggag cgcaaattgg gtggtaaatt tcatctaaag ctaaatattg 180
gttcgagacc gatagcaaac aagtaccatg agggaaaggt gaaaaggact ttgaaaagag 240
agttaaaagt gcctgaaatt gctgaaaggg aagcgaatgg aaccagttgt tcttggtgag 300
tattggtgtt gtctaaagtg atggctygcc acttcaacgc aagtgtggtg gcaggttttg 360
atctggatgc gatactgctt ctcgccttgc atgtcaacrt cagttcataa ttgaggaaaa 420
ctctaaggac atggtaattc gcttccgagt gactgaatgt cctcagttga actcattttt 480
gaactgctct ctgtgtgtct ggtagcactg cttcatgtgc ttgcctgcga tcttctgctc 540
tgcatgaagg ttgttggtgc caggagcatg tccttgacat tagaacgatg acgaaatggt 600
tttattcgac ccgtcttgaa acacggacca aggagtctaa catatgtgca agttcacggg 660
cgggaaaacc tgcttgcgca atgaaagtga ctgctgggat ttttgcacca gcaaccgacc 720
aatcaattgt gagaggtttg agtatgagca tatctgttag gacccgaaag atggtgaact 780
atgcttgaga agggtgaagt caggggaaac wctgatggag gctcgtagcg atactgacgt 840
gcaaatcgtt cgt 853
<210> 2
<211> 201
<212> DNA
<213> 东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)
<400> 2
caggattgtc gggtgcatga cgctcctgat cgtctcctgc cttgtgtgtc aacgccagtt 60
cgcgatcgag gaaaactcca gggtcatggt agcttgtctt cgggtgagtg aatagccttg 120
gcagaactca ttcgcggact gtttctttcg tgtctggttg cagtgtcttt ggcaccttgg 180
agatctcggc ttggcctgcc a 201
<210> 3
<211> 282
<212> DNA
<213> 剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum)
<400> 3
cttcttggtg agattgttgt gcgctattgt gattgctttc tgcttcaacg caagtgttgc 60
agtgggtttt gagcatgacg cgcactttgt ttctcacctc gtgtgtcaac gtcggttcag 120
atttgaggaa aactctaggg acatggttaa ttgctcgcga gtgattgaat gtgcctggta 180
gaactcatgt ctaaactgat ttccgcatgt ctggtcgcag tgttctcatt acctgcgtct 240
gggttcgtgg cttgtagctt ctgttactcg tcgcgggctt ct 282

Claims (7)

1.一种鉴定海洋沉积物中休眠体的方法，其特征在于：由目标藻种的特定区域获得特异性探针及引物，利用荧光原位杂交对沉积物中目标藻种休眠体进行检测，随后根据形态学观察定性筛选沉积物中经探针杂交标记的休眠体，将筛选的休眠体再经单细胞聚合酶链式反应进一步获知其种类。
2.按权利要求1所述的鉴定海洋沉积物中新型休眠体的方法，其特征在于：所述目标藻种的特定区域获得特异性探针及引物的获得为在核糖体基因大亚基(28S rDNA)高可变区D2区域设计目标种的特异性探针及引物，对设计的探针采用至少一种颜色的荧光染料分别标记。
3.按权利要求2所述的鉴定海洋沉积物中新型休眠体的方法，其特征在于：所述特异性探针及引物为获取目标藻种及其他同属或异属的28S rDNA序列，在D2区域设计目标种特异性探针，并在探针5’端添加异硫氰酸荧光素(FITC)或花青类(Cy3)荧光基团。
4.按权利要求1所述的鉴定海洋沉积物中新型休眠体的方法，其特征在于：将待鉴定沉积物样品根据密度梯度离心原理，使用多聚钨酸钠溶液(SPT)对沉积物样品进行离心和休眠体富集，而后加入双色荧光基团的探针和引物进行杂交，杂交后在暗室内使用荧光显微镜进行观察，筛选出杂交产物中经探针标记的休眠体，待用。
5.按权利要求4所述的鉴定海洋沉积物中新型休眠体的方法，其特征在于：所述形态学观察时显微镜荧光设置为450–480nm激发波长，大于515nm的发射波长，视野下被探针标记的休眠体呈现黄绿色；设置为530–550nm激发波长，大于575nm的发射波长，视野下被探针标记的休眠体呈现橘红色；即，筛选出同时被两种颜色探针杂交上的休眠体。
6.按权利要求1或4所述的鉴定海洋沉积物中新型休眠体的方法，其特征在于：所述筛选出杂交产物中经两种荧光探针标记的休眠体，再利用特定区域获得特异性引物进行单细胞聚合酶链式反应，反应产物经测序后与参考序列进行比对获知单细胞休眠体物种的种属信息。
7.按权利要求1所述的鉴定海洋沉积物中新型休眠体的方法，其特征在于：所述方法适用于各类海洋、淡水的沉积物或船舶压载舱底泥中各种休眠体的检测鉴定。
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Citations (3)

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CN1710097A (zh) * 2004-06-16 2005-12-21 中国科学院海洋研究所 一种现场快速定性鉴定赤潮微藻的方法
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Title
YUYANG LIU等: "Evidence for resting cyst production in the cosmopolitan toxic dinoflagellate Karlodinium veneficum and the cyst distribution in the China seas", 《HARMFUL ALGAE》, 18 March 2020 (2020-03-18), pages 3 - 4 *

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