CN110964646B - 一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及pf1022a的制备方法 - Google Patents

一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及pf1022a的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及PF1022A的制备方法；所述座坚壳菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18132；所述座坚壳菌用于PF1022A生产，菌丝生长快，菌丝浓度低，发酵时间短，发酵单位高。

Description

一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及PF1022A的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及PF1022A的制备方法。
背景技术
PF1022A是一种对动物低毒、防治谱广、效果好的驱虫药物，其是继大环内酯类驱虫药后，最有潜力的用于牲畜和宠物的一类驱虫药。PF1022A可以与七螺旋状类latrophilin跨膜受体的氨基位点相结合,该受体分离自捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus Rudolphi),其作用是诱导外部钙流入细胞。这种新的抗线虫药物的作用模式与已知的驱虫剂,如苯并咪唑类、咪唑并噻唑类、大环内酯类的作用机理大不相同。所以PF1022A类抗虫药物效果好，对耐药的寄生虫同样有强大的杀虫效果。
目前PF1022A合成有固相合成法和生物合成方法。固相合成法步骤繁琐、工艺复杂，不适于大规模生产。而用微生物发酵方式生产PF1022A的报道比较少，产量又比较低，仅限于实验室水平。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及PF1022A的制备方法；所述座坚壳菌用于PF1022A生产，菌丝生长快，菌丝浓度低，发酵时间短，发酵单位高。
为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种座坚壳菌，所述座坚壳菌(Rosellinia sp.)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18132，保藏日期为2019年6月19日。
本发明提供了所述座坚壳菌在生产PF1022A中的应用。
本发明还提供了用于培养上述座坚壳菌的发酵培养基，以质量百分数计，所述发酵培养基由麦芽糖1.0％～3.5％，糊精0.2％～1.0％，大豆油0.5％～2.0％，麦芽抽提物0.5％～2.0％，黄豆粉0.5％～2.5％，酵母抽提物0.5％～2.0％，磷酸二氢钾0.2％～0.8％，氯化钠0.2％～0.8％，硫酸镁0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.5％和余量的水组成
优选的，以质量百分数计，所述发酵培养基由麦芽糖1.0％～3.5％，糊精0.2％～1.0％，大豆油0.5％～2.0％，麦芽抽提物0.5％～2.0％，黄豆粉0.5％～2.5％，酵母抽提物0.5％～2.0％，磷酸二氢钾0.2％～0.8％，氯化钠0.2％～0.8％，硫酸镁0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.5％和余量的水组成。
本发明还提供了一种PF1022A的制备方法，包括：上述座坚壳菌经发酵，得到PF1022A。
优选的，所述方法具体包括：将所述座坚壳菌的种子液接种至发酵培养基中培养，得到发酵液。
优选的，所述方法具体包括：
所述座坚壳菌活化接种于斜面培养基中培养；得到斜面菌种；
斜面菌种接种至种子培养基中培养，得到种子液。
优选的，所述方法具体：
所述座坚壳菌活化接种于保藏分离斜面培养基中25～26℃，培养7～10d，得到斜面菌种；
斜面菌种接种至种子培养基中25～26℃,转速230r/min，培养3～5d，得到种子液；
将所述种子液接种至发酵培养基25～26℃,转速230r/min，培养3～5d，得到发酵液。
优选的，将所述种子液接种至发酵培养基25～26℃,转速230r/min，培养135h，得到发酵液。
优选的，以质量百分数计，所述斜面培养基由麦芽抽提物2％～4％，酪蛋白胨0.4％～1.0％，琼脂1.0％～2.5％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉0.5％～2.0％，葡萄糖0.5％～1.5％，麦芽抽提物0.2％～1.5％，棉籽粉0.2％～1.5％，黄豆饼粉0.2％～1.5％，，酵母浸粉0.2％～1.5％，硫酸镁0.05％～0.2％，氯化钠0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.4％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述发酵培养基由麦芽糖1.0％～3.5％，糊精0.2％～1.0％，大豆油0.5％～2.0％，麦芽抽提物0.5％～2.0％，黄豆粉0.5％～2.5％，酵母抽提物0.5％～2.0％，磷酸二氢钾0.2％～0.8％，氯化钠0.2％～0.8％，硫酸镁0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.5％和余量的水组成。
优选的，以质量百分数计，所述斜面培养基由芽抽提物3％，酪蛋白胨0.6％，琼脂1.5～2％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉1％，葡萄糖1％，麦芽抽提物0.5％，棉籽粉0.5％，黄豆饼粉0.5％，酵母浸粉0.5％，硫酸镁0.1％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.2％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述发酵培养基由所述麦芽糖2.5％，糊精0.5％，大豆油1％，麦芽抽提物1％，黄豆粉1.5％，酵母抽提物1％，磷酸二氢钾0.5％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.2％，碳酸钙0.3％和余量的水组成。
优选的，所述方法还包括：从所述发酵液中分离提取PF1022A。
优选的，所述发酵液用乙酸乙酯萃取,减压浓缩后，用乙酸乙酯进行二次萃取，减压浓缩，得到浓缩液；
所述浓缩液利用高压制备液相层析***进行分离，收集目标组分；
目标组分减压浓缩、结晶，得到PF1022A成品。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
本发明利用等离子体诱变育种并结合紫外诱变的复合诱变方法得到的座坚壳菌，其生物合成PF1022A的能力得到提高；经10L不锈钢发酵罐验证，在10L发酵罐中，具有菌丝生长快、菌丝浓度低(菌浓24％左右)、发酵时间短(135h)的特点，而且在10L发酵罐上发酵单位最高达到1.81g/L；与现有专利报道(专利申请号CN107217007A)的5L发酵罐上192h放罐的发酵单位1.481g/L相比，不仅发酵时间明显缩短，而且产量最高提高了22.2％，既缩短了发酵周期同时也降低了能耗。
本发明采用的常压室温等离子体(ARTP)诱变***具有温度低、活性粒子浓度高等特点，对菌株的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制，并最终稳定遗传进而形成突变株。因此，常压室温等离子体(ARTP)诱变***可以作为一种快速简便的方法应用到座坚壳菌育种中。
本技术发明完全符合工业化PF1022A生产菌株的诱变和筛选需要，并可应用于工业化发酵生产，具有重大的经济价值。
附图说明
图1为本发明复合诱变筛选得到的诱变菌株发酵效价、菌体生长量与pH结果图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
菌株SIIA-16-1#的分离与特征
1.菌株SIIA-16-1#的分离：
从四川雅安蒙顶山的土壤样品中分离筛选得到产PF1022A的原始菌株SIIA-16-1#。
试验方法和步骤：
1.培养基的制备
(1)配方：葡萄糖10.0g、蛋白胨5.0g、琼脂20g、K2HPO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、1/3000孟加拉红水溶液100mL、0.03℅链霉素稀释液100mL、自来水800mL。
(2)操作步骤：
1)按上述配方将原料混合，并煮沸至琼脂溶化。
2)趁热分装于18mm×180mm试管，每管15mL，塞好棉塞，贴好标签，装入小铁丝筐，并用旧报纸将棉塞部分包好。
3)高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。
其中，0.03％链霉素溶液的制备过程为：取国产链霉素1g/瓶，用无菌吸管吸入10mL无菌水溶解，得到10％链霉素溶液取0.3mL该溶液定容于100mL灭菌容量瓶即可得到0.03％链霉素溶液。
2.土壤稀释液的制备
用“稀释平板计数法”中的方法进行，将土样稀释至10-5。
称取土样10g放入盛90mL无菌水的三角瓶中，振摇约20分钟，使土与水充分混合，将菌分散。在无菌操作条件下，用1mL无菌移液管吸取lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。
3.平板分离
(1)倒平板
将加入链霉素溶液的马丁氏培养基倒平板，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
(2)涂布
将上述每种培养基的三个平板分别标上10-1、10-2、10-3三种稀释度，然后用三支1mL无菌吸管分别由10-1、10-2、10-3三管土壤稀释液中各吸取0.1mL对号放于已标好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
4.恒温培养
将上述接种土壤稀释液的平板倒置于28℃培养5～7d。
5.挑菌纯化
从长有单菌落的平板中选取典型的真菌菌落转接斜面，并同时制片作纯度检查，若不纯，应进一步挑取该菌落制成菌悬液进一步作稀释分离，直至获得纯培养体为止。
6.计数
选择每皿出现10～100个菌落的平板，计算土壤真菌(包括酵母菌)的含量。
选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算：
每g样品的菌数＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数
这样求得的是每克原始土样中的活菌数，若要折算为每克干土的含菌数，还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数(烘干土的质量/原土样的质量)。
7.菌种保存
将分离到的真菌菌株SIIA-16-1#转接到PDA斜面上培养，待长好后，置于冰籍中保存。
2.菌株SIIA-16-1#的特征
2.1.菌体形态：菌体为真菌，不产生有性孢子或无性孢子。
2.2.菌落形态：在平板上，菌落菌丝体呈白色绒毛状，该菌落的反面是白色至淡黄色。生长约3周后在菌落的反面可观察到直径为2～3mm的深褐色斑点。
2.3.培养特征：
将菌株SIIA-16-1#接种在各种合成培养基和有机培养基上，25～26℃培养7d，记录相应的生长特征(见表1)。
表1
培养基种类 生长状况 菌落背面颜色 可溶性色素
土豆葡萄糖培养基 良好，菌落白色 白色至淡黄色 无
土豆胡萝卜培养基 良好，菌落白色 白色至淡黄褐色 无
麦芽提取物培养基 良好，菌落白色 白色至淡黄色 无
燕麦粥培养基 良好，菌落白色 白色至淡黄色 无
2.4.菌株SIIA-16-1#的生理生化特征：
在营养丰富的固体培养基上进行培养(在CzA琼脂、LcA琼脂和CMA琼脂上分别进行培养)，发现其最适生长温度为25～26℃，25℃以下生长缓慢，37℃以上该菌株不生长。该菌株为真菌，需氧生长；能够利用葡萄糖、淀粉、淀粉浆、蔗糖、糊精、甘油、糖蜜、动物及植物油。
CzA琼脂培养基组成：葡萄糖3％、硝酸钠0.3％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钾0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、琼脂1.5％，PH自然；
LcA琼脂培养基组成：葡萄糖0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.02％、氯化钾0.02％、硝酸钠0.2％、酵母抽提物0.02％、琼脂1.5％，PH自然；
CMA琼脂培养基组成：玉米粉4％、琼脂1.5％，PH自然。
实施例2
1、诱变菌株SIIA-18-56#的分离、诱变与特征
1、诱变菌株SIIA-18-56#的分离、诱变
1.1菌悬液制备：
从四川雅安蒙顶山的土壤样品中分离筛选得到产PF1022A的原始菌株SIIA-16-1#。往菌株SIIA-16-1#的斜面培养物中加入10mL无菌生理盐水进行洗涤，倒入加有碎玻璃的摇瓶中振荡打散，制成菌悬液备用。
1.2复合诱变处理：
(1)用移液枪吸取10μL1.1中菌悬液于直径为1cm的载玻片上，置于以氦气为工作气体，功率120W，通气量为10SLM，处理距离为2mm的常压室温等离子体诱变***(ARTP诱变***)中。分别处理0s、15s、30s、45s、60s、80s，将诱变处理后的菌悬液稀释后涂布于分离培养基上，25～26℃培养7d。根据菌落计数和摇瓶筛选结果，统计出每个照射剂量下的致死率和正变率。
由实验结果可知：当ARTP处理时间为80s时，致死率接近于100％；而诱变时间为45s时菌株的正突变率最大为38.2％，致死率为92％。考虑复合诱变后获得足够的菌株数量，本实验复合诱变采用的ARTP处理时间选取30s。
(2)用移液枪吸取1.1中菌悬液5mL于无菌培养皿中，紫外(功率30W，灯距35cm)分别照射0s、20s、30s、40s、60s、90s、120s。将诱变处理后的菌悬液稀释后涂布于分离培养基上，25～26℃培养7d。根据菌落计数和摇瓶筛选结果，统计出每个照射剂量下的致死率和正变率。
由实验结果可知：座坚壳菌对紫外线较为敏感，当照射时间为120s时，致死率接近100％。而照射时间为40s时菌株的正突变率最大为32.3％，致死率为88.6％。考虑复合诱变后获得足够的菌株数量，本实验复合诱变采用的UV处理时间选取30s。
(3)将1.1中的菌悬液采用(1)中选用的照射剂量处理(ARTP处理时间30s)后，将载玻片上的菌体用无菌生理盐水洗下，并立即(在30s内)按(2)中选用的紫外照射时间(功率30W，灯距35cm，UV处理时间30s)进行复合诱变处理。
1.3平板初筛:
分离培养基：以质量百分比计，由芽抽提物3％，酪蛋白胨0.6％，琼脂1.5～2％和余量的水组成，pH5.6，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min。
用生理盐水梯度稀释并取0.1mL涂布于分离培养基上，25～26℃培养7～10d。
1.4摇瓶复筛:
斜面培养基：以质量百分比计，由芽抽提物3％，酪蛋白胨0.6％，琼脂1.5～2％和余量的水组成，pH5.6，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min。
挑选平板初筛生长出的座坚壳菌单菌落接种于斜面培养基上，25～26℃培养7～10d；
挑选出发酵单位高于出发菌株30％的突变株，即为诱变菌株SIIA-18-56#。
2.诱变菌株SIIA-18-56#特征与鉴定
2.1菌体形态：菌体为真菌，不产生有性孢子或无性孢子。
2.2菌落形态：在平板上，菌落菌丝体呈灰白色绒毛状，该菌落的反面是灰白色至淡黄色。
2.3培养特征：
将菌株SIIA-18-56#接种在各种合成培养基和有机培养基上，25～26℃培养7d，记录相应的生长特征(见表2)。
表2
培养基种类 生长状况 菌落背面颜色 可溶性色素
土豆葡萄糖培养基 良好，菌落灰白色 灰白色至淡黄色 无
土豆胡萝卜培养基 良好，菌落灰白色 灰白色至淡黄褐色 无
麦芽提取物培养基 良好，菌落灰白色 灰白色至淡黄色 无
燕麦粥培养基 良好，菌落灰白色 灰白色至淡黄色 无
2.4诱变菌株SIIA-18-56#的生理生化特征：
在营养丰富的固体培养基上进行培养在营养丰富的固体培养基上进行培养(在CzA琼脂、LcA琼脂和CMA琼脂上分别进行培养)，发现其最适生长温度为25～26℃，25℃以下生长缓慢，37℃以上该菌株不生长。该菌株为真菌，需氧生长；能够利用葡萄糖、淀粉、蔗糖、糊精、甘油、糖蜜、果糖、麦芽糖、动物及植物油；不利用海藻糖和木糖。
CzA琼脂培养基组成：葡萄糖3％、硝酸钠0.3％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钾0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、琼脂1.5％，PH自然；
LcA琼脂培养基组成：葡萄糖0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.02％、氯化钾0.02％、硝酸钠0.2％、酵母抽提物0.02％、琼脂1.5％，PH自然；
CMA琼脂培养基组成：玉米粉4％、琼脂1.5％，PH自然。
2.5鉴定
综合以上分类数据分析，诱变菌株SIIA-18-56#属于座坚壳属Rosellinia，其与已报道的座坚壳属中相关菌株在形态学、生理生化特征方面有所差异，因此，将诱变菌株SIIA-18-56#命名为Rosellinia sp.SIIA-18-56#。
诱变菌株SIIA-18-56#为座坚壳菌(Rosellinia sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18132，保藏日期为2019年6月19日。
实施例3
诱变菌株SIIA-18-56#的培养
1.培养基的配制：
斜面培养基：以质量百分数计，所述斜面培养基由芽抽提物3％，酪蛋白胨0.6％，琼脂1.5～2％和余量的水组成；pH5.6，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min；
种子培养基：以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉1％，葡萄糖1％，麦芽抽提物0.5％，棉籽粉0.5％，黄豆饼粉0.5％，酵母浸粉0.5％，硫酸镁0.1％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.2％和余量的水组成；pH7.0，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min；
发酵培养基：以质量百分数计，所述发酵培养基由所述麦芽糖2.5％，糊精0.5％，大豆油1％，麦芽抽提物1％，黄豆粉1.5％，酵母抽提物1％，磷酸二氢钾0.5％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.2％，碳酸钙0.3％和余量的水组成；pH7.0，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min。
2.菌种活化：
将甘油保存的实施例2中的菌株SIIA-18-56#转接至斜面培养基，于25～26℃，培养7～10d，得到斜面菌种。
3.摇瓶种子培养：
选择生长良好的斜面菌种，接种于装有上述1中制得的种子培养基中(250mL三角瓶内装25mL)，于25～26℃,转速230r/min，培养3～5d，得到种子液。
4.摇瓶发酵培养：
将3中制得的种子液以10％(v/v)的接种量接种于上述1中制得的发酵培养基中(250mL三角瓶内装25mL)，于转速230r/min，培养132h，得到发酵液。
5.从发酵液中分离提取PF1022A：
取发酵液1mL，加入2mL丙酮，震荡抽提1h后，取上清液，进行HPLC检测，PF1022A产量达到1.68g/L。
实施例4
诱变菌株SIIA-18-56#生产PF1022A
1.培养基的配制：
斜面培养基：以质量百分数计，所述斜面培养基由芽抽提物3％，酪蛋白胨0.6％，琼脂1.5～2％和余量的水组成；pH5.6，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min；
种子培养基：以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉1％，葡萄糖1％，麦芽抽提物0.5％，棉籽粉0.5％，黄豆饼粉0.5％，酵母浸粉0.5％，硫酸镁0.1％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.2％和余量的水组成；pH7.0，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min；
发酵培养基：以质量百分数计，所述发酵培养基由所述麦芽糖2.5％，糊精0.5％，大豆油1％，麦芽抽提物1％，黄豆粉1.5％，酵母抽提物1％，磷酸二氢钾0.5％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.2％，碳酸钙0.3％和余量的水组成；pH7.0，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min。
2.菌种活化：
将甘油保存的实施例2中的菌株SIIA-18-56#转接至斜面培养基，于25～26℃，培养7～10d，得到斜面菌种。
3.摇瓶种子培养：
选择生长良好的斜面菌种，接种于装有上述1中制得的种子培养基中(250mL三角瓶内装25mL)，于25～26℃,转速230r/min，培养3～5d，得到种子液。
4.发酵培养：
将3中制得的种子液按10％(v/v)的接种量在火焰保护下移入到已灭菌的装有通6L发酵培养基的10L不锈钢发酵罐中，培养条件为搅拌轴转速420r/min，25～26℃，通气量1:1(VVM)，罐压0.05Mpa，培养135h后终止发酵，得到发酵液。
5.从发酵液中分离提取PF1022A：
将6L发酵液倒入储罐中，往储罐中加入6L乙酸乙酯，搅拌2h，搅拌轴转速50r/min，加入破乳剂后静置过夜，分层后移去下层的发酵液；将乙酸乙酯萃取液移入浓缩装置中进行减压浓缩，回收减压浓缩的有机溶剂；
采用所回收的有机溶剂(乙酸乙酯)对发酵液进行二次萃取，减压浓缩，得到浓缩液；所述浓缩液利用高压制备液相层析***进行分离，制备柱为C18柱，检测波长为220nm，流动相为乙腈-水(体积比80:20)，收集目标组分减压浓缩干后，获得PF1022A组分，结晶后即得PF1022A成品7.6g。
实施例5
本实施例和实施例4的区别在于：
斜面培养基：以质量百分数计，所述斜面培养基由麦芽抽提物4％，酪蛋白胨0.4％，琼脂1.0～2.5％和余量的水组成；
种子培养基：以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉2.0％，葡萄糖1.5％，麦芽抽提物1.5％，棉籽粉0.2％，黄豆饼粉1.5％，酵母浸粉0.2％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.1％，碳酸钙0.4％和余量的水组成，pH7.0；
发酵培养基：以质量百分数计，所述发酵培养基由麦芽糖1.0％，糊精1.0％，大豆油2.0％，麦芽抽提物0.5％，黄豆粉2.5％，酵母抽提物0.5％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.8％，硫酸镁0.3％，碳酸钙0.5％和余量的水组成，pH7.0。
其余所有条件均与实施例4完全一致。
将获得的5.6L发酵液倒入储罐中，往储罐中加入5.6L乙酸乙酯，搅拌2h，搅拌轴转速50r/min，加入破乳剂后静置过夜，分层后移去下层的发酵液；将乙酸乙酯萃取液移入浓缩装置中进行减压浓缩，回收减压浓缩的有机溶剂；
采用所回收的有机溶剂(乙酸乙酯)对发酵液进行二次萃取，减压浓缩，得到浓缩液；所述浓缩液利用高压制备液相层析***进行分离，制备柱为C18柱，检测波长为220nm，流动相为乙腈-水(体积比80:20)，收集目标组分减压浓缩干后，获得PF1022A组分，结晶后即得PF1022A成品6.6g。
实施例6
本实施例和实施例4的区别在于：
斜面培养基：以质量百分数计，所述斜面培养基由麦芽抽提物2％，酪蛋白胨1.0％，琼脂1.0～2.5％和余量的水组成；
种子培养基：以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉0.5％，葡萄糖0.5％，麦芽抽提物0.2％，棉籽粉1.5％，黄豆饼粉0.2％，酵母浸粉1.5％，硫酸镁0.2％，氯化钠0.3％，碳酸钙0.1％和余量的水组成，pH7.0；
发酵培养基：以质量百分数计，所述发酵培养基由所述麦芽糖3.5％，糊精0.2％，大豆油0.5％，麦芽抽提物2.0％，黄豆粉0.5％，酵母抽提物2.0％，磷酸二氢钾0.2％，氯化钠0.2％，硫酸镁0.1％，碳酸钙0.1％和余量的水组成，pH7.0。
其余所有条件均与实施例4完全一致。
将获得的5.8L发酵液倒入储罐中，往储罐中加入5.8L乙酸乙酯，搅拌2h，搅拌轴转速50r/min，加入破乳剂后静置过夜，分层后移去下层的发酵液；将乙酸乙酯萃取液移入浓缩装置中进行减压浓缩，回收减压浓缩的有机溶剂；
采用所回收的有机溶剂(乙酸乙酯)对发酵液进行二次萃取，减压浓缩，得到浓缩液；所述浓缩液利用高压制备液相层析***进行分离，制备柱为C18柱，检测波长为220nm，流动相为乙腈-水(体积比80:20)，收集目标组分减压浓缩干后，获得PF1022A组分，结晶后即得PF1022A成品6.8g。
实施例7
诱变菌株SIIA-18-56#生产PF1022A
本实施例和实施例4的区别在于：
4.发酵培养：
将实施例4中制得的种子液按10％(v/v)的接种量在火焰保护下移入到已灭菌的装有通6L发酵培养基的10L不锈钢发酵罐中，培养条件为搅拌轴转速420r/min，25～26℃，通气量1:1(VVM)，罐压0.05Mpa，培养66h、72h、90h、94h、114h、118h、135h、144h、159h、166h后终止发酵，得到发酵液。
HPLC测定所得的发酵液中PF1022A的发酵单位及发酵液中菌丝的浓度，结果如表3所示，效价、菌体生长量与pH结果见图1。
表3
Figure GDA0002467725330000141
表3、图1说明，通过复合诱变筛选得到的诱变菌株SIIA-18-56#，在10L发酵罐中，具有菌丝生长快、菌丝浓度低(菌浓24％左右)、发酵时间短(135h)的特点，而且在10L不锈钢发酵罐上发酵单位最高达到了1.81g/L。不仅极大地缩短了发酵周期(专利报道的发酵时间为192h，放罐单位为1.481g/L)，降低了能耗，而且在发酵单位上还有了一定的提高。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种座坚壳菌(Roselliniasp.)，其特征在于，所述座坚壳菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18132。
2.权利要求1所述座坚壳菌在生产PF1022A中的应用。
3.一种PF1022A的制备方法，其特征在于，包括：发酵权利要求1所述座坚壳菌，得到PF1022A。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：将所述座坚壳菌的种子液接种至发酵培养基中培养，得到发酵液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：
所述座坚壳菌活化接种于斜面培养基中培养；得到斜面菌种；
斜面菌种接种至种子培养基中培养，得到种子液。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：
所述座坚壳菌活化接种于保藏分离斜面培养基中25～26℃，培养7～10d，得到斜面菌种；
斜面菌种接种至种子培养基中25～26℃,转速230r/min，培养3～5d，得到种子液；
将所述种子液接种至发酵培养基25～26℃,转速230～420r/min，培养3～5d，得到发酵液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
以质量百分数计，所述斜面培养基由麦芽抽提物2％～4％，酪蛋白胨0.4％～1.0％，琼脂1.0％～2.5％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉0.5％～2.0％，葡萄糖0.5％～1.5％，麦芽抽提物0.2％～1.5％，棉籽粉0.2％～1.5％，黄豆饼粉0.2％～1.5％，酵母浸粉0.2％～1.5％，硫酸镁0.05％～0.2％，氯化钠0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.4％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述发酵培养基由麦芽糖1.0％～3.5％，糊精0.2％～1.0％，大豆油0.5％～2.0％，麦芽抽提物0.5％～2.0％，黄豆粉0.5％～2.5％，酵母抽提物0.5％～2.0％，磷酸二氢钾0.2％～0.8％，氯化钠0.2％～0.8％，硫酸镁0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.5％和余量的水组成。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：从所述发酵液中分离提取PF1022A。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵液用乙酸乙酯萃取,减压浓缩后，用乙酸乙酯进行二次萃取，减压浓缩，得到浓缩液；
所述浓缩液利用高压制备液相层析***进行分离，收集目标组分；
目标组分减压浓缩、结晶，得到PF1022A成品。
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