CN109280034B - 一种具有抑菌活性的苯并氮氧杂卓类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有抑菌活性的苯并氮氧杂卓类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然化合物技术领域，具体涉及一种具有抑菌活性的苯并氮氧杂卓类化合物及其制备方法与应用。本发明所述苯并氮氧杂卓类化合物为新结构化合物，其由申请人自行筛选的疣孢菌V.gifhornensis FIM06‑0025经发酵提取所得，经测定，该苯并氮氧杂卓类化合物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有广谱抑制活性，尤其对革兰氏阴性菌幽门螺杆菌和肺炎克雷伯氏菌以及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌具有较强的抑制活性，可用于制备广谱抗菌药物。

Description

一种具有抑菌活性的苯并氮氧杂卓类化合物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于天然化合物提取技术领域，具体涉及一种具有抑菌活性的 苯并氮氧杂卓类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
自1929年发现医用抗生素青霉素、1958年发现农用抗生素灭瘟素S 以来，迄今全世界已发现4000余种抗生素，在人畜疾病防控及农业有害生 物防治方面发挥了重要的作用，推动了人类文明和科学技术的进步。
但是，大量广谱抗生素的使用，反而加速了致病菌的进化，也导致病 原体尤其是细菌病原体的耐药性日趋增强，使得现有药物的疗效下降。此 外，广谱抗生素的大量使用也导致多重耐药菌的种类也在增多，使得耐药 性自革兰阴性杆菌发展到革兰阳性细菌，由院内感染发展到院外感染。耐 药细菌和多药耐药细菌的不断出现与快速传播，使细菌感染的预防、治疗 与控制面临着严峻的挑战，因此，细菌耐药问题是21世纪最严重的公共健 康问题之一。
现有细菌的耐药问题突出表现在耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌 和非发酵糖细菌，其中尤以肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌 等的耐药性最为严重，临床治疗也最为困难。虽然诸多学者对此进行了大 量的研究工作，但在过去的30年内，只有噁唑烷酮类和环脂肽类两类抗革 兰氏阳性菌药被批准上市，抗革兰氏阴性菌的药物则更少，临床用药现状 依然不容乐观。面临细菌耐药性的不断升级、抗菌药物疗效降低、以及临 床无药可用等棘手的问题，研发新型抗耐药菌药物的工作已迫在眉睫。
从微生物次生代谢产物中寻找有活性的化合物作为先导化合物创制新 药是世界药学工作者公认的有效途径之一，而微生物资源更是为创新药物 研究提供了无穷的源泉。微生物丰富多样的次生代谢产物为化学药物新药 研究与开发提供了大量极为珍贵的模式结构和药物前体小分子，是药物发 现源头创新和持续创新的重要物质基础，对整个创新药物的研究具有决定 性意义。
放线菌是微生物药物的主要来源，其中以链霉菌属及一些稀有放线菌 属为主。但自70年代以后，从链霉菌中发现新化合物的几率就越来越少， 而新化合物的重复率也越来越高。疣孢菌、诺卡氏菌等这些目前获得的种 类少的放线菌(俗称稀有放线菌)已被日益关注。稀有放线菌的次级代谢 产物中蕴藏着大量结构新颖的活性化合物，提高了获得目标活性化合物的 几率。
已知稀有放线菌中，疣孢菌(Verrucosispora)属于放线菌目小单孢菌 科(Micromonosporaceae)。自1998年Rheims等从沼泽淤泥中最早分离得到 疣孢菌之后，科学家们陆陆续续从海洋泥样、红树林、海鞘以及海绵中分 离到该属菌株。据报道，疣孢菌由于蕴藏着极其丰富的天然产物资源，正 成为微生物药物的一个重要菌源。如2004年，从日本海289m深的沉积物中 分离出属于小单孢菌科的verrucosispora maris AB 18-032，该菌株能产生抗 MRSA、VRSA活性的聚酮类化合物深海素(Abyssomicin C)，该化合物具 有新的抑菌作用靶点，对寻找新型高效抗生素具有积极意义。Bull和Stach 通过对verrucosispora maris AB 18-032的基因组分析，发现其至少包含了20 个天然产物合成的基因簇，这与Nett等的研究结论一起证明了疣孢菌不但可 以合成抗菌的活性物质，而且还可以代谢合成更多的天然化合物。又如， 2008年，从挪威海250米深的沉积物中分离到的verrucosispora sp.MG-37，该 菌株合成抗肿瘤的福安类化合物(proximicins)；2010年，Dai等从南海3602 米深的沉积物中分离出verrucosispora sediminis MS426T，并从该菌株分离到 8个环二肽(cyclo-dipetides)和两种诺卡菌胺雷士物(nocardamine-like)， 其中有些具有抗细菌与真菌活性；2010年，Shirai等从菌株verrucosispora gifhornensisYM28-088中分离到了具有抗***癌的两个新的二萜类化合 物(gifhornennolones A和B)。此外，从疣孢菌中还分离到抗肿瘤化合物 thiochondrilline C和Harrucomicin C等结构新颖、活性优良的化合物。从疣孢 菌中筛选结构新颖或者新作用机制的抗菌药物以应对多药耐药菌具有现实 可行性。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种苯并氮氧杂卓类化合 物，并进一步公开其制备方法与应用。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种苯并氮氧杂卓类化合物或其 药学上可接受的盐，所述苯并氮氧杂卓类化合物具有如下式(1)所示的结 构：
Figure BDA0001750972580000031
本发明还公开了一种制备所述的苯并氮氧杂卓类化合物的方法，包括 以疣孢菌Verrucosispora gifhornensis FIM06-0025进行发酵培养的步骤，以 及从所得发酵液中提取所述苯并氮氧杂卓类化合物的步骤；
所述疣孢菌Verrucosispora gifhornensis FIM06-0025保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15242，保 藏日期为2018年01月18日。
具体的，所述发酵培养步骤包括将所述的疣孢菌V.gifhornensis FIM06-0025接种到发酵培养基中进行发酵的步骤，并收集发酵液；
所述发酵培养基每升含有：可溶性淀粉20.0g，K2HPO4 0.5g，KNO3 5.0g， MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCO3 1.0g，余量为海 水，调pH7.2-7.5。
具体的，所述提取苯并氮氧杂卓类化合物的步骤具体包括：
(1)将收集的发酵液经固液分离，得到菌丝体和上清液，备用；
(2)取分离的菌丝体加入甲醇和丙酮的混合溶剂进行提取，并将所得 提取液浓缩去除溶剂，得到第一浸膏；将所得第一浸膏与分离的所述上清 液合并，并加入乙酸乙酯进行萃取，经浓缩得打第二浸膏；
(3)将所得第二浸膏经C18反相硅胶柱层析，并分别以体积比30： 100、50：100、70：100、70：90的甲醇-水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱， 并收集洗脱剂的洗脱浓度为70：100的组分，得到第一组分A-1；
(4)将所得第一组分A-1经硅胶柱层析，并以氯仿-甲醇溶液为洗脱剂， 从体积比9：1-1：1进行梯度洗脱，分部收集洗脱液，经TLC检测，以体 积比10：1的氯仿-甲醇为展开剂，碘为显色剂，合并相同组分，并收集TLC 检测Rf值为0.55的组分，得到第二组份A-2；
(5)将所得第二组份A-2经Sephadex LH-20柱层析，并以体积比1： 1的甲醇-乙腈溶液为洗脱剂，收集洗脱流份经TLC检测，以体积比10：1 的氯仿-甲醇为展开剂，并收集Rf值为0.61的组分，即得如权利要求1所 示结构的苯并氮氧杂卓类化合物。
进一步的，所述甲醇和丙酮的体积比为1：1，所述甲醇和丙酮的混合 溶剂的用量与所述菌丝体的体积比为1.5-2.0：1。
所述步骤(2)中，所述提取步骤为超声提取。
本发明还公开了所述的苯并氮氧杂卓类化合物或其药学上可接受的盐 在制备抗菌药物中的用途。
具体的，所述抗菌药物包括抗幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动 杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌或屎肠球 菌药物。
本发明还公开了一种抗菌药物，所述药物以所述的苯并氮氧杂卓类化 合物或其药学上可接受的盐为活性成分。
具体的，所述抗菌药物包括抗幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动 杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌或屎肠球 菌药物。
本发明还公开了一株疣孢菌株，其分类命名为Verrucosispora gifhornensis，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏编号为CGMCC No.15242，保藏日期为2018年01月18日。
本发明还公开了所述的疣孢菌株用于发酵制备如权利要求1所述苯并 氮氧杂卓类化合物的用途。
本发明所述苯并氮氧杂卓类化合物为新结构化合物，其由申请人自行 筛选的疣孢菌V.gifhornensis FIM06-0025经发酵提取所得，经测定，该苯 并氮氧杂卓类化合物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有广谱抑制活性， 尤其对革兰氏阴性菌幽门螺杆菌和肺炎克雷伯氏菌以及革兰氏阳性菌金黄 色葡萄球菌具有较强的抑制活性，可用于制备广谱抗菌药物。
本发明所述苯并氮氧杂卓类化合物由疣孢菌V.gifhornensis FIM06-0025经发酵提取所得，制备方法简单易行。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实 施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为本发明菌株FIM06-0025在营养琼脂培养基中的单菌落形态；
图2为本发明菌株FIM06-0025的扫描电镜图；
图3为本发明化合物FW251的HRESI-TOF-MS谱；
图4为本发明化合物FW251的IR谱；
图5为本发明化合物FW251的1H-NMR谱；
图6为本发明化合物FW251的1H-1H COSY谱；
图7为本发明化合物FW251的HMBC谱；
图8为本发明化合物FW251的13C-NMR谱；
图9为本发明化合物FW251的HSQC谱；
图10为本发明化合物FW251的DEPT谱；
图11为本发明化合物FW251的化学结构以及主要的1H-1H COSY和 HMBC相关谱。
具体实施方式
实施例1
从福建东海海绵中筛选出一株菌株，命名为FIM06-0025，经检测，其 分类学特征如下。
1.1、菌株的理化性质
菌株FIM06-0025在营养琼脂培养基中的单菌落形态如图1所示。从菌 株FIM06-0025的电镜扫描图(图2)可见，基内菌丝体发育良好，分枝有 隔，直径0.4μm，单个孢子着生于短孢子梗上，孢子有柄，表面有疣状突 起。
在无菌条件下，将筛选菌株FIM06-0025用接种环接种到如下ISP1-ISP7 的琼脂斜面培养基上，于32℃进行培养2-5d，观察记录FIM06-0025菌株 在不同培养基中的培养特征(见下表1所示)。
所述营养琼脂培培养基包括如下组分(g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0， 酵母膏2.0，氯化钠5.0，琼脂12.0，蒸馏水1000mL，灭菌前调pH值为 7.2-7.5。
ISP1培养基包括如下组分(g/L)：胰胨0.5，酵母膏0.3，琼脂2，蒸馏水 1L，灭菌前调pH7.2-7.5。
ISP2培养基包括如下组分(g/L)：酵母膏0.4，麦芽膏1，葡萄糖0.4，琼 脂2，蒸馏水1L，灭菌前调pH7.3。
ISP3培养基包括如下组分(g/L)：燕麦粉2，琼脂2，微量元素1mL，琼 脂2，蒸馏水1L，灭菌前调pH7.4。
ISP4培养基包括如下组分(g/L)：可溶性淀粉10.0，K2HPO4 1.0，MgSO4 1.0，NaCl1.0，(NH4)2SO4 2.0，CaCO3 2.0，微量元素1mL，琼脂2，蒸馏水 1L，灭菌前调pH 7.2。
ISP5培养基包括如下组分(g/L)：L-天冬素1.0，K2HPO4 1.0，甘油10.0， 琼脂20.0，微量元素1mL，琼脂2，蒸馏水1L，灭菌前调pH 7.2-7.4。
ISP6培养基包括如下组分(g/L)：蛋白胨酵母膏铁琼脂36.0，酵母膏1.0， 琼脂2，蒸馏水1L，灭菌前调pH 7.2-7.4。
ISP7培养基包括如下组分(g/L)：甘油1.5，L-酪氨酸0.05，L-天冬素0.1， K2HPO40.05，MgSO4 0.05，NaCl 0.05，微量元素1mL/L，琼脂1.5，蒸馏水 1L，灭菌前调pH 7.2-7.4。
微量元素溶液包括如下组分(g/L)：FeSO4·7H2O 0.1，MnCl·4H2O 0.1， ZnSO4·7H2O 0.1，蒸馏水100mL。
表1 FIM06-0025在不同培养基中的培养特征
培养基 生长状况 基丝颜色
ISP1 + Moderate Orange Yellow
ISP2 +++ Deep Brown
ISP3 +++ Moderate Orange
ISP4 +++ Moderate Orange
ISP5 + Deep Brown
ISP6 +++ Deep Orange Yellow
ISP7 +-++ Brownish Black
注：+++表示生长良好；++表示生长一般；+表示生长差；-表示不生长；颜色与色值参照ISCC-NBC 标准。
以微生物在单一碳源条件下的生长速率来表征微生物对这种碳源的利 用强度。选用ISP9基础培养基进行测试。
考察碳源为21种碳源，包括蜜二糖、棉籽糖、D-甘露糖、L-木糖、肌 醇、水杨素、L-鼠李糖、卫矛醇、山梨醇、二硫苏糖醇、D-半乳糖、甜醇、 七叶苷、赤藓醇、纤维二糖、阿东糖醇、松三糖、海藻糖、L-***糖、 D-葡萄糖和甲壳素。每种碳源添加0.8g/L，并以不加碳源培养基作为对照， 每个处理3个重复。
在无菌条件下，将菌株FIM06-0025用接种环接种到上述含有不同碳源 的ISP9基础培养基培养皿平板上，于32℃倒置培养，不同培养时间记录结 果并同空白比较，并分析碳源利用的结果(如下表所示2)。
ISP9基础培养基包括如下组分(g/L)：K2HPO4 5.65，KH2PO4 2.38， (NH4)2SO42.64，MgSO4·7H2O 1.0，琼脂12.0，碳源1.0，微量元素1mL，蒸 馏水1000mL，调pH7.5。
微量元素配制包括如下组分(g/L)：CuSO4·5H2O 0.64g，FeSO4·7H2O 0.11g，ZnSO4·7H2O 0.15g，MnCl2·4H2O 0.79g，蒸馏水100mL。
表2菌株FIM06-0025碳源利用情况
Figure BDA0001750972580000081
Figure BDA0001750972580000091
注：+表示可以完全利用；±表示可以部分利用；-表示完全不能利用。
1.2菌株16S rRNA鉴定
取上述培养至对数生长期的FIM06-0025菌液5mL，于8000r/min进行 离心15min，倾去上清液，收集菌体。
采用CTAB/NaCl法提取菌体基因组DNA，具体步骤如下：向菌体中加 入1.35mL TE溶液(pH 8.0)，悬浮并加入0.3mL 10％的十二烷基硫酸钠 (SDS)和150μL、100mg/ml溶菌酶和150μL、100mg/mL蛋白酶K，混匀， 60℃进行水浴1h，并加0.25mL、5mol/L的NaCl和0.2mLCTAB/NaCl溶 液，于65℃水浴10min，再以等体积的苯酚-氯仿-异戊醇溶剂和氯仿-异戊 醇溶剂各抽提3次，于10000r/min离心处理10min，吸取上清液，并加入 0.6倍体积的异丙醇，放置于-20℃环境中沉淀DNA，将溶出的DNA溶于 50μL TE中，于-20℃保存备用。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组 DNA完整性，并采用如下16S rRNA基因的通用引物：
27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和
1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对提取的DNA进行PCR扩 增。
将扩增后的DNA产物送至上海生物工程有限公司进行测序，其16S rRNA序列如SEQID NO.1所示。用BLAST软件与NCBI的GenBank数据 库收录的16S rRNA序列进行比对分析，Blast搜索同源序列。经比较，菌 株FIM06-0025与疣胞菌Verrucosispora gifhornensisDSM 44337T的16S rRNA基因序列的相似性为99％，综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果， 确定菌株FIM06-0025为疣胞菌Verrucosispora。
将该菌株分类命名为Verrucosispora gifhornensis，其保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.15242，保藏日期为 2018年01月18日。
实施例2菌株的发酵
取一铂环保存的菌株Verrucosispora gifhornensis FIM06-0025高氏天冬 素琼脂斜面培养物接入种子培养基中，于26℃、240rpm条件下进行摇床培 养223d，得到V.gifhornensis FIM06-0025的种子培养液。
将得到的菌株FIM06-0025的种子培养液以体积分数5-10％的接种量接 种到配制的发酵培养基中，于26℃、240rpm条件下进行摇床发酵培养4-5d， 得到疣胞菌V.gifhornensis FIM06-0025的发酵培养液。
所述高氏天冬素琼脂斜面培养基包括如下组分(g/L)：可溶性淀粉20.0g， 天冬素0.5g，海盐16.5g，NaCl 0.5g，KNO3 1.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 1.0g，琼脂12.0g，海水1000mL，自然pH值；其制备方法是 将各组分按其含量混合均匀，于121℃高温灭菌30min，备用。
所述种子培养基包括如下组分(g/L)：可溶性淀粉15.0g，酵母粉5.0g， 蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g， (NH4)2SO4 0.5g，CaCO31.0g，1L海水配制，其制备方法是将各组分按其含 量混合均匀，灭菌前调pH7.5，121℃高温灭菌30min，备用。
所述发酵培养基包括如下组分(g/L)：可溶性淀粉20.0g，K2HPO4 0.5g， KNO35.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCO3 1.0 g，海水1000mL，其制备方法是将各组分按其含量混合均匀，pH 7.2-7.5， 于121℃高温灭菌30min，备用。
经HPLC检测，所得发酵液中，目标化合物苯并氮氧杂卓类化合物的发 酵效价为0.064mg/L。
实施例3化合物的提取
将上述实施例2制备的疣胞菌V.gifhornensis FIM06-0025的发酵培养液 50L，在4500rpm条件下离心，分别得到菌丝体和上清夜，备用；
取分离得到的菌丝体，加入1.5-2.0倍体积的甲醇-丙酮混合溶剂(1：1， v：v)混匀，进行超声提取2次，控制超声温度低于40℃，超声时间30min； 收集提取液在低于40℃条件下进行减压浓缩以去除甲醇-丙酮溶剂，得到第 一浸膏(210g)；将所得第一浸膏与上述分离的上清液进行合并，将所得合 并液加入1.5-2.0倍体积的乙酸乙酯进行萃取2次，随后于低于40℃条件下进 行减压浓缩以去除乙酸乙酯，得到第二浸膏(169g)；
取所得第二浸膏经C18反相硅胶柱进行层析，分别用积比为30：100、 50：100、70：100和70：90的甲醇-水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，并合并 甲醇-水洗脱剂浓度为70：100的洗脱组分，得到第一组分A-1(110mg)；
将所得第一组分A-1用100-200目硅胶拌样，以干法装柱后，用氯仿-甲 醇为洗脱液，从体积比9：1-1：1进行梯度洗脱，分别收集各部分洗脱液， 经TLC检测，以体积比10：1的氯仿-甲醇为展开剂，以碘为显色剂，合并相 同组分，分别得到五种组分，即Rf值分别为0.27、0.39、0.55、0.67和0.75 的组分，收集Rf值为0.55的组分(30mg)，得到第二组份A-2；
将所得第二组份A-2，再经Sephadex LH-20柱层析，以体积比1：1的甲 醇-乙腈溶剂为洗脱剂，洗脱流份经TLC检测，以体积比10：1的氯仿-甲醇 为展开剂，收集Rf值为0.61的组分(3.2mg)，即为所需单体化合物，记为化 合物FW251。
实施例4结构鉴定
对化合物FW251进行质谱、紫外光谱、红外光谱和核磁共振等数据测 试，从而确定化合物的结构。
化合物FW251为白色粉末，其
Figure BDA0001750972580000111
UV(MeOH),λ max:241nm，301nm；HR-TOF-MS(m/z 208.1032[M+H]+(Calcd for 208.0974) (见图3)，可见其分子式为C11H13NO3，计算其不饱和度为6。
如图4所示的红外吸收光谱(IR)显示，在3075，1614，1493，和1582cm-1处有吸收说明含有芳香苯环基团，1644cm-1处的强吸收峰说明有酰胺的存在。
如图5所示的1H NMR图谱显示，有1个甲基质子[δH1.11(3H)]信号，1组 亚甲基质子[δH(4.44,4.32)]信号，2个次甲基质子[δH4.32、δH3.76]信号，1个9-NH的氨基氢质子[δH4.8]和1个10-OH苯羟基质子[δH12.3]信号以及4个苯基 质子[δH7.43(1H,J＝7.8Hz)、δH7.59(1H,J＝7.8Hz)、δH6.92(1H,J＝7.5Hz)、 δH6.96(1H,J＝8.3Hz)]信号。从4个苯基质子信号的耦合常数可以看出化合物 中含有1个邻位取代的苯环，1H-1H COSY和HMBC波谱进一步验证了上述结 论(如图6、图7)。
如图8-9所示的13C-NMR和DEPT135(DMSO-d6,125MHz)图谱显示， 化合物含有11个碳信号，其中包括1个亚甲基，1个甲基，6个次甲基和3个 季碳。1H-1H COSY(如图6)中显示，11-CH3(δH1.11)、10-H(δH3.76)、7-H(δH4.32) 和8-H(δH4.44,4.32)的耦合关系可得到以下结构片段：CH3-C10-C7-C8，在如 图7所示的HMBC谱中显示，8-H与9-C(δC 164.9)酰胺碳的相关可知片段 CH3-C10-C7-C8-NH-CO-，再则，2-H(δH7.59)与9-C的酰胺碳的耦合关系可推 出片段CH3-C10-C7-C8-NH-CO-与芳香基团通过酰胺碳9-C连接。综合以上分 析，并结合图10的HSQC和图7所示的HMBC谱图，得到化合物FW251的全 部碳信号和氢信号归属，见下表3所示。最后依据不饱和度以及分子量确定 了化合物FW251的化学结构(如图11)如下式(1)所示，即为新结构的苯 并氮氧杂卓类化合物。因而确定化合物FW251的化学结构和主要1H-1HCOSY和HMBC相关谱如图11。
Figure BDA0001750972580000121
表3化合物FW251的1H NMR(in Chloroform-d4,400MHz)和13C-NMR(inChloroform-d4,100 MHz)数据
Figure BDA0001750972580000122
Figure BDA0001750972580000131
实施例5抗菌活性测试
采用微量肉汤稀释法，以头孢噻肟钠为阳性对照品，测试化合物FW251 的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。
测试菌包括革兰氏阴性菌：幽门螺杆菌(H.pylori)ATCC 43504、肺 炎克雷伯菌(K.pneumoniae)ATCC 4352、大肠杆菌(E.coli)ATCC 25922、铜 绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC 27853和鲍曼不动杆菌(A.baumanniiin) ATCC 17978以及革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 25923、 白色念珠菌(C.albicans)ATCC 90028和屎肠球菌(E.faecium)ATCC 35667 (见下表4所示)。
具体操作步骤如下：
(1)MH肉汤培养基配制：称取MH肉汤培养基21.0g，加入到1L蒸馏 水中，加热煮沸至完全溶解，分装于试管中，121℃高压灭菌15min，备用；
(2)测试菌前期培养：无菌条件下，将测试菌接种到100mL MH肉汤 培养基中，置于35℃培养箱培养12h，备用；
(3)贮存液制备：分别称取适量待测样品和阳性对照品，阳性对照品 用1mL无菌水溶解，待测样品用1mL甲醇溶解，各自贮存液的初浓度应该大 于1000μg/mL；
(4)测试菌溶液的制备：无菌条件下，将上述培养好的测试菌用MH 肉汤校正到0.5麦氏单位浊度标准后按1:20的比例进行稀释，此时菌液浓度 约为5×106CFU/mL，备用；
(5)贮存液稀释和接种测试菌：无菌操作，取无菌的96孔板一个，除 第一孔加入160μL MH肉汤外，其余每孔均加入MH肉汤100μL，在第1孔加 入待测样品原液40μL混匀，然后吸取100μL至第2孔，混匀后在吸取100μL 至第3孔混匀，如此连续倍比稀释至倒数第3孔，并从倒数第3孔总吸取100μL 弃去。倒数第2孔为不含药物的生长对照，最后1孔为未接种的对照。然后 在每孔中加入上述制备好的测试菌接种物个10μL，使每孔最终的菌液浓度 约为5×105CFU/mL；
(6)孵育：将已接种测试菌的96孔板盖好盖子，置35℃生化培养 箱中培育16-20h；
(7)MIC终点判读：用肉眼在96孔板中所见能完全抑制细菌生长 的为该样品对该种细菌的最低抑制浓度，记录结果见下表4。
表4抑菌试验测定结果
测试菌 FW251(μg/mL) 头孢噻肟钠(μg/mL)
幽门螺杆菌 150 28
肺炎克雷伯氏菌 210 30
鲍曼不动杆菌 180 200
大肠杆菌 210 0.039
铜绿假单胞菌 210 100
白色念珠菌 220 180
金黄色葡萄球菌 180 6
屎肠球菌 190 128
结果如表4所示，化合物FW251对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有 广谱抑制活性(MIC值为3.4-200μg/mL)，尤其对革兰氏阴性菌幽门螺杆 菌和肺炎克雷伯氏菌以及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌具有较强的抑制活 性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。

Claims (3)

1.一种制备苯并氮氧杂卓类化合物的方法，其特征在于，所述苯并氮氧杂卓类化合物具有如下式(1)所示的结构：
Figure FDA0002975076630000011
所述方法包括以疣孢菌Verrucosispora gifhornensis FIM06-0025进行发酵培养的步骤，以及从所得发酵液中提取所述苯并氮氧杂卓类化合物的步骤；
所述疣孢菌Verrucosispora gifhornensis FIM06-0025保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15242，保藏日期为2018年01月18日；
所述发酵培养步骤包括将所述的疣孢菌Verrucosispora gifhornensis FIM06-0025接种到发酵培养基中，于26℃、240rpm条件下进行摇床发酵培养4-5d的步骤，并收集发酵液；
所述发酵培养基每升含有：可溶性淀粉20.0g，K2HPO4 0.5g，KNO3 5.0g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCO3 1.0g，余量为海水，调pH7.2-7.5；
所述提取苯并氮氧杂卓类化合物的步骤具体包括：
(1)将收集的发酵液经固液分离，得到菌丝体和上清液，备用；
(2)取分离的菌丝体加入甲醇和丙酮的混合溶剂进行提取，并将所得提取液浓缩去除溶剂，得到第一浸膏；将所得第一浸膏与分离的所述上清液合并，并加入乙酸乙酯进行萃取，经浓缩得到第二浸膏；
(3)将所得第二浸膏经C18反相硅胶柱层析，并分别以体积比30：100、50：100、70：100、70：90的甲醇-水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，并收集洗脱剂的洗脱浓度为70：100的组分，得到第一组分A-1；
(4)将所得第一组分A-1经硅胶柱层析，并以氯仿-甲醇溶液为洗脱剂，从体积比9：1-1：1进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，经TLC检测，以体积比10：1的氯仿-甲醇为展开剂，碘为显色剂，合并相同组分，并收集TLC检测Rf值为0.55的组分，得到第二组份A-2；
(5)将所得第二组份A-2经Sephadex LH-20柱层析，并以体积比1：1的甲醇-乙腈溶液为洗脱剂，收集洗脱流份经TLC检测，以体积比10：1的氯仿-甲醇为展开剂，并收集Rf值为0.61的组分，即得如式(1)所示结构的苯并氮氧杂卓类化合物。
2.根据权利要求1所述的制备所述苯并氮氧杂卓类化合物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述提取步骤为超声提取。
3.一种疣孢菌株用于发酵制备苯并氮氧杂卓类化合物的用途，其特征在于，所述苯并氮氧杂卓类化合物具有如下式(1)所示的结构：
Figure FDA0002975076630000021
所述疣孢菌株分类命名为疣孢菌Verrucosispora gifhornensis FIM06-0025，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15242，保藏日期为2018年01月18日。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110092758B (zh) * 2019-03-27 2021-06-18 福建省微生物研究所 一种新型生物碱化合物及发酵制备该化合物的疣孢菌株

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005082873A2 (de) * 2004-02-27 2005-09-09 Bioagency Ag 1,4-benzothiazepane und derivate
CN103086996A (zh) * 2013-01-25 2013-05-08 西北农林科技大学农药研究所 一种苯并氮氧杂卓类抗生素及其制备方法
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Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005082873A2 (de) * 2004-02-27 2005-09-09 Bioagency Ag 1,4-benzothiazepane und derivate
CN103086996A (zh) * 2013-01-25 2013-05-08 西北农林科技大学农药研究所 一种苯并氮氧杂卓类抗生素及其制备方法
CN105294593A (zh) * 2015-12-08 2016-02-03 山东大学 光学纯7-氨基-2,3,4,5-四氢苯并[b][1,4]氧氮杂卓-3-醇及其应用
CN108794368A (zh) * 2018-06-05 2018-11-13 福建省微生物研究所 一种具有多样抑菌活性的生物碱类化合物及其制备方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Design, Synthesis, and Antibacterial Evaluation of Oxazolidinones with Fused Heterocyclic C-Ring Substructure;Mahesh S. Deshmukh等;《ACS Med. Chem. Lett.》;20170928;第8卷;第1153-1158页 *
Isolation, purification and identification of two new alkaloids metabolites from marine-derived Verrucosispora sp. FIM06025;Ming-Hong Chen等;《Natural Product Research》;20191231;第33卷(第20期);第2897-2903页 *
海绵共附生疣孢菌FIM060022抑菌活性代谢产物的研究;陈玉英等;《中国抗生素杂志》;20140930;第39卷(第9期);第641-645、664页 *

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