CN107815426B - 发酵生产春雷霉素的专用菌株及其应用 - Google Patents

发酵生产春雷霉素的专用菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种发酵生产春雷霉素的专用菌株及其应用。本发明从牡丹江海林市某蔬菜地土壤中分离到一株好氧放线菌，通过对该放线菌进行紫外及化学诱变处理，最终获得一株高产春雷霉素的菌株BJX007，其保藏编号为CGMCC No.11622。经鉴定，菌株BJX007为小金色链霉菌(Streptomyces microaureus)，其发酵生产春雷霉素的能力高，产量可达25000μg/mL发酵液，且菌株BJX007连续传代5次后其生产春雷霉素的能力仍保持原有水平，表明其遗传稳定性好，可用于工业化大规模春雷霉素的生产。本发明为利用生物发酵技术生产春雷霉素提供了宝贵的微生物资源。

Description

发酵生产春雷霉素的专用菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种发酵生产春雷霉素的专用菌株及其应用。
背景技术
春雷霉素(Kasugamycin)又称春日霉素，是由放线菌产生的氨基糖苷类抗生素，属内吸抗生素，兼有治疗和预防作用，纯品为白色针状结晶固体，在常温下稳定，酸性和中性条件下稳定，在碱性条件下易分解。水剂形式为深绿色液体，常温下可贮存2年以上，对环境友好，是较理想的农用杀菌剂，在农业生产上得到广泛应用，对水稻上的稻瘟病有优异防效和治疗作用，此外对防治西瓜细菌性角斑病，桃树流胶病，疮痂病，穿孔病等病害有特效。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产春雷霉素的专用菌株--小金色链霉菌BJX007。
本发明的另一目的是提供菌株BJX007在发酵生产春雷霉素中的应用。
为了实现本发明目的，本发明从牡丹江海林市横道河子附近的蔬菜地中分离到一株放线菌，具体方法如下：将土壤制成悬液，将土壤悬液接种于分离培养基中进行培养，挑取单菌落进行稀释划线分离纯化，获得纯培养菌株。按照《真菌鉴定手册》索引表进行菌株形态鉴定。
经鉴定，该菌株为好氧放线菌，孢子丝呈螺旋形，孢子球形至卵圆形，中间凸起，表面光滑，在合成培养基上气生菌丝为灰白色，基内菌丝为土黄色。
其中，所述分离培养基配方如下：胰蛋白胨3g/L，豆饼粉10g/L，甘油10mL/L，氯化钠3g/L，碳酸钙2g/L，琼脂粉25g/L，pH值自然。所述合成培养基配方如下：玉米淀粉20g/L，豆饼粉45g/L，氯化钠2.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，豆油12mL/L，淀粉酶0.1g/L，pH值自然。
对该株放线菌进行以下诱变处理：
(1)紫外诱变两次：取菌悬液5ml，加入无菌培养皿中，用30W的紫外照射仪于30cm高度处垂直照射。设定照射时间分别为60s、90s。分离培养基灭菌后，加入终浓度0.1μg/ml、0.2μg/ml经过滤除菌的链霉素，铺制平皿，28℃培养10d。挑取单菌落按照上述方法进行高通量筛选、摇瓶复试。获得的高产春雷霉素菌株进行下一步诱变。
(2)亚硝酸钠(NIT)诱变
将经过紫外诱变筛选到的菌株，制备该菌株的菌悬液，取10mL菌悬液分别加入250mL锥形瓶中，瓶中装有90mL含不同浓度(0、5、10、20、40、60和80mg/L)NIT的硅酸盐改性培养基，在30℃、200r/min条件下处理40min，然后离心分离菌体沉淀，并用无菌水洗涤3次，除去NIT，终止诱变。然后取各诱变菌液1mL稀释后涂布于改性培养基琼脂平板上，在30℃下培养7d后进行菌落计数，确定最佳诱变剂量并挑取该诱变剂量下的菌落进行初筛与复筛。得到高产春雷霉素的菌株继续进行化学诱变处理。
(3)氯化锂处理
将经过NIT诱变筛选到的菌株，制备该菌株的孢子悬液，取10mL孢子悬液(孢子数108个/mL)，按1％的浓度加入LiCl，在摇床上振荡10h、12h、15h、20h，终止诱变，取各诱变菌液1mL稀释涂布于琼脂培养基平板上，在28℃下培养10d后进行菌落计数，确定最佳诱变剂量并挑取该诱变剂量下的菌落进行初筛和复筛，最终获得一株高产春雷霉素的菌株BJX007。
经鉴定，菌株BJX007为好氧放线菌，孢子丝呈螺旋形，孢子球形至卵圆形，中间凸起，表面光滑，在合成培养基上气生菌丝为灰白色，基内菌丝为土黄色。
菌株BJX007的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示，将其16SrDNA序列在GenBank中进行比对，并构建菌株BJX007的***进化树。其中，用于PCR扩增菌株BJX007 16SrDNA序列的引物为：
正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
反向引物：5′-AAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA-3′
综合菌株形态特征、16SrDNA基因序列***进化分析结果，鉴定菌株BJX007为小金色链霉菌(Streptomyces microaureus)，该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.11622，保藏日期2015年11月5日。
本发明还提供小金色链霉菌BJX007在发酵生产春雷霉素中的应用。
包括以下步骤：
S1、制备种子液：从菌株BJX007的斜面培养基上挖取1cm2带菌培养基接入装有发酵培养基的250mL种子瓶内，装液量为30mL，于28℃220r/min震荡培养48h，所得菌液按10％的质量百分比接入装有发酵培养基的发酵瓶中，所述发酵瓶的容积250mL，装液量为35mL，于28℃220r/min震荡培养24h，得到种子液；
S2、发酵培养：将上述种子液按10％的质量百分比接入装有发酵培养基的发酵瓶中，所述发酵瓶的容积250mL，装液量为35mL，于28℃220r/min摇床震荡培养165-170h(优选7d)，发酵结束后，从发酵液中分离得到春雷霉素。
其中，所述发酵培养基配方如下：玉米淀粉15-20g/L，豆饼粉45-50g/L，氯化钠2.5g-3/L，磷酸二氢钾0.2g-0.5/L，豆油10-12mL/L，淀粉酶0.05-0.1g/L，pH值自然。
优选地，所述发酵培养基配方如下：玉米淀粉20g/L，豆饼粉45g/L，氯化钠2.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，豆油12mL/L，淀粉酶0.1g/L。
本发明提供的小金色链霉菌BJX007，其发酵生产春雷霉素的能力高，产量可达25000μg/mL发酵液，且菌株BJX007连续传代5次后其生产春雷霉素的能力仍保持原有水平，表明其遗传稳定性好，可用于工业化大规模春雷霉素的生产。本发明为利用生物发酵技术生产春雷霉素提供了宝贵的微生物资源。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
本发明中所用淀粉酶为高温淀粉酶，酶活为10000U/g。
实施例1菌株BJX007的分离和鉴定
1、原始菌株的分离鉴定
从牡丹江海林市横道河子附近的蔬菜地中分离到一株放线菌，按照《真菌鉴定手册》索引表进行菌株形态鉴定。
经鉴定，该菌株为好氧放线菌，孢子丝呈螺旋形，孢子球形至卵圆形，中间凸起，表面光滑，在合成培养基上气生菌丝为灰白色，基内菌丝为土黄色。
2、原始菌株的诱变处理
(1)紫外诱变两次：取菌悬液5ml，加入无菌培养皿中，用30W的紫外照射仪于30cm高度处垂直照射。设定照射时间分别为60s、90s。分离培养基灭菌后，加入终浓度0.1μg/ml、0.2μg/ml经过滤除菌的链霉素，铺制平皿，28℃培养10d。挑取单菌落按照上述方法进行高通量筛选、摇瓶复试。获得的高产春雷霉素菌株进行下一步诱变。
(2)亚硝酸钠(NIT)诱变
将经过紫外诱变筛选到的菌株，制备该菌株的菌悬液，取10mL菌悬液分别加入250mL锥形瓶中，瓶中装有90mL含不同浓度(0、5、10、20、40、60和80mg/L)NIT的硅酸盐改性培养基，在30℃、200r/min条件下处理40min，然后离心分离菌体沉淀，并用无菌水洗涤3次，除去NIT，终止诱变。然后取各诱变菌液1mL稀释后涂布于改性培养基琼脂平板上，在30℃下培养7d后进行菌落计数，确定最佳诱变剂量并挑取该诱变剂量下的菌落进行初筛与复筛。得到高产春雷霉素的菌株继续进行化学诱变处理。
(3)氯化锂处理
将经过NIT诱变筛选到的菌株，制备该菌株的孢子悬液，取10mL孢子悬液(孢子数108个/mL)，按1％的浓度加入LiCl，在摇床上振荡10h、12h、15h、20h，终止诱变，取各诱变菌液1mL稀释涂布于琼脂培养基平板上，在28℃下培养10d后进行菌落计数，确定最佳诱变剂量并挑取该诱变剂量下的菌落进行初筛和复筛，最终获得一株高产春雷霉素的菌株BJX007。
3、菌株BJX007的鉴定
经鉴定，菌株BJX007为好氧放线菌，孢子丝呈螺旋形，孢子球形至卵圆形，中间凸起，表面光滑，在合成培养基上气生菌丝为灰白色，基内菌丝为土黄色。
菌株BJX007的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示，将其16SrDNA序列在GenBank中进行比对，并构建菌株BJX007的***进化树。其中，用于PCR扩增菌株BJX007 16SrDNA序列的引物为：
正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
反向引物：5′-AAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA-3′
综合菌株形态特征、16SrDNA基因序列***进化分析结果，鉴定菌株BJX007为小金色链霉菌(Streptomyces microaureus)。
实施例2菌株BJX007在发酵生产春雷霉素中的应用
1、制备种子液：从菌株BJX007的斜面培养基上挖取1cm2带菌培养基接入装有发酵培养基的250mL种子瓶内，装液量为30mL，于28℃220r/min震荡培养48h，所得菌液按10％的质量百分比接入装有发酵培养基的发酵瓶中，所述发酵瓶的容积250mL，装液量为35mL，于28℃220r/min震荡培养24h，得到种子液。
2、发酵培养：将上述种子液按10％的质量百分比接入装有发酵培养基的发酵瓶中，所述发酵瓶的容积250mL，装液量为35mL，于28℃220r/min摇床震荡培养7d，发酵结束后，所得发酵液中春雷霉素含量高达25000μg/mL，然后从发酵液中分离获得春雷霉素。
其中，所述发酵培养基配方如下：玉米淀粉20g/L，豆饼粉45g/L，氯化钠2.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，豆油12mL/L，淀粉酶0.1g/L，pH值自然。培养基灭菌条件：121℃灭菌30min。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0001113280380000011
Figure IDA0001113280380000021

Claims (4)

1.小金色链霉菌(Streptomyces microaureus)BJX007，其保藏编号为CGMCCNo.11622。
2.权利要求1所述小金色链霉菌BJX007在发酵生产春雷霉素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备种子液：从菌株BJX007的斜面培养基上挖取1cm2带菌培养基接入装有发酵培养基的250mL种子瓶内，装液量为30mL，于28℃220r/min震荡培养48h，所得菌液按10％的质量百分比接入装有发酵培养基的发酵瓶中，所述发酵瓶的容积250mL，装液量为35mL，于28℃220r/min震荡培养24h，得到种子液；
S2、发酵培养：将上述种子液按10％的质量百分比接入装有发酵培养基的发酵瓶中，所述发酵瓶的容积250mL，装液量为35mL，于28℃220r/min震荡培养165-170h，发酵结束后，从发酵液中分离得到春雷霉素；
其中，所述发酵培养基配方如下：玉米淀粉15-20g/L，豆饼粉45-50g/L，氯化钠2.5g-3/L，磷酸二氢钾0.2g-0.5/L，豆油10-12mL/L，淀粉酶0.05-0.1g/L，pH值自然；所述淀粉酶的酶活为10000U/g。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基配方如下：玉米淀粉20g/L，豆饼粉45g/L，氯化钠2.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，豆油12mL/L，淀粉酶0.1g/L。
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