CN116179400B - 一株产重排甾体化合物的黏细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产重排甾体化合物的黏细菌，该黏细菌命名为珊瑚球菌(Corallococcusinteremptor)SDU284，已于2022年8月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25442。本发明还公开了所述黏细菌在发酵制备corasterol化合物中的应用。实验证实本发明所述黏细菌珊瑚球菌SDU284培养过程简单、周期短、不易污染、corasterol化合物产物稳定，极具应用前景和研究价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株黏细菌及其发酵生产重排甾体化合物的应用，具体涉及一株产重排甾体corasterol的黏细菌(Corallococcus interemptor)及其培养方法以及在发酵制备corasterol化合物中的应用。
背景技术
甾体一直是药物发现和开发的重要资源，重排甾体由于其特殊的结构特征及潜在的生物生理活性越来越受到研究者的关注。从结构上来讲，重排甾体是经典甾体的四环母核(A–D环)骨架或C-17位侧链发生氧化重排或转化后形成的非典型类甾体。重排甾体不仅具有多样化的骨架特征，往往还具有显著的生物活性，如抗炎、抗肿瘤、抗菌和免疫抑制等。调研发现，重排甾体的发现数量远不如经典甾体，且来源主要集中在大型真菌蘑菇及真菌等真核生物，例如来自于食用菌菇的重排甾体strophasterol A(J.Wu,S.Tokuyama,K.Nagai,et al.Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,10820–10822)、来自于青霉菌的penicillitone(J.Xue,P.Wu,L.Xu,et al.Org.Lett.2014,16,1518–1521)以及来自于海洋真菌的dankasterone A等(T.Amagata,M.Doi,M.Tohgo,et al.Chem.Commun,1999,1321–1322)，而目前尚未见细菌来源重排甾体的相关报道。
黏细菌是一类高等的原核生物，是具有复杂多细胞行为和形态发生变化的革兰氏阴性菌。黏细菌能够滑行运动，并以掠食性生活而闻名，这与其能分泌在外的丰富多样的活性次级代谢产物和蛋白质有关。经检索，尽管黏细菌在自然界中普遍存在，但其产生的次级代谢产物并未充分开发和利用，相关研究报道并不多。因此，黏细菌有望成为挖掘天然活性药源分子的重要微生物资源，并能尽可能避免重复发现已知的化学实体(M.A.Skinnider,N.A.Magarvey,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2017,114,E6271–E6272；J.Herrmann,A.A.Fayad,R.Müller,Nat.Prod.Rep.2017,34,135–160.)。
重排甾体corasterol是申请人在黏细菌中首次发现，该化合物的发现表明黏细菌是挖掘重排甾体的重要微生物新资源。
经检索，有关产重排甾体化合物的黏细菌特别是珊瑚球菌(Corallococcusinteremptor)SDU284及其应用还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株产重排甾体corasterol的黏细菌(Corallococcus interemptor)及其培养方法以及在发酵制备corasterol化合物中的应用。
本发明所述产重排甾体化合物的黏细菌，其特征在于：所述黏细菌命名为珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年8月1日，保藏编号为CGMCC No.25442，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所述菌株是从吉林省松原市夜字泡湖湖底泥土样中采用常规方法分离筛选得到，命名为菌株SDU284，其具有如下生物学特征：
菌株SDU284菌落及形态特征是：菌株SDU284生长在VY/2培养基上，在30℃下培养3天呈橙黄色，菌落光滑，凸起，呈圆形(具体形态见附图1)。菌株营养细胞呈短杆状，大小1.1～5.4μm×0.4～0.7μm，无孢子产生。
菌株SDU284生理生化特征是：革兰氏阴性菌，好氧，生长最适温度30-35℃，在30℃生长良好；菌株SDU284能够吸附刚果红及产生过氧化氢酶，不能降解琼脂、纤维素、几丁质、淀粉和蔗糖。
通过全基因组测序，菌株SDU284的16S rRNA基因序列全长为1538bp(如序列表SEQID NO.1所示)，通过EzBioCloud数据库的比对，菌株SDU284的16S rRNA的基因序列与Corallococcus interemptor AB047AT和Corallococcus exiguus DSM 14696T的16S rRNA的基因序列的相似性分别为99.92％和99.79％。***发育树(图2)表明该菌株与Corallococcus interemptorT处于同一分支，因此，初步鉴定该菌株属于Corallococcusinteremptor，该菌株已于2022年8月1日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.25442，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所述的黏细菌在发酵制备corasterol化合物中的应用，其中所述corasterol化合物是式(I)所示的化合物：
其中，利用珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284发酵制备corasterol化合物的方法是：
(1)选择珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284并将其接种于新鲜VY/2平板上，3032℃培养2–3天，得到活化菌体；
(2)将步骤(1)制得的活化菌体接种于VY/2液体种子培养基中，3032℃培养2–3天，得到种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液接种至VY/2发酵培养基中，3032℃发酵731天，滤掉菌丝体，得到含corasterol化合物的发酵液；
(4)向发酵液加入树脂，吸附发酵液中的代谢产物12–20小时；
(5)收集树脂，甲醇洗脱，减压浓缩洗脱液，得到甲醇相粗提物。采用氢谱追踪及硅胶柱色谱及高效液相色谱，实现对corasterol化合物的分离纯化。
上述的应用中，所述VY/2平板固体培养基配方是：安琪酵母0.5g/100ml，七水硫酸镁0.1g/100ml，氯化钙0.07g/100ml，琼脂粉1.5–2g/100ml，pH值调至7.2；所述VY/2液体种子培养基或VY/2发酵培养基配方是：安琪酵母0.5g/100ml，七水硫酸镁0.1g/100ml，氯化钙0.07g/100ml，pH值调至7.2。
上述的应用中，步骤(1)至(3)所述菌的培养温度优选是30℃。
上述的应用中，所述树脂的型号是HP-20，其加入量是20g/L发酵液，在30℃，200rpm条件下吸附12小时。
上述珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284液体种子培养时间优选为3天。
上述珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284产corasterol化合物发酵培养时间优选为7天。
本发明对于上述珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284发酵甲醇粗提物中的corasterol化合物进行了分离纯化及鉴定：
取SDU284菌的发酵粗品1g，使用反相中低压柱层析将粗提物分成六个馏分A–F，采用氢谱测试与正相硅胶色谱联用，快速富集并锁定了含corasterol化合物的组分，通过进一步的高效液相色谱纯化得到了corasterol单体化合物，见图3–图5。
本发明公开了一株产重排甾体化合物的黏细菌及其在制备corasterol化合物中的应用。该黏细菌为重排甾体化合物生产菌株的首次报道。目前已报道的重排甾体主要来源于真核生物，如真菌及大型真菌蘑菇等，本发明首次从黏细菌中发现了重排甾体，为重排甾体的开发应用提供了重要的微生物新资源。该黏细菌在制备corasterol化合物的应用中，所述珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284能够产生corasterol化合物，且培养过程简单、周期短、不易污染、产物稳定，具有极大的应用前景。
附图说明
本发明所述珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284已于2022年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25442。
图1：珊瑚球菌SDU284菌株在VY-2平板上的培养6天的菌落特征。
图2：珊瑚球菌SDU284的进化位置在黏细菌目中的进化位置。
图3：氢谱追踪SDU284的粗提物及馏分A–F中corasterol所在馏分。
图4：珊瑚球菌SDU284所产corasterol化合物的HPLC谱图。
图5：Corasterol的高分辨质谱图。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对本发明做了更详细的说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1菌株的分离及纯化
菌株分离方法：待WCX培养基凝固后，在培养基上均匀涂抹4个黄豆大小的大肠杆菌。将处理后的样品(吉林省松原市夜字泡湖湖底泥土样)均匀的涂抹在大肠杆菌菌垫上，于30℃恒温培养箱中培养。培养3天后，每天在体视显微镜下观察平板黏细菌的生长变化情况。及时小心挑取子实体顶部或刮取菌膜边缘，转接至新的有大肠杆菌菌垫的WCX培养基或者VY/2培养基，进行进一步的纯化培养，从中得到一株橙黄色细菌，命名为菌株SDU284。
其中，上述WCX培养基的配方：CaCl2·2H2O 0.1g/100ml，琼脂1.5g/100ml，pH 7.2。灭菌后加入放线菌酮至终浓度25μg/mL。VY/2培养基的配方及配制方法：安琪酵母0.5g/100ml，七水硫酸镁0.1g/100ml，氯化钙0.07g/100ml，pH值调至7.2。VY/2固体培养基需添加1.5–2g/100ml的琼脂粉。
上述菌株SDU284生长在VY/2培养基上，在30℃下培养3天呈橙黄色，菌落光滑，凸起，呈圆形(具体形态见附图1)。菌株营养细胞呈短杆状，大小1.1～5.4μm×0.4～0.7μm，无孢子产生。菌株SDU284生理生化特征是：革兰氏阴性菌，好氧，生长最适温度30–35℃，在30℃生长良好；菌株SDU284能够吸附刚果红及产生过氧化氢酶，不能降解琼脂、纤维素、几丁质、淀粉和蔗糖。
通过全基因组测序，菌株SDU284的16S rRNA基因序列全长为1538bp(如序列表SEQID NO.1所示)，通过EzBioCloud数据库的比对及进化树的构建确定该菌株为珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)(图2)。
上述珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2022年8月1日，保藏编号为CGMCCNo.25442，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例2菌株SDU284的发酵及所产corasterol化合物的获得
菌株SDU284发酵步骤如下：
将珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284接种于新鲜VY/2平板上，30℃培养2–3天得活化菌体；用接种环刮取菌体，接种至100mL含VY/2液体种子培养基的摇瓶中，30℃培养2–3天，达到对数生长期，取体积含量10％种子培养液接转接至新鲜VY/2发酵培养基中。在30℃，200rpm条件下培养7天，过滤掉菌体，培养液中加入2％(w/v)的吸附树脂HP-20，30℃，200rpm条件下吸附12小时，收集树脂，甲醇洗脱，减压浓缩洗脱液，得到甲醇相粗提物。
其中，上述VY/2平板固体培养基配方是：安琪酵母0.5g/100ml，七水硫酸镁0.1g/100ml，氯化钙0.07g/100ml，琼脂粉1.5–2g/100ml，pH值调至7.2；所述VY/2液体种子培养基或VY/2发酵培养基配方是：安琪酵母0.5g/100ml，七水硫酸镁0.1g/100ml，氯化钙0.07g/100ml，pH值调至7.2。
取SDU284菌的发酵粗品1g，使用反相中低压柱层析将粗提物分成六个馏分A–F，采用氢谱测试与正相硅胶色谱联用，快速富集并锁定了含corasterol化合物的组分，通过进一步的高效液相色谱纯化得到了corasterol单体化合物。
其中上述的正相硅胶色谱使用的洗脱液包括环己烷-丙酮配比为6:1及二氯甲烷-甲醇配比为50:1。高效液相色谱流动相甲醇-水溶液合适的配比为98:2。
图3显示，对珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284发酵粗提物进行反相中低压制备得到了六个馏分A–F，氢谱检测显示组分F中在δH 5.0–5.5之间有明显的甾体侧链上烯双键的特征氢信号，是含有corasterol化合物的组分。并由图4：珊瑚球菌SDU284所产corasterol化合物的HPLC谱图及图5：corasterol的高分辨质谱图得到证实。
实施例3利用珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284发酵制备corasterol化合物
(1)将SDU284接种于新鲜VY/2平板上，28℃培养3天，得到活化菌体；
(2)将步骤(1)制得的活化菌体用10μL接种环接种于含VY/2液体种子培养基的摇瓶中，28℃振荡培养3天，得到种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积比1:9的量接种至VY/2发酵培养基中，28℃发酵8天，滤掉菌丝体，得到含corasterol的发酵液。
其中，上述各种培养基配方同实施例2。
实施例4利用珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284发酵制备corasterol化合物
(1)将SDU284接种于新鲜VY/2平板上，32℃培养2天，得到活化菌体；
(2)将步骤(1)制得的活化菌体适量用10μL接种环接种于含VY/2液体种子培养基的摇瓶中，32℃振荡培养2天，得到种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积比1:9的量接种至VY/2发酵培养基中，32℃发酵6天，滤掉菌丝体，得到含corasterol的发酵液。
其中，上述各种培养基配方同实施例2。
Claims (6)
1.一株产重排甾体化合物的黏细菌，其特征在于：所述黏细菌命名为珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年8月1日，保藏编号为CGMCC No.25442，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述产重排甾体化合物的黏细菌在发酵制备corasterol化合物中的应用，其中所述corasterol化合物是式(I)所示的化合物：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用黏细菌发酵制备corasterol化合物的方法是：
(1)黏细菌选择珊瑚球菌(Corallococcus interemptor)SDU284并将其接种于新鲜VY/2平板上，30±2℃培养2–3天，得到活化菌体；
(2)将步骤(1)制得的活化菌体接种于VY/2液体种子培养基中，30±2℃培养2–3天，得到种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液接种至VY/2发酵培养基中，30±2℃发酵7±1天，滤掉菌丝体，得到含corasterol化合物的发酵液；
(4)向发酵液加入树脂，吸附发酵液中的代谢产物12–20小时；
(5)收集树脂，甲醇洗脱，减压浓缩洗脱液，得到甲醇相粗提物；采用氢谱追踪及硅胶色谱及高效液相色谱，实现对corasterol化合物的分离纯化。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述VY/2平板固体培养基配方是：安琪酵母0.5g/100ml，七水硫酸镁0.1g/100ml，氯化钙0.07g/100ml，琼脂粉1.5-2g/100ml，pH值调至7.2；所述VY/2液体种子培养基或VY/2发酵培养基配方是：安琪酵母0.5g/100ml，七水硫酸镁0.1g/100ml，氯化钙0.07g/100ml，pH值调至7.2。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)至(3)所述菌的培养温度是30℃。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述树脂的型号是树脂HP-20，其加入量是20g/L，在30℃，200rpm条件下吸附12小时。
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