CN103146594B - 纤维堆囊菌菌株及其在埃博霉素合成方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程和生物制药领域，具体涉及纤维堆囊菌株 Sorangiumcellulosum So2163，还涉及该菌株在埃博霉素合成方面的应用。纤维堆囊菌株( Sorangiumcellulosum )So2163，该菌株已于2012年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2012211。本发明的纤维堆囊菌株 Sorangiumcellulosum So2163，为埃博霉素的工业化生产提供了新的菌株资源。
Description
技术领域
本发明属于生物工程和生物制药领域，具体涉及纤维堆囊菌株Sorangium cellulosum So2163 ，还涉及该菌株在埃博霉素合成方面的应用。
背景技术
癌症是一种严重威胁人类健康和生命的常见病和多发病，是世界各国医学科学领域中的重要科研课题，目前尚无满意的治疗措施。紫杉醇作为目前应用最为广泛的抗肿瘤药物，其年销量达到了20亿美元，占抗肿瘤药物市场份额的10%。由于其抗癌普扩大以及非肿瘤性疾病方面良好的治疗前景，预计今后世界需求量将达到每年2000公斤，而美国BMS公司紫杉醇制剂的售价为每公斤500-1000万美元。
埃博霉素作为与紫杉醇具有相同抗肿瘤机制的一类大环内酯类化合物，能够抑制癌症晚期纺锤体和纺锤丝的形成，从而抑制有丝***，组织癌细胞增值，也具有光谱的抗癌疗效。同时埃博霉素与紫杉醇相比还具备以下几个优点：良好的水溶性；更广的抗癌谱；更强的对耐药性肿瘤的抑制能力；以及最重要的一点——它是目前发现的唯一一种由微生物发酵产生的促微管聚合活性化合物，具备大规模发酵制备的潜力。自从1996年被发现以来，逐渐成为抗肿瘤药物的研究热点，目前已经有很多埃博霉素类化合物进入不同水平的临床评估阶段，并且其中之一——ixabepilong，埃博霉素的大患内酰胺结构类似物，已经于2007年10月经美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，展示了良好的治疗效果。埃博霉素类药物也被认为是紫杉醇的更新换代产品，其市场容量不会低于10亿美元/年，我国的年销售额也将在1亿美元以上。
Epothilone的制备方法目前主要有三种，分别是化学全合成法、生物合成法和化学修饰法。
鉴于其简单的化学结构和很好的抗肿瘤疗效，epothilone一经发现就成为生物有机化学家们关注的热点，目前已经有数十条全合成路线相继报道，且较为详尽的结构与活性关系也已经被推导，epothilone全合成工作也于上世纪末在我国开展，但是由于埃博霉素的结构相对仍较为复杂，化学全合成步骤冗长，产率非常低，不具备工业化生产的前景。
人们通过对epothilone的构效关系研究发现其16元大环内酯结构中的酰基部分与其生物活性密切相关，而O-烷基部分的修饰对其活性影响不大，因此通过对天然epothilone进行化学修饰开发新的结构类似物具有良好的应用前景。目前批准上市的ixabepilone和处于临床评估的BMS-310705均是化学修饰的结构类似物。但是化学修饰法也必须依赖于大量原料的供应才能够实施。因此生物合成仍然是epothilone生产的唯一有效途径。
Epothilone产生菌最早报道的是来自于美国Emporia州立大学的SMP44菌株以及来自于德国国家生物技术研究中心GBF的So ce90菌株，其epothilone A的产量均为20mg/L左右。国内目前仅有少数几个单位在研究埃博霉素的发酵生产，能够应用的菌株数量稀少且多为野生菌株，因此开发寻找新的能够合成埃博霉素的微生物菌株具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了能够合成埃博霉素的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So2163，还提供了利用该菌株发酵生产埃博霉素的方法。
本发明的纤维堆囊菌株(Sorangium cellulosum)So2163，该菌株已于2012年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC NO. M 2012211。
上述菌株的16S rDNA序列片段长度为1466bp。
纤维堆囊菌株其培养方法，包括下述的步骤：采用CNST培养基于30℃培养5天，待菌落扩展充分并形成子实体结构后，转入EMP发酵培养基，培养温度为30℃，转速200rpm，培养时间7-8天。
纤维堆囊菌株的培养方法中，向发酵该菌株所用的EPM培养基中添加了大孔类吸附树脂，优选为1%的XAD-16大孔吸附树脂。
培养完成后用色谱纯甲醇浸提树脂吸附产物。
本发明还要保护的是，纤维堆囊菌株在生产抗肿瘤药物埃博霉素、在埃博霉素类化合物及以埃博霉素为母核的结构衍生物、埃博霉素A、埃博霉素B生产中的应用。
本发明的有益效果在于，本发明的纤维堆囊菌株So2163，是一株分离自土壤样品的天然埃博霉素产生菌，可以在液体发酵条件下合成埃博霉素，因此具备开发成药用原料生产菌种的潜力，可以带来巨大的经济效益和市场价值。
附图说明
图1 实施例2中菌株的细胞图片；
图2 实施例2中菌株菌落形态照片；
图3 实施例4中菌株发酵粗提物的HPLC检测谱图；
图4 实施例4中菌株合成的埃博霉素A的LC-MS检测谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
菌株纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So2163，该菌株已于2012年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2012211。
实施例中所用原料均从市场购得，实施例中未注明具体条件的实验方法，均参照常规条件如Sambrook等人所著的《分子克隆实验室手册》（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989），实施例中所用核磁共振仪为Bruker Avance600型核磁共振波谱仪。
实施例1
菌株So2163的分离方法
将土壤样品磨碎后均匀洒在CNST培养基上，30℃培养7-10天后观察，待初步长出菌落后挑取接种于新的CNST培养基进行纯化保存。
CNST培养基配方(/L)：KNO3 0.5g/L； Na2HPO4 0.25g/L； MgSO4 1g/L；pH 7.5；固体培养基添加1.2%的琼脂粉，铺放灭菌处理的滤纸片做碳源；102.34 kPa 30min 湿热灭菌后备用。
实施例2
菌株So2163的种属鉴定
（1）形态学方法鉴定
将菌株So2163采用CNST培养基于30℃培养5天，待菌落扩展充分并形成子实体结构后进行镜检，分别观测其菌体细胞、子实体形态和扩展菌膜形态（实验结果见附图1），结果表明，该菌株具备典型的纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）形态学特征。
（2）分子生物学方法鉴定
通过设计16S rDNA细菌通用扩增引物27F（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和1492R（5’-TAC CTT GTT ACG ACT T-3’），以菌株So2163基因组为模板进行PCR扩增，得到了长度为1466bp的16S rDNA片段，通过测序后与GeneBank中序列进行比对，发现与Sorangium cellulosum 16S rDNA序列同源性达到99%以上（序列结果见序列表1）。
根据实施例2的结果，将该微生物鉴定为Sorangium属，命名为So2163。
实施例3
菌株So2163的培养方法及发酵产物前处理过程
合成埃博霉素采用EPM培养基，培养温度为30℃，转速200rpm，培养时间7-8天，发酵结束后收集XAD-16大孔吸附树脂，蒸馏水洗涤2-3次后采用2倍体积色谱纯甲醇浸提2小时，10000rpm离心处理10min后及得到发酵粗提物。
EPM培养基配方(/L)：马铃薯淀粉 2.0 g、葡萄糖 2.0 g、豆饼粉 2.0 g；脱脂牛奶 1.0 g、MgSO4 1.0 g、CaCl2 1.0 g、VB12 0.5 mg、Amberlite XAD-16 大孔吸附树脂 2% (v/v) ，调节pH 7.2，121℃灭菌处理20min。
实施例4
菌株So2163发酵产物中所含埃博霉素的分析和鉴定方法
（1） 薄层层析（TLC）
使用石油醚：丙酮=4:1展开剂体系，对So2163发酵粗提物进行展开，在GF254硅胶板上通过紫外光照射观察明显的暗点，并与埃博霉素标准品进行比对，发现两者有相同的Rf值，初步证明两者为同一物质。
（2）高效液相色谱（HPLC）
选择分析性C-18 ODS色谱柱（4.6×250 mm, Kromasil），色谱条件： 检测波长249nm，流速0.8 mL/min，流动相为甲醇：水=7:3，实验表明发酵产物中含有与埃博霉素标准品保留时间相同的物质（见附图3），（埃博霉素A的保留时间为7.5 min，埃博霉素B的保留时间为8.7 min）根据峰面积可以计算出发酵产物中埃博霉素的含量。
（3）液质联用质谱（LC-MS）
实施例中使用少量经制备液相色谱纯化后的发酵样品进行了液质联用检测。结果表明样品中的主要成分分子量为493.4（+1 H+），与埃博霉素A标准品分子量相同（如附图4），说明两者为同一物质。
（4）核磁共振（NMR）
实施例中使用一定量的经HPLC纯化后的样品进行了核磁共振检测，通过实验表明，发酵样品同埃博霉素B标准品具有相同的响应信号，从分子结构上证明两者为同一物质。
Claims (5)
1.纤维堆囊菌株(Sorangium cellulosum )So2163，该菌株已于2012 年6 月10 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2012211；该菌株的16S rDNA 序列片段长度为1466bp。
2.如权利要求1 所述的纤维堆囊菌株(Sorangium cellulosum )So2163的培养方法，包括下述的步骤：采用CNST 培养基于30℃培养5 天，待菌落扩展充分并形成子实体结构后，转入EMP 发酵培养基，培养温度为30℃，转速200rpm，培养时间7-8 天；
CNST培养基配方(/L) ：KNO3 0.5g/L ； Na2HPO4 0.25g/L ； MgSO4 1g/L ；pH 7.5 ；固体培养基添加1.2% 的琼脂粉，铺放灭菌处理的滤纸片做碳源；102.34 kPa 30min 湿热灭菌后备用；
EPM培养基配方(/L) ：马铃薯淀粉 2.0 g、葡萄糖 2.0 g、豆饼粉 2.0 g ；脱脂牛奶1.0 g、MgSO4 1.0 g、CaCl2 1.0 g、VB12 0.5 mg、Amberlite XAD-16 大孔吸附树脂 2% (v/v)，调节pH 7.2，121℃灭菌处理20min；
发酵该菌株所用的EPM培养基中添加了大孔类吸附树脂；
所述的大孔类吸附树脂为1% 的XAD-16 大孔吸附树脂；
培养完成后用色谱纯甲醇浸提树脂吸附产物。
3.如权利要求1所述的纤维堆囊菌株(Sorangium cellulosum )So2163在生产抗肿瘤药物埃博霉素中的应用。
4.如权利要求1 中所述的纤维堆囊菌株(Sorangium cellulosum )So2163在埃博霉素类化合物及以埃博霉素为母核的结构衍生物生产中的应用。
5.如权利要求1 中所述的纤维堆囊菌株(Sorangium cellulosum)So2163在埃博霉素A、B 生产中的应用。
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