CN101361972B - 以il-6拮抗剂作为有效成分治疗慢性类风湿性关节炎 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及白介素-6拮抗剂在制备用于治疗慢性类风湿性关节炎的药物组合物中的用途。其中的白介素-6拮抗剂是白介素-6的抗体。

Description

以IL-6拮抗剂作为有效成分治疗慢性类风湿性关节炎
本申请是申请日1995年6月7日，申请号95196077.6的同名专利申请的分案申请。
本发明涉及慢性类风湿性关节炎的治疗，或含有白介素-6拮抗剂作为有效成分的滑膜细胞生长抑制剂。
背景技术
慢性类风湿关节炎为一***性的慢性炎性疾病，该疾病主要是由于***包括滑膜组织在关节内异常生长所致(Melnyk et al.，Arthritis Rheum.33：493-500，1990)。在慢性类风湿性关节炎病人的关节可以看到明显的滑膜细胞增殖，如由于滑膜细胞异常生长所致的多层结构形成(血管翳形成)，滑膜细胞浸入软骨及骨组织，滑膜内血管形成，炎症细胞如淋巴细胞及巨噬细胞的浸润。已有报道认为慢性类风湿性关节炎的发病机理与遗传，细菌感染及各种细胞因子和生长因子有关，但其确切的发病机理仍未阐明。
近年来，在慢性类风湿性关节炎病人的滑膜及滑膜液中已检测出若干细胞因子及生长因子，其中包括有白介素-1(IL-1)，白介素-8(IL-8)，肿瘤坏死因子α(TNFα)，转化生长因子β(TGFβ)，成纤维细胞生长因子(FGF)及血小板衍化生长因子(PDGF)、(Nourietal.，Clin.Exp.Immunol.55：295-302，1984；Thornton et al.，Clin.Exp.Immunol 86：79-86，1991；Saxne，et al.，Arthritis Rheum，31：1041-1045，1988；Seitz et al.，J.Clin.Invest.87：463-469，1991；Lafyatisetal.，J.Immunol.143：1142-1148，1989；Melnyketal.，Arthritis Rheum.33：493-500，1990)。
现认为IL-1，TNFα及PDGF为非常强的滑膜细胞生长因子(Thornton et al.，Clin.Exp.Immunol.86：79-86，1991；Lafyatis etal.，J Immunol.143：1142-1148，1989；Gitter et al.，Immunology66：196-200，1989)。另外认为通过IL-1及TNF刺激可导致滑膜细胞白介素-6(IL-6)的生成(Ito el al.，Arthmitis Rheum.35：1197-1201，1992)。
IL-6为一细胞因子，又被称为B细胞刺激因子2或干扰素β2。起初由于IL-6激活B淋巴细胞所以认为其是一种分化因子(Hirano，T.et al.，Nature324，73-76；1986)，以后发现IL-6为一多功能细胞因子，其可以影响多种细胞的功能(Akira，S.et al，Adv，in Immunology 54，1-78，1993)。IL-6活性的发挥需要有两种功能不同的细胞膜分子。其中之一为IL-6受体(IL-6R)，分了子量约为80KD，其可特异性地与IL-6结合。
IL-6R主要是以与细胞膜结合的形式存在，其在细胞膜上表达并且渗透到细胞膜，但也能以溶解的IL-6R形式存在(SIL-6R)，其主要是由细胞外的部分组成。另一个蛋白质是gp 130，分子量约为130KD，该蛋白质不与配体结合，其功能主要是介导信号传导。IL-6与IL-6R形成复合物IL-6/IL-6R，该复合物再与另一个膜蛋白gp 130结合从而引发IL-6对细胞的生物学活性(Tega et al.，J.Exp.Med.196：967，1987)。
已有报道发现慢性类风湿性关节炎病人的血清及滑膜液中含有过量的白介素-6(IL-6)及可溶性的IL-6受体(SIL-6R)(Houssiau et al.，Arthritis Rheum.31：784-788，1988；Hirano et al.，Eur.J.Immunol，18：1797-1801，1988；Yoshioka et al.，Japn.J.Rheumatol.inpress)，而且在类风湿性关节炎动物模型的实验中也得到类似结果(Takai et al.，Arthritis Rheum.32：594-600，1989；Leisten et al.，Clin.Immunol.Immunopathol.56：108-115，1990)，这些结果表明IL-6与慢性类风湿性关节炎有关。
然而，日本未审查的专利公开号为4-89433披露了可强烈促进IL-6生成的肽类可以有效的治疗类风湿性关节炎。
Higaki等则认为IL-6可减慢慢性类风湿性关节炎病人滑膜细胞的生长，所以IL-6有抑制滑膜细胞生长的功能(Clinical Immunology，22：880-887，1990)。这样，有关IL-6与慢性类风湿性关节炎关系上存在相互矛盾的报道，并且该关系目前还不清楚。
最近，Wendling等人报道对慢性类风湿性关节炎病人服用抗-IL-6抗体可暂时缓解临床及生物学症状，同时血清中IL-6的水平也升高(J.Rheumatol.20：259-262，1993)。
这些报告对于IL-6对慢性类风湿性关节炎滑膜细胞的生长是有促进作用还是有抑制作用，有关这方面没有任何数据，所以现在还不清楚IL-6对慢性类风湿关节炎的病人的滑膜细胞是否有直接作用。
本发明披露
抗炎症的甾体类制剂如皮质类固醇已被用来治疗类风湿性关节炎，但由于持续使用该类药物可引发如皮肤损害及抑制肾上腺皮质功能等所不希望的副作用，所以一直在寻找副作用较小的药物。
本发明的目的是提供一种没有上述缺点的新的治疗慢性类风湿性关节炎的方法。更进一步地讲本发明提供了一种药物组合物，该组合物可以抑制慢性类风湿性关节炎滑膜细胞的异常增殖，其有效成分为白介素-6的拮抗剂。
本发明者就IL-6对于类风湿性关节炎滑膜细胞的作用进行了细致的研究，研究中发现IL-6本身对慢性类风湿性关节炎滑膜细胞的生长并无促进作用，而对IL-6以外的另一个因子的研究表明虽然IL-6本身对滑膜细胞生长无促进作用，但在IL-6与可溶性的IL-6R同时存在时可见到其强烈的促进滑膜细胞增殖作用，而且该滑膜细胞的增殖作用可被加入抑制IL-6活性的拮抗剂如IL-6抗体或IL-6R抗体所抑制。本发明正是基于上述的发现而完成的。
换句话讲，本发明涉及一种治疗慢性类风湿性关节炎的药物组合物，该组合物包括以一种IL-6拮抗剂作为有效成分。更具体地讲本发明涉及治疗慢性类风湿性关节炎的药物组合物，该组合物的有效成分为IL-6拮抗剂并可抑制滑膜细胞的异常增殖。本发明还涉及其有效成分为IL-6拮抗剂的滑膜细胞生长抑制剂。
附图的简要说明
图1所示的为在IL-6或SIL-6R单独及IL-6与SIL-6R同时存在的条件下滑膜细胞摄入胸腺嘧啶3H的情况。
图2所示为在IL-1β和SIL-6R同时存在的条件下IL-6抗体或IL-6R抗体对滑膜细胞摄入胸腺嘧啶3H的影响。
图3所示为在IL-6及IL-6R同时存在的情况下IL-6抗体或IL-6R抗体对滑膜细胞摄入胸腺嘧啶3H的影响。
图4所示为IL-6R抗体对小鼠胶原所致关节炎模型发生的抑制作用。
图5所示为关节炎小鼠血清中抗胶原抗体的水平。
图6所示为一胶原所致关节炎小鼠后爪关节的组织病理学检查的照片。(a)为服用IL-6受体抗体组小鼠的照片，(b)为服用对照抗体组小鼠的照片。在服用IL-6受体抗体组中，肉芽组织对软骨及骨的浸润(慢性增殖性滑膜炎)受到明显的抑制。
本发明的详细说明
根据本发明，治疗慢性类风湿性关节炎的药物组合物是当将治疗慢性类风湿性关节炎的药物组合物给病人服用后，可抑制关节内滑膜细胞的生长，并且对症状有缓解及治疗作用的药物。
根据本发明，所使用的IL-6拮抗剂可为任何一种物质，只要其能阻断IL-6的信号传导并抑制IL-6的生物学活性。IL-6拮抗剂包括IL-6抗体，IL-6R抗体，gp 130抗体，修饰过的IL-6，反义IL-6R及IL-6或IL-6R的部分肽类。
根据本发明，用作拮抗剂的抗体，如IL-6抗体，IL-6R抗体或gp 130抗体可以是任何一种衍生物或类型(单克隆，多克隆)，但是以由哺乳类动物所制得的单克隆抗体为最佳。这些抗体可与IL-6，IL-6R或gp 130结合从而抑制IL-6与IL-6R或IL-6R与gp 130之间的结合，并阻断IL-6的信号传导，抑制IL-6的生物学活性。
对于产生单克隆抗体细胞的动物种类并无特殊的限制，只要是哺乳类动物，人类抗体或者人类以外其它哺乳类动物所产生的抗体都可以使用。对于除了人类以外的哺乳类动物所产生的单克隆抗体最好是用家兔或鼠来制备，因为上述的单克隆抗体容易制备。对于鼠类没有特殊的限制，但最好是小鼠，大鼠及豚鼠。
IL-6抗体的实例包括有MH 166(Matsuda et al.，Eur.J.Immunol.18：951-956，1988)及SK2抗体(Sato et al.，Journal for the21ST General Meeting of the Japan Immunology Association，21：116，1991)。IL-6R抗体的实例有PM-1抗体(Hirata et al.，J.Immunol.143：2900-2906，1989)，AUK12-20抗体，AUK 64-7抗体及AUK146-15抗体(Intl.Unexamined Patent Application No.WO 92-19759)。gp 130抗体的实例有AM64抗体(Japanese UnexaminedPatent Publication No.3-219894)。
在上述抗体中，以PM-1抗体为最佳。
单克隆抗体可通过已知技术的方法来制备。即按常规免疫方法以IL-6，IL-6R或gp 130作为免疫的致敏抗原，然后将所得的免疫细胞用常规的细胞融合方法与已知的父辈细胞融合，并通过常规的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞用来制备抗体。
更具体地讲，可用下述方法制备单克隆抗体。例如，如果致敏抗原为人IL-6，可使用由Hirano等人Nature 324：73，1986，披露的人类IL-6基因序列来得到抗体。将人类IL-6基因序列***到一个可以公开表达的载体***内，并且用其转化合适的宿主细胞，之后从宿主细胞或培养上清液纯化所需的IL-6蛋白质，然后用纯化的IL-6蛋白质作为致敏抗原。
有关人类IL-6R，也可通过上述的人类IL-6的同样方法得到IL-6R蛋白质，即使用欧洲专利申请号为EP 325474所介绍的基因序列来制备。有两种类型的IL-6R，一种在细胞膜上表达，而另一种为可溶形式(SIL-6R)，其与细胞膜分离。SIL-6R主要是由结合在细胞膜上的IL-6R的细胞外域组成，它与结合在细胞膜上的IL-6R不同在于：其没有跨膜域，或跨膜结构及细胞内域。
有关人类gp 130，可通过上述的制备人类IL-6同样的方法得到gp 130蛋白质，即使用欧洲专利申请号EP 411946所介绍的基团序列来制备。
以致敏抗原免疫的哺乳类动物并无特殊的限制，但是在选择时最好考虑到这些细胞与用来融合的母细胞兼容性，通常使用小鼠，大鼠，豚鼠及家兔。
以致敏抗原免疫动物可采用发表的已知方法来完成。例如，常规的方法包括经腹腔或皮下给哺乳类动物注射致敏抗原。具体地讲，最好用等量的PBS(磷酸缓冲盐溶液)或生理盐水稀释并混悬致敏抗原，并且如需要与一定量的常规佐剂如弗氏完全佐剂一起使用，然后每4-21天给哺乳类动物注射几次。在致敏抗原免疫时也可使用适当的载体。
经上述免疫后，确定血清中所要的抗体升高浓度，然后取出哺乳类动物的免疫细胞，最好为脾细胞做细胞融合。
用于与上述免疫细胞融合的母细胞可以是哺乳类动物的骨髓瘤细胞，可以选用已知的若干种细胞株，包括有P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunology 123：1548，1978)，P3-U1(Current Topics inMicrobiology and Immunology 81：1-7，1978)，NS-1(Eur.J.Immunol.6：511-519，1976)，MPC-11(Cell，8：405-415，1976)，SP2/o(Nature，276：269-270，1978)，Of(J.Immunol：Meth.35：1-21，1980)，S194(J.Exp.Med.148：313-323，1978)，R210(Nature，277：131-133，1979)。可采用已知的方法将免疫细胞与骨髓瘤细胞融合，例如采用Milstein等人的方法(Milstein et al.，Methods Enzymol.73：3-46，1981)。
更具体地讲，上述的细胞融合可采用加有细胞融合促进剂的常规营养培养液来进行。融合促进剂可以是如聚乙二醇(PEG)或Sendai病毒(HVJ)，如需要加强融合作用也可加入如二甲基亚砜以提高融合效率。
免疫细胞与骨髓细胞之间的比例最好是免疫细胞的数量为骨髓瘤细胞的1-10倍。用于细胞融合的培养介质可以是如RPMI 1640培养介质或MEM培养介质，这些培养介质都适合骨髓瘤细胞的生长，也可使用其它常用的培养介质，也可在培养介质中补充血清溶液如小牛血清(FCS)。
细胞融合是以下述的方法来进行的，即在上述的培养介质中加入预先热至37℃的PEG溶液，然后将一定数量的免疫细胞与骨髓瘤细胞充分混匀。如用平均分子量约1000至6000的PEG加入到培养介质中，通常浓度为30到60％(w/v)，然后将细胞混合以形成所需要的融合细胞(杂交瘤)。下一步骤是通过重复地逐渐加入适当的培养介质并离心以去除上清液，通过这一步骤去除细胞融合剂等，这些制剂对杂交瘤的生长不利。
通过一正常的选择培养介质培养杂交瘤以选出适当的杂交瘤细胞，选择培养介质如HAT培养介质(含有次黄嘌呤，氨基喋呤及胸腺嘧啶)。将杂交瘤细胞在HAT培养介质中培养一定的时间，通常为几天到几周，以使杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡。下一步是对培养的细胞进行有限的稀释，使得产生所需抗体的杂交瘤细胞易于进行标记并单克隆。
通过上述方法制备出的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞可以在普通的培养介质内传代培养，也可将其置于液氮内长期保存。
为了得到杂交瘤所产生的单克隆抗体，可以按照常规的方法培养杂交瘤细胞，然后回收培养上清液，或者也可采用另一种方法即将杂交瘤细胞注入一适当哺乳类动物内，让其生长，然后再回收腹水。前者用来得到高纯度的抗体，后者则用来制备大量的抗体。
采用上述方法所得的单克隆抗体然后可以通过常规的纯化方法加以纯化。这些方法包括有如盐折，凝胶过滤，亲和层析等。
通过上述方法制备的单克隆抗体可以采用通常的免疫方法如放射免疫分析(RIA)，酶连免疫分析(EIA，ELISA)，荧光抗体技术(免疫荧光分析)等来检测其高度的敏感性及高纯度的抗原识别能力。
本发明中使用的单克隆抗体并不局限于杂交瘤产生的单克隆抗体，也有经过人工修饰后的单克隆抗体，如为了降低单克隆抗体抗人的异种抗原性，而对单克隆抗体进行人工修饰。例如所使用的嵌合抗体，它的可变区是由除人类以外的哺乳类动物如小鼠的可变区组成，而其恒定区则为人类抗体，这种嵌合抗体可通过一种已知的产生嵌合抗体的方法来制备，具体地讲是采用一种基团重组技术。
依照本发明也可使用重构人类抗体。这些抗体可通过使用小鼠或非人类哺乳类动物的互补决定簇区域替换人类抗体的互补决定簇区域来制备，而所用的技术为已知的常规基因重组方法。依据本发明，可采用已知的一种方法得到有用的重构人类抗体。较好的这种重构人类抗体为hPM-1(见Intl.Unexamined Parent Aplication No.WO 92-19759)。
需要时可改换抗体可变区的结构区域(FR)的氮基酸，这样重构人类抗体互补决定簇区域可形成一个适当的抗体结合位点(Sato et al.，Cancer Res.53：851-856，1993)。另外，为了达到上述目的也可构建用于结合抗原的抗体片段的基因密码，以抑制IL-6的活性，例如抗体的Fab或Fv片段，或者单链Fv(scFv)，其中Fv的L和H链可通过一个适当的连结物连结起来，并使其在适当的宿主细胞内表达(见例如，Bird etal.，TIBTECH，9：132-137，199l；Huston et al.，Proc.Natl.Sci.USA，85：5879-5883，1988)。
依照本发明，可使用已有报道过的修饰IL-6，见Brakenhoff et al.J.Biol.chem.269：86-93，1994或Savino et al.，EMBO J.13：1357-1367，1994。
可通过对IL-6氨基酸序列引入突变，如替换，去除或***氨基酸，使所用的修饰过的IL-6保持有与IL-6R结合的活性而又去除了IL-6信号传递的功能。只要具备上述的特性，可通过任何一种动物种类制备IL-6，但从抗原性方面考虑，最好采用从人类细胞制备出的IL-6。
另外，IL-6氨基酸序列的二级结构可通过已知的分子模型设计方法来预测，如WHATIF(Vriend et al.，J.Mol. Graphics.8：52-56，1990)，这样可以估计突变化的氨基酸序列对整个结构带来的影响。在决定了要进行适当突变的氨基酸后，可使用一含有编码人类IL-6基因的核苷酸序列的载体做为模板，并用常规的PCR方法(多聚酶链反应)对其进行突变，以得到修饰的IL-6基因编码。如需要可将该模板***到一个合适的表达载体内，并在大肠杆菌或哺乳类细胞内表达，然后使用任何一种培养介质的上清，以常规的方法经过分离及纯化后，估价其与IL-6R结合的活性及中和IL-6信号传递的活性。
本发明使用的IL-6防肽或IL-6R部分肽只要可分别与IL-6R或IL-6结合，并无IL-6信号传导活性，就可以为任何序列。在U.S.Patent PubicationNo.US5210075中记载了IL-6部分肽及IL-6R部分肽。在Japanese Patent Publication No.5-300338中记载了IL-6反义寡核苷酸。
由于IL-6与慢性类风湿性关节炎有关，所以如果药物组合物能阻断IL-6所致的IL-6信号传导并抑制滑膜细胞的异常生长，依照本发明，其有效成分为IL-6拮抗剂的该药物组合物可治疗慢性类风湿性关节炎。例1证实了在体外对类风湿性关节炎病人滑膜细胞生长的抑制作用。在例2中，给用二型胶原免疫的小鼠关节炎模型服用IL-6受体抗体，有关结果表明(1)以一关节炎的指标为基础来判定对关节炎的发生有抑制作用(图4)，(2)抑制了在胶原免疫的小鼠血液中抗二型胶原抗体的产生(图5)，(3)检查服用IL-6R抗体的小鼠关节炎模型的后爪关节，表明对肉芽组织对软骨及骨的浸润有抑制作用(慢性增殖性滑膜炎)(图6)。
在上述的(1)和(2)中，结果证实IL-6受体抗体对关节炎有抑制作用，尤其在小鼠关节炎发病的起始阶段，该抑制作用更明显。(3)的结果证明对肉芽组织对软骨及骨的浸润有抑制作用，由例1中所得的结果也支持这一点(体外对滑膜细胞生长的抑制)。
(1)及(2)的实验结果表明本发明治疗慢性类风湿性关节炎的药物组合物对类风湿性关节炎有很好的初始阶段治疗效果。
本发明用于治疗慢性类风湿性关节炎的药物组合物最好经非胃肠途径给药，例如经静脉，肌肉，腹腔或皮下注射给药，可全身也可局部给药。该组合物也可以医用制剂试剂盒的形式与至少一种医用载体或稀释剂一起给药。
本发明用于治疗慢性类风湿性关节炎的药物组合物在给人服用时，其剂量可依据病理情况，病人的年龄及给药方式有所不同，并依照上述的情况选择不同的剂量。例如在1到1000mg/病人这样一个范围内，有4个不同的最大剂量可以选择。当然，用于治疗类风湿性关节炎的本发明药物组合物并不局限于这些药物剂量。
本发明用于治疗类风湿性关节炎的药物组合物可按照常规的方法配制而成。例如，注射制剂可通过溶剂如生理盐水或一种缓冲盐溶液溶解提纯的IL-6拮抗剂，然后再加入吸附抑制剂如吐温80，凝胶或人血清白蛋白(HSA)等配制而成，该混合物在溶液重组使用前可以冻干保存。用于冻干保存的赋形剂可以为一种糖醇，如甘露糖醇，葡葡糖或者庶糖。
实例
本发明将通过下面的实例，文献实例及实验实例做进一步更详细的说明，但应知道本发明并不局限于这些实例。
参考实例1.人类可溶性IL-6受体的制备
可溶性IL-6R可通过PCR(多聚酶链反应)的方法使用含有碥码人IL-6受体CDNA的质粒pBSF2R，236制备而成(Yasukawa et al.，J.Biochem.108：673-676，1990)，该质粒可依据Yamasali等人提供的方法来得到(Science，241：825-828，1988)。
上述的质粒BSF2R.236可以使用限制性内切酶SphI来消化以得到IL-6R的CDNA片段，然后将该片段***到mp18中(AmershamCo.，)。通过采用一体外致突变***(Amersham Co.，)以PCR方法以一设计好的合成的寡核苷酸ATATTCTCTAGAGAGATTCT对IL-6R cDNA引入一个终止密码，从而导致IL-6R cDNA突变。上述实验步骤其结果是在氨基酸345的位置上引入一个终止密码，这样就可以得到可溶性IL-6R(SIL-6R)的cDNA编码。
为了使SIL-6R cDNA在CHO细胞中表达，将上述经HindIII-SaII内切酶切下的SIL-6R cDNA***到质粒pECEdhfr中去(Clauser et al.，Cell，45：721-735，1986)，该质粒中有一编码二氢叶酸还原酶(dhfr)的cDNA，该dhfr***在限制性内切酶PvaI的酶切位点上，这样即得到了CHO细胞的表达质粒pECEdhfr344。
通过使用磷酸钙沉淀的方法(Chen et al.，Mol.Cell，Biol，7：2745-2751，1987)，使用10μg的质粒pECEdhfr 344转染dhfr-CHO细胞系DXB-11(Urland et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，4216-4220，1980)。
将转染的CHO细胞在含有1mM谷氨酸，10％透射过的小牛血清(FCS)，100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的不含核苷酸的αMEM选择培养介质中培养3周。通过限制稀释的方法筛选已转染的CHO细胞，并得到一个单克隆的CHO细胞株。将CHO细胞克隆在浓度为20nM至200nM氨甲喋呤溶液中扩增，以得到产生人类SIL-6R的CHO细胞系5E27。
使用含5％FCS的Iscove改进的Dulbecco培养介质(IMDM，Gibco Co.的产品)，培养CHO细胞系5E27，回收培养液上清，并按照通常的ELISA方法(酶连免疫吸附分析法)测定培养液上清中的SIL-6R浓度。
参考实例2.人类IL-6抗体的制备
可以按照Matsuda等人的方法来制备人类IL-6抗体(Eur.J.Immunol. 18：951-956，1988)。
以10μg重组的IL-6(Hisano et al.，Immunol.Lett，17：41，1988)与弗氏完全佐剂一起免疫BALB/C小鼠，每周进行一次直到血清中可以检测到抗IL-6抗体。
取出局部***的淋巴细胞，使用聚乙二醇使之与骨髓瘤细胞系P3U1融合。按照D：等人的方法(Selective Methods in CellularImmunology，W.H.Freeman and Co.，San Francisco，351，1980)使用HAT培养液选出杂交瘤，通过上述步骤建立起一个产生人类IL-6抗体的杂交瘤细胞系。产生人类IL-6抗体的杂交瘤可通过下面的方法进行IL-6结合情况的分析。
具体地讲，在4℃的温度下，在0.1M的碳酸氢盐缓冲溶液(pH9.6)100μl中用山羊抗小鼠Ig抗体(10μg/ml，Cooper Biomedical，Inc.的产品，Malvern，PA)涂覆一柔软的聚乙烯96孔微板(DynatechLaboratorles，Inc.的产品，Alexandria，VA)并且过夜。然后在室温下用1μl含有1％牛血清白蛋白的PBS处理该板2小时。经过PBS冲洗后，向每个孔中加入10μl的杂交瘤培养上清液，并在4℃的温度下过夜孵育。
冲洗该板并向每个小孔内加入125I标记的重组IL-6直至2000cpm/0.5ng/孔，再经冲洗后以伽马计数器(Beckman Gamma 9000，BeckmanInstruments，Fullerton，CA)测定每个孔的放射活性。在216个杂交瘤克隆中，有32个杂交瘤克隆经过IL-6结合分析测定为阳性。从这些克隆中最后得到稳定的克隆MH166.BSF2。由该杂交瘤产生的IL-6抗体MH166为IgG1K亚型。
然后采用依赖IL-6生长的小鼠杂交瘤细胞系MH60.BSF2(Matsudaet al.，Eur.J.Immunol.18：951-956，1988)，通过对该杂交瘤生长的影响来测定MH 166抗体的中和活性。将数量为1×104/200μl/孔的MH60.BSF2细胞悬浮，然再向孔内加入含MH 166抗体的样品，培养48小时后再加入15.1Ci/mmol的3H胸腺嘧啶(New England Nuclear，Boson，MA)，之后再继续培养6小时。
将细胞置玻璃滤纸上并用自动收集器处理(Labo Mash ScienceCo.，Tokyo，Japan)。使用家兔的抗IL-6抗体做为对照。结果显示，MH 166抗体对MH60.BSF2细胞摄取3H胸腺嘧啶的抑制呈剂量-依赖方式。这证明MH 166抗体有中和IL-6的活性。
参考实例3.人类IL-6受体抗体的制备
按照其说明，通过Hirata等人方法(J.Immunol.，143：2900-2906，1989)构建的抗IL-6R抗体与用CNBr激活的Sepharose 4B结合(Pharmacia Fine Chemicals的产品，Piscataway，NJ)，结合的复合物用来纯化IL-6R。(Yamasakiet al.，Science，241：825-828，1988)。
以含有1％毛地黄皂苷(Wako Chemicals的产品)，10mM三乙醇胺(pH 7.8)及0.15M NaCl的1mM p-对氨基苯基甲烷磺酰氟盐酸盐(Wako Chemicals的产品)(毛地黄皂苷缓冲液)溶解人类骨髓瘤细胞系U266，并与结合在Sepharose 4B株上的MT18抗体混合。用毛地黄皂苷缓冲液冲洗珠子6次，这样即得到用来免疫的部分纯化的IL-6R。
以从3×109U266细胞得到的部分纯化的IL-6R免疫BALB/C小鼠，每10天4次，然后采用常规的方法制备杂交瘤，使用下面的方法测定阳性生长孔内杂交瘤培养液上清对IL-6结合的活性。在用35S蛋氨酸(2.5mCi)标记5×107U 266细胞后，以上述的毛地黄皂苷缓冲液溶解这些细胞。将溶解的U266细胞与结合在琼脂糖凝胶4B珠上的0.04ml MT18抗体混合，之后用毛地黄皂苷缓冲液冲洗6次，用0.25ml的毛地黄皂苷缓冲液(pH 3.4)冲掉35S蛋氨酸标记的IL-6R，并用0.025ml的1MTris(pH 7.4)中和。
将0，05ml的杂交瘤培养液上清与0.01ml的蛋白G琼脂糖凝胶混合(Pharmacia的产品)。冲洗后，将琼脂糖凝胶与预先制备的35S标记的IL-6R溶液培养。使用SDS-PAGE的方法测定免疫沉淀物，并检测杂交瘤培养上清液与IL-6R的反应情况。通过上述方法，建立了反应阳性的杂交瘤克隆PM-1。由杂交瘤PM-1产生的IL-6R抗体PM-1为Ig1K亚型。
使用人类骨髓瘤细胞系U 266来检测由杂交瘤PM-1生产的抗体对IL-6与人类IL-6R结合的抑制活性。人类重组IL-6是采用大肠杆菌(Hirano et al.，Immunol.Lett.，17：41，1988)和125I标记的Bolton-Hunter试剂(New England Nudeer，Boston，MA)制备而成的(Taga et al.，J.Exp.Med.166：967，1987)。
在过量100倍的非标记的IL-6存在的条件下，将4×105U266的细胞与70％(v/v)的杂交瘤PM-1培养上清及14000cpm的125I标记的IL-6一起在室温下培养1小时。将70μl样本加入装有300μlFCS的400μl微量聚乙烯离心管内，离心后测定细胞的放射活性。
结果证明杂交瘤PM-1产生的抗体可抑制IL-6与IL-6R的结合。
参考实例4.小鼠IL-6受体抗体的制备
在日本专利申请号6-134617中记载了抗小鼠IL-6受体的单克隆抗体的制备方法。
按照Saito等人的方法(J.Immunol.，147：168-173，1993)，产生小鼠可溶性IL-6受体的CHO细胞在含有10％FCS的IMDM培养液中培养，通过采用小鼠可溶性IL-6受体抗体RS12(See ibid.Saito etal.，)及一个固定亲和凝胶10(Biorad)的亲和柱从培养液上清中纯化小鼠可溶性IL-6受体。
将所得的50μg小鼠可溶性IL-6受体与弗氏完全佐剂混合，并经腹腔注入Wistan大鼠(Nihon Charles River Co.)。2周后以弗氏不完全佐剂强化免疫。第45天处死大鼠，取大约2×108个脾细胞按常规的方法使用50％的PEG 1500(Berlinger Mannheim)与1×107个小鼠P3U1骨髓瘤细胞进行融合，之后使用HAT培养液筛选杂交瘤细胞。
在将杂交瘤培养上清加在表面涂有兔抗大鼠IgG抗体(CappelCo.)的免疫板上之后，小鼠可溶性的IL-6受体与之反应，并以ELISA方法使用兔抗小鼠IL-6受体抗体及碱性磷酸酶标记的绵羊抗兔IgG，筛选杂交瘤产生的抗小鼠可溶性IL-6受体的抗体。还要进行两次更进一步的筛选以确定产生抗体的杂交瘤克隆，从而最后得到单一的杂交瘤克隆。该克隆命名为MR16-1。
通过检测MH60.BSF2细胞摄入3H胸腺嘧啶的情况可了解该杂交瘤产生的抗体拮抗小鼠IL-6信号传导的中和活性(Matsuda et al.，J.Immunol，18，951-956，1988)，向96孔板内加入MH 60.BSF2细胞，最后浓度为1×104个细胞/200μl/孔，然后加入小鼠IL-6(10pg/ml)及MR16-1抗体或RS12抗体，浓度为12.3-1000ng/ml，在37℃，CO2浓度为5％的条件下培养44小时，之后加入3H胸腺嘧啶(1μCi/孔)，4小时后测定其摄入情况。结果发现MR16-1抗体可抑制MH60.BSF2细胞摄取3H胸腺嘧啶。
实验1.建立慢性类风湿性关节炎的滑膜细胞系
(1)滑膜细胞的制备
通过对慢性类风湿性关节炎病人的关节手术取得滑膜组织。所得滑膜组织先以剪刀切碎，然后用5mg/ml的I型胶原酶(Sigma ChemicalCo.的产品)及溶于IMDM(Igcove修改过的Dulbecco培养液)的浓度为培养酶消化0.15mg/ml的牛胰腺DNA酶在温度为37℃的条件下1小时进行酶解离，然后通过滤网过滤得到单一的细胞。然后将所得的细胞使用含5％FCS的IMDM在培养瓶内过夜培养。之后通过去除非粘附细胞得到滑膜细胞。将滑膜细胞传代培养3至6次后使用这些细胞进行下面的实验。
(2)由滑膜细胞产生的IL-6
将上述所得的滑膜细胞混悬于含有5％FCS  (HycloneLaboratories Inc.的产品)，10U/ml的青霉素G及100μg/ml的链霉素IMDM培养液内，并以3×103细胞/孔的数量加入到96孔微滴板上(FalconCo.的产品)并培养，另外还向小孔内加入人类白介素-1β(IL-1β)，人类肿瘤坏死因子α(TNFα)，人类血小板衍化生长因子(PDGF)AB及人类碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，浓度分别为0.01或0.1，0.1或1，1或10及1或10ng/ml，在37℃的条件下培养72小时后收集培养液上清。
将100μl抗人IL-6抗体MH 166(1μg/ml)加到96孔ELISA板上(免疫板：Nunc Co.的产品)。在4℃的条件下孵育24小时。随后用含有0.05％吐温20的PBS冲洗每个孔，并用含有1％BSA的PBS在4℃的条件下过夜封闭。用含有1％BSA的PBS稀释前面得到的培养液上清，并将其加到每个孔内，然后在室温下孵育2小时。用含有0.05％吐温20的PBS冲洗后，再加入2.5μg/ml的经100μl蛋白A柱(Pharmacia的产品)纯化过的兔多克隆抗人IL-6抗体。
室温下孵育2小时，在培养液上清中与IL-6结合的兔多克隆抗IL-6抗体与碱性磷酸酶结合的抗兔IgG抗体反应(Tago Co.的产品)。然后按照附带的说明加入1mg/ml Sigma 104碱性磷酸酶底物(Sigma Co.的产品)并在405～600nm的范围内用MPR A4微板读数器(Tosoh Co.的产品)测量吸光度。
每次测试都制做重组IL-6的标准曲线，以将吸光度OD值转化成人IL-6的浓度。其结果见表1。
表1
滑膜细胞产生的IL-6增高
  处理(ng/ml)   IL-6(ng/ml)
  未处理   0.096±0.012
  IL-1β   0.010.1   6.743±0.17817.707±0.259
  TNFα    0.11   0.575±0.0081.688±0.034
  PDGF-AB  110   0.163±0.0350.165±0.016
  bFGF     110   0.181±0.0090.230±0.019
注：用IL-1β，TNFα，PDGF-AB或bFGF将滑膜细胞培养3天。培养之后，采用ELISA方法测定上清的IL-6浓度。
结果证明IL-1β可强烈的增加滑膜细胞产生IL-6。
实施例1
(1)实验1中所得的滑膜细胞(3×103/孔)混悬于含5％FCS(Hyclone Laboratories，Inc.的产品)，10U/ml青霉素G和100μg/ml链霉素的IMDM培养液中，然后将其加入96孔微滴板的孔内(#3072，Falcon Co.的产品)，在各种浓度的IL-6或SIL-6单独存在的情况下，或IL-6与SIL-6R同时存在的情况下培养5天。培养72小时时，向每个孔内加入浓度为1μCi/孔3H胸腺嘧啶(Amersham International plc的产品)，培养结束后，以闪烁计数仪测定细胞的放射活性。结果见图1所示。
其结果单独与IL-6或SIL-6R培养的细胞对3H胸腺嘧啶的摄取很少，并且没有观察到滑膜细胞的生长。相反在至少浓度为10ng/ml的IL-6及100ng/ml的SIL-R存在的情况下，与对照组比较可观察到有明显的3H胸腺嘧啶摄取。这样，实际上在IL-6单独存在情况下没有刺激滑膜细胞生长的作用，而在IL-6与S IL-6R同时存在的情况下可见到其对滑膜细胞强烈的刺激生长作用。
(2)在产生IL-6(0.1mg/ml)，100ng/ml S IL-6R及25μg/mlIL-6抗体或25μg/ml IL-6R抗体的足量IL-β存在条件下培养滑膜细胞(3×103/孔)。培养72小时后向每个孔内加入浓度为1μCi/孔的3H胸腺嘧啶，培养结束后，采用闪烁计数仪测定细胞的放射活性。结果见图2。加入IL-6抗体或IL-6R抗体可完全抑制由S IL-6R所引起的滑膜细胞生长。
(3)在100ng/ml IL-6(Genzyme Co.产品)，100ng/mlS IL-6R及25μg/ml IL-6抗体或IL-6R抗体(皆由上述参考实例得到)存在的条件下培养滑膜细胞(3×103/孔)。培养72小时后，将浓度为1μCi/孔3H胸腺嘧啶加到每个孔内，培养结束后，用闪烁计数仪测量细胞的放射活性。其结果可见图3。加入IL-6抗体或IL-6R抗体可完全抑制由S IL-6R所致的滑膜细胞生长。
实施例2
用小鼠关节炎模型来研究IL-6受体抗体对关节炎发生的抑制作用。
通过将溶解于0.1N，乙酸水溶液的牛II型胶原溶液(CollagenTechnology Group)(4mg/ml)和完全佐剂H37Ra(DIFCO)等量混合来制备佐剂。给8至9周龄的雌性DBA/1J小鼠(Charles River Japan)尾的根部皮下注射100μl的佐剂。20天后在小鼠背部皮下再注射100μl的佐剂以引发关节炎。
在第1次胶原致敏后按每只小鼠2mg的剂量静脉注射小鼠IL-6受体抗体MR16-1，此后的7周里每周再给小鼠皮下注射0.5mg(n＝5)的抗体。对于对照组使用同型的抗DNP抗体KH-5(Chugai Seiyaku)(n＝5).
以关节炎指数来评价关节炎的严重程度。以每个肢体4分，每个个体共16分来进行评估。评估的标准如下。
0.5：在关节的一侧可见红斑。
1：在关节两侧观察到红斑或充血但大肿胀***。
2：观察到中等程序肿胀***。
3.足背部有严重的肿胀***，但未及整个足趾。
4：足背及足趾严重的肿胀***。
其结果见图4。
与对照抗体给药组比较，IL-6受体抗体给药组可观察到其对早期阶段关节炎的发生有明显的抑制作用。
另一方面与对照抗体给药组比较，在IL-6受体抗体给药组通过测定早期阶段关节炎小鼠血中的抗II型胶原抗体的滴度发现其抗体显著减少(图5)。
在以胶原免疫后第35天处死小鼠，其后腿以20％的***固定。然后标本以EDTA溶液(pH 7.6)脱矿质并用酒精脱水。随后用石蜡包埋标本并切成2μm厚的切片。用苏木精及伊红对切片进行染色并放大125倍在镜下观察(图6)。其结果，与对照抗体给药组比较，在IL-6受体抗体给药组其对肉芽组织对软骨及骨的浸润，即慢性增殖性滑膜炎有抑制作用。
IL-6为一细胞因子，它可使B细胞分化成产生抗体的细胞。在IL-6受体存在的情况下，IL-6也可促进滑膜细胞的增殖。在小鼠胶原性关节炎模型的实验中，与对照抗体给药组比较，在胶原致敏后的第21天及35天由于抗IL-6受体抗体可显著地抑制抗II型胶原抗体的滴度，所以认为抗IL-6受体抗体对抗体产生的抑制也是其对关节炎有抑制作用的一个原因。另外，在胶原致敏后的第49天，虽然此时未见到对抗体产生的抑制作用，但在这期间仍可观察到其对关节炎发生有一定的抑制作用，对跗骨周围组织进行HE染色可观察到：与对照组比较，在抗IL-6受体抗体给药组其对肉芽组织对软骨及骨的浸润有抑制作用，基于上述事实说明抑制滑膜细胞生长也是其抑制关节炎作用的一个原因。
工业方面的应用性
来自慢性类风湿性关节炎病人的滑膜细胞在IL-6及S IL-6R同时存在的情况下可以促进其增长。基于慢性类风湿性关节炎病人滑膜液体中含有大量的IL-6及S IL-6R引起滑膜细胞增殖这样一个事实，现认为IL-6引发的信号传导与慢性类风湿性关节炎滑膜细胞的异常增殖有关。
依照本发明，现已证实有效成分为IL-6拮抗剂的药物组合物可治疗慢性类风湿性关节炎，其可在IL-6及S IL-6R存在的情况下抑制慢性类风湿性关节炎病人滑膜细胞的生长，所以对慢性类风湿性关节炎有治疗作用。总之，本发明所述的IL-6拮抗剂对有滑膜细胞异常增殖的慢性类风湿性关节炎是一种有益的治疗制剂。

Claims (4)

1.白介素-6受体的抗体作为有效成分在制备用于治疗慢性类风湿性关节炎的药物组合物中的用途。
2.权利要求1的用途，其特征在于所述白介素-6受体的抗体是人白介素-6受体的抗体。
3.权利要求2的用途，其特征在于所述人白介素-6受体的抗体是PM-1抗体。
4.权利要求3的用途，其特征在于所述PM-1抗体是人源化PM-1抗体。
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