HU223602B1

HU223602B1 - Krónikus reumatoid artritisz kezelésére szolgáló, IL-6 receptor elleni antitestet tartalmazó gyógyszerkészítmény

Info

Publication number: HU223602B1
Application number: HU9701906A
Authority: HU
Inventors: Masahiko Mihara; Tadamitsu Kishimoto; Yoichiro Moriya; Yoshiyuki Ohsugi
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha; Tadamitsu Kishimoto
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 2004-10-28
Also published as: HUT77036A; WO1996011020A1; LU92048I2; AU700819B2; CZ296919B6; HK1127497A1; CA2201781C; NO2009009I2; NO971546D0; FI971404A0; EP0783893A1; EP0783893A4; PL319574A1; JP3067987B2; EP2077120A2; NO321089B1; EP2107070A1; KR100306517B1; RU2147443C1; ES2384222T3

Abstract

A találmány a szinoviális sejtek növekedésének gátlószerére, valaminta krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmas, a szinoviálissejtek növekedésének gátlószerét tartalmazó gyógyszerkészítményekrevonatkozik. A krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmasgyógyszerkészítmény, illetve a szinoviális sejtek növekedésénekgátlószere hatóanyagként IL–6 receptor elleni antitestet tartalmaz. ŕ

Description

A találmány a krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményekre, illetve a szinoviális sejtek növekedését gátló készítményekre vonatkozik, melyek hatóanyagként interleukin-6 receptor elleni antitestet tartalmaznak.

A krónikus reumatoid artritisz olyan idült gyulladásos megbetegedés, melynek során a kötőszövet, így például a szinoviális szövet abnormális növekedése fordul elő az ízületekben [Melnyk et al., Arthritis Rheum., 33, 493-500 (1990)]. A krónikus reumatoid artritiszben szenvedő betegek ízületeiben megfigyelhető a szinoviális sejtek markáns növekedése, a szinoviális sejtek abnormális növekedése következtében többrétegű képletek kialakulása (pannuszképződés), a szinoviális sejtek behatolása a porcszövetbe és a csontszövetbe, a szinoviális szövet vaszkularizációja, valamint a fehérvérsejtek - limfociták és makrofágok - beszűrődése. A krónikus reumatoid artritisz kialakulásának mechanizmusát olyan tényezőkre vezetik vissza, mint az öröklődés, a bakteriális fertőzés, illetve a különböző citokinek és növekedési faktorok hatása, de a kialakulás teljes mechanizmusa mindmáig tisztázatlan.

Az utóbbi időben citokineket és növekedési faktorokat - interleukin-1 (IL— 1), interleukin-8 (IL—8), tumor-nekrózisfaktor a (TNFa), transzformációs növekedési faktor β (TGFP), fibroblasztnövekedési faktor (FGF) és vérlemezke-eredetű növekedési faktor (PDGF) - mutattak ki a krónikus reumatoid artritiszben szenvedő betegek szinoviális membránjában és szinoviális folyadékában [Nouri et al., Clin. Exp. Immunoi., 55, 295-302 (1984); Thomton et al., Clin. Exp. Immunoi., 86, 79-86 (1991); Saxne et al., Arthritis Rheum., 31, 1041-1045 (1988); Seitz et al., J. Clin. Invest., 87, 463-469 (1991); Lafyatis et al., J. Immunoi., 143, 1142-1148 (1989); Melnyk et al., Arthritis Rheum., 33, 493-500 (1990)].

Úgy tartják, hogy az IL-1, a TNFa és a PDGF különösen erőteljes szinoviálissejt-növekedési faktorok [Thomton et al., Clin. Exp. Immunoi., 86, 79-86 (1991); Lafyatis et al., J. Immunoi., 143, 1142-1148 (1989); Gitter et al., Immunology, 66, 196-200 (1989)]. Valószínűsítik, hogy IL-1- és TNF-stimuláció hatására a szinoviális sejtek interleukin-6 (IL—6) termelésébe kezdenek [Ito et al., Arthritis Rheum., 35, 1197-1201 (1992)].

Az IL-6 citokin ismeretes B-sejt-stimuláló faktor 2 vagy interferon β2 néven is. Az IL-6 molekulát a B limfoid sejtek aktiválódásában részt vevő differenciálódási faktorként fedezték fel [Hirano T. et al., Natúré, 324, 73-76 (1986)], majd később bebizonyosodott, hogy olyan multifunkcionális citokin, amely egy sor különféle sejttípus működését befolyásolja [Akira

S. et al., Adv. in Immunology, 54, 1-78 (1993)]. Két, funkcionálisan különböző molekula szükséges az IL-6-aktivitás előidézéséhez. Ezek egyike az IL-6 receptor (IL-6R), egy kb. 80 kD tömegű fehérje, amely specifikusan kötődik az IL-6 molekulához.

Az IL-6R membránhoz kapcsolódó alakban fordulhat elő, mely a sejtmembránon expresszálódik, majd behatol a sejtmembránba, valamint vízoldható alakban (sIL-6R), mely főleg az extracelluláris domént tartalmazza. A másik fehérje a kb. 130 kD tömegű gpl30, mely nem a ligandumhoz kötődik, hanem a jelátvitelben tölt be mediátor szerepet. Az IL-6 és az IL-6R hozza létre az IL-6/IL-6R komplexet, amely a gpl30 membránfehérjével kapcsolódva előidézi a sejt IL-6 biológiai aktivitását [Taga et al., J. Exp. Med., 196, 967 (1987)].

Ismeretes, hogy a krónikus reumatoid artritiszben szenvedő betegek széruma, illetve szinoviális folyadéka kórosan nagy mennyiségben tartalmaz interleukin-6 (IL-6) és vízoldható IL-6 receptor (sIL-6R) molekulát [Houssiau et al., Arthritis Rheum., 31, 784-788 (1988); Hirano et al., Eur. J. Immunoi., 18, 1797-1801 (1988); Yoshioka et al., Japan J. Rheumatol. in press], és mivel hasonló eredményeket kaptak reumatoid artritisz állatmodell-kísérletekben is [Takar et al., Arthritis Rheum., 32, 594-600 (1989); Leisten et al., Clin. Immunoi. Immunopathol., 56, 108-115 (1990)], valószínűsítik, hogy az IL-6 valamiképpen szerepet játszik a krónikus reumatoid artritiszben.

Mindazonáltal a 4-89433 számú japán szabadalmi közzétételi irat szerint bizonyos, az IL-6 termelését erőteljesen serkentő fehérjékkel hatásosan kezelhető a krónikus reumatoid artritisz. Ezzel összhangban Higaki és munkatársai azt állítják, hogy a krónikus reumatoid artritiszben szenvedő betegek szinoviális sejtjei IL-6 hatására csak lassan növekednek, következésképp az IL-6 a szinoviális sejtek növekedésének gátlószere [Clinical Immunology, 22, 880-887 (1990)]. Egymásnak ellentmondó közlemények léteznek tehát az IL-6 és a krónikus reumatoid artritisz kapcsolatát illetően, azaz a kép még mindig nem világos.

Újabban Wedling és munkatársai azt közölték, hogy krónikus reumatoid artritiszben szenvedő betegeket anti-IL-6 antitestekkel kezelve a klinikai és biológiai tünetek átmenetileg enyhíthetők, miközben a szérum IL-6-szintje emelkedik [J. Rheumatol., 20, 259-262 (1993)].

Ezekben a közleményekben egyáltalán nincs adat arra vonatkozóan, hogy az IL-6 gyorsítja-e a krónikus reumatoid artritiszes szinoviális sejtek növekedését, avagy gátlóhatást mutat. Ezek alapján továbbra sem ismeretes, hogy az IL-6 rendelkezik-e közvetlen hatással a krónikus reumatoid artritiszben szenvedő betegek szinoviális sejtjeire.

A gyulladásgátló hatású szteroidok, így a kortikoszteroidok alkalmazásban vannak ugyan a reumatoid artritisz kezelésére, de folyamatos használatuk nemkívánatos mellékhatásokkal - bőrszövet károsodása, mellékvese működési zavarai - jár, így állandóan keresik a kevesebb mellékhatást kiváltó hatóanyagokat.

Fentiek alapján a találmány célja olyan új, krónikus reumatoid artritisz terápia biztosítása, amely nélkülözi az említett hátrányokat. A találmány közelebbről egyrészt a krónikus reumatoid artritiszben tapasztalható kóros szinoviális sejtnövekedés gátlására szolgáló, hatóanyagként interleukin-6-antagonistát tartalmazó gyógyszerkészítményt, másrészt pedig ugyanilyen hatással rendelkező, a krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt biztosít.

HU 223 602 Bl

Kutatást végeztünk az IL-6 reumatoid artritiszes szinoviális sejtekre gyakorolt hatására vonatkozóan, melynek során azt tapasztaltuk, hogy az IL-6 önmagában nem segíti elő a krónikus reumatoid artritiszes szinoviális sejtek növekedését. Emiatt a vizsgálatokat kiterjesztettük más faktorokra is, és így jutottunk a találmány alapját képező felismeréshez: míg az IL-6 önmagában nincs hatással a szinoviális sejtek növekedésére, addig IL-6 és vízoldható IL-6R együttes jelenlétében erőteljes növekedésserkentő hatás tapasztalható, ami viszont elnyomható az IL-6-aktivitást gátló antagonista, például IL-6 antitest vagy IL-6R antitest adagolásával.

Mindezek alapján a találmány a krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmas, hatóanyagként IL-6 receptor elleni antitestet tartalmazó gyógyszerkészítményekre vonatkozik. Közelebbről a találmány olyan, a krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmas, hatóanyagként IL-6 receptor elleni antitestet tartalmazó gyógyszerkészítményekre vonatkozik, melyek elnyomják a szinoviális sejtek kóros növekedését. A találmány vonatkozik továbbá a szinoviális sejtnövekedés gátlószerére is, mely hatóanyagként IL-6 receptor elleni antitestet tartalmaz.

A mellékelt 1. ábra a szinoviális sejtek ³H-timidinfelvételét mutatja IL-6, sIL-6R, valamint IL-6 és sIL-6R együttes jelenlétében.

A 2. ábra az IL-6 antitest, illetve az IL-6R antitest hatását mutatja a szinoviális sejtek ³H-timidin-felvételére IL— lb és sIL-6R együttes jelenlétében.

A 3. ábra az IL-6 antitest, illetve az IL-6R antitest hatását mutatja a szinoviális sejtek ³H-timidin-felvételére IL-6 és sIL-6R együttes jelenlétében.

A 4. ábra az IL-6R antitest hatását mutatja a kollagénnel indukált artritisz kialakulására egérmodellben.

Az 5. ábra a szérum antikollagén antitestszintjét mutatja artritiszes egérben.

A 6. ábra a kollagén-artritiszes egér hátsó lábízületének hisztopatológiai vizsgálata során készült fényképek: (a) IL-6 receptor antitesttel kezelt csoportból származó egér, és (b) a kontrollantitesttel kezelt csoportból származó egér. Az IL-6 receptor antitesttel kezelt csoportban a porc- és csontszövet granulációs inváziója (krónikus proliferatív szinovitisz) egyértelműen gátolt.

A találmány szerinti, krónikus reumatoid artritisz kezelésére szolgáló készítmény olyan gyógyszer, mely a krónikus reumatoid artritiszben szenvedő betegeknek beadva elnyomja az ízületekben a szinoviális sejtek kóros növekedését, és csillapítja, valamint gyógyítja a tüneteket.

A találmány értelmében alkalmazott IL-6-antagonista bármely forrásból származhat, feltéve, hogy olyan anyag, amely blokkolja az IL-6-jelátvitelt, és gátolja az IL-6 biológiai aktivitást. Ilyen IL-6-antagonista például az IL-6 antitest, az IL-6R antitest, a gpl30 antitest, a módosított IL-6, az antiszensz IL-6R, valamint az IL-6 és az IL-6R parciális peptidjei.

A találmány értelmében antagonistaként használt antitest, például IL-6 antitest, IL-6R antitest vagy gpl30 antitest bármely származék vagy típus lehet (monoklonális, poliklonális, de különösen előnyös az emlősökből származó monoklonális antitestek alkalmazása. Ezek az antitestek kötődnek az IL-6, IL-6R, illetve gpl30 molekulákhoz, megakadályozva így az IL-6 és az IL-6R, illetve az IL-6R és a gpl30 kapcsolódását, és ezáltal blokkolják az IL—6-jelátviteIt, gátolva az IL-6 biológiai aktivitást.

A monoklonális antitestek előállítására szolgáló sejtek nincsenek állatfajra korlátozva, feltéve, hogy emlősökről van szó. Humán antitestek és nem humán emlőseredetű antitestek egyaránt alkalmazhatók. Az emlős- vagy nem humán monoklonális antitestek előnyösen nyúl- vagy rágcsálóeredetű monoklonális antitestek, mivel ezeket egyszerűbb előállítani. A rágcsálókat illetően nincs különösebb korlátozás, de előnyösen egér, patkány vagy hörcsög alkalmazható.

Ilyen IL-6 antitestek például az MH166 [Matsuda et al., Eur. J. Immunoi., 18, 951-956 (1988)] és a SK2 anitest [Sato et al., Journal fór the 21st General Meeting of the Japan Immunology Association, 21, 116 (1991)]. Az IL-6R antitestre példa a PM-1 antitest [Hirata et al., J. Immunoi. 143, 2900-2906 (1989)], az AUK12-20 antitest, AUK64-7 antitest és az AUK14615 antitest (WO92-19759 számú nemzetközi szabadalmi közzétételi irat). A gpl30 antitestre példa az AM64 antitest (3-219894 számú japán szabadalmi közzétételi irat).

Fentiek közül előnyösen a PM-1 antitestet használjuk.

A monoklonális antitestek előállítása az ismert technikákon alapuló, alábbiak szerinti módszerrel történhet. Ennek megfelelően szenzitizáló antigénként IL-6, IL-6R, illetve gpl30 molekulát használunk az immunizálás során a szokásos immunizálási eljárásban, majd az így kapott immunocitákat ismert szülősejtekkel fuzionáltatjuk a szokásos módon. A monoklonális antitestet termelő sejteket ismert szkrínmódszerrel kiemelve állítjuk elő az antitesteket.

Közelebbről a monoklonális antitestek előállítása az alábbiak szerint történik. Abban az esetben például, ha a szenzitizáló antigén IL-6, az antitesteket a humán IL-6 génszekvencia [Hirano et al., Natúré, 324, 73 (1986)] felhasználásával kapjuk meg. A humán IL-6 génszekvenciát nyilvánosan hozzáférhető expressziós vektorrendszerbe inszertáljuk, és ezzel megfelelő gazdaszervezetet transzformálunk, majd a keletkező IL-6 fehérjét a sejtekből vagy a tenyészet felülúszójából izoláljuk, tisztítjuk, és a szenzitizálást az így kapott tisztított IL-6 antigénnel végezzük.

Humán IL-6R esetében az IL-6R fehéije ugyanazzal a módszerrel állítható elő, mint amit a fentiekben az IL-6 esetében ismertettünk, ezúttal az EP325474 számú szabadalomban leírt szekvencia felhasználásával. Kéttípusú IL-6R molekula létezik, az egyik a sejtmembránban expresszálódik, a másik pedig a vízold3

HU 223 602 Bl ható forma (sIL-6R), amely elválik a sejtmembrántól. Az sIL-6R főleg a sejtmembránhoz kapcsolódó IL-6R extracelluláris doménjét tartalmazza, és abban tér el a membránhoz kötött IL-6R molekulától, hogy hiányzik belőle a transzmembrán dómén, vagy a transzmembrán dómén és az intracelluláris dómén egyaránt.

A humán gpl30 esetében a gpl30 fehérje ugyanazzal a módszerrel kapható meg, amelyet már ismertettünk a humán IL-6 előállításánál, ezúttal az EP411946 számú szabadalomban leírt szekvencia felhasználásával.

A szenzitizáló antigénnel immunizált emlősállatok köre nem korlátozott különösebbképpen, de ezeket előnyösen annak figyelembevételével választjuk meg, hogy milyen mértékben kompatibilisek a sejtfúzió során használt szülősejttel. Általában egeret, patkányt, hörcsögöt vagy nyulat használhatunk erre a célra.

Az állatok immunizálása a szenzitizáló antigénnel ismert módon történhet. Ilyen, hagyományosnak tekinthető módszer például a szenzitizáló antigén intraperitoneális vagy szubkután injektálása az emlősökbe. Közelebbről a szenzitizáló antigént előnyösen ekvivalens mennyiségű PBS-oldattal vagy fiziológiás sóoldattal hígítjuk, szuszpendáljuk, és kívánt esetben valamely szokásos adjuvánssal, például komplett Freund-adjuvánssal együtt juttatjuk az emlősállatba néhány alkalommal 4-21 naponta. A szenzitizáló antigénnel végzett immunizálást megfelelő hordozó alkalmazásával is végezhetjük.

Az immunizálással, majd a megerősítő oltásokkal létrehozott magas antitestszérumszint elérése után az emlősállatokból kinyert immunocitákkal sejtfúziót végzünk. A sejtfúzióhoz előnyösen lépsejt-immunocitákat használunk.

A fenti immunocitákkal végzendő sejtfúzióhoz használt szülősejtek emlősállatokból származó hibridómasejtek lehetnek, amilyen egy sor nyilvánosan hozzáférhető sejtvonal, így például a P3 (P3 x63Ag8.653) [J. Immunoi., 123, 1548 (1978)], a p3-Ul [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], az NS-1 [Eur. J. Immunoi., 6, 511-519 (1976)], az MPC-11 [Cell., 8, 405-415 (1976)], az SP2/0 [Natúré, 276, 269-270 (1978)], az Of [J. Immunoi. Meth., 35, 1-21 (1980)], az S194 [J. Exp. Med., 148, 313-323 (1978)], valamint az R210 [Natúré, 277, 131-133 (1979)]. Az immunociták és a mielómasejtek fúziója ismert módon kivitelezhető, például Milstein és munkatársainak módszerével [Milstein et al., Methods Enzymol., 73, 3-46(1981)]

Még közelebbről, a fenti sejtfúziót szokásos tápközegben, sejtfüziós promoter jelenlétében végezzük el. Az alkalmazott sejtfúziós promoter lehet például polietilénglikol (PEG) vagy Sendai-vírus (HVJ), és kívánt esetben, a fúzió hatékonyságának növelése érdekében egyéb segédanyagokat, például dimetil-szulfoxidot is használhatunk.

Az immunociták és a mielómasejtek fúziója során az immunocitákat előnyösen 1-10-szeres feleslegben alkalmazzuk. A sejtfúzióhoz használt tápközeg lehet például RPMI1640 tápközeg vagy MEM-tápközeg, melyek alkalmasak a mielómasejtek tenyésztésére, de más, megfelelő tápközeget, valamint kiegészítő komponenseket, például magzati boíjúszérumot (FCS) is felhasználhatunk.

A sejtfúzió kivitelezéséhez az immunociták és a mielómasejtek előírt mennyiségét alaposan összekeverjük a fenti tápközegben, 37 °C-ra melegített PEG-oldatot adunk hozzá - például 1000 és 6000 közötti átlagos molekulatömegű polietilénglikolt - általában 30-60 térfogat% koncentrációban, hogy megkapjuk a kívánt fúziós sejteket (hibridómákat). Ezt követően alkalmas tápközeg fokozatos hozzáadásával és a felülúszót centrifügálással eltávolítva, az eljárást többször megismételve, a sejtfüziós ágenseket eltávolítjuk, mivel ezek jelenléte nem kedvez a hibridómák növekedésének.

A megfelelő hibridómák kiválasztása normál szelektív tápközegben, például HAT-tápközegben való (mely hipoxantint, aminopterint és timint tartalmaz) tenyésztéssel történik. A HAT-tápközegben való tenyésztés adott ideig, általában néhány naptól néhány hétig történik, amely elegendő ahhoz, hogy a nemhibridóma sejtek (nem fúziós sejtek) elpusztuljanak. Ezt követően normál-sorozathígítást végzünk, és a kívánt antitestet termelő hibridómasejteket monoklónozzuk.

Az így elkészített, monoklonális antitest termelésére képes hibridómákat szubkultúrában, szokványos tápközegben elszaporíthatjuk, és hosszú távú tárolásra folyékony nitrogénben elhelyezhetjük.

Annak érdekében, hogy a monoklonális antitesteket kinyerjük a hibridómákból, a hibridómákat szokásos módon tenyésztve a felülúszót elkülönítjük, vagy más módszer szerint a hibridómákat megfelelő emlősállatba injektálva elszaporítjuk, és az aszcitesz folyadékot elkülönítjük. Az első módszer a nagy tisztaságú antitest előállítására alkalmas, a második pedig az antitestek tömegtermelésére.

Az ezen eljárásokkal kapott monoklonális anitesteket nagymértékben tisztíthatjuk szokásos tisztítási módszerek alkalmazásával, így például kisózással, gélszűréssel, affínitáskromatográfiával és hasonlókkal.

Az így kapott monoklonális antitestek tisztaságát, érzékenységét és antigénfelismerő képességét a szokásos immunológiai módszerek, például radioimmunmeghatározás (RIA), enzimkapcsolt immunmeghatározás (EIA, ELISA), fluoreszcenciás antitesttechnika (immunfluoreszcens analízis) stb. alkalmazásával vizsgálhatjuk.

A találmány értelmében felhasználható monoklonális antitestek köre nem korlátozódik a hibridómák által termelt monoklonális antitestekre, hanem lehetnek ezek olyanok is, melyeket mesterségesen módosítottuk annak érdekében, hogy az emberi szervezettel szembeni heteroantigenicitást csökkentsük. Alkalmazhatunk például olyan kiméra antitestet, amely egy emlős, nem humán - például egér - monoklonális antitest változó régióját, valamint egy humán antitest állandó régióját tartalmazza. Ilyen kiméraantitest-előállítható ismert kiméraantitest-előállítási technikával, különösen genetikai rekombinációs módszerrel.

Módosított humán antitestek is felhasználhatók a találmány értelmében. Ezeket oly módon állíthatjuk elő, hogy a humán antitest komplementer determináns

HU 223 602 Β1 régióját egér vagy más, nem humán emlősállat anitestjének komplementer determináns régiójára cseréljük. Az erre szolgáló szokásos genetikai rekombinációs technikák közismertek. Az ismert módszerek egyike alkalmazható a találmány szerinti módosított humán antitest előállítására. Az ilyen módosított humán antitest előnyös példája a hPM-1 [WO92-19759 számú nemzetközi szabadalmi közzétételi irat].

Adott esetben az antitest változó régiójának vázrégiójához (FR) tartozó aminosavakat kicserélhetjük oly módon, hogy a módosított humán antitest komplementer determináns régiója megfelelő antigénkötő helyet képezzen [Sato et al., Cancer Rés., 53, 851-856 (1993)]. Ezen túlmenően, a fenti célok úgy is megvalósíthatók, hogy olyan antitestfragmenst kódoló gént hozunk létre, amely az antigénhez kötődve gátolja az IL-6-aktivitást. Ilyen lehet valamely Fab, Fv vagy egyláncú Fv (scFv) fragmens, melyben a H és L lánc Fv fragmense megfelelő linker segítségével kapcsolódik. A szóban forgó gént azután alkalmas gazdaszervezetben expresszálhatjuk [például Bírd et al., TIBTECH, 9, 132-137 (1991); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883 (1988)].

A találmány értemében felhasznált, módosított IL-6 lehet például a Brakenoff és munkatársai [J. Bioi. Chem., 269, 86-93 (1994)] vagy a Savino és munkatársai [Embo J., 13, 1357-1367 (1994)] által közölt.

A felhasznált, módosított IL-6 előállítható úgy is, hogy az IL-6 aminosavszekvenciában mutációt, például szubsztitúciót, deléciót vagy inszerciót idézünk elő oly módon, hogy az IL-6R-kötő aktivitás megmaradjon, de az IL-6 transzfer funkció megszűnjön. Az ehhez felhasznált IL-6 származhat bármely állatfajból, feltéve, hogy rendelkezik a fentebb felsorolt tulajdonságokkal. Antigenitási szempontból mégis az a legelőnyösebb, ha humán eredetű genetikai anyagot alkalmazunk.

Az IL-6 aminosavszekvencia szekunder szerkezete előre kiszámítható nyilvánosan hozzáférhető molekulamodellező programok, például a WHATIF [Vriend et al., J. Mól. Graphics, 8, 52-56 (1990)] használatával, és ezáltal kiértékelhető a mutáns aminosavnak a teljes szerkezetre gyakorolt hatása. A megfelelő mutáns aminosavak meghatározását követően egy, a humán IL-6 gént kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó vektort templátként felhasználva, a mutációt a szokásos PCR (polimeráz láncreakció) technika alkalmazásával beépítve, olyan gént kaphatunk, amely már a módosított IL-6 genetikai kódját tartalmazza. Ezt azután, kívánt esetben, alkalmas expressziós vektorba juttatva az IL-6 molekulát E. coli sejtekben vagy emlőssejtekben expresszálhatjuk, majd felhasználhatjuk a felülúszóban, avagy izolálva és tisztítva, melyet szokásos módszerekkel végzünk, hogy az IL-6R-kötési képességet, valamint a hatástalanított IL—6-jelátviteli aktivitást értékeljük.

A találmány értelmében felhasználható IL-6 parciális peptid vagy IL-6R parciális peptid bármely szekvenciájú lehet, amennyiben képes kötődni az IL-6R, illetve az IL-6 molekulához, és nincs IL-6jelátviteli aktivitása. Ilyen IL-6 parciális peptideket ismertet az US 5210075 számú szabadalom. IL-6 antiszensz oligonukleotid szerepel az 5-300338 számú japán szabadalomban.

A krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmas, a találmány szerinti gyógyszerkészítmény alkalmas a krónikus reumatoid artritisz kezelésére, amennyiben blokkolja az IL-6-jelátvitelt és megakadályozza a szinoviális sejtek IL-6 által előidézett kóros növekedését, amely a betegség következménye. Az 1. példa a krónikus reumatoid artritiszes betegekből származó szinoviális sejtekre gyakorolt in vivő növekedésgátló hatást mutatja be. A 2. példában Il-es típusú kollagénnel immunizált, artritiszes egérmodellben vizsgáltuk az IL-6 receptor antitesttel történt kezelés hatását. A kapott releváns adatok (1) az artritiszindex alapján mért artritisz kialakulás gátlását (4. ábra), (2) a kollagénnel immunizált egerek vérében az anti ΙΙ-es típusú kollagénanitest-képződés gátlását (5. ábra), illetve (3) az IL-6 receptor antitesttel kezelt artritiszes egérmodellben a hátsó láb ízületében bekövetkező, a porc- és csontszövet granulózisos inváziójának (krónikus proliferatív szinovitisz) gátlását (6. ábra) mutatják.

Az (1) és (2) pontot illetően az eredmények igazolják az IL-6 receptor antitest gátló hatását, különösen kezdetben, az artritisz kialakulásakor az egérmodellben. A (3) pont eredményei azt mutatják, hogy a porcés csontszövet granulózisos inváziója gátolt, ami támogatja az 1. példában kapott eredményeket (in vitro szinoviálissejtnövekedés-gátlás).

Az (1) és (2) kísérleti adatok azt bizonyítják, hogy a találmány szerinti, krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény kiváló kezdeti hatással van a reumatoid artritiszre.

A találmány szerinti, a krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt előnyösen parenterálisan juttatjuk a szervezetbe, például intravénásán, intramuszkulárisan, intraperitoneálisan vagy szubkután injektáljuk, szisztémásán vagy lokálisan. Készítményünk lehet azonban készlet formájában is, legalább egyfajta gyógyászati vivőanyaggal vagy hígítószerrel együtt.

A találmány szerinti, a krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény adagolása, amennyiben emberi szervezetbe kívánjuk juttatni, függ a beteg állapotától, életkorától, a bejuttatás módjától, és a megfelelő és alkalmas dózisokat ennek alapján kell meghatározni. Választható például 4 részletben elosztva 1-1000 mg/beteg dózis. Mindazonáltal a találmány szerinti, a krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény értelem szerint nem korlátozható erre a dózistartományra.

A találmány szerinti, a krónikus reumatoid artritisz kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény a szokásos módon formulálható. Az injekciós készítmény előállításához például a tisztított IL-6-antagonistát oldószerben, így fiziológiás sóoldatban vagy pufferoldatban feloldjuk, majd adszorpciós inhibitort, így Tween 80-at, zselatint, humán szérumalbumint (HSA) vagy hasonlót adunk hozzá, és az elegyet felhasználásig lio5

HU 223 602 Β1 filizáljuk. A liofilizáláshoz segédanyagként cukoralkoholt, például mannitot vagy glükózt, esetleg valamilyen szacharidot használhatunk.

A találmányt részletesebben a következő példákkal, referencia- és kísérleti példákkal szemléltetjük, melyek a találmány jobb megértését szolgálják, anélkül, hogy a találmány tárgykörét bármilyen módon korlátoznák.

1. referenciapélda

Humán vízoldható IL-6 receptor előállítása

A humán vízoldható IL-6R előállítása [Yasukawa et al., J. Biochem., 103, 673-676 (1990)] PCR- (polimeráz láncreakció) módszerrel, humán IL-6 receptort (IL-6R) kódoló cDNS-t tartalmazó pBSF2R.236 plazmid felhasználásával történt, Zamasaki és munkatársainak módszere [Science, 241, 825-828 (1988)] alapján.

Az említett, humán IL-6 receptort (IL-6R) kódoló cDNS-t tartalmazó pBSF2R.236 plazmidot Sphl restrikciós enzimmel emésztettük, hogy IL-6R cDNS-fragmenshez jussunk, melyet mpl8 (Amersham Co.) molekulába inszertáltunk. Az IL-6R cDNS-be való stopkodon beviteléhez tervezett ATATTCTCTAGAGAGATTCT szintetikus oligoprimert használtuk fel arra, hogy az IL-6R cDNS-be PCR technikával, Invitro Mutagenesis System (Amersham Co.) alkalmazásával, mutációt vigyünk be. Ezzel az eljárással sikerült stopkodont bejuttatni a 345. aminosav helyére, és így megkapni a vízoldható IL-6R-t (sIL-6R) kódoló cDNS-t.

Annak érdekében, hogy az sIL-6R cDNS-t CHOsejtekben expresszáljuk, az említett sIL-6R cDNS-t HZndIII-5'ΰί/Ι emésztésnek vetettük alá, majd a pECEdhfr plazmidba [Clauser et al., Cell., 45, 721-735 (1986)] inszertáltuk, mely aPvi/I hasítási helyen a dihidrofolát reduktáz enzimet (dhfr) tartalmazta. Ezzel a módszerrel jutottunk el a pECEdhfr344 CHOsejt expressziós plazmidhoz.

pg pECEdhfr344 plazmid felhasználásával transzfekciót végeztünk a DXB-11 dhfr CHO sejtvonalon [Urland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)], kalcium-foszfát precipitációs módszer [Chen et al., Mól. Cell. Bioi., 7, 2745-2751 (1987)] alkalmazásával.

A transzfekción átesett CHO-sejteket 3 héten át nukleozidmentes, 1 mM glutamint, 10% dializált magzati borjúszérumot (FCS), 100 U/ml penicillint és 100 pg/ml sztreptomicint tartalmazó aMEM szelektív táptalajon tenyésztettük. A szelektált CHO-sejteket határhígításos módszerrel szkrínelve egyetlen monoklonális CHO-sejt-vonalat kaptunk. A CHO-sejt-klónt 20 nM és 200 nM koncentrációjú metotrexáttal (MTX) amplifikálva kaptuk a humán sIL-6R-termelő 5E27 jelű CHO-sejt-vonalat.

Az 5E27 jelű CHO-sejt-vonalat Iscove-féle módosított Dulbecco-tápközegben (IMDM, Gibco Co.), 5% FCS jelenlétében tenyésztettük, a felülúszót elkülönítettük és sIL-6R koncentrációját ELISA- (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) technikával, ismert módon meghatároztuk.

2. referenciapélda

Humán IL-6 antitest előállítása

A humán IL-6 antitest előállítása Matsuda és munkatársainak módszere [Eur. J. Immunok, 18, 951-956 (1988)] alapján történt.

BALB/c egereket immunizáltunk 10 pg rekombináns IL-6 fehérjével [Hirano et al., Immunoi. Lett., 17, 41 (1988)], valamint komplett Freund-adjuvánssal hetente, míg anti-IL-6 antitesteket sikerült kimutatni a vérszérumban.

A lokális limfoid csomóból extrahált immunocitákat polietilénglikol 1500 jelenlétében fuzionáltattuk P3U1 mielómasejtekkel. A hibridómasejteket Oi és munkatársai módszerével [Selective Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 351 (1980)] HAT-tápközegben szelektáltuk, és a humán IL-6 antitestet termelő hibridómasejtvonalat izoláltuk. A humán IL-6 antitestet termelő hibridómasejt-vonalat IL-6-kötési vizsgálatnak vetettük alá a következők szerint.

Puha polivinilanyagú, 96 lyukú mikrotiterlemezt (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA, USA) egy éjszakán át 100 pl kecske antiegér lg antitest oldattal (10 pl/ml, Cooper Biomedical, Inc, Maivem, PA, USA) kezeltünk 0,1 M koncentrációjú karbonát-hidrogén-karbonát pufferoldatban (pH 9,6), 4 °C-on. A mikrotiterlemezt ezután 2 órán át szobahőmérsékleten 100 pl térfogatú, 1% marha-szérumalbumint (BSA) tartalmazó PBS-oldattal kezeltük. A PBS-oldattal való mosás után minden egyes lyukba 100 pl hibridómasejt-felülúszót mértünk, és egy éjszakán át 4°C-on inkubáltuk.

A lemezt ezután mostuk, majd ¹²⁵I-jelölt rekombináns IL-6 fehérjét adtunk minden egyes lyukba 2000 cpm/0,5 ng/lyuk mennyiségben. Újabb mosás után az egyes lyukak aktivitását gamma-számlálóval (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA) megmértük. Az átvizsgált 216 hibridómaklónból 32 adott pozitív eredményt az IL-6kötési próba során. Ezek közül kaptuk végül is az MH166.BSF2 stabil kiónt. A hibridómaklón által termelt MH166 jelű IL-6 antitest IgGIK szubtípusú.

Ezt követően az MH60.BSF2 jelű, IL-6-függő egér-hibridómasejtvonalat [Matsuda et al., Eur. J. Immunoi., 18, 951-956 (1988)] használtunk az MH166 antitest hibridómasejt növekedésére gyakorolt neutralizáló hatásának vizsgálatára. Az MH60.BSF2 sejteket 1x104/200 pl/lyuk mennyiségben szétosztva MH166tartalmú mintát adtunk hozzájuk, és a tenyésztést 48 órán át végeztük. Ezt követően 15,1 Ci/mmol ³Htimidint (New England Nuclear, Boston, MA, USA) adtunk hozzájuk, majd a tenyésztést további 6 órán át folytattuk.

A sejteket ezután üvegszálból készült szűrőpapírra vittük, és automata sejtfeltáró berendezéssel (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan) kezeltük. Kontrollként nyúl anti-IL-6 antitestet használtunk. A vizsgálat eredménye szerint az MH166 antitest dózisfüggő módon gátolta az MH60.BSF2 sejtek ³H-timidin-felvételét. Ezzel igazolást nyert, hogy az MH166 antitest neutralizálja az IL-6-aktivitást.

HU 223 602 Bl

3. referenciapélda

Humán IL-6 receptor antitest előállítása

A Hirata és munkatársainak módszerével [J. Immunoi., 143, 2900-2906 (1989)] előállított anti-IL-6R MTI8 konstrukciót Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, USA) gélen rögzítve cianogénbromiddal kezeltük a gyártó előírásai szerint, és ezt az immobilizált komplexet használtuk fel IL-6R tisztítására [Yamasaki et al., Science, 241, 825-828 (1988)].

U266 humán mielómasejt-vonalat digitonin pufferoldatot [1% digitonin (Wako Chemicals), 10 mM trietanol-amin (pH 7,8), 0,15 M NaCl] tartalmazó 1 mM p-amino-fenil-metán-szulfonil-fluorid-hidrokloriddal (Wako Chemicals) szolubilizáltunk, és Sepharose 4B gélgömbökön rögzített MTI8 antitesttel kevertünk. A gélgömböket hatszor mostuk digitonin pufferoldattal, hogy megkapjuk az immunizáláshoz szükséges, részlegesen tisztított IL-6R fehéqét.

A 3 χ 10⁹ U266 sejtből kinyert, részlegesen tisztított IL-6R fehérje felhasználásával BALB/c egereket immunizáltunk 10 naponként 4 alkalommal, majd a hibridómákat ismert módon kinyertük. A mikrotiterlemezen növekedést mutató hibridómatenyészetek felülúszóinak IL-6-kötő aktivitását a következő módszerrel vizsgáltuk meg. 5 χ 10⁷ U266 sejtet ³⁵S-metioninnal (2,5 mCi) jelöltünk, és a fentiek szerinti digitoninpufferben szolubilizáltunk. A szolubilizált U266 sejteket 0,04 ml térfogatú, Sepharose 4B gélgömbökön rögzített MTI8 antitesttel kevertünk, majd a gélgömböket hatszor mostuk digitonin pufferoldattal. Ezután a ³⁵S-metioninnal jelölt IL-6R fehérjét 0,25 ml térfogatú pH 3,4 digitonin pufferoldattal lemostuk, és 0,025 ml térfogatú 1 M TRIS (pH 7,4) pufferoldattal neutralizáltuk.

A hibridómatenyészet felülúszójának 0,05 ml térfogatnyi mennyiségét 0,01 ml Protein G Sepharose (Pharmacia) géllel kevertük, majd a gélt mostuk, és 0,005 ml térfogatú, fentiek szerint elkészített, ³⁵S-jelölt IL-6R oldattal inkubáltuk. Az immunprecipitálódott anyagot SDS-PAGE-vizsgálattal analizáltuk, és az IL-6R fehérjével reakcióba lépett hibridóma-felülúszókat megvizsgáltuk. Ennek eredményeképp jutottunk a pozitív reakciót adó PM-1 hibridómaklónhoz. A PM-1 hibridómasejt-vonal által termelt PM-1 antiIL6R antitest IgGIK szubtípusú.

A PM-1 hibridómasejt-vonal által termelt antitestnek az IL-6 és a humán IL-6R kötődését gátló hatását U266 humán mielómasejt-vonal felhasználásával vizsgáltuk. A humán rekombináns IL-6 fehérjét E. coli sejtekkel [Hirano et al., Immunoi. Lett., 17, 41 (1988)] állítottuk elő, ¹²⁵I-jelölésüket Bolton-Hunter-reagenssel (New England Nuclear, Boston, MA, USA) végeztük [Taga et al., J. Exp. Med., 166, 967 (1987)].

4x 10⁵ U266 sejtet 70 térfogat% PM-1 hibridómafelülúszóval és 14 000 cpm ¹²⁵I-jelölt IL-6 fehéqével szobahőmérsékleten egy órán át inkubáltuk, százszoros feleslegű jelöletlen IL-6 jelenlétében. Az elegyből kivett 70 μΐ térfogatú mintát 400 μΐ-es polietilén mikrocentrifügacsőben lévő 300 μΐ térfogatú magzati borjúszérumra (FCS) rétegeztünk, majd centrifugálást követően a sejtek radioaktivitását megmértük.

Az így kapott eredmények szerint a PM-1 hibridómasejt-vonal által termelt antitest gátolja az IL-6 kötődését az IL-6R fehérjéhez.

4. referenciapélda

Egér IL-6 receptor antitest előállítása

Az egér IL-6 receptor elleni monoklonális antitestek előállítása a 6-134617 számú japán szabadalmi bejelentésben leírtak szerint történt.

Egér vízoldható IL-6 receptort termelő CHOsejteket Saito és munkatársainak módszerével [J. Immunoi., 147, 168-173 (1993)], 10% FCS-tartalmú IMDM-tápközegben tenyésztettünk. A tenyészet felülúszójából az egér vízoldható IL-6 receptor kinyerését RS12 egér vízoldható IL-6 antitest [Saito et al., ibidf felhasználásával, Affigel 10 (Biorad) immobilizáló géltöltetű oszlopon végeztük.

pg így kapott egér vízoldható IL-6 receptort komplett Freund-adjuvánssal keverve intraperitoneálisan Wistar-patkányokba (Nihon Charles River Co.) injektáltunk. Az immunizálás fokozását két hét múlva inkomplett Freund-adjuvánssal végeztük. A 45. napon a patkányokat levágtuk, és a belőlük származó 2 χ 10⁸ lépsejtet lxlO⁷ P3U1 egér-mielómasejttel fuzionáltattuk ismert módon, 50% PEG1500 (Boehringer-Mannheim) alkalmazásával, majd a hibridómákat HATtápközegben szkríneltük.

A hibridómatenyészet felülúszóját nyúl antipatkány IgG antitesttel bevont immun-mikrotiterlemezre (Cappel Co.) vittük, és egér vízoldható IL-6 receptorral reagáltattuk. Az egér vízoldható IL-6 receptor elleni antitestet termelő hibridómákat ELISAmódszerrel szkríneltük, nyúl antiegér IL-6 receptor antitest és alkalikus foszfatázzal jelölt birka antinyúl IgG antitest felhasználásával. Az antitesttermelést igazoló hibridómaklónokat kétszer szubszkríneltük, annak érdekében, hogy egyetlen hibridómaklónt kapjunk. Az így előállított klón jelölése MR16-1.

Az MR 16-1 hibridómaklón által termelt antitest egér IL-6-jelátvitelt neutralizáló képességének vizsgálatát a ³H-timidin-beépülés mérésével végeztük, MH60.BSF2 sejteken [Matsuda et al., J. Immunoi., 18, 951-956 (1988)]. Az MH60.BSF2 sejteket 96 lyukú mikrotiterlemezre vittük 1 χ 10⁴ sejt/200 μΐ/lyuk mennyiségben, majd egér IL-6 fehéqét (10 pg/ml), valamint MR16-1 vagy RS12 antitestet (12,3-1000 ng/ml) adtunk hozzá. A mikrotiterlemezt 37 °C-on, 5% CO₂tartalom mellett 44 órán át inkubáltuk, majd ³H-timidint adtunk hozzá (1 pCi/lyuk), és a beépülést 4 óra elteltével megmértük. A kapott eredmények szerint az MR 161 antitest gátolta a ³H-timidin beépülését az MH60.BSF2 sejtekbe.

1. kísérleti példa

Krónikus reumatoid artritiszes szinoviális sejtvonal létrehozása

1. Szinoviális sejtek előállítása

A szinoviális szövetet krónikus reumatoid artritiszben szenvedő beteg ízületén végzett sebészeti műtét során nyertük. A szinoviális szövetet ollóval felap7

HU 223 602 Β1 rítottuk, majd enzimes emésztésnek vetettük alá 37 °C-on egy órán át IMDM-tápközegben, 5 mg/ml Ies típusú kollagenázt (Sigma Chemical Co.) és 0,15 mg/ml marhahasnyálmirigy-DN-ázt (Sigma Chemical Co.) használva. Az elegyet ezután szitán vezettük keresztül, hogy egyedi sejteket kapjunk. Az így kapott sejteket egy éjszakán át 5% FCS-tartalmú IMDM-tápközegben tenyésztettük, majd a nem kitapadó sejteket eltávolítva jutottunk a szinoviális sejtekhez. A szinoviális sejteket 3-6-szor passzálva használtuk fel a következő kísérlethez.

2. IL-6 előállítása szinoviális sejtekkel

A fentiek szerint kapott szinoviális sejteket 5% FCS(Hyclone Laboratories Inc.) tartalmú IMDMtápközegben, 10 U/ml penicillin G és 100 pg/ml sztreptomicin jelenlétében 96 lyukú mikrotiterlemezen (Falcon Co.) tenyésztettük, minden lyukba 3 χ 10³ sejtet juttatva. Az egyes lyukakba humán interleukin 1 β-t (IL-Ιβ), humán tumor-nekrózisfaktor α-t (TNFa), humán vérlemezke-eredetű növekedési faktort (PDGF)AB, illetve humán bázikus növekedési faktort (bFGF) adtunk, 0,01 vagy 0,1,0,1 vagy 1,1 vagy 10, illetve 1 vagy 10 ng/ml koncentrációban. A tenyésztést 37 °C-on 72 órán át végeztük, majd a felülúszókat kinyertük.

100 μΐ ΜΗ 166 anti-humán IL-6 antitestet (1 pg/ml) adtunk 96 lyukú ELISA immun-mikrotiterlemezbe, és 4 °C-on 24 órán át inkubáltuk. Ezután a lyukakat 0,05% Tween 20 tartalmú PBS pufferoldattal mostuk, majd 4 °C-on egy éjszakán át 1% BSAtartalmú PBS pufferoldattal blokkoltuk. A korábban kinyert felülúszókat 1% BSA-tartalmú PBS pufferoldattal hígítva a lyukakba mértük, majd az inkubálást szobahőmérsékleten 2 órán át folytattuk. Ezután a lyukakat 0,05% Tween 20 tartalmú PBS pufferoldattal mostuk, majd 100 μΐ-es protein A oszlopon (Pharmacia) tisztított 2,5 pg/ml nyúl antihumán IL-6 antitestet adtunk hozzájuk.

Kétórás, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a felülúszóban lévő IL-6 fehérjéhez kötődött nyúl poliklonális anti-IL-6 antitestet alkalikus foszfatázzal jelölt antinyúl IgG antitesttel (Tago Co.) reagáltattuk. Ezután a lyukakba 1 mg/ml Sigma 104 alkalikus foszfatázszubsztrátumot (Sigma Co.) adtunk a gyártó előírásának megfelelően, majd adszorbanciájukat 405-600 nm hullámhosszon, MPR A4 mikrotiterlemez-leolvasó (Tosoh Co.) segítségével megmértük.

Minden egyes meghatározás során kalibrációs görbét vettünk fel rekombináns IL-6 fehérjével annak érdekében, hogy a méréseknél kapott abszorbancia ODértékeit IL-6-koncentráció-értékekre tudjuk átszámítani. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.

1. táblázat

A szinoviális sejtek IL-6-termelése

Kezelés (ng/ml)	IL-6 (ng/ml)
Kezeletlen kontroll	0,096+0,012
IL 1 βΟ,ΟΙ 0,1	6,743+0,178 17,707+0,259

Kezelés (ng/ml)	IL-6 (ng/ml)
TNFa 0,1 1	0,575+0,008 1,688+0,034
PDGF-AB 1 10	0,163+0,035 0,165+0,016
bFGF 1 10	0,181+0,009 0,230+0,019

Megjegyzés a táblázathoz; A szinoviális sejteket 3 napon át tenyésztettük IL-1 β, TNFa, PDGF-AB, illetve bFGF jelenlétében. A tenyésztést követően a felülúszó IL-6-koncentrációját ELISAmódszerrel mértük.

Az eredmények szerint az IL-Ιβ erőteljesen serkenti a szinoviális sejtek IL-6-termelését.

1. példa (1) Az 1. kísérleti példában kapott szinoviális sejteket 5% FCS- (Hyclone Laboratories Inc.) tartalmú IMDM-tápközegben, 10 U/ml penicillin G és 100 pg/ml sztreptomicin jelenlétében 96 lyukú mikrotiterlemezen (#3072, Falcon Co.) tenyésztettük 5 napon át, minden lyukba 3χ 10³ sejtet juttatva. Az egyes lyukakba különböző koncentrációban IL-6 és sIL-6R fehérjét mértünk, külön-külön, illetve együtt. A tenyésztés 72. órájában ³H-timidint juttattunk a lyukakba (1 pCi/lyuk), majd a tenyésztés végén a sejtek radioaktivitását szcintillációs számlálóval meghatároztuk. A kapott eredmények az 1. ábrán láthatók.

Az eredmények szerint a szinoviális sejtek ³H-timidin-felvétele alacsony volt mind IL-6, mind pedig sIL-6R egyedüli jelenlétében, és nem volt megfigyelhető a szinoviális sejtek számottevő gyarapodása. Abban az esetben azonban, ha az IL-6 legalább 10 ng/ml, a sIL-6R pedig legalább 100 ng/ml koncentrációban együttesen jelen volt, a kontrollcsoporthoz képest számottevő ³H-timidin-felvétel volt tapasztalható. Míg az IL-6 önmagában nem idézte elő a szinoviális sejtek látható növekedését, addig az IL-6 és a sIL-6R együttes jelenlétében a szinoviális sejtek erőteljes gyarapodását észleltük.

(2) A szinoviális sejteket (3xlO³/lyuk) IL-6termelés előidézéséhez elegendő mennyiségű IL-lb (0,1 ng/ml), illetve 100 ng/ml sIL-6R, és 25 mg/ml IL-6 antitest vagy 25 pg/ml sIL-6R antitest jelenlétében tenyésztettük. A tenyésztés 72. órájában ³H-timidint juttattunk a lyukakba (1 pCi/lyuk), majd a tenyésztés végén a sejtek radioaktivitását szcintillációs számlálóval meghatároztuk. A kapott eredmények a 2. ábrán láthatók. Az eredmények szerint az IL-6 antitest, valamint a sIL-6R antitest teljesen elnyomja a szinoviális sejtek sIL-6R előidézte gyarapodását.

(3) A szinoviális sejteket (3xlO³/lyuk) 100 ng/ml IL-6 (Genzyme Co.), illetve 100 ng/ml sIL-6R, és 25 pg/ml IL-6 antitest vagy 25 pg/ml sIL-6R antitest - melyeket a referenciapéldákban leírtak szerint készítettünk - jelenlétében tenyésztettük. A tenyésztés 72. órájában ³H-timidint juttattunk a lyukakba (1 pCi/lyuk), majd a tenyésztés végén a sejtek radioak8

HU 223 602 Bl tivitását szcintillációs számlálóval meghatároztuk. A kapott eredmények a 3. ábrán láthatók. Az eredmények szerint az IL-6 antitest, valamint a sIL-6R antitest teljesen elnyomja a szinoviális sejtek sIL-6R előidézte gyarapodását.

2. példa

Az IL-6 receptor antitestnek az artritisz kialakulását gátló hatását egér-artritiszmodellben tanulmányoztuk.

ΙΙ-es típusú marhakollagén-oldatot (Collagen Technology Research Group) (4 mg/ml) feloldottuk 0,1 N vizes ecetsavoldatban, majd azonos térfogatú H37Ra komplett adjuvánssal (DIFCO) elegyítettük. 100 μΐ így előállított elegyet 8-9 hetes nőstény DBA/1J egerek (Charles River Japan) faroktövébe injektáltunk szubkután. Húsz nappal később újabb 100 μΐ elegyet injektáltunk szubkután a gerincbőr alá, az artritisz előidézésére.

Az egereket intravénásán kezeltük 2 mg/egér MR 16-1 IL-6 receptor antitesttel az első kollagénes szenzitizáláskor, majd szubkután további 0,5 mg (n=5) antitesttel hetente, a rákövetkező 7 héten. Kontrollként megegyező izotípusú KH-5 anti-DHP antitestet (Chugai Seyaku) használtunk (n=5).

Az artritisz súlyosságát az artritiszindex alapján értékeltük. Az értékelést egy végtagonkénti 4 pontos skála, és egy egyedenkénti 16 pontos skála segítségével végeztük. A kiértékelési protokoll a következő:

0,5 bőrpír figyelhető meg az ízület egyik oldalán;

bőrpír figyelhető meg az ízület mindkét oldalán, de duzzanat nem észlelhető;

enyhe duzzanat észlelhető;

komoly lábduzzanat figyelhető meg, de nem érinti az összes ujjat;

a láb és az ujjak komoly duzzanata figyelhető meg.

A kapott eredmények a 4. ábrán láthatók. Az artritisz kialakulása a korai fázistól kezdve egyértelműen gátolt az IL-6 receptor antitesttel kezelt csoportban, a kontrollantitesttel kezelt csoporthoz képest.

Másrészről, az egérvérben mért anti-II-es típusú kollagéntiter-eredmények határozott csökkenést mutatnak a betegség korai szakaszához képest az IL-6 receptor antitesttel kezelt csoportban, a kontrollanitesttel kezelt csoport értékeihez képest (5. ábra).

A kollagénimmunizációt követő 35. napon levágott egerek hátsó lábát 20%-os formaiinban fixáltuk, majd EDTA-oldatban (pH 7,6) demineralizáltuk és alkohollal vízmentesítettük. Ezután az egérlábakat paraffinnel bevontuk és 2 pm vastagságú metszeteket készítettünk belőlük. Az így kapott metszeteket hematoxilinnel és eozinnal festettük, majd 125-szörös nagyításban vizsgáltuk (6. ábra). A vizsgálat eredményeképp megállapítható volt, hogy az IL-6 receptor antitesttel kezelt csoportban a porc- és csontszövet granulózisos inváziója, azaz a krónikus proliferatív szinovitisz kialakulása gátolt volt a kontrollcsoportnál megfigyelhetőhöz képest.

Az IL-6 olyan citokin, amely a B-sejtek antitesttermelő sejtekké való differenciálódását idézi elő. Az IL-6 elősegíti a szinoviális sejtek proliferációját is,

IL-6 receptor jelenlétében. Mivel az egér-kollagénartritiszmodellben az anti-IL-6 receptor antitest kezelés számottevően csökkentette a kollagénszenzitizálás utáni

21. és 35. napon mérhető anti-II-es típusú kollagénantitest-titert, feltételezhető, hogy az IL-6 receptor antitest artritiszellenes hatásának egyik eleme az antitesttermelés gátlása. Jóllehet a kollagénszenzitizálást követő 49. nap után az antitesttermelés gátlása nem volt már megfigyelhető, az a tény, hogy az artritisz kialakulása ekkor is gátolt volt, valamint, hogy a lábtőcsontok HE-festéses vizsgálata a porc- és csontszövet granulózisos inváziójának gátoltságát mutatta ki az anti-IL-6 receptor antitesttel kezelt csoportban a kontrollcsoporthoz képest, okkal feltételezhető, hogy a szinoviális sejtnövekedést gátló hatás hozzájárul az artritiszellenes hatáshoz.

A krónikus reumatoid artritiszben szenvedő betegek szinoviális sejtjeinek proliferációja figyelhető meg IL-6 és sIL-6R együttes jelenlétében. Az a tény, hogy a krónikus reumatoid artritiszben szenvedő betegek szinoviális folyadéka elegendő mennyiségben tartalmaz IL-6 és aIL-6R fehérjét ahhoz, hogy a szinoviális sejtnövekedést előidézze, valószínűvé teszi az IL-6 jelátvitelének részvételét a szinoviális sejtek kóros gyarapodásában krónikus reumatoid artritisz esetén.

Mindezek alapján igazolást nyert, hogy a találmány szerinti, hatóanyagként IL-6-antagonistát felhasználó, krónikus reumatoid artritisz elleni gyógyszerkészítmény gátolja a szinoviális sejtek gyarapodását a krónikus reumatoid artritiszben szenvedő betegeknél IL-6 és sIL-6R jelenlétében, és ilyen módon krónikus reumatoidartritisz-ellenes terápiás hatással rendelkezik. Ezek szerint a találmány szerinti IL-6-antagonista hasznos gyógyszerkészítmény a krónikus reumatoid artritisz kezelésére, melyben a szinoviális sejtek kóros gyarapodása megy végbe.

Claims

1. Interleukin-6 receptor elleni antitestek alkalmazása reumatoid artritisz kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására.

2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az interleukin-6 receptor elleni antitestek szuppresszálják a szinoviális sejtek krónikus reumatoid artritisz esetén bekövetkező abnormális növekedését.

3. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az interleukin-6 receptor humán eredetű interleukin-6 receptor.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitest monoklonális antitest.

5. A 3. vagy 4. igénypont bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitest PM-1 antitest.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitest kiméra antitest.

7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitest újraformált humán antitest.

8. A 3-5. és 7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitest újraformált humán PM-1 antitest.

HU 223 602 Bl

9. Interleukin-6 receptor elleni antitestek alkalmazása szinoviális sejtek abnormális növekedésének gátlására szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására.

10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest monoklonális antitest. 5

11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest PM -1 antitest.

12. A 9-11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitest kiméra antitest.

13. A 9-11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitest újraformált humán antitest.

14. A 11. vagy 13. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest újraformált humán PM-1 antitest.