WO2009152691A1

WO2009152691A1 - 聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物及制备方法和应用

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Publication number: WO2009152691A1
Application number: PCT/CN2009/000656
Authority: WO
Inventors: 胡富强; 杜永忠; 袁弘; 蒙盼
Original assignee: 浙江大学
Priority date: 2008-06-17
Filing date: 2009-06-16
Publication date: 2009-12-23
Also published as: CN101293933B; CN101293933A; US20110118200A1; US8466127B2; EP2289946A4; JP2011524446A; EP2289946A1

Abstract

本发明提供一种包括式（I）所示结构单元和式（II）所示结构单元的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物及其制备方法，其中壳寡糖的分子量小于200,000，脱乙酰度为70~100%，且壳寡糖链上的部分自由氨基被脂肪酸或聚乙二醇取代，n是所述聚乙二醇的聚合度，R是具有11~21个碳原子的烷基，脂肪酸的接枝率为1~5 0%，聚乙二醇的接枝率为0.05~50%。本发明还提供了包括该聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物作为载体的药物组合物，以及该聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物在制备药物组合物中的应用。

Description

聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物及制备方法和应用

发明领域

本发明涉及聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物及其制备方法、包括聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物的药物组合物，以及聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物在制备药物组合物中的应用。背景技术

受药物自身体内生物转运能力的限制，药物必须依赖其理化性质，经体循环转运至病灶组织、病灶细胞及亚细胞器的药物分子作用靶点，而发挥其疗效。现有药物的这种体内生物药剂学和药物动力学特征，明显缺乏药物对疾病组织和健康组织的特异性选择，为达到满意疗效，需较高的给药剂量，易导致药物毒副作用的发生，从而限制药物的临床应用。

靶向治疗是解决上述问题的最有效措施之一。药物的分子靶标主要集中在病灶组织细胞，其中酶占 50%,受体占 35%，离子通道占 15%，药物主要通过对分子靶标的占位效应实现疗效。如大多数细胞毒类抗肿瘤药物的分子靶标，主要位于肿瘤细胞细胞核中的 DNA (如丝裂霉素( 、阿霉素、喜树碱），或位于细胞浆内的微管蛋白（如紫杉醇、长春碱）；基因治疗药物的分子靶标也位于病灶细胞的细胞浆或细胞核，如质粒 DNA位于细胞核， siRNA位于细胞浆；抗病毒药物的分子靶标也均位于病灶细胞的细胞核或细胞浆。通过合适的载体技术，将药物直接靶向病变组织（器官）、细胞是解决药物疗效低和毒副作用的重要手段之一。目前国内外的科学家通过载体技术在肿瘤药物的组织（器官）和细胞靶向上取得了一定的进展，但并没有取得突破性的疗效，其本质在于绝大多数抗肿瘤药物的分子作用靶点位于细胞内，因此肿瘤细胞内药物分子作用靶点（亚细胞器）靶向性载体材料技术的研究开发是突破癌症化疗瓶颈的关键。

靶向载体的设计主要包括载体的病灶脏器靶向性，以及在此基础上穿越病灶脏器内的病灶细胞靶向，从而完成针对药物分子靶标的亚细胞器靶向。早期的组织器官靶向，利用微粒的小粒径被动靶向到肝等组织，通过 "增强的透过及滞留效应" （enhanced permeability and retention effect) 聚集到肿瘤组织等。当前，研究者利用肿瘤细胞表面某些受体（如叶酸受体）过度表达的特性，将配体修饰载体材料成功应用于肿瘤的靶向治疗。从而达到肿瘤细胞的靶向，提高细胞内的抗肿瘤药物浓度，增强抗肿瘤药物本身的疗效。

近年来，聚合物胶团在药物制剂学、生物医学及高分子领域已经引起了人们广泛的重视。聚合物胶团是由两亲性的嵌段或接枝共聚物在水性介质中自聚形成，具有核 ~壳结构。其疏水性链段构成胶团的内核，亲水性链段形成胶团的外壳。疏水核可为难溶性药物提供储库的作用；亲水性外膜保持胶团在水性环境中的稳定性，并可进行理化性质修饰以达到特定的目的，如胶团的主动靶向等。

聚合物胶团作为一种药物传输***，有许多优势：通过调整材料的溶解性、 pH值、 Zeta电位等可以控制药物在生物体内的释放；由于胶团粒径很小，故可穿过血脑屏障、网状内皮组织***，也可促进肠胃黏膜等的良好吸收，到达大尺寸粒子无法通过的部位，达到被动靶向的目的；聚合物胶团骨架对药物的保护和屏蔽作用，可在一定程度上避免药物的分解，保持药物的稳定性，降低药物的毒性；与脂质体相比，聚合物胶团的载药量较高; 聚合物材料的多样性，使得以聚合物为载体的药物制剂亦多样化，能满足各种使用需求。

有报道指出，在药物载体中进行亲水性的聚乙二醇修饰，可以减少血浆蛋白对载体的吸附作用，同时可减少巨噬细胞对药物载体的吞噬作用，使载体在循环***中的半衰期延长。基于此在聚合物胶团的亲水外壳上进行聚乙二醇修饰，可以减少血浆蛋白对聚合物胶团的调理作用，从而减少巨噬细胞对聚合物胶团的摄取，延缓聚合物胶团从血浆中被清除的过程。通过 "增强的透过及滞留效应"，可进一步提高聚合物胶团在肿瘤组织的被动靶向功能；或者是通过配体与抗体修饰实现其他脏器组织的主动靶向。

本发明在我们前期的研究工作基础上，利用具有快速细胞摄取和细胞器靶向的壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团，进行表面聚乙二醇修饰，合成了可以避免网状内皮***识别的长循环性壳寡糖脂肪酸嫁接物，并应用于抗肿瘤药物、基因治疗药物和抗病毒药物等的制备与应用。发明内容

为了提高药物活性组分在体内的靶向吸收，本发明提供了一种聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，其可以通过形成聚合物胶团，控制药物活性组分在生物体内的释放，实现药物的主动靶向和被动靶向，并可在一定程度上避免药物的分解，保持药物的稳定性，降低药物的毒副作用。该聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物可以作为药物载体，应用于多种药物的制备，例如，可以应用于抗肿瘤药物、基因治疗药物、抗病毒药物等的制备。

本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物可以包括下式（I) 所表示的结构单元和下式（Π) 所表示的结构单元：

其中，壳寡糖链上的部分自由氨基被具有 12〜22个碳原子的脂肪酸或分子量为 1,000~10，000的聚乙二醇取代， n是聚乙二醇的聚合度， R是具有 11〜21个碳原子的烷基。

在本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物中，脂肪酸的接枝率为 1~50%，聚乙二醇的接枝率为 0.05〜50%。

壳寡糖脂肪酸嫁接物是指壳寡糖链上的部分自由氨基被脂肪酸取代的寡聚物。上述脂肪酸可以是具有 12^22个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸。另一方面，上述脂肪酸可以是具有 12〜22个碳原子的直链或支链脂肪酸。另外，脂肪酸优选具有 12~20个碳原子，或具有 12〜18 个碳原子，或具有 14~22个碳原子，或具有 16~22个碳原子，或具有 14~20个碳原子，或具有 16~18个碳原子。优选地，上述脂肪酸可以选自月桂酸、豆蔻酸、软脂酸、油酸、硬脂酸、山嵛酸或其任意混合物。

本发明使用的壳寡糖可由壳聚糖的降解而得到，其中 N 乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖以 β〜1，4〜糖苷键连接。例如，壳寡糖可以是分子量小于 200,000、脱乙酰度为 70〜100%的壳寡糖。优选地，上述壳寡糖的脱乙酰度可以是 80~100%，优选 90〜100%，也可以是 70~80%，或 70~90%。

本发明使用的壳寡糖的分子量优选小于 100,000，更优选小于 50,000，最优选小于 5,000。另一方面，本发明使用的壳寡糖分子量大于 500，更优选大于 1,000，最优选大于 2,000。例如，壳寡糖的分子量可以是 500 100,000、 500-50,000、 500-5000、 1,000-100,000、 2000~100，000、 1,000-50,000或 2，000〜5，000。

在本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物中，脂肪酸的接枝率大于或等于 1%，优选大于或等于 5%，更优选大于或等于 10%，进一步优选大于或等于 15%，最优选大于或等于 20%。另一方面，脂肪酸的接枝率小于或等于 50%，优选小于或等于 45%，更优选小于或等于 40%, 进一步优选小于或等于 35%，最优选小于或等于 30%。例如，脂肪酸的接枝率可以是 1~50%、 5~50%、 10〜50%、 15〜50%、 20-50%, 卜 45%、卜 40%、卜 35%、卜 30%、 5-45% 10~40%、 15~35%或 20~30%。

在本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物中，聚乙二醇的接枝率大于或等于 0.05%，优选大于或等于 0.1%, 更优选大于或等于 1.0%, 进一步优选大于或等于 5.0%，最优选大于或等于 10.0%。另一方面，脂肪酸的接枝率小于或等于 50%，优选小于或等于 45%，更优选小于或等于 40%，进一步优选小于或等于 35%，最优选小于或等于 30%。例如，脂肪酸的接枝率可以是 0.05~50%、 0.5-50%, 1.0~50%、 5.0-50%, 10.0~50% 0.卜 45%、 0.1~40%> 0.1-35%. 0.1~30% 0.5~45%、 1.0〜40%、 5.0~35%或 10.0~30%。

在本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物中，聚乙二醇的分子量大于或等于 1,000，优选大于或等于 1，500，更优选大于或等于 2,000, 进一步优选大于或等于 2,500，最优选大于或等于 3,000。另一方面，聚乙二醇的分子量小于或等于 10,000，优选小于或等于 9，500，更优选小于或等于 9,000，进一步优选小于或等于 8，000，最优选小于或等于 7,000。例如，聚乙二醇的分子量可以是 1，000~10，000、 1,500-10,000. 2,000-10,000, 2，500〜10，000、 3,000~10,000、 1，000~9,500、 1 ,000-9,000 1 ,000-8,000 > 1 ,000-7,000 1 ,500-9,500 2,000-9,000, 2,500-8,000或 3,000~7000。

本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物可以通过用聚乙二醇对壳寡糖脂肪酸嫁接物进行修饰而制备，其典型的制备方法可以包括以下步骤：

(a) 将壳聚糖在酶的存在下降解，得到分子量小于 200,000的壳寡糖；

(b)将所述壳寡糖和具有 12~22个碳原子的脂肪酸在交联偶合剂的存在下偶联，得到壳寡糖脂肪酸嫁接物；

(c)将端基取代的聚乙二醇和所述壳寡糖脂肪酸嫁接物偶联，得到所述聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，其中所述聚乙二醇的分子量为 1，000〜 10,000。

在上述的步骤（a) 中，壳聚糖的降解可以采用本领域技术人员公知的方法进行。例如，降解使用的酶可以是纤维素酶。并且，酶与壳聚糖的重量比可以是 0.05~5.0： 100。降解可以在温度为 50~65 t、 pH 值为 4.0~6.0的条件下进行。降解完成后，可以采用本领域技术人员公知的方法进行分离纯化。例如，可以使用超滤膜进行超滤分级，并对得到的滤液进行冷冻干燥，从而得到分子量小于 200,000的低分子量壳寡糖。

在上述的步骤（b) 中，壳聚糖和脂肪酸的偶联可以采用本领域技术人员公知的方法进行。例如，该步骤中使用的交联偶合剂可以是本领域公知的任何交联缩合剂，例如 1-羟基苯并***（简称 HOBT)、苯并*** -1-三 (三甲氨基) -三氟磷酸酯（简称 ΒΟΡ)、 Ν，Ν'-二环己基碳二亚胺（简称 DCC) 等。并且，壳聚糖、脂肪酸和交联偶合剂的摩尔比可以是 1 : 1-50： 1~50。壳聚糖和脂肪酸的偶联可以在 4~90°C的温度下进行。偶联完成后，可以采用本领域技术人员公知的方法进行分离纯化。例如，可以对偶联反应液进行透析纯化，并通过冷冻干燥得到疏水改性的壳寡糖，即壳寡糖脂肪酸嫁接物。

在上述的步骤（c) 中，端基取代的聚乙二醇可以是任何能够通过适当的反应与上述步骤（b) 中得到的壳寡糖脂肪酸嫁接物偶联的端基活化的聚乙二醇，例如，端醛基化聚乙二醇、端羧基化聚乙二醇、端琥珀亚胺化聚乙二醇或端马来酸酐化聚乙二醇等。在步骤（c) 中，端基取代的聚乙二醇和在上述步骤（b) 中得到的壳寡糖脂肪酸嫁接物的投料摩尔比例可以是 1 : 20至 80: 1。一方面，该比例可以优选为 1 : 20至 1 : 1，更优选 1 : 5至 5 : 1，再更优选 1 : 5至 10: 1，进一步优选 1 : 5至 20: 1，最优选 1 : 5至 50: 1。另一方面，该比例可以优选为 50: 1至 80: 1，更优选 20: 1至 80: 1，再更优选 10: 1至 80: 1 , 进一步优选 10: 1至 80: 1，最优选 5 : 1至 80: 1。更优选地，该比例可以是 1 : 1至 50: 1，或 5 : 1至 20: 1，或 10: 1至 20: 1。例如，在步骤（c) 中端基取代的聚乙二醇和壳寡糖脂肪酸嫁接物的投料摩尔比例可以是 1 : 20、 1： 10、 1： 5、 1： 1、 5： 1、 10： 1、 20： 1、 50： 1 或 80: 1或任何其他适当的比例。

在步骤（c) 中，可以通过聚乙二醇端部的活性基团与壳寡糖脂肪酸嫁接物的氨基的席夫反应来进行偶联。例如，在使用端醛基化聚乙二醇的情况下，可以通过聚乙二醇端部的醛基与氨基的席夫反应来进行偶联。如本领域技术人员所公知，可以通过对反应物和水的混合物进行超声以促进溶解，并在室温下搅拌，进行上述席夫反应。反应完成后，可以采用本领域技术人员公知的方法进行分离纯化。例如，可以对偶联反应液进行透析纯化，并通过冷冻干燥得到聚乙二醇修饰的壳寡糖脂肪酸嫁接物。

另外，还可以通过聚乙二醇端部的活性基团与壳寡糖脂肪酸嫁接物的氨基的缩合反应来进行偶联。例如，在使用端琥珀亚胺化聚乙二醇或端马来酸酐化聚乙二醇的情况下，可以通过聚乙二醇端部的琥珀亚胺基或马来酸酐基与氨基的缩合反应来进行偶联。在使用端醛基化聚乙二醇的情况下，反应可以在适量缩合剂的存在下进行，缩合剂的例子可以有 1-羟基苯并***（简称 HOBT)、苯并*** -1-三 (三甲氨基) - 三氟磷酸酯（简称 ΒΟΡ)、 Ν,Ν'-二环己基碳二亚胺（简称 DCC) 等。缩合反应完成后，可以采用本领域技术人员公知的方法进行分离纯化。例如，可以对偶联反应液进行透析纯化，并通过冷冻干燥得到聚乙二醇修饰的壳寡糖脂肪酸嫁接物。

本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物具有在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性。例如， 1.0 mg/mL本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物可以在水中或 pH值为 1-12的缓冲液中形成胶团。通过微粒粒度仪测定，上述胶团的粒径在 20〜500 nm的范围内。通过表面电位测定仪测定，上述胶团的表面电位在 10~50 mV的范围内。通过芘荧光法测定，本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物在 PBS 中的临界胶团浓度为 5~300μ₈/ηι1的范围内。

本发明还提供了包括上述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物作为载体的药物组合物。该组合物可以包括适当的药物活性组分和本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物。

在本发明的药物组合物中，药物活性组分可以是抗肿瘤药物，例如，丝裂霉素 C、阿霉素、紫杉醇、羟基喜树碱等。本发明的抗肿瘤药物组合物能够逆转肿瘤细胞的耐药性。

在本发明的药物组合物中，药物活性组分可以是基因治疗药物，例如，质粒 DNA和 siRNA等。

在本发明的药物组合物中，药物活性组分可以是抗病毒药物。该抗病毒药物的典型例子有抗乙肝病毒药物，例如，阿德福韦、阿昔洛韦、阿德福韦酯、恩替卡韦和更昔洛韦等。

此外，在本发明的药物组合物中，药物活性组分还可以是上述药物之外的其他药物，例如降钙素、干扰素、胰岛素等多肽蛋白质药物；肝素、透明质酸等多糖类药物。

另外，本发明还提供了聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物在制备上述药物组合物中的用途。附图说明

图 1 显示了聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在巨噬细胞 RAW264.7中的定量摄取情况。 (◊): 比较例 1的壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团；（Δ):实施例 2的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团；（X ) 实施例 3的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团；（口）实施例 1的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团。

图 2 显示了聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在肝癌细胞 HepG2中的定量摄取情况。比较例 1的壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团； (Δ): 实施例 2的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团；（X ) 实施例 3的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团；（口）实施例 1的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团。

图 3 显示了聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在永生化正常肝细胞 BRL-3A中的定量摄取情况。 (◊)·· 比较例 1的壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团；（△): 实施例 2的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团； (X ) 实施例 3的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团；（口）实施例 1的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团。

图 4A和 4B分别显示了本发明的包括聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物作为载体的药物组合物以及作为对照的药物溶液对 HBsAg、 HBeAg和 HBV-DNA表达的抑制作用（与 HepG2.2.15细胞共孵育后）。具体实施方式

以下通过实施例的方式对本发明进行详述，但本发明并不局限于这些实施例。

(1 ) 聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物的制备

比较例 1-3

(制备壳寡糖硬脂酸嫁接物）

将壳聚糖（平均分子量 450,000) 6 g加入到 200 mL 1.25 (v/v)的盐酸水溶液中，在 55~60°C条件下搅拌溶解，并稀氨水或稀盐酸调 pH至 5.0。以纤维素酶与壳聚糖比例 0.5: 100 (w/w)加入纤维素酶。控制反应时间 8小时后，将反应产物以 4000 rmin-¹离心 10分钟。上清液用 0.45 μπ微孔滤膜预处理，以不同分子量的超滤膜分级，超滤液冷冻干燥，得到一定分子量的壳寡糖。通过凝胶渗透色谱法，测定壳寡糖的平均分子量为 18,600。

称取以上得到的壳寡糖 5.0 g, 加入 40 mL双蒸水搅拌溶解后，加入碳二亚胺 1.0 g，搅拌溶解。在比较例 1-3中，分别将 0.78 g、 1.5 g 和 2.4 g硬脂酸加至 10 mL甲醇溶液中，超声溶解后，加至上述壳寡糖溶液中，在 O rmin—¹磁力搅拌条件下，控制温度 60°C，反应时间 24h 以上。终反应液置透析袋，双蒸水透析 24h，除去反应副产物。透析液冷冻干燥，得到疏水改性壳寡糖，即壳寡糖硬脂酸嫁接物。

通过本领域公知的凝胶渗透色谱法，测定比较例 1-3的壳寡糖硬脂酸嫁接物的平均分子量分别为 20,000、 21000和 33000。

比较例 4

(制备壳寡糖月桂酸嫁接物）

采用与上述比较例 1中相同的方法制备平均分子量为 18,600的壳寡糖。称取以上得到的壳寡糖 5.0 g，加入 40 mL双蒸水搅拌溶解后，加入碳二亚胺 1.0 g, 搅拌溶解。将 0.5 g月桂酸加至 10 mL甲醇溶液中，超声溶解后，加至上述壳寡糖溶液中，在 AOO rmin—¹磁力搅拌条件下，控制温度 60°C，反应时间 24h以上。终反应液置透析袋，双蒸水透析 24h，除去反应副产物。透析液冷冻干燥，得到疏水改性壳寡糖，即壳寡糖月桂酸嫁接物。

通过本领域公知的凝胶渗透色谱法，测定比较例 4 的壳寡糖硬脂酸嫁接物的平均分子量分别为 20,000。

比较例 5

(制备壳寡糖山嵛酸嫁接物）

采用与上述比较例 1中相同的方法制备平均分子量为 18,600的壳寡糖。称取以上得到的壳寡糖 5.0 g，加入 40 mL双蒸水搅拌溶解后，加入碳二亚胺 1.0 g，搅拌溶解。将 1.0 g山嵛酸加至 10 mL甲醇溶液中，超声溶解后，加至上述壳寡糖溶液中，在 ^O rmin—¹磁力搅拌条件下，控制温度 60°C，反应时间 24h以上。终反应液置透析袋，双蒸水透析 24h，除去反应副产物。透析液冷冻干燥，得到疏水改性壳寡糖，即壳寡糖山嵛酸嫁接物。

通过本领域公知的凝胶渗透色谱法，测定比较例 5 的壳寡糖山嵛酸嫁接物的平均分子量分别为 20,500。

比较例 6

(制备壳寡糖油酸嫁接物）

釆用与上述比较例 1中相同的方法制备平均分子量为 18,600的壳寡糖。称取以上得到的壳寡糖 5.0 g，加入 40 mL双蒸水搅拌溶解后，加入碳二亚胺 1.0 g，搅拌溶解。将 0.8 g油酸加至 10 mL甲醇溶液中，超声溶解后，加至上述壳寡糖溶液中，在 O rmin—¹磁力搅拌条件下，控制温度 60°C，反应时间 24h以上。终反应液置透析袋，双蒸水透析 24h，除去反应副产物。透析液冷冻干燥，得到疏水改性壳寡糖，即壳寡糖油酸嫁接物。

通过本领域公知的凝胶渗透色谱法，测定比较例 5 的壳寡糖油酸嫁接物的平均分子量分别为 20,000。

实施例 1

称取壳寡糖硬脂酸嫁接物 200 mg (分子量为 20,000), 端醛基化聚乙二醇（分子量 2,000) 2.68 mg (端醛基化聚乙二醇和壳寡糖 -硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 1 :5 )，溶于 50 mL去离子水中，探头超声 20次 (400w，工作 2s间歇 3s)，室温下磁力搅拌（400 rpm)过夜，将反应产物置于透析袋中（截留分子量为 7000Da， Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA) 中，透析 48 h，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物固体粉末。

实施例 2

采用与上述实施例 1 基本相同的方法制备聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物，不同之处仅在于所用端醛基化聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 1 :1。

实施例 3

采用与上述实施例 1 基本相同的方法制备聚乙二醇修饰壳寡糖硬 ^ 脂酸嫁接物，不同之处仅在于所用端醛基化聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 5:1。

实施例 4

采用与上述实施例 1 基本相同的方法制备聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物，不同之处仅在于所用端醛基化聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 1 : 10。

实施例 5

采用与上述实施例 1 基本相同的方法制备聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物，不同之处仅在于所用端醛基化聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 1 :20。

实施例 6

采用与上述实施例 1 基本相同的方法制备聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物，不同之处仅在于所用端酸基化聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 80:1。

实施例 7

称取壳寡糖硬脂酸嫁接物 200 mg (分子量为 21,000)，端醛基化聚乙二醇（分子量 2,000) 380 mg (端醛基化聚乙二醇和壳寡糖-硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 20:1 )，溶于 50 mL去离子水中，探头超声 20次 (400w，工作 2s间歇 3s)，室温卞磁力搅拌（400 rpm)过夜，将反应产物置于透析袋中（截留分子量为 7000Da， Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA) 中，透析 48 h，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物固体粉末。

实施例 8

称取壳寡糖硬脂酸嫁接物 200 mg (分子量为 33,000)，端醛基化聚乙二醇（分子量 2,000) 363 mg (端酸基化聚乙二醇和壳寡糖-硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 30:1 )，溶于 50 mL去离子水中，探头超声 20次 (400w，工作 2s间歇 3s)，室温下磁力搅拌（400 rpm)过夜，将反应产物置于透析袋中（截留分子量为 7000Da， Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA) 中，透析 48 h，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物固体粉末。

实施例 9

采用与上述实施例 1 基本相同的方法制备聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物，不同之处仅在于所用端醛基化聚乙二醇的分子量为 1,000，并且端醛基化聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 20: 1 ο

实施例 10

采用与上述实施例 1 基本相同的方法制备聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物，不同之处仅在于所用端醛基化聚乙二醇的分子量为

10,000 , 并且端醛基化聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 2: 1。

实施例 11

称取壳寡糖-硬脂酸嫁接物（分子量为 20,000) 100 mg, 端羧基化聚乙二醇（分子量 2，000) 100 mg (端羧基化聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 10: 1 )，碳二亚胺 lOOmg溶于 50 mL去离子水中，探头超声 20次（400w，工作 2s间歇 3s)， 60°C下磁力搅拌（400 rpm) 48h, 将反应产物置于透析袋中（截留分子量为 7000Da， Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA) 中，透析 48 h，以除去未反应的端羧基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物固体粉末。

实施例 12

称取壳寡糖-硬脂酸嫁接物（分子量为 20,000) 100 mg, 端琥珀酰亚胺化聚乙二醇（分子量 2,000) 100 mg (端琥珀酰亚胺化聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 10:1 )，溶于 50 mL去离子水中，探头超声 20次（400w，工作 2s间歇 3s)，室温下磁力搅拌（400 rpm) 48h, 将反应产物置于透析袋中（截留分子量为 7000Da， Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA) 中，透析 48 h，以除去未反应的端琥珀酰亚胺化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物固体粉末。

实施例 13

称取壳寡糖-硬脂酸嫁接物（分子量为 20,000) 100 mg, 端马来酸酐化 PEG (分子量 2,000) 100 mg (端马来酸酐化聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为 10:1 )，溶于 50 mL去离子水中，探头超声 20次（400w，工作 2s间歇 3s)，室温下磁力搅拌（400 rpm) 48h，将反应产物置于透析袋中（截留分子量为 7000Da， Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA) 中，透析 48 h，以除去未反应的端马来酸酐化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物固体粉末。

实施例 14

称取壳寡糖月桂酸嫁接物 200 mg (分子量为 20,000，比较例 4)，端醛基化聚乙二醇（分子量 2,000) 200 mg (端醛基化聚乙二醇和壳寡糖-月桂酸嫁接物的摩尔比例为 10: 1 )，溶于 50 mL去离子水中，探头超声 20次（400w，工作 2s间歇 3s), 室温下磁力搅拌（400 rpm) 过夜，将反应产物置于透析袋中（截留分子量为 7000Da， Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA) 中，透析 48 h，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰壳寡糖月桂酸嫁接物固体粉末。

实施例 15

称取壳寡糖山嵛酸嫁接物 200 mg (分子量为 20,500，比较例 5)，端醛基化聚乙二醇（分子量 2，000) 194 mg (端醛基化聚乙二醇和壳寡糖-山嵛酸嫁接物的摩尔比例为 10: 1 )，溶于 50 mL去离子水中，探头超声 20次（400w，工作 2s间歇 3s)，室温下磁力搅拌（400 rpm) 过夜，将反应产物置于透析袋中（截留分子量为 7000Da， Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA) 中，透析 48 h，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻千燥，得到聚乙二醇修饰壳寡糖山嵛酸嫁接物固体粉末。

实施例 16

称取壳寡糖油酸嫁接物 200 mg (分子量为 20000，比较例 6)，端醛基化聚乙二醇（分子量 2,000) 200 mg (端醛基化聚乙二醇和壳寡糖 -油酸嫁接物的摩尔比例为 10:1 )，溶于 50 mL去离子水中，探头超声 20次（400w，工作 2s间歇 3s)，室温下磁力搅拌（400 rpm)过夜，将反应产物置于透析袋中（截留分子量为 7000Da， Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA) 中，透析 48 h，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰壳寡糖油酸酸嫁接物固体粉末。 (2)聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物的特性

分别称取上述比较例 1-6 得到的壳寡糖脂肪酸嫁接物和上述实施例 1-16得到的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物 10 mg，加适量双蒸水水浴超声 10 min分散，并定容至 100 mL，得到相应的胶团溶液。使用 Zetasizer 3000HS分析仪，测定溶液中胶团的平均粒径（D) 和表面电位（Zeta)。通过公知的芘荧光法，分别测定未经修饰的或聚乙二醇修饰的壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团在 PBS 中的临界胶团浓度（CMC：)。通过公知的三硝基苯磺酸法，测定聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物中的聚乙二醇（PEG) 接枝率和脂肪酸接枝率，并可得到氨基取代度。实施例 1-16以及比较例 1-6的上述特性均列于下表 1。

表 1

可见，本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物具有在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性。而且，本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物的临界胶团浓度明显低于一般表面活性剂的临界胶团浓度。本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物形成的胶团作为一种药物传输***，具有许多优势：通过调整材料的聚乙二醇和脂肪酸的接枝率、材料的溶解性、 pH值、 Zeta电位等可以控制药物活性组分在生物体内的释放；由于胶团粒径很小，故可穿过血脑屏障、网状内皮组织***，也可促进肠胃黏膜等的良好吸收，到达大尺寸粒子无法通过的部位，达到被动靶向的目的；聚合物胶团骨架对药物的保护和屏蔽作用，可在一定程度上避免药物的分解，保持药物的稳定性，降低药物的毒性；与脂质体相比，聚合物胶团的载药量较高；聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物结构的多样性，使得以聚合物为载体的药物制剂亦多样化，能满足各种使用需求。因此，本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物可以作为载体用于许多种药物组合物的制备。

(3)聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团在不同细胞系中的摄取分别称取 10 mg比较例 1的壳寡糖硬脂酸嫁接物和实施例 1-3的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物，溶于 2 mL 去离子水中，探头超声 20 次（400w，工作 2s 间歇 3s) 后，加入 200 μL 异硫氰基荧光素

(fluorescein isothiocyanate, FITC) 的乙醇溶液 (2.0 mg/ mL) , 在避光与磁力搅拌（400 rpm) 条件下，连续反应 24 h。将终反应液置透析袋

(截留分子量为 7,000， Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA) 中，用去离子水透析 24 h，除去未反应的 FITC。透析液冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物的荧光标记产物。

分别取 RAW264.7细胞（巨噬细胞）、 HepG2细胞（肝癌细胞）、 BRL-3A细胞（永生化正常肝细胞），在含有 10%胎牛血清的 DMEM

( RAW264.7 和 HepG2 ) 和含有 10°/。新生牛血清的 1640 培养液

(BRL-3A) 中连续培养（5% C0₂， 37°C孵箱）。取对数生长期，胰酶消化后用培养液稀释，按每孔 l x lO⁵个细胞的密度接种于 24孔培养板

(Nalge Nune Interational, Naperville, IL, USA)孵箱内培养 24 h。在培养液中加入异硫氰基荧光素标记的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液孵育。胶团浓度控制为 100 g/ml。培养 1.5， 3 , 6， 12, 24 h 后，用 PBS润洗细胞，然后用胰酶消化。收集细胞消化液，探头超声 20次（400w，工作 2s间歇 3s)，得到细胞裂解液。用荧光分光光度计测定细胞裂解液中的荧光强度，计算细胞对聚乙二醇修饰的壳寡糖- 硬脂酸嫁接物胶团的摄取百分数，并用蛋白校正。根据下式计算细胞对胶团的摄取量：

P_t (%)= F_t/F₀ x l00%

其中， P_t是 t时间内细胞对胶团的摄取百分数， F_t和 F_Q分别是 t时间和 0时间的荧光吸收（已通过蛋白校正）。

比较例 1的壳寡糖硬脂酸嫁接物和实施例 1-3的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团对于 RAW264.7细胞、 HepG2细胞和 BRL-3A 细胞的细胞摄取结果见图 1-3。另外，以上各种嫁接物胶团对于 RAW264.7细胞、 HepG2细胞和 BRL-3A细胞的 24小时摄取结果列于下表 2。

表 2

从以上结果可见，相对于未修饰的壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团（比较例 1 )，本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物（实施例 1-3 ) 在相同时间内在巨噬细胞 RAW264.7细胞中的摄取量大为减少。并且，随着聚乙二醇修饰比例（PEG接枝率）的增加，胶团在巨噬细胞中的摄取逐渐减少。

另外，相对于未修饰的壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团（比较例 1 )，本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物（实施例 1-3 )在相同时间内在肿瘤细胞 HepG2以及正常细胞 BRL-3A中的摄取没有显著区别。

因此，可以预期壳寡糖脂肪酸嫁接物经聚乙二醇修饰后可大大减少载体在血液中被巨噬细胞吞噬的可能性，增加载体材料在体内的循环时间，以及载体材料在靶组织中的分布，同时聚乙二醇的修饰不影响载体材料在病灶细胞中的摄取，因此，通过该载体材料可增加病灶细胞内药物的靶向输送。 (4)聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团在抗肿瘤药物组合物中的应用

(4.1 )聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物的应用

(a) 丝裂霉素 C制剂

分别取 10 mg比较例 1中的壳寡糖硬脂酸嫁接物和实施例 1-3中的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物，溶于 1.5mL PBS中，加入浓度为 l mg/mL的丝裂霉素 CPBS溶液 0.5mL，探头超声 20次（400w，工作 2s间歇 3s)，得到负载丝裂霉素 C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液，胶团溶液中嫁接物的浓度为 5 mg/ml, 药物的包封率为 30%左右。

以肝癌细胞 HepG2为模型细胞，负载丝裂霉素 C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的抗肿瘤疗效通过给药***与细胞共孵育后的 1( ₅₍₎值（细胞半数致死率）来评价。细胞存活率试验采用四唑盐比色法 (MTT Assay)测定。细胞于 24孔板预培养 24h贴壁生长后，分别加入不同浓度的丝裂霉素 C溶液（溶剂为 PBS) 和不同浓度的负载丝裂霉素 C 的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团，并设对照孔，每组重复 3次；孵育 48h后，每孔加入 MTT溶液 60 孵育 4h后弃去上清液， PBS溶液冲洗 2次，每孔加入 DMSO 400 L，终止反应。将培养板水平振荡 10 min，用酶联检测仪在 570 nm处测定吸收度，按下式计算细胞存活率：

细胞存活率 (％)=A₅₇o(样品） I A₅₇o(对照) x l00%

其中 A₅₇。(样品)为加入游离药物或载药胶团后的细胞的吸收度， A₅₇。(对照)为空白对照的细胞的吸收度。

另外，作为对照例，使用相同方法测定丝裂霉素 C溶液的 IC₅。值。上述试验结果列于下表 3。

从以上结果可见，相对于丝裂霉素 C溶液（对照例），本发明的负载丝裂霉素 C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团（实施例 1-3 ) 的药效提高了大约 14倍。并且，本发明的负载丝裂霉素 C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团（实施例 1-3 ) 的药效与负载丝裂霉素 C 的壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团（比较例 1 ) 相当，可见，聚乙二醇修饰后不影响载药胶团的抗肿瘤活性。

(b) 阿霉素制剂

取 50 mg实施例 7中制备的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物 (聚乙二醇分子量 2,000，壳寡糖分子量 18,600，聚乙二醇接枝率 8.1%，硬脂酸接枝率 8%)，置 50 mL烧杯中，加入 40 mL蒸馏水（pH为 5.7)，探头超声 20次（500w，工作 2s停 3s)，转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至 50 mL，得 1 mg/mL的胶团溶液。移取该聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液 20mL，加入 2mL浓度为 Img/mL的阿霉素二甲亚砜溶液，室温条件下搅拌 3h后，置于分子量为 3500的透析袋中，蒸馏水透析 24h后，透析原液 5000 rpm离心 5分钟，去除析出的疏水性抗肿瘤药物。上清液过 0.22 μιη的微孔滤膜，即得负载阿霉素的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团。

经测定，聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团的粒径为 55.8nm，表面电位为 31.7 mV。药物包封率为 97.2%。

接下来，进行抗肿瘤药效的评价。具体地，以***细胞 Hda细胞为模型，在 96孔细胞培养板中，每孔加入含 5 X 10³个 Hela细胞的 100 培养液，置 37°C、 5 % C0₂孵箱培养 24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物、聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团溶液和盐酸阿霉素溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常 DMEM 培养液继续培养 48h，每孔加浓度 5 mg/mL噻唑兰（MTT)溶液 20μί，置于 37°C、 5%C0₂ 孵箱继续培养 4h后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜 150 ，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算：细胞抑制率％= (空白对照组吸光度-实验组吸光度) /空白对照组吸光度 X I 00%

经计算，聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物的 IC_5C值为 563.5 g/mL。阿霉素溶液的 IC₅。值为 1.7 g/mL，而聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团溶液的 IC_5Q值为 0.2 g/mL。结果表明，聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物为低毒性材料，而且阿霉素经聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团包载后，在***细胞 Hela细胞上可提高抗肿瘤疗效 8.5 倍。

(c) 紫杉醇（Taxol) 制剂取 50 mg实施例 8中制备的聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物（聚乙二醇分子量 2000，壳寡糖分子量 18,600，聚乙二醇接枝率 8.1%，硬脂酸接枝率 48.3%)，置 50 mL烧杯中，加入 40 mL蒸馏水（pH为 5.7)，探头超声 20次（500w，工作 2s停 3s)，转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至 50 mL，得 1 mg/mL的胶团溶液。移取该聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液 20 mL, 加入 2mL浓度为 Img/mL的紫杉醇二甲亚枫溶液，室温条件下搅拌 3h后，置于分子量为 3，500的透析袋中，蒸馏水透析 24h后，透析原液 5000 rpm离心 5分钟，去除析出的疏水性抗肿瘤药物。上清液过 0.22 μπι的微孔滤膜，即得负载紫杉醇的聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团。

经测定，聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团的粒径为 89.1 nm, 表面电位为 28.7 mV。药物包封率为 99.6%。

接下来，以肿瘤细胞抑制率，评价聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。具体地，以人肺癌细胞 A549细胞为模型，在 96孔细胞培养板中，每孔加入含 5 X 10³个 A549细胞的 100 μL培养液，置 37°C、 5 % C0₂孵箱培养 24h，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物、聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团溶液和紫杉醇溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常 DMEM培养液继续培养 48h，每孔加浓度 5 mg/mL噻唑兰（MTT) 溶液 20μί，置于 37°C、 5%C0₂孵箱继续培养 4h后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜 150 μί，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算：

细胞抑制率％= (空白对照组吸光度-实验组吸光度) / 空白对照组吸光度 X I 00%

经计算，聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物的 IC₅o值为 489.6 g/mL，紫杉醇溶液的 IC₅₍₎值为 3.2 Mg/mL, 而聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团溶液的 IC_5Q值为 0.1 g/mL。结果表明聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物为低毒性材料，紫杉醇经聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团包载后，在人肺癌细胞 A549细胞上可提高抗肿瘤疗效 32倍。

(d) 羟基喜树碱制剂

取 50 mg实施例 7中制备的聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物（聚乙二醇分子量 2，000，壳寡糖分子量 18,600，聚乙二醇接枝率 8.1%，硬脂酸接枝率 8%)，置 50 mL烧杯中，加入 40 mL蒸馏水（pH为 5.7)，探头超声 20次（500w，工作 2s停 3s)，转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至 50 mL, 得 1 mg/mL的胶团溶液。移取该聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液 20 mL, 加入 2 mL浓度 1 mg/mL的羟基喜树碱乙醇溶液，室温条件下搅拌 3h后，置于分子量为 3,500的透析袋中，蒸馏水透析 24h后，透析原液 5000 rpm离心 5分钟，去除析出的疏水性抗肿瘤药物。上清液过 0.22 μηι的微孔滤膜，即得负载羟基喜树碱的聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团。

经测定，聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团的粒径为 72.9 nm, 表面电位为 36.2 mV。药物包封率为 89.4%。

接下来，以肿瘤细胞抑制率，评价聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。具体为：以人肺癌细胞 A549细胞为模型，在 96孔细胞培养板中，每孔加入含 5 X 10³个 A549细胞的 100 μL培养液，置 37°C、 5 % ( 0₂孵箱培养 24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物、聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团溶液和羟基喜树碱注射液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常 DMEM培养液继续培养 48h，每孔加浓度 5 mg/mL噻唑兰（MTT) 溶液 20 μί，置于 37°C、 5%C0₂孵箱继续培养 4h后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜 150 ，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算：

细胞抑制率％= (空白对照组吸光度-实验组吸光度 )/ 空白对照组吸光度 X I 00%

经计算，聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物的 IC₅₍₎值为 496.3 g/mL, 羟基喜树碱注射液的 IC₅。值为 8.6 g/mL, 而聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团溶液的 IC_5Q值为 0.4 ^ig/mL。结果表明，本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物为低毒性材料，羟基喜树碱经聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团包载后，在人肺癌细胞 A549细胞上可提高抗肿瘤疗效 21.5倍。

(4.2)聚乙二醇修饰壳寡糖月桂酸嫁接物的应用

取 50 mg实施例 14中制备的聚乙二醇修饰壳寡糖月桂酸嫁接物，采用与以上（4.1 ) (c) 中相同的方法，制备聚乙二醇修饰壳寡糖月桂酸嫁接物的紫杉醇载药胶团。经测定，聚乙二醇壳寡糖月桂酸嫁接物载药胶团的粒径为 123.7 nm, 表面电位为 31.4mV。药物包封率为 99.3%。

接下来，通过与以上（4.1 ) (c) 中相同的方法，评价聚乙二醇修饰壳寡糖月桂酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。评价结果显示，聚乙二醇修饰壳寡糖月桂酸嫁接物的 IC₅。为 456.1 g/mL，紫杉醇溶液的 IC₅₍₎为 3.2 g/mL，而聚乙二醇修饰壳寡糖月桂酸嫁接物载药胶团溶液的 IC₅。为 0.1 g/mL。结果表明聚乙二醇修饰壳寡糖月桂酸嫁接物为低毒性材料，紫杉醇经聚乙二醇修饰壳寡糖月桂酸嫁接物胶团包载后，在人肺癌细胞 A549细胞上可提高抗肿瘤疗效 32倍。

(4.3)聚乙二醇修饰壳寡糖山嵛酸嫁接物的应用

取 50 mg实施例 15中制备的聚乙二醇修饰壳寡糖山嵛酸嫁接物，采用与以上（4.1 ) (c) 中相同的方法，制备聚乙二醇修饰壳寡糖山嵛酸嫁接物的紫杉醇载药胶团。

经测定，聚乙二醇修饰壳寡糖山嵛酸嫁接物载药胶团的粒径为 86.4 nm, 表面电位为 33.1 mV。药物包封率为 99.8%。

接下来，通过与以上（4.1 ) (c) 中相同的方法，评价聚乙二醇壳寡糖山嵛酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。评价结果显示，聚乙二醇壳寡糖山嵛酸嫁接物的 IC₅₍₎值为 438.8 g/mL,紫杉醇溶液的 IC₅o值为 3.2 g/mL，而聚乙二醇修饰壳寡糖山嵛酸嫁接物载药胶团溶液的 IC₅o 值为 0.2 g/mL。结果表明聚乙二醇修饰壳寡糖山嵛酸嫁接物为低毒性材料，紫杉醇经聚乙二醇壳寡糖山嵛酸嫁接物胶团包载后，在人肺癌细胞 A549细胞上可提高抗肿瘤疗效 16倍。

(4.4)聚乙二醇修饰壳寡糖油酸嫁接物胶团的应用

取 50 mg实施例 16中制备的聚乙二醇修饰壳寡糖油酸嫁接物，采用与以上（4.1 ) (c) 中相同的方法，制备聚乙二醇修饰壳寡糖油酸嫁接物的紫杉醇载药胶团。

经测定，聚乙二醇壳寡糖油酸嫁接物载药胶团的粒径为 109.2 nm，表面电位为 35.2mV。药物包封率为 99.4%。

接下来，通过与以上（4.1 ) (c) 中相同的方法，评价聚乙二醇壳寡糖油酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。评价结果显示，聚乙二醇壳寡糖油酸嫁接物的 IC_5Q值为 413.7 g/mL，紫杉醇溶液的 IC_5Q值为 3.2 g/mL, 而聚乙二醇修饰壳寡糖油酸嫁接物载药胶团溶液的 IC₅₍₎值为 0.1 g/mL。结果表明聚乙二醇修饰壳寡糖油酸嫁接物为低毒性材料，紫杉醇经聚乙二醇修饰壳寡糖油酸嫁接物胶团包载后，在人肺癌细胞 A549细胞上可提高抗肿瘤疗效 32倍。

(5)聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物在逆转肿瘤耐药性中的应用

(a) 阿霉素制剂

通过与以上（4.1 ) (b) 中相同的方法制备负载阿霉素的聚乙二醇' 修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团。

经测定，聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团的粒径为 67.2 nm, 表面电位为 38.3 mV。药物包封率为 96.4%。

接下来，以肿瘤细胞抑制率评价聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效，以及对耐药肿瘤细胞耐药性的逆转效率。

具体地，分别以乳腺癌细胞（MCF-7)及其耐药细胞（MCF-7-adr) 为模型细胞，在 96孔细胞培养板中，每孔加入 100 μL含 5 X 10³个 MCF-7细胞或 MCF-7-adr细胞的培养液，置 37°C、 5 % C0₂孵箱培养 24h。待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团溶液、聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团溶液和盐酸阿霉素溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常 DMEM培养液继续培养 48小时，每孔加 5 mg/mL噻唑兰（MTT) 溶液 20 μί，置于 37°C、 5%C0₂孵箱继续培养 4小时后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜 150 ，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算：

经计算，聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团溶液、盐酸阿霉素溶液，以及聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团溶液，对 MCF-7敏感和耐药细胞的 IC₅。（细胞半数致死率）值总结于下表 4。

表 4

以上结果表明，本发明的聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物为低细胞毒性材料，阿霉素经聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团包封后，可提高 MCF-7敏感细胞约 1倍的抗肿瘤疗效，并可完全逆转 MCF-7耐药细胞的耐药性。

(b) 紫杉醇制剂

通过与以上（4.1 ) (c) 中相同的方法制备负载紫杉醇的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团。

经测定，聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团的粒径为 85.6nm，表面电位为 32.5 mV。药物包封率为 98.5%。

接下来，以肿瘤细胞抑制率，评价聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效，以及对耐药肿瘤细胞耐药性的逆转效率。

具体地，分别以卵巢癌细胞 SKOV-3细胞和耐药细胞 SKOV-3/ST30 细胞为模型，在 96 孔细胞培养板中，每孔加入 ΙΟΟμί 含 5 X 10³个 SKOV-3或 SKOV-3/ST30细胞的培养液，置 37°C、 5 % C0₂孵箱培养 24h，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团溶液和紫杉醇，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常 DMEM培养液继续培养 48小时，每孔加 5 mg/mL噻唑兰（MTT) 溶液 20 μί，置于 37°C、 5%C0₂孵箱继续培养 4h后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜 150 μί，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算：

经计算，紫杉醇和聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物载药胶团溶液对 SKOV-3敏感和耐药细胞的 IC₅o 于下表 5。

以上结果表明，紫杉醇经聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团包封后，可分别提高卵巢癌 SKOV-3敏感细胞 3.5倍的抗肿瘤疗效，并完全逆转卵巢癌耐药细胞的耐药性。 ( 6 )聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物在基因治疗药物组合物中的应甩

(a) 质粒 DNA制剂

负载质粒 DNA的聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团的制备

取 10 mg实施例 8中制备的聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物（聚乙二醇分子量 2,000，壳寡糖分子量 18,600，聚乙二醇接枝率 8.1%，硬脂酸接枝率 48.3%) 精密称定，加 10 mL水溶解，制备成胶团溶液，水浴超声 15分钟，用孔径为 0.22 μιη的微孔滤膜过滤以除菌。用 25 mM 的 Na₂S0₄溶液配制 pEGFP(绿色荧光蛋白质粒 DNA )溶液 (500 g/mL)。将胶团溶液和绿色荧光质粒 DNA溶液按照 N/P 比（壳寡糖的氨基与 DNA的磷酸基的摩尔比） 3混合，产物置室温 25分钟，以进一步促进胶团 /质粒 DNA复合纳米颗粒的形成。

取制备的混悬液适量，并以去离子水适当稀释后，用微粒粒度与表面电位测定仪，分别测定粒径及表面电位。得到的负载质粒 DNA的聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团的理化性质的结果见表 6。

表 6

由以上结果可知，当嫁接物胶团与 pEGFP质粒 DNA形成复合物胶团后，粒径有所增大，说明嫁接物胶团与 pEGFP质粒 DNA形成复合物是通过多个嫁接物胶团对 pEGFP质粒 DNA包裹和密接。

载 -pEGFP基因的嫁接物胶团的细胞转染

A549细胞的培养

取人 II型肺上皮细胞 A549,在含有 10 %小牛血清培养液中连续培养（5 % C0₂、 37°C孵箱）。取对数生长期细胞，胰酶消化后用 DMEM 稀释，按每孔 2 X 10⁵个细胞的密度接种 24孔培养板，孵箱内预培养 24h。

嫁接物 -pEGFP胶团体外转染

转染前 24h内，将 A549细胞按 2 X 10⁵/孔接种于 24孔细胞培养板中，置 37°C、 5%C0₂细胞培养箱中继续培养至 80-90%融合。转染时，吸弃前一天铺制的细胞板中的培养液，用 PBS洗涤两次后，加入脂质体 LipofectamineTM2000、嫁接物 -pEGFP复合纳米粒混悬液以及预先调至 pH 7.4的无血清的 DMEM培养基至终体积 0.5 ml, 继续培养 6h; 换用完全培养基，继续培养至 72h。

转染效率的测定：将培养板取出后，吸去培养液， PBS洗涤 2次，再将细胞从培养板上消化下来，用一定量 PBS分散后，用流式细胞仪测定转染效率。结果显示，嫁接物介导 (N/P58)的细胞转染效率为 14.2%, 脂质体 LipofectamineTM2000的转染效率为 25.1%。

载 -PEDF基因的嫁接物胶团的体内基因治疗

以 PEDF为治疗基因，制备嫁接物载药胶团。采用 QGY肿瘤裸鼠模型动物，以 2.5 mg kg (质粒 DNA)剂量（载体量 7.5 mg/kg)给药 2 次（第 1、 5天）； 21天后，对 QGY肿瘤细胞模型动物的抑瘤率达到 49.04% (阿霉素阳性对照 2 mg/kg，连续给药 7天，抑瘤率 78.85%)。

(b) siRNA制剂

负载 siRNA的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团的制备取 10 mg聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物（聚乙二醇分子量 2，000，壳寡糖分子量 18,000，聚乙二醇接枝率 8.1%, 硬脂酸接枝率 48.3%)，加 10 mL水溶解，制备成胶团溶液，水浴超声 15分钟，用孔径为 0.22 μιη的微孔滤膜过滤以除菌。用 25 mM的 Na₂S0₄溶液配制 siRNA溶液 (500 g/mL)。将胶团溶液和 siRNA溶液溶液按照 N/P比 3混合，产物置室温 25分钟，以进一步促进胶团 /siRAN复合纳米颗粒的形成。

取制备的混悬液适量，并以去离子水适当稀释后，用微粒粒度与表面电位测定仪，分别测定粒径及表面电位。得到的负载 siRNA的聚乙二醇壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团性质的结果见表 7。

(7)聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物在抗病毒药物组合物中的应用聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物抗病毒载药胶团的制备

取实施例 8中制备的 100 mg聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物（聚乙二醇分子量 2,000，壳寡糖分子量 18,600，聚乙二醇接枝率 8.1%，硬脂酸接枝率 48.3%)，置 50 mL烧杯中，加入 90 mL蒸馏水（pH为 5.7)，探头超声 20次（500w，工作 2s停 3s)，转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至 lOO mL, 得 1 mg/mL的胶团溶液。移取该聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液 20 mL，分别加入 1 mL浓度为 1 mg/mL的阿德福韦、阿昔洛韦、阿德福韦酯、恩替卡韦、更昔洛韦水溶液，室温条件下搅拌 3小时后，探头超声 20次（500w，工作 2s停 3s)，过 0.22 μπι的微孔滤膜，即得负载抗病毒药物的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团。

微粒粒度与表面电位测定仪测定载药胶团的粒径与电位，并通过 HPLC法测定药物包封率。得到的负载抗病毒药物的聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团的理化性质的结果见表 8。

表 8

聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团的抗病毒活性

取 HepG2.2.15细胞，在含有约 10%小牛血清的 RPMI 1640培养液中培养（5%C0₂， 37°C孵箱）。当细胞达对数生长期时，即可进行接种。取对数生长期细胞， PBS 润洗后，加入胰酶消化并用培养液稀释，按每孔 l xlO⁴个细胞的密度接种于 24孔培养板内，孵箱内培养 24小时。 24孔培养板内细胞贴壁生长后，弃去旧培养液，使用 PH7.4的缓冲溶液 (PBS)润洗 2遍后分别加入含不同药物浓度的阿德福韦酯溶液和聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物载阿德福韦酯胶团溶液，分别继续培养 2， 4， 6， 8， 10天后，收集培养液，酶免疫测定试剂盒测定细胞培养液中的表面抗原（HBsAg)和 e抗原（HBeAg)含量，即时 PCR定量法测定乙肝病毒 DNA (HBV DNA)含量。四唑盐比色法（MTT Assay)测定细胞生存率。

阿德福韦酯溶液和聚乙二醇壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团与 HepG2.2.15细胞共孵育后，对 HBsAg, HBeAg和 HBV-DNA表达的抑制率变化结果见图 4A和 4B。

结果显示，阿德福韦酯经嫁接物胶束负载后，药物的抗病毒效果显著提高，特别是对乙肝病毒 DNA表达的抑制效果显著，在较低的给药剂量下也能完全抑制乙肝病毒 DNA的表达。

治疗指数 TI是评价抗病毒药物临床应用前景的指标之一。 Ή >2为有效低毒， 1<TI<2为低效有毒， Ή<1为有毒性作用。 TI=TC₅₍₎ / IC₅₍)，其中 TC₅₍₎是药物与病毒感染细胞作用十天后，引起 50%细胞死亡的药物浓度，其可通过本领域公知的四唑盐比色法（MTT Assay)测定； IC_5Q 是药物与病毒感染细胞作用十天后，对 HBsAg、 HbeAg的抑制率为 50% 时的药物浓度，其可通过本领域公知的酶免疫分析法测定。阿德福韦酯的嫁接物胶团给药***对 HBsAg、 HBeAg的治疗指数的结果见表 9。

表 9

结果显示，嫁接物胶团给药***对 HBsAg、 HBeAg的治疗指数均在 2 以上。这表明包括本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物作为载体的抗病毒药物组合物是高效低毒的抗病毒制剂。工业应用性

本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物可以作为药物载体广泛应用于多种药物组合物中，并提高药物活性组分在体内的靶向吸收，并可在一定程度上避免药物的分解，保持药物的稳定性，降低药物的毒副作用。因此，本发明的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物及包括该嫁接物的药物组合物具有广泛的工业应用性。

Claims

权利要求

1. 一种聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，其包括下式（I)所表示的结构单元和下式

( II )

其中，壳寡糖链上的部分自由氨基被具有 12〜22个碳原子的脂肪酸或分子量为 1，000~10，000的聚乙二醇取代，其中 n是所述聚乙二醇的聚合度， R是具有 11~21个碳原子的垸基，

所述脂肪酸的接枝率为 1~50%，且所述聚乙二醇的接枝率为 0·05〜50%。

2. 根据权利要求 1所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，其中所述聚乙二醇的接枝率为 0.5~50%。

3. 根据权利要求 1或 2所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，其中所述脂肪酸的接枝率为 5~50%。

4. 根据权利要求 1-3 中任一项所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，其中所述聚乙二醇的分子量为 2，000~10，000。

5. 根据权利要求 1-4中任一项所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，其中所述脂肪酸是选自月桂酸、豆蔻酸、软脂酸、油酸、硬脂酸、山嵛酸的至少一种。

6. 一种制备如权利要求 1所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物的方法，其包括以下步骤：

(c) 将端基取代的聚乙二醇和所述壳寡糖脂肪酸嫁接物偶联，得到所述聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，其中所述聚乙二醇的分子量为 1,000~10,000。

7. 根据权利要求 6所述的方法，其中在步骤（c) 中，所述端基取代的聚乙二醇和所述壳寡糖脂肪酸嫁接物的投料摩尔比例为 1 :20 至 80:1。

8. 根据权利要求 6所述的方法，其中所述端基取代的聚乙二醇选自端醛基化聚乙二醇、端羧基化聚乙二醇、端琥珀酰亚胺化乙二醇和端马来酸酐化聚乙二醇。

9. 一种药物组合物，其包括药物活性组分和根据权利要求 1所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物。

10. 根据权利要求 9所述的药物组合物，其中所述药物活性组分是抗肿瘤药物，优选地，所述抗肿瘤药物是选自丝裂霉素（、阿霉素、紫杉醇和羟基喜树碱的至少一种。

11. 根据权利要求 10所述的药物组合物，其能够逆转肿瘤细胞的耐药性。

12. 根据权利要求 9所述的药物组合物，其中所述药物活性组分是基因治疗药物，优选地，所述基因治疗药物是质粒 DNA或 siRNA。

13. 根据权利要求 9所述的药物组合物，其中所述药物活性组分是抗病毒药物，优选地，所述抗病毒药物是抗乙肝病毒药物。

14. 根据权利要求 13所述的药物组合物，其中所述抗乙肝病毒药物是选自阿德福韦、阿昔洛韦、阿德福韦酯、恩替卡韦和更昔洛韦的至少一种。

15. 根据权利要求 1 所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物在制备药物组合物中的用途。

16. 根据权利要求 15所述的用途，其中所述药物组合物包括抗肿瘤药物、基因治疗药物或抗病毒药物。