CN107674210B - 三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束及制备与应用 - Google Patents

三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束及制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种三苯基膦‑壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束，采用两步酰胺法，将四羧丁基三苯基膦嫁接至壳聚糖硬脂酸嫁接物，得具有线粒体靶向功能的三苯基膦‑壳聚糖硬脂酸嫁接物，通过透析法包封抗肿瘤药物阿霉素，得线粒体靶向三苯基膦‑壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。本发明提供的载药胶束具备线粒体高效靶向的功能，经过包封的药物阿霉素，可最大限度降低阿霉素在正常组织及非靶部位的泄露，降低其毒副作用，同时准确的将阿霉素大量靶向输送至肿瘤细胞线粒体，增加阿霉素在肿瘤细胞线粒体的浓度，诱导肿瘤细胞凋亡，大幅度提高抗肿瘤疗效。

Description

三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束及制备与应用
技术领域
本发明属制药领域，涉及线粒体靶向给药***的构建，尤其涉及一种线粒体靶向三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的构建及其在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症有六大特征其包括：无限增殖潜力，对生长抑制信号的不敏感，凋亡的抑制，持续的增殖信号，诱导血管的发生，通过毛细血管壁和基底膜的侵袭和转移到其他位置。由于癌细胞是正常细胞突变，具有杀死癌细胞潜力的化学治疗剂也对正常组织产生非特异性毒性。
药物分子主要通过占位效应，作用于病灶细胞的受体、酶、离子通道。近年来，与药理作用相关的信号通路调控，也开始成为药物作用候选位点。病灶细胞的细胞膜，胞浆中的线粒体、内质网，细胞核及核膜等亚细胞结构，是药物分子的主要作用位点。受药物分子自身理化性质的限制，能够进入到作用位点的药物分子数量非常有限，是导致现有药物毒副作用大、疗效低的主因。
药物递释***有可能将药物直接递释到其分子作用位点，提高靶点部位药物浓度，进而大幅度提高疗效。与传统药物递释***相比，针对含药物分子作用位点的亚细胞结构靶向药物递释***已成为解决上述难题的关键。
线粒体功能障碍与癌细胞有很大的相关性，包括其无限增殖潜力，细胞凋亡受损，对抗生长信号的不敏感，增强的合成代谢和减少的自噬。由于线粒体介导细胞凋亡在细胞死亡中扮演重要作用，线粒体是诱导肿瘤细胞凋亡的重要靶点。通过分子靶向技术，将促凋亡药物输送至肿瘤细胞线粒体，可大幅度提高药物疗效与安全性。因此设计触发肿瘤细胞凋亡的线粒体靶向给药***可能是有希望的癌症治疗策略。
充分的亲脂性与离域正电荷结合是线粒体靶向的先决条件。线粒体通过氧化磷酸化途径在其脂双层中保持约-180至-200mV的恒定膜电位。这种高的负膜电位在其他任何细胞器中都不存在的，这为亲脂阳离子提供了选择性积累地条件。包括四羧丁基三苯基膦，三苯基膦，罗丹明123，氟吡啶和蒽环类在内的各种亲脂性阳离子已证实在细胞内递送时，在线粒体中有选择性的积累。
为降低脱靶效应，较好的抑制肿瘤细胞增长，靶向肿瘤细胞线粒体诱导凋亡成为重中之重。将线粒体靶向与胶束给药***结合，一方面诱导肿瘤细胞凋亡，另一方面减少药物本身的副作用，可大幅度提高抗肿瘤疗效。
由两亲嵌段共聚物分子在水性介质中自聚集形成的聚合物胶束，是传递药物的新型纳米给药载体。因其具有一些特有的药物载体性质，如粒径小，在体内、外具有良好的稳定性和生物相容性，药物的控制释放以及生物膜通透性等特性，被认为是一种具有广阔前景的新型靶向给药***。聚合物胶束通过“增强渗透与保留作用”，被动靶向肿瘤部位。
壳聚糖硬脂酸嫁接物是由聚阳离子天然高分子材料壳聚糖经脂肪酸修饰后所得，该嫁接物在水性介质中可通过自组装形成嫁接物胶束，具有快速的肿瘤细胞摄取功能。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的制备方法，其中壳聚糖的分子量为19kDa，脂肪酸的碳链长度为十八碳，壳聚糖的脱乙酰度为95％，氨基取代度为18.0～20.7％，三苯基膦的修饰比例为1.2～3.9％。
其具有代表性的化学结构通式为：
Figure BDA0001414920670000021
通过以下制备步骤实现：
(1)根据发明专利ZL200610051601.0提供的方法合成壳聚糖硬脂酸嫁接物：
取分子量为19kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/ml溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6：1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(2)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取四羧丁基三苯基膦，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/ml溶液。另按碳二亚胺：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为3：1取碳二亚胺，按N-羟基琥珀酰亚胺：四羧丁基三苯基膦摩尔比为3：1取N-羟基琥珀酰亚胺，加入上述溶液中，活化2小时，得反应液1。按氨基聚乙二醇2000：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为1：1取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜中，加入到反应液1中，室温搅拌9小时，得反应液2。于反应液2中加入与氨基聚乙二醇2000摩尔比为1：1的二琥珀酰亚胺，室温搅拌12小时，得反应液3。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为5：1～20：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于少量去离子水中。将反应液3加入壳聚糖硬脂酸嫁接物水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后冷冻干燥，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸(固体粉末)。
合成路线为：
Figure BDA0001414920670000031
合成路线其中，1)为碳二亚胺(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的活化，2)为氨基-聚乙二醇2000的结构式，3)为二琥珀酰亚胺的结构式，4)为壳聚糖硬脂酸的结构式
本发明所使用的壳聚糖脂肪酸嫁接物已为国家发明专利“荧光标记疏水改性壳聚糖聚合物及制备方法和应用”(专利号：ZL2005100507981)；和“表面修饰疏水改性壳聚糖聚合物给药胶团及其制备方法”(专利号：ZL200610051601.0)所涵盖。壳聚糖脂肪酸嫁接物中壳聚糖的分子量19kDa；脂肪酸的碳链长度为十八碳；壳聚糖的脱乙酰度为95％；氨基取代度为16.8％。
本发明的第二个目的是提供一种三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的构建方法，载有的药物为阿霉素，通过以下方案实现：
(1)碱基阿霉素制备：称取盐酸阿霉素200mg，溶于20mL二甲基亚砜中，加入三乙胺，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:2，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时，收集透析袋中产物，于8000r下离心10min，收集沉淀，用水溶解，重复三次以除去残留的盐酸阿霉素，冷冻干燥，得碱基阿霉素；
(2)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备:称取三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为400w，工作2s停3s，制备2mg/mL的嫁接物胶束溶液。另取碱基阿霉素，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按阿霉素:嫁接物的质量比为5％～15％的投药量加入含2mg/mL阿霉素的二甲亚砜溶液，在室温下避光搅拌2小时，反应结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被嫁接物胶束包封的阿霉素，收集上清液，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
本发明的第三个目的是提供一种三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在制备线粒体靶向抗肿瘤药物中的应用。研究显示，三苯基膦修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物具有高效的线粒体靶向能力，且三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束具有显著的抗肿瘤活性。
本发明提供一种三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束，采用两步酰胺法，将四羧丁基三苯基膦嫁接至壳聚糖硬脂酸嫁接物，得具有线粒体靶向功能的三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物，通过透析法包封抗肿瘤药物阿霉素，得线粒体靶向三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。本发明提供的载药胶束具备线粒体高效靶向的功能，经过包封的药物阿霉素，可最大限度降低阿霉素在正常组织及非靶部位的泄露，降低其毒副作用，同时准确的将阿霉素大量靶向输送至肿瘤细胞线粒体，增加阿霉素在肿瘤细胞线粒体的浓度，诱导肿瘤细胞凋亡，大幅度提高抗肿瘤疗效。
附图说明
图1为三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的核磁共振图谱，A为四羧丁基三苯基膦、B为氨基聚乙二醇、C为壳聚糖硬脂酸嫁接物、D为三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物。
图2为三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物在乳腺癌MCF-7细胞上孵育4、12、24小时的定量摄取情况。
图3为三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物在MCF-7细胞线粒体共定位系数分析。
图4为三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束在pH 6.8释放介质中的释放曲线。
图5为三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束在MCF-7细胞上的抗肿瘤药效。
具体实施方式
本发明通过实施例和附图作进一步的说明。
实施例1
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量为450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖50g，加至1500mL体积比1.2％的盐酸水溶液中，55℃温度条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶胀后，缓慢加入重量比为2％的壳聚糖酶溶液，在55℃条件下进行壳聚糖酶解反应，以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5小时，加入重量/体积比为0.3％的活性炭，将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为19.0kDa。将分子量为450kDa的壳聚糖降解为19kDa，并称之为低分子量。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为19.0kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/ml溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6:1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取四羧丁基三苯基膦，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/ml溶液。另按碳二亚胺：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为3：1取碳二亚胺，按N-羟基琥珀酰亚胺：四羧丁基三苯基膦摩尔比为3：1取N-羟基琥珀酰亚胺，加入上述溶液中，活化2小时，得反应液1。按氨基聚乙二醇2000：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为1：1取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜中，加入到反应液1中，室温搅拌9小时，得反应液2。于反应液2中加入与氨基聚乙二醇2000摩尔比为1：1的二琥珀酰亚胺，室温搅拌12小时，得反应液3。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为5：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于少量去离子水中。将反应液3加入壳聚糖硬脂酸嫁接物水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后冷冻干燥，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸固体粉末。
采用三硝基苯磺酸法测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取1～10mg不同重量的壳聚糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，于344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸各6mg，分别溶于3mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算得，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为18.0％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为16.8％，三苯基膦修饰比例为1.2％。
实施例2
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量为450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖50g，加至1500mL体积比1.2％的盐酸水溶液中，55℃温度条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶胀后，缓慢加入重量比为2％的壳聚糖酶溶液，在55℃条件下进行壳聚糖酶解反应，以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5小时，加入重量/体积比为0.3％的活性炭，将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为19.0kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为19.0kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/ml溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6:1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取四羧丁基三苯基膦，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/ml溶液。另按碳二亚胺：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为3：1取碳二亚胺，按N-羟基琥珀酰亚胺：四羧丁基三苯基膦摩尔比为3：1取N-羟基琥珀酰亚胺，加入上述溶液中，活化2小时，得反应液1。按氨基聚乙二醇2000：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为1：1取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜中，加入到反应液1中，室温搅拌9小时，得反应液2。于反应液2中加入与氨基聚乙二醇2000摩尔比为1：1的二琥珀酰亚胺，室温搅拌12小时，得反应液3。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为10：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于少量去离子水中。将反应液3加入壳聚糖硬脂酸嫁接物水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后冷冻干燥，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸固体粉末。
采用三硝基苯磺酸法测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取1～10mg不同重量的壳聚糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，于344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸各6mg，分别溶于3mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算得，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为19.2％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为16.8％，三苯基膦修饰比例为2.4％。
实施例3
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量为450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖50g，加至1500mL体积比1.2％的盐酸水溶液中，55℃温度条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶胀后，缓慢加入重量比为2％的壳聚糖酶溶液，在55℃条件下进行壳聚糖酶解反应，以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5小时，加入重量/体积比为0.3％的活性炭，将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为19.0kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为19.0kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/ml溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6:1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取四羧丁基三苯基膦，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/ml溶液。另按碳二亚胺：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为3：1取碳二亚胺，按N-羟基琥珀酰亚胺：四羧丁基三苯基膦摩尔比为3：1取N-羟基琥珀酰亚胺，加入上述溶液中，活化2小时，得反应液1。按氨基聚乙二醇2000：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为1：1取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜中，加入到反应液1中，室温搅拌9小时，得反应液2。于反应液2中加入与氨基聚乙二醇2000摩尔比为1：1的二琥珀酰亚胺，室温搅拌12小时，得反应液3。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为20：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于少量去离子水中。将反应液3加入壳聚糖硬脂酸嫁接物水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后冷冻干燥，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸固体粉末。
采用三硝基苯磺酸法测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取1～10mg不同重量的壳聚糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，于344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸各6mg，分别溶于3mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算得，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为20.7％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为16.8％，三苯基膦修饰比例为3.9％。
(4)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的理化性质
核磁共振光谱法测定四羧丁基三苯基膦、氨基聚乙二醇、壳聚糖硬脂酸嫁接物、三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物。称取四羧丁基三苯基膦、氨基聚乙二醇、壳聚糖硬脂酸嫁接物、三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物各10mg，分别用0.5mL D2O溶解，用核磁共振1H-NMR测定。结果参见图1，A为四羧丁基三苯基膦、B为氨基聚乙二醇、C为壳聚糖硬脂酸嫁接物、D为三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物。由图可确定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成。
采用芘荧光法测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取芘12mg，精密称定，置于100mL容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液1mL，置于100mL容量瓶中稀释并定容。移取稀释后的芘溶液0.5mL分别置10mL玻璃试管中，50℃挥去丙酮。分别加入不同浓度的壳聚糖硬脂酸嫁接物和三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液5mL，控制芘终浓度为7×10-7mol/L，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，其中Ex＝337nm，Em：I1＝374nm，I3＝384nm，狭缝＝2.5nm和10nm，测定荧光强度，经计算得，壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为29.2μg/mL，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为62.4μg/mL。
分别取三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物和壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶解于蒸馏水，探头超声30次，功率为400w，工作2s，间歇3s，得到1mg/mL的嫁接物胶束溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测得，壳聚糖硬脂酸的粒径为91.2±0.93nm，Zeta电位为16.9±0.40mV。三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为100.4±23.1nm，Zeta电位为23.7±0.95mV。
(5)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取及线粒体共定位
采用糖脂嫁接物荧光标记胶束进行细胞摄取及线粒体共定位研究。以异硫氰基荧光素(FITC)标记壳聚糖硬脂酸嫁接物及三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物。分别取壳聚糖硬脂酸嫁接物或三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体，溶于去离子水中，配制成2mg/mL糖脂嫁接物载体溶液。另取FITC，溶于无水乙醇，配制成2mg/mL溶液。在400rpm条件下，将40μLFITC乙醇溶液，缓慢滴入糖脂嫁接物载体溶液，避光搅拌4小时。随后置于截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析8小时。透析纯化物8000rpm离心10min，取上清液，得到FITC标记的糖脂嫁接物载体。
取生长状态良好的MCF-7细胞，以2×105/mL密度接种于覆有玻片的6孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育4、12、24小时，收集细胞。流式细胞仪定量检测FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取情况。结果见图2。
取生长状态良好的MCF-7细胞，以5×104/mL密度接种于覆有玻片的24孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育24小时，吸弃培养基，加入含线粒体探针的不含酚红DMEM培养液孵育30min，PBS冲洗三遍。盖玻片以4％多聚甲醛避光固定，20min后取出，甘油包埋于载玻片上，封片。激光共聚焦扫描显微镜观察FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取及线粒体共定位情况，用Imaris软件分析共定位系数，结果见图3。
图3所示，经Imaris软件分析计算得，与壳聚糖硬脂酸相比，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物与线粒体的共定位系数为0.49，有显著性差异。结果说明三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有高效的线粒体靶向功能。
(6)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备
碱基阿霉素制备：称取盐酸阿霉素200mg，溶于20mL二甲基亚砜中，加入三乙胺，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:2，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时，收集透析袋中产物，于8000r下离心10min，收集沉淀，用水溶解，重复三次以除去残留的盐酸阿霉素，冷冻干燥，得碱基阿霉素。
称取三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为400w，工作2s停3s，制备2mg/mL的嫁接物胶束溶液。另取碱基阿霉素，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按阿霉素:嫁接物的质量比为5％的投药量加入含2mg/mL阿霉素的二甲亚砜溶液，室温下避光搅拌2小时，反应结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被嫁接物胶束包封的阿霉素，收集上清液，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
利用荧光分光光度法测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束中阿霉素的含量。精密量取0.5mL含1mg/mL阿霉素的二甲基亚砜溶液于10mL容量瓶，用含二甲基亚砜：水＝9:1的溶媒稀释至刻度，混匀，作为母液待用。分别取适量母液，用溶媒进行稀释，获得0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、1、2μg/mL的阿霉素溶液，荧光分光光度仪测定各个浓度溶液的荧光强度，其中Em＝565nm，Ex＝505nm，狭缝＝5.0nm，工作电压＝700V，以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标作图，即得标准曲线。
利用有机溶剂提取-超滤离心法分别测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束和壳聚糖硬脂酸载药胶束中阿霉素载药量和包封率。取10μL的1mg/mL阿霉素载药纳米粒溶液，用含二甲基亚砜：水＝9:1的溶媒稀释至1000μL，水浴超声30分钟，荧光分光光度仪测定样品荧光强度，根据标准曲线计算载药纳米粒溶液中游离药物浓度。另取500μL阿霉素载药纳米粒溶液，置于超滤离心管中，10000rpm离心20分钟，取滤液测定未被包封的游离药物浓度。
包封率＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/阿霉素投药质量×100％
载药量＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量+嫁接物胶束的质量)×100％
经计算得到三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为4.3％，包封率为89.6％；壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为3.9％，包封率为81.5％。
实施例4
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量为450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖50g，加至1500mL体积比1.2％的盐酸水溶液中，55℃温度条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶胀后，缓慢加入重量比为2％的壳聚糖酶溶液，在55℃条件下进行壳聚糖酶解反应，以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5小时，加入重量/体积比为0.3％的活性炭，将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为19.0kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为19.0kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/ml溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6:1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取四羧丁基三苯基膦，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/ml溶液。另按碳二亚胺：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为3：1取碳二亚胺，按N-羟基琥珀酰亚胺：四羧丁基三苯基膦摩尔比为3：1取N-羟基琥珀酰亚胺，加入上述溶液中，活化2小时，得反应液1。按氨基聚乙二醇2000：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为1：1取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜中，加入到反应液1中，室温搅拌9小时，得反应液2。于反应液2中加入与氨基聚乙二醇2000摩尔比为1：1的二琥珀酰亚胺，室温搅拌12小时，得反应液3。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为20：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于少量去离子水中。将反应液3加入壳聚糖硬脂酸嫁接物水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后冷冻干燥，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸固体粉末。
采用三硝基苯磺酸法测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取1～10mg不同重量的壳聚糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，于344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸各6mg，分别溶于3mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算得，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为20.7％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为16.8％，三苯基膦修饰比例为3.9％。
(4)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的理化性质
核磁共振光谱法测定四羧丁基三苯基膦、氨基聚乙二醇、壳聚糖硬脂酸嫁接物、三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物。称取四羧丁基三苯基膦、氨基聚乙二醇、壳聚糖硬脂酸嫁接物、三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物各10mg，分别用0.5mL D2O溶解，用核磁共振1H-NMR测定。结果参见图1，A为四羧丁基三苯基膦、B为氨基聚乙二醇、C为壳聚糖硬脂酸嫁接物、D为三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物。由图可确定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成。
采用芘荧光法测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取芘12mg，精密称定，置于100mL容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液1mL，置于100mL容量瓶中稀释并定容。移取稀释后的芘溶液0.5mL分别置10mL玻璃试管中，50℃挥去丙酮。分别加入不同浓度的壳聚糖硬脂酸嫁接物和三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液5mL，控制芘终浓度为7×10-7mol/L，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，其中Ex＝337nm，Em：I1＝374nm，I3＝384nm，狭缝＝2.5nm和10nm，测定荧光强度，经计算得，壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为29.2μg/mL，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为62.4μg/mL。
分别取三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物和壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶解于蒸馏水，探头超声30次，功率为400w，工作2s，间歇3s，得到1mg/mL的嫁接物胶束溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测得，壳聚糖硬脂酸的粒径为91.2±0.93nm，Zeta电位为16.9±0.40mV。三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为100.4±23.1nm，Zeta电位为23.7±0.95mV。
(5)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取及线粒体共定位
采用糖脂嫁接物荧光标记胶束进行细胞摄取及线粒体共定位研究。以异硫氰基荧光素(FITC)标记壳聚糖硬脂酸嫁接物及三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物。分别取壳聚糖硬脂酸嫁接物或三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体，溶于去离子水中，配制成2mg/mL糖脂嫁接物载体溶液。另取FITC，溶于无水乙醇，配制成2mg/mL溶液。在400rpm条件下，将40μLFITC乙醇溶液，缓慢滴入糖脂嫁接物载体溶液，避光搅拌4小时。随后置于截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析8小时。透析纯化物8000rpm离心10min，取上清液，得到FITC标记的糖脂嫁接物载体。
取生长状态良好的MCF-7细胞，以2×105/mL密度接种于覆有玻片的6孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育4、12、24小时，收集细胞。流式细胞仪定量检测FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取情况。结果见图2。
取生长状态良好的MCF-7细胞，以5×104/mL密度接种于覆有玻片的24孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育24小时，吸弃培养基，加入含线粒体探针的不含酚红DMEM培养液孵育30min，PBS冲洗三遍。盖玻片以4％多聚甲醛避光固定，20min后取出，甘油包埋于载玻片上，封片。激光共聚焦扫描显微镜观察FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取及线粒体共定位情况，用Imaris软件分析共定位系数，结果见图3。
图3所示，经Imaris软件分析计算得，与壳聚糖硬脂酸相比，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物与线粒体的共定位系数为0.49，有显著性差异。结果说明三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有高效的线粒体靶向功能。
(6)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备
碱基阿霉素制备：称取盐酸阿霉素200mg，溶于20mL二甲基亚砜中，加入三乙胺，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:2，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时，收集透析袋中产物，于8000r下离心10min，收集沉淀，用水溶解，重复三次以除去残留的盐酸阿霉素，冷冻干燥，得碱基阿霉素。
称取三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为400w，工作2s停3s，制备2mg/mL的嫁接物胶束溶液。另取碱基阿霉素，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按阿霉素:嫁接物的质量比为10％的投药量加入含2mg/mL阿霉素的二甲亚砜溶液，室温下避光搅拌2小时，反应结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被嫁接物胶束包封的阿霉素，收集上清液，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
利用荧光分光光度法测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束中阿霉素的含量。精密量取0.5mL含1mg/mL阿霉素的二甲基亚砜溶液于10mL容量瓶，用含二甲基亚砜：水＝9:1的溶媒稀释至刻度，混匀，作为母液待用。分别取适量母液，用溶媒进行稀释，获得0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、1、2μg/mL的阿霉素溶液，荧光分光光度仪测定各个浓度溶液的荧光强度，其中Em＝565nm，Ex＝505nm，狭缝＝5.0nm，工作电压＝700V，以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标作图，即得标准曲线。
利用有机溶剂提取-超滤离心法分别测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束和壳聚糖硬脂酸载药胶束中阿霉素载药量和包封率。取10μL的1mg/mL阿霉素载药纳米粒溶液，用含二甲基亚砜：水＝9:1的溶媒稀释至1000μL，水浴超声30分钟，荧光分光光度仪测定样品荧光强度，根据标准曲线计算载药纳米粒溶液中游离药物浓度。另取500μL阿霉素载药纳米粒溶液，置于超滤离心管中，10000rpm离心20分钟，取滤液测定未被包封的游离药物浓度。
包封率＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/阿霉素投药质量×100％
载药量＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量+嫁接物胶束的质量)×100％。
经计算得到三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为8.1％，包封率为87.9％；壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为7.4％，包封率为79.5％。
实施例5
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量为450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖50g，加至1500mL体积比1.2％的盐酸水溶液中，55℃温度条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶胀后，缓慢加入重量比为2％的壳聚糖酶溶液，在55℃条件下进行壳聚糖酶解反应，以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5小时，加入重量/体积比为0.3％的活性炭，将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为19.0kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为19.0kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/ml溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6:1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取四羧丁基三苯基膦，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/ml溶液。另按碳二亚胺：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为3：1取碳二亚胺，按N-羟基琥珀酰亚胺：四羧丁基三苯基膦摩尔比为3：1取N-羟基琥珀酰亚胺，加入上述溶液中，活化2小时，得反应液1。按氨基聚乙二醇2000：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为1：1取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜中，加入到反应液1中，室温搅拌9小时，得反应液2。于反应液2中加入与氨基聚乙二醇2000摩尔比为1：1的二琥珀酰亚胺，室温搅拌12小时，得反应液3。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为20：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于少量去离子水中。将反应液3加入壳聚糖硬脂酸嫁接物水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后冷冻干燥，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸固体粉末。
采用三硝基苯磺酸法测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取1～10mg不同重量的壳聚糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，于344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸各6mg，分别溶于3mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算得，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为20.7％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为16.8％，三苯基膦修饰比例为3.9％。
(4)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的理化性质
核磁共振光谱法测定四羧丁基三苯基膦、氨基聚乙二醇、壳聚糖硬脂酸嫁接物、三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物。称取四羧丁基三苯基膦、氨基聚乙二醇、壳聚糖硬脂酸嫁接物、三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物各10mg，分别用0.5mL D2O溶解，用核磁共振1H-NMR测定。结果参见图1，A为四羧丁基三苯基膦、B为氨基聚乙二醇、C为壳聚糖硬脂酸嫁接物、D为三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物。由图可确定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成。
采用芘荧光法测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取芘12mg，精密称定，置于100mL容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液1mL，置于100mL容量瓶中稀释并定容。移取稀释后的芘溶液0.5mL分别置10mL玻璃试管中，50℃挥去丙酮。分别加入不同浓度的壳聚糖硬脂酸嫁接物和三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液5mL，控制芘终浓度为7×10-7mol/L，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，其中Ex＝337nm，Em：I1＝374nm，I3＝384nm，狭缝＝2.5nm和10nm，测定荧光强度，经计算得，壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为29.2μg/mL，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为62.4μg/mL。分别取三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物和壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶解于蒸馏水，探头超声30次，功率为400w，工作2s，间歇3s，得到1mg/mL的嫁接物胶束溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测得，壳聚糖硬脂酸的粒径为91.2±0.93nm，Zeta电位为16.9±0.40mV。三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为100.4±23.1nm，Zeta电位为23.7±0.95mV。
(5)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取及线粒体共定位
采用糖脂嫁接物荧光标记胶束进行细胞摄取及线粒体共定位研究。以异硫氰基荧光素(FITC)标记壳聚糖硬脂酸嫁接物及三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物。分别取壳聚糖硬脂酸嫁接物或三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体，溶于去离子水中，配制成2mg/mL糖脂嫁接物载体溶液。另取FITC，溶于无水乙醇，配制成2mg/mL溶液。在400rpm条件下，将40μLFITC乙醇溶液，缓慢滴入糖脂嫁接物载体溶液，避光搅拌4小时。随后置于截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析8小时。透析纯化物8000rpm离心10min，取上清液，得到FITC标记的糖脂嫁接物载体。
取生长状态良好的MCF-7细胞，以2×105/mL密度接种于覆有玻片的6孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育4、12、24小时，收集细胞。流式细胞仪定量检测FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取情况。结果见图2。
取生长状态良好的MCF-7细胞，以5×104/mL密度接种于覆有玻片的24孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育24小时，吸弃培养基，加入含线粒体探针的不含酚红DMEM培养液孵育30min，PBS冲洗三遍。盖玻片以4％多聚甲醛避光固定，20min后取出，甘油包埋于载玻片上，封片。激光共聚焦扫描显微镜观察FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取及线粒体共定位情况，用Imaris软件分析共定位系数，结果见图3。
图3所示，经Imaris软件分析计算得，与壳聚糖硬脂酸相比，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物与线粒体的共定位系数为0.49，有显著性差异。结果说明三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有高效的线粒体靶向功能。
(6)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备
碱基阿霉素制备：称取盐酸阿霉素200mg，溶于20mL二甲基亚砜中，加入三乙胺，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:2，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时，收集透析袋中产物，于8000r下离心10min，收集沉淀，用水溶解，重复三次以除去残留的盐酸阿霉素，冷冻干燥，得碱基阿霉素。
称取三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为400w，工作2s停3s，制备2mg/mL的嫁接物胶束溶液。另取碱基阿霉素，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按阿霉素:嫁接物的质量比为15％的投药量加入含2mg/mL阿霉素的二甲亚砜溶液，室温下避光搅拌2小时，反应结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被嫁接物胶束包封的阿霉素，收集上清液，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
利用荧光分光光度法测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束中阿霉素的含量。精密量取0.5mL含1mg/mL阿霉素的二甲基亚砜溶液于10mL容量瓶，用含二甲基亚砜：水＝9:1的溶媒稀释至刻度，混匀，作为母液待用。分别取适量母液，用溶媒进行稀释，获得0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、1、2μg/mL的阿霉素溶液，荧光分光光度仪测定各个浓度溶液的荧光强度，其中Em＝565nm，Ex＝505nm，狭缝＝5.0nm，工作电压＝700V，以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标作图，即得标准曲线。
利用有机溶剂提取-超滤离心法分别测定三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束和壳聚糖硬脂酸载药胶束中阿霉素载药量和包封率。取10μL的1mg/mL阿霉素载药纳米粒溶液，用含二甲基亚砜：水＝9:1的溶媒稀释至1000μL，水浴超声30分钟，荧光分光光度仪测定样品荧光强度，根据标准曲线计算载药纳米粒溶液中游离药物浓度。另取500μL阿霉素载药纳米粒溶液，置于超滤离心管中，10000rpm离心20分钟，取滤液测定未被包封的游离药物浓度。
包封率＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/阿霉素投药质量×100％
载药量＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量+嫁接物胶束的质量)×100％。
经计算得到三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为10.9％，包封率为81.3％；壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为10.2％，包封率为75.8％。
制备1mg/mL的三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束溶液，用微粒粒度与表面电位测定仪分别测定载药胶束的粒径及表面电位。经测定得，壳聚糖硬脂酸载药胶束的粒径为64.2±2.80nm，Zeta电位为11.6±1.48mV。三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束的粒径为67.2±2.82nm，Zeta电位为18.7±1.78mV。
(7)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束体外释放行为的考察分别取浓度为1mg/mL三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束和壳聚糖硬脂酸载药胶束溶液1mL，放入分子截留量为7000的透析袋中，将透析袋放入装有20mL pH6.8磷酸缓冲液的离心管中，置于37℃的摇床中振荡。于不同时间点取样，取样后弃去全部释放介质，加入新鲜介质20mL，连续取样3天。荧光分光光度法测定样品中的药物浓度，其中Ex＝505nm，Em＝565nm，狭缝＝5nm，电压为700v。释放曲线见图4，结果显示，三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束和壳聚糖硬脂酸载药胶束在前12小时内均有较快的释放，随后的药物释放则较缓慢，并持续至72小时。两种载药胶束累计释放量分别为41.9％和32.96％。
(8)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的抗肿瘤药效评价
本发明以肿瘤细胞抑制率IC50值，评价三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束的抗肿瘤药效。细胞存活率试验采用四唑盐比色法测定。以MCF-7细胞为模型，在96孔细胞培养板中，每孔加入200μL含4×103个MCF-7细胞的培养液，置37℃、5％CO2孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的游离药物溶液、壳聚糖硬脂酸载药胶束、三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔；孵育48小时后，每孔加入5mg/mL噻唑兰溶液20μL，继续孵育4小时后弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜200μL，用酶联检测仪测定吸光度，按下式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝实验组吸光度/对照组吸光度×100％
游离药物、壳聚糖硬脂酸载药胶束、三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束对MCF-7细胞的细胞存活率见图5。经计算，游离药物、壳聚糖硬脂酸载药胶束、三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束对MCF-7细胞的IC50值结果分别为4.61μg/mL，3.93μg/mL，1.51μg/mL。研究结果表明三苯基膦-壳聚糖硬脂酸载药胶束对MCF-7细胞的抑制效果最显著，具有较好的抗肿瘤效果。

Claims (3)

1.一种三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的制备方法，其中壳聚糖的分子量为19 kDa，脂肪酸的碳链长度为十八碳，壳聚糖的脱乙酰度为95%，氨基取代度为18.0~20.7%，三苯基膦的修饰比例为1.2~3.9%，其具有代表性的化学结构通式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)合成壳聚糖硬脂酸嫁接物：
取分子量为19 kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20 mg/ml溶液，另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6：1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min，然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12 小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000 Da的透析袋中，蒸馏水透析72 小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物；
(2)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取四羧丁基三苯基膦，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10 mg/ml溶液，另按碳二亚胺：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为3：1取碳二亚胺，按N-羟基琥珀酰亚胺：四羧丁基三苯基膦摩尔比为3：1取N-羟基琥珀酰亚胺，加入上述溶液中，活化2 小时，得反应液1，按氨基聚乙二醇2000：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为1：1取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜中，加入到反应液1中，室温搅拌9小时，得反应液2，于反应液2中加入与氨基聚乙二醇2000摩尔比为1：1的二琥珀酰亚胺，室温搅拌12小时，得反应液3，按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为5：1~20：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于去离子水中，将反应液3加入壳聚糖硬脂酸嫁接物水溶液中，室温搅拌24小时，将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后冷冻干燥，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸；合成路线：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
2.一种三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备方法，其特征在于，该嫁接物包封的药物为阿霉素，通过以下步骤实现：
取2mg/mL权利要求1的三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物胶束溶液，按阿霉素: 嫁接物的质量比为5%~15%，加入含2mg/mL碱基阿霉素的二甲亚砜溶液，在室温下避光搅拌2小时，转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000rpm下低温离心10min，除去未被嫁接物胶束包封的阿霉素，收集上清液，得到目的物三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束；在三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束中，阿霉素的重量百分含量为：4.3~10.9 %。
3.根据权利要求2所述方法制备的三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在制备线粒体靶向抗肿瘤药物中的应用。
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