CN107875399B - 一种替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸纳米粒及制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸，为高分子物质，其中壳寡糖上的氨基被脂肪酸和替米沙坦分子取代。其中壳寡糖脂肪酸分子量为1～20kDa，脱乙酰度为70％～100％，脂肪酸的碳链长度为C12‑C22，氨基取代度为1％～50％。本发明在结构稳定，被动靶向肿瘤作用强，体内稳定性高的壳寡糖脂肪酸结构基础上，再化学修饰小分子量的替米沙坦，不仅增加了药物在体内的稳定性，还通过与肿瘤细胞表面高表达的血管紧张素II受体I相互作用，具备了主动靶向肿瘤细胞能力，可提高抗肿瘤药物在肿瘤治疗的疗效。其代表性的结构通式为：

Description

一种替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸纳米粒及制备与应用

技术领域

本发明属药剂学领域，涉及一种替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸纳米粒和制备方法，以及所合成的替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸纳米粒的应用。

背景技术

肿瘤仍然是威胁人类生活质量的最重要的疾病，尽管化疗、放疗等治疗方法可以延长病人的存活期，但是小分子抗肿瘤药物体内分布缺乏特异性，容易损伤人体正常器官，比如现有的盐酸阿霉素注射液，容易产生严重的心肌退行性病变，骨髓抑制等副作用，限制了临床应用。

包封游离药物的纳米给药***，可以通过增强渗透与截留效应，被动扩散至肿瘤组织，提高抗肿瘤药效。尽管纳米药物在治疗方面提高了病人的生存期，但临床治疗结果并没有如临床前实验结果那样乐观。因此，研究人员利用正常细胞与肿瘤细胞受体表达水平差异，通过在纳米给药***表面修饰靶头如单克隆抗体，多肽，核算，适配体等实现肿瘤病灶部位更多的聚集。

壳聚糖是一类由氨基葡萄糖组成的阳离子聚合物，能够通过碱或酶使甲壳素脱乙酰基而得到。这种天然聚阳离子天然高分子材料具有较好的生物相容性、生物可降解性、安全性。细胞对对脂溶性物质具有较高的摄取能力，但壳寡糖因缺乏亲脂性，不容易透过细胞膜。壳寡糖与亲脂性脂肪酸通过化学嫁接，制备得到的两亲性高分子在水性介质中可通过自聚集的方式形成胶束。该纳米粒由于修饰的脂肪酸在胶束表面形成的次级核，能够被肿瘤细胞快速摄取。该胶束通过物理包裹的方式包载抗肿瘤药物后，可显著提高原有抗肿瘤药物的治疗活性和逆转肿瘤细胞耐药性的功能。

现有研究已经证实血管紧张素II受体I是在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体家族，并且在多种肿瘤细胞膜上高表达，如乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌等。因此血管紧张素II受体I可以成为实现肿瘤微环境靶向的潜在受体。

血管紧张素II受体I抑制剂如替米沙坦已经被FDA批准用来保护高血压病人的脏器。有学者也已经证明替米沙坦是ARBs类药物中与AT₁R亲和力最强的。

将含羧基的替米沙坦与壳寡糖脂肪酸结构中的部分氨基嫁接，制备得到的产物在水中可以通过自聚集形成主动靶向作用的胶束。该胶束的疏水性内核可以增溶疏水性药物分子。由于表面修饰的替米沙坦，药物递送***可以提高细胞的药物摄取，增加抗肿瘤治疗药效。该主动靶向载体材料的应用，可以大幅度提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的摄取以及增加肿瘤部位药物的聚集，最终提高患者的治疗药效。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸纳米粒，其具有代表性的结构通式为：

其中：

a为替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸纳米粒中氨基没有被取代的糖单环百分比，范围为40％～90％，

b为替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸纳米粒中被脂肪酸取代的糖单环百分比，范围为1％～50％，

c为替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸纳米粒中被替米沙坦取代的糖单环百分比，范围为0.3％～2.0％。

本发明的第二个目的是提供替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸的制备方法，通过以下方案实现：

1.反应液制备：称取15mmol～30mmol的替米沙坦，溶于1.5mL N,N-二甲基甲酰胺，加入150mmol N-羟基琥珀酰亚胺和150mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，60℃活化1小时；

2.称取壳寡糖脂肪酸2mmol，溶于4mL水中，探头超声30次，加入上述反应液，并补加4.0mL N，N-二甲基甲酰胺，60℃反应12小时；将反应液置透析袋中，在pH 1.0酸液中透析2天，蒸馏水继续透析2天，冷冻干燥，得到目的产物替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸。

本发明所使用的壳寡糖脂肪酸已为国家发明专利“荧光标记疏水改性壳聚糖聚合物及制备方法和应用”(专利号：ZL2005100507981)和“表面修饰疏水改性壳寡糖聚合物给药胶团及其制备方法”(专利号：ZL200610051601.0)所涵盖。壳寡糖脂肪酸氨基取代度为1％～50％；其中壳寡糖的分子量1～200kDa；脂肪酸的碳链长度为：C12-C22；壳寡糖的脱乙酰度为70％-100％。

本发明的第三个目的是提供替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸在制备抗肿瘤免疫治疗药中的应用，具体是在制备靶向乳腺癌肿瘤细胞的抗肿瘤免疫治疗药中的应用。研究结果表明替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸可以主动靶向乳腺癌肿瘤细胞。

本发明提供的替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸，为高分子物质，其中壳寡糖上的氨基被脂肪酸和替米沙坦分子取代。其中壳寡糖脂肪酸分子量为1～20kDa，脱乙酰度为70％～100％，脂肪酸的碳链长度为C12-C22，氨基取代度为1％～50％。本发明在结构稳定，被动靶向肿瘤作用强，体内稳定性高的壳寡糖脂肪酸结构基础上，再化学修饰小分子量的替米沙坦，不仅增加了药物在体内的稳定性，还通过与肿瘤细胞表面高表达的血管紧张素II受体I相互作用，具备了主动靶向肿瘤细胞能力，可提高抗肿瘤药物在肿瘤治疗的疗效。本发明优势是：在前期的研究工作基础上，利用壳寡糖脂肪酸上游离的丰富的氨基与替米沙坦分子上具有反应活性的羧基在催化剂作用下反应，合成得到替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸递送***，提高了药物的体内稳定性，可提高肿瘤细胞对药物的摄取及抗肿瘤药效。

附图说明

图1为替米沙坦、壳寡糖脂肪酸和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸的核磁共振图谱。

图2为阿霉素、壳寡糖脂肪酸载药胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸载药胶束在不同pH释放介质中阿霉素的释放曲线。

图3为流式细胞仪检测不同键合比例的替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸的载体在乳腺癌细胞上摄取结果。

具体实施方式

本发明通过实施例和附图作进一步的说明。

实施例1

根据国家发明专利“荧光标记疏水改性壳聚糖聚合物及制备方法和应用”(专利号：ZL2005100507981)和“表面修饰疏水改性壳寡糖聚合物给药胶团及其制备方法”(专利号：ZL200610051601.0)，合成制备得到壳寡糖脂肪酸。

采用三硝基苯磺酸法测定壳寡糖硬脂酸的氨基取代度，取1～10mg不同重量的壳寡糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，344nm处测定吸光度，制备标准曲线，取上述壳寡糖脂肪酸4mg、溶于2mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算壳寡糖-硬脂酸的氨基取代度为6.71％；

替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸的制备：

取替米沙坦7.71mg，溶于1.5mL N,N-二甲基甲酰胺，加入17.25mg N-羟基琥珀酰亚胺和28.65mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，60℃活化1小时；

称取壳寡糖脂肪酸40mg，溶于4mL水中，探头超声30次，加入上述反应液全部，并补加4.0mL N,N-二甲基甲酰胺，60℃反应12小时。将反应液置透析袋中，在pH 1.0酸液中透析2天，蒸馏水继续透析2天，冷冻干燥，得到替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸。

分别称取4mg壳寡糖脂肪酸与替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸，加入2mL水，探头超声30次，分别取2mg/mL异硫氰酸荧光素200μl，室温避光搅拌12小时。将反应液置透析袋中，透析1天，离心，得到异硫氰酸荧光素标记的壳寡糖脂肪酸与替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸。

在24孔细胞培养板中，每孔加入1mL含1×10⁵个MCF-7细胞，置37℃、5％CO₂孵箱培养12小时，待细胞完全贴壁后，每孔加入100μl替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸。继续孵育12小时，弃去培养液，用等渗的磷酸盐缓冲液清洗三次，用0.25％胰酶将细胞消化下来，离心获得细胞沉淀，以0.5mL缓冲液重悬细胞沉淀，流式细胞仪检测异硫氰酸荧光素的荧光值。检测结果显示壳寡糖脂肪酸与替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸分别为12.8和22.1。

实施例2

根据国家发明专利“荧光标记疏水改性壳聚糖聚合物及制备方法和应用”(专利号：ZL2005100507981)和“表面修饰疏水改性壳寡糖聚合物给药胶团及其制备方法”(专利号：ZL200610051601.0)，合成制备得到壳寡糖脂肪酸。

采用三硝基苯磺酸法测定壳寡糖硬脂酸的氨基取代度，取1～10mg不同重量的壳寡糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，344nm处测定吸光度，制备标准曲线，取上述壳寡糖脂肪酸4mg溶于2mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算壳寡糖-硬脂酸的氨基取代度为6.71％；

替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸的制备：

取替米沙坦11.56mg，溶于1.5mL N,N-二甲基甲酰胺，加入17.25mg N-羟基琥珀酰亚胺和28.65mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，60℃活化1小时；

称取壳寡糖脂肪酸40mg，溶于4mL水中，探头超声30次，加入上述反应液全部，并补加4.0mL N,N-二甲基甲酰胺，60℃反应12小时。将反应液置透析袋中，在pH 1.0酸液中透析2天，蒸馏水继续透析2天，冷冻干燥，得到替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸产物。

分别称取4mg壳寡糖脂肪酸与替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸，加入2mL水，探头超声30次，分别取2mg/mL异硫氰酸荧光素200μl，室温避光搅拌12小时。将反应液置透析袋中，透析1天，离心，得到异硫氰酸荧光素标记的壳寡糖脂肪酸与替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸。

在24孔细胞培养板中，每孔加入1mL含1×10⁵个MCF-7细胞，置37℃、5％CO₂孵箱培养12小时，待细胞完全贴壁后，每孔加入100μl替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸。继续孵育12小时，弃去培养液，用等渗的磷酸盐缓冲液清洗三次，用0.25％胰酶将细胞消化下来，离心获得细胞沉淀，以0.5mL缓冲液重悬细胞沉淀，流式细胞仪检测异硫氰酸荧光素的荧光值。检测结果显示壳寡糖脂肪酸与替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸分别为12.8和35.8。

实施例3

根据国家发明专利“荧光标记疏水改性壳聚糖聚合物及制备方法和应用”(专利号：ZL2005100507981)和“表面修饰疏水改性壳寡糖聚合物给药胶团及其制备方法”(专利号：ZL200610051601.0)，合成制备得到壳寡糖脂肪酸。

采用三硝基苯磺酸法测定壳寡糖硬脂酸的氨基取代度，取1～10mg不同重量的壳寡糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，34nm处测定吸光度，制备标准曲线，取上述壳寡糖脂肪酸4mg溶于2mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算壳寡糖-硬脂酸的氨基取代度为6.71％。

替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸的制备：

取替米沙坦15.42mg，溶于1.5mL N,N-二甲基甲酰胺，加入17.25mg N-羟基琥珀酰亚胺和28.65mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，60℃活化1小时；

称取壳寡糖脂肪酸40mg，溶于4mL水中，探头超声30次，加入上述反应液全部，并补加4.0mL N,N-二甲基甲酰胺，60℃反应12小时。将反应液置透析袋中，在pH 1.0酸液中透析2天，蒸馏水继续透析2天，冷冻干燥，得到替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸产物。

核磁共振光谱法测定替米沙坦、壳寡糖硬脂酸和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸。称取壳寡糖脂肪酸和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸各5mg，分别用0.5mLD₂O溶解，另取替米沙坦5mg，溶于0.5mLDMSO-d6，用核磁共振¹H-NMR测定，结果参见图1，图中A替米沙坦，B为壳寡糖脂肪酸，C为替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸。

采用芘荧光法测定壳寡糖脂肪酸和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸的临界胶束浓度。精密称定芘12mg，置100mL容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液1mL，置100mL容量瓶中稀释并定容。移取稀释后的芘溶液0.5mL分别置10mL玻璃试管中，50℃挥去丙酮。分别加入不同浓度的壳寡糖脂肪酸和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸溶液5mL，控制芘终浓度为7×10^-7mol/l，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱(EX＝337nm，EM：I₁＝374nm，I₃＝384nm，狭缝＝2.5nm和10nm)，测定荧光强度，并计算临界胶束浓度，分别为48.3μg/mL和16.1μg/mL。

分别精密称取壳寡糖脂肪酸和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸4mg，加入2mL水，探头超声30次，分别加入2mg/mL阿霉素二甲亚砜溶液200μl。磁力搅拌2小时后，置于透析袋透析2天，获得壳寡糖脂肪酸载药胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸载药胶束。

利用荧光分光光度法测定壳寡糖脂肪酸载药胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸载药胶束中阿霉素的含量，阿霉素溶于二甲基亚砜，二甲亚砜稀释配成不同浓度的溶液，制备标准曲线。一定量壳寡糖脂肪酸载药胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸载药胶束溶于二甲亚砜中，测定荧光值，通过标准曲线计算载体中阿霉素含量(重量百分比)分别为8.0％和7.5％。

称取壳寡糖脂肪酸，替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸各10mg，精密称定，溶解于10mL蒸馏水，得到1mg/mL的溶液。探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)。微粒粒度与表面电位分析仪测定壳寡糖脂肪酸胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸胶束的粒径为62.3nm和76.3nm，Zeta电位为16.7mV和35.1mV。

另称取壳寡糖脂肪酸载药胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸载药胶束各10mg，精密称定，溶解于10mL蒸馏水，得到1mg/mL的溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测定壳寡糖脂肪酸载药胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸载的粒径为34.6nm和30.3nm。

壳寡糖脂肪酸载药胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸体外释放行为的考察：

分别取阿霉素浓度为30μg/mL壳寡糖脂肪酸载药胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸载药胶束1mL，放入透析袋(MWCO＝7000)中，将透析袋放入20mL不同pH的磷酸缓冲液(分别为pH 5.0和pH 7.4)中，在37℃的摇床中振荡。于不同时间点取样，取样后弃去全部释放介质，加入新鲜介质20mL，连续取样72小时。荧光分光光度法测定样品中的药物浓度(EX＝505nm，EM＝565nm，狭缝＝5nm)。释放曲线见图2。

壳寡糖脂肪酸载药胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸载药胶束的抗肿瘤药效：

本发明以肿瘤细胞抑制率，评价替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸细胞存活率试验采用四唑盐比色法测定。以乳腺癌细胞MCF-7细胞为模型，在96孔细胞培养板中，每孔加入200μl含2×10³个MCF-7细胞的培养液，置37℃、5％CO₂孵箱培养12小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的阿霉素溶液、壳寡糖脂肪酸载药胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸载药胶束，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔；孵育48小时后，每孔加入5mg/mL噻唑兰溶液20μl，继续孵育4小时后弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜200μl，用酶联检测仪测定570nm处吸光度，按下式计算细胞存活率：

细胞存活率(％)＝实验组吸光度/对照组吸光度×100％

经计算，阿霉素、壳寡糖脂肪酸载药胶束和替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸载药胶束对MCF-7细胞的IC50分别为1.80μg/mL，4.39μg/mL和2.49μg/mL。

分别称取4mg壳寡糖脂肪酸与替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸，加入2mL水，探头超声30次，分别取2mg/mL异硫氰酸荧光素200μl，室温避光搅拌12小时。将反应液置透析袋中，透析1天，离心，得到异硫氰酸荧光素标记的壳寡糖脂肪酸与替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸。

在24孔细胞培养板中，每孔加入1mL含1×10⁵个MCF-7细胞，置37℃、5％CO₂孵箱培养12小时，待细胞完全贴壁后，每孔加入100μl替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸。继续孵育12小时，弃去培养液，用等渗的磷酸盐缓冲液清洗三次，用0.25％胰酶将细胞消化下来，离心获得细胞沉淀，以0.5mL缓冲液重悬细胞沉淀，流式细胞仪检测异硫氰酸荧光素的荧光值。检测结果如图3所示壳寡糖脂肪酸与替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸分别为12.8和53.4。

Claims (2)

1.一种替米沙坦修饰的壳寡糖脂肪酸纳米粒，其特征在于，其代表性的结构通式为：

其中：

a为替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸纳米粒中氨基没有被取代的糖单环百分比，范围为40%~90%，

b为替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸纳米粒中被脂肪酸取代的糖单环百分比，范围为1%~50%，

c为替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸纳米粒中被替米沙坦取代的糖单环百分比，范围为0.3%~2.0%；

所述的替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸通过以下制备方法获得：

（1）反应液制备：取15mmol~30mmol的替米沙坦，溶于1.5mL N,N-二甲基甲酰胺，加入150mmol N-羟基琥珀酰亚胺和150mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，60℃活化1小时；

（2）称取壳寡糖脂肪酸2mmol，溶于4mL水中，探头超声30次，加入上述反应液，并补加4.0mL N，N-二甲基甲酰胺，60℃反应12小时；将反应液置透析袋中，在pH 1.0 酸液中透析2天，蒸馏水继续透析2天，冷冻干燥，得到目的产物替米沙坦修饰壳寡糖脂肪酸。

2.根据权利要求1所述的一种替米沙坦修饰的壳寡糖脂肪酸纳米粒在制备抗肿瘤免疫治疗药中的应用，其特征在于，在制备靶向乳腺癌肿瘤细胞的抗肿瘤免疫治疗药中的应用。

Images