CN101148483A - 叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种叶酸修饰的壳寡糖－硬脂酸嫁接物，具有在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性，1mg/ml的壳寡糖－脂肪酸嫁接物水溶液，可形成粒径为5～1000nm、zeta电位为5～80mV的胶团。叶酸修饰的壳寡糖－硬脂酸嫁接物的临界胶团浓度位于0.001～0.1mg/ml之间，明显低于一般表面活性剂的临界胶团浓度，当胶团遇到体液被稀释时，可以继续保持胶团的结构，表明叶酸修饰的壳寡糖－硬脂酸嫁接物胶团适宜作为药物的载体使用。本发明提供的壳寡糖－硬脂酸嫁接物胶团作为叶酸配体靶向载体在抗肿瘤治疗中的应用。

Description

叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物及制备方法和应用

技术领域

本发明属化合物合成方法，涉及叶酸修饰壳寡糖-硬脂酸嫁接物及其胶团的制备方法，以及壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团作为叶酸配体靶向载体在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术

肿瘤一直是直接威胁人类健康的重大疾病，肿瘤化疗由于药物本身缺乏分子靶向性，因而出现治愈率低、毒副作用巨大等重大治疗问题。通过合适的载体技术，将药物直接靶向病变组织(器官)、细胞是解决癌症化疗治愈率低和毒副作用的重要手段之一。目前国内外的科学家通过载体技术在肿瘤药物的组织(器官)和细胞靶向上取得了一定的进展，但并没有取得突破性的疗效，其本质在于绝大多数抗肿瘤药物的分子作用靶点位于细胞内，因此肿瘤细胞内药物分子作用靶点(亚细胞器)靶向性载体材料技术的研究开发是突破癌症化疗瓶颈的关键。

靶向载体的设计主要包括载体的病灶脏器靶向性，以及在此基础上穿越病灶脏器内的病灶细胞靶向，从而完成针对药物分子靶标的亚细胞器靶向。早期的组织器官靶向，利用微粒的小粒径被动靶向到肝等组织，通过“增强的透过及滞留效应”(enhanced permeability and retention effect)聚集到肿瘤组织等。

当前，研究者利用肿瘤细胞表面某些受体(如叶酸受体)过度表达的特性，将配体修饰载体材料成功应用于肿瘤的靶向治疗。从而达到肿瘤细胞的靶向，提高细胞内的抗肿瘤药物浓度，增强抗肿瘤药物本身的疗效。

近年来，聚合物胶团在药物制剂学、生物医学及高分子领域已经引起了人们广泛的重视。聚合物胶团是由两亲性的嵌段或接枝共聚物在水性介质中自聚形成，具有核-壳结构。其疏水性链段构成胶团的内核，亲水性链段形成胶团的外壳。疏水核可为难溶性药物提供储库的作用；亲水性外膜保持胶团在水性环境中的稳定性，并可进行理化性质修饰以达到特定的目的，如胶团的主动靶向等。

聚合物胶团作为一种药物传输***，有许多优势：通过调整材料的溶解性、pH值、Zeta电位等可以控制药物在生物体内的释放；由于胶团粒径很小，故可穿过血脑屏障、网状内皮组织***，也可促进肠胃黏膜等的良好吸收，到达大尺寸粒子无法通过的部位，达到被动靶向的目的；聚合物胶团骨架对药物的保护和屏蔽作用，可在一定程度上避免药物的分解，保持药物的稳定性，降低药物的毒性；与脂质体相比，聚合物胶团的载药量较高；聚合物材料的多样性，使得以聚合物为载体的药物制剂亦多样化，能满足各种使用需求。

有报道指出，叶酸受体在肿瘤细胞表面过度表达，而正常细胞的表面叶酸受体则很少。基于此在聚合物胶团的亲水外壳上进行叶酸修饰，就可以使其靶向具有较多叶酸受体的肿瘤细胞表面，从而大大增加其抗肿瘤能力，减少毒副作用。

本发明在我们前期的研究工作基础上，利用壳寡糖-硬脂酸嫁接物形成的胶团，进行表面叶酸修饰，合成了具有细胞表面叶酸受体过表达癌细胞靶向性的壳寡糖-硬脂酸嫁接物，并应用于细胞水平的抗肿瘤治疗。

发明内容

本发明的一个目的是提供叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物，其具有代表性的结构通式为：

其中x，y为聚合度；采用的脂肪酸为硬脂酸(n＝16)；壳寡糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70-100％；壳寡糖链上的部分自由氨基被叶酸取代，

本发明的第二个目的是提供壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的叶酸修饰方法，通过以下方案实现：

分别称取壳寡糖-硬脂酸嫁接物200mg和叶酸20mg，加入200ml蒸馏水后探头超声20次使溶解(400w，工作2s，间歇3s)，然后加入碳二亚胺20mg，维持90℃水浴加热，400r·min^-1搅拌5小时后停止加热，待反应产物冷却后将其置于透析袋中(截留分子量为7000Da，杭州华东医药集团)透析48h，以除去水溶性的小分子副产物，然后将透析液经10,000rpm，5min离心后取上清液冷冻干燥，得叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸聚合物固体粉末。

本发明的第三个目的是提供壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团作为叶酸配体靶向载体在抗肿瘤治疗中的应用。

本发明的实验研究结果表明，采用叶酸嫁接的壳寡糖-硬脂酸嫁接物，能对细胞表面叶酸受体表达较多的癌细胞进行选择性地吸附，短时间内大大提高嫁接物进入癌细胞的数量(图2)，而未叶酸嫁接的壳寡糖-硬脂酸嫁接物则表现为对细胞表面叶酸受体的多与少无选择性识别能力(图3)。在细胞抗肿瘤药效学研究结果表明，以叶酸嫁接的壳寡糖-硬脂酸嫁接物为载体包封的抗肿瘤药物，能对细胞表面叶酸受体表达较多的癌细胞具有更强的杀伤能力(图5)，其原因为增强的叶酸受体介导的内吞作用。为了更好的比较叶酸嫁接的壳寡糖-硬脂酸嫁接物载抗肿瘤药物胶团的抗肿瘤效果，我们将其与该抗肿瘤药临床用制剂进行比较，结果表明，我们的载药胶团能产生更强的癌细胞杀伤能力(图6)，分析原因为载药胶团较临床用制剂更能显著增强抗肿瘤药物的细胞内在化(图7)。由于大多数抗肿瘤药物的作用位点位于细胞内，因此增加抗肿瘤药物的细胞内在化将能显著提高其抗肿瘤功效。

本发明所制备得到的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物，具有在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性，1mg/ml的壳寡糖-脂肪酸嫁接物水溶液，可形成粒径为5～1000nm、zeta电位为5～80mV的胶团。叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物的临界胶团浓度位于0.001～0.1mg/ml之间，明显低于一般表面活性剂的临界胶团浓度，当胶团遇到体液被稀释时，可以继续保持胶团的结构，表明叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团适宜作为药物的载体使用。该嫁接物胶团，具有主动靶向肿瘤细胞表面的叶酸受体的功能，大大提高了胶团被细胞摄取的速度和载药胶团的抗肿瘤活性。

附图说明

图1：Hela和A549细胞在同一孔中混合培养的示意图。

图2：FITC标记的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团与A549和Hela细胞共孵育2小时后的荧光倒置显微镜照片。

图3：FITC标记的未采用叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团与A549和Hela细胞共孵育2小时后的荧光倒置显微镜照片。

图4：FITC标记的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团与A549和Hela细胞共孵育6小时后的荧光倒置显微镜照片。

图5：胶团的原子力显微镜照片。

图6：药物从胶团中的释放行为。

图7，载药胶团对不同细胞的抑制率研究。

图8，Taxol的不同细胞药效学研究。

图9：载药胶团与Taxol处理的Hela细胞内药物的累积。

具体实施方式

本发明结合附图和实施里作进一步的说明。

实例一：

1、低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备

取市售分子量为550kDa的壳聚糖(70％脱乙酰度)，在55℃和pH5.0条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶，降解壳聚糖。以粘度法控制壳聚糖的降解程度。所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，使用分子量为10kDa和30kDa的超滤膜进行超滤分级。取分子量介于10kDa和30kDa的超滤液冷冻干燥，得脱乙酰度为70％、分子量54.0kDa的壳寡糖。

2、壳寡糖-脂肪酸嫁接物制备

取上述0.0001mol壳寡糖，溶于100ml蒸馏水中，制备壳寡糖的水溶液，加入0.01mol N-羟基琥珀酰亚胺溶解后，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时；另分别称取0.002mol的硬脂酸，在40℃的条件下，溶于20ml的无水乙醇，加入0.01mol的碳二亚胺，在50℃磁力搅拌的条件下反应1小时。在上述两反应液各反应1小时后，分别将壳寡糖的反应液与硬脂酸的反应液混合，继续在室温、磁力搅拌的条件下反应48小时。终反应液经透析后，冷冻干燥，干燥产物经40℃的无水乙醇洗涤后得到壳寡糖-硬脂酸嫁接物。

采用三硝基苯磺酸法，测定所得壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量的壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2ml的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N盐酸2ml，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述壳寡糖-脂肪酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，测定344nm波长处的吸收值，按标准曲线计算壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为22.1％。

3、壳寡糖-硬脂酸聚合物胶团的叶酸修饰及理化性质的测定别称取壳寡糖-硬脂酸嫁接物200mg和叶酸10mg，加入200ml蒸馏水后探头超声20次使溶解(400w，工作2s，间歇3s)，然后加入碳二亚胺10mg，维持90℃水浴加热，400r·min^-1搅拌5小时后停止加热，待反应产物冷却后将其置于透析袋中(截留分子量为7000Da，杭州华东医药集团)透析48h，以除去水溶性的小分子副产物，然后将透析液经10,000rpm，5min离心后取上清液冷冻干燥，得叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸聚合物固体粉末。

采用芘荧光法测定，叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物的临界胶团浓度。取叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。将1mg/ml的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物溶液稀释成不同浓度的溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘的终浓度为7×10^-7mol·L^-1)，水浴超声(400w，30min)。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度，CMC值为0.017mg/ml。

另取叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制备1mg/ml的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液。Zetasizer 3000HS分析仪测定叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径为106.7nm及Zeta电位为50.5。采用原子力显微镜观察粒子大小与形态(图5)。

4、叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团在两种肿瘤细胞中的摄取比较取0.1g异硫氰基荧光素和0.5g叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定后分别溶解于60％乙醇溶液中。在冰浴、避光与磁力搅拌(400r·min^-1)条件下，将叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物乙醇溶液，滴加到异硫氰基荧光素溶液中，相同条件下继续反应10h。终反应液置透析袋，重蒸水透析24h，除去未反应异硫氰基荧光素。透析液冷冻干燥，得异硫氰基荧光素标记叶酸修饰壳寡糖-硬脂酸嫁接物。

取异硫氰基荧光素标记叶酸修饰壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定。加适量重蒸水，水浴超声10min分散，定容至1000ml，得异硫氰基荧光素标记叶酸修饰壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液。

以人II型肺上皮细胞A549细胞和人子***细胞Hela细胞为模型细胞，在含有约10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养(5％CO₂，37℃孵箱)。当细胞达对数生长期时，即可进行接种。取对数生长期细胞，PBS润洗后，加入胰酶消化并用培养液稀释，按每孔1×10⁵个细胞的密度将两种细胞接种于同一个孔中(中间用一个薄板挡住，参见图1)，孵箱内预培养24小时。在培养液中加入异硫氰基荧光素标记的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液孵育。胶团浓度控制为100μg/ml。培养2h、6h后，用荧光倒置显微镜观察(参见图2～4)。荧光显微镜观察结果显示，在短时间内(2h)，中的荧光要比A549细胞中的荧光亮很多，而且Hela细胞中摄取胶团的细胞数也要比A549细胞多(参见图2)，这主要是因为Hela细胞膜表面的叶酸受体远远多于A549细胞膜表面的叶酸受体。当载体没有进行叶酸修饰时，载体在两者细胞摄取的数量没有显著性差别(参见图3)。但是由于壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团自身就具有快速被细胞所摄取的能力，所以在作用长时间后，叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团在两种细胞上的摄取量不会因为细胞表面的叶酸受体的密度不同而现出明显的差异，参见图4。

5、负载紫杉醇的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的制备分别精密称取叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物100mg和紫杉醇10mg，溶解在DMSO和水(9∶1)混合溶剂中，室温搅拌3小时。然后放入透析袋(截留分子量为7000Da，美国波谱实验室有限公司)内，纯水透析4小时。取出后，5000rpm离心5min，冻干。药物的释放研究结果表明，由于胶团对药物的包裹作用，药物的释放速率较临床用制剂缓慢，参见图6，图中◇：Taxol；△：载药胶团。

6、负载紫杉醇的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的抗肿瘤活性以肺癌A549细胞和Hela细胞为模型细胞，负载紫杉醇的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的抗肿瘤疗效通过给药***与细胞共孵育后的IC₅₀值(细胞的半数致死率)来评价。细胞存活率试验采用四唑盐比色法(MTT Assay)测定。两种细胞分别于24孔板预培养24h细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的紫杉醇溶液(溶剂为Cremophor：无水乙醇1∶1(W/W))和不同浓度的负载紫杉醇的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团，并设对照孔，每组重复3次；孵育48h后，每孔加入MTT溶液60μL孵育4h后弃去上清液，PBS溶液冲洗2次，每孔加入DMSO 500μL，终止反应。将培养板水平振荡10min，用酶联检测仪在570nm处测定吸收度，按(1)式计算细胞存活率：

细胞存活率(％)＝A₅₇₀(样品)/A₅₇₀(对照)×100％    (1)

其中A₅₇₀(样品)为加入混悬液后的细胞的吸收度，A₅₇₀(对照)为空白对照的细胞的吸收度。

所测定的紫杉醇溶液和负载紫杉醇的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团在A549和Hale细胞中的IC50值结果见表1和图7、图8，图7中◇：Hela；口：A549；图8中◇：Hela；口：A549。

表1：紫杉醇溶液和负载紫杉醇的胶团溶液在Hela和A549细胞中的IC50值

细胞系	给药***	IC50(ug/ml)
			HelaA549	紫杉醇溶液(Taxol)负载紫杉醇的胶团紫杉醇溶液(Taxol)负载紫杉醇的胶团	11.00.2687.00.32

负载紫杉醇的胶团与紫杉醇溶液(Taxol)在Hela细胞内随时间的累积量参见图9，图中◇：Taxol；口：载药胶团。

实例二：

1、低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备

取市售分子量为550kDa的壳聚糖(70％脱乙酰度)，在55℃和pH5.0条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶，降解壳聚糖。以粘度法控制壳聚糖的降解程度。所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，使用分子量为10kDa和30kDa的超滤膜进行超滤分级。取分子量介于10kDa和30kDa的超滤液冷冻干燥，得脱乙酰度为70％、分子量54.0kDa的壳寡糖。

2、壳寡糖-脂肪酸嫁接物制备

取上述0.0001mol壳寡糖，溶于100ml蒸馏水中，制备壳寡糖的水溶液，加入0.01mol N-羟基琥珀酰亚胺溶解后，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时；另分别称取0.002mol的硬脂酸，在40℃的条件下，溶于20ml的无水乙醇，加入0.01mol的碳二亚胺，在50℃磁力搅拌的条件下反应1小时。在上述两反应液各反应1小时后，分别将壳寡糖的反应液与硬脂酸的反应液混合，继续在室温、磁力搅拌的条件下反应48小时。终反应液经透析后，冷冻干燥，干燥产物经40℃的无水乙醇洗涤后得到壳寡糖-硬脂酸嫁接物。

采用三硝基苯磺酸法，测定所得壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量的壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2ml的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N盐酸2ml，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述壳寡糖-脂肪酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，测定344nm波长处的吸收值，按标准曲线计算壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为22.1％。

3、壳寡糖-硬脂酸聚合物胶团的叶酸修饰及理化性质的测定

分别称取壳寡糖-硬脂酸嫁接物200mg和叶酸20mg，加入200ml蒸馏水后探头超声20次使溶解(400w，工作2s，间歇3s)，然后加入碳二亚胺20mg，维持90℃水浴加热，400r·min^-1搅拌5小时后停止加热，待反应产物冷却后将其置于透析袋中(截留分子量为7000Da，美国波谱实验室有限公司)透析48h，以除去水溶性的小分子副产物，然后将透析液经10,000rpm，5min离心后取上清液冷冻干燥，得叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸聚合物固体粉末。

采用芘荧光法测定，叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物的临界胶团浓度。取叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。将1mg/ml的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物溶液稀释成不同浓度的溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘的终浓度为7×10^-7mol·L^-1)，水浴超声(400w，30min)。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度，CMC值为0.017mg/ml。

另取叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制备1mg/ml的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液。Zetasizer 3000HS分析仪测定叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径为117.2nm及Zeta电位为39.8。

实例三：

1、低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备

取市售分子量为550kDa的壳聚糖(70％脱乙酰度)，在55℃和pH5.0条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶，降解壳聚糖。以粘度法控制壳聚糖的降解程度。所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，使用分子量为10kDa和30kDa的超滤膜进行超滤分级。取分子量介于10kDa和30kDa的超滤液冷冻干燥，得脱乙酰度为70％、分子量54.0kDa的壳寡糖。

2、壳寡糖-脂肪酸嫁接物制备

取上述0.0001mol壳寡糖，溶于100ml蒸馏水中，制备壳寡糖的水溶液，加入0.01mol N-羟基琥珀酰亚胺溶解后，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时；另分别称取0.002mol的硬脂酸，在40℃的条件下，溶于20ml的无水乙醇，加入0.01mol的碳二亚胺，在50℃磁力搅拌的条件下反应1小时。在上述两反应液各反应1小时后，分别将壳寡糖的反应液与硬脂酸的反应液混合，继续在室温、磁力搅拌的条件下反应48小时。终反应液经透析后，冷冻干燥，干燥产物经40℃的无水乙醇洗涤后得到壳寡糖-硬脂酸嫁接物。

采用三硝基苯磺酸法，测定所得壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量的壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2ml的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N盐酸2ml，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述壳寡糖-脂肪酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，测定344nm波长处的吸收值，按标准曲线计算壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为22.1％。

3、壳寡糖-硬脂酸聚合物胶团的叶酸修饰及理化性质的测定分别称取壳寡糖-硬脂酸嫁接物200mg和叶酸30mg，加入200ml蒸馏水后探头超声20次使溶解(400w，工作2s，间歇3s)，然后加入碳二亚胺30mg，维持90℃水浴加热，400r·min^-1搅拌5小时后停止加热，待反应产物冷却后将其置于透析袋中(截留分子量为7000Da，美国波谱实验室有限公司)透析48h，以除去水溶性的小分子副产物，然后将透析液经10,000rpm，5min离心后取上清液冷冻干燥，得叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸聚合物固体粉末。

采用芘荧光法测定，叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物的临界胶团浓度。取叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。将1mg/ml的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物溶液稀释成不同浓度的溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘的终浓度为7×10^-7mol·L^-1)，水浴超声(400w，30min)。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度，CMC值为0.017mg/ml。

另取叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制备1mg/ml的叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液。Zetasizer 3000HS分析仪测定叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径为124.9nm及Zeta电位为25.2。

Claims (4)

1.一种叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物，其特征是：具有代表性的结构通式为：

其中x，y为聚合度，采用的脂肪酸为n＝16的硬脂酸，壳寡糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70-100％，壳寡糖链上的部分自由氨基被叶酸取代。

2.根据权利要求1所述叶酸修饰的壳寡糖-脂肪酸嫁接物，其特征是：具有在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性，1mg/ml的壳寡糖-脂肪酸嫁接物水溶液可形成粒径为5～1000nm、zeta电位为5～80mV的胶团。叶酸修饰的壳寡糖-脂肪酸嫁接物的临界胶团浓度位于0.001～0.1mg/ml之间。

3.根据权利要求1所述叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物的制备方法，其特征是由叶酸的羧基与壳寡糖的氨基的耦合反应合成得到，具体制备方法为：

分别称取壳寡糖-硬脂酸嫁接物200mg和叶酸20mg，加入200ml蒸馏水后探头超声20次使溶解，超声条件为：400w、工作2秒、间歇3秒，然后加入碳二亚胺20mg，维持90℃水浴加热，400r·min^-1搅拌5小时后停止加热，待反应产物冷却后将其置于透析袋中，透析48小时，然后将透析液经10,000rpm，5分钟离心后取上清液冷冻干燥，得叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物固体粉末。

4.根据权利要求1所述叶酸修饰的壳寡糖-脂肪酸嫁接物作为叶酸配体靶向载体在制备抗肿瘤药物中应用。

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