CN107880152A - angiopep‑2修饰的还原响应型壳聚糖‑硬脂胺嫁接物及制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种angiopep‑2修饰的还原响应型壳聚糖硬脂胺嫁接物，在还原响应型壳聚糖‑硬脂胺嫁接物表面修饰angiopep‑2，其临界胶束浓度位于10～150μg/mL，在水性介质中可自聚集形成粒径为30～300nm、表面电位为10～30mV。研究表明，angiopep‑2修饰的还原响应型壳聚糖‑硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束可借助正负电荷吸附作用与脑部angiopep‑2受体作用跨过病理性血脑屏障，二级靶向脑胶质瘤，表明angiopep‑2修饰的还原响应型壳聚糖‑硬脂胺嫁接物可作为脑胶质瘤靶向药物载体，在制备抗恶性脑胶质瘤药物中应用。其结构通式为：

Description

angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物及制备 和应用
技术领域
本发明属于化合物合成方法，具体涉及angiopep-2修饰的壳聚糖-硬脂胺嫁接物和制备方法，以及在制备抗恶性脑胶质瘤治疗中的脑靶向载体中的应用。
技术背景
脑是人体的重要器官，中枢神经***疾病(老年性痴呆、帕金森病)、脑血管病变、肥胖症和脑肿瘤等疾病的发生都与脑组织的病变息息相关。血脑屏障的存在阻碍了用于脑部疾病诊断和治疗药物向脑内的递送；约有98％的小分子药物和几乎100％的大分子药物,包括蛋白、多肽和基因药物无法通过外周给药的方式直接递送入脑,这成为了实现脑部疾病诊断和治疗的阻碍因素。
由于肿瘤细胞的大量增殖、代谢旺盛，肿瘤细胞存在大量的还原型谷胱甘肽，其浓度是正常细胞内环境浓度的7～10倍。与传统的药物递释***相比，环境响应型纳米给药***可以特异性地响应物理、化学、生物等内源性或外源性刺激，在病灶位置响应环境条件，触发释放药物，并且在体循环或正常细胞保持稳定，减少药物在非病灶位点的泄露，降低药物相关的毒副作用。其中，氧化还原型的给药***设计已经成为近年来药剂学研究领域的热点之一。
理想的脑靶向纳米给药材料应满足低毒、生物相容性好及生物可降解、控制药物释放、避免网状内皮***识别以及良好的穿透血脑屏障等特点。低分子量壳聚糖具有毒性低、生物可降解、高亲水性等优点，用硬脂胺将壳聚糖进行疏水性修饰，以二硫键为链桥构建还原响应型壳聚糖-硬脂胺纳米载体，明显提高肿瘤组织中药物递释***的药物释放速率。此外，angiopep-2是aprotinin衍生的多肽，它可以特异性地靶向低密度脂蛋白受体相关蛋白1。低密度脂蛋白受体相关蛋白1在血脑屏障和脑胶质瘤细胞都有高表达，因此，将angiopep-2修饰于还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物表面，可实现血脑屏障和脑胶质瘤的双重靶向作用。此外，脑部疾病的存在会不同程度地破坏血脑屏障的结构和功能，血脑屏障的完整性和通透性发生改变。血脑屏障的病理性渗漏可以进一步促进angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物给药***的脑部转运，增强药物对脑胶质瘤的治疗效果。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物，其具有代表性的结构通式如下：
N＝100‐1000
其中，壳聚糖的分子量为5～100kDa，脱乙酰度为70～95％，壳聚糖上的游离氨基部分被硬脂胺和angiopep-2取代。
1mg/mL的angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物在水性介质中可以自聚集形成胶束，其粒径为30～300nm，表面电位为10～30mV，临界胶束浓度介于10～150μg/mL之间。
本发明的第二个目的是提供所述angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的制备方法，具体通过以下步骤实现：
(1)取angiopep-2和二碳酸二叔丁酯，溶于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺溶剂中，室温避光搅拌12小时；然后加入碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，活化angiopep-2链的游离羧基，室温搅拌1.5小时，随后加入聚乙二醇，室温避光搅拌24小时，接着加入N,N-二琥珀酰亚胺继续搅拌9小时(angiopep-2游离羧基：二碳酸二叔丁酯：碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺：聚乙二醇：N,N-二琥珀酰亚胺＝1：1～1.5：2～5：2～5：1～3：1～1.3，摩尔比)。以上所有试剂均溶解于二甲基亚砜/二甲基甲酰胺溶剂，形成有机相。
(2)取还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉末，溶于去离子水，得到终浓度为5mg/mL的胶束溶液，最后缓慢滴加步骤(1)的有机相到水相中，室温避光搅拌24小时，反应结束后用12mol/L浓盐酸调节反应体系的pH 1～2，继续搅拌2小时，最后用氢氧化钠将体系的pH调节至中性(angiopep-2：还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物＝1：1.5～8，质量比)。
(3)将步骤(2)中反应产物转移至透析袋中，去离子水透析48小时，透析液冷冻干燥即可得到angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉，核磁共振氢谱确定嫁接物结构如图1所示。
本发明的第三个目的是提供angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物在制备抗恶性脑胶质瘤药物的脑靶向载体中的应用。
本发明的研究实验结果表明，angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物能选择性地吸附于低密度脂蛋白受体相关蛋白1表达较多的脑微血管内皮细胞和脑胶质瘤细胞，短时间内大大提高嫁接物载抗肿瘤药物胶束穿透血脑屏障及进入脑胶质瘤细胞的数量。而未经angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载抗肿瘤药物胶束对细胞表面低密度脂蛋白受体相关蛋白1的多少无选择性识别能力。angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载抗肿瘤药物胶束在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中72小时的累积药物释放量为46.9％，而angiopep-2修饰的壳聚糖-硬脂酸嫁接物载抗肿瘤药物胶束累积药物释放量仅为25.3％。当磷酸盐缓冲液中还原型谷胱甘肽浓度达到10mM时，angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载抗肿瘤药物胶束中药物释放效率大大提高，在72小时的累积药物释放量为80.6％(图2)。表明angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物适宜作为脑胶质瘤靶向药物载体使用。
相同时间下，angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载抗肿瘤药物胶束在高级脑胶质瘤U87MG细胞(图5)内的摄取更强、更快。在细胞水平抗肿瘤药效学研究结果表明，angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束能对细胞表面低密度脂蛋白受体相关蛋白1表达较多的高级脑胶质瘤U87MG细胞(图3)具有更强的致死效率，其原因为增强的低密度脂蛋白受体相关蛋白1介导的细胞内吞作用及还原型谷胱甘肽响应的药物快速释放作用。此外，angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载抗肿瘤药物胶束在肿瘤组织的分布明显强于未经angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载抗肿瘤药物胶束。表明angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物适宜作为脑胶质瘤靶向药物载体使用。
本发明的有益之处是：angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物具有主动靶向血脑屏障及脑胶质瘤的功能。angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载抗肿瘤药物胶束可借助静电吸附作用及低密度脂蛋白受体相关蛋白1介导的途径穿过病理性血脑屏障，二级靶向作用于低密度脂蛋白受体相关蛋白1高表达的低级/高级脑胶质瘤。对比已有的脑靶向载体，angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物可以选择性响应肿瘤组织及肿瘤细胞高浓度还原型谷胱甘肽快速释放药物，增强肿瘤组织抗肿瘤药物的蓄积浓度，减少正常组织的非特异性分布及药物释放，最终实现恶性脑胶质瘤的高效治疗。本发明在前期研究工作的基础上，在还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物表面修饰angiopep-2，构建具有血脑屏障和脑胶质瘤双重靶向功能的药物载体，并且应用于细胞水平和动物水平的抗恶性脑胶质瘤治疗。
附图说明
图1：angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的核磁共振氢谱。
图2：angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束体外释放曲线。
图3：angiopep-2修饰/未修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束于恶性脑胶质瘤U87MG细胞的细胞毒性。
图4：angiopep-2修饰/未修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物对恶性脑胶质瘤U87MG细胞的细胞毒性。
图5：angiopep-2修饰/未修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束与恶性脑胶质瘤U87MG细胞共孵育1小时、4小时、12小时的荧光共聚焦显微镜照片。
图6：angiopep-2修饰/未修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束于原位恶性脑胶质瘤组织分布。
具体实施方案
本发明结合附图和实施例作进一步说明
实施例一：
1.还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定硬脂胺230.5mg、3,3’-二硫代二丙酸179.9mg、4-二甲氨基吡啶31.4mg、二环己基碳二亚胺528.7mg溶于40.0mL无水二甲基亚砜中，氮气保护,60℃水浴加热搅拌，反应18小时，趁热抽滤，滤液中加入984.5mg N-羟基琥珀酰亚胺和1639.9mg碳二亚胺,60℃水浴加热搅拌活化30分钟。活化结束后，将此反应体系加入到60℃预热的0.5g壳聚糖水溶液中，60℃条件下水浴加热继续搅拌8小时，反应结束后，将反应体系转移至透析袋中，去离子水透析48小时，除去水溶性杂质。透析结束后，将透析液离心(10000转/分钟，离心10分钟)除去水不溶性杂质。将上清进行冷冻干燥，冻干固体分散于适量无水乙醇中，醇洗三遍，除去游离的硬脂胺及其他脂溶性杂质，滤饼复溶于适量去离子水中，冷冻干燥后得到还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物。
2.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定10mg angiopep-2和11.1mg二碳酸二叔丁酯，溶于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，室温避光搅拌12小时；然后加入2.5mg碳二亚胺和1.5mg N-羟基琥珀酰亚胺活化多肽链上游离羧基，室温搅拌1.5小时，随后加入8.69mg聚乙二醇，室温避光搅拌24小时；接着加入1.113mg N,N-二琥珀酰亚胺继续搅拌9小时。以上所有试剂均溶解于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，形成有机反应体系。精密称定80mg还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉末，溶于去离子水，得到终浓度为5mg/mL的胶束溶液。最后将上述反应的有机相缓慢滴加到水相中，室温避光搅24小时。反应结束后用浓盐酸调节反应体系的pH 1～2，继续搅拌2小时；最后用氢氧化钠将体系的pH调节至中性。反应产物转移至透析袋中，去离子水透析48小时，透析液冷冻干燥即可得到angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉。其核磁结构如图1所示，angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物氢谱图中可观察到6.7ppm、7.0ppm和7.2ppm处的质子峰，且在3.4-3.6ppm之间可观察到强烈的聚乙二醇上亚甲基信号峰，说明angiopep-2成功连接于还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物上。经测定，1mg/mL的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物胶束、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物胶束的粒径、表面电位、临界胶束浓度分别为125.8±6.5nm、27.3±0.3mV、76.3μg/mL和137.0±3.1nm、24.1±0.2mV、90.8μg/mL。
3.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束的制备
取盐酸阿霉素100mg，精密称定，溶于适量二甲亚枫，以摩尔比1:2加入适量三乙胺，室温下避光搅拌过夜。终止反应，将反应体系转移至透析袋中，去离子水透析24小时，除去未反应的三乙胺及盐酸阿霉。8000转/分钟离心10分钟，去离子水离清洗沉淀三遍，沉淀复溶于适量去离子水中，冷冻干燥，得到碱基化的阿霉素(简称阿霉素)。取10mg阿霉素，精密称定，于二甲亚枫中溶解成2.0mg/mL的阿霉素储备液，备用。按照5％～50％的投药量，边搅拌边向浓度为2.0mg/mL的angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物胶束溶液中加入阿霉素储备液，室温下避光搅拌2小时，反应结束后，将反应液转移至透析袋中，去离子水透析24小时，透析液定容，8000转/分钟离心10分钟，除去游离的阿霉素，取上清液即为angiopep-2靶向修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束。
4.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束体外释放
取1.0mL阿霉素浓度为1.0mg/mL的载药纳米粒溶液，置于透析袋中，透析袋置于释放管内，向其中加入20mL pH 7.4的PBS溶液，37℃、60转/分钟恒温振荡水浴箱中振荡。选择不同的时刻点取样，每次取样后将全部释放介质换成新的释放介质，荧光分光光度仪测定样品中阿霉素的浓度，即可得出阿霉素累积释放量和释放百分率。
pH 7.4条件下，还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物/阿霉素胶束中药物的累积释放量可达53.0％，Angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物/阿霉素胶束中药物累积释放量可达46.9％(图2)。
5.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载药胶束对高级脑胶质瘤U87MG细胞的细胞毒性
以U87MG脑胶质瘤细胞作为高级脑胶质瘤模型细胞，采用四唑蓝比色法评价还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束对肿瘤细胞的生长抑制效果。根据实施例一中方法3制备得到还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束和angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束，以1×104个/孔的密度，取200μL生长良好的U87MG脑胶质瘤细胞悬液接种于96孔板中。在37℃，5％二氧化碳条件下孵育至贴壁。然后向其中加入不同浓度的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束和angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束，以未处理组作为空白对照，每组重复3次。继续孵育48小时，然后向每孔加入5mg/mL的噻唑蓝20μL，继续孵育4小时，弃去培养基，向每孔中加入200μL二甲基亚砜，将96孔板置于恒温振荡箱中振荡15分钟。用酶标仪测量570nm处吸光度值。根据以下公式计算细胞抑制率：
细胞抑制率(％)＝(1-实验组的吸光度/对照组的吸光度值)×100％
其中还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束和angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束对U87MG细胞的IC50分别为2.94±0.08μg/mL、0.94±0.04μg/mL(图3)。
6.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物对高级脑胶质瘤U87MG细胞的细胞毒性
以U87MG脑胶质瘤细胞作为高级脑胶质瘤模型细胞，根据实施例一方法6中所述操作，测得还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物对高级脑胶质瘤U87MG细胞的IC50均介于600～800μg/mL(图4)。
7.angiopep-2靶向修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载药胶束在高级脑胶质瘤U87MG细胞的经时摄取
选用U87MG脑胶质瘤细胞作为高级脑胶质瘤模型细胞，考察细胞对还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束的摄取能力。按照2×104/孔的密度将U87MG脑胶质瘤细胞接种于覆盖有小玻片的24孔板中，37℃、5％二氧化碳孵育24小时，细胞贴壁后，载药胶束溶液，阿霉素终浓度为0.5μg/mL。实验终止前30分钟向每孔中加入0.5mg/mL核染试剂20μL。实验终止后，磷酸盐缓冲液洗涤细胞3遍，4％多聚甲醛固定10-15分钟，共聚焦荧光显微镜观察载药胶束胶束在细胞中的经时摄取情况。结果如图5所示，由于angiopep-2介导的转胞吞增强作用，相同摄取时间，angiopep-2靶向修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束在U87MG胶质瘤细胞摄取数量更多，胞内药物荧光信号也更强。
8.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束在高级脑胶质瘤U87MG原位肿瘤组织分布
选择雄性BABL/c裸鼠(20±2g)为模型动物构建U87MG原位脑胶质瘤模型，根据实施例一方法3制备angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束，按照2mg/kg的阿霉素给药剂量尾静脉注射。给药12小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，将组织冷冻切片，并且于共聚焦观察肿瘤组织药物分布，结果如图6所示。angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束在肿瘤组织的分布明显强于非angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物载阿霉素胶束。
实施例二：
1.还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定硬脂胺230.5mg、3,3’-二硫代二丙酸179.9mg、4-二甲氨基吡啶31.4mg、二环己基碳二亚胺528.7mg溶于40.0mL无水二甲基亚砜中，氮气保护,60℃水浴加热搅拌，反应18小时，趁热抽滤，滤液中加入984.5mg N-羟基琥珀酰亚胺和1639.9mg碳二亚胺,60℃水浴加热搅拌活化30分钟。活化结束后，将此反应体系加入到60℃预热的0.5g壳聚糖水溶液中，60℃条件下水浴加热继续搅拌8小时，反应结束后，将反应体系转移至透析袋中，去离子水透析48小时，除去水溶性杂质。透析结束后，将透析液离心(10000转/分钟，10分钟)除去水不溶性杂质。将上清进行冷冻干燥，冻干固体分散于适量无水乙醇中，醇洗三遍，除去游离的硬脂胺及其他脂溶性杂质，滤饼复溶于适量去离子水中，冷冻干燥后得到还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物。
2.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定10mg angiopep-2和11.1mg二碳酸二叔丁酯，溶于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，室温避光搅拌12小时；然后加入2.5mg碳二亚胺和1.5mg N-羟基琥珀酰亚胺活化多肽链上游离羧基，室温搅拌1.5小时，随后加入8.69mg聚乙二醇，室温避光搅拌24小时；接着加入0.856mg N,N-二琥珀酰亚胺继续搅拌9小时。以上所有试剂均溶解于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，形成有机反应体系。精密称定40mg还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉末，溶于去离子水，得到终浓度为5mg/mL的胶束溶液。最后将上述反应的有机相缓慢滴加到水相中，室温避光搅24小时。反应结束后用浓盐酸调节反应体系的pH 1～2，继续搅拌2小时；最后用氢氧化钠将体系的pH调节至中性。反应产物转移至透析袋中，去离子水透析48小时，透析液冷冻干燥即可得到angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉。经测定，1mg/mL的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物嫁接物胶束的粒径、电位、临界胶束浓度分别为125.8±6.5nm、27.3±0.3mV、76.3μg/mL和147.6±6.9nm、20.9±0.2mV、111.1μg/mL。
实施例三：
1.还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定硬脂胺230.5mg、3,3’-二硫代二丙酸179.9mg、4-二甲氨基吡啶31.4mg、二环己基碳二亚胺528.7mg溶于40.0mL无水二甲基亚砜中，氮气保护,60℃水浴加热搅拌，反应18小时，趁热抽滤，滤液中加入984.5mg N-羟基琥珀酰亚胺和1639.9mg碳二亚胺,60℃水浴加热搅拌活化30分钟。活化结束后，将此反应体系加入到60℃预热的0.5g壳聚糖水溶液中，60℃条件下水浴加热继续搅拌8小时，反应结束后，将反应体系转移至透析袋中，去离子水透析48小时，除去水溶性杂质。透析结束后，将透析液离心(10000转/分钟，10分钟)除去水不溶性杂质。将上清进行冷冻干燥，冻干固体分散于适量无水乙醇中，醇洗三遍，除去游离的硬脂胺及其他脂溶性杂质，滤饼复溶于适量去离子水中，冷冻干燥后得到还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物。
2.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定10mg angiopep-2和11.1mg二碳酸二叔丁酯，溶于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，室温避光搅拌12小时；然后加入2.5mg碳二亚胺和1.5mg N-羟基琥珀酰亚胺活化多肽链上游离羧基，室温搅拌1.5小时，随后加入8.69mg聚乙二醇，室温避光搅拌24小时；接着加入1.284mg N,N-二琥珀酰亚胺继续搅拌9小时。以上所有试剂均溶解于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，形成有机反应体系。精密称定20mg还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉末，溶于去离子水，得到终浓度为5mg/mL的胶束溶液。最后将上述反应的有机相缓慢滴加到水相中，室温避光搅24小时。反应结束后用浓盐酸调节反应体系的pH 1～2，继续搅拌2小时；最后用氢氧化钠将体系的pH调节至中性。反应产物转移至透析袋中，去离子水透析48小时，透析液冷冻干燥即可得到angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉。经测定，1mg/mL的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物嫁接物胶束的粒径、电位、临界胶束浓度分别为125.8±6.5nm、27.3±0.3mV、76.3μg/mL和155.1±5.4nm、18.4±0.4mV、132.7μg/mL。
实施例四：
1.还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定硬脂胺345.7mg、3,3’-二硫代二丙酸269.9mg、4-二甲氨基吡啶47.1mg、二环己基碳二亚胺793.1mg溶于60.0mL无水二甲基亚砜中，氮气保护,60℃水浴加热搅拌，反应18小时，趁热抽滤，滤液中加入1476.8mg N-羟基琥珀酰亚胺和2459.9mg碳二亚胺,60℃水浴加热搅拌活化30分钟。活化结束后，将此反应体系加入到60℃预热的0.5g壳聚糖水溶液中，60℃条件下水浴加热继续搅拌8小时，反应结束后，将反应体系转移至透析袋中，去离子水透析48小时，除去水溶性杂质。透析结束后，将透析液离心(10000转/分钟，10分钟)除去水不溶性杂质。将上清进行冷冻干燥，冻干固体分散于适量无水乙醇中，醇洗三遍，除去游离的硬脂胺及其他脂溶性杂质，滤饼复溶于适量去离子水中，冷冻干燥后得到还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物。
2.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定10mg angiopep-2和11.1mg二碳酸二叔丁酯，溶于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，室温避光搅拌12小时；然后加入2.5mg碳二亚胺和1.5mg N-羟基琥珀酰亚胺活化多肽链上游离羧基，室温搅拌1.5小时，随后加入8.69mg聚乙二醇，室温避光搅拌24小时；接着加入1.113mg N,N-二琥珀酰亚胺继续搅拌9小时。以上所有试剂均溶解于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，形成有机反应体系。精密称定80mg还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉末，溶于去离子水，得到终浓度为5mg/mL的胶束溶液。最后将上述反应的有机相缓慢滴加到水相中，室温避光搅24小时。反应结束后用浓盐酸调节反应体系的pH 1～2，继续搅拌2小时；最后用氢氧化钠将体系的pH调节至中性。反应产物转移至透析袋中，去离子水透析48小时，透析液冷冻干燥即可得到angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉。经测定，1mg/mL的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物嫁接物胶束的粒径、电位、临界胶束浓度分别为97.9±3.4nm、23.1±0.7mV、65.2μg/mL和110.7±7.2nm、22.5±0.1mV、78.0μg/mL。
实施例五：
1.还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定硬脂胺345.7mg、3,3’-二硫代二丙酸269.9mg、4-二甲氨基吡啶47.1mg、二环己基碳二亚胺793.1mg溶于60.0mL无水二甲基亚砜中，氮气保护,60℃水浴加热搅拌，反应18小时，趁热抽滤，滤液中加入1476.8mg N-羟基琥珀酰亚胺和2459.9mg碳二亚胺,60℃水浴加热搅拌活化30分钟。活化结束后，将此反应体系加入到60℃预热的0.5g壳聚糖水溶液中，60℃条件下水浴加热继续搅拌8小时，反应结束后，将反应体系转移至透析袋中，去离子水透析48小时，除去水溶性杂质。透析结束后，将透析液离心(10000转/分钟，10分钟)除去水不溶性杂质。将上清进行冷冻干燥，冻干固体分散于适量无水乙醇中，醇洗三遍，除去游离的硬脂胺及其他脂溶性杂质，滤饼复溶于适量去离子水中，冷冻干燥后得到还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物。
2.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定10mg angiopep-2和11.1mg二碳酸二叔丁酯，溶于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，室温避光搅拌12小时；然后加入2.5mg碳二亚胺和1.5mg N-羟基琥珀酰亚胺活化多肽链上游离羧基，室温搅拌1.5小时，随后加入8.69mg聚乙二醇，室温避光搅拌24小时；接着加入1.113mg N,N-二琥珀酰亚胺继续搅拌9小时。以上所有试剂均溶解于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，形成有机反应体系。精密称定40mg还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉末，溶于去离子水，得到终浓度为5mg/mL的胶束溶液。最后将上述反应的有机相缓慢滴加到水相中，室温避光搅24小时。反应结束后用浓盐酸调节反应体系的pH 1～2，继续搅拌2小时；最后用氢氧化钠将体系的pH调节至中性。反应产物转移至透析袋中，去离子水透析48小时，透析液冷冻干燥即可得到angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉。经测定，1mg/mL的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物嫁接物胶束的粒径、电位、临界胶束浓度分别为97.9±3.4nm、23.1±0.7mV、65.2μg/mL和118.6±6.2nm、19.3±0.2mV、97.2μg/mL。
实施例六：
1.还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定硬脂胺345.7mg、3,3’-二硫代二丙酸269.9mg、4-二甲氨基吡啶47.1mg、二环己基碳二亚胺793.1mg溶于60.0mL无水二甲基亚砜中，氮气保护,60℃水浴加热搅拌，反应18小时，趁热抽滤，滤液中加入1476.8mg N-羟基琥珀酰亚胺和2459.9mg碳二亚胺,60℃水浴加热搅拌活化30分钟。活化结束后，将此反应体系加入到60℃预热的0.5g壳聚糖水溶液中，60℃条件下水浴加热继续搅拌8小时，反应结束后，将反应体系转移至透析袋中，去离子水透析48小时，除去水溶性杂质。透析结束后，将透析液离心(10000转/分钟，10分钟)除去水不溶性杂质。将上清进行冷冻干燥，冻干固体分散于适量无水乙醇中，醇洗三遍，除去游离的硬脂胺及其他脂溶性杂质，滤饼复溶于适量去离子水中，冷冻干燥后得到还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物。
2.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定10mg angiopep-2和11.1mg二碳酸二叔丁酯，溶于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，室温避光搅拌12小时；然后加入2.5mg碳二亚胺和1.5mg N-羟基琥珀酰亚胺活化多肽链上游离羧基，室温搅拌1.5小时，随后加入8.69mg聚乙二醇，室温避光搅拌24小时；接着加入1.113mg N,N-二琥珀酰亚胺继续搅拌9小时。以上所有试剂均溶解于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，形成有机反应体系。精密称定20mg还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉末，溶于去离子水，得到终浓度为5mg/mL的胶束溶液。最后将上述反应的有机相缓慢滴加到水相中，室温避光搅24小时。反应结束后用浓盐酸调节反应体系的pH 1～2，继续搅拌2小时；最后用氢氧化钠将体系的pH调节至中性。反应产物转移至透析袋中，去离子水透析48小时，透析液冷冻干燥即可得到angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉。经测定，1mg/mL的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物嫁接物胶束的粒径、电位、临界胶束浓度分别为97.9±3.4nm、23.1±0.7mV、65.2μg/mL和129.2±5.8nm、16.2±0.3mV、117.9μg/mL。
实施例七：
1.还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定硬脂胺461.0mg、3,3’-二硫代二丙酸359.8mg、4-二甲氨基吡啶62.8mg、二环己基碳二亚胺1057.4mg溶于80mL无水二甲基亚砜中，氮气保护,60℃水浴加热搅拌，反应18小时，趁热抽滤，滤液中加入3279.8mg N-羟基琥珀酰亚胺和1969.0mg碳二亚胺,60℃水浴加热搅拌活化30分钟。活化结束后，将此反应体系加入到60℃预热的0.5g壳聚糖水溶液中，60℃条件下水浴加热继续搅拌8小时，反应结束后，将反应体系转移至透析袋中，去离子水透析48小时，除去水溶性杂质。透析结束后，将透析液离心(10000转/分钟，10分钟)除去水不溶性杂质。将上清进行冷冻干燥，冻干固体分散于适量无水乙醇中，醇洗三遍，除去游离的硬脂胺及其他脂溶性杂质，滤饼复溶于适量去离子水中，冷冻干燥后得到还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物。
2.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定10mg angiopep-2和11.1mg二碳酸二叔丁酯，溶于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，室温避光搅拌12小时；然后加入2.5mg碳二亚胺和1.5mg N-羟基琥珀酰亚胺活化多肽链上游离羧基，室温搅拌1.5小时，随后加入8.69mg聚乙二醇，室温避光搅拌24小时；接着加入1.113mg N,N-二琥珀酰亚胺继续搅拌9小时。以上所有试剂均溶解于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，形成有机反应体系。精密称定80mg还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉末，溶于去离子水，得到终浓度为5mg/mL的胶束溶液。最后将上述反应的有机相缓慢滴加到水相中，室温避光搅24小时。反应结束后用浓盐酸调节反应体系的pH 1～2，继续搅拌2小时；最后用氢氧化钠将体系的pH调节至中性。反应产物转移至透析袋中，去离子水透析48小时，透析液冷冻干燥即可得到angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉。经测定，1mg/mL的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物嫁接物胶束的粒径、电位、临界胶束浓度分别为83.2±4.1nm、20.9±0.5mV、47.6μg/mL和95.1±5.4nm、18.8±0.3mV、68.5μg/mL。
实施例八：
1.还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定硬脂胺461.0mg、3,3’-二硫代二丙酸359.8mg、4-二甲氨基吡啶62.8mg、二环己基碳二亚胺1057.4mg溶于80mL无水二甲基亚砜中，氮气保护,60℃水浴加热搅拌，反应18小时，趁热抽滤，滤液中加入3279.8mg N-羟基琥珀酰亚胺和1969.0mg碳二亚胺,60℃水浴加热搅拌活化30分钟。活化结束后，将此反应体系加入到60℃预热的0.5g壳聚糖水溶液中，60℃条件下水浴加热继续搅拌8小时，反应结束后，将反应体系转移至透析袋中，去离子水透析48小时，除去水溶性杂质。透析结束后，将透析液离心(10000转/分钟，10分钟)除去水不溶性杂质。将上清进行冷冻干燥，冻干固体分散于适量无水乙醇中，醇洗三遍，除去游离的硬脂胺及其他脂溶性杂质，滤饼复溶于适量去离子水中，冷冻干燥后得到还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物。
2.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定10mg angiopep-2和11.1mg二碳酸二叔丁酯，溶于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，室温避光搅拌12小时；然后加入2.5mg碳二亚胺和1.5mg N-羟基琥珀酰亚胺活化多肽链上游离羧基，室温搅拌1.5小时，随后加入8.69mg聚乙二醇，室温避光搅拌24小时；接着加入1.113mg N,N-二琥珀酰亚胺继续搅拌9小时。以上所有试剂均溶解于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，形成有机反应体系。精密称定40mg还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉末，溶于去离子水，得到终浓度为5mg/mL的胶束溶液。最后将上述反应的有机相缓慢滴加到水相中，室温避光搅24小时。反应结束后用浓盐酸调节反应体系的pH 1～2，继续搅拌2小时；最后用氢氧化钠将体系的pH调节至中性。反应产物转移至透析袋中，去离子水透析48小时，透析液冷冻干燥即可得到angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉。经测定，1mg/mL的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物嫁接物胶束的粒径、电位、临界胶束浓度分别为83.2±4.1nm、20.9±0.5mV、47.6μg/mL和102.8±6.3nm、15.7±0.4mV、95.4μg/mL。
实施例九：
1.还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定硬脂胺461.0mg、3,3’-二硫代二丙酸359.8mg、4-二甲氨基吡啶62.8mg、二环己基碳二亚胺1057.4mg溶于80mL无水二甲基亚砜中，氮气保护,60℃水浴加热搅拌，反应18小时，趁热抽滤，滤液中加入3279.8mg N-羟基琥珀酰亚胺和1969.0mg碳二亚胺,60℃水浴加热搅拌活化30分钟。活化结束后，将此反应体系加入到60℃预热的0.5g壳聚糖水溶液中，60℃条件下水浴加热继续搅拌8小时，反应结束后，将反应体系转移至透析袋中，去离子水透析48小时，除去水溶性杂质。透析结束后，将透析液离心(10000转/分钟，10分钟)除去水不溶性杂质。将上清进行冷冻干燥，冻干固体分散于适量无水乙醇中，醇洗三遍，除去游离的硬脂胺及其他脂溶性杂质，滤饼复溶于适量去离子水中，冷冻干燥后得到还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物。
2.angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的合成
精密称定10mg angiopep-2和11.1mg二碳酸二叔丁酯，溶于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，室温避光搅拌12小时；然后加入2.5mg碳二亚胺和1.5mg N-羟基琥珀酰亚胺活化多肽链上游离羧基，室温搅拌1.5小时，随后加入8.69mg聚乙二醇，室温避光搅拌24小时；接着加入1.113mg N,N-二琥珀酰亚胺继续搅拌9小时。以上所有试剂均溶解于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺，形成有机反应体系。精密称定20mg还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉末，溶于去离子水，得到终浓度为5mg/mL的胶束溶液。最后将上述反应的有机相缓慢滴加到水相中，室温避光搅24小时。反应结束后用浓盐酸调节反应体系的pH 1～2，继续搅拌2小时；最后用氢氧化钠将体系的pH调节至中性。反应产物转移至透析袋中，去离子水透析48小时，透析液冷冻干燥即可得到angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉。经测定，1mg/mL的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物、angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物嫁接物胶束的粒径、电位、临界胶束浓度分别为83.2±4.1nm、20.9±0.5mV、47.6μg/mL和117.4±3.9nm、13.2±0.2mV、113.1μg/mL。

Claims (6)

1.一种angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖硬脂胺嫁接物，其结构通式为：
R＝-NH2或
或HN2-angiopep-2-CONH-(CH2CH2O)n-CH2-NHCOCH3
N＝100‐1000
其中，壳聚糖的分子量为5～100kDa，脱乙酰度为70～95％，壳聚糖链上的游离氨基部分被硬脂胺和angiopep-2取代。
2.根据权利要求书1所述的angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖硬脂胺嫁接物，其特征在于，1mg/mL的angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物在水性介质中可以自聚集形成胶束，其粒径为30～300nm，表面电位为10～30mV，临界胶束浓度介于10～150μg/mL之间。
3.权利要求书1所述的angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的制备方法，其特征在于，具体通过以下步骤实现：
(1)取angiopep-2和二碳酸二叔丁酯，溶于无水二甲基亚砜/二甲基甲酰胺溶剂中，室温避光搅拌12小时；然后加入碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，活化angiopep-2链的游离羧基，室温搅拌1.5小时，随后加入聚乙二醇，室温避光搅拌24小时，接着加入N,N-二琥珀酰亚胺继续搅拌9小时；
(2)取还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉末，溶于去离子水，得到终浓度为5mg/mL的胶束溶液，最后缓慢滴加步骤(1)的有机相到水相中，室温避光搅拌24小时，反应结束后用12mol/L浓盐酸调节反应体系的pH 1～2，继续搅拌2小时，最后用氢氧化钠将体系的pH调节至中性；
(3)将步骤(2)中反应产物转移至透析袋中，去离子水透析48小时，透析液冷冻干燥即可得到angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物冻干粉。
4.权利要求书3所述的angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中angiopep-2游离羧基：二碳酸二叔丁酯：碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺：聚乙二醇：N,N-二琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1～1.5：2～5：2～5：1～3：1～1.5。
5.权利要求书3所述的angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中angiopep-2：还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物的质量比为1：1.5～8。
6.根据权利要求1所述的angiopep-2修饰的还原响应型壳聚糖-硬脂胺嫁接物在制备抗恶性脑胶质瘤药物的脑靶向载体中的应用。
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