CN103083682B - 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药物技术领域，具体为一种叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物及其制备方法和应用。本发明的聚合物药物由紫杉醇经琥珀酰酯键共价连接至壳聚糖季铵盐并连接肿瘤靶向配体叶酸而成。其制备方法为：琥珀酸酐开环与紫杉醇化学连接合成琥珀酰紫杉醇，壳聚糖经季铵化修饰制得壳聚糖季铵盐，在催化剂作用下，琥珀酰紫杉醇共价连接至壳聚糖季铵盐，并引入靶向配体叶酸；该聚合物药物在水中可自组装形成纳米粒，其中以疏水性药物为内核，以壳聚糖季铵盐为亲水外壳。该聚合物药物制备方法简单、重复性和安全性良好，可通过口服和静脉注射二种给药途径增强紫杉醇的靶向性和抑瘤功效。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物及其制备方法和应用。
背景技术
抗肿瘤化学药物因水溶性差、体内非特异性分布、毒副作用较大等，无法充分发挥其治疗功效。紫杉醇作为一线化疗药物，可促进微管装配并阻止微管蛋白解聚，从而有效抑制癌细胞的快速***和增殖。但紫杉醇难溶于水，临床使用的紫杉醇注射液是以聚氧乙烯蓖麻油/乙醇（1:1, v/v）作为溶媒，静脉注射后可引起过敏反应、心血管毒性等毒副作用。采用药物递送***可克服上述缺陷，其中水溶性聚合物载体与紫杉醇化学连接形成的聚合物药物可改善紫杉醇溶解度，控制药物释放，提高肿瘤靶向性，减轻毒副作用。紫杉醇可直接与聚合物载体连接，但可能因空间位阻等因素药物释放速率过慢（Shahin M et al., Int J Pharm 2010,389:213-222），可将紫杉醇先与二元羧酸或氨基酸等小分子连接后间接连接至聚合物载体，间接连接可提高药物的反应活性，增加药物水解位点。
目前研究的基于紫杉醇的聚合物药物多经静脉注射给药，静脉注射后药物可直接进入血液循环；在癌症的长期治疗过程中，口服相对于静脉注射更加方便，可提高病人顺应性。紫杉醇的小肠渗透性差，易受到肠上皮细胞表面P-糖蛋白介导的药物外排及细胞色素P450依赖的药物代谢，口服生物利用度非常低。借助递送载体可提高药物的口服吸收，其中壳聚糖以优良的理化性质及易于进行结构与功能修饰而广泛用于口服递送载体的制备，但壳聚糖在生理环境下水溶性差，应用受到限制。壳聚糖可经水解或酶解为低分子量壳聚糖（Mw<10 kDa），水溶性增强，将紫杉醇经琥珀酰酯键与低分子量壳聚糖共价连接形成低分子量壳聚糖-紫杉醇聚合物药物，可改善紫杉醇溶解性，提高紫杉醇口服生物利用度（Lee E et al., J Med Chem 2008,51:6442-6449），口服低分子量壳聚糖-紫杉醇的体内抑瘤率和静脉注射紫杉醇溶液相当。但一般认为分子量大于50 kDa的分子或与其相当的粒子（例如纳米粒）有明显的增强渗透滞留（EPR）效应，可被动靶向肿瘤组织。低分子量壳聚糖-紫杉醇聚合物药物的分子量较小且不能自组装形成纳米粒，无法利用EPR效应提高抗肿瘤功效。
利用配体与细胞膜上受体特异性识别作用，对药物递送载体进行靶向配体修饰可增加细胞对药物递送载体的摄取，增强主动靶向功效。小肠上皮细胞表面叶酸受体高表达，叶酸修饰的纳米粒可显著提高药物的小肠转运能力（Roger E et al., Mol Pharmaceutics 2012,9:2103-2110）；叶酸受体在多种肿瘤细胞（如卵巢癌、肝癌、乳腺癌等）表面高表达且活性显著高于正常细胞，叶酸修饰的纳米粒可在肿瘤组织中高度蓄积，具有良好的肿瘤细胞靶向性（Wang J et al., Biomacromolecules 2011,12:228-234）。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种具有自组装性能、可用于多种给药途径的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物及其制备方法和应用。
本发明的基本方案如下：
琥珀酸酐经吡啶催化开环，与紫杉醇连接合成琥珀酰紫杉醇；壳聚糖与碘甲烷反应合成壳聚糖季铵盐；壳聚糖季铵盐与琥珀酰紫杉醇经催化缩合，并将靶向配体叶酸连接至壳聚糖季铵盐，制得叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。该聚合物药物因含有亲水性聚合物链和疏水性药物，在水中可自组装形成纳米粒。本发明依据壳聚糖季铵盐的亲水性、黏膜黏附和细胞黏附等作用，将紫杉醇通过琥珀酰酯键共价连接至壳聚糖季铵盐，提高药物水溶性，控制药物释放，增强药物肿瘤靶向性；依据叶酸对于多种肿瘤细胞的主动靶向性，将叶酸共价连接至壳聚糖季铵盐，实现聚合物药物的肿瘤组织主动靶向，减小药物对正常组织的毒副作用。本发明制备的叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物可通过口服和静脉注射等多种给药途径提高药物的抗肿瘤功效。
具体说来，本发明提供的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，是抗肿瘤药物紫杉醇经琥珀酰酯键共价连接至壳聚糖季铵盐，再将靶向配体叶酸连接至壳聚糖季铵盐形成的聚合物药物，该聚合物药物在水中可自组装形成纳米粒。其中壳聚糖分子量范围为10-500 kDa，紫杉醇载药量为3-25%。
所述的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，自组装形成的纳米粒平均粒径为100-500 nm。
本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备方法如下：
（1）琥珀酸酐混悬于二氯甲烷，加入紫杉醇，搅拌，加入无水吡啶，搅拌反应24-72 h；减压蒸馏，加水洗涤，离心收集沉淀，真空干燥，得琥珀酰紫杉醇；
（2）按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成壳聚糖季铵盐；
（3）琥珀酰紫杉醇溶于二甲基亚砜，加入催化剂，搅拌；将壳聚糖季铵盐溶于水，加至含有琥珀酰紫杉醇的二甲基亚砜中，反应6-24 h；
（4）将叶酸溶于二甲基亚砜，加入催化剂，搅拌，加至步骤（3）得到的反应体系中，避光反应6-24 h；纯化，冷冻干燥，得叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。
步骤（1）中，琥珀酸酐与紫杉醇的质量比为1:1-1:10，吡啶用量为反应体系的0.25-2.0%（v/v）。
步骤（2）中，合成壳聚糖季铵盐反应时间为45-150 min；所得壳聚糖季铵盐以Cl-型阴离子交换树脂纯化、冷冻干燥；其中反应45、120和150 min所得的壳聚糖季铵盐的季铵化度分别为15%、30%和45%。
步骤（3）中，反应所用催化剂为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，且琥珀酰紫杉醇与1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比均为1:1-1:10，琥珀酰紫杉醇与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.4:1，壳聚糖季铵盐水溶液浓度为10-30 mg/ml。
步骤（4）中，叶酸与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.3:1，反应所用催化剂为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，且叶酸与1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比均为1:1-1:10。
本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，可通过口服和静脉二种给药途径用于肝癌等多种癌症的治疗。
本发明的优点在于：
（1）依据壳聚糖季铵盐良好的水溶性、黏附性及促进渗透等优点，将紫杉醇经生理条件下可裂解的连接键共价连接至壳聚糖季铵盐，并将靶向配体叶酸连接至壳聚糖季铵盐，制备一种新型叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。本发明的叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物可增强药物小肠渗透性，不仅可通过EPR效应富集于肿瘤组织，也可通过靶向配体叶酸与肿瘤细胞表面特异性受体的识别、结合，增加肿瘤组织中药物分布，提高药物的抗肿瘤功效，降低对其它脏器的毒性。
（2）本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物水中自组装形成纳米粒，粒径分布均匀，分散性较好，且在不同pH环境下粒径稳定。
（3）本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物可在体内缓慢释药，可防止药物到达靶点前对正常组织的毒性；酸性条件下聚合物药物较稳定，药物释放速率随释放介质pH的增大而增大，可防止药物在胃部损失，有利于聚合物药物的肠道吸收。
（4）本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的小肠黏膜黏附率高于壳聚糖季铵盐，可通过打开小肠上皮紧密连接和上皮细胞摄取显著提高紫杉醇的小肠转运效率。
（5）本发明的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物可通过口服和静脉注射二种给药途径用于肝癌等多种癌症的治疗； H22肝癌模型小鼠抑瘤效果研究中，口服和静脉注射叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物组的抑瘤率均显著高于静脉注射紫杉醇溶液组。
（6）连接紫杉醇和叶酸可降低壳聚糖季铵盐的正电荷，增强血液相容性。
（7）本发明各种原料廉价易得，引入靶向基团的方法简捷方便，连接键牢固，合成工艺简单，条件可控，重复性好。
本文所用术语：
如本文所用，术语“PTX”指紫杉醇。
如本文所用，术语“TMC”指N,N,N-三甲基壳聚糖季铵盐。
如本文所用，术语“EDC”指1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
如本文所用，术语“NHS”指N-羟基琥珀酰亚胺。
如本文所用，术语“FA”指叶酸。
如本文所用，术语“TMC-PTX”指壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。
如本文所用，术语“FA-TMC-PTX”指叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。
附图说明
图1为叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的扫描电镜图（实施例13）。图中标尺2 μm。
图2为叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物（实施例12、13、14）在不同pH环境下的粒径。
图3为叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物（实施例13）在pH 7.4 PBS中10天内的释放情况（A）；在不同pH释放介质中的释放情况（B），其中，从下往上的曲线对应的Ph值依次为：1.2，4.5，5.0，5.3，5.7，6.0，6.5，7.0，7.4 。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，浓度为质量体积百分数（w/v）。
实施例1 琥珀酰紫杉醇的制备
称取3 mg琥珀酸酐，加4 mL二氯甲烷，搅拌；加30 mg PTX，搅拌；加10 μL无水吡啶，反应体系变澄清，搅拌24 h；50 °C减压蒸馏，加10 mL水，搅拌15 min，离心收集沉淀；加30 mL水洗涤沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。
实施例2 琥珀酰紫杉醇的制备
称取6 mg琥珀酸酐，加4 mL二氯甲烷，搅拌；加30 mg PTX，搅拌；加20 μL无水吡啶，反应体系变澄清，搅拌40 h；50 °C减压蒸馏，加10 mL水，搅拌15 min，离心收集沉淀；加30 mL水洗涤沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。
实施例3 琥珀酰紫杉醇的制备
称取10 mg琥珀酸酐，加4 mL二氯甲烷，搅拌；加30 mg PTX，搅拌；加30 μL无水吡啶，反应体系变澄清，搅拌55 h；50 °C减压蒸馏，加10 mL水，搅拌15 min，离心收集沉淀；加30 mL水洗涤沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。
实施例4 琥珀酰紫杉醇的制备
称取20 mg琥珀酸酐，加4 mL二氯甲烷，搅拌；加30 mg PTX，搅拌；加50 μL无水吡啶，反应体系变澄清，搅拌65 h；50 °C减压蒸馏，加10 mL水，搅拌15 min，离心收集沉淀；加30 mL水洗涤沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。
实施例5 琥珀酰紫杉醇的制备
称取30 mg琥珀酸酐，加4 mL二氯甲烷，搅拌；加30 mg PTX，搅拌；加80 μL无水吡啶，反应体系变澄清，搅拌72 h；50 °C减压蒸馏，加10 mL水，搅拌15 min，离心收集沉淀；加30 mL水洗涤沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。
实施例6 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为10 kDa，反应时间为45 min，所得TMC的季铵化度为15%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:1:1，搅拌；加入TMC溶液，反应6 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例7 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为30 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:3:3，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例8 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为150 min，所得TMC的季铵化度为45%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应24 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光搅拌反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例9 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:7:7，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例10 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为500 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:10:10，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例11 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取10 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例12 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取20 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例13 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例14 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取60 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例15 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取80 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例16 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为10 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于10 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例17 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为30 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于10 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于10 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例18 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于6.7 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于13.3 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例19 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于60 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例20 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为500 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于80 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例21 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取12 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:1:1，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应6 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例22 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取22 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:2:2，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例23 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取40 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:4:4，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应24 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例24 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取50 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:6:6，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例25 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间为120 min，所得TMC的季铵化度为30%；Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥。称取200 mg TMC溶于20 mL水；称取40 mg 琥珀酰紫杉醇（实施例3）溶于40 mL二甲基亚砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩尔比为1:5:5，搅拌；加入TMC溶液，反应12 h制备TMC-PTX；称取60 mg FA溶于二甲基亚砜，加入NHS和EDC，FA、NHS和EDC的摩尔比为1:10:10，搅拌，加至TMC-PTX反应体系中，避光反应12 h；以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥。
实施例26 扫描电镜表征叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的形态
将实施例13的FA-TMC-PTX用适量水分散后滴加至云母片上，室温自然干燥，黏于铜台，喷金，扫描电镜（SEM）观察其形貌，见附图1。由图可见FA-TMC-PTX可自组装形成纳米粒，纳米粒近似球形，表面光滑，粒径为100-200 nm，粒径分布均匀且分散性较好。
实施例27 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的粒径、电势
将实施例12、13和14的FA-TMC-PTX用适量水分散，Zetasizer Nano电势及粒度测定仪测定粒径和Zeta电势。粒径测定参数：He-Ne激光（波长635 nm），折光率和粘度分别为n=1.333和η=0.933 cp，测定温度25 °C。电势测定参数：He-Ne激光（波长635 nm），散射角θ=14°，测定温度25 °C。每份样品平行测定3次。测定结果见表1。如表1所示，水中FA-TMC-PTX形成的纳米粒粒径随琥珀酰紫杉醇投料量的增大而先减小后增大，纳米粒电势均大于30 mV，表明纳米粒较稳定。
实施例28 不同pH环境下叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的粒径
将实施例12、13和14的FA-TMC-PTX分别分散于pH 1.2 HCl、pH 5.0 PBS、pH 6.8 PBS和pH 7.4 PBS中，粒度测定仪测定粒径。粒径测定参数：He-Ne激光（波长635 nm），折光率和粘度分别为n=1.333和η=0.933 cp，测定温度25 °C。每份样品平行测定3次。测定结果见附图2。由附图2可见pH 1.2-7.4环境下FA-TMC-PTX形成的纳米粒粒径无显著变化；FA-TMC-PTX口服后经过胃肠道进入血液并最终到达肿瘤组织，经历了不同的pH环境，而在不同pH环境下FA-TMC-PTX可保持稳定的纳米形态。
实施例29 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的载药量
精密配制1 mg/mL FA-TMC-PTX（实施例12、13、14），精密量取200 μL，加水稀释至2 mL，测定227 nm处吸光值，计算聚合物药物的载药量（%）。如表1所示，FA-TMC-PTX的载药量随琥珀酰紫杉醇投料量的增大而增大。
表1 叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的粒径、电势和载药量(n=3)
| 样品 | 粒径（nm） | 多分散性 | 电势（mV） | 载药量（%） |
| FA-TMC-PTX (实施例12) | 311.1 ± 19.6 | 0.360 ± 0.066 | 33.2 ± 0.7 | 5.0 ± 0.3 |
| FA-TMC-PTX (实施例13) | 186.9 ± 21.5 | 0.290 ± 0.022 | 30.7 ± 1.3 | 10.5 ± 0.3 |
| FA-TMC-PTX (实施例14) | 344.7 ± 9.1 | 0.187 ± 0.031 | 32.3 ± 1.3 | 17.2 ± 0.3 |
实施例30 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的体外释放
称取适量FA-TMC-PTX（实施例13）分散在pH 7.4 PBS中，量取4 mL，置MWCO 3,500 Da透析袋中，透析袋置100 mL含0.1%（w/v）吐温80的pH 7.4 PBS溶液中，37 °C、100 rpm振荡温育；分别于1、2、3、4、6、8、12、24 h和2、3、4、5、6、7、8、9、10 d取样0.5 mL，补加0.5 mL释放介质；样品12,000 rpm离心10 min，上清液以0.22 μm滤膜过滤，HPLC测定PTX浓度。
配制1 mg/mL FA-TMC-PTX（实施例13），量取100 μL，分别加入含0.1%（w/v）吐温80的pH 4.5、5.0、5.3、5.7、6.0、6.5、7.0、7.4 PBS和pH 1.2 HCl溶液稀释至1 mL，37 °C、100 rpm振荡温育，分别于1、2、4、6、8、24、48 h 12,000 rpm离心10 min，上清液以0.22 μm滤膜过滤，HPLC测定PTX浓度。
HPLC色谱条件：色谱柱：Hypersil ODS2柱（中科院大连化物所，200×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈：水（52:48, v/v）；流速：1 mL/min；检测波长：227 nm；进样量：20 μL。
按实施例29计算聚合物药物中PTX量，按下式计算累积释放百分率：
累积释放百分率（%）=（Ci×V/PTX量）×100
其中Ci为取样点释放介质中PTX浓度（μg/mL），V为释放介质体积。
如附图3A所示，pH 7.4 PBS中FA-TMC-PTX（实施例13）无明显突释，可持续缓慢释放药物达10 d，可防止药物到达靶点前对正常组织的毒性，减缓药物的清除速率。如附图3B所示，FA-TMC-PTX（实施例13）在酸性条件下较稳定，药物释放量随释放介质pH增大而增大，可防止药物在胃部损失，有利于聚合物药物的肠道吸收；此外，肿瘤细胞可经胞吞作用摄取纳米级聚合物药物，入胞后进入内涵体或溶酶体胞内小室中（pH 4-6），在弱酸性环境下缓慢释放PTX，聚合物药物逃避内涵体或溶酶体进入细胞质（pH 7.2），释药速率增大，有利于PTX与其靶点胞质内微管作用发挥功效。
实施例31 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的在体小肠黏附
称取3 mg RhB，加1 mL pH 4.5 HCl溶液溶解，加1.5 mg NHS和3 mg EDC，避光搅拌1 h；称取0.3 g TMC溶于加9 mL水，加至RhB体系中，避光搅拌24 h；反应液以水透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，得RhB标记的TMC。以RhB标记的TMC替代TMC，按实施例13制备RhB标记的FA-TMC-PTX。
SD大鼠，禁食12小时，可自由饮水，称重，按350 mg/kg腹腔注射水合氯醛溶液（3.5%，w/v）麻醉大鼠，沿腹中线打开腹腔，取约10 cm回肠肠段，生理盐水冲洗至净，两端用手术线结扎成封闭肠环，肠环中注入1 mL RhB标记的TMC或RhB标记的FA-TMC-PTX（1 mg/mL）；将肠段放回腹腔，2 h后处死大鼠，剪开肠环收集肠液，加生理盐水冲洗肠段，合并肠液和冲洗液，酶标仪测定RhB标记的TMC和RhB标记的FA-TMC-PTX含量（λ ex=560 nm，λ em=590 nm）。按下列公式计算小肠黏附力（%）：
小肠黏附力（%）=(A-B)×100/A
其中A为注入液中RhB标记的FA-TMC-PTX的理论含量；B为收集肠液中RhB标记的FA-TMC-PTX的含量。
可见，2 h后有89.0 ± 2.9%的FA-TMC-PTX（实施例13）黏附至小肠，显著高于TMC（48.8 ± 1.0%）。与TMC相比，FA-TMC-PTX正电荷减弱，分子链间相互作用降低，柔韧性增加，且疏水性增强，可与黏膜黏蛋白和小肠上皮细胞经疏水作用力结合，小肠黏附力提高。
实施例32 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的小肠离体转运
PTX溶液配制：以聚氧乙烯蓖麻油/无水乙醇（1:1，v/v）配制1 mg/mL PTX贮备液，使用时以Kreb’s-Ringer缓冲液稀释至100 μg/mL。PTX/TMC混合液配制：配制10 mg/mL TMC溶液，使用时将PTX贮备液、TMC溶液和Kreb’s-Ringer缓冲液按1:1:8（v/v/v）混合。
SD大鼠，禁食12小时，可自由饮水。颈椎脱臼处死，沿腹中线打开腹腔取出回肠，以Kreb’s-Ringer缓冲液清洗干净，剪成约7 cm长，两端约1 cm处用手术线结扎形成封闭肠环，肠环内分别注入0.5 mL PTX溶液、PTX/TMC混合液、FA-TMC-PTX（实施例13）（浓度按PTX计为100 μg/mL）。肠环置高型称量瓶中，加入5 mL 37 °C氧气饱和的Kreb’s-Ringer缓冲液，使肠环保持拉伸状态，37 °C、100 rpm振荡温育。分别于30、60、90、120、180 min取样200 μL，补加37 °C Kreb’s-Ringer缓冲液200 μL。样品12,000 rpm离心15 min，上清液以0.22 μm滤膜过滤，HPLC测定样品中PTX含量，按下式计算PTX的表观渗透系数（P app）。
其中A为离体小肠肠段表面积，C0为肠环内药物初始浓度。
大鼠小肠中PTX溶液、PTX/TMC混合液和FA-TMC-PTX（实施例13）的P app分别为（1.76 ± 0.41）×10-7 cm/s、（4.74 ± 0.55）×10-7 cm/s和（3.30 ± 0.25）×10-6 cm/s，表明FA-TMC-PTX可显著促进PTX的小肠转运。PTX/TMC混合液的P app为PTX溶液的2.7倍，但显著低于FA-TMC-PTX，表明FA-TMC-PTX通过上皮细胞摄取增加PTX的小肠转运量。
实施例33 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物在H-22肝癌模型小鼠的体内抑瘤效果
PTX溶液配制：以聚氧乙烯蓖麻油/无水乙醇（1:1，v/v）配制10 mg/mL PTX溶液，使用时加生理盐水稀释10倍。
雌性昆明小鼠（18-22g）前肢腋下接种H-22肝癌腹水，待肿瘤长至100 mm3，随机分组，每组6只。每组荷瘤小鼠分别口服（p.o.）或静脉注射（i.v.）以下样品：生理盐水（p.o.）、生理盐水（i.v.）、PTX溶液（i.v.）、FA-TMC-PTX（实施例13）（p.o.）和FA-TMC-PTX（实施例13）（i.v.）。给药剂量按紫杉醇计均为10 mg/kg。隔天给药一次，连续给药五次。以第一次给药时间为第0 d，至第16天，处死小鼠，取出肿瘤并称重，计算抑瘤效果，见表2。
如表2所示，口服和静脉注射FA-TMC-PTX（实施例13）对H-22肝癌模型小鼠的体内抗肿瘤效果显著，抑瘤率分别为69.4%和87.5%，显著高于静脉注射PTX溶液（抑瘤率34.52%）；静脉注射FA-TMC-PTX抑瘤率显著高于口服FA-TMC-PTX。
表2 聚合物药物和紫杉醇溶液在H22肝癌模型小鼠的体内抗肿瘤效果
*: p<0.05 vs PTX溶液（i.v.）组 #: p<0.05 vs FA-TMC-PTX（p.o.）组。
实施例34 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的溶血率
取健康昆明小鼠全血3 mL，置经肝素钠抗凝的离心管中，3,000 rpm离心10 min，弃上清液，生理盐水洗涤红细胞沉淀至上清液无红色，生理盐水配制成2%（v/v）红细胞悬液。量取0.5 mL红细胞悬液，分别加入0.5 mL生理盐水配制的TMC和FA-TMC-PTX（实施例13）（0.5、1、2 mg/mL），分别以0.5 mL水和生理盐水为阳性对照和阴性对照，37 °C、100 rpm振荡温育1 h，3,000 rpm离心10 min，取上清液，测定540 nm处的吸光值，按下式计算溶血率（%）：
TMC的溶血率表现出浓度依赖性，0.5、1、2 mg/mL TMC的溶血率分别为1.21 ± 0.23%、4.98 ± 0.36%和11.22 ± 0.73%，2 mg/mL TMC溶血率大于5%；而0.5、1、2 mg/mL FA-TMC-PTX的溶血率分别为1.48 ± 0.19%、3.61 ± 0.39%和4.00 ± 0.26%，均低于5%，血液相容性改善。
实施例35 LDH试验测定叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的组织毒性
SD大鼠，禁食12 h，可自由饮水，称重，按350 mg/kg腹腔注射水合氯醛溶液（3.5%，w/v）麻醉大鼠，沿腹中线打开腹腔，取出约10 cm回肠肠段，两端用手术线结扎成封闭肠环，肠环内注入1 mL生理盐水配制的FA-TMC-PTX（实施例13）（1 mg/mL）；生理盐水为阴性对照，10 mg/mL脱氧胆酸钠为阳性对照。将肠段放回腹腔，2 h后处死大鼠，沿结扎线剪开肠环，收集肠液，12,000 rpm离心10 min，量取上清液20 μL，LDH试剂盒测定LDH含量（U/mL）。
阴性对照、阳性对照和FA-TMC-PTX（实施例13）组的LDH释放量分别为2.55 ± 0.62 U/mL、7.14 ± 0.05 U/mL、3.69 ± 0.35 U/mL，FA-TMC-PTX组LDH释放量与生理盐水组相比无显著性差异，但显著低于阳性对照组，表明聚合物药物组织毒性低，安全性良好。
Claims (9)
1.一种叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，其特征在于由下述过程制备获得：壳聚糖经季铵化修饰制得亲水性壳聚糖季铵盐，琥珀酸酐开环与紫杉醇化学连接制得疏水性琥珀酰紫杉醇，壳聚糖季铵盐和琥珀酰紫杉醇共价连接，壳聚糖季铵盐共价连接叶酸；其中琥珀酰紫杉醇与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.4:1，叶酸与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.3:1。
2.根据权利要求1所述的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，其特征在于壳聚糖分子量范围为10-500 kDa。
3.根据权利要求1所述的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，其特征在于紫杉醇载药量为3-25%。
4.根据权利要求1-3之一所述的叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物，其特征在于由该药物自组装形成的纳米粒，粒径为100-500 nm。
5.一种如权利要求1-4之一所述的叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）琥珀酸酐混悬于二氯甲烷，加入紫杉醇，搅拌，加入无水吡啶，搅拌反应24-72小时；减压蒸馏，加水洗涤，离心收集沉淀，真空干燥，得琥珀酰紫杉醇；
（2）合成壳聚糖季铵盐；
（3）琥珀酰紫杉醇溶于二甲基亚砜，加入催化剂，搅拌；壳聚糖季铵盐溶于水，加至含有琥珀酰紫杉醇的二甲基亚砜中，反应6-24 小时；
（4）叶酸溶于二甲基亚砜，加入催化剂，搅拌，加至（3）的反应体系中，避光反应6-24 小时；纯化，冷冻干燥，得叶酸修饰壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中琥珀酸酐与紫杉醇的质量比为1:1-1:10，吡啶用量为反应体系的0.25-2.0%，v/v。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中反应时间为45-150 min；所得壳聚糖季铵盐以Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；其中反应45、120和150 min所得的壳聚糖季铵盐的季铵化度分别为15%、30%和45%。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤（3）中琥珀酰紫杉醇与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.4:1，壳聚糖季铵盐水溶液浓度为10-30 mg/mL，反应所用催化剂为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，且琥珀酰紫杉醇与1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比均为1:1-1:10。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤（4）中叶酸与壳聚糖季铵盐的质量比为0.05:1-0.3:1，反应所用催化剂为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，且叶酸与1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比均为1:1-1:10。
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| CN111603445B (zh) * | 2020-04-17 | 2021-02-19 | 华南农业大学 | 一种纳米乳液药物载体及其制备方法与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101780042A (zh) * | 2010-03-26 | 2010-07-21 | 天津大学 | 一种紫杉醇纳米靶向缓释长循环脂质体及其制备方法 |
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2013
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN101780042A (zh) * | 2010-03-26 | 2010-07-21 | 天津大学 | 一种紫杉醇纳米靶向缓释长循环脂质体及其制备方法 |
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