ES2212638T3 - Utilizacion de celulas tumorales en tiempo escalonado en combinacion con anticuerpos intactos para la inmunizacion. - Google Patents
Utilizacion de celulas tumorales en tiempo escalonado en combinacion con anticuerpos intactos para la inmunizacion.Info
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Abstract
Utilización de células tumorales autólogas, o de células tumorales alogénicas del mismo tipo de tumor tratadas para prevenir su supervivencia después de la reinyección, en una aplicación alternada en el tiempo con anticuerpos biespecíficos y/o triespecíficos intactos que tienen las propiedades siguientes de: 1) unión a una célula T; 2) unión a por lo menos un antígeno en una célula tumoral; 3) unión mediante sus porciones Fc en el caso de anticuerpos biespecíficos o mediante una tercera especificidad en el caso de anticuerpos triespecíficos a células positivas para el receptor de Fc; para la fabricación de un medicamento, en donde las células tumorales y los anticuerpos intactos dirigidos contra las células tumorales se administran de manera alternada en el tiempo al hombre a ser inmunizado con el fin lograr una inmunización contra el tumor.
Description
Utilización de células tumorales en tiempo
escalonado en combinación con anticuerpos intactos para la
inmunización.
La invención hace referencia a la utilización a
tiempo alterno de células tumorales en combinación con anticuerpos
intactos para la inmunización de hombres y animales.
En los últimos años, la inmunoterapia con
anticuerpos, específicamente los anticuerpos biespecíficos y
triespecíficos, ha alcanzado un gran interés. Sin embargo, un
problema esencial en la utilización de dichos anticuerpos en la
inmunoterapia es, por ejemplo, la activación de células del sistema
inmune, p.ej., de los linfocitos T.
Las patentes DE 196 49 223 y DE 197 10 495
describen anticuerpos biespecíficos y triespecíficos que se utilizan
en la inmunoterapia. Estos anticuerpos biespecíficos y
triespecíficos son capaces de unirse a una célula T, por lo menos a
un antígeno en una célula diana y, mediante su porción Fc o mediante
una tercera especificidad, a células positivas para el receptor de
Fc (células auxiliares).
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar una nueva utilización para una preparación combinatoria
que contenga células tumorales tratadas para prevenir su
supervivencia después de su reinyección, además de anticuerpos
biespecícificos y/o triespecíficos intactos dirigidos contra las
células tumorales.
De acuerdo con la presente invención, este
objetivo se ha logrado administrando al hombre a inmunizar células
tumorales autólogas o células tumorales alogénicas del mismo tipo
de tumor, habiendo sido tratadas cada una de estas células
tumorales para prevenir su supervivencia después de reinyectarlas de
forma alternada en el tiempo en combinación con anticuerpos
biespecíficos y/o triespecíficos que presentan las siguientes
propiedades:
(\alpha) unión a una célula T;
(\beta) unión a por lo menos un antígeno en una
célula tumoral;
(\gamma) unión, por su porción Fc (en el caso
de anticuerpos biespecíficos) o por una tercera especificidad (en
el caso de anticuerpos triespecíficos), a células positivas para el
receptor de Fc.
De acuerdo con la presente invención, las células
tumorales y los anticuerpos forman una entidad funcional y se
administran como una combinación para lograr una inmunización de
forma dirigida, en donde es esencial para una utilización
satisfactoria que la aplicación se realice de forma alternada en el
tiempo. Principalmente, es posible administrar por primera vez las
células tumorales tratadas seguido de, de forma alternada en el
tiempo, los anticuerpos, o administrar al paciente en primer lugar
los anticuerpos seguido de las células tumorales de forma alternada
en el tiempo.
Preferentemente, el intervalo entre la
administración de las células tumorales y los anticuerpos o
viceversa es de aproximadamente 1-48 horas. En
especial es preferible un intervalo de 1-24 horas y
mejor de 1-12 horas. También son posibles intervalos
de 1-6 horas o 2-4 horas. Para el
éxito de la presente invención es importante que la aplicación se
lleve a cabo de forma alternada en el tiempo, en donde el intervalo
a utilizar también puede depender del tipo de tumor a tratar y del
anticuerpo utilizado. El intervalo óptimo en cada caso puede
determinarse por el experto en la materia mediante
experimentación.
Si es posible, las células tumorales utilizadas
deberían administrarse intactas. Sin embargo, es necesario prevenir
su supervivencia después de la reinyección. Con este propósito, se
ha considerado razonable someter las células tumorales a irradiación
o prevenir su supervivencia después de la reinyección mediante
agentes químicos. Mediante estos dos tipos de tratamiento en
particular, la estructura externa de las células tumorales, es
decir, el patrón reconocido por los anticuerpos, permanece
inalterable.
Para la irradiación, se utiliza de preferencia la
irradiación gamma, preferentemente a una dosis de
20-200 Gy. Para un tratamiento químico, la
mitomicina C es especialmente satisfactoria y es preferible en la
utilización de anticuerpos biespecíficos y/o triespecíficos
heterólogos.
El éxito de la inmunización puede además ser
mejorado administrando varias veces anticuerpos y células tumorales,
cada uno de forma alternada en el tiempo. Otra mejora de la
inmunogenicidad de las células tumorales puede lograrse
sometiéndolas a un pretratamiento por calor antes de su inyección.
El intervalo de temperaturas preferido es de
41-42ºC, pudiéndose determinar la temperatura
óptima mediante experimentación. Los resultados preferidos se logran
a una temperatura de aproximadamente 41,8ºC. El tiempo del
pretratamiento por calor es generalmente de 1 a 6 horas,
preferentemente de 3 horas. El tiempo al igual que la temperatura,
que pueden utilizarse de forma óptima, dependerá del tipo de tumor a
tratar. Los valores óptimos respectivos pueden determinarse por el
experto en la materia mediante experimentación de laboratorio.
Tal como se pudo demostrar en el modelo de tumor
murino singénico (autólogo), otros factores también pueden
desempeñar un papel importante para una inducción satisfactoria de
la inmunidad. En consecuencia, es importante la entrega
espacialmente correcta del material tumoral. Es necesario entregar
las células tumorales a las células inmunes responsables de la
inmunización en el contexto espacial correcto. En este sentido, una
aplicación intravenosa (i.v.), intraperitoneal (i.p.), o subcutánea
(s.c.) ha demostrado ser específicamente favorable, ya que de ese
modo al utilizar anticuerpos biespecíficos y/o triespecíficos se
asegura un contacto óptimo en estos compartimentos con las células
inmunes correspondientes.
Para una inmunización satisfactoria, es además
ventajoso que la cantidad de células tumorales administradas se
seleccione de forma adecuada. Así, en experimentos que utilizan el
modelo de tumor murino se ha demostrado que la inmunización
satisfactoria deseada no se logra si el número de células tumorales
es demasiado bajo. En cambio, si la cantidad de células tumorales es
demasiado elevada, puede producirse un efecto adverso, por ejemplo
debido a la ocurrencia de fenómenos de tolerancia. Si estos
resultados se transfieren a la situación en el paciente, ello
significa que puede ser ventajoso para el éxito de la inmunización
el administrar una cantidad definida de material tumoral en el
contexto espacial correcto, junto con una cantidad igualmente
definida de anticuerpos. Aunque, una inmunización satisfactoria se
puede lograr sin haber optimizado alguno de estos parámetros, se
obtienen en particular buenos resultados si las cantidades de
anticuerpos y la cantidad de material tumoral además del contexto
espacial se han ajustado entre sí y se han optimizado.
Teniendo en cuenta la anterior argumentación, se
puede establecer, por ejemplo, una protección inmune insuficiente si
el número de células tumorales es demasiado bajo. En consecuencia,
es necesario para completar con éxito la inmunización que ésta se
realice con un número definido de células tumorales activadas y una
cantidad definida de anticuerpos biespecíficos y/o triespecíficos.
Los valores respectivos pueden determinarse por el experto en la
materia mediante experimentación.
Los anticuerpos biespecíficos y/o triespecíficos
utilizados de acuerdo con la presente invención se administran
preferentemente en una cantidad de 5-500 \mug,
preferentemente de 10-300 \mug,
10-100 \mug o 10-50 \mug, cada
uno por inyección. La cantidad de anticuerpo utilizado depende del
tipo de tumor a tratar, de la respuesta del paciente y de otros
factores. Las cantidades óptimas pueden determinarse por el experto
en la materia mediante experimentación.
Preferentemente, las células tumorales se
administran en una cantidad de 10^{7}-10^{9}
células por inyección, siendo preferible un número de células de
aproximadamente. Tal como se detalló anteriormente, las células
tumorales se han de tratar antes de la reinyección para prevenir su
supervivencia después de la reinyección, así, opcionalmente, se
pueden someter a un pretratamiento por calor. Para mayores detalles
ver la presente especificación.
Sin embargo, es indispensable administrar las
células tumorales y los anticuerpos de forma alternada en el tiempo.
Lo que sirve para asegurar que mediante la inyección de anticuerpos
biespecíficos y/o triespecíficos y preferentemente heterólogo en los
animales o humanos a tratar, los linfocitos T presentes en exceso en
la sangre periférica se unan y preactiven gracias al brazo de unión
de alta afinidad de estos anticuerpos. Además, las células inmunes
auxiliares positivas para el receptor de Fc presentes pueden unirse
por la porción Fc del anticuerpo biespecífico o triespecífico. Si
este complejo celular de células T y células positivas para el
receptor de Fc es dirigido por el segundo brazo de unión al tumor de
alta afinidad hacia las células tumorales presentes en número
relativamente bajo, éstas serán destruidas por los linfocitos T o
por las células positivas para el receptor de Fc, respectivamente, y
fagocitadas por las células positivas para el receptor de Fc
integradas en el complejo celular, como los macrófagos. Esto se ha
demostrado experimentalmente utilizando monocitos/macrófagos humanos
marcados y células tumorales. En una siguiente etapa, el material
tumoral incorporado se procesará y presentará al sistema inmune
mediante la clase I MHC y en particular las moléculas de clase II,
lo que es un prerrequisito importante para la reacción humoral
observada.
Tal como se demuestra por el Ejemplo de acuerdo
con la presente invención, la detección de anticuerpos reactivos
tumorales formados después de una terapia es dependiente de la
activación de linfocitos T específicos de tumor CD4+, que son
capaces de estimular los clones de células B específicas de tumor
mediante la cooperación de células T/B. En consecuencia, mediante la
detección indirecta de una reacción inmune humoral también es
posible proporcionar una evidencia de una respuesta de célula T CD4
y ofrecer así una explicación de la supervivencia de los ratones
como resultado de la administración alternada en el tiempo de
células tumorales y anticuerpos.
El desarrollo de una protección inmune de larga
duración contra el tumor mediante bsacs se examinó en un modelo de
tumor autólogo murino. En primer lugar, ratones C57Beispiel/6
recibieron una dosis letal de células de melanoma autólogo y, al
cabo de dos días, una segunda inyección de anticuerpos parentales o
biespecíficos, respectivamente. Para analizar el desarrollo de una
respuesta de larga duración en los ratones, los ratones
supervivientes se sometieron a otra administración tumoral después
de 100 días, sin embargo, en este caso, sin anticuerpos. Además,
para poder cuantificar la implicación de las células tumorales
administradas en el desarrollo de una protección inmune, se
realizaron experimentos utilizando una dosis tumoral baja de 1500
células tumorales (tcs), así como una dosis tumoral elevada de 5000
células tumorales. Aparte de la supervivencia de los ratones, la
presencia de respuesta inmune humoral contra el tumor se utilizó
como otro criterio para la protección inmune. Con este propósito, se
compararon los sueros de los ratones antes y después de 100 días de
tratamiento (es decir, inmediatamente antes de la administración del
segundo tumor) respecto a la presencia de anticuerpos
anti-tumorales.
La Figura 1 muestra las curvas de supervivencia
de los ratones después de la primera administración tumoral con 1500
ó 5000 células tumorales, respectivamente. Mientras que todos los
ratones controles sin tratamiento con anticuerpo murieron a los 35
días, todos los ratones tratados con bsac pudieron ser curados. En
comparación, de los ratones tratados con una combinación de dos acs
parentales únicamente el 84% sobrevivió después de la dosis tumoral
baja y sólo el 16% sobrevivió después de la dosis tumoral
elevada.
Esta diferencia cualitativa entre los bsacs y los
acs parentales también se observó en relación con el desarrollo de
una reacción inmune humoral. La Figura 2 muestra la respuesta inmune
humoral contra las células tumorales tal como se cuantificó por
citometría de flujo. Mientras que los supervivientes del "grupo
parental" no presentaron una respuesta inmune humoral, dicha
respuesta sí se observó en los ratones del "grupo
biespecífico". En este sentido, fue especialmente importante la
cantidad de material tumoral administrado. Hubo una diferencia
significativa entre los grupos con una cantidad baja o alta de tumor
administrado. Después de una dosis tumoral baja determinada,
únicamente el 17% de los ratones presentaron un título alto y el 33%
bajo, mientras que un título alto se detectó en el 66% de los
ratones con la dosis tumoral mayor.
Además, los resultados obtenidos en relación con
la reacción inmune humoral se correlacionan de forma evidente con la
supervivencia de los ratones después de la segunda administración
tumoral, pero sin la consiguiente inyección de anticuerpos.
Únicamente los ratones que habían desarrollado un título de
anticuerpos alto contra el tumor sobrevivieron a la administración
tumoral, o murieron tras un período de tiempo prolongado en
comparación con el grupo control sin inmunización. Por el contrario,
todos los ratones sin un título detectable murieron primero y sin
tardanza en comparación con el grupo control. La Figura 3 muestra
las curvas de supervivencia de los ratones que habían recibido una
segunda administración sin haberse sometido a otro tratamiento de
anticuerpos más tarde. Los ratones que habían recibido una primera
dosis de 5000 tcs mostraron de forma marcada una mejor supervivencia
en comparación con los ratones de una primera administración de
dosis baja de 1500 tcs.
Los anticuerpos de utilidad de acuerdo con la
presente invención son capaces de activar las células positivas para
el receptor Fc, por lo que se inicia o incrementa la expresión de
citocinas y/o antígenos co-estimuladores.
En el caso de los anticuerpos triespecíficos, la
unión de las células positivas para los receptores de Fc tiene lugar
por ejemplo mediante el receptor Fc de las células positivas para
los receptores de Fc, o alternativamente mediante otros antígenos en
dichas células (células presentadoras de antígenos) como por ejemplo
el receptor de manosa.
Mediante la aplicación alternada en el tiempo de
anticuerpos biespecíficos y/o triespecíficos preferentemente
heterólogos de la presente invención, se desarrolla en el paciente
una inmunidad anti-tumoral y preferentemente una
inmunidad anti-tumoral de larga duración. La
administración (reinyección) se realiza preferentemente en un
paciente después del tratamiento del tumor primario, preferentemente
en pacientes con una situación de enfermedad residual mínima (MRD).
En los pacientes con una cantidad baja de células tumorales
residuales en los que, sin embargo, el riesgo de recidiva puede ser
elevado, la aplicación alternada en el tiempo descrita de acuerdo
con la presente invención es especialmente satisfactoria.
De los anticuerpos biespecíficos y/o
triespecíficos heterólogos que pueden utilizarse de acuerdo con la
presente invención, algunos son conocidos y otros se describen por
primera vez en la aplicación anterior. Un ejemplo para bsac es el
anticuerpo anti-CD3 x anti-EpCAM
(GA-733-2) que se utiliza en tumores
epiteliales como el carcinoma mamario.
En la célula tumoral, tiene lugar una regulación
positiva de MHCI además de una activación de la maquinaria de
procesamiento intracelular (complejo del proteosoma) debido a la
liberación de citoquinas (como INF-\gamma y
TNF-\alpha) en la proximidad de la célula tumoral.
Las citocinas se liberan gracias a la activación mediada por
anticuerpos biespecíficos de células T y células auxiliares. Esto
significa que mediante los bsacs se destruyen o se fagocitan no sólo
las células tumorales sino que indirectamente también se incrementa
la inmunogenicidad anti-tumoral.
La activación de la célula positiva para el
receptor de Fc por el bsac es dependiente de la subclase o de la
combinación de subclase respectiva. Tal como se demostró mediante
experimentos in vitro, por ejemplo, los bsacs de la
combinación de subclases
IgG2a-ratón/IgG2b-rata son capaces
de unirse a y activar simultáneamente las células positivas para el
receptor de Fc que conducen a una regulación positiva o a una
formación nueva (expresión), respectivamente, de los antígenos
co-estimuladores como el CD40, CD80, o CD86 en la
superficie de estas células. Mientras que los bsacs de la
combinación de subclases
IgG1-ratón/IgG2b-rata son capaces de
unirse a las células positivas para el receptor de Fc ((1) Haagen y
col., J. Immunology, 1995, 154:1852-1860), pero
evidentemente son incapaces de activar estas células con intensidad
comparable ((2) Gast y col., Cancer Immunol. Immunother., 1995,
40:390).
Mientras que el bsac intacto se une y
simultáneamente activa la célula T con un brazo de unión (p.ej., CD3
o CD2), las señales co-estimuladoras de la célula
positiva para el receptor de Fc unidas a la porción Fc del bsac
pueden transferirse a la célula T, es decir, únicamente la
combinación de la activación de célula T mediante un brazo de unión
del bsac y la transferencia simultánea de las señales
co-estimuladoras desde la célula positiva para el
receptor de Fc a la célula T conducen a una activación eficiente de
célula T (Fig. 4A). Asimismo, las células T específicas de tumor
que han sido activadas de forma insuficiente por la célula tumoral
y en consecuencia son anérgicas pueden ser reactivadas mediante el
pretratamiento ex-vivo de la presente
invención (Fig. 4B).
Otro aspecto importante en la inducción de
inmunidad anti-tumoral es la posible fagocitosis,
procesamiento y presentación de componentes tumorales por las
células auxiliares (monocitos/macrófagos, o células dendríticas) que
han sido marcadas por el bsac. Mediante este mecanismo clásico de
presentación de antígenos, pueden generarse tanto células positivas
para CD4 y específicas de tumor como células positivas para CD8.
Además, las células CD4 específicas de tumor desempeñan una función
importante en la inducción de una respuesta inmune humoral en el
contexto de cooperación de células T/B.
Los anticuerpos biespecíficos y triespecíficos
son capaces de unirse al complejo de receptor de célula T en la
célula T con un brazo de unión y a los antígenos asociados al tumor
en la célula tumoral con el segundo brazo de unión. En consecuencia,
se activan las células T que destruyen las células tumorales al
liberar citocinas o mediante mecanismos mediadores de apoptosis.
Además, en el marco de activación de las células T por los
anticuerpos biespecíficos, parece probable que las células T
reconozcan los antígenos específicos de tumor mediante su receptor,
con lo que se inicia una inmunización de larga duración (Fig. 4B).
En este sentido, es de especial importancia que la porción Fc
intacta del anticuerpo biespecífico o triespecífico medie la unión
con las células auxiliares como monocitos/macrófagos y células
dendríticas, causando el desarrollo de su citotoxicidad y/o la
transferencia concomitante de señales
co-estimuladoras importantes a la célula T.
Evidentemente, de esta forma puede inducirse una respuesta de
células T contra péptidos específicos del tumor, que eran
desconocidos hasta hoy.
Redirigiendo las células T específicas de tumor y
posiblemente anérgicas contra las células tumorales mediante
anticuerpos biespecíficos y/o triespecíficos y
co-estimulando simultáneamente dichas células T
mediante la unión de células auxiliares con la porción Fc del
anticuerpo biespecífico o triespecífico, se puede eliminar el estado
anérgico de las células T citotóxicos (CTLs), es decir, se puede
eliminar una tolerancia de célula T preexistente en el paciente
hacia el tumor mediante anticuerpos biespecíficos y/o triespecíficos
heterólogos y, en consecuencia, es posible inducir una inmunidad
antitumoral de larga duración.
Esta última cuestión se apoya en resultados
iniciales in vivo de experimentos con ratones que indican el
desarrollo de este tipo de inmunidad anti-tumoral
de larga duración después del tratamiento con un tumor singénico y
bsacs intactos. En estos experimentos, de los 14 animales de ensayo
tratados satisfactoriamente con bsacs después de una primera
inyección tumoral, todos sobrevivieron a una segunda inyección
tumoral llevada a cabo 144 días después de la primera inyección
-sin administración de bsac adicional-.
Preferentemente, los anticuerpos utilizados de
acuerdo con la presente invención son capaces de reactivar los
antígenos específicos de tumor que se hallan en un estado de
energía. Además, son capaces de inducir anticuerpos de unión al
complemento y reactivos con el tumor, en consecuencia, inducir una
respuesta inmune humoral.
La unión a la célula T tiene lugar
preferentemente mediante CD3, CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28 y/o
CD44. Las células positivas para el receptor de Fc tienen por lo
menos un receptor Fc\gamma I, II o III.
Los anticuerpos que pueden utilizarse de acuerdo
con la presente invención son capaces de unirse a monocitos,
macrófagos, células dendríticas, células T "supresoras
naturales" (células NK) y/o neutrófilos activados que son células
positivas para el receptor Fc\gamma I y/o II.
Los anticuerpos que pueden utilizarse de acuerdo
con la invención conducen a la iniciación o al incremento de la
expresión de CD40, CD80, CD86, ICAM-1, y/o
LFA-3 que son antígenos
co-estimuladores, y/o la secreción de citoquinas por
la célula positiva para el receptor de Fc. Preferentemente, las
citocinas son IL-1, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-8,
IL-12, INF-\gamma y/o
TNF-\alpha.
Preferentemente, la unión a las células T tiene
lugar mediante el complejo de receptor de célula T en dicha
célula.
Los anticuerpos biespecíficos que se pueden
utilizar de acuerdo con la presente invención son por ejemplo:
un anticuerpo anti-CD3 X
anti-antígeno asociado al tumor y/o un anticuerpo
anti-CD4 X anti-antígeno asociado al
tumor y/o un anticuerpo anti-CD5 X
anti-antígeno asociado al tumor y/o un anticuerpo
anti-CD6 X anti-antígeno asociado al
tumor y/o un anticuerpo anti-CD8 X
anti-antígeno asociado al tumor y/o un anticuerpo
anti-CD2 X anti-antígeno asociado al
tumor y/o un anticuerpo anti-CD28 X
anti-antígeno asociado al tumor y/o un anticuerpo
anti-CD44 X anti-antígeno asociado
al tumor.
Los anticuerpos triespecíficos que se pueden
utilizar de acuerdo con la presente invención son
preferentemente:
un anticuerpo anti-CD3 X
anti-antígeno asociado al tumor y/o un anticuerpo
anti-CD4 X anti-antígeno asociado al
tumor y/o un anticuerpo anti-CD5 X
anti-antígeno asociado al tumor y/o un anticuerpo
anti-CD6 X anti-antígeno asociado al
tumor y/o un anticuerpo anti-CD8 X
anti-antígeno asociado al tumor y/o un anticuerpo
anti-CD2 X anti-antígeno asociado al
tumor y/o un anticuerpo anti-CD28 X
anti-antígeno asociado al tumor y/o un anticuerpo
anti-CD44 X anti-antígeno asociado
al tumor.
Los anticuerpos triespecíficos que pueden
utilizarse de acuerdo con la presente invención tienen por lo menos
un brazo de unión a célula T, un brazo de unión a célula tumoral y
un brazo de unión a células positivas para el receptor de Fc. Este
último brazo de unión puede ser un brazo de unión
anti-receptor Fc o un brazo de unión al receptor de
manosa.
Preferentemente, el anticuerpo biespecífico es un
anticuerpo biespecífico de rata/ratón intacto y heterólogo.
Mediante los anticuerpos biespecíficos y
triespecíficos que pueden utilizarse de acuerdo con la presente
invención, se activan y redirigen las células T contra las células
tumorales. Los anticuerpos preferidos, biespecíficos, intactos y
heterólogos de utilidad se seleccionan a partir de una o más de las
combinaciones de isotipos siguientes:
IgG2b-rata/IgG2a-ratón,
IgG2b-rata/IgG2b-ratón,
IgG2b-rata/IgG3-ratón;
IgG2b-rata/IgG1-humana,
IgG2b-rata/IgG2-humana,
IgG2b-rata/IgG3-humana
[alotipo oriental G3m(st)= unión a la proteína A],
IgG2b-rata/IgG4-humana;
IgG2b-rata/IgG2c-rata;
IgG2a-ratón/IgG3-[alotipos
caucásicos G3m(b+g) = no unión a proteína A, en los
siguientes indicado por *]-humana
IgG2a-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*-[CH2-CH3]-humana
IgG2a-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-[IgG3*-[CH2-CH3]-humana
IgG2a-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG1-[bisagra]-humana-[IgG3*-[CH2-CH3]-humana
[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*-[CH2-CH3]-humana
[VH-CH1-VL-CL]-ratón-IgG4-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG4
-[bisagra]-humana-IgG4[región
N-terminal de
CH2]-humana-IgG3*[región
C-terminal de CH2:>posición aa
251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG2b-rata/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra-CH2-CH3]-humana
IgG2b-rata/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG2-[bisagra-CH2-CH3]-humana
IgG2b-rata/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG3-[bisagra-CH2-CH3,
alotipo oriental]-humana
IgG2b-rata/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG4-[bisagra-CH2-CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*-[CH2-CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG4[región
N-terminal de
CH2]-humana-IgG3*
[región C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
[región C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG4[región
N-terminal de
CH2]-humana-IgG3*
[región C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
[región C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG2[región
N-terminal de CH2]-IgG3*[región
C-terminal de CH2:>posición aa
251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG2[región
N-terminal de CH2]-IgG3*[región
C-terminal de CH2:>posición aa
251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
IgG2-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG2-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
IgG4-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG4-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
\newpage
IgG4-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG4-[bisagra]-humana-IgG4[región
N-terminal de CH2]-IgG3*
[región C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
[región C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG2b-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
IgG2b-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
IgG2b-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG4-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG4-[bisagra]-humana-IgG4-[CH2]-humana-IgG3*-[CH3*]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG4-[CH2]-humana-IgG3*-[CH3*]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG4-[CH2]-humana-IgG3*-[CH3*]-humana
IgG4-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG4-[bisagra]-humana-IgG4-[CH2]-humana-IgG3*-[CH3*]-humana
Preferentemente, los anticuerpos de utilidad de
acuerdo con la presente invención son anticuerpos intactos
monoclonales, quiméricos, recombinantes, sintéticos,
semi-sintéticos o modificados químicamente que
tienen por ejemplo fragmentos Fv, Fab, scFv o
F(ab)_{2}.
Preferentemente, se utilizan anticuerpos o sus
derivados o fragmentos de origen humano, o aquellos modificados para
ser adecuados para su utilización en humanos (los denominados
"anticuerpos humanizados") (ver por ejemplo Shalaby y col., J.
Exp. Med. 175 (1992), 217; Mocikat y col., Transplantation 57
(1994), 405).
La preparación de los distintos tipos de
anticuerpos y fragmentos de anticuerpos anteriormente mencionados es
bien conocida por el experto en la materia. La preparación de
anticuerpos monoclonales, preferentemente de origen mamífero,
p.ej., humanos, de rata, ratón, conejo, o cabra, puede realizarse
utilizando procedimientos convencionales como los descritos por
ejemplo en Köhler y Milstein (Nature 256 (1975), 495), en Harlow y
Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988); Cold Spring Harbor) o
en Galfré (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) o en DE 195 31 346.
Además es posible preparar los anticuerpos
descritos mediante la tecnología del DNA recombinante de acuerdo con
las técnicas conocidas por el experto en la materia (ver kurucz y
col., J. Immunol. 154 (1995), 4576; Hollinger y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90 (1993), 6444).
La preparación de anticuerpos con dos
especificidades distintas, los denominados anticuerpos
biespecíficos, se pueden realizar bien mediante la tecnología del
DNA recombinante, o bien mediante la técnica conocida como fusión de
hibridomas híbridos (ver por ejemplo Milstein y col., Nature 305
(1983), 537). Esta técnica incluye la fusión de líneas celulares de
hibridomas productoras cada una de anticuerpos con una de las
especificidades deseadas y la identificación y aislamiento de
líneas celulares recombinantes productoras de anticuerpos con ambas
especificidades.
El problema subyacente en la presente invención
puede solucionarse utilizando anticuerpos biespecíficos o
triespecíficos si presentan propiedades y efectos caracterizados en
la reivindicación 1. A continuación, se describe con mayor detalle
la preparación de anticuerpos con dos o tres especificidades,
respectivamente. Para ello se ha incorporado aquí mediante
referencias en su totalidad las referentes a los anticuerpos
biespecíficos y triespecíficos y a los procedimientos de
preparación.
La preparación de anticuerpos que presentan tres
especificidades, los denominados anticuerpos
tri-específicos, que son adecuados para solucionar
el problema subyacente en la presente invención puede, por ejemplo,
llevarse a cabo acoplando a una de las cadenas pesadas de IgG de un
anticuerpo biespecífico un tercer sitio de unión antigénica con una
especificidad adicional, p.ej., en la forma de "fragmentos
variables de cadena sencilla" (scFv). El scFv puede acoplarse,
por ejemplo, utilizando un
-S-S(G_{4}S)_{n}D-I-engarce
a una de las cadenas pesadas (S=serina,
G=glicina, D=aspartato,
I=isoleucina).
De forma análoga, las construcciones
triespecíficas F(ab)_{2} pueden prepararse
reemplazando las regiones CH2-CH3 de la cadena
pesada de una especificidad de un anticuerpo biespecífico mediante
un scFv con una tercera especificidad, mientras que las regiones
CH2-CH3 de la cadena pesada con la otra
especificidad pueden eliminarse por ejemplo mediante inserción de un
codón de parada (en el extremo de la región "bisagra") en el
gen codificante mediante, por ejemplo, recombinación homóloga (ver
Fig. 5).
También es posible preparar las construcciones
scFv triespecíficas en donde las tres regiones VH-VL
que representan las tres especificidades distintas se ordenan en
series (Fig. 6).
De acuerdo con la presente invención, existen por
ejemplo anticuerpos biespecíficos intactos utilizados. Estos
anticuerpos biespecíficos intactos están compuestos de dos
semi-moléculas de anticuerpo (cada una con una
cadena de inmunoglobulina H y una L) con una especificidad para
cada molécula, y adicionalmente con una porción Fc como los
anticuerpos normales, que realizan las bien conocidas funciones
efectoras. Estos se preparan preferentemente utilizando la
tecnología del cuadroma. Este procedimiento de preparación se
ejemplifica en la patente DE-A-4419
399. Para una descripción completa, este documento se ha incorporado
en su totalidad mediante referencias y también en relación con la
definición de anticuerpos biespecíficos. Se sobreentiende que otros
procedimientos de preparación también son útiles si conducen a
anticuerpos biespecíficos intactos de acuerdo con la definición
anterior y según la presente invención.
Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos
intactos pueden producirse en cantidades suficientes utilizando un
procedimiento de preparación desarrollado recientemente (6). La
combinación de 2 anticuerpos biespecíficos dirigidos contra 2
antígenos distintos asociados al tumor (p.ej.,
c-erb-B2, ep-cam,
como GA-733-2=C215), en las células
de carcinoma mamario minimiza el riesgo de no reconocer las células
tumorales que expresen únicamente uno de los antígenos.
También se ha intentado lograr una inmunidad
anti-tumoral mediante tratamiento con fragmentos
F(ab')_{2} biespecíficos con especificidades
anti-c-erb-B2 x
anti-CD64. La principal desventaja de los fragmentos
bsF(ab')_{2} deriva de que las especificidades utilizadas
únicamente contra células Fc\gammaRI puedan redirigirse contra el
tumor. Mediante este anticuerpo biespecífico, las células T no se
redirigen al tumor. Aunque las células Fc\gammaRI+ puedan activar
células T específicas de tumor indirectamente por la presentación de
péptidos específicos de tumor (mediante MHC I o MHC II,
respectivamente) después de, por ejemplo, la fagocitosis de los
componentes de la célula tumoral, la eficiencia de la inducción de
inmunidad anti-tumoral, en este caso, es inferior
porque las células T no están unidas por este bsac y no pueden
contribuir a la co-estimulación de células
positivas para el receptor Fc.
Otras ventajas de los bsacs intactos capaces de
redirigir las células T en comparación con los fragmentos
bsF(ab')_{2} anteriormente mencionados se puede detallar
de la manera siguiente:
- 1.
- Es posible para las células positivas para el receptor Fc unirse a bsacs intactos y contribuir por una parte a eliminar directamente el tumor mediante ADCC (citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo) y por otra parte a la activación de células T, tal como se detalló anteriormente.
- 2.
- Los bsacs intactos redirectores de célula T también funcionan en el direccionamiento de células T específicas de tumor anergizadas hacia la célula tumoral, que de acuerdo con la invención pueden ser reactivadas directamente en el sitio tumoral. Esto no puede lograrse mediante un fragmento bsF(ab')2 con especificidades de anti-CD64 X anti-antígeno asociado a tumor.
- 3.
- Un fragmento bsF(ab')2 con especificidades de anti-CD64 X anti-antígeno asociado al tumor únicamente es capaz de lograr una inmunidad anti-tumoral en el 30% de los pacientes, mientras que de acuerdo con la presente invención, que utiliza bsacs intactos redirectores de células T en experimentos con ratones, se puede lograr una protección del 100% de los animales.
La Unión del bsac con el FcG-RI
muestra dos ventajas esenciales en relación con una efectividad
anti-tumoral óptima:
(1) Las células positivas
Fc\gamma-RI tienen la capacidad de eliminar las
células tumorales mediante el ADCC y, en consecuencia, son capaces
de contribuir sinergísticamente al efecto
anti-tumoral de las células T citotóxicas dirigidas
contra la célula tumoral por los bsacs.
(2) Las células positivas
Fc\gamma-RI (como los monocitos/macrófagos/células
dendríticas) son capaces de proporcionar señales
co-estimuladoras importantes similares a la
presentación del antígeno a la célula T y, en consecuencia, evitar
la anergización. Además, tal como se muestra en la Figura 4, incluso
las células T con un receptor de célula T que reconoce péptidos
específicos tumorales (antígenos expresados por la vía MHC en la
célula tumoral) pueden estimularse como un producto intermedio
debido a la interacción mediada por bsac de la célula T con células
auxiliares y tumorales. En esta constelación, los estímulos
conjuntos necesarios para la activación correcta de la célula T
podrían proporcionarse por la célula auxiliar (como el monocito).
Así, a pesar de la destrucción directa del tumor mediada por bsac
independiente del receptor de célula T (Fig. 4A), el anticuerpo de
la presente invención debería también ser capaz de activar y
generar células T específicas de tumor (Fig. 4B), que después de la
degradación del bsac continúen patrullando en el paciente. Esto
significa, que al igual que en la terapia génica (p.ej., mediante
la incorporación de antígenos co-estimuladores como
el B-7 en la célula tumoral), la tolerancia tumoral
en el paciente puede ser eliminada por los bsacs intactos.
En este sentido es además ventajoso que la
expresión de Fc\gamma-RI sobre las células
respectivas se regule positivamente después del tratamiento con
G-CSF.
Los anticuerpos intactos, preferentemente
biespecíficos y/o triespecíficos heterólogos que se utilizan de
acuerdo con la presente invención tienen las siguientes propiedades
de:
- a)
- unión a célula T;
- (b)
- unión a por lo menos un antígeno sobre una célula tumoral;
- (c)
- unión, mediante la porción Fc (en el caso de anticuerpos biespecíficos) o una tercera especificidad (en el caso de anticuerpos triespecíficos), a las células positivas para el receptor de Fc,
con lo que dichos anticuerpos inducen una
respuesta inmune y/o destruyen las células tumorales, y en donde
dicho anticuerpo se selecciona para unirse a un antígeno de
superficie, como el antígeno diana sobre la célula tumoral, el cual
puede inducirse y no está presente en la célula en el estado no
inducido (estado normal), o está presente en una cantidad tan baja
que es insuficiente para la destrucción de la célula (Figs. 7A +
B).
Se ha demostrado que después de la inducción, un
número relativamente pequeño de antígenos diana sobre la célula
tumoral es suficiente para unirse a los anticuerpos biespecíficos y
triespecíficos intactos para inducir la destrucción de la célula
tumoral y/o la respuesta inmune. De acuerdo con la invención, una
"cantidad pequeña" significa una cantidad de antígenos diana
sobre la célula tumoral de 100 antígenos diana por célula diana,
preferentemente más de 300 y aún más preferentemente más de 1000
antígenos diana por célula tumoral. Los antígenos diana inducibles
pueden también estar presentes en una cantidad de hasta 500.000 por
célula diana, siendo también inducibles cantidades de hasta 400.000,
300.000, 200.000 ó 100.000 por célula diana. Otros intervalos de
cantidad preferidos para los antígenos diana van desde 50.000 a
100.000 y desde 5000 a 50.000.
Ejemplos de antígenos de superficie inducibles
sobre las células tumorales (antígenos diana) que pueden utilizarse
para una inmunoterapia mediante anticuerpos biespecíficos y
triespecíficos son las proteínas de choque térmico y las moléculas
MIC "relacionadas con la clase I MHC". Las proteínas de choque
térmico (Hsp) se sintetizan por la célula en respuesta al estrés
celular. De acuerdo con la presente invención, "el estrés
celular" incluye por ejemplo una degeneración de la célula, el
efecto de la radiación, de sustancias químicas y de temperatura
elevada sobre la célula, además del efecto de una infección de la
célula producida por microorganismos. En la actualidad, se conocen
cuatro familias de proteínas de choque térmico, las cuales se
diferencian por su distinto peso molecular. Estas familias son
denominadas como Hsp25, Hsp60, Hsp70 y Hsp90 en donde el número
proporciona el peso molecular aproximado de las proteínas de estrés
en kilodaltons. Las proteínas de choque térmico se caracterizan por
tener secuencias aminoacídicas altamente conservadas, en donde el
grado de conservación es superior al 35% de identidad aminoacídica,
preferentemente del 35-55%, más preferentemente del
55-65% y todavía más preferentemente entre el
75-80% de identidad aminoacídica.
Se hace referencia a los artículos de revisión
siguientes: Annu. Rev. Genet. 27, 437-496 (1993);
Biochimie 76, 737-747 (1994); Cell. Mol. Life Sci.
53, 80-129, 168-211 (1997);
Experientia 48, 621-656 (1992); Kabakov & Gabai,
Heat Shock Proteins and Cytoprotection, Berlin: Springer 1997.
Normalmente, las proteínas de choque térmico no
se expresan en tejido sano. Sin embargo, hay estudios que muestran
que las proteínas de choque térmico pueden expresarse por ejemplo
en líneas de células tumorales derivadas de pacientes (Melcher y
col., Nature Medicine, 4:581, 1998). Sin embargo, la expresión de
las proteínas de choque térmico en las líneas de células tumorales
es relativamente débil y en consecuencia no es adecuada para las
aproximaciones inmunoterapéuticas conocidas actualmente y que
utilizan anticuerpos monoclonales y anticuerpos
biespecíficos
(F(ab)_{2}) incompletos.
(F(ab)_{2}) incompletos.
Ejemplos de proteínas de choque térmico son las
Hsp60 y la Hsp70/72.
Lo mismo se aplica a las moléculas MIC. Estas
moléculas también pueden ser inducidas mediante estrés celular, tal
como se definió con mayor detalle anteriormente. Las moléculas MIC
son moléculas relacionadas con la clase I MHC y se hallan bajo el
control de elementos del promotor de choque térmico (Groh y col.,
PNAS 93:12445, 1996).
Ejemplos de moléculas MIC son la MIC A y la MIC
B. Así, las moléculas MIC, que en un tejido normal no se expresan o
se expresan tan poco, son inadecuadas como estructura diana para
ser reconocidas por un anticuerpo con el fin de lograr la
destrucción de las células; mientras que, por ejemplo, en los
tumores epiteliales dichas moléculas se expresan en tal cantidad
que podrían utilizarse como antígenos diana en inmunoterapia con
los anticuerpos biespecíficos y triespecíficos proporcionados por
la presente invención.
Los anticuerpos biespecíficos o triespecíficos
intactos de acuerdo con la presente invención se seleccionan para
ser dirigidos contra por lo menos un antígenos diana en una célula
tumoral, antígeno que es inducible y normalmente no está presente
en la célula tumoral en un estado no inducido. La cantidad de
antígenos inducidos es por ejemplo de aproximadamente 100 antígenos
diana/célula. Sin embargo, ello no significa que dicho antígeno
diana esté ausente en otras células; es decir células
no-diana. Por ejemplo, las proteínas de choque
térmico están presentes en tejido de rápida regeneración, p.ej.,
las células de la mucosa del tracto gastrointestinal e incluso en
estado fisiológico cuando se expresan de forma constitutiva. Sin
embargo, estas proteínas de choque térmico no se abarcan en la
presente invención ya que no son inducibles pero sí están presentes
en el tejido normal. También, algunas células de la mucosa del
tracto gastrointestinal pueden ser destruidas por los anticuerpos
de la presente invención dirigidos contra las proteínas de choque
térmico, ya que como se explicó anteriormente estas células expresan
constitutivamente las proteínas de choque térmico en su superficie.
Aunque la posible destrucción de dichas células es una desventaja
para el paciente, no se considera relevante comparado con la
destrucción que se puede lograr del tumor.
Por ello, el tejido de rápida regeneración no es
la diana principal para los anticuerpos de la presente invención,
pero puede ser un "blanco" para estos anticuerpos si el
anticuerpo, de acuerdo con la presente invención, no únicamente
reconoce los antígenos diana inducibles en la célula tumoral, sino
que también lo hace cuando estos antígenos estén presentes en p.ej.,
el tejido de rápida regeneración. Ya que estos tejidos se dividen
rápidamente, después de finalizar la terapia con anticuerpos, se
puede regenerar rápidamente el estado original de este tejido para
que de nuevo pueda desempeñar su función fisiológica. En
consecuencia, la invención no se refiere al reconocimiento de
antígenos por los anticuerpos biespecíficos y triespecíficos, de
acuerdo con la presente invención, en p.ej., el tejido de rápida
regeneración, en donde probablemente se expresen de forma
constitutiva, sino que la invención comprende exclusivamente
aquellos anticuerpos dirigidos contra antígenos diana que son
inducibles en la célula tumoral y que pueden expresarse, por
ejemplo, de forma constitutiva después de la inducción.
De acuerdo con la presente invención, el término
"inducible" hace referencia a aquellos antígenos diana que son
operativamente específicos de tumor y no están presentes en la
célula en su estado fisiológico normal, o están presentes en tan
poca cantidad que no es posible inducir una respuesta inmune contra
dichos antígenos, o debido a su reducido número no se produce una
destrucción celular, o sólo se presentan en cantidad insuficiente o
sin utilidad terapéutica.
Los anticuerpos biespecíficos y triespecíficos
intactos de acuerdo con la presente invención sirven para dirigir
no sólo un tipo de células inmunes contra las células tumorales,
sino también para dirigir las células T y las células auxiliares y
en consecuencia son especialmente adecuados para el reconocimiento
de antígenos de superficie inducibles, que son las estructuras diana
operativas. Es posible demostrar que tan sólo un número pequeño de
antígenos diana, aproximadamente de 100 a 5000 antígenos por célula
en la superficie de la célula tumoral es suficiente para lograr su
destrucción. Los experimentos in vitro realizados con este
fin utilizando preparaciones de células madre (PBSZ) se describen en
el siguiente Ejemplo A. Así, la clase de anticuerpos biespecíficos
y triespecíficos intactos de acuerdo con la presente invención es
capaz de destruir las células tumorales o de iniciar una respuesta
inmune después del reconocimiento de estas células, aún cuando la
expresión de los antígenos diana sea muy baja.
Ya que están dirigidos contra antígenos
inducibles, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención
pueden contribuir a solucionar el problema de una falta de
antígenos diana específicos de una célula diana y necesarios para
una inmunoterapia de células tumorales.
Después de haber conseguido evidencias de la
extraordinaria eficacia de los bsacs intactos en modelos animales
preclínicos, no sólo in vitro sino también in vivo
(Lindhofer y col., Blood, 88: 5651, 1996), se desarrolló la
purificación de preparaciones de células madre a partir de células
tumorales contaminantes como otra posible utilización (Lindhofer y
col., Exp. Hematol. 25:879, 1997).
Basándose en estos experimentos, los
consiguientes experimentos con preparaciones de células madre
completas (aproximadamente 2 x 10^{10} células) fueron capaces de
demostrar en particular una eficacia en el intervalo subsaturado de
antígenos diana. Así, en experimentos de titulación, la cantidad de
bsac administrada fue tan baja que en una preparación de PBSZ
(célula madre de sangre periférica) que contenía aproximadamente
6,5 x 10^{9} células T a una dosis de 5 \mug de
anticuerpo/preparación, únicamente 3000 moléculas CD3 de las
aproximadamente 30.000 moléculas CD3/célula T fueron unidas por bsac
(ver los cálculos). Y todavía los bsacs intactos fueron capaces de
destruir las células diana (aquí célula tumoral
HCT-8) incluso en dichas condiciones.
Los experimentos se realizaron de forma que las
alícuotas se obtuvieron de las preparaciones PBSZ tratadas y
contaminadas con una cantidad de células tumorales definida. Podría
demostrarse que las células tumorales se destruyen incluso a esta
concentración baja de bsacs intactos en la que sólo una parte de
los antígenos diana está ocupada.
- La evaluación del experimento descrito anteriormente proporcionó los siguientes resultados:
- Número total de células PBSZ del Paciente WaGr: 2,5 x 10^{10} + 5 \mug de bsac
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\begin{minipage}[t]{150mm}* Número de pocillos con crecimiento
tumoral sobre placas de 6 ó 12 pocillos, respectivamente, al cabo de
14 días de cultivo.\end{minipage} \cr
\begin{minipage}[t]{150mm}º Los experimentos de titulación
utilizando la línea de células tumorales HCT-8
demostraron que 1-2 células tumorales/pocillo eran
suficientes para representar un crecimiento tumoral claro, que
puede ser evaluado visualmente al cabo de 14 días de
cultivo.\end{minipage} \cr}
Un bsac intacto tiene un peso molecular de 150
KDa, es decir, 1 mol corresponde a 150 KDa y de acuerdo con la
definición corresponde a 6 x 10^{23} moléculas. Así, 5 \mug
corresponden a aproximadamente 2 x 10^{13} moléculas.
En una preparación de células madres se
determinaron 6,5 x 10^{9} células T y dado que una célula T porta
aproximadamente unas 30.000 moléculas CD3, se calculan un total de
19,5 x 10^{13} moléculas CD3 para la preparación de células
madre.
Ya que cada uno de los bsacs tiene un brazo de
unión anti-CD3, puede concluirse que, comparando
teóricamente las dos cantidades de moléculas calculadas
anteriormente en este ejemplo en particular, no más de
aproximadamente 3000 moléculas CD3 pueden estar ocupadas por los
bsacs.
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Claims (22)
1. Utilización de células tumorales autólogas, o
de células tumorales alogénicas del mismo tipo de tumor tratadas
para prevenir su supervivencia después de la reinyección, en una
aplicación alternada en el tiempo con anticuerpos biespecíficos y/o
triespecíficos intactos que tienen las propiedades siguientes
de:
- \alpha)
- unión a una célula T;
- \beta)
- unión a por lo menos un antígeno en una célula tumoral;
- \gamma)
- unión mediante sus porciones Fc en el caso de anticuerpos biespecíficos o mediante una tercera especificidad en el caso de anticuerpos triespecíficos a células positivas para el receptor de Fc;
- para la fabricación de un medicamento,
- en donde las células tumorales y los anticuerpos intactos dirigidos contra las células tumorales se administran de manera alternada en el tiempo al hombre a ser inmunizado con el fin lograr una inmunización contra el tumor.
2. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizada porque dichas células tumorales se
administran antes que los anticuerpos, o dichos anticuerpos se
administran antes que las células tumorales, en donde el intervalo
entre cada administración es de 1-48 horas.
3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, caracterizada porque el intervalo es de
1-24 horas, preferentemente de 1-12
horas, más preferido de 1-6 horas o
1-4 horas o 2-4 horas.
4. Utilización de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque los
anticuerpos se administran mediante una inyección en una cantidad
de 5-500 \mug, preferentemente de
10-300 \mug, más preferido de
1-100 \mug o 10-50 \mug y las
células tumorales se administran mediante una inyección en una
cantidad de 10^{7}-10^{9} células y
preferentemente de aproximadamente 10^{8} células.
5. Utilización de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dichos
anticuerpos se seleccionan por ser capaces de unirse, mediante su
porción Fc en el caso de anticuerpos biespecíficos o mediante su
brazo de unión específico en el caso de anticuerpos triespecíficos,
a las células positivas para el receptor de Fc que tienen un
receptor Fc\gamma I, II, o III.
6. Utilización de acuerdo con la reivindicación
5, caracterizada porque dichos anticuerpos son capaces de
unirse a monocitos, macrófagos, células dendríticas, células "T
supresoras" (células NK) y/o neutrófilos activados que son
células positivas para el receptor I FC\gamma.
7. Utilización de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dichos
anticuerpos son capaces de inducir anticuerpos de unión al
complemento reactivos con el tumor y, en consecuencia, inducir una
respuesta inmune humoral.
8. Utilización de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dichos
anticuerpos se seleccionan para unirse a las células T mediante
CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28 y/o CD44.
9. Utilización de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dichos
anticuerpos se seleccionan para que después de su unión con las
células positivas para el receptor de Fc, se inicie o incremente la
expresión de CD40, CD80, CD86, ICAM-1 y/o
LFA-3, que son antígenos
co-estimuladores, y/o se inicie o incremente la
secreción de citocinas por la célula positiva para el receptor de
Fc.
10. Utilización de acuerdo con la reivindicación
9, caracterizada porque los anticuerpos se seleccionan para
que se incremente la secreción de las citocinas
IL-1, IL-2, IL-4,
IL-6, IL-8, IL-12,
INF-\gamma y/o del
TNF-\alpha.
11. Utilización de acuerdo con la reivindicación
8, caracterizada porque dicho anticuerpo es un anticuerpo
biespecífico, que se selecciona para ser un anticuerpo
anti-CD3 X anti-antígeno asociado al
tumor y/o anticuerpo anti-CD4 X
anti-antígeno asociado al tumor y/o anticuerpo
anti-CD5 X anti-antígeno asociado
al tumor y/o anticuerpo anti-CD6 X
anti-antígeno asociado al tumor y/o anticuerpo
anti-CD8 X anti-antígeno asociado al
tumor y/o anticuerpo anti-CD2 X
anti-antígeno asociado al tumor y/o anticuerpo
anti-CD28 X anti-antígeno asociado
al tumor y/o anticuerpo anti-CD44 X
anti-antígeno asociado al tumor.
12. Utilización de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicho
anticuerpo biespecífico se selecciona a partir de una o más de las
combinaciones siguientes:
IgG2b-rata/IgG2a-ratón,
IgG2b-rata/IgG2b-ratón,
IgG2b-rata/IgG3-ratón;
IgG2b-rata/IgG1-humana,
IgG2b-rata/IgG2-humana,
IgG2b-rata/IgG3 alotipo oriental
G3m(st)-humana,
IgG2b-rata/IgG4-humana;
IgG2b-rata/IgG2c-rata;
IgG2a-ratón/IgG3 alotipos
caucásicos G3m(b+g), en los siguientes indicado por *-
humana
IgG2a-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*-[CH2-CH3]-humana
IgG2a-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-[IgG3*-[CH2-CH3]-humana
IgG2a-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG1-[bisagra]-humana-[IgG3*-[CH2-CH3]-humana
[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*-[CH2-CH3]-humana
[VH-CH1-VL-CL]-ratón-IgG4-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG4
-[bisagra]-humana-IgG4[región
N-terminal de
CH2]-humana-IgG3*[región
C-terminal de CH2:>posición aa
251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG2b-rata/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra-CH2-CH3]-humana
IgG2b-rata/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG2-[bisagra-CH2-CH3]-humana
IgG2b-rata/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG3-[bisagra-CH2-CH3,
alotipo oriental]-humana
IgG2b-rata/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG4-[bisagra-CH2-CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*-[CH2-CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG4[región
N-terminal de
CH2]-humana-IgG3*
[región C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
[región C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG4[región
N-terminal de
CH2]-humana-IgG3*
[región C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
[región C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG2[región
N-terminal de CH2]-IgG3*[región
C-terminal de CH2:>posición aa
251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG2[región
N-terminal de CH2]-IgG3*[región
C-terminal de CH2:>posición aa
251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
IgG2-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG2-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
IgG4-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG4-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
IgG4-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG4-[bisagra]-humana-IgG4[región
N-terminal de CH2]-IgG3*[re-
gión C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
gión C-terminal de CH2:>posición aa 251]-humana-IgG3*[CH3]-humana
IgG2b-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
IgG2b-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
IgG2b-ratón/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG3*[CH2-CH3]-humana
[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG4-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG4-[bisagra]-humana-IgG4-[CH2]-humana-IgG3*-[CH3*]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-rata-IgG1-[bisagra]-humana-IgG4-[CH2]-humana-IgG3*-[CH3*]-humana
IgG1-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-ratón-IgG1-[bisagra]-humana-IgG4-[CH2]-humana-IgG3*-[CH3*]-humana
IgG4-humana/[VH-CH1,
VL-CL]-humana-IgG4-[bisagra]-humana-IgG4-[CH2]-humana-IgG3*-[CH3*]-humana
13. Utilización de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicho
anticuerpo biespecífico es un anticuerpo biespecífico heterólogo,
preferentemente un anticuerpo biespecífico de rata/ratón
heterólogo.
14. Utilización de acuerdo con la reivindicación
8, caracterizada porque dicho anticuerpo es un anticuerpo
triespecífico que se selecciona para ser un anticuerpo
anti-CD3 X anti-antígeno asociado a
tumor y/o un anticuerpo anti-CD4 X
anti-antígeno asociado a tumor y/o un anticuerpo
anti-CD5 X anti-antígeno asociado a
tumor y/o un anticuerpo anti-CD6 X
anti-antígeno asociado a tumor y/o un anticuerpo
anti-CD8 X anti-antígeno asociado a
tumor y/o un anticuerpo anti-CD2 X
anti-antígeno asociado a tumor y/o un anticuerpo
anti-CD28 X anti-antígeno asociado a
tumor y/o un anticuerpo anti-CD44 X
anti-antígeno asociado a tumor.
15. Utilización de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque se utilizan
células tumorales que han sido tratadas mediante irradiación,
preferentemente mediante irradiación gamma y preferentemente a una
dosis de 50 a 200 Gy, o mediante sustancias químicas, de
preferencia mitomicina C.
16. Utilización de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicho
anticuerpo se selecciona para unirse a un antígeno de superficie
que es el antígeno diana en la célula tumoral, el cual es inducible
y está ausente de la célula tumoral en el estado no inducido (estado
normal), o está presente en una cantidad tan pequeña que es
insuficiente para la destrucción de las células tumorales por el
anticuerpo.
17. Utilización de acuerdo con la reivindicación
16, caracterizada porque las células tumorales se someten a
una pretratamiento por calor para incrementar la
inmunogenicidad.
18. Utilización de acuerdo con la reivindicación
16 ó 17, caracterizada porque se utilizan como antígenos
inducibles las proteínas de choque térmico o las moléculas MIC
relacionadas con la MHC de clase I.
19. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque se utilizan
como proteínas de choque térmico las proteínas Hsp25, Hsp60 o Hsp70
(Hsp72) o Hsp90 y como moléculas MIC, MIC A y MIC B.
20. Utilización de acuerdo con la reivindicación
19, caracterizada porque dicho anticuerpo está dirigido
contra antígenos diana que después de la inducción de la célula
diana están presentes en una cantidad mínima de 100 y máxima de
500.000 por célula diana.
21. Utilización de acuerdo con la reivindicación
20, caracterizada porque el anticuerpo se selecciona además
para ser capaz de activar las células positivas para el receptor de
Fc, con lo que se inicia o incrementa la expresión de citocinas y/o
de antígenos co-estimuladores.
22. Utilización de acuerdo con una o más de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la
aplicación alternada en el tiempo de los anticuerpos biespecíficos
y/o triespecíficos intactos se realiza varias veces para
incrementar el éxito de la inmunización.
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