ES2290171T3 - Uso de anticuerpos contra complejos de peptidos mch especificos. - Google Patents
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Abstract
Un método para diagnosticar artritis reumatoide que comprende detectar la presencia de un complejo de péptido-MHC especifico para artritis reumatoide en un paciente con anticuerpos o dominio de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a un complejo peptídico obtenido de MHC-HC-gp39.
Description
Uso de anticuerpos contra complejos de péptidos
MCH específicos.
La presente invención se refiere a métodos de
diagnóstico de artritis reumatoide, anticuerpos monoclonales usados
en este método y; una composición de diagnóstico que comprende estos
anticuerpos.
Las enfermedades autoinmunes son un problema
principal en el cuidado de salud humana. Algunas enfermedades
autoinmunes pueden ser el resultado directo de un proceso
inmunológico dirigido a un antígeno o complejo antigénico mientras
que en otros la reacción autoinmune puede implicar muchos tipos de
antígenos que pueden estar presentes en múltiples órganos.
El papel funcional primario del sistema inmune
es la protección del individuo contra patógeno invasores que tienen
antígenos extraños, es decir no propios. Para cumplir esta función
de manera eficaz y segura, es necesario un mecanismo para
discriminar entre antígenos extraños y autoantígenos obtenidos del
propio cuerpo del individuo. La mayoría de los individuos son
generalmente tolerantes con sustancia que se originan en su propio
cuerpo.
Por otro lado, algunos individuos no son capaces
de reconocer a sus antígenos como propios y generan una respuesta
inmune contra sustancias, tejidos o componentes endógenos. Dicha
respuesta inmune causa gran daño a los órganos que contienen estas
sustancias endógenas. El desarrollo de las enfermedades autoinmunes
asociadas es en general muy lento (cuestión de años) y esto
dificulta el diagnóstico clínico oportuno y el tratamiento de alto
grado. Generalmente el diagnóstico sólo puede realizarse después de
que ya se hayan causado daños considerables al cuerpo.
El diagnóstico de enfermedades autoinmunes tales
como artritis reumatoide (AR) es más difícil en las etapas
tempranas de la enfermedad o cuando están implicadas relativamente
pocas articulaciones y el diagnóstico desfavorable normalmente se
retrasa hasta varios meses después de la aparición de los síntomas.
Distinguir, por ejemplo, la artritis reumatoide de otras causas de
artritis inflamatoria crónica o síndromes de sinovitis transitoria
en este punto es difícil. Frecuentemente se observan pacientes con
un síndrome de poliartritis indiferenciada persistente y la
diferenciación de artritis reumatoide puede ser inicialmente
difícil. Muchos pacientes presentarán signos y síntomas de artritis
inflamatoria pero no tienen artritis reumatoide.
Las posibilidades de que los individuos
desarrollen una enfermedad autoinmune están íntimamente ligadas a
sus antecedentes genéticos: genes que codifican moléculas clase II
del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que presentan
(auto)antígenos para células T de respuesta que reconocen
complejos péptido-MCH muestran una fuerte unión
genética con la susceptibilidad a la enfermedades. En estados
tempranos de enfermedad, se piensa que la patogenia es a través de
de células T. Las células T reconocen moléculas específicas del
complejo mayor de histocompatibilidad, combinadas con un péptido
antigénico gracias al receptor de células T (TCR). La señal
generada por el complejo MHC/péptido/TCR conduce a la activación de
células T. Este complejo trimolecular es el elemento clave en la
respuesta inmune general y en autoimnunidad. Actualmente se cree que
la presentación de autoantígenos procesados unidos a MHC a los TCR
de las células T CD4+ está implicada en la patogénesis de muchas
enfermedades autoinmunes.
Uno de los autoantígenos candidatos
identificados en la artritis reumatoide es la
glicoproteína-39 del cartílago humano (HC
gp-39) (Verheijden et al., 1997, Arthritis
and Rheum., 40: 1115-1125). La inmunización en
ratones BALB/c con esta proteína dio como resultado el desarrollo
de artritis recidivante crónica. La administración intranasal de la
proteína antes de esta inmunización dio como resultado: i) completa
abolición de respuestas DTF, y ii) protección contra o retraso de
la aparición de la enfermedad. Adicionalmente, HC
gp-39 puede reducir la incidencia y gravedad de la
artritis inducida colágeno de tipo II en ratones DBA/1 usando un
régimen de semi-terapéutico. (Joosten et
al., 2000, Arthritis Rheum. 43: 645-655).
Varios péptidos de HC gp-39 se
identificaron como potencialmente auto-reactivos. Al
menos cuatro de estos péptidos (103-116,
259-271, 263-275, y
326-338) son reconocidos por las células T de
pacientes de AR. Curiosamente, HC
gp-39^{263-275} fue reconocido de
forma más destacada en pacientes de AR que en controles sanos, lo
que sugiere un papel de este epítopo de células T en la iniciación
o mantenimiento de la artritis reumatoide. Este péptido es por lo
tanto de interés para fines terapéuticos y de diagnóstico en AR.
Para fines terapéuticos, puede usarse el péptido o una modificación
para tolerización nasal. Adicionalmente, puede usarse el péptido
complejado con DRB 1*0401 por tolerización intravenosa.
El péptido complejado con una molécula MHC puede
explotarse para fines de diagnóstico. La forma convencional de
detección de complejos péptido-MHC específicos la
activación de células T que tienen TCR relevante. Sin embargo,
dichos ensayos funcionales no pueden usarse para identificar el APC
que tiene ligandos de TCR en secciones titulares.
De acuerdo con la presente invención, se han
generado anticuerpos que tienen especificidad por un complejo
péptido-MHC asociado con la artritis reumatoide. El
péptido-MHC es un péptido en el complejo obtenido a
partir de HC gp-39.
Los complejos péptido-MHC son
específicos de síndrome, es decir la enfermedad se caracteriza por
la aparición de dichos complejos específicos de MHC y
autoantígeno.
Actualmente se ha descubierto que estos
complejos específicos a menudo pueden detectarse en los tejidos de
un paciente antes de que pueda realizarse con certeza el diagnóstico
clínico. Los complejos inmunes predicen por lo tanto que enfermedad
se está desarrollando.
La detección oportuna de estos complejos inmunes
en los tejidos o en la sangre del paciente es muy importante porque
el tratamiento del paciente puede iniciarse antes, retrasando, o
incluso previniendo de este modo, los a menudo graves daños durante
la fase tardía de la enfermedad.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la
invención se proporciona un método para diagnosticar una artritis
reumatoide. El método comprende la detección de la presencia de
complejos péptido-MHC específicos autoinmunes en un
paciente que padece una enfermedad autoinmune. La detección hace uso
de anticuerpos que se unen específicamente al complejo
péptido-MHC.
El término anticuerpo como se usa en este
documento se define como una única especie de anticuerpo o múltiples
especies de anticuerpos con características de unión para el
antígeno relevante. El anticuerpo solo reconoce al complejo
péptido-MHC y no reconoce al péptido o al MHC en
solitario. Por lo tanto, el anticuerpo debe ser capaz de reconocer
a un péptido asociado autoinmune específico situado en el surco de
unión de una molécula de MHC. El anticuerpo puede purificarse a
partir de suero que contiene dichos anticuerpos, pero
preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, más
preferiblemente un anticuerpo monoclonal de ratón o de ser humano.
El anticuerpo, por lo tanto, se une al complejo
péptido-MHC específico autoinmune en el paciente que
padece una enfermedad autoinmune. Este complejo específico se
denomina a menudo referido complejo péptido-MHC.
Quedará claro para los especialistas en la
técnica que también los fragmentos del anticuerpo que sigan siendo
capaces de unirse al complejo péptido-MHC específico
forman parte de la invención. Por el término fragmento se entiende
por lo tanto aquellas partes de los anticuerpos que comprenden
regiones de dominio variable tales como Fab, F(ab') 2 o Fv.
El anticuerpo también puede manipularse genéticamente incluyendo
anticuerpos de cadena sencilla o anticuerpos quiméricos (por
ejemplo, bi-específicos) que pueden unirse al
complejo péptido-MHC. Adicionalmente, el anticuerpo
puede estar compuesto por regiones originadas a partir de diferentes
especies, tales como por ejemplo anticuerpos quiméricos o
humanizados.
El complejo péptido-MHC a
detectar de acuerdo con la presente invención, está asociado con
artritis reumatoide. Preferiblemente, el complejo MHC es de tipo
HLA DRB1*0401, DRB1*0404, DBR1*0407 y DBR1*0101, siendo HLA
DBR1*0401 el más preferido mientras que el péptido del complejo se
obtiene de HC gp-39. Los anticuerpos se preparan
usando complejos con péptidos obtenidos de HC gp-39.
Preferiblemente el péptido comprende los aminoácidos
263-273 ó 263-275 de HC
gp-39 (HC
gp-39^{263-273} o HC
gp-39^{263-275}), pero son
posibles pequeñas variaciones en las secuencias de aminoácidos.
Dichos anticuerpos detectarán complejos péptido-MHC
asociados a HC gp-39, es más probable que los
anticuerpos detecten complejos péptido-MHC cuyo
péptido se obtiene a partir de HC gp-39.
Será evidente para los especialistas en la
técnica que los péptidos pueden prolongarse en cualquier extremo
del péptido o en ambos extremos y seguir ejerciendo la misma función
inmunológica, es decir, en un complejo asociado a MHC es capaz ser
reconocido por un anticuerpo. La parte prolongada puede ser una
secuencia de aminoácidos similar a la secuencia natural de la
proteína. Sin embargo, el péptido también puede prolongarse mediante
secuencias no naturales. También la secuencia del propio péptido
puede ser ligeramente diferente y seguir siendo capaz de ser
reconocida por el anticuerpo.
Las variaciones que pueden producirse en una
secuencia, especialmente de los péptidos más pequeños, pueden
demostrarse mediante diferencia(s) de (un)
aminoácido(s) en la secuencia global o mediante deleciones,
sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de (un)
aminoácido(s) en dicha secuencia. Se han descrito
sustituciones de aminoácidos que se espera que no alteren
esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas. Las
sustituciones de aminoácidos entre aminoácidos relacionados o
sustituciones que se han producido frecuentemente en la evolución
son entre otras Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val
(véase Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat.
Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, supl. 3). En
base a esta información Lipman y Pearson desarrollaron un método de
comparación de proteínas rápido y sensible (Science, 227:
1435-1441, 1985) y determinaron la similitud
funcional entre polipéptido homólogos.
Los péptidos (más pequeños) pueden prepararse
mediante métodos de química orgánica bien conocidos para la
síntesis de péptidos tales como por ejemplo, síntesis de péptidos en
fase sólida descrito por ejemplo en los documentos J. Amer. Chem.
Soc. 85: 2149 (1963) y Int. J. Peptide Protein Res. 35:
161-214 (1990).
Los péptidos pueden estabilizarse mediante
modificaciones C- y/o N- terminales, que disminuirán la hidrólisis
catalizada por exopeptidasa. Las modificaciones pueden incluir:
acilación C-Terminal (por ejemplo acetilación =
Ac-péptido), introducción de amidas
N-terminales, (por ejemplo
péptido-NH_{2}) combinaciones de acilación e
introducción de amidas (por ejemplo
Ac-péptido-NH_{2}) e introducción
de D-aminoácidos en lugar de
L-aminoácidos (Powell et al., J. Pharm.
Sci., 81: 731-735, 1992).
Otras modificaciones se centran en la prevención
de la hidrólisis por endopeptidasas. Los ejemplos de estas
modificaciones son: introducción de D-aminoácidos en
lugar de L-aminoácidos, aminoácidos modificados,
ciclación dentro del péptido, introducción enlaces peptídicos
modificados, por ejemplo enlaces peptídicos reducidos
\psi[CH_{2}NH] y por ejemplo peptoides (derivados de
glicina N-alquilada) (Adang et al., Recl.
Trav. Chim. Pays-Bas, 113: 63-78,
1994 y Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:
9367-9371, 1992).
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales de
acuerdo con procedimientos convencionales. Se realizan
inmunizaciones de animales con preparaciones que contienen
complejos del péptido-MCH en presencia o en ausencia
de un adyuvante apropiado. Después se generan hibridomas mediante
fusión de células B de estos animales inmunizados con células de
mieloma usando una técnica de fusión apropiada, preferiblemente
fusión-PEG (Kohler y Milstein, Nature 256;
495-497, 1975) o electrofusión (Van Duijn et
al., Exp. Cell Research, 183, 463-472, 1989).
Los procedimientos convencionales para inmunización, fusión,
selección de hibridomas, clonación y aumento a escala de hibridomas
y purificación de anticuerpos monoclonales se describen bien en
manuales para la generación de anticuerpos monoclonales, por
ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: a laboratory manual, Cold
Spring Harbor Laboratory 1988 o Coligan et al., Current
Protocols in Inmunology, John Wiley and Sons Inc. 1992.
Pueden seleccionarse células B específicas de
antígeno y cultivarse en condiciones de dilución limitada en un
sistema de cultivo para células B, preferiblemente el sistema de
cultivo de células B EL-4. Después pueden someterse
clones individuales de células B a fusión para obtener hibridomas
que producen anticuerpo monoclonal como se describe en los
documentos EP448470 y US6.020.170 incluidos en este documento como
referencia.
También pueden generarse anticuerpos
monoclonales o fragmentos de anticuerpos humanos de acuerdo con
técnicas bien conocidas en la técnica. La quimerización o
humanización de anticuerpos monoclonales de ratón adecuados puede
generar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos humanos. Otra
técnica bien conocida para generar anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos humanos es la tecnología de presentación de fagos.
También pueden generarse anticuerpos monoclonales humanos mediante
transformación EBV de células B sensibilizadas in vivo,
mediante inmortalización de células B inmunizadas in vitro o
mediante inmortalización de células B a partir de ratones
transgénicos inmunizados que expresan un repertorio de
inmunoglobulina humana.
La inmunización con el complejo apropiado puede
realizarse con complejo de péptido-MHC que se aísla
como se describe en el ejemplo 1. Como fuente para el complejo, sin
embargo, pueden usarse también células que presentan el antígeno
(APC) tales como monocitos, células dendríticas y células B que
tengan el complejo MHC apropiado y se carguen con el autoantígeno
específico, por ejemplo proporcionando a las APC la HC
gp-39. Como una alternativa para proporcionar a las
APC la proteína completa de interés, también pueden proporcionarse
subsecuencias de la misma. La longitud de las subsecuencias no es
importante siempre que ésta comprenda el epítopo a reconocer por la
molécula de MHC relevante. Preferiblemente estos péptidos tienen una
secuencia de aminoácidos de 9-55 restos de
aminoácidos. Más preferiblemente los péptidos tienen una secuencia
de aminoácidos de 9-35, en particular
9-25 restos de aminoácidos. Se prefieren mucho más
los péptidos que tienen una secuencia de 9-15 restos
de aminoácidos. El péptido más preferido es
HC-gp39^{263-273} o
HC-gp39^{263-275}.
Por lo tanto, también es objeto de la presente
invención proporcionar anticuerpos que sean específicos para
complejos de péptido-MHC asociados con artritis
reumatoide. Preferiblemente, el complejo MHC es del tipo HLA
DRB1*0401, DRB1*0404, DRB1*0407 y DRB1*0101, siendo HLA DRB1*0401 el
más preferido mientras que el péptido en el complejo es
preferiblemente un antígeno asociado a AR. El péptido más preferido
se obtiene de HC gp-39. Preferiblemente el péptido
comprende los aminoácidos 263-273 ó
263-275 de HC gp-39
(HC-gp39^{263-273} o
HC-gp39^{263-275}), pero son
posibles pequeñas variaciones en las secuencias de aminoácidos. Los
anticuerpos más preferidos son ORG38948 08A, ORG38948 12A u
ORG38948 04B.
La presente memoria descriptiva describe
anticuerpos que reaccionan con complejos de
péptido-MHC específicos en los que el péptido
consta de multímeros de un péptido asociado a AR más pequeño, tal
como por ejemplo un dímero o un trímero. Un multímero puede ser un
homómero, compuesto por una multitud del mismo péptido, o un
heterómero compuesto por diferentes péptidos.
De nuevo otro objeto de la presente invención es
proporcionar anticuerpos reactivos con los complejos específicos de
artritis reumatoide, cuyo péptido está conectado a moléculas de MHC,
de modo que el bucle de unión está ocupado por el péptido. Una
molécula enlazadora flexible, preferiblemente también compuesta de
secuencia de aminoácidos, puede conectar al péptido. También las
subunidades de MHC pueden unirse covalentemente directamente o a
través de una molécula espaciadora flexible. Pueden estar
construidas por ejemplo, sobre moléculas de Ig monoméricas o
diméricas como "armazón". Las moléculas de MHC no necesitan
poseer sus dominios constantes y pueden estar compuestas por sus
dominios variables solamente, unidas directamente de forma covalente
entre sí o unidas a través de un enlazador flexible. Dichos
anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden prepararse mediante
tecnología de ADN recombinante convencional. Los complejos de
péptido/MHC diméricos con IgG como armazón se describen por
Lebowitz et al. (1999) Cellular Immunology 192:
175-184.
Los complejos de péptido/MHCs tetraméricos para
MHCI se han descrito por Davis et al. (1996) Science 274:
94-99 y para MHCII por Gütgemann et al.
(1998) Immunity 8: 667-673 y Kotzin et al.
(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 291-296.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
usarse para la identificación de complejos específicos autoinmunes
por ejemplo de HC gp-39^{263-275}
en APC en secciones tisulares y para la cuantificación de complejos
de péptido-MHC por ejemplo complejos DRB1*0401/HC
gp-39^{263-275} sobre APC
individuales. La cuantificación del complejo
péptido-MHC con anticuerpos específicos proporciona
una oportunidad de controlar la actividad de la enfermedad. Los
anticuerpos pueden usarse adicionalmente para situar la APC en
tejidos patológicos.
Dependiendo del anticuerpo, es decir, de la
especificidad del complejo péptido-MHC pueden
diagnosticarse varias enfermedades autoinmunes tales como diabetes
mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, Miastenia
gravis, psoriasis y artritis reumatoide. Además, usando anticuerpos
con especificidad para AR asociados con complejos de
péptido-MHC, puede distinguirse la artritis
reumatoide de otras causas de enfermedades inflamatorias crónicas
tales como poliartritis, artritis psoriática, espondiloartropatía u
osteoartritis.
Existen varias técnicas para usar el anticuerpo
o fragmentos de anticuerpo para detectar complejos de
péptido-MHC específicos. Estas técnicas incluyen
aunque sin limitación: inmunohistoquímica, FACS, inmunoprecipitación
y transferencia de Western. Los anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos pueden usarse sin marcar o conjugados con una enzima,
un isótopo radioactivo, un fluorócromo, una partícula paramagnética
o una molécula de biotina.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar anticuerpos para su uso en la purificación de los
complejos anti-inmune de
péptido-MHC mediante por ejemplo cromatografía de
afinidad. Para este fin, los anticuerpos se acoplan a una matriz
sólida por ejemplo, perlas Sepharose, perlas de Sílice o perlas
paramagnéticas usando técnicas que se conocen bien en la técnica.
Los anticuerpos a usar para este fin son los descritos para el
método de diagnóstico de acuerdo con la invención.
Para evitar una respuesta antigénica a los
anticuerpos, se prefiere usar anticuerpos humanos. Si los
anticuerpos son de origen no humano, se prefieren anticuerpos
humanizados. Se conocen métodos para humanizar anticuerpos, tales
como injerto CDR (Jones et al., Nature 321,
522-525, 1986).
Los anticuerpos ORG38948 08A, ORG38948 12A u
ORG38948 04B se han depositado en ECACC Salisbury Witshire PS4 0JG,
UK con los números de acceso 99061728; 99061729; y 99061730,
respectivamente. Estos depósitos se han realizado según los términos
del Tratado de Budapest.
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(Formulario pasa a página
siguiente)
\newpage
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la
invención.
Figura
1
Se titularon anticuerpos monoclonales en placas
de microELISA recubiertas con Org38948 (a) o DRB1*0401 (b)
purificados. Después se incubaron las placas con HRP de cabra
anti-ratón y la reacción de color se desarrolló
usando procedimientos de ELISA convencionales.
Figura
2
Parte superior: transferencia 1; se realizó
SDS/PAGE en condiciones no reductoras y las transferencias se
desarrollaron con L243.
Parte inferior: transferencia 2; se realizó
SDS/PAGE en condiciones reductoras y se desarrollaron transferencias
con L227.
Pista 1: marcador de peso molecular, pista 2:
ORG38948 01A (IgG1, \kappa), pista 3: ORG38948 04B (IgA,
\kappa), pista 4: ORG38948 08A (IgGI, \kappa), pista 5: ORG38948
09A (IgA, \kappa), pista 6: ORG38948 11B (IgG1, \kappa), pista
7: ORG38948 12A (IgG1, \kappa), pista 8:
ZP(19-38) 1A (IgG1 de control): pista 9: L243
(anti-HLA-DR), pista 10: ZP 1A (IgA
de control).
Nota: ORG38948 09A es un anticuerpo que
reacciona con Org38948 y DRB1*0401.
Figura
3ª
Se cargaron células BSM con HC
gp39^{263-275} (---) y una tinción con anticuerpos
anti-Org38948 se comparó con la tinción de las
células no cargadas
(- - - - - - - - -)
mediante análisis FACS. El L243 anti-HLA/DR se usó
como control positivo para la presencia de moléculas DR. Se usaron
anticuerpos de control de isotipo como control negativo
(\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot).
Figura
3b
Se cargaron células Priess con HC
gp-39^{263-275} (---) y la tinción
mediante anticuerpos anti-Org38948 se comparó con la
tinción de células no cargadas
(- - - - - - - - -)
mediante análisis FACS. Se usó L243 anti-HLA/DR como
control positivo para la presencia de moléculas DR. Se usaron
anticuerpos de control de isotipo como control negativo
(\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot\cdot).
Figura
4
Los complejos de Org38948 se recubrieron y se
incubaron con concentraciones en aumento de MAb y el hibridoma de
células T de interés. Después de dos días de incubación a 37ºC, se
determinó la producción de IL-2. Cada valor
representa los conteos medios de cultivos por triplicado. a)
Hibridoma 5G11, b) hibridoma 4G11 y c) hibridoma 8B12.
Figura
5
Las células BSM pulsadas con HC
gp-39^{263-275} se incubaron con
10 \mug/ml de MAb e hibridomas de células T 5G11 (panel izquierdo)
o 14011 (panel derecho). Después de dos días de incubación a 37ºC,
se determinó la producción de IL-2. Cada valor
representa los conteos medios de cultivos por triplicado + las
desviación típica.
Org38948 es un complejo del dímero DRB1*0401
(DRA, DRB1*0401) con un péptido que abarca los aminoácidos
263-275 de HC gp-39, disuelto en
una solución de detergente de dodecilmaltósido al 0,05%.
Las moléculas de DRB1*0401 se purificaron como
se describe por Nag et al (J. Immunol. (1993) 150:
1558-1564) con algunas modificaciones secundarias.
En resumen, la línea celular linfoblastoide transformada EBV BSM
(NIGMS, GM06821) se cultivó en medio RPMI 1640 que contenía FCS al
10%, 2 g/l de glucosa y L-glutamina 4 mM. Después
de recoger las células, se extrajeron las moléculas de DRB1*0401 con
Triton X100 al 0,5% en PBS. Después, el lisado se aclaró por
filtración y se concentró adicionalmente en una membrana de
ultrafiltración de 10 kD. El lisado de Triton X100 concentrado se
aplicó en una columna de Sepharose-4B acoplada a
L243 y el DRB1*0401 unido se eluyó en PBS, dodecilmaltósido al
0,05%, pH 11,3. Las fracciones se neutralizaron inmediatamente con
tampón de fosfato de sodio monobásico al 20% y las moléculas de
DRB1*0401 se recogieron a través de una columna de intercambio
iónico DEAE en PBS, dodecilmaltósido al 0,05% pH 7,3.
El péptido que corresponde con los restos de
aminoácidos 263-275 de HC gp-39 se
sintetizó en condiciones de GMP en Diosynth usando química fmoc.
Se prepararon complejos de
péptido-MHC incubando un exceso molar de 50 veces de
HC gp-39^{263-275} con moléculas
de DRB1*0401 purificado durante 72-80 horas a 37ºC
en PBS, dodecilmaltósido al 0,05% pH 7,0. Finalmente, se retiró el
péptido libre mediante cromatografía en columna de exclusión por
tamaños de tándem S-300/S-200 y los
complejos purificados se almacenaron en PBS, dodecilmaltósido al
0,05%, pH 7,2.
Se inmunizaron ratones hembra BALB/c de seis
semanas de edad de acuerdo con el programa que se presenta en la
Tabla I. En el día 48 del programa de inmunización, se recogió una
muestra de sangre mediante punción orbital. En este momento, se
descubrieron altos títulos de anticuerpos para Org38948 y DRB1*0401
(que variaban de 22.000 a 46.000). No se descubrieron diferencias
significativas entre los programas de inmunización utilizados. Cinco
días después de la inyección final, los ratones se sacrificaron y
se prepararon poblaciones de células del bazo sin eritrocitos como
se ha descrito anteriormente (Steenbakkers, 1992 J. Immunol. Methods
152: 69; Steenbakkers, 1994, Molecular Biology Reports 19: 125).
Estas poblaciones de células del bazo se congelaron a -140ºC o se
usaron para la generación de un MAb directamente.
Para la generación del MAb, se reunieron 2 x
10^{7} células del bazo sin eritrocitos del ratón 1, ratón 2 y
ratón 3 y se incubaron en DMEM/F12 de HAM (Gibco BRL, Paisly, UK,
cat. Nº 041-91825), suero de ternero al 10%
(Hyclone, Logan, UT, USA) durante 1 hora a 37ºC en un matraz de
cultivo de plástico para retirar la mayor parte de los monocitos.
Posteriormente las células no adherentes se sometieron a tres ciclos
posteriores de centrifugado en placas de cultivo recubiertas con
DRB1*0401 como se describe por Steenbakkers et al. (1994,
Molecular Biology Reports 19: 125). En estas etapas, las células B
dirigidas contra HLA-DRB1*0401 se retiran de la
suspensión celular. Posteriormente, se seleccionaron células B
dirigidas contra complejos DRB1*0401/HC
gp39^{263-275} incubando la suspensión celular
resultante en placas de cultivo recubiertas con Org38948 durante 90
minutos a 37ºC. Las células no unidas se eliminaron lavando
cuidadosamente y finalmente se recogieron las células unidas
mediante un tratamiento con tripsina.
Se generaron hibridomas que producían
anticuerpos monoclonales a partir de estas células B seleccionadas
mediante expansión clonal y mini-electrofusión como
se ha descrito anteriormente (Steenbakkers et al., 1994
Molecular Biology Reports 19: 125). En resumen, las células B
seleccionadas se mezclaron con el sobrenadante de células T y
50.000 células EL-4 B5 irradiadas (2500 rad) a un
volumen final de 200 \mul de DMEM/F12 de HAM, suero de ternero al
10% en placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos. El
día 8, se ensayaron los sobrenadantes en un ensayo ELISA usando
placas recubiertas con DRB1*0401 o con Org38948. Los cultivos de
células B que producían MAb reactivo con Org38948 y no con
DRB1*0401 se sometieron a un proceso de
mini-electrofusión. Las células B específicas de
estos cultivos se mezclaron con 10^{6} células de mieloma
NS-1 y se retiró el suero lavando con DMEM/F12 de
HAM. A continuación, las células se trataron con una solución de
pronasa durante 3 minutos y posteriormente se lavaron con medio de
fusión. La electrofusión se realizó en una cámara de fusión de 50
\mul mediante un campo eléctrico alterno de 30 s, 2 MHz, 400 V/cm
seguido de un pulso de alto voltaje cuadrado de 10 \mus, 3 kV/cm
y de nuevo un campo eléctrico alterno de 30 s, 2 MHZ, 400 V/cm.
Finalmente, el contenido de la cámara de fusión se transmitió a
medio de selección (DMEM/F12 de HAM, FCS al 10%, hipoxantina
10^{-4} M (Sigma®), timidina 1,6 x 10^{-5} M (Sigma®),
aminopterina 0,4 \muM (Life Technologies®), medio condicionado
del carcinoma de la vejiga humana T24 al 1% (ATCC HTB 4)) y se
colocaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos en
condiciones de dilución limitante. En el día 13 después de la
fusión, se examinó el crecimiento de hibridomas en los cultivos y
se ensayó de nuevo en un ELISA usando placas recubiertas con
DRB1*0401 o con Org38948.
Después del cultivo de células B y de la
mini-electrofusión, se descubrieron 5 anticuerpos
(ORG38948 01A, ORG38948 04B, ORG38948 08A, ORG39848 11B Y ORG38948
12A) que mostraban reactividad con Org38948, pero no con DRB1*0401
en un ELISA (Figuras 1a y 1b). Como estos MAb no reaccionan tampoco
con placas de poliestireno recubiertas con HC
gp-39^{263-275} y como la
reactividad con Org38948 no podía inhibirse mediante HC
gp-39^{213-275} libre, estos MAb
se dirigen contra un epítopo de combinación de DRB1*0401 y HC
gp39^{213-275}, la ausencia de unión al péptido
HC gp-39^{263-275} se confirmó en
un experimento BIAcore.
Para un soporte adicional de la especificidad
del MAb, se realizaron inmunoprecipitaciones con Org38948. En
resumen, se incubaron 10 \mug de Org38948 con 6 x 10^{6} perlas
paramagnéticas acopladas con Ig de oveja anti-ratón
(Dynal® 110.02, Oslo, Noruega) cargadas previamente con 1 ml de
sobrenadante de hibridoma durante 2 horas a 4ºC en 300 \mul de
PBS, BSA al 0,1%. Después, los inmunoprecipitados se lavaron 3 veces
con PBS, se llevaron a ebullición en una muestra de tampón y se
sometieron a SDS-PAGE en un gel al 10% en
condiciones no reductoras y reductoras. Se realizó la transferencia
electroforética de las proteínas a membranas PVDF usando
procedimientos convencionales. Después de bloquear los sitios de
unión libres en la transferencias con PBS, Tween 20® al 0,5%, leche
desnatada al 5%, las transferencias se incubaron con MAb
anti-DR (20 ml de L243 a 2 \mug/ml o 12,5 ml de
L227 a 1,1 \mug/ml) en PBS, Tween20® al 0,5% BSA al 1%, suero de
cabra normal al 1% durante una hora a temperatura ambiente.
Después, las transferencias se incubaron durante 1 hora con Ig de
cabra anti-ratón conjugada con fosfatasa alcalina en
el mismo tampón. Finalmente, las transferencias se desarrollaron
usando BCIP® y NBT como sustrato cromogénico. Estos experimentos
mostraron que el MAb es capaz de hacer inmunoprecipitar una
molécula de 60 kD que se disocia en dos moléculas de 33 kD y 28 kD
cuando se realiza un SDS/PAGE en condiciones reductoras (Figura 2).
Estos pesos moleculares confirman la reactividad del MAb con
moléculas de MHC de clase II que están compuestas por dos cadenas
polipeptídicas unidas no covalentemente (cadena \alpha 32 kD y
cadena \beta 28 kD).
\vskip1.000000\baselineskip
Usando análisis FACS, se estableció la unión de
los MAb con diferentes líneas de células B transformadas con EBV
que expresan MHC (BLCL) pulsadas con diversos péptidos. Los péptidos
se sintetizaron mediante síntesis peptídica en fase sólida usando
un sintetizador Milligen 9050 automatizado y se purificaron mediante
HPLC de fase inversa.
En resumen, se incubaron 10^{6} BLCL con 40
\mug de péptido en 500 \mul de DMEM/F12 de HIAM o medio blanco
durante 4 horas a 37ºC. Después de esta incubación las células se
lavaron con PBS, FCS al 2%, azida sódica al 0,02%. Se incubaron
aproximadamente 2 x 10^{5} células durante 1 hora, a 4ºC, con 130
\mul de sobrenadante de hibridoma que contenía el MAb más 20
\mul de PBS, FCS al 20%, azida sódica al 0,02%. Después de lavar
las células 2 veces con PBS, FCS al 2%, azida sódica al 0,02%, se
incubaron durante 1 hora a 4ºC con 50 \mul de PBS, FCS al 20% y
azida sódica al 0,02% más 10 \mul de Ig de cabra
anti-ratón/FITC (Beckton & Dickinson).
Posteriormente las células se lavaron tres veces con PBS, FCS al 2%
y azida sódica al 0,02% y finalmente se resuspendieron en 400
\mul de PBS, p-formaldehído al 2%. Como control
para la unión de los péptidos, las células se incubaron con HC
gp-39^{263-275} biotinilada y se
tiñeron con estreptavidina/PE (Beckton & Dickinson). Como
control para la expresión de HLA-DR, la tinción se
realizó con L243 anti-HLA/DR (inmunoglobulina
purificada del hibridoma ATCC HB 55). Las células teñidas se
analizaron con el FACScan^{TM} (Beckton & Dickinson). En
todos los casos, se aplicó un análisis de dispersión hacia delante y
lateral para eliminar células muertas y restos celulares para los
posteriores análisis.
Dos BLCL homocigóticas para DRB1*0401 (BSM y
Priess) se cargaron con HC pg39^{263-275}, y la
reactividad de los anticuerpos para estas células se comparó con
las de las células que no se habían cargado con este péptido. Las
Figuras 3a y b muestran que todos los anticuerpos específicos para
Org38948, excepto ORG38948 11B, discriminan la reactividad entre
BLCL cargadas con péptido y no cargadas. La mejor tinción de los
complejos de DRB1*0401/HC
gp-39^{263-275} se obtuvo con
ORG38948 01A, ORG38948 8A y ORG38948 12A. Sin embargo, dos de estos
anticuerpos (01A y 08A) mostraron alguna tinción de fondo en una de
las BLCL (BSM), lo que probablemente les hace menos útiles.
\vskip1.000000\baselineskip
Al estudiar la unión a diversos péptidos
modificados y truncados de HC
pg-39^{263-275} en el contexto de
DRB1*0401, se mapearon los epítopos reconocidos por los anticuerpos.
La reactividad de los anticuerpos se comparó con el reconocimiento
por las TCR del hibridoma 8B12 de células T de ratón (el hibridoma
de células T de ratón reconoce a HC
gp-39^{263-275} en el contexto de
HLA-DRB1*0401. Este hibridoma se generó a partir de
ratones transgénicos HLA-DRBI*0401^{+/+},
CD4^{+/+}, I-A\beta^{-/-} inmunizados con HC
gp-39^{263-275} de acuerdo con los
descrito por Cope et al., 1999 Arthritis and Rheumatism 42:
1597-1507).
Se permiten diversas modificaciones en la
estructura peptídica y en las cadenas laterales sin que influyan en
el reconocimiento por ORG38948 12A u 8B12 (Tabla II). El
reconocimiento por los anticuerpos ORG38948 01A y ORG38948 08A
parece más crítico con respecto a los epítopos reconocidos, ya que
las modificaciones se reconocen peor (ORG38948 08A) o no se
reconocen en absoluto (ORG38948 01A). ORG38948 12A no reacciona con
un péptido que se prolongue en dos aminoácidos en el extremo N
(DRB1*0401/HC
gp-39^{261-275}).
En otro experimento, se ensayaron diversos
truncamientos de HC
gp-39^{263-275} para establecer el
epítopo mínimo en DRB1*0401 reconocido por ORG38948 12A. En el
extremo C pueden retirarse dos aminoácidos sin pérdida de unión,
mientras que en el extremo N no se permiten truncamientos (Tabla
III). Por lo tanto, el epítopo mínimo reconocido por ORG38948 12A
es DRB1*04010/HC gp-39^{263-273}.
El epítopo reconocido por ORG38948 12A es diferente del epítopo
reconocido por el hibridoma 8B12. Además de los truncamientos de dos
aminoácidos en el extremo C, el hibridoma 8B12 permite la retirada
de dos aminoácidos en el extremo N.
Usando el mismo procedimiento que se describe en
el ejemplo 3, se investigó si 1) el MAb
anti-Org38948 reacciona de forma cruzada con
DRB1*0401 cargado con un conjunto de diferentes péptidos y 2) la
unión de ORG38948 12A está restringida a HC
gp-39^{263-275} en el contexto de
DRB1*0401 o también se reconocen otros complejos de
HLA-DR/HC
gp-39^{263-275}.
Nota 1) se pulsaron células Priess con péptidos
que se unen bien al DRB1*0401. Los datos que se resumen en la Tabla
IV muestran que no se observó reacción cruzada con DRB1*0401
cargadas con otros péptidos obtenidos de HC gp-39
que alcanzan a un motivo de unión DRB1*0401. Además no se descubrió
reacción cruzada con DRB1*0401 cargado con péptidos no relacionados
de Influenza Heamagglutinin y Mycobacterium
leprae.
ORG38948 12A también reconoce HC
gp-39^{263-275} biotinilado
mientras que los anticuerpos ORG38948 01A, ORG38948 04B y ORG38948
08A no lo reconocen. Puesto que la biotina se acopla en el extremo N
del péptido, esto sugiere que el último MAb reconoce un epítopo
cercano al extremo N del péptido en el complejo.
Nota 2) Para estudiar la reactividad cruzada de
ORG38948 12A con otros complejos de HLA-DR/HC
gp-39^{263-275} diferentes del
DRB1*0401/HC gp-39^{263-275}, se
usaron las siguientes líneas celulares de linfoblastoide B
transformadas con EBV:
Estas BLCL homocigóticas se cargaron con HC
gp-39^{263-275} y posteriormente
se tiñeron con ORG38948 12A. En una serie de experimentos, ORG38948
12A tiñe a HC gp-39^{263-275} en
el contexto de DRB1*0401 y DRB1*0407 (Tabla V). A concentraciones
de anticuerpo normales, no se observó tinción del péptido en el
contexto de DRB1*0101, DRB1*0404, DRB1*1402 (haplotipos
susceptibles a A.R.), DRB1*0402, DRB1*1301, DRB1*1401 (estrechamente
relacionados, haplotipos no susceptibles a A.R.) y DRB1*1501 (con
relación más distante, haplotipo no susceptible a A.R.). A
concentraciones de anticuerpo extremadamente altas, también se
descubrió reactividad más débil con HC
gp-39^{263-275} en el contexto de
DRB1*0101, DRB1*0404, DRB1*1301 y DRB1*1401. En los controles de
estos experimentos, se estableció que i) ORG38948 12A no se une a
BLCL no cargadas, ii) HC
gp-39^{263-275} se une las BLCL e
iii) todas las BLCL muestran un alto nivel de expresión de DR (no
se muestran los datos).
La inhibición de la activación inducida por
antígeno de hibridomas de células T por un MAb
anti-Org38948 se midió en dos ensayos diferentes.
En un ensayo, los hibridomas de células T se estimularon con
complejos de péptido/MHC. En otro ensayo, se usaron células B
transformadas con EBV cargadas con HC
gp-39^{263-275} para la
estimulación de hibridomas de células T 5G11, 8B12 y 14G11
(hibridomas de células T de ratón que reconocen a
HC-gp-39^{263-275}
en el contexto de HLA-DRB1*0401; estos hibridomas se
generaron a partir de ratones transgénicos
HLA-DRB1*0401^{+/+}, CD4 humano^{+/+},
I/A\beta^{-/-} inmunizados con HC
gp-39^{263-275} de acuerdo con lo
descrito por Cope et al., 1999, Arthritis and Rheumatism 42:
1597-1507).
Para la estimulación con complejos de
péptido/MHC, se recubrieron micro pocillos de fondo plano durante
una noche a 4ºC con 100 \mul de Org38948 a una concentración de
200 ng/ml en PBS. El exceso de complejo se retiró lavando dos veces
con PBS. Después los pocillos se incubaron durante 1 hora a 37ºC con
diversas concentraciones de MAB en 100 \mul de DMEM/F12 de HAM, y
FCS al 10%. Después de la preincubación con MAb, se añadieron 100
\mul de una suspensión de hibridoma de células T en DMEM/F12 de
HAM, FCS al 10% (5G11 y 14G11 al 2 x 10^{4} células/pocillo; 8B12
a 10^{4} células/pocillo). Los cultivos se incubaron durante dos
días a 37ºC y finalmente se recogió el sobrenadante para la
medición de IL-2 de ratón. La Figura 4a muestra que
todos los MAb inhibieron la activación del hibridoma 5G11 de manera
relacionada con la dosis. Usando ORG38948 01 A, se obtuvo una
inhibición parcial en comparación con un MAb de IgG de control. Por
otro lado, la incubación con ORG38948 08A y ORG38948 12A dio como
resultado la completa inhibición a una concentración de 25
\mug/ml. Los anticuerpos específicos para el complejo eran
inhibidores menos potentes de la activación de hibridomas de células
T que el MAb anti HLA/DR, L243, lo que puede deberse a diferencias
en la afinidad de los anticuerpos. Se obtuvieron resultados
similares usando el hibridoma 14G11 (Figura 4b). El hibridoma 8B12
se inhibía peor (Figura 4c) lo que concuerda con las observaciones
previas de que este hibridoma necesita menos complejos para
estimularse completamente.
En el otro ensayo, se cargaron células BSM con
HC gp-39^{263-275} mediante
incubación de 1,2 x 10^{6} células con 10 \mug de péptido en 1
ml de DMEM/F12 de HAM durante 5 horas a 37ºC. Después, se retiró
lavando el exceso de péptido y las células se irradiaron con una
dosis de 15.000 rad.
Posteriormente, se preincubaron 2 x 10^{4}
células BSM cargadas con péptido durante 1 hora a 37ºC en micro
pocillos de fondo redondo con 10 \mug/ml de MAb en un volumen
final de 100 \mul de DMEM/F12 de HAM. Después, se añadieron 2 x
10^{4} hibridomas de células T en 100 \mul de DMEM/F12 de HAM,
FCS al 20%. Después de dos días de incubación a 37ºC, se recogió el
sobrenadante y se ensayo en IL-2 de ratón. Como
puede deducirse a partir de la Figura 5, se descubrió que todos los
anticuerpos inhibían la activación inducida por péptido de los
hibridomas 5G11 y 14G11 a una concentración de 10 \mug/ml. De
nuevo se obtuvo una mayor inhibición con el MAb
anti-HLA/DR, L243.
Nota: IL-2 de ratón se
determinó en un ELISA de doble sándwich usando anti
IL-2 de ratón (Pharmingen 18161D) para la captura y
anti IL-2/biotina (Pharmingen 18172D) como segundo
anticuerpo. Se uso estreptavidina conjugada con Europio
(Wallac^{TM} 1244-360) para la detección de la
unión a IL-2 en un fluorómetro de resolución
temporal.
Se realizó inmunohistoquímica en secciones
sinoviales como se describe por Baeten et al. (2000 Arthritis
and Rheumatism 43: 1233-1243). En resumen, se
congelaron repentinamente biopsias sinoviales en nitrógeno liquido
y se realizaron secciones crioestáticas de 5 \mum. Después de la
fijación en acetona durante 10 minutos y el bloqueo de peroxidasa
endógena con peroxido de hidrogeno al 1%, las secciones se incubaron
durante 30 minutos con un conjunto de 3 MAb anti-HC
gp-39 diferentes (06A, 08B y 10B) o ORG38948 12A. Se
incubaron secciones paralelas con MAb emparejado con un isotipo
irrelevante como control negativo. Las secciones se incubaron
posteriormente con anticuerpo secundario anti-ratón
biotinilado, seguido de un complejo de
estreptavidina-peroxidasa (Dako, Glostrup,
Dinamarca). La reacción de color se desarrolló usando sustrato
cromógeno
3-amino-9-etilcarbazol
(AEC). Finalmente, las secciones se contra-tiñeron
con hematoxilina. Las secciones sinoviales teñidas se valoraron en
modo ciego independientemente por dos observadores.
Las secciones de tejido sinovial de 19 pacientes
de AR, 10 pacientes de SpA, 3 pacientes de PsA, 2 pacientes de OA,
1 paciente con condrocalcinosis y 3 pacientes con un diagnóstico aún
por identificar se ensayaron en expresión de HC
gp-39 y se tiñeron con ORG38948 12A mediante
inmunohistoquímica usando un conjunto de 3 MAb
anti-HC gp-39 y ORG38948 12A
respectivamente. Se detectaron complejos de DR4/HC
gp-39^{263-275} o
DRB1*0101/HC-gp39^{263-275} en 10
de los 15 pacientes de AR que compartían el epítopo positivo (Tabla
VIa). La reactividad con DRB1*0404/HC
gp-39^{263-275} y DRB1*0101/HC gp-39^{263-275} está de acuerdo con la observación de que ORG38948 12A también reconoce a HC gp-39^{263-275} en el contexto de DRB1*0404 y DRB1*0101 (Tabla V). La tinción con ORG38948 12A estaba restringida a células individuales similares a las dendritas situadas en o cerca de infiltrados linfoides (no se muestran los datos). Esta situación es claramente distinta de la situación de las células que expresan HC gp-39, lo que sugiere que las células que expresan MHC/HC gp-39^{263-275} no son las células que producen HC gp-39. No se descubrió ninguna tinción con MAb ORG38948 12A en los 19 pacientes de control con diversas enfermedades (Tabla VIb). Cinco de estos pacientes son controles relevantes debido a la expresión del epítopo compartido (DR4 o DR1), seis son negativos para el epítopo compartido y el tipo HLA-DR de los otros aún es desconocido. La tinción con un anticuerpo de control de isótopo siempre fue negativa.
gp-39^{263-275} y DRB1*0101/HC gp-39^{263-275} está de acuerdo con la observación de que ORG38948 12A también reconoce a HC gp-39^{263-275} en el contexto de DRB1*0404 y DRB1*0101 (Tabla V). La tinción con ORG38948 12A estaba restringida a células individuales similares a las dendritas situadas en o cerca de infiltrados linfoides (no se muestran los datos). Esta situación es claramente distinta de la situación de las células que expresan HC gp-39, lo que sugiere que las células que expresan MHC/HC gp-39^{263-275} no son las células que producen HC gp-39. No se descubrió ninguna tinción con MAb ORG38948 12A en los 19 pacientes de control con diversas enfermedades (Tabla VIb). Cinco de estos pacientes son controles relevantes debido a la expresión del epítopo compartido (DR4 o DR1), seis son negativos para el epítopo compartido y el tipo HLA-DR de los otros aún es desconocido. La tinción con un anticuerpo de control de isótopo siempre fue negativa.
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<110> Akzo Nobel N.V.
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<120> Uso de anticuerpos contra complejos
de péptidos-MHC específicos
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\vskip0.400000\baselineskip
<130>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
263-273
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
263-275
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly
Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
263-274
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly
Val}
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
263-272
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
265-275
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
266-275
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
264-274
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly
Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
265-273
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: en el extremo N conectada a acetilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly
Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: en el extremo N conectada a
HOCH2-(CHOH)4-CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly
Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: en el extremo N está conectada a acetilo; en el extremo
C está conectada a NH2; Xaa en la posición 12 es
NH-CH(CH(CH3)2)-CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly
Xaa Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: en el extremo N está conectada a acetilo; en el extremo
C está conectada a NH2; Xaa en la posición 2 es
N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Xaa Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly
Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: en el extremo N está conectada a acetilo; en el extremo
C está conectada a NH2; Xaa en la posición 2 es
N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O);
Xaa en la posición 12 es
NH-CH(CH(CH3)2)-CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Xaa Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly
Xaal Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
261-275
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Gly Arg Ser Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr
Gly Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: en el extremo N está conectada a acetilo; en el extremo
C está conectada a NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly
Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus de la gripe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Haemaglutinina AA
307-319
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Phe Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu
Ala Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium leprae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de 18K AA
38-51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Glu Phe Val Val Glu Phe Asp Leu Pro Gly
Ile Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
103-116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr
Gln Ser Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
259-271
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser
Ser Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HC gp-39 AA
326-338
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Gly Tyr Asp Asp Gln Glu Ser Val Lys Ser
Lys Val}
Claims (14)
1. Un método para diagnosticar artritis
reumatoide que comprende detectar la presencia de un complejo de
péptido-MHC especifico para artritis reumatoide en
un paciente con anticuerpos o dominio de unión a antígeno de los
mismos que se unen específicamente a un complejo peptídico obtenido
de MHC-HC-gp39.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la parte de MHC del complejo es del tipo HLA DBR1*0401, DBR1*0404,
DRB1*0407 y DRB1*0101.
3. El método de la reivindicación 2, en el que
el tipo de MHC es HLA DRB 1*0401.
4. El método de las reivindicaciones
1-3, en el que el péptido obtenido de HC
gp-39 comprende
HC-gp39^{263-273} o
HC-gp39^{263-275}.
5. El método de la reivindicación 4, en el que
el péptido obtenido de HC gp-39 es
HC-gp39^{263-273} o
HC-gp39^{263-275}.
6. El método de la reivindicación 5, en el que
el anticuerpo se produce por el hibridoma de número de acceso
99061728, el hibridoma de número de acceso 99061729 o el hibridoma
de número de acceso 99061730.
7. Un anticuerpo o dominios de unión al antígeno
del mismo, que se unen específicamente a un complejo de péptido
obtenido de HC gp-39 en el surco de unión de una
molécula MHC.
8. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que la molécula de MHC es del tipo
seleccionado entre HLA DRB1*0401, DRB1*0404, DRB1*0407 y
DRB1*0101.
9. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la molécula de MHC es del tipo HLA
DRB1*0401.
10. El anticuerpo de acuerdo con las
reivindicaciones 7-9, en el que el péptido obtenido
de HC gp-39 es
HC-gp39^{263-273} o
HC-gp39^{263-275}.
11. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que el péptido de HC gp-39
es HC-gp39^{263-273} o
HC-gp39^{263-275}.
12. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 11, donde el anticuerpo se produce por el hibridoma
número de acceso 99061728, hibridoma número de acceso 99061729 o
hibridoma número de acceso 99061730.
13. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 7, para su uso en diagnóstico.
14. Uso del anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 7 para la purificación de complejos de
péptido-MHC específicos para artritis
reumatoide.
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