TWI615407B - 具有經改變細胞傳訊活性之改質抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於改質抗原結合分子(ABM)。在特定實施例中，本發明係關於包括嵌合、靈長類化或人類化抗體或片段之重組單株抗體或片段，其具有改變藉由靶標抗原所調介細胞傳訊活性之能力及/或改變一或多種靶標抗原交聯之調介之能力。此外，本發明係關於編碼此等改質ABM之核酸分子以及含有此等核酸分子之載體及宿主細胞。本發明進一步係關於用於產生本發明改質ABM之方法及在疾病治療中使用此等改質ABM之方法。此外，本發明係關於具有改質之糖基化且具有改良之治療性質的改質ABM，包括Fc受體結合增強且效應功能增強之抗體。

Description

具有經改變細胞傳訊活性之改質抗原結合分子
本發明係關於抗原結合分子(ABM)。在特定實施例中，本發明係關於包括嵌合、靈長類化或人類化抗體或片段在內之重組單株抗體或片段，該等抗體或片段具有改變藉由靶標抗原所調介細胞傳訊活性之能力及/或改變一或多種靶標抗原交聯之調介之能力。此外，本發明係關於編碼此等ABM之核酸分子以及含有此等核酸分子之載體及宿主細胞。本發明進一步係關於用於產生本發明ABM之方法及於疾病治療中使用此等ABM之方法。此外，本發明係關於具有改質之糖基化且具有改良之治療性質之ABM，包括Fc受體結合增強及效應功能增強之抗體。
抗體(亦稱作免疫球蛋白)具有含四條多肽鏈之基本結構：兩條相同重(H)鏈及與之配對的兩條相同輕(L)鏈。每一重鏈及輕鏈各包含一可變區(分別為VH及VL)及一恆定區(分別為CH及CL)。CH區具有3個結構域(CH1、CH2及CH3)，而較小之CL區僅具有一個結構域(簡稱作CL)。每一VH及VL區包含3個互補決定區(CDR)，按照下列順序側接有4個框架區：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。CDR係V區中變化最大之部分，且決定著抗體之抗原特異性。成對之VH及VL可共同形成抗原結合位點，且二價抗體具有兩個此等抗原結合位點。應注 意，該抗體基本結構可以各種方式加以改進(例如藉由產生該結構之片段)，但同時保持或甚至改良期望之功能及/或抗原結合活性。
VH與CH1結構域之間的介面包含保守胺基酸。可將該接觸區域描述為「分子球窩接頭」。該接頭決定「肘部運動」亦及VH及VL區相對於CH1及CL區之所謂「肘角度」，且防止V與C區之間形成剛性接觸(Lesk及Chothia，Nature(1988)335(8)：188-190)。球窩關節之窩可由VH框架區胺基酸殘基形成，具體而言係11、110及112位之胺基酸殘基(根據Kabat等人之系統編號，(1987)，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版(Public Health Services，NIH，Washington，DC))。(參見Lesk及Chothia，Nature(1988)335(8)：188-190)該球窩關節之「球」可見於CH1結構域中，且可主要由148及149位的兩個胺基酸形成(參見Landolfi等人，J.Immunol.(2001)166：1748-1754；Lesk及Chothia，Nature(1988)335(8)：188-190)(其中將形成「球」之該等CH1殘基分別編號為149及150))。此等位置之胺基酸的差異可指示V區與C區之間形成之肘角度，且因此指示VH-VL二聚體之定向(參見Lesk及Chothia，Nature(1988)335(8)：188-190)。佔據此等VH位置之胺基酸殘基在整個免疫球蛋白序列中係高度保守的(參見例如，Lesk及Chothia，Nature(1988)335(8)：188-190)。該關節所涉及之所有殘基(例如，11、110、112、148及149位)係位於框架區(例如，殘基11、110及112)或恆定結構域(例如，148及149位，根據Landolfi等人；149及150位，根據Lesk及Chothia)，且似乎並未直接參與抗原結合。Landolfi等人，J.Immunol.(2001)166：1748-1754。
除調介諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)等效應功能外，單株抗體亦可藉由誘發或抑制細胞傳訊途徑來調介細胞功能。舉例而言，單株抗體已顯示可調介抗原交聯、激活死亡受體(例如，藉由促進受體之寡聚作用或模仿配體結合) 以及阻斷細胞生長分化中配體介導之細胞傳訊及/或增殖途徑(參見例如，Ludwig等人，Oncogene(2003)22：9097-9106)。
凋亡或程式性細胞死亡可由若干不同機制觸發。舉例而言，藉助細胞膜結合之「死亡受體」(例如，腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員)激活傳訊途徑可導致凋亡誘發。同樣，表面抗原(例如，CD20)之二聚作用或交聯亦可誘發凋亡(參見例如，Ludwig等人，Oncogene(2003)22：9097-9106)。
尚存在對於靶向與細胞傳訊(包括但不限於凋亡誘發)有關之抗原之增強治療方法的需求，以用於靈長類(包括但不限於人類)疾病之治療。
認識到具有改變藉由靶標抗原所調介細胞傳訊活性之能力及/或改變一或多種靶標抗原交聯之調介之能力的改質抗原結合分子(ABM)具有巨大治療潛力，故本發明發明人開發了此等ABM以及用於產生此等ABM之方法。該方法尤其涉及產生重組、嵌合抗體或其嵌合片段。此等改質ABM之功效可藉由改造抗體Fc區之糖基化譜圖而得到進一步加強。
因此，在一態樣中，本發明係關於一種改質抗原結合分子，其包含一與親本抗原結合分子的重鏈或輕鏈可變區相比在該重鏈或輕鏈可變區的至少一個框架區中含有至少一處胺基酸殘基取代之重鏈或輕鏈可變區，其中在該改質抗原結合分子與一靶標抗原複合時，該取代會導致該靶標抗原之細胞傳訊活性發生改變。在一特定實施例中，該經改變細胞傳訊活性係凋亡。在一實施例中，該改質抗原結合分子具有增強之誘發凋亡之能力。在另一實施例中，該改質抗原結合分子具有減弱之誘發凋亡之能力。
在另一態樣中，本發明係關於一種改質抗原結合分子，其包含 一與親本抗原結合分子的重鏈或輕鏈可變區相比在該重鏈或輕鏈可變區的至少一個框架區中含有至少一處胺基酸殘基取代之重鏈或輕鏈可變區，其中作為該取代之結果，該改質抗原結合分子具有經改變之調介一或多種靶標抗原交聯之能力。
在一實施例中，本發明改質抗原結合分子在該重鏈可變區之FR1中含有一處取代。在另一實施例中，該取代包括選自由至少2個、至少3個或至少4個胺基酸組成之群的替換。
在一實施例中，該取代包括該重鏈可變區整個FR1之替換。在又一實施例中，整個FR1係由種系VH FR1替換。在特定實施例中，該種系VH FR1在8至13 Kabat位包含一胺基酸序列，該胺基酸序列選自由下列組成之群：SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104及SEQ ID NO：105。
在一實施例中，該改質ABM在該重鏈可變區之FR1中含有一處取代，該取代包括在8、9、10、11、12或13 Kabat位中一或多處進行之胺基酸殘基之替換。
在一特定實施例中，該重鏈可變區FR1中之取代包括在8 Kabat位進行之胺基酸殘基替換。在一更具體之實施例中，該重鏈可變區FR1中之取代包括在8 Kabat位用選自由精胺酸及甘胺酸組成之群的胺基酸殘基進行之胺基酸殘基之替換。
在另一特定實施例中，該重鏈可變區FR1中之取代包括在9 Kabat位進行之胺基酸殘基之替換。在一更具體之實施例中，該重鏈可變區FR1中之取代包括在9 Kabat位用選自由丙胺酸、脯胺酸、甘胺酸、絲 胺酸及組胺酸組成之群的胺基酸殘基進行之胺基酸殘基之替換。
在一特定實施例中，該重鏈可變區FR1中之取代包括在10 Kabat位進行之胺基酸殘基之替換。在一更具體之實施例中，該取代包括在10 Kabat位用選自由麩胺酸、蘇胺酸、甘胺酸、丙胺酸及纈胺酸組成之群的胺基酸殘基進行之胺基酸殘基之替換。
在另一特定實施例中，該重鏈可變區FR1中之取代包括在11 Kabat位進行之胺基酸殘基之替換。在具體實施例中，該取代包括在11 Kabat位用白胺酸以外之任一胺基酸進行之胺基酸殘基之替換。在另一具體之實施例中，該取代包括在11 Kabat位用非極性胺基酸進行之胺基酸殘基之替換。在另一具體實施例中，該取代包括在11 Kabat位用選自由纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸及***酸組成之群的胺基酸殘基進行之胺基酸殘基之替換。在一特定實施例中，該取代包括在11 Kabat位用白胺酸進行之胺基酸殘基之替換。
在另一特定實施例中，該重鏈可變區FR1中之取代包括在12 Kabat位進行之胺基酸殘基之替換。在一具體實施例中，該取代包括在12 Kabat位用選自由離胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸組成之群的胺基酸殘基進行之胺基酸殘基之替換。
在另一特定實施例中，該重鏈可變區FR1中之取代包括在11及12 Kabat位進行之胺基酸殘基之替換。在一具體實施例中，該取代包括在11 Kabat位用纈胺酸及在12 Kabat位用離胺酸進行之胺基酸殘基之替換；在11 Kabat位用白胺酸及在12 Kabat位用纈胺酸進行之胺基酸殘基之替換；在11 Kabat位用纈胺酸及在12 Kabat位用異白胺酸進行之胺基酸殘基之替換；或在11 Kabat位用纈胺酸及在12 Kabat位用纈胺酸進行之胺基酸殘基之替換。
在另一特定實施例中，該重鏈可變區FR1中之取代包括在13 Kabat位進行之胺基酸殘基之替換。在一具體實施例中，該取代包括 在13 Kabat位用選自由離胺酸、精胺酸、麩胺醯胺及麩胺酸組成之群的胺基酸殘基進行之胺基酸殘基之替換。
在本發明另一態樣中，ABM中之取代包括在該重鏈可變區FR4中進行之至少一個胺基酸殘基之替換。在一特定實施例中，該重鏈可變區FR4中之取代包括在110或112 Kabat位中一或多處進行之胺基酸殘基之替換。
在一特定實施例中，該取代包括在110 Kabat位用選自由白胺酸、異白胺酸、蘇胺酸或絲胺酸組成之群的胺基酸進行之胺基酸殘基之替換。在一更具體之實施例中，該取代包括在110 Kabat位用異白胺酸進行之胺基酸殘基之替換。
在另一實施例中，該取代包括在112 Kabat位用選自由纈胺酸、白胺酸、異白胺酸或蘇胺酸組成之群的胺基酸進行之胺基酸殘基之替換。在一更具體之實施例中，該取代包括在112 Kabat位用異白胺酸進行之胺基酸殘基之替換。
在一態樣中，本發明進一步係關於一種改質抗原結合分子，該改質抗原結合分子包含一與親本多肽之CH1結構域相比含有至少一處胺基酸殘基取代之CH1結構域，其中在該改質抗原結合分子與一靶標抗原複合時，該取代會導致該靶標抗原之細胞傳訊活性發生改變。
在另一態樣中，本發明進一步係關於一種改質抗原結合分子，該改質抗原結合分子包含一與親本多肽之CH1結構域相比含有至少一處胺基酸殘基取代之CH1結構域，其中作為該取代之結果，該抗原結合分子具有經改變之調介一或多種靶標抗原交聯之能力。
在一特定實施例中，該CH1中之取代包括在148、149或150位中一或多處進行之胺基酸殘基之替換。在一更具體之實施例中，該取代包括在149位用白胺酸進行之胺基酸殘基之替換。在另一實施例中，該取代包括整個CH1結構域之替換。在另一實施例中，該取代包括用 IgM CH1結構域替換IgG CH1結構域。
在另一態樣中，本發明係關於一種含有至少一處胺基酸取代之改質抗原結合分子，其中該取代包括在位於可變區與恆定區間介面之該區的輕鏈中進行之胺基酸殘基之替換，其中在該改質抗原結合分子與一靶標抗原複合時，該取代會導致該靶標抗原結合分子之細胞傳訊活性發生改變。
在另一態樣中，本發明係關於一種含有至少一處胺基酸取代之改質抗原結合分子，其中該取代包括在位於可變區與恆定區間介面之該區的輕鏈中進行之胺基酸殘基之替換，其中作為該取代之結果，該改質抗原結合分子具有經改變之調介一或多種靶標抗原交聯之能力。
在一特定實施例中，該ABM輕鏈可變區之取代包括在10、12、39、40、41、80、81、83、84、103、105、106及108 Kabat位中一或多處進行之胺基酸替換。在一特定實施例中，該ABM輕鏈可變區之取代包括在40、80、83、105或106 Kabat位中一或多處進行之胺基酸殘基之替換。
在另一特定實施例中，該ABM輕鏈之取代包括在40、80、83、105或106 Kabat位中一或多處用非極性胺基酸進行之胺基酸殘基之替換。
在另一特定實施例中，該ABM輕鏈之取代包括在40 Kabat位用丙胺酸進行之胺基酸殘基之替換。
在另一特定實施例中，該ABM輕鏈之取代包括在80 Kabat位用脯胺酸進行之胺基酸殘基之替換。
在另一特定實施例中，該ABM輕鏈之取代包括在83 Kabat位用***酸進行之胺基酸殘基之替換。
在另一特定實施例中，該ABM輕鏈之取代包括在105 Kabat位用丙胺酸進行之胺基酸殘基之替換。
在另一特定實施例中，該ABM輕鏈之取代包括在106 Kabat位用丙胺酸進行之胺基酸殘基之替換。在一更為特定之實施例中，該ABM輕鏈之取代包括在106 Kabat位進行之胺基酸殘基之替換，其中該抗原結合分子在其誘發凋亡之能力方面有所減弱。
在一些實施例中，本發明取代包括如上所述在重鏈及/或輕鏈可變區及/或恆定區進行之胺基酸殘基替換之組合。
在一態樣中，本發明改質ABM之該(等)胺基酸取代在該改質ABM與一靶標抗原複合時會導致該靶標抗原之細胞傳訊活性發生改變。
在本發明一態樣中，該經改變細胞傳訊活性係增強之激動劑活性。在一實施例中，該增強之激動劑活性係選自由誘發凋亡及誘發細胞分化組成之群。
在本發明另一態樣中，該經改變細胞傳訊活性係增強之拮抗劑活性。在一實施例中，該拮抗劑活性係阻斷選自由細胞存活、細胞生長、細胞增殖及血管發生組成之群的細胞傳訊途徑。
在又一態樣中，本發明改質抗原結合分子可特異結合人類CD20。在另一態樣中，該改質抗原結合分子可特異結合人類TNF受體超家族成員。在一特定實施例中，該TNF受體超家族係選自由TNFR1、CD95、TRAILR1、TRAILR2、EDAR及p75NGFR組成之群。
在本發明另一態樣中，該改質抗原結合分子可特異結合受體酪胺酸激酶。在一特定實施例中，該受體酪胺酸激酶係選自由HER1(EGFR1)、HER2/neu、HER3、HER4、IGF-1R、FGFR、PDGFR、VEGFR1、VEGFR2及VEGFR3組成之群。在一更具體之實施例中，該受體酪胺酸激酶係HER1(EGFR1)。
在另一態樣中，本發明進一步係關於一種改質ABM，其可選自但不限於由全抗體、Fab片段或其融合蛋白、F(ab')2片段或其融合蛋 白、微小抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體組成之群。在一特定實施例中，該改質ABM係嵌合或完全人類抗體。在一更為特定之實施例中，該嵌合改質ABM係人類化抗體。在另一特定實施例中，該改質ABM係多特異性抗體。在一更為特定之實施例中，該改質ABM係雙特異性抗體。
在另一態樣中，本發明親本抗原結合分子包含一選自由SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62組成之群的重鏈可變區。
在另一態樣中，本發明親本抗原結合分子包含一選自由SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133及SEQ ID NO：134組成之群的輕鏈。
在又一態樣中，本發明亦係關於進一步包含人類Fc區之改質ABM。根據一實施例，該改質ABM之Fc區已經改質具有經改變之寡糖。在一更具體之實施例中，該Fc區已經改質與非經改質Fc區相比具有比例降低之岩藻糖殘基。在另一具體實施例中，該Fc區與非經改質Fc區相比具有比例升高之二等分寡糖。在另一具體實施例中，該改質寡糖係二等分複合體。在另一具體實施例中，該改質寡糖在Fc區與非經改質Fc區相比具有比例升高之二等分非岩藻糖基化寡糖。在另一具體實施例中，該Fc區與非經改質Fc區相比在該經改質Fc區中具有升高之GlcNAc殘基與岩藻糖殘基比。在另一具體實施例中，該二等分非岩藻糖基化寡糖係雜合體。在另一具體實施例中，該二等分非岩藻糖基化寡糖係複合體。
根據另一態樣，本發明靶標抗原係一選自由膜轉運受體、G一蛋白偶聯受體及酵素偶聯受體組成之群的細胞表面受體。在一特定實施例中，該膜轉運受體係一通道偶聯受體。在另一特定實施例中，該酵 素偶聯受體係選自由受體鳥苷酸環化酶、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶結合受體、受體酪胺酸磷酸酶及受體絲胺酸/蘇胺酸激酶組成之群。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含本發明改質ABM之醫藥組合物。本發明涵蓋，該醫藥組合物可進一步包含一醫藥上可接受之載劑、佐劑或其組合。
本發明亦係關於一種治療患者之可由經改變細胞傳訊活性治療之疾病的方法，該方法包括投與給該患者治療有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含一本發明改質ABM及一醫藥上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明係關於一種編碼包含一重鏈或輕鏈可變區之多肽之經分離多核苷酸，其中該重鏈或輕鏈可變區與親本重鏈或輕鏈可變區相比在至少一個框架區中含有至少一處胺基酸殘基取代，且其中在該多肽與一靶標抗原複合時，該取代會導致該靶標抗原之細胞傳訊活性發生改變。
在又一態樣中，本發明係關於一種編碼包含一重鏈或輕鏈可變區之多肽的經分離多核苷酸，其中該重鏈或輕鏈可變區與親本重鏈或輕鏈可變區相比在至少一個框架區含中有至少一處胺基酸殘基取代，且其中作為該取代之結果，該多肽具有經改變之調介一或多種靶標抗原交聯之能力。
在一實施例中，本發明多核苷酸編碼一多肽，其中該多肽包含一抗體重鏈或輕鏈。在另一實施例中，本發明多核苷酸編碼一多肽，其中該多肽包含一融合蛋白。本發明亦係關於由本發明該等多核苷酸編碼之多肽。
本發明亦係關於一種包含本發明多核苷酸之載體及包含該載體之宿主細胞。
本發明進一步係關於一種編碼包含一重鏈或輕鏈可變區之多肽 的多核苷酸，該多肽與親本抗原結合分子的重鏈或輕鏈可變區相比在該重鏈或輕鏈可變區的至少一個框架區含中有至少一處胺基酸殘基取代，其中該多肽係本發明改質ABM。
本發明亦係關於一種經改造可表現至少一個編碼一多肽之核酸的宿主細胞，其中該多肽具有量足以改質由該宿主細胞產生之多肽之Fc區中寡糖之β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III活性，其中該多肽係本發明改質ABM。在一實施例中，該具有β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III活性之多肽係融合多肽。在一特定實施例中，該融合多肽包含β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III之催化結構域。在另一實施例中，該融合多肽進一步包含異源高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域。該高爾基體定位結構域可選自但不限於由甘露糖苷酶II之定位結構域、β(1,2)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶I之定位結構域、β(1,2)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶II之定位結構域、甘露糖苷酶I之定位結構域以及α1-6核心岩藻糖基轉移酶之定位結構域組成之群。
在另一實施例中，該改質ABM包含一人類IgG Fc區之等效區。
在又一實施例中，作為寡糖改質之結果，由本發明宿主細胞產生之改質ABM展示出增強之Fc受體結合親和力及/或增強之效應功能。根據本發明，該增強之效應功能係選自由增強之Fc介導之細胞毒性、增強之對NK細胞之結合、增強之對巨噬細胞之結合、增強之對多形核細胞之結合、增強之對單核細胞之結合、增強之誘發凋亡之直接傳訊、增強之樹突狀細胞成熟及增強之T細胞引發組成之群。在一實施例中，該Fc受體係Fcγ激活受體。在另一實施例中，該Fc受體係FcγRIIIA受體。
本發明宿主細胞可選自包括但不限於CHO細胞、HEK293-EBNA細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞之群組。
在另一態樣中，本發明係關於一種用於產生改質ABM之方法，該改質ABM包含一與親本ABM的重鏈或輕鏈可變區相比在該重鏈或輕鏈可變區的至少一個框架區中含有至少一處胺基酸殘基取代之重鏈或輕鏈可變區，其中在該改質ABM與一靶標抗原複合時，該取代會導致該靶標抗原之細胞傳訊活性發生改變，該方法包括：(i)在允許表現該多核苷酸之條件下培養本發明宿主細胞；及(ii)自培養基中回收該改質ABM。
在又一態樣中，本發明係關於一種用於產生改質ABM之方法，該改質ABM包含一與親本抗原結合分子的重鏈或輕鏈可變區相比在該重鏈或輕鏈可變區的至少一個框架區中含有至少一處胺基酸殘基取代之重鏈或輕鏈可變區，其中作為該取代之結果，該改質抗原結合分子具有經改變之調介交聯之能力，該方法包括：(i)在允許表現該多核苷酸之條件下培養本發明宿主細胞；及(ii)自培養基中回收該改質ABM。
在又一態樣中，本發明係關於一種改變ABM促進含有ABM之靶標抗原之複合體形成之能力的方法，該方法包括：取代親本ABM的至少一個重鏈或輕鏈可變區框架區中的至少一個胺基酸殘基。在一實施例中，該ABM可增強表現該靶標抗原之細胞中的凋亡之誘發。在另一實施例中，該ABM可增強表現該靶標抗原之細胞中的細胞分化之誘發。
本發明亦係關於一種誘發細胞凋亡之方法，該方法包括使該細胞與改質ABM接觸，該改質ABM包含一與親本ABM的重鏈或輕鏈可變區相比在該重鏈或輕鏈可變區的至少一個框架區中含有至少一處胺基酸殘基取代之重鏈或輕鏈可變區，其中該改質ABM與該親本多肽相比具有增強之誘發凋亡之能力。在一特定實施例中，該細胞系腫瘤細胞。在一實施例中，該接觸於活體內進行。
在另一態樣中，本發明亦係關於一種治療可由經改變之靶標抗原細胞傳訊活性治療之疾病或病症的方法，該方法包括投與給需要其之受試者治療有效量之改質ABM，其中該改質ABM包含一與親本ABM之重鏈或輕鏈可變區相比在該重鏈或輕鏈可變區的至少一個框架區中含有至少一處胺基酸取代之重鏈或輕鏈可變區，且其中在該改質ABM與一靶標抗原複合時，該取代會導致該靶標抗原之細胞傳訊活性發生改變。
在又一態樣中，本發明係關於一種治療可由經改變之調介一或多種靶標抗原交聯之能力治療之疾病或病症的方法，該方法包括投與給需要其之受試者治療有效量之改質ABM，其中該改質ABM包含一與親本ABM之重鏈或輕鏈可變區相比在該重鏈或輕鏈可變區的至少一個框架區中含有至少一處胺基酸取代之重鏈或輕鏈可變區，且其中作為該取代之結果，該改質ABM具有經改變之調介一或多種靶標抗原交聯之能力。
在一特定實施例中，根據本發明投與之改質ABM包含一選自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：38組成之群的重鏈可變區。
在一態樣中，擬用本發明改質ABM治療之疾病或病症係細胞增殖病症。在一實施例中，細胞增殖病症係癌症。在另一態樣中，擬用本發明改質ABM治療之疾病或病症係B細胞病症。在一具體實施例中，該B細胞病症係B細胞淋巴瘤。
本發明亦係關於本發明改質ABM用於製造治療或預防癌症之藥物之用途。
在一特定實施例中，本發明亦係關於本發明改質ABM製造治療或預防癌症之藥物之用途，其中該癌症係選自由B-細胞淋巴瘤、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、 ***癌、腎癌及腦癌組成之群。
在另一特定實施例中，本發明亦係關於本發明改質ABM用於製造治療或預防癌症之藥物之用途，其中該抗原結合分子係以自約1.0毫克/公斤至約15毫克/公斤之治療有效量使用。在又一實施例中，該治療有效量係自約1.5毫克/公斤至約12毫克/公斤。在又一實施例中，該治療有效量係自約1.5毫克/公斤至約4.5毫克/公斤。在又一實施例中，該治療有效量係自約4.5毫克/公斤至約12毫克/公斤。在又一實施例中，該治療有效量係約1.5毫克/公斤。在又一實施例中，該治療有效量係約4.5毫克/公斤。在又一實施例中，該治療有效量係約12毫克/公斤。
本發明亦係關於一種治療或預防癌症之方法，該方法包括向需要其之患者投與治療有效量之本發明醫藥組合物。在一特定實施例中，該癌症係選自由B-細胞淋巴瘤、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、***癌、腎癌及腦癌組成之群。
本發明亦係關於一種治療或預防癌前病況或病損之方法，該方法包括向需要其之患者投與治療有效量之如請求項85或158之醫藥組合物。在一特定實施例中，該癌前病況或病損係選自由口腔白斑、光化性角化病(日光性角化病)、結腸或直腸之癌前息肉、胃黏膜上皮異型增生、腺瘤型異型增生、遺傳性非息肉病性結腸癌症候群(HNPCC)、巴瑞特氏食道症(Barrett's esophagus)、膀胱異型增生及癌前子宮頸病況組成之群。
本發明亦係關於一種用於治療或預防癌症之本發明改質抗原結合分子在一特定實施例中，該癌症係選自由B-細胞淋巴瘤、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、***癌、腎癌及腦癌組成之群。
本發明亦係關於一種用於治療或預防癌前病況或病損之本發明改質抗原結合分子。在一特定實施例中，該癌前病況或病損係選自由口腔白斑、光化性角化病(日光性角化病)、結腸或直腸之癌前息肉、胃黏膜上皮異型增生、腺瘤型異型增生、遺傳性非息肉病性結腸癌症候群(HNPCC)、巴瑞特氏食道症、膀胱異型增生及癌前子宮頸病況組成之群。
本發明亦係關於一種用於治療與一或多種靶標抗原之經改變細胞傳訊活性及/或經改變之交聯有關之病症的本發明改質抗原結合分子。
圖1. 多種抗-CD20抗體重鏈可變區構造之胺基酸序列比對。單株抗體1F5重鏈可變區之胺基酸序列係用作參照序列。相對於1F5之胺基酸差異以陰影表示。
圖2. 不同人類化抗-CD20抗體與Raji B細胞之結合。將親本(嵌合)B-ly1與彼等兩個經鑑別可誘發強烈凋亡之人類化重鏈變體(BHH2及BHH6)以及經假設可恢復此效應之(人類化，非凋亡性)B-HL8變體的彼等衍生物(B-HL11至17)加以比較。所有人類化重鏈變體均與同一BKV1人類化輕鏈變體配對。
圖3. 利妥昔單抗(rituximab)(O)及chB-ly1(△)與Raji B-淋巴瘤細胞上CD20之結合。
圖4. 三種抗-CD20抗體之抗體依賴性凋亡的比較。chB-ly1wt代表具有一鼠類可變區及一人類恆定區之嵌合B-ly1抗體構造。BHH2-BKV1代表人類化變體，包含鼠類B-ly1 CDR及對於重鏈源自VH1類人類種系V基因且與BKV1人類化B-ly1輕鏈配對之人類框架區。BHL8-BKV1wt代表人類化變體，該人類化變體包含鼠類B-ly1 CDR及源自兩個不同人類種系V基因且與BKV1人類化B-ly1輕鏈配對之人類框架 區。
圖5. B-ly1抗-CD20抗體的5個人類化變體之抗體依賴性凋亡之比較。BHH2-BKV1代表人類化變體，該人類化變體包括鼠類B-ly1 CDR及對於重鏈源自VH1類(BHH2)且與BKV1人類化B-ly1輕鏈配對之人類框架區。BHL8-BKV1wt代表人類化變體，該人類化變體包含鼠類B-ly1 CDR及源自兩個不同人類種系V基因且與BKV1人類化B-ly1輕鏈配對之人類框架區。BHL14-BKV1代表BHL8之衍生物，其中在重鏈可變區12 Kabat位有一纈胺酸向離胺酸之取代且在48 Kabat位有一纈胺酸向甲硫胺酸之取代，且其與BKV1輕鏈構造配對。BHL15-BKV1 W1亦源自BHL8，其中在重鏈可變區16 Kabat位有一甘胺酸向絲胺酸之取代且在48 Kabat位有一纈胺酸向甲硫胺酸之取代，且其與BKV1輕鏈構造配對。BHL16-BKV1 W1係源自BHL8，其中在重鏈可變區20 Kabat位有一白胺酸向纈胺酸之取代且在48 Kabat位有一纈胺酸向甲硫胺酸之取代，且其與BKV1輕鏈構造配對。BHL17-BKV1 W1係源自BHL8，其中在重鏈可變區48 Kabat位有一纈胺酸向甲硫胺酸之取代且其與BKV1輕鏈構造配對。
圖6. C2B8抗-CD20單株抗體與B-ly1抗體的兩種人類化變體(BHH2-BKV1及BHL13-BKV1)在Z-138細胞中誘發之抗體依賴性凋亡的比較。BHH2-BKV1代表人類化變體，其包含鼠類B-ly1 CDR及對於重鏈源自VH1類人類種系V基因且與BKV1人類化B-ly1輕鏈配對之人類框架區。BHL13-BKV1係源自BHL8(參見5，上文)，其中在重鏈可變區11 Kabat位有一白胺酸向纈胺酸之取代且在48 Kabat位有一纈胺酸向甲硫胺酸之取代，且其與BKV1輕鏈配對。
圖7. 三種不同類別FcγRIIIa-158V/F基因型之全血中利妥昔單抗(rituximab)(◇)與chB-ly1(■)之B-細胞消耗：(A)來自F/F供體之全血，對於較低親和力受體為純合；(B)來自F/V供體之全血，對親和力受體 為雜合；及(C)來自V/V供體之全血，對較高親和力受體為純合。
圖8. 糖改造之嵌合B-ly1抗體的MALDI-TOF譜圖。(A)詳述比峰值之百分比的表格；(B)糖改造之嵌合B-ly1的波譜；(C)用Endo-H處理之糖改造之嵌合B-Ly1的波譜。
圖9. 不同人類化抗-CD20抗體對Raji B細胞之結合。B-HH2構造與B-HL8及B-HL11構造間之差異位於框架1及2區中，其中三個CDR均相同。B-HL8及B-HL11之FR1及FR2序列係源自人類VH3類，而整個B-HH2框架係源自人類VH1。B-HL11係B-HL8具有單突變Glu1Gln之衍生物，其中Gln係B-HH2構造中之胺基酸殘基。此意味著Glu1Gln交換並不會改變結合親和力或強度。B-HH2與B-HL8間之其他差異係14個FR殘基，其中一或多個會影響此抗體之抗原結合特性。
圖10. 人類化抗-CD20抗體BHL4-BKV1對Raji靶標細胞之結合。B-HL4構造係源自B-HH2抗體，其中用人類種系序列IGHV1-45(Acc No X92209)之FR1替換B-HH2之FR1。儘管僅在FR1區內四個位置具有不同胺基酸，此構造卻顯示出大大減小之抗原結合能力。此等殘基位於2、14、28及30位(根據Kabat編號)。此等位置中，28及30位似乎為有影響之位置，乃因其係CDR1 Chothia定義的一部分。
圖11. B-HH1、B-HH2、B-HH3(所有均與BKV1人類化B-ly1輕鏈配對)與親本抗體B-ly1間結合特性之比較。數據顯示所有Ab顯示出類似的EC50值，但B-HH1構造與變體B-HH2及B-HH3相比結合時具有較低強度/化學計量。B-HH1會因其部分人類CDR1及CDR2區(Kabat定義)以及28位之Ala/Thr多態性(Kabat編號)而不同於B-HH2及B-HH3。此表明，28位、完整CDR1及/或完整CDR2對於抗體/抗原相互作用係重要的。
圖12. B-HL1、B-HH1及B-ly1親本抗體間結合特性之比較。數據顯示與B-ly1相比在B-HL1構造中缺乏任何結合活性及約一半的B-HH1 結合強度/化學計量。B-HL1以及B-HH1二者均根據源自人類VH1類別之接受體框架加以設計。在其他差異中，B-HL1構造之71位(Kabat編號)係一顯著差異，表明其對於抗原結合之推定重要性。
圖13. 抗-CD20抗體重鏈構造B-HL2與B-HL3之間對其抗原之結合特性的比較。在二者情形中，將鼠類VL序列與人類化重鏈組合。數據顯示，B-HL2及B-HL3構造並未展示CD-20結合活性。
圖14. 抗-CD20抗體對Z-138 MCL細胞之凋亡作用。
圖15. 抗-CD20抗體於PR-1(DLBCL細胞系)(左圖)及Z-138(MCL細胞系)(右圖)誘發之凋亡。分析細節：將5x105個細胞/孔接種在24-孔板(5x105個細胞/毫升)內之培養基中。將終濃度為10微克/毫升之各個抗體、用於陰性對照之PBS或5mM喜樹鹼(Camptothecin，CPT)陽性對照加入各孔中。按o/n(16小時)培育樣品，用AnnV-FITC染色並藉由FACS分析。分析按一式三份實施。(*)：扣減對於單獨PBS之信號(單獨PBS對PR-1及Z-138細胞分別給出8%及2%之AnnV+)。使用如下抗體：C2B8(嵌合、非糖改造)；BHH2-BKV1(人類化、非糖改造)。注意：此分析並不涉及任何額外效應細胞，僅涉及靶標加抗體或對照。
圖16. 抗-CD20抗體誘發之免疫效應細胞的靶標細胞殺傷；左圖：全血正常B-細胞消耗；右圖：Raji作為靶標細胞之ADCC。分析細節：藉由過夜培育及藉由FACS進行之對CD19+/CD3+之分析來測定正常全血中B-細胞消耗。使用PBMC作為效應物用4小時培育及25：1效應細胞：靶標比測定ADCC。藉由相對於去污劑溶解(100%)及沒有抗體之溶解(0%)的鈣黃綠素滯留來量測靶標殺傷。使用如下抗體：C2B8(嵌合、非糖改造形式)；BHH2-BKV1-wt(BHH2-BKV1之人類化、非糖改造形式)；BHH2-BKV1-GE(BHH2-BKV1之人類化、糖改造形式)。
圖17. 未改質、非糖改造之BHH2-BKV1人類化IgG1 B-ly1抗-人 類CD20抗體之PNGaseF釋放之Fc-寡糖的MALDI/TOF-MS譜圖。
圖18. 糖改造之BHH2-BKV1g1人類化IgG1 B-ly1抗-人類CD20抗體之PNGaseF釋放之Fc-寡糖的MALDI/TOF-MS譜圖。糖改造係藉由抗體基因與編碼具有β-1,4-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III(GnT-III)催化活性之酵素的基因於宿主細胞中之共表現實施。
圖19. 糖改造之BHH2-BKV1g2人類化IgG1 B-ly1抗-人類CD20抗體之PNGaseF釋放之Fc-寡糖的MALDI/TOF-MS譜圖。糖改造係藉由抗體基因與編碼具有β-1,4-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III(GnT-III)催化活性之酵素及編碼具有高爾基體β-甘露糖苷酶II催化活性之酵素的基因在宿主細胞中之共表現實施。
圖20. 在表現重組CD16之CHO細胞表面展示非糖改造及糖改造(g2型式；糖基化譜圖參見圖17至19)抗體對人類FcγRIIIa受體之結合。
圖21. 非Fc改造及Fc改造抗-CD20抗體對Z-138 MCL細胞之凋亡作用。分析細節：將5x105個細胞/孔接種於24-孔板(5x105個細胞/毫升)內培養基中。將終濃度為10微克/毫升之各個抗體或用於陰性對照之PBS加入各孔中。按o/n(16小時)培育樣品，用AnnV-FITC染色並藉由FACS分析。分析按一式三份實施。使用如下抗體：C2B8=利妥昔單抗(嵌合、非糖改造形式)；BHH2-BKV1(人類化、非糖改造-對於糖基化譜圖參見圖17至19)；BHH2-BKV1g1(人類化、糖改造)；BHH2-BKV1g2(人類化，糖改造)。注意：此分析並未涉及任何額外效應細胞，僅涉及靶標加抗體或對照。(*)：扣減單獨PBS之信號。
圖22. 不同人類化抗-CD20抗體對Raji B細胞之結合。將人類化重鏈構造BHH2與其衍生物BHH4及BHH7加以比較。亦顯示可解決28及30 Kabat位之影響的變體(BHH8及BHH9)。
圖23. 單胺基酸交換對抗-CD20抗體在Z-138 MCL細胞上誘發之 凋亡的影響。分析細節：將5x105個細胞/孔接種於24-孔板(5x105個細胞/毫升)內培養基中。將終濃度為10微克/毫升之各個抗體或用於陰性對照之PBS(無Ab)加入各孔中。按o/n(16小時)培育樣品，用AnnV-FITC染色並藉由FACS加以分析。分析按一式三份實施。使用如下抗體：C2B8(嵌合、非糖改造)；BHH2(人類化、非糖改造)；BHH2-A(BHH2衍生物，其中在11 Kabat位有一纈胺酸向白胺酸之取代)；及BHH2-B(BHH2衍生物，其中在12 Kabat位有一離胺酸向纈胺酸之取代)；後三個係與BKV1輕鏈配對。抗原結合之KD未因取代而改變。注意：此分析並未涉及任何額外效應細胞，僅涉及靶標加抗體或對照。
圖24. 單胺基酸交換對由先前非活性抗-CD20抗體在Z-138 MCL細胞上誘發之凋亡的影響。分析細節：將5x105個細胞/孔接種於24-孔板(5x105個細胞/毫升)內培養基中。將終濃度為10微克/毫升之各個抗體或用於陰性對照之PBS加入各孔中。按o/n(16小時)培育樣品，用AnnV-FITC染色並藉由FACS加以分析。分析按一式三份實施。使用如下抗體：C2B8(嵌合、非糖改造)；BHL8(人類化、非糖改造)；BHL13(BHL8衍生物，其中在11 Kabat位有一白胺酸向纈胺酸之取代且在在48 Kabat位有一纈胺酸向甲硫胺酸之取代)；及BHL14(BHL8衍生物，其中在12 Kabat位有一纈胺酸向離胺酸之取代且在48 Kabat位有一纈胺酸向甲硫胺酸之取代)；後三個係與BKV1輕鏈配對。注意：此分析並未涉及任何額外效應細胞，僅涉及靶標加抗體或對照。
圖25. 輕鏈內單胺基酸交換對由抗-CD20抗體在Z-138 MCL細胞上誘發之凋亡的影響。分析細節：將5x105個細胞/孔接種於24-孔板(5x105個細胞/毫升)內培養基中。將終濃度為10微克/毫升之各個抗體、用於陰性對照之PBS(無Ab)或5mM用於陽性對照之喜樹鹼(CPT)加入各孔中。按o/n(16小時)培育樣品，用AnnV-FITC染色並藉由FACS加以分析。分析按一式三份實施。使用如下抗體：與BKV1輕鏈 配對之BHH2-A(BHH2衍生物，其中在11 Kabat位有一纈胺酸向白胺酸之取代)；與BKV1輕鏈配對之BHH6(BHH2衍生物，其中在34 Kabat位有一甲硫胺酸向異白胺酸之取代)；及與BKV14輕鏈配對之BHH6(BKV1衍生物，其中在106 Kabat位有一異白胺酸向丙胺酸之取代)。
圖26. VH與CH1結構域間介面處分子「球窩關節」之三維繪圖。
除非下文及本文另有說明，否則本文所用術語具有業內通用含義。
本文所用術語抗原結合分子(ABM)以其最廣義係指特異結合抗原決定簇之分子。「特異結合」意指該結合對抗原具有選擇性，且可區別於不需要之或非特異性相互作用。本文所用術語改質抗原結合分子(或改質ABM)欲指包含在重鏈可變區及/或CH1區含有至少一處胺基酸殘基取代及/或在輕鏈可變區及/或CL區含有至少一處胺基酸殘基取代之ABM。
本文所用術語抗體欲包括全抗體分子(包括單株、多株及多特異性(例如，雙特異性)抗體)及具有Fc區並保留結合特異性之抗體片段，以及包括免疫球蛋白Fc區之等效區並保留結合特異性之融合蛋白。本發明亦涵蓋保留結合特異性之抗體片段，包括但不限於VH片段、VL片段、Fab片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、微小抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體(參見例如，Hudson及Souriau，Nature Med.9：129-134(2003)，其全文以引用方式併入本文中)。本發明亦涵蓋人類化、靈長類化及嵌合抗體。本文所用全抗體係指包括兩重鏈及兩輕鏈之免疫球蛋白分子，其中每一鏈包含可變區及恆定區。
本文所用術語可變區欲指免疫球蛋白重鏈或輕鏈之N端結構域。 根據本發明一實施例，改質ABM可包含可變區之功能片段。
本文所用術語重鏈可變區欲指免疫球蛋白重鏈之N端結構域。在一實例中，該重鏈可變區係由1至113 Kabat位界定(其中特定殘基處之可能***如由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)所指定之殘基)。根據本發明一實施例，改質ABM可包含重鏈可變區之功能片段。
本文所用術語重鏈恆定區欲指免疫球蛋白重鏈之C端結構域。有五類天然存在之重鏈恆定區：IgA、IgG、IgE、IgD及IgM。在一實例中，該重鏈恆定區包含一CH1結構域、一CH2結構域及一CH3結構域。
本文所用術語CH1區欲指免疫球蛋白重鏈之恰在可變區C端及鉸鏈區N端之結構域。舉例而言，在IgG類型之免疫球蛋白中，CH1通常由114至228 Kabat位界定。
本文所用術語凋亡欲指程式性細胞死亡，其特徵為因細胞質、質膜及/或細胞器凝聚而出現的某些細胞事件，例如核片段化及/或凋亡小體形成。
本文所用術語激動劑活性欲指作用劑(例如，抗原結合分子)在其與細胞表面結合之分子相互作用(例如，結合)及起始或誘發反應時具有之活性。
本文所用術語拮抗劑活性欲指作用劑(例如，抗原結合分子)在其與細胞上分子相互作用(例如，結合)且阻礙反應起始或誘發反應或中斷進行中反應時具有之活性。
本文所用術語融合及嵌合在提及多肽(例如ABM)時使用時係指包含源自兩個或更多個異源多肽(例如來自不同物種之抗體部分)之胺基酸序列的多肽。舉例而言，對於嵌合ABM，非抗原結合組份可源自 多種物種，包括靈長類(例如黑猩猩)及人類。嵌合ABM之恆定區最佳大體等同於天然人類抗體之恆定區；嵌合抗體之可變區最佳係源自特異結合感興趣抗原之非人類(即，供體)抗原結合分子。該嵌合ABM可包含整個供體可變區；另一選擇，該嵌合抗體可包含人類化或靈長類化抗體。人類化抗體係尤佳形式之融合或嵌合抗體。
本文所用術語人類化用來意指源自非人類抗原結合分子(例如，鼠類抗體)保留或大體保留親本分子之抗原結合性質但在人類中具有較低免疫原性之抗原結合分子。此可藉由各種方法達成，該等方法包括：(a)將整個非人類可變結構域接入人類恆定區上以產生嵌合抗體；(b)僅將非人類CDR接入人類框架區及恆定區上，保留或不保留關鍵性框架殘基(例如，彼等對於保留良好抗原結合親和力或抗體功能具有重要性之殘基)；或(c)植入整個非人類可變結構域，但需藉由表面殘基替換來用人類樣部分將其「覆蓋」。此等方法揭示於Jones等人，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，81：6851-6855(1984)；Morrison及Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994)，所有上述文獻之全文均以引用方式併入本文中。
在抗體的每一重鏈及輕鏈可變結構域中一般有3個互補決定區或CDR(CDR1、CDR2及CDR3)，在抗體的每一重鏈及輕鏈可變結構域中CDR側接有四個框架亞區(即，FR1、FR2、FR3及FR4)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。人類化抗體之論述尤其可見於美國專利第6,632,927號及美國公開申請案第2003/0175269號，二者之全文以引用方式併入本文中。
類似地，本文所用術語靈長類化用來意指源自非靈長類抗原結合分子(例如，鼠類抗體)保留或大體保留親本分子之抗原結合性質但 在靈長類中具有較低免疫原性之抗原結合分子。
在其中術語有兩個或更多個定義可使用及/或為業內接受之情形中，除非有明確的相反說明，否則本文所用術語定義欲包括所有此等含義。具體實例係使用術語「互補決定區」(「CDR」)描述重鏈及輕鏈多肽二者可變區中所見之非鄰接抗原組合位點。此特定區已由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)及Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)闡述，上述兩個文獻均以引用方式併入本文中，其中該等定義在彼此進行比較時包括胺基酸殘基之重疊或子集。不過，意指抗體CDR或其變體之各定義的應用欲涵蓋於本文所定義及使用之術語的範圍內。包含由每一上述引用之參考文獻定義之CDR的適宜胺基酸殘基以比較方式列示於表I中。包含特定CDR之精確殘基數會隨CDR序列及大小而改變。給定抗體可變區胺基酸序列，熟習此項技術者可以常規方式確定哪些殘基含有特定CDR。
Figure TWI615407BD00001
1 表1中所有CDR定義之編號係根據Kabat等人(參見下文)所述編號規定進行。
2 「OxAbM」係指由Oxford Molecular之「AbM」抗體模型構建 軟體定義之CDR。
Kabat等人亦定義一適用於任何抗體之用於可變結構域序列的編號系統。業內普通技術者可明確地將此「Kabat編號」系統指定給任何可變結構域序列，除序列本身外不依賴於任何實驗數據。本文所用「Kabat編號」係指Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)闡述之編號系統。除非另有說明，否則提及ABM中具體胺基酸殘基位置之編號係根據Kabat編號系統。序列表之序列未根據Kabat編號系統編號。
本文所用具有「GnTIII活性」之多肽係指能夠催化N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)殘基以β-1-4鍵方式加入N-連接寡糖三甘露糖基核心之β-連接甘露糖苷之多肽。此包括展現類似但不必等同於β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III(根據Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(NC-IUBMB)亦稱作β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙醯葡糖胺基-轉移酶(EC 2.4.1.144))活性之酵素活性的融合多肽，該活性可在特定生物分析中量測(有或無劑量依賴性)。在其中確實存在劑量依賴性之情形中，其與GnTIII相比無需與GnTIII之活性相同，而是實質類似於給定活性中之劑量依賴性(即，該候選多肽相對於GnTIII會展現較高活性或至多約25倍以下、且較佳展現至多約10倍以下之活性，且最佳展現至多約3倍以下之活性。)
本文所用術語變體(或類似物)係指藉由胺基酸***、刪減及取代，利用(例如)重組DNA技術形成之不同於明確闡述之本發明多肽的多肽。本發明ABM之變體包括嵌合、靈長類化或人類化抗原結合分子，其中一或若干個胺基酸殘基係藉由替換、添加及/或刪減而改質，此方式應不會實質影響抗原結合親和力。確定哪些胺基酸殘基可 經替換、添加或刪減同時不會破壞感興趣活性之指導可如下獲得：對特定多肽之序列與同源肽之序列加以比較並最小化高度同源區(保守區)中進行之胺基酸序列變化數或用一致序列替換胺基酸。
另一選擇，可利用遺傳密碼之「冗餘性」來合成或選擇編碼此等相同或類似多肽之重組變體。可引入各種密碼子取代(例如產生各種限制性位點之沉默變化)以最優化向質粒或病毒載體中之選殖或在特定原核或真核系統中之表現。多核苷酸序列之突變可反映在多肽或加入至該多肽以改良該多肽任一部分之性質、改變諸如配體結合親和力、鏈間親和力或降解/更換率等特徵之其他肽的結構域中。
本文所用胺基酸殘基取代欲指替換參考序列(例如，親本分子，如抗原結合分子)中一或多個胺基酸。在一實施例中，胺基酸殘基取代可藉由(例如)編碼多肽之核酸序列的點突變(相對於親本序列)達成。在另一實施例中，胺基酸殘基取代可藉由用(例如)在相對於親本之待取代位置包含期望胺基酸之種系VH序列的框架區替換親本多肽的整個框架區達成。
「保守」胺基酸取代係彼等用具有類似結構及/或化學性質的另一胺基酸替換一胺基酸達成之取代，即，保守胺基酸替換，且可根據所涉及殘基之極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性的相似性來實現。舉例而言，非極性(疏水性)胺基酸包括甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、***酸、色胺酸及甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩胺醯胺；帶正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；且帶負電荷(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。「***」或「刪減」較佳在約1至20個胺基酸之範圍內，更佳係1至10個胺基酸。允許之變化可藉由利用重組DNA技術在多肽分子中系統性進行胺基酸***、刪減或取代並分析所得重組變體活性來以實驗方法確定。
本文所用術語親本抗原結合分子或親本分子係指具有由多核苷酸序列編碼之特定胺基酸序列的多肽。親本分子之序列(即，親本序列)用作進行胺基酸殘基取代之參考序列，該等取代可改變所得分子(例如，改質抗原結合分子)之能力以誘發或阻斷抗原之細胞傳訊活性及/或交聯。同樣，親本分子之活性在確定取代是否已對抗原之細胞傳訊活性及/或交聯產生作用及必要時確定該作用之程度時用作參考。與其親本相比含有一或多處胺基酸取代之序列(例如，改質ABM)可繼而用作進一步取代之親本序列。
本文所用術語經改變細胞傳訊活性欲指ABM誘發或抑制靶標抗原之細胞傳訊活性之能力的增強或減弱。
本文所用術語一或多種靶標抗原的經改變之文聯欲指ABM使能夠形成複合體之靶標抗原彼此更加靠近、及/或與其他膜結合分子更加靠近、及/或使之形成更有利於相互作用之構像(例如，藉助蛋白質交聯或膜結合受體寡聚作用)以起始細胞傳訊途徑之能力的增強或減弱。
本文所用細胞傳訊機制或細胞傳訊活性欲指引起特定細胞事件或生物功能之整個傳訊(即，訊號轉導)途徑以及沿該途徑之任何傳訊步驟。
具有與本發明參考核苷酸序列至少(例如)95%「一致」之核苷酸序列的核酸或多核苷酸欲指，除去按參考核苷酸序列的每100個核苷酸計該多核苷酸序列可包括至多5處點突變外，該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致。換言之，為獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中至多有5%核苷酸可經刪減或用另一核苷酸取代，或可將數量為至多佔參考序列全部核苷酸5%之核苷酸***參考序列中。
作為實際情況，可使用已知電腦程式按慣例確定任一特定核酸 分子或多肽與本發明核苷酸序列或多肽序列是否為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。用於確定查詢序列(本發明序列)與目標序列之間最佳整體匹配(亦稱作整體序列比對)之較佳方法可使用基於Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6：237-245(1990)演算法之FASTDB電腦程式確定。在序列比對中查詢序列及目標序列均係DNA序列。可藉由將U轉換為T來比較RNA序列。該整體序列比對之結果係以百分比一致性表示。DNA序列之FASTDB比對中所使用的用以計算百分比一致性之較佳參數係：矩陣=一元，k-元組=4，錯配罰分=1，連接罰分=30，隨機組長=0，截斷值=1，空位罰分=5，空位大小罰分0.05，視窗大小=500或目標核苷酸序列之長度(不論長短)。
若目標序列因5'或3'刪減非內部刪減而短於查詢序列，則須對結果進行手工校正。此乃因FASTDB程式在計算百分比一致性時未考慮到目標序列之5'及3'截短。對於相對於查詢序列5'或3'端截短之目標序列，百分比一致性如下校正：計算查詢序列對應於目標序列5'及3'之未匹配/對準之鹼基數，以查詢序列全部鹼基之百分比表示。藉有FASTDB序列比對之結果確定核苷酸是否匹配/對準。然後自百分比一致性中扣減掉該百分比，由上述FASTDB程式使用指定參數加以計算以得到最終的百分比一致性得分。此經校正之得分係用於本發明目的之得分。對於手工調整百分比一致性得分目的而言，僅計算由FASTDB比對顯示未與查詢序列匹配/對準之目標序列5'及3'鹼基以外之鹼基。
舉例而言，用90個鹼基之目標序列與100個鹼基之查詢序列進行比對來確定百分比一致性。刪減出現在目標序列5'端，因此FASTDB比對不會顯示5'端前10個鹼基之匹配/對準。10個不配對鹼基表示序列之10%(5'及3'端不匹配鹼基數/查詢序列總鹼基數)，因此在由FASTDB程式計算之百分比一致性得分中扣減10%。若其餘90個鹼基完全匹 配，則最終百分比一致性會係90%。在另一實例中，將90個鹼基之目標序列與100個鹼基之查詢序列加以比較。此次刪減為內部刪減，以致在目標序列5'或3'端不存在與查詢序列不匹配/對準之鹼基。在此情形中，由FASTDB計算之百分比一致性不需手工校正。再次，僅對目標序列5'及3'端未與查詢序列匹配/對準之鹼基進行手工校正。就本發明目的而言無需進行其他手工校正。
具有與本發明查詢胺基酸序列至少(例如)95%「一致」之胺基酸序列的多肽，除去按查詢胺基酸序列的每100個胺基酸計該目標多肽序列可包括至多5處胺基酸改變外，該目標多肽之胺基酸序列與查詢序列一致。換言之，為獲得具有與查詢胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列的多肽，目標序列中至多有5%之胺基酸殘基可經***、刪除或用另一胺基酸取代。此等參考序列之改變可出現在參考胺基酸序列之胺基或羧基末端位置或彼等末端位置之間的任何地方，單獨散佈在參考序列殘基中間或在參考序列中呈一或多個連續基團形式。
作為實際情況，可使用已知電腦程式按慣例確定任一特定多肽與參考多肽是否為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。用於確定查詢序列(本發明序列)與目標序列之間最佳整體匹配(亦稱作整體序列比對)之較佳方法可使用基於Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6：237-245(1990)之演算法的FASTDB電腦程式確定。在序列比對中，查詢序列與目標序列係兩個核苷酸序列或兩個胺基酸序列。該整體序列比對之結果以百分比一致性表示。FASTDB胺基酸比對中所使用的較佳參數係：矩陣=PAM 0，k-元組=2，錯配罰分=1，連接罰分=20，隨機組長=0，截斷值=1，視窗大小=序列長度，空位罰分=5，空位大小罰分=0.05，視窗大小=500或目標胺基酸序列之長度(不論長度)。
若目標序列因N端或C端刪減非內部刪減而短於查詢序列，則須 對結果進行手工校正。此乃因FASTDB程式在計算整體百分比一致性時並未考慮目標序列之N端及C端截短。對於相對於查詢序列在N端及C端截短之目標序列，該百分比一致性係如下校正：計算查詢序列對應於目標序列N端及C端之未與相應目標殘基匹配/對準的殘基數，以查詢序列之全部殘基的百分比表示。藉由FASTDB序列比對結果確定殘基是否匹配/對準。然後自百分比一致性中扣減掉該百分比，由上述FASTDB程式使用指定參數加以計算以得到最終的百分比一致性得分。此最終的百分比一致性得分係用於本發明目的之得分。就手工調整百分比一致性得分之目的而言僅考慮目標序列N端及C端未與查詢序列匹配/對準之殘基。即，僅考慮目標序列中最遠之N端及C端殘基以外之查詢殘基位置。
舉例而言，對90個胺基酸殘基之目標序列與100個殘基之查詢序列加以比較以確定百分比一致性。刪減出現在目標序列N端，因此該FASTDB比對不會顯示N端前10個殘基之匹配/對準。10個不配對殘基表示序列之10%(N端及C端不匹配殘基數/查詢序列總殘基數)，因此在由FASTDB程式計算之百分比一致性得分中扣減10%。若其餘90個殘基完全匹配，則最終百分比一致性會係90%。在另一實例中，將90個殘基之目標序列與100個殘基之查詢序列加以比較。此次，刪減係內部刪減，故在目標序列N端或C端不存在與查詢序列不匹配/對準之殘基。在此情形中，由FASTDB計算之百分比一致性不需手工校正。再次，僅對FASTDB比對中展示之未與查詢序列匹配/對準之目標序列N端及C端以外之殘基位置進行手工校正。就本發明目的而言無需進行其他手工校正。
本文所用與本發明核酸序列「在嚴謹性條件下雜文」之核酸係指可在以下條件下雜交之多核苷酸：於42℃在含有50%甲醯胺、5x SSC(750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5x Denhardt's溶液、10%硫酸葡聚糖及20微克/毫升經變性剪切之鮭精DNA之溶液中過夜培育，隨後在0.1x SSC中於約65℃下洗滌濾紙。
本文所用術語Fc區欲指IgG重鏈之C端區。儘管IgG重鏈Fc區的邊界會稍有變化，但通常將人類IgG重鏈Fc區界定為自Cys226位胺基酸殘基伸展至其羧基端。
本文所用術語免疫球蛋白Fc區之等價區欲包括天然存在之免疫球蛋白Fc區等位變體以及具有可產生取代、添加或刪減但不會實質降低免疫球蛋白調介效應功能(例如抗體依賴性細胞毒性)之能力之改變的變體。舉例而言，可自免疫球蛋白Fc區之N端或C端刪減一或多個胺基酸同時不實質損失生物功能。此等變體可根據業內已知的一般規則加以選擇以對活性產生最小影響。(參見例如，Bowie,J.U.等人，Science 247：1306-10(1990))。在一實施例中，Fc區之等價區亦可構成異源融合蛋白的一部分。在一些實施例中，Fc區等價區亦涵蓋來自另一類免疫球蛋白(例如，IgA、IgE、IgD及IgM)重鏈之相應區。
本文所用術語高爾基體定位結構域係指高爾基體駐留多肽之胺基酸序列，其負責將該多肽錨定在高爾基複合體內部位置中。一般而言，定位結構域含有酵素之胺基末端「尾巴」。
本文所用術語效應功能係指彼等歸因於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)之生物活性。抗體效應功能之實例包括但不限於Fc受體結合親和力、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合體介導之抗原呈遞細胞之抗原攝取、細胞表面受體之下調，等等。
應將本文所用術語改造(engineer、engineered、engineering)、糖改造(glycoengineer、glycoengineered、glycoengineering)及糖基化改造理解為包括對天然存在多肽或重組多肽(例如抗原結合分子(ABM))或其片段之糖基化模式的任何操作。糖基化改造包括細胞糖基化機制 之代謝改造(例如寡糖合成途徑之遺傳操作)，以達成細胞中表現之糖蛋白糖基化的改變。在一實施例中，糖基化改造係糖基轉移酶活性之改變。在一特定實施例中，該改造可引起葡糖胺基轉移酶活性及/或岩藻糖基轉移酶活性發生改變。
本文所用術語宿主細胞涵蓋任一類型之能夠經改造產生本發明多肽及抗原結合分子的細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如，哺乳動物培養細胞，如CHO細胞、BHK細胞、HEK293-EBNA細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、Y0骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞以及植物細胞，僅舉幾個例子，但亦包括轉基因動物、轉基因植物或培養植物或動物組織中所含有之細胞。在一實施例中，該宿主細胞經改造可產生具有改質糖型之抗原結合分子。在一較佳實施例中，該抗原結合分子係抗體、抗體片段或融合蛋白。在某些實施例中，該宿主細胞已經進一步操作可表現水平增加之一或多種具有GnTIII活性之多肽。在其他實施例中，該宿主細胞已經改造使其核心α1,6-岩藻糖基轉移酶活性得到消除、降低或抑制。術語核心α1,6-岩藻糖基轉移酶活性涵蓋核心α1,6-岩藻糖基轉移酶基因之表現以及核心α1,6-岩藻糖基轉移酶酵素與其受質之相互作用二者。
本文所用術語Fc調分之細胞毒性包括抗體依賴性細胞毒性及含有人類Fc區之可溶Fc融合蛋白調介之細胞毒性。其係引起「人類免疫效應細胞」溶解「抗體靶向細胞」之免疫機制，其中： 人類免疫效應細胞系一群在其表面展示Fc受體之白細胞，藉助Fc受體該等白細胞可結合至抗體Fc區或Fc融合蛋白上並實施效應功能。此一群體可包括但不限於外周血單核細胞(PBMC)及/或天然殺傷(NK)細胞。
抗體靶向細胞系抗體或Fc融合蛋白結合之細胞。抗體或Fc融合 蛋白可經由蛋白質Fc區N端部分結合靶標細胞。
本文所用術語增強之Fc調介之細胞毒性經定義為在給定時間內、給定濃度抗體或Fc融合蛋白存在下、於靶標細胞周圍培養基中藉由上述定義之Fc調介之細胞毒性機制溶解之「抗體靶向細胞」數目的增加，及/或給定時間內藉由Fc調介之細胞毒性機制達成給定數目「抗體靶向細胞」溶解所需之靶標細胞周圍培養基中抗體或Fc融合蛋白濃度之降低。Fc調介之細胞毒性之增加係相對於相同抗體或Fc融合蛋白調介之細胞毒性，相同抗體或Fc融合蛋白由相同類型宿主細胞產生，使用熟習此項技術者已知的相同標準方法製備、純化、調配及儲存，但其已無法由經本文所述方法改造可表現糖基轉移酶GnTIII之宿主細胞產生。
具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之抗體意指由業內普通技術者已知的任何適宜方法測定具有增強之ADCC的抗體(如該術語在本文中所定義之)。一種公認之ADCC分析於下文所示實例中闡述。另一公認之活體外ADCC分析如下：1)該分析使用已知可表現由抗體之抗原結合區識別之靶標抗原的靶標細胞；2)該分析使用自隨機選擇之健康供體血液中分離的人類外周血單核細胞(PBMC)作為效應細胞；3)該分析根據以下方案實施；i)PBMC用標準密度離心程序分離並以5x106個細胞/毫升懸浮於RPMI細胞培養基中；ii)靶標細胞藉由標準組織培養方法培養，在成活力高於90%之指數生長期收穫，於RPMI細胞培養基中洗滌，用100微居51Cr標記，用細胞培養基洗滌兩次，並以105個細胞/毫升之密度重懸於細胞培養基中； iii)將100微升上述最終靶標細胞懸浮液轉移至96-孔微量滴定板的各孔中；iv)將抗體在細胞培養基中自4000奈克/毫升連續稀釋至0.04奈克/毫升並將50微升所得抗體溶液加到96-孔微量滴定板中的靶標細胞中，一式三份測試覆蓋上述整個濃度範圍之各種抗體濃度；v)對於最大釋放(MR)對照，在含有經標記靶標細胞之滴定板的3個額外孔中加入50微升2%(V/V)非離子型去垢劑水溶液(Nonidet，Sigma，St.Louis)來代替抗體溶液(上述第iv點)；vi)對於自發釋放(SR)對照，在含有經標記靶標細胞之滴定板的3個額外孔中加入50微升RPMI細胞培養基來代替抗體溶液(上述第iv點)；vii)然後將96-孔微量滴定板在50 x g下離心1分鐘並在4℃下培育1小時；viii)將50微升PBMC懸浮液(上述第i點)加入各孔以產生25：1之效應細胞：靶標細胞比並將各滴定板在培養箱中於5% CO2氣氛下在37℃放置4小時；ix)收集來自各孔之不含細胞的上清液並使用γ計數器定量實驗釋放之放射性(ER)；x)根據公式(ER-MR)/(MR-SR)x100對每一抗體濃度計算特異溶解之百分比，其中ER係對該抗體濃度定量之平均放射性(見上述第ix點)，MR係對MR對照(見上述第v點)定量之平均放射性(見上述第ix點)，且SR係對SR對照(見上述第vi點)定量之平均放射性(見上述第ix點)；4)「增強之ADCC」經定義為上述測試之抗體濃度範圍內觀察到的特異溶解最大百分比之增加，及/或達成上述測試之抗體濃度範圍內觀察到的特異溶解最大百分比一半時所需之抗體濃度的降低。 ADCC之增強係相對於如下ADCC，該ADCC係用上述分析量測，由相同抗體調介，該相同抗體由相同類型宿主細胞產生，使用熟習此項技術者已知的相同標準方法製備、純化、調配及儲存，但已無法由經改造可過表現GnTIII之宿主細胞產生。
具有重鏈及/或輕鏈胺基酸取代之抗原結合分子
在一態樣中，本發明係關於包含改質重鏈及/或輕鏈V區及/或C區之ABM，及此等ABM誘發靶標抗原之細胞傳訊活性及/或調介靶標抗原交聯之能力可因此等改變而得到增強(即，誘發或增加)或減弱(即，抑止或降低)的發現。因此，本發明提供具有經改質重鏈及/或輕鏈V區及/或C區之多肽(包括ABM)、編碼此等多肽之核酸序列(例如載體)、用於產生具有經改質重鏈及/或輕鏈V區及/或C區之多肽的方法以及將其用於各種疾病及病症治療之方法。
已知抗體治療功效中涉及若干機制，包括抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、及生長停滯或凋亡之誘發以及細胞生長、細胞增殖、細胞存活及/或其他細胞事件之阻斷或抑制。舉例而言，激動單株抗體誘發細胞死亡及其他細胞傳訊事件之實例已有報導。Cerisano等人顯示特徵為凋亡樣特徵(包括磷脂醯基-絲胺酸(PS)暴露、形態學改變及/或碘化丙錠(PI)攝取)之非卡斯蛋白酶依賴性細胞死亡之誘發，以及針對跨膜糖蛋白即CD99之激動抗體(例如，抗-CD99 013 Mab及O662 MAb)刺激之尤因氏肉瘤(Ewing's Sarcoma)細胞之同型凝集(Cerisano等人，Oncogene 23：5664-5674(2003))。同樣，Hahn等人報導稱MAPK傳訊途徑受到CD99與抗-CD99單株抗體(例如，DN16及YG32)結合的激活，此引起細胞之同型凝集(Hahn等人，FEBS Letters 470：350-354(2000))。Pettersen等人鑑別出CD99的新功能結構域，其可由抗-CD99單株抗體即Ad20激活，該激活可在經轉化T細胞中誘發凋亡(Pettersen等人，J.Immunol.166：4931-4942 (2001))。針對CD47之單株抗體(例如，B6H12)亦可誘發非卡斯蛋白酶依賴性細胞死亡，此與細胞骨架重組傳訊途徑有關(Mateo等人，Blood 100：2882-2890(2002))。上述每一參考文獻之全文均以引用方式併入本文中。
在其他實例中，某些針對CD20之抗體(例如，利妥昔單抗及托西莫單抗(tositumomab))及針對CD52之抗體(CAMPATH-1H)已顯示可在腫瘤細胞中直接誘發凋亡。參見Ludwig等人，Oncogene 22：9097-9106(2003)。對於利妥昔單抗及若干其他具有微弱或不具有傳訊活性之單株抗體(抗-CD19、CD21、CD22及Her2)，誘發凋亡或生長停滯之能力可藉有將抗體以化學方式轉化成IgG-IgG同型二聚體來得到增強。Ghetie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.94：7509-14(1997)。據推測，該增強係歸因於增強之負傳訊及/或四價抗體同型二聚體過度交聯。Ghetie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.94：7509-14(1997)。交聯及增強之凋亡業已藉助二級抗體或Fc-受體承載輔助細胞達成。參見Jazhirehi及Bonavida，Oncogene 24：2121-43(2005)。上述參考文獻中每一個之全文均以引用方式併入本文中。
不希望受到理論的限制，本發明發明人已確定，抗原結合分子肘鉸鏈區之胺基酸殘基的改質會影響ABM誘發或抑制靶標抗原傳訊活性及/或交聯之能力。肘鉸鏈區之角度控制著V區相對於免疫球蛋白C區之取向，且如此可促進抗體與抗原及效應蛋白間之相互作用。參見Lesk及Chothia，Nature 335：188-90(1988)。Lesk及Chothia鑑別出構成抗體肘鉸鏈區之分子球窩關節的殘基，即，VH區中11、110及112 Kabat位以及CH1區中149及150位，並注意到構成此關節之殘基在各抗體中高度保守。Lesk及Chothia，Nature 335：188-90(1988)(其全文以引用方式併入本文中)。然而，其並未對球窩殘基或其附近之殘基進行改質。Landolfi等人顯示，AF2(即針對人類IFNγ之中和抗體)中 10至13 Kabat位的改質造成該抗體中和活性之明顯損失，但未影響抗體對其靶標抗原之結合。Landolfi等人，J.Immunol.166：1748-54(2001)(其全文以引用方式併入本文中)。然而，Landolfi等人並未顯示對抗體誘發細胞傳訊或調介抗原交聯之能力的影響。
對於多價ABM，改變抗原結合位點取向之能力在抗體與多個抗原結合位點複合時可用來調整結合之抗原單元的接近程度。抗原單元彼此間接近程度利於抗原單元間較強或較弱相互作用(例如，交聯、二聚作用，等等)。舉例而言，若ABM中每一VH/VL-CH1/CL對之肘角度經取向可使抗原結合位點彼此更加接近，則結合之抗原單元(例如，細胞表面受體分子)彼此亦會更加接近或成為更有利於相互作用之構象。此接近程度或構象改變可調介結合之抗原間的相互作用，例如，交聯及寡聚作用。另一方面，使得抗原結合位點距離更遠或具有較為不利之構象的取向會阻礙其相互作用。
VL-CL介面處之胺基酸殘基亦可經改質以影響抗原結合位點取向。舉例而言，將輕鏈可變區框架中Kabat殘基40、80、83、105及106置於VL/CL介面。
任何細胞傳訊機制之活性均會受到本發明ABM的影響(即誘發或抑制)。在本發明一態樣中，所涉及之細胞傳訊機制係彼等藉助細胞表面受體蛋白質(包括離子通道偶聯、G-蛋白偶聯及酵素偶聯之細胞表面受體蛋白質)引發者。一般參見，Chapter 15：Cell Signaing in MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL，Alberts等人編輯，(第3版，1994)(其以引用方式併入本文中)。因此，舉例而言，本發明細胞傳訊活性包括但不限於彼等可導致凋亡、細胞分化、細胞生長、細胞增殖及細胞存活者，以及沿該途徑之任一傳訊步驟。在一實施例中，細胞傳訊活性藉助酵素偶聯受體發生；在一特定實施例中，該酵素偶聯受體係受體酪胺酸激酶。在另一實施例中，細胞傳訊活性係藉助離子通 道偶聯受體。
本發明ABM的經改質之重鏈或輕鏈V區及/或C區因至少一處胺基酸取代而不同於相應未經改質之親本多肽(例如，親本抗原結合分子)各區。「親本」、「起始」或「未經改質」之多肽較佳包含抗體重鏈或輕鏈的至少一部分，且可使用業內可用於產生含有重鏈V區或CH1區或其一部分及/或輕鏈V或C區或其一部分之多肽之技術製備。在具體實施例中，親本多肽係抗原結合分子且包含VH或VL區的至少一部分。在某些實施例中，可產生經改質之重鏈及/或輕鏈V區(例如根據本文所揭示之方法)且可將其融合至所選異源多肽(例如抗體Fc)上。在本發明一實施例中，改質ABM或其片段包括融合蛋白，其中經改質之重鏈V區或其片段係融合至選自由IgA、IgG、IgE、IgD及IgM或其片段或衍生物組成之群的重鏈恆定區上。在一特定實施例中，該重鏈恆定區係IgG。在本發明另一實施例中，改質ABM或其片段包含一融合蛋白，其中經改質之輕鏈V區或其片段係融合至選自由IgA、IgG、IgE、IgD及IgM或其片段或衍生物組成之群的輕鏈恆定區上。在一特定實施例中，該輕鏈恆定區係IgG。在具體實施例中，本發明多肽包括含有具有經改質之重鏈及/或輕鏈V區之輕鏈及重鏈的全抗體(例如，IgG)。
編碼包含經改質之重鏈V區或CH1區或輕鏈V區或CL區之多肽的多核苷酸可藉由業內已知方法利用本說明書有關特定序列之指導製備。此等方法包括但不限於藉由較早製備之編碼該多肽之核酸的定點(或寡核苷酸調介之)誘變、PCR誘變及盒式誘變進行製備。定點誘變係一用於製備取代變體之較佳方法。此技術為業內熟知(參見例如，Carter等人，Nucleic Acias Res.13：4431-4443(1985)及Kunkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488(1987)，二者以引用方式併入本文中)。簡言之，在實施DNA定點誘變時，首先使編碼期望突變之寡核 苷酸與該起始DNA單鏈雜交，藉此改變起始DNA。雜交後，使用DNA聚合酶以經雜交之寡核苷酸作為引物並以單鏈起始DNA作為模板合成整個第二鏈。從而將編碼期望突變之寡核苷酸摻入至所得雙鏈DNA中。
PCR誘變亦適用於產生未經改質之起始多肽的胺基酸序列變體(參見例如，Vallette等人，Nuc.Acids Res.17：723-733(1989)，以引用方式併入本文中)。簡言之，當PCR中使用少量模板DNA作為起始材料時，在序列上與模板DNA中相應區稍有不同之引物可用於產生相對較大量的僅在引物不同於模板之位置區別於模板序列之特異DNA片段。
另一用於製備ABM變體之方法，即盒式誘變，係基於Wells等人(Gene 34：315-323(1985)，以引用方式併入本文中)所述之技術。起始材料係包含待改質之起始多肽DNA的質粒(或其他載體)。待突變之起始DNA之密碼子需加以鑑別。經鑑別之突變位點的每一側須具有唯一的限制性內切酶位點。若不存在此種限制酶切位點，則其可利用上述寡核苷酸調介之誘變方法產生以將其引入起始多肽DNA中的適宜位置。在此等位點切割質粒DNA以使其線性化。編碼介於限制酶切位點之間但含有期望突變之DNA序列的雙鏈寡核苷酸可使用標準程序合成，其中寡核苷酸的兩條鏈分開合成且隨後使用標準技術使其雜交在一起。此雙鏈寡核苷酸稱作序列盒。此序列盒經設計具有與線性化質粒末端相配伍之5'及3'端，使其可直接與質粒連接。此質粒現在已含有突變之DNA序列。
另一選擇或另外，可確定編碼多肽變體之期望胺基酸序列，且可合成產生編碼此一胺基酸序列變體之核酸序列。
親本多肽之胺基酸序列可經改質以產生具有經改質之重鏈V區及/或經改質之CH1區及/或經改質之輕鏈V區及/或經改質之CL區的 ABM，其中在該改質ABM與靶標抗原複合(例如，與之結合)時誘發靶標抗原之細胞傳訊活性之能力發生改變。細胞傳訊活性可為激動劑活性或拮抗劑活性。根據本發明一態樣，激動劑活性可在經改質之抗原結合分子與細胞膜結合受體結合時由之誘發並起始細胞傳訊途徑。在一具體實施例中，細胞傳訊途徑係凋亡途徑。在另一實施例中，細胞傳訊途徑係細胞分化途徑。根據本發明另一態樣，經改質之抗原結合分子的拮抗劑活性可在(例如)ABM結合細胞膜結合受體並阻礙細胞傳訊途徑之誘發或破壞正在進行之傳訊時出現。拮抗劑活性可藉由(例如)阻斷內源配體結合及後續訊號轉導及/或阻礙為細胞傳訊途徑所必需之受體或其他分子之交聯或寡聚作用來達成。在一實施例中，經抑制或破壞之細胞傳訊途徑係細胞生長途徑。在另一實施例中，經抑制或破壞之細胞傳訊途徑係細胞***途徑。在另一實施例中，經抑制或破壞之細胞傳訊途徑係細胞存活途徑。
同樣，親本多肽之胺基酸序列亦可經改質以產生具有經改質之重鏈V區或經改質之C區(例如，經改質之CH1區)及/或經改質之輕鏈V區及/或經改質之CL區的ABM，其中調介一或多種靶標抗原交聯之能力在該改質ABM與靶標抗原複合(例如，與之結合)時發生改變。在一實施例中，使該結合之靶標抗原(例如，細胞表面受體分子)較與相應未經改質之親本ABM結合時彼此更為接近及/或處於對相互作用而言更為有利之構象中，從而增強結合之抗原間的交聯及寡聚作用。在另一實施例中，使結合之靶標抗原(例如，細胞表面受體分子)較與相應未經改質之親本ABM結合時彼此距離更遠及/或處於對相互作用而言較為不利之構象中，從而減弱或阻礙結合之抗原間的交聯及寡聚作用。在一特定實施例中，該增強之交聯或寡聚作用導致凋亡增強。在另一實施例中，該增強之交聯或寡聚作用導致細胞分化增強。在另一實施例中，交聯或寡聚作用之減弱導致細胞生長減弱、細胞***減弱 或細胞存活減弱。
重鏈V區或CH1區或輕鏈V區或CL區生物學性質中的大量改質可藉由選擇在保持下列特徵之作用方面顯著不同之取代達成：(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如，呈折疊或螺旋構象；(b)靶位點處分子之電荷或疏水性，或(c)側鏈之大小。可根據常見側鏈性質將天然存在之殘基分為以下各類：(1)疏水性殘基：met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水殘基：cys、ser、thr；(3)酸性殘基：asp、glu；(4)鹼性殘基：asn、gln、his、lys、arg；(5)影響鏈取向之殘基：gly，pro；及(6)芳香族殘基：trp、tyr、phe。
非保守性取代會需要將此等種類之一的成員調換成另一種類之成員。保守取代會需要將此等種類之一的成員調換成相同種類的另一成員。
包含改質ABM之例示性多肽
在一態樣中，本發明係關於其中胺基酸改質可改變ABM誘發細胞傳訊活性及/或調介抗原交聯之能力的抗原結合分子。在一實施例中，對ABM之改質包括重鏈或輕鏈可變區的至少一個框架區中相對於親本分子的至少一處胺基酸殘基取代。在一特定實施例中，該取代替換重鏈FR1中胺基酸殘基。在一較佳實施例中，對ABM之改質包括重鏈可變區8、9、10、11、12或13 Kabat位中一或多處之胺基酸殘基取代。在另一實施例中，對ABM之改質包括重鏈FR4中胺基酸殘基取代。在一特定實施例中，對ABM之改質包括重鏈可變區Kabat位110或112中一或多處之胺基酸殘基取代。在另一實施例中，對ABM之改質包括至少一處位於V區與C區間介面處之輕鏈胺基酸殘基取代。在一 更為特定之實施例中，對ABM之改質包括40、80、83、105或106 Kabat位中一或多處之胺基酸殘基取代。
在一實施例中，可藉由在親本序列中產生可導致期望之胺基酸殘基改變之點突變來使胺基酸得到取代。另一選擇，對ABM之改質可包括用在特定位置包含期望之胺基酸殘基的框架區替換親本分子的整個框架區。在一特定實施例中，對ABM之改質包括用由種系可變基因序列編碼之FR1替換親本分子FR1。
在本發明另一實施例中，該ABM包含至少一個CH1區且相比於親本多肽，ABM之改質包括至少一處胺基酸殘基取代。在一特定實施例中，對ABM之改質包括重鏈恆定區148、149及/或150位胺基酸殘基中一或多個之取代。
在另一態樣中，本發明係關於經改質之包含一或多個截短之親本抗原結合分子CDR的抗原結合分子。此等截短之CDR最低程度會含有用於給定CDR之特異性決定之胺基酸殘基。「特異性決定殘基」意指彼等直接參與同抗原之相互作用的殘基。一般而言，在給定CDR中僅有約1/5至1/3的殘基參與結合抗原。特定CDR中特異性決定殘基可藉由(例如)根據Padlan等人(FASEB J.9(1)：133-139(1995)該文獻之全文內容以引用方式併入本文中)所述方法由三維模型構建計算原子間接觸並確定給定殘基位置處序列可變性來鑑別。
因此，本發明亦係關於一種含有至少一個親本分子互補決定區或其至少含有該互補決定區之特異性決定殘基之變體或截短形式的經分離多核苷酸，其中該經分離多核苷酸編碼融合多肽。較佳地，此等經分離多核苷酸編碼係改質抗原結合分子之融合多肽。在一實施例中，該多核苷酸含有親本分子的三個互補決定區或其至少含有該三個互補決定區中每一個之特異性決定殘基的變體或截短形式。在另一實施例中，該多核苷酸編碼嵌合(例如，人類化)抗體輕鏈或重鏈的整個 可變區。本發明進一步係關於由此等多核苷酸編碼之多肽。
在另一實施例中，本發明係關於一種改質抗原結合分子，其含有親本分子的至少一個互補決定區或其至少含有該互補決定區之特異性決定殘基之變體或截短形式，並含有源自異源多肽之序列。在一實施例中，該改質抗原結合分子含有親本分子的三個互補決定區或其至少含有該三個互補決定區中每一個之特異性決定殘基之變體或截短形式。在另一態樣中，該改質抗原結合分子含有抗體輕鏈或重鏈之可變區。在一特別有用之實施例中，該抗原結合分子係一嵌合(例如，人類化)抗體。本發明亦係關於製備此等改質抗原結合分子之方法，及其在疾病治療(包括細胞增殖病症)方面之用途。
已知抗體治療功效涉及若干機制，包括抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、以及生長停滯、細胞分化或凋亡之誘發。
本發明係關於改質ABM，其與相應未經改質之親本ABM相比具有增強之誘發凋亡的能力。舉例而言，稍有或沒有誘發凋亡能力之親本ABM可根據本發明改質以產生確實具有誘發凋亡之能力或具有增強之誘發凋亡之能力的改質ABM。本發明亦係關於與相應未經改質之親本ABM相比具有增強的誘發生長停滯或細胞分化之能力的改質ABM。舉例而言，稍有或沒有誘發生長停滯或細胞分化之能力的親本ABM可根據本發明改質以產生確實具有誘發生長停滯或分化之能力或具有增強的誘發生長停滯或分化之能力的改質ABM。
舉例而言，尤其係對於抗-CD20抗體，大部分實驗證據表明，利妥昔單抗係藉由CDC及ADCC分析所量測之習知效應機制起作用。類似地，已顯示活體內不同淋巴瘤細胞對利妥昔單抗之抗性隨其在活體外對CDC之敏感性而變化。相反，已經批准可用於治療用途之另一抗-CD20抗體(B1)的活體內作用方式既不需要補體活性亦不需要天然殺 傷(NK)細胞活性。相反，B1活體內功效係歸因於其誘發有效凋亡之能力。一般而言，根據其消滅淋巴瘤細胞之機制可將抗-CD20單株抗體分為兩個不同類別。I型抗-CD20抗體主要利用補體殺傷靶標細胞，而II型抗體以不同機制(主要為凋亡)發揮作用。利妥昔單抗及1F5係I型抗-CD20抗體之實例，而B1係II型抗體之實例。參見例如，Cragg,M.S.及Glennie,M.J.，Blood 103(7)：2738-2743(2004年4月)；Teeling,J.L.等人，Blood 104(6)：1793-1800(2004年9月)，二者之全文內容以引用方式併入本文中。
頒予Umaña等人之美國專利申請公開案第2005/0123546號(其全文以引用方式併入本文中)揭示首個已知實例，其中I型抗-CD20抗體經改造具有增強之效應功能(例如ADCC)且可產生有效凋亡能力，從而有效地將I型抗-CD20抗體變為II型抗-CD20抗體。在一實施例中，本發明係關於與I型親本抗-CD20抗體相比在重鏈或輕鏈含有可變區取代之經改質抗-CD20抗體，其中該(等)取代使經改質抗-CD20抗體誘發凋亡之能力增強。在另一實施例中，本發明係關於經改造之II型抗-CD20抗體，作為旨在增強效應功能且不喪失誘發凋亡之重要能力之改造的結果，其具有增強之ADCC。在一實施例中，II型抗-CD20抗體與親本分子相比在重鏈或輕鏈可變區含有一或多個胺基酸之取代。在另一實施例中，I型及/或II型抗-CD20抗體已經改造從而在Fc區具有經改變之糖基化模式。在一特定實施例中，糖基化改變之改質ABM在Fc區包含水平增加之二等分複合體殘基。在另一特定實施例中，糖基化改變之改質ABM在Fc區包含水平降低之岩藻糖殘基。參見頒予Shitara等人之美國專利申請公開案第2004 0093621號，其全文內容以引用方式併入本文中。在另一實施例中，I型或II型抗-CD20抗體已經歷多肽改造，如頒予Presta之美國專利第6,737,056號或美國專利申請公開案第2004 0185045號(Macrogenics)或美國專利申請公開案第2004 0132101號(Xencor)中所教示，上述每一專利案之全文內容均以引用方式併入本文中。本發明進一步係關於製備此等經改造之I型或II型抗體之方法及在各種B細胞病症(包括B細胞淋巴瘤)治療中使用此等抗體之方法。
嵌合及人類化改質ABM
嵌合小鼠/人類抗體已有所闡述。參見例如，Morrison,S.L.等人，PNAS I1：6851-6854(1984年11月)；歐洲專利公開案第173494號；Boulianna,G.L等人，Nature 312：642(1984年12月)；Neubeiger,M.S.等人，Nature 314：268(1985年3月)；歐洲專利公開案第125023號；Tan等人，J.Immunol.135：8564(1985年11月)；Sun,L.K等人，Hybridoma 5(1)：517(1986)；Sahagan等人，J.Immunol.137：1066-1074(1986)。一般參見，Muron，Nature 312：597(1984年12月)；Dickson，Genetic Engineering News 5(3)(1985年3月)；Marx，Science 229：455(1985年8月)；以及Morrison，Science 229：1202-1207(1985年9月)。Robinson等人在PCT公開案第WO/88104936號中闡述一具有人類恆定區及鼠類可變區之嵌合抗體，其對CD20抗原決定部位具有特異性；Robinson參考文獻中該嵌合抗體之鼠類部分係源自2H7小鼠單株抗體(γ2b，κ)。儘管該參考文獻指出所述嵌合抗體係治療B細胞病症之「主要候選者」，但僅可將此陳述視作提供給業內技術者的建議以確定此建議對於此特定抗體是否正確，原因尤其在於該參考文獻缺乏任何支持治療效力主張之資料，且重要的是缺乏使用高等哺乳動物(例如靈長類或人類)獲得之資料。
用於形成嵌合抗體之方法可供業內技術者使用。舉例而言，輕鏈及重鏈可利用(例如)存於分開之質粒或單個(例如，多順反子性)載體中的免疫球蛋白輕鏈及免疫球蛋白重鏈來分開表現。隨後可將此等純化並在活體外組裝成完整抗體；用於達成此等組裝之方法已有所闡 述。參見例如，Scharff,M.，Harvey Lectures 69：125(1974)。用於自簡化之經分離輕鏈及重鏈形成IgG抗體的活體外反應參數亦已有所闡述。參見例如，Sears等人，Biochem.16(9)：2016-25(1977)。
在一尤佳實施例中，本發明嵌合ABM係人類化抗體。用於人類化非人類抗體之方法為業內已知。舉例而言，本發明人類化ABM可根據如下專利案之方法製備：頒予Winter之美國專利第5,225,539號、頒予Queen等人之美國專利第6,180,370號或頒予Adair等人之美國專利第6,632,927號、頒予Foote之美國專利申請公開案第2003/0039649號；頒予Sato等人之美國專利申請公開案第2004/0044187號；或頒予Leung等人之美國專利申請公開案第2005/0033028號，其每一個之全文內容均以引用方式併入本文中。較佳地，在人類化抗體中引入一或多個來自非人類來源之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱作「引入」殘基，其通常取自「引入」可變結構域。人類化基本按照Winter及同事之方法藉由用超變區序列替代人類抗體相應序列來實施(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))。故此等「人類化」抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上少於一個完整人類可變結構域的部分已由來自非人類物種之相應序列所取代。實際上，人類化抗體通常為人類抗體，其中某些超變區殘基且可能係某些FR殘基由來自齧齒類動物抗體中類似位點之殘基所取代。本發明人類化抗-CD20抗體會包含人類免疫球蛋白之恆定區。
欲用於製備人類化抗體之人類可變結構域的選擇(包括輕鏈及重鏈二者)對於降低抗原性非常重要。根據所謂「最佳擬合」方法，針對已知人類可變結構域序列之完整文庫篩選齧齒類動物抗體可變結構域之序列。因而將與齧齒類動物序列最接近之人類序列視為人類化抗 體之人類框架區(FR)(Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901(1987))。選擇人類框架序列之另一方法係：將完整齧齒類框架每一單獨亞區(即，FR1、FR2、FR3及FR4)之序列或各個亞區之某種組合(例如，FR1與FR2)與對應於該框架亞區之已知人類可變區序列(例如，由Kabat編號確定者)文庫加以比較，並針對與齧齒類者最接近之每一亞區或組合選擇人類序列(2003年2月27日公開之Leung美國專利申請公開案第2003/0040606A1號)。另一方法使用源自特定輕鏈或重鏈亞群之所有人類抗體的一致序列之特定框架區。同一框架可用於若干不同之人類化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993))，每一參考文獻之全文內容均以引用方式併入本文中。
更為重要的是，經人類化之抗體需保留對抗原之高親和力及其他有利的生物學性質。為達成此目標，根據較佳方法人類化抗體可藉由使用親本與人類化序列之三維模型來分析親本序列及各種概念性人類化產物之方法製備。三維免疫球蛋白模型可使用熟習此項技術者所熟知的電腦程式產生(例如InsightII，Accelrys公司(前身MSI)，或在如Schwede等人，Nucleic Acids Res.2003(13)：3381-3385所述之 http：//swissmodel.expasy.org/ )。通過觀察此等模型可分析此等殘基在侯選免疫球蛋白序列功能行使中可能起到之作用，即分析可影響侯選免疫球蛋白與其抗原相結合之能力的殘基。以此方式，可從接受者及引入序列中選擇FR殘基併合並以達成期望抗體特徵，例如保持對靶抗原之親和力。一般而言，超變區殘基直接且最為實質性地參與影響抗原結合。
在另一實施例中，根據(例如)揭示於頒予Balint等人之美國專利申請公開案第2004/0132066號之方法(該專利案之全文內容以引用方 式併入本文中)，本發明抗原結合分子經改造後具有增強之結合親和力。
在一較佳實施例中，本發明係關含有編碼具有下文表3及/或5中所示胺基酸序列之多肽之序列的經分離多核苷酸。本發明進一步係關於含有與下文表2及/或4中所示核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的經分離之核酸。在另一實施例中，本發明係關於含有編碼具有與下文表3及/或5中胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列之多肽之序列的經分離核酸。本發明亦涵蓋含有編碼具有表3及/或5中任一構造之胺基酸序列(具有保守胺基酸取代)之多肽之序列的經分離核酸。在某些實施例中，表2至5之多核苷酸或多肽中的任一個均可排除在外。因此，舉例而言，在某些實施例中，改質ABM及/或編碼改質ABM之多核苷酸並不包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38中任一個或所有。在另一實例中，在某些實施例中，本發明改質ABM並不包括SEQ ID NO：55至62中任一個或所有。
在另一實施例中，本發明係關於包含如下文表3及/或5中所示胺基酸序列之經分離多肽。本發明進一步係關於包含由下文表2及/或4所示核苷酸序列編碼之序列之經分離多肽。在另一實施例中，本發明係關於包含與下文表3及/或5中胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的經分離多肽。本發明亦涵蓋包含表3及/或5中任一構造之胺基酸序列之經分離多肽(具有保守胺基酸取代)。在某些實施例中，表2至5之多核苷酸或多肽的任一個均可排除在外。因此，舉例而言，在某些實施例中，多肽並不包含對應於或由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38中任一個或所有編碼之胺基酸 序列。在另一實例中，在某些實施例中，本發明改質ABM並不包括SEQ ID NO：55至62中任一個或所有。
Figure TWI615407BD00002
Figure TWI615407BD00003
Figure TWI615407BD00004
Figure TWI615407BD00005
Figure TWI615407BD00006
Figure TWI615407BD00007
Figure TWI615407BD00008
Figure TWI615407BD00009
Figure TWI615407BD00010
Figure TWI615407BD00011
Figure TWI615407BD00012
在另一特定實施例中，本發明係關於包含編碼具有源自圖1及表6中所示親本序列之胺基酸序列且在至少一個重鏈FR區含有至少一處胺基酸取代之多肽之序列的經分離多核苷酸。在另一實施例中，本發 明係關於包含源自圖1及表6中所示親本序列之胺基酸序列且在至少一個重鏈FR區含有至少一處胺基酸取代之經分離多肽。
Figure TWI615407BD00013
在一態樣中，與親本ABM相比本發明改質ABM可包含整個框架區之取代。因此，舉例而言，本發明進一步係關於包含編碼具有至少一個源自人類種系VH序列之重鏈FR之多肽之序列的經分離多核苷酸。在一較佳實施例中，FR1區或8至13 Kabat位之人類VH種系序列係源自下文表7中指出之序列中的任一個。此等序列可獲得自IMGT資料庫(http：//imgt.cines.fr：8104/textes/IMGTrepertoire)，且以其登錄號識別之每一序列整體均明確以引用方式併入本文中。
Figure TWI615407BD00014
在另一實施例中，本發明係關於包含編碼一如下多肽之序列的 經分離多核苷酸，該多肽在重鏈可變區8至13 Kabat位或其任一子集(例如，9至12位、10至12位，等等)中包含如下文表8中所示序列中任一個之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明係關於經分離之多肽，該多肽在8至13 Kabat位或其任一子集(例如，9至12位、10至12位，等等)中包含如下文表8中所示序列中任一個之胺基酸序列。
Figure TWI615407BD00015
在另一實施例中，本發明係關於包含編碼如下多肽之序列的經分離多核苷酸，該多肽在重鏈可變區108至113 Kabat位或其任一子集 (例如，110至112位、110及112位，等等。)中含有一胺基酸序列。在一特定實施例中，108至113位之序列係如下文表9中所示。在另一實施例中，本發明係關於經分離之多肽，該多肽在108至113 Kabat位或其任一子集(例如，110至112位、110及112位，等等)中包含如下文表9中所示序列中任一個之胺基酸序列。
Figure TWI615407BD00016
在另一實施例中，本發明係關於包含一或多個本發明經分離多核苷酸之表現載體及/或宿主細胞。
一般而言，任一型之經培養細胞系均可用來表現本發明ABM。在一較佳實施例中，CHO細胞、HEK293-EBNA細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER 細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、或植物細胞均可用作背景細胞系以產生本發明經改造之宿主細胞。
進一步包含Fc區及Fc區變體之改質ABM
在一實施例中，在重鏈V區及/或CH1區及/或輕鏈V區及/或C區含有一或多處胺基酸取代之本發明ABM可進一步包含人類Fc區。在一具體實施例中，該人類恆定區係如SEQ ID NO：80及81中所示之IgG1，且如下所示：
IgG1核苷酸序列(SEQ ID NO：80)
Figure TWI615407BD00017
Figure TWI615407BD00018
IgG1胺基酸序列(SEQ ID NO：81)
Figure TWI615407BD00019
然而，人類Fc區之變體及同種型亦涵蓋於本發明中。舉例而言，適用於本發明之變體Fc區可根據教示於如下專利案中之方法製備：頒予Presta之美國專利第6,737,056號(因一或多處胺基酸改質而具有經改變之效應功能的Fc區變體)；或美國專利申請案第60/439,498號；第60/456,041號；第60/514,549號；或WO 2004/063351(因胺基酸改質而具有增強之結合親和力的變體Fc區)；或美國專利申請案第10/672,280號或WO 2004/099249(因胺基酸改質而具有經改變之對FcγR之結合的Fc變體)，每一專利案之全文內容均以引用方式併入本文中。
在本發明另一態樣中，在重鏈V區及/或CH1區及/或輕鏈V區及/ 或C區含有一或多處胺基酸取代之ABM可進一步包含Fc區變體。人們可對Fc區加以改造以產生具有經改變之對一或多種FcR之結合親和力的變體。舉例而言人們可如美國臨時專利公開案第60/678,776號(其全文以引用方式併入本文中)所述改質Fc區的一或多個胺基酸殘基以改變(例如增強或減弱)對FcR之結合。一般而言，人們可在經鑑別會影響FcR結合之Fc區的一或多個殘基處進行胺基酸取代以產生此一Fc區變體。在較佳實施例中，僅有1至約10個Fc區殘基可經刪減或取代。本文中包含一或多處胺基酸改質(例如取代)之Fc區較佳會保留至少約80%、且較佳至少約90%、且最佳至少約95%之親本Fc區序列或天然序列人類Fc區。
人們亦可製備胺基酸***改質之Fc區，其變體具有經改變之效應功能。舉例而言，人們可在經鑑別會影響FcR結合之一或多個Fc區位置的附近引入至少一個胺基酸殘基(例如1至2個胺基酸殘基且一般不超過10殘基)。附近意指在本文鑑別之Fc區殘基的1至2個胺基酸殘基以內。此等Fc區變體可展示增強之或減弱之FcR結合及/或效應功能。為產生此等***變體，人們可評估包含FcR結合區(例如感興趣FcR之胞外結構域)及其中***胺基酸殘基之Fc區之多肽的共結晶結構(參見例如，Sondermann等人，Nature 406：267(2000)；Deisenhofer，Biochemistry 20(9)：2361-2370(1981)；及Burmeister等人，Nature 3442：379-383,(1994)，上述所有均以引用方式併入本文中)以合理設計展現(例如)經改良FcR結合能力之改質Fc區。
藉由在親本Fc區中引入適宜胺基酸序列改質，人們可產生(a)在人類效應細胞存在下更有效或更低效地調介一或多種效應功能及/或(b)以較親本多肽為佳之親和力結合Fcγ受體(FcγR)或Fc新生兒受體(FcRn)之變體Fc區。此等改質Fc區在Fc區中一般會包含至少一處胺基酸改質。
在較佳實施例中，親本多肽Fc區係一人類Fc區，例如在任何物種Fc區中已知或發現之天然人類Fc區人類IgG1(A及非A同種異型)、IgG2、IgG3、IgG4及所有同種異型。此等區具有如彼等揭示於美國臨時專利申請案第60/678,776號(其全文以引用方式併入本文中)之序列。
在某些實施例中，為產生在重鏈V區及/或CH1區及/或輕鏈V區及/或C區包含一或多處胺基酸取代且進一步包含具有改良之效應功能(例如，ADCC)之改質Fc區的ABM，則親本多肽較佳具有預先存在之ADCC活性(例如，該親本多肽包含人類IgG1或人類IgG3之Fc區)。在一些實施例中，具有改良之ADCC的改質Fc區可較具有天然序列IgG1或IgG3 Fc區之抗體實質更有效地調介ADCC。
在特定實施例中，將胺基酸改質引入親本Fc區之CH2結構域。
本發明具有改質Fc區之多肽可經受一或多種進一步改質，取決於多肽之期望或預期用途。此等改質可涉及(例如)胺基酸序列的進一步改變(胺基酸殘基之取代、***及/或刪減)、與異源多肽之融合及/或共價改質。此等進一步改質可在上文揭示之可導致Fc受體結合及/或效應功能改變之胺基酸改質之前、同時或之後進行。
另一選擇或另外，有用的是將胺基酸改質與一或多種可改變Fc區Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性功能之進一步胺基酸改質組合。本文中在此方面特別受關注之起始多肽係可結合Clq並展示補體依賴性細胞毒性(CDC)之多肽。本文所述胺基酸取代可用來改變起始多肽結合Clq之能力及/或改質其補體依賴性細胞毒性功能(例如，減弱且較佳消除此等效應功能)。然而，在一或多處所述位置包含取代且具有改良之Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)功能之多肽亦涵蓋於本文中。舉例而言，起始多肽可能無法結合Clq及/或調介CDC但可根據本文教示改質以使其獲得此等進一步之效應功能。此外，具有預先 存在之Clq結合活性且視情況進一步具有調介CDC之能力之多肽可經改質以使此等活性中的一種或兩種得到增強。改變Clq及/或改質其補體依賴性細胞毒性功能之胺基酸改質闡述於(例如)WO 00/42072中，其以引用方式併入本文中。
如上文所揭示，人們可藉由(例如)改質Clq結合及/或FcR結合且從而改變CDC活性及/或ADCC活性來設計具有經改變效應功能之Fc區或其一部分。舉例而言，人們可產生具有改良之Clq結合及改良之FcγRIII結合(例如，具有改良之ADCC活性及改良之CDC活性二者)之改質Fc區。另一選擇，在人們期望效應功能得到減弱或消除時，人們可構建CDC活性減弱及/或ADCC活性減弱之改質Fc區。在其他實施例中，人們可僅增強此等活性之一，且視情況亦可減弱其他活性，例如，產生ADCC活性提高但CDC活性減弱之改質Fc區且反之亦然。
另一類型之胺基酸取代可用來改變多肽之糖基化模式。舉例而言，此可如下達成：刪減一或多個存在於多肽中之碳水化合物部分，及/或增加一或多個在抗體中原本不存在於之多肽中之糖基化位點。多肽糖基化通常係經N-連接或O-連接。N-連接意指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈的連接。肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸以外之任何胺基酸)係碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈進行酶促連接之識別序列。故，多肽中存在該等肽序列的任一個均可產生潛在性糖基化位點。O-連接之糖基化係指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一與羥基胺基酸(最常見為絲胺酸或蘇胺酸)的連接，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
在一些實施例中，本發明提供包含具有如下Fc區之改質親本多肽之組合物，其中該改質Fc區包含至少一處表面殘基胺基酸改質(參見例如，Deisenhofer，Biochemistry，28；20(9)：2361-70，1981年4月及WO 00/42072，二者以引用方式併入本文中)。在其他實施例中，本發 明提供包含具有如下Fc區之改質親本多肽之組合物，其中該改質Fc區包含至少一處非表面殘基胺基酸改質。在另一些實施例中，本發明包含具有Fc區之親本多肽變體，其中該變體包含至少一處表面胺基酸改質及至少一處非表面胺基酸改質。
可藉由在已接受糖改造以致至少一種糖蛋白改質之糖基轉移酶之表現發生改變之宿主細胞中製備改質ABM以進一步增強本發明改質ABM之治療功效。在一實施例中，糖改造之宿主細胞可進一步表現下列中的一或多種：編碼具有GnTIII活性之多肽的多核苷酸、編碼具有ManII活性之多肽之多核苷酸、或編碼具有GalT活性之多肽之多核苷酸。在一較佳實施例中，宿主細胞表現編碼具有GnTIII活性或ManII活性之多肽之多核苷酸。在另一較佳實施例中，宿主細胞表現編碼具有GnTIII活性之多肽之多核苷酸以及編碼具有ManII活性之多肽之多核苷酸。在又一較佳實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域之融合多肽。在另一較佳實施例中，本發明改質ABM在可表現編碼具有GnTIII活性之多肽之多核苷酸之宿主細胞中的表現可產生Fc受體結合親和力增強且效應功能增強之改質ABM。因此，在一實施例中，本發明係關於含有如下各物之宿主細胞：(a)包含編碼具有GnTIII活性之多肽之序列的經分離核酸；及(b)編碼本發明ABM(例如，可結合人類CD20之嵌合、靈長類化或人類化抗體)之經分離多核苷酸。在一較佳實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含GnTIII之催化結構域的融合多肽且該高爾基體定位結構域係甘露糖苷酶II之定位結構域。用於產生此等融合多肽及使用其產生效應功能增強之抗體的方法揭示於美國臨時專利公開案第60/495,142號及美國專利申請公開案第2004/0241817號中，每一專利案之全文內容均明確以引用方式併入本文中。在另一較佳實施例中，嵌合ABM係具有鼠類B-Ly1抗體結合特異性之嵌合抗體或其片 段。在一尤佳實施例中，該嵌合抗體包含人類Fc。在另一較佳實施例中，該抗體係靈長類化或人類化抗體。
在一實施例中，一或若干個編碼本發明ABM之多核苷酸可在組成型啟動子控制下表現，或另一選擇為在經調節表現系統中表現。適宜的經調節表現系統包括但不限於四環素調節之表現系統、蛻化素誘導型表現系統、lac-switch表現系統、糖皮質激素誘導型表現系統、溫度誘導型啟動子系統及金屬硫蛋白金屬誘導型表現系統。若將若干不同的編碼本發明ABM之核酸納入宿主細胞系統中，則其中的一些可在組成型啟動子控制下表現，而另一些在經調節之啟動子控制下表現。將最大表現水平視作不會對細胞生長率產生顯著不良影響之穩定多肽表現的可能最高之水平，且可使用常規實驗測定。表現水平可由業內一般習知之方法測定，包括使用ABM特異性抗體或與ABM融合之肽標籤的特異性抗體進行之西方點漬分析；以及北方點漬分析。在另一選擇中，多核苷酸可以可操作方式連接到報告基因上；具有與親本抗體大體相同之結合特異性之改質ABM的表現水平可藉由量測與報告基因表現水平相關之訊號測定。報告基因與編碼該融合多肽之核酸可以單個mRNA分子形式一起轉錄；其各自編碼序列可由內核糖體進入位點(IRES)或不依賴cap之轉譯增強子(CITE)連接。報告基因可與至少一個編碼具有與親本抗體大體相同之結合特異性之改質ABM的核酸一起轉譯，以形成單條多肽鏈。編碼本發明AMB之核酸可在單個啟動子控制下以可操作方式連接到報告基因上，使得編碼融合多肽之核酸與報告基因轉錄成或可剪接成兩個分開之信使RNA(mRNA)分子之RNA分子；所得mRNA之一轉譯成該報告蛋白，而另一個轉譯成該融合多肽。
改質ABM之表現
為熟習此項技術者所熟知之方法可用於構建含有具有與親本抗 體大體相同之結合特異性之改質ABM編碼序列以及適宜之轉錄/轉譯控制訊號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/遺傳重組。參見例如，該等技術闡述於Maniatis等人，MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associate及Wiley Interscience，N.Y(1989)。
可使用多種宿主表現載體系統來表現本發明ABM之編碼序列。較佳地，使用哺乳動物細胞作為用含有感興趣蛋白質編碼序列及融合多肽編碼序列之重組質粒DNA或黏粒DNA表現載體轉染之宿主細胞系統。最佳地，CHO細胞、HEK293-EBNA細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、或植物細胞均可用作宿主細胞系統。表現系統及選擇方法之某些實例闡述於下列參考文獻及其中之參考文獻中：Borth等人，Biotechnol.Bioen.71(4)：266-73(2000-2001)；Werner等人，Arzneimittelforschung/Drug Res.48(8)：870-80(1998)；Andersen及Krummen，Curr.Op.Biotechnol.13：117-123(2002)；Chadd及Chamow，Curr.Op.Biotechnol.12：188-194(2001)；以及Giddings，Curr.Op.Biotechnol.12：450-454(2001)。在替代實施例中，可涵蓋其他真核宿主細胞系統，包括用含有本發明ABM編碼序列之重組酵母表現載體轉化之酵母細胞，例如美國專利申請案第60/344,169號及WO 03/056914中教示之表現系統(用於在非人類真核宿主細胞中產生人類樣糖蛋白之方法)(每一專利案之全文內容均以引用方式併入本文中)；用含有具有與親本抗體大體相同之結合特異性之改質ABM編碼序列之重組病毒表現載體(例如，杆狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；用 含有本發明ABM編碼序列之重組病毒表現載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染或用重組質粒表現載體(例如，Ti質粒)轉化之植物細胞系統，包括但不限於教示於下列專利案之表現系統：美國專利第6,815,184號(用於自經基因改造之線葉藻中表現及分泌生物活性多肽之方法)；WO 2004/057002(藉由在苔蘚植物細胞中引入糖基轉移酶基因製備糖基化蛋白質)及WO 2004/024927(在苔蘚原生質體中產生胞外異源非植物蛋白質之方法)；及美國專利申請案第60/365,769號、第60/368,047號以及WO 2003/078614(包含功能哺乳動物GnTIII酵素之轉基因植物中的糖蛋白加工)(上述每一專利案之全文內容以引用方式併入本文中)；或用重組病毒表現載體(例如，腺病毒、牛痘病毒)感染之動物細胞系統，包括經改造而含有編碼具有與親本抗體大體相同之結合特異性之改質ABM的多拷貝DNA、可在雙微染色體中穩定擴增(CHO/dhfr)或不穩定擴增(例如，鼠類細胞系)之細胞系。在一實施例中，包含多核苷酸編碼本發明ABM之載體具有多順反子性。同樣，在一實施例中，上述ABM係抗體或其片段。在一較佳實施例中，ABM係人類化抗體。
就本發明方法而言，穩定表現一般對瞬時表現較佳，此乃因其通常可達成重現性更強之結果亦及其更適於大規模生產。與其使用含有病毒複製起始子之表現載體，宿主細胞可用受適宜表現控制元件(例如，啟動子、增強子序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點，等等)控制之各個編碼核酸及選擇標記物基因轉化。導入外源DNA後，可使經改造細胞在富集培養基中生長1至2天，且隨後轉換為選擇培養基。重組質粒中選擇標記物可賦予針對選擇之抗性並允許選擇其中質粒已穩定整合入其染色體且生長形成隨後可經選殖並擴增成細胞系之轉化灶的細胞。
可使用多種選擇系統，包括但不限於單純性皰疹病毒胸苷激酶 (Wigler等人，Cell 11：223(1977))、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska及Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026(1962))以及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人，Cell 22：817(1980))基因，上述可分別在tk-、hgprt-或aprt-細胞中採用。同樣，抗代謝物抗性亦可用作對於下列基因進行選擇之基礎：dhfr，其可賦予針對胺甲蝶呤之抗性(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA 77：3567(1989)；O'Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其可賦予針對黴酚酸之抗性(Mulligan及Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，其可賦予針對胺基糖苷G-418之抗性(Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1(1981))；以及hygro，其可賦予針對潮黴素之抗性(Santerre等人，Gene 30：147(1984)。最近，業已闡述了其他選擇基因，即trpB，其允許細胞利用吲哚以代替色胺酸；hisD，其允許細胞利用組胺醇以代替組胺酸(Hartman及Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8047(1988))；麩胺醯胺合成酶系統；以及ODC(鳥胺酸脫羧酶)，其可賦予針對鳥胺酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥胺酸，即DFMO之抗性(McConlogue，in：Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory編寫(1987))。
包含具有經改變糖基化之Fc區之改質ABM的表現
在另一態樣中，本發明進一步係關於用於改質由宿主細胞產生之在V區或CH1區含有至少一處胺基酸取代之改質ABM之糖基化譜圖的方法，該方法包括在該宿主細胞中表現編碼本發明改質ABM之核酸及編碼具有GnTIII活性之多肽的核酸或包含此等核酸之載體。較佳地，改質多肽係IgG或其包含Fc區之片段。在一尤佳實施例中，ABM係人類化抗體或其片段。在另一實施例中，宿主細胞經改造可共表現本發明ABM、GnTIII以及甘露糖苷酶II(ManII)。
作為改質之結果，由本發明宿主細胞產生之改質ABM展現增強 之Fc受體結合親和力及/或增強之效應功能。在一尤佳實施例中，改質ABM係人類化抗體或其含有Fc區之片段。較佳地，增強之Fc受體結合親和力係增強之對Fcγ激活受體(例如FcγRIIIa受體)的結合。增強之效應功能較佳係下列中一或多種之增強：增強之抗體依賴性細胞毒性、增強之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、增強之細胞因子分泌、增強之免疫複合體調介之抗原呈遞細胞之抗原攝取、增強之Fc調介之細胞毒性、增強之對NK細胞之結合、增強之對巨噬細胞之結合，增強之對多形核細胞(PMN)之結合、增強之對單核細胞之結合、增強之靶標結合抗體之交聯、增強之誘發凋亡之直接傳訊、增強之樹突狀細胞成熟以及增強之T細胞引發。
效應功能可藉由熟習此項技術者已知之各種分析量測及/或測定。用於量測效應功能(包括Fc受體結合親和力及補體依賴性細胞毒性)之各種分析闡述於美國申請公開案第2004/0241817A1號中，其全文以引用方式併入本文中。細胞因子分泌可使用(例如)三明治ELISA量測(參見例如，McRae等人，J.Immunol.164：23-28(2000)且細胞因子三明治ELISA程序可在 www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols 獲得)，或藉由Takahashi等人(British J.Pharmacol.137：315-322(2002))所述之方法量測，每一參考文獻之全文以引用方式併入本文中。例如，樹突狀細胞成熟可使用Kalergi及Ravetch(J.Exp.Med.195：1653-59(2002))所闡述之分析確定，該參考文獻之全文以引用方式併入本文中。吞噬作用及抗原攝取/呈遞分析之實例由Gresham等人，J.Exp.Med.191：515-28(2000)；Krauss等人，J.Immunol.153：1769-77(1994)；及Rafiq等人，J.Clin.Invest.110：71-79(2002)以及Hamano等人，J.Immunol.164：6113-19(2000)提供，每一參考文獻之全文均以引用方式併入本文中。細胞表面受體之下調可藉由(例如)Liao等人，Blood 83：2294-2304(1994)所述之方法 量測，其全文以引用方式併入本文中。通用方法、程序及分析可參見CELL BIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK，Celis,J.E.編輯，(第2版，1998)，其全文以引用方式併入本文中。熟習此項技術者會瞭解，可使上述參考之方法、程序以及分析適用於本發明之用途。
本發明亦係關於用於在宿主細胞中產生本發明具有改質寡糖之ABM的方法，該方法包括：(a)在允許本發明ABM產生之條件下培養經改造可表現至少一個編碼具有GnTIII活性之多肽之核酸的宿主細胞，其中該具有GnTIII活性之多肽以足以改質由該宿主細胞產生之該ABM之Fc區寡糖的量表現；及(b)分離該ABM。在一較佳實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含GnTIII之催化結構域之融合多肽。在一尤佳實施例中，該融合多肽進一步包含高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域。
較佳地，該高爾基體定位結構域係甘露糖苷酶II或GnTI之定位結構域。另一選擇，該高爾基體定位結構域係選自由下列組成之群：甘露糖苷酶I之定位結構域、GnTII之定位結構域、以及α 1-6核心岩藻糖基轉移酶之定位結構域。由本發明方法產生之ABM具有增強之Fc受體結合親和力及/或增強之效應功能。較佳地，該增強之效應功能係下列中一或多種：增強之Fc調介之細胞毒性(包括增強之抗體依賴性細胞毒性)、增強之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、增強之細胞因子分泌、增強之免疫複合體調介之抗原呈遞細胞之抗原攝取、增強之對NK細胞之結合、增強之對巨噬細胞之結合、增強之對單核細胞之結合、增強之對多形核細胞之結合、增強之誘發凋亡之直接傳訊、增強之靶標結合之抗體交聯、增強之樹突狀細胞成熟、或增強之T細胞引發。增強之Fc受體結合親和力較佳係增強之對Fc激活受體(例如FcγRIIIa)之結合。在一尤佳實施例中，ABM係人類化抗體或其片段。
在另一實施例中，本發明係關於具有與親本抗體大體相同之結合特異性之由本發明方法產生之改質ABM，其在該多肽Fc區中具有比例升高之二等分寡糖。本發明涵蓋，此一ABM包括抗體及其含有Fc區之片段。在一較佳實施例中，該ABM係人類化抗體。在一實施例中，二等分寡糖在ABM Fc區之百分比係總寡糖的至少50%；更佳係至少60%、至少70%、至少80%或至少90%；且最佳係至少90至95%。在又一實施例中，作為由本發明方法改質其寡糖之結果，由本發明方法產生之ABM在Fc區具有比例升高之非岩藻糖基化寡糖。在一實施例中，非岩藻糖基化寡糖之百分比係至少50%；較佳係至少60%至70%；最佳係至少75%。非岩藻糖基化寡糖可屬於雜合體或複合體類型。在一尤佳實施例中，由本發明宿主細胞及方法產生之ABM在Fc區具有比例升高之二等分非岩藻糖基化寡糖。二等分非岩藻糖基化寡糖可為雜合體或複合體。具體而言，本發明方法可用於產生其中至少15%、更佳至少20%、更佳至少25%、更佳至少30%、更佳至少35%的ABM Fc區寡糖為二等分非岩藻糖基化寡糖之ABM。本發明方法亦可用於產生其中至少15%、更佳至少20%、更佳至少25%、更佳至少30%、更佳至少35%的多肽Fc區寡糖為二等分雜合體非岩藻糖基化寡糖之多肽。
在另一實施例中，本發明係關於由本發明方法產生之具有與親本抗體大體相同之結合特異性且經改造具有增強之效應功能及/或增強之Fc受體結合親和力之改質ABM。較佳地，增強之效應功能係下列中的一或多種：增強之Fc調介之細胞毒性(包括增強之抗體依賴性細胞毒性)、增強之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、增強之細胞因子分泌，增強之免疫複合體調介之抗原呈遞細胞之抗原攝取、增強之對NK細胞之結合、增強之對巨噬細胞之結合、增強之對單核細胞之結合、增強之對多形核細胞之結合、增強之誘發凋亡之直接傳訊、增 強之靶標結合抗體之交聯、增強之樹突狀細胞成熟、或增強之T細胞引發。在一較佳實施例中，增強之Fc受體結合親和力係增強之對Fc激活受體(最佳係FcγRIIIa)之結合。在一實施例中，改質ABM係抗體、含有Fc區之抗體片段或包含免疫球蛋白Fc區等效區之融合蛋白。在一尤佳實施例中，ABM係人類化抗體。
包含改質ABM之醫藥組合物
本發明進一步係關於包含本發明改質ABM及一醫藥上可接受之載劑的醫藥組合物。
任何習用載劑材料均可使用。載劑材料可以係適用於經腸、經皮或非經腸投與之有機或無機載劑材料。適宜載體包括水、明膠、***膠、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、滑石粉、植物油、聚乙二醇、礦脂及諸如此類。此外，醫藥製備物可含有其他醫藥活性劑。可根據醫藥複合之公認慣例加入額外添加劑，例如矯味劑、穩定劑、乳化劑、緩衝劑及諸如此類。
本文所用片語「醫藥上可接受」係指彼等在合理藥學判斷範圍內適於與人類及動物組織接觸使用且無過高毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症且與合理得益/風險比率相應之化合物、材料、組合物及/或劑型。
本發明進一步係關於此等用於癌症治療或預防之醫藥組合物。本發明進一步係關於一種治療或預防癌症之方法，該方法包括投與治療有效量之本發明醫藥組合物。
較佳地，癌症係選自由乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、***癌、腎癌及腦癌組成之群。
本發明進一步係關於此等用於癌前病況或病損治療或預防之醫藥組合物。本發明進一步係關於一種治療或預防癌前病況或病損之方法，該方法包括投與治療有效量之本發明醫藥組合物。
較佳地，該癌前病況或病損係選自由下列組成之群：口腔白斑、光化性角化病(日光性角化病)、結腸或直腸之癌前息肉、胃黏膜上皮異型增生、腺瘤型異型增生、遺傳性非息肉病性結腸癌症候群(HNPCC)、巴瑞特氏食道症、膀胱異型增生及癌前子宮頸病況。
本發明進一步提供用於生成及使用宿主細胞系統以產生本發明改質ABM之糖型的方法，該改質ABM之糖型具有增強之Fc受體結合親和力(較佳為增強之對Fc激活受體之結合)及/或具有增強之效應功能(包括抗體依賴性細胞毒性)。可用於本發明改質ABM之糖改造方法已更為詳細地闡述於美國專利第6,602,684號及臨時美國專利申請案第60/441,307號及WO 2004/065540中，其全文內容以引用方式併入本文中。另一選擇，可根據揭示於歐洲專利第1 176 195 A1號(其全文內容以引用方式併入本文中)之技術對本發明改質ABM進行糖改造以在Fc區具有減少之岩藻糖殘基。
用於產生具有經改變之糖基化模式之改質ABM之細胞系的生成
本發明提供用於產生本發明具有改質糖基化模式之改質ABM的宿主細胞表現系統。特定而言，本發明提供用於產生治療價值提高之本發明改質ABM糖型之宿主細胞系統。因此，本發明提供經選擇或經改造可表現具有GnTIII活性之多肽之宿主細胞表現系統。在一實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含異源高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域之融合多肽。具體而言，此等宿主細胞表現系統可經改造以包含編碼具有GnTIII之多肽的重組核酸分子，該重組核酸分子係以可操作方式連接到組成型或經調節之啟動子系統中。
在一具體實施例中，本發明提供已經改造可表現至少一個編碼具有GnTIII活性且包含異源高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域之融合多肽之核酸的宿主細胞。在一態樣中，宿主細胞經改造可具用一包含至少一個編碼具有GnTIII活性且包含異源高爾基體駐留多肽之 高爾基體定位結構域之融合多肽之基因的核酸分子。
一般而言，任何類型之培養細胞系(包括上述細胞系)均可用作改造本發明宿主細胞系之背景。在一較佳實施例中，CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、或植物細胞均可用作背景細胞系以形成經本發明改造之宿主細胞。
本發明欲涵蓋任何經改造可表現具有GnTIII活性之多肽之宿主細胞，該多肽包括包含本文所定義之異源高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域的融合多肽。
一或若干個編碼具有GnTIII活性之多肽的核酸可在組成型啟動子控制下表現或另一選擇在經調節表現系統中表現。此等系統為業內所熟知，且包括上文所述系統。若將若干編碼具有GnTIII活性且包含異源高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域之融合多肽的不同核酸納入宿主細胞系統內，則其中一些可在組成型啟動子控制下表現，而其他一些須在調節之啟動子控制下表現。具有GnTIII活性之融合多肽的表現水平可藉由業內習知之方法確定，該等方法包括西方點漬分析、北方點漬分析、報告基因表現分析或GnTIII活性之量測。另一選擇，可採用結合GnTIII生物合成產物之凝集素(例如，E4-PHA凝集素)。或者，可採用量測由經改造具有編碼具GnTIII活性之多肽之核酸的細胞產生之抗體調介之增強之Fc受體結合或增強之效應功能的功能分析。
表現具有改質糖基化模式之蛋白質之轉染子或轉化子的鑑別
包含本發明改質ABM之編碼序列並表現生物活性基因產物之宿主細胞可藉由至少四種通用方法鑑別：(a)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(b)「標記物」基因功能之存在或不存在；(c)評定藉由宿主細胞中各自mRNA轉錄物之表現量測之轉錄水平；以及(d)檢測藉由免疫分 析或其生物活性量測之基因產物。
在第一種方法中，本發明改質ABM編碼序列及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列的存在可藉由DNA-DNA或DNA-RNA雜交使用包含分別與各自編碼序列同源之核苷酸序列或其一部分或衍生物之探針來檢測。
在第二種方法中，重組表現載體/宿主系統可根據某些「標記物」基因功能(例如，胸苷激酶活性、對抗生素抗性、對胺甲喋呤之抗性、轉化表型、杆狀病毒中包含體形成，等等)之存在或不存在來鑑別。舉例而言，若將本發明改質ABM之編碼序列或其片段及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列***載體之標記物基因序列內，則含有各自編碼序列之重組體可藉由標記物基因功能之不存在來鑑別。另一選擇，可將標記物基因以與編碼序列串聯之形式置於用於控制編碼序列表現之相同或不同啟動子的控制下。響應於誘發或選擇之標記物的表現指示本發明改質ABM之編碼序列及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列的表現。
在第三種方法種，本發明改質ABM編碼區或其片段以及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列的轉錄活性可藉由雜交分析評定。舉例而言，RNA可經分離並藉由北方點漬使用與本發明改質ABM編碼序列或其片段以及具有GnTIII活性之多肽或其特定部分之編碼序列同源之探針加以分析。另一選擇，宿主細胞總核酸可經提取並進行對此等探針之雜交分析。
在第四種方法中，蛋白質產物之表現可以免疫學方法評定，例如西方點漬分析、免疫分析，例如放射免疫沉澱、酵素偶聯免疫分析及諸如此類。然而，表現系統成功性之最終測試涉及生物活性基因產物之檢測。
具有增強之效應功能(包括抗體依賴性細胞毒性)之改質ABM的產 生及用途
在較佳實施例中，本發明提供具有與鼠類B-Ly1抗體大體相同之結合特異性並具有增強之效應功能(包括抗體依賴性細胞毒性)之嵌合改質ABM的糖型。抗體之糖基化改造先前已有闡述。參見(例如)美國專利第6,602,684號，其全文內容與引用方式併入本文中。
用於治療某些類型癌症之非結合單株抗體(mAbs)之臨床試驗最近以產生了令人鼓舞之結果。Dillman，Cancer Biother.& Radiopharm.12：223-25(1997)；Deo等人，Immunology Today 18：127(1997)。一種嵌合非結合之IgG1已經批准可用於低級或濾泡性B-細胞何傑金氏(何傑金氏)淋巴瘤(Dillman，Cancer Biother.& Radiopharm.12：223-25(1997))，而另一非結合之mAb(靶向實體***腫瘤之人類化IgG1)亦已在III期臨床試驗中顯示出有希望之結果(Deo等人，Immunology Today 18：127(1997))。該兩種mAb之抗原可在其各自腫瘤細胞中高水平表達及該等抗體可在活體外及活體內藉由效應細胞調介有效腫瘤破壞。相反，許多具有很好腫瘤特異性之其他非結合mAb無法引發足夠有效可臨床利用之效應功能(Frost等人，Cancer 80：317-33(1997)；Surfus等人，J.Immunother.19：184-91(1996))。對於某些此等較弱mAb，當前正在測試輔助細胞因子療法。添加細胞因子可藉由增加循環淋巴細胞之活性及數目來刺激抗體依賴性細胞毒性(ADCC)(Frost等人，Cancer 80：317-33(1997)；Surfus等人，J.Immunother.19：184-91(1996))。ADCC，一種對抗體靶向細胞之溶解性攻擊，可在白細胞受體結合至抗體恆定區(Fc)時引發(Deo等人，Immunology Today 18：127(1997))。
一種可增加非結合IgG1之ADCC活性之不同但互補之方法為改造抗體Fc區。蛋白質工程研究已顯示，FcγR可與IgG CH2結構域之較低鉸鏈區相互作用(Lund等人，J.Immunol.157：4963-69(1996))。然而， FcγR結合亦需要共價連接至CH2區之保守Asn 297處之寡糖的存在(Lund等人，J.Immunol.157：4963-69(1996)；Wright及Morrison，Trends Biotech.15：26-31(1997))，表明寡糖及多肽二者均直接對相互作用位點作出貢獻或需要寡糖來維持活性CH2多肽構象。因此，寡糖結構之改質可作為增加相互作用親和力之手段來探究。
IgG分子在其Fc區攜帶有兩個N連接之寡糖，每一重鏈上一個。與任何糖蛋白相同，抗體可以共用相同多肽主鏈但具有不同的連接至糖基化位點上之寡糖的一群糖型形式產生。通常見於血清IgG Fc區之寡糖係屬於複合雙觸類型(Wormald等人，Biochemistry 36：130-38(1997))，其具有低水平之末端唾液酸及二等分N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)及可變程度之末端半乳糖基化及核心岩藻糖基化。某些研究表明，FcγR結合所需之最少的碳水化合物結構位於寡糖核心內(Lund等人，J.Immunol.157：4963-69(1996))。
產生非結合之治療用mAb之工業及學術研究中使用之小鼠或倉鼠源細胞系通常將所需寡糖決定子連到Fc位點上。然而，此等細胞系中表現之IgG缺乏少量存於血清IgG之二等分GlcNAc(Lifely等人，Glycobiology 318：813-22(1995))。相反，最近觀察到，大鼠骨髓瘤產生之人類化IgG1(CAMPATH-1H)在其某些糖型中帶有二等分GlcNAc(Lifely等人，Glycobiology 318：813-22(1995))。該大鼠細胞來源之抗體達到與標準細胞系產生之CAMPATH-1H抗體類似的最大活體外ADCC活性，但抗體濃度明顯較低。
CAMPATH抗原通常以高水平存在於淋巴瘤細胞上，且此嵌合mAb在二等分GlcNAc不存在下具有高ADCC活性(Lifely等人，Glycobiology 318：813-22(1995))。在N連接之糖基化途徑中，藉由GnTIII加入二等分GlcNAc(Schachter，Biochem.Cell Biol.64：163-81(1986))。
先前研究使用單個產生抗體之CHO細胞系，其之前經改造可以外部調節之方式表現不同水平之經選殖GnTIII基因酵素(Umana,P.等人，Nature Biotechnol.17：176-180(1999))。此方法首次確認了GnTIII表現與經改質抗體ADCC活性間之嚴格相關性。因此，本發明涵蓋具有鼠類B-Ly1抗體之結合特異性並具有由增強之GnTIII活性導致之經改變糖基化的重組嵌合抗體或其片段。增強之GnTIII活性導致改質ABM Fc區中二等分寡糖百分比之增加以及岩藻糖殘基百分比之降低。此抗體或其片段具有增強之Fc受體結合親和力以及增強之效應功能。此外，本發明係關於包含免疫球蛋白Fc區之等效區的抗體片段及融合蛋白。
根據本發明方法之改質ABM的治療應用
在其最廣泛含義中，本發明改質ABM可用於表現靶標抗原之活體內或活體外靶標細胞，尤其在該靶標抗原表現於細胞表面之情況下如此。對於診斷或治療目的可靶向表現靶標抗原之細胞。在一態樣中，本發明改質ABM可用於改變表現靶標抗原之細胞中的細胞傳訊活性。在另一態樣中，本發明改質ABM可用於改變一或多種靶標抗原之交聯及/或寡聚作用。用於本發明改質ABM之靶標抗原可為細胞表面受體，包括但不限於CD20、CD21、CD22、CD19、CD47、CD99、CD2、CD45、Her1(EGFR)、Her2/neu、Her3、Her4、TRAIL受體(例如，TRAILR1、TRAILR2)、TNFR、FGF受體(例如，FGFR1)、IGF受體、PDGF受體、VEGF受體及其他細胞表面結合之受體。在一特定實施例中，該靶標抗原係CD20。本發明改質ABM亦可起到停滯細胞週期、引起靶標細胞(例如，腫瘤細胞)凋亡、抑制血管發生及/或引起靶標細胞分化之作用。
在另一態樣中，本發明係關於用於治療可由經改變之靶標抗原細胞傳訊活性及/或由經改變之調介一或多種靶標抗原交聯之能力治 療之疾病的方法，該方法包括向需要其之受試者投與治療有效量之本發明改質ABM。在一具體實施例中，該改質ABM係抗體。在一更具體之實施例中，該抗體係人類化抗體。可對其投與改質ABM之疾病實例包括但不限於細胞增殖疾病或病症、自身免疫疾病或病症以及與細菌或病毒感染有關之疾病或病症。
在一實施例中，該疾病或病症係細胞增殖病症。可由本發明ABM治療之細胞增殖病症之實例包括但不限於位於腹部、骨、乳腺、消化系統、肝、胰腺、腹膜、內分泌腺(腎上腺、甲狀旁腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼睛、頭頸部、神經系統(中樞及周圍)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾、胸腔區以及泌尿生殖系統之贅瘤、癌症、惡性腫瘤及/或腫瘤。可用本發明ABM治療之特定贅瘤、癌症、惡性腫瘤及/或腫瘤包括但不限於表皮及鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、胰腺癌、卵巢癌、***癌、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、腎細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、腦腫瘤、惡性黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食管癌、肝癌、皮膚癌、尿道癌、絨毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜細胞增生症、男性細胞瘤、子宮內膜增生、子宮內膜異位、胚瘤、纖維肉瘤、卡波西氏(Kaposi's)肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、成血管細胞瘤、成視網膜細胞瘤、星形細胞瘤、神經纖維瘤、少突神經膠質瘤、成神經管細胞瘤、成神經節細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、錯構胚細胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀腺肉瘤、尤因氏(Ewing's)肉瘤以及維爾姆斯(Wilms)瘤。
類似地，其他細胞增殖病症亦可用本發明改質ABM治療。此等細胞增殖病症之實例包括但不限於高丙種球蛋白血症、淋巴組織增殖性病症、副蛋白血症、紫癜、結節病、賽雜瑞氏(Sezary)症候群、瓦爾登斯特倫氏(Waldenstron's)巨球蛋白血症、高歇病(Gaucher's disease)、組織細胞增多病及位於上述列示之器官系統之除贅瘤以外之任何其他細胞增殖疾病。
自身免疫疾病或病症之實例包括但不限於免疫調介之血小板減少症，例如急性特發性血小板減少紫癜及慢性特發性血小板減少紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏(Sydenham's)舞蹈病、狼瘡性腎炎、風濕熱、多腺症候群、亨諾-許蘭二氏(Henoch-Schonlein)紫癜、鏈球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安氏(Takayasu's)動脈炎、艾迪生氏(Addison's)病、多形性紅斑、結節性多動脈炎、強直性脊椎炎、古得派斯德氏(Goodpasture's)症候群、血栓閉塞性脈管炎、原發性膽汁性肝硬化、橋本氏(Hashimoto's)甲狀腺炎、甲狀腺毒症、慢性活動性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常天皰瘡、韋格納氏(Wegener's)肉芽腫病、膜性腎病、肌萎縮性側索硬化、脊髓癆、多肌痛、惡性貧血、急進性腎小球性腎炎及纖維性肺泡炎、炎症性反應，例如炎症性皮膚病，包括乾癬及皮炎(例如特應性皮炎)；全身性硬皮病及硬化；與炎症性腸病有關之反應(例如克隆氏(Crohn's)病及潰瘍性結腸炎)；呼吸窘迫症候群(包括成人呼吸窘迫症候群；ARDS)；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結腸炎；腎小球腎炎；過敏性病症，例如濕疹及哮喘以及T細胞浸潤及慢性炎症性反應之其他病症；動脈粥樣硬化；白細胞黏附缺陷病；類風濕性關節炎；全身性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病(例如1型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病)；多發性硬化；雷諾氏(Reynaud's)症候群；自身免疫性甲狀腺炎；變應性腦脊髓炎；薛格連氏(Sjorgen's)症候群；幼年發病型糖尿病；以及與常見於結核病、結節病、多肌炎、肉芽腫病及血管炎之細胞因子及T-淋巴細胞調介之急性及延遲性超敏反應有關的免疫反應；惡性貧血(艾迪生氏病)；與白血球滲出有關之疾病；中樞神經系統(CNS)炎症性病症；多器官損傷症候群；溶血性貧血(包括但不限於冷球蛋白症或庫柏(Coombs)陽 性貧血)；重症肌無力；抗原-抗體複合體調介之疾病；抗腎小球基底膜病；抗磷脂症候群；變應性神經炎；葛雷夫斯氏(Graves')病；Lambert-Eaton肌無力症候群；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多發性內分泌病；萊特爾氏(Reiter's)病；僵人症候群；貝切特氏(Behcet)病；巨細胞性動脈炎；免疫複合體腎炎；IgA腎病；IgM多發性神經病；免疫血小板減少紫癜(ITP)或自身免疫血小板減少症，等等。
本發明改質ABM可單獨使用或與其他治療或治療劑組合使用以治療可由一或多種靶標抗原細胞傳訊活性及/或交聯之增強或減弱治療之病症。在一實施例中，本發明改質ABM亦可單獨使用以靶向及殺傷活體內腫瘤細胞。改質ABM亦可與一適宜治療劑聯用以治療人類癌瘤。舉例而言，改質ABM可與標準或習用治療方法(例如化療、放療)組合使用或可結合或連接到治療藥物或毒素以及淋巴因子或腫瘤抑制性生長因子上，以將治療劑遞送至癌瘤部位。在特定實施例中，本發明改質ABM之共軛物包括：(1)免疫毒素(改質ABM與細胞毒性部分之共軛物)及(2)標記之(例如放射標記之、酵素標記之或螢光色素標記之)改質ABM，其中標記物提供用於鑑別包含經標記ABM之免疫複合體的方法。改質ABM亦可用於藉助天然補體過程誘導溶解並用於與通常存在之抗體依賴性細胞毒性細胞相互作用。
免疫毒素之細胞毒性部分可為細胞毒性藥物或細菌或植物來源之具酵素活性毒素，或此一毒素之具酵素活性的片段(「A鏈」)。所用具酵素活性之毒素及其片段係白喉毒素A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚麴菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、戴安辛蛋白、美洲商陸(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果 素、巴豆毒蛋白、蘆荀(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、米托潔林(mitogellin)、侷限毒素、酚黴素以及依諾黴素。在另一實施例中，改質ABM與小分子抗癌藥物結合。改質ABM與此等細胞毒性部分之共軛物可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製備。此等試劑之實例係SPDP、IT、亞胺酸酯之雙功能衍生物，如鹽酸己二醯亞胺二甲酯、活性酯，例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯、醛類，例如戊二醛、雙疊氮化合物，例如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺、雙重氮鎓衍生物，例如雙-(對重氮鎓苯甲醯基)乙二胺、二異氰酸酯，例如甲苯2,6-二異氰酸酯以及雙-活性氟化合物，例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯。可將毒素之溶解部分連接至改質ABM之Fab片段上。額外適宜毒素為業內已知，如(例如)公開之美國專利申請案第2002/0128448號中所證明，其全文以引用方式併入本文中。
在一實施例中，本發明抗原結合分子可結合至一額外部分(例如放射標記物或毒素)上。此等結合之改質ABM可由業內熟知的多種方法產生。
多種放射性核素均適用於本發明且熟習此項技術者有能力容易地確定各種情況下哪種放射性核素最適宜。舉例而言，131碘係用於靶向免疫療法之熟知放射性核素。然而，131碘之臨床使用受限於若干因素，包括：8天之身體半衰期；碘化抗體在血液及腫瘤部位二者中之脫鹵作用；以及放射特徵(例如，大量γ組份)，此對於腫瘤中之局部劑量沈積會係次最佳者。隨著優良螯合劑之出現，將金屬螯合基團連到蛋白質上之可能使採用其他放射性核素(例如111銦及90釔)之機會增多。90釔為放射免疫治療應用中之使用提供了若干優點：90釔64小時之半衰期長度足以使抗體在腫瘤中積累，與(例如)131碘不同，90釔係高能純β放射體，在其衰變時不會伴隨γ輻射(範圍係100至1000細胞直徑之組織內)。此外，貫穿輻射之最低量允許將90釔標記之抗體投與給 門診患者。另外，經標記抗體之內在化並非為細胞殺傷所需，且電離輻射之局部放射對於附近缺乏靶標抗原之腫瘤細胞應係致死的。
90釔標記之本發明改質ABM的有效單次治療劑量(即，治療有效量)範圍係約5至約75mCi，更佳係約10至約40mCi。131碘標記之本發明ABM的有效單次治療非骨髓摘除劑量範圍係自約5至約70mCi，更佳係約5至約40mCi。131碘標記之本發明抗體的有效單次治療摘除劑量(即，會需要自體骨髓移植)範圍係約30至約600mCi，更佳係約50至少於約500mCi。與本發明嵌合抗體聯用時，由於與鼠類抗體相比具有更長之循環半衰期，故131碘標記之嵌合抗體的有效單次治療非骨髓摘除劑量範圍係約5至約40mCi，更佳係少於約30mCi。用於(例如)111銦標記物之成像標準通常係少於約5mCi。
對於本發明放射標記之抗體，伴隨其之療法使用單個療法治療或使用多種治療進行。由於放射性核素組份，較佳在治療之前，「收集」經歷輻射導致之潛在致命之骨髓毒性之患者的周圍幹細胞(「PSC」)或骨髓(「BM」)。BM及/或PSC係使用標準技術收集，且隨後清洗並冷凍用於可能之再輸注。另外，最佳係在治療之前，使用診斷標記之抗體(例如，使用111銦)在患者上實施診斷放射量測定研究，其目的在於確保治療用標記之抗體(例如，使用90釔)不會在任何正常器官或組織中不必要地「濃縮」。
在一實施例中，使嵌合之糖改造的本發明改質ABM結合至蓖麻毒素A鏈上。最有利的是，蓖麻毒素A鏈係藉由重組方法脫糖基化並製備。製備蓖麻毒素免疫毒素之有利方法闡述於Vitetta等人，Science 238，1098(1987)中，其以引用方式併入本文中。
在用於殺傷用於診斷目的之活體外人類癌症細胞時，通常會將該等共軛物以至少約10nM之濃度加入細胞培養基中。用於活體外用途之調配物及投與方式並非關鍵所在。通常使用與培養或灌注培養基 相容之水性調配物。可藉由習用技術讀取細胞毒性以確定癌症存在或程度。
如上所述，用於治療癌症之細胞毒性放射性醫藥可藉由將放射性同位素(例如，I、Y、Pr)結合至本發明嵌合之糖改造及/或改質ABM上製備。本文所用術語「細胞毒性部分」欲包括該等同位素。
在另一實施例中，用細胞毒性藥物添裝脂質體並用本發明ABM塗覆脂質體。由於本發明改質ABM的許多目標分子表現在細胞表面上(例如，在惡性B細胞表面上有許多CD20分子)，因此，此方法允許將大量藥物遞送給正確的細胞類型。
用於將此等治療劑結合至抗體上之技術為人們熟知(參見例如，Arnon等人，「Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy」，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Reisfeld等人(編輯)，第243至56頁(Alan R.Liss公司，1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」，Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(編輯)，第623至53頁(Marcel Dekker公司，1987)；Thorpe，「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」，Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(編輯)，第475至506頁(1985)；以及Thorpe等人，「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)(每一上述參考文獻之全文內容均以引用方式併入本文中)。
本發明ABM之又一些治療應用包括藉由(例如)重組DNA技術結合或連接至能夠將前藥轉化成細胞毒性藥物之酵素上及將該抗體-酵素共軛物與前藥聯用以在腫瘤部位將該前藥轉化成細胞毒性劑(參見例如，Senter等人，「Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4842-46(1988)； 「Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates」，Cancer Research 49：5789-5792(1989)；以及Senter，「Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates：A New Approach to Cancer Therapy」，FASEB J.4：188-193(1990))。
本發明ABM之又一治療用途涉及在補體存在下使用非結合之抗體或作為抗體-藥物或抗體-毒素共軛物的一部分，以去除癌症患者骨髓中的腫瘤細胞。根據此方法，藉由該抗體之治療在活體外清洗來自體內之自體骨髓並將該骨髓重新輸注給該患者(參見例如，Ramsay等人，「Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies」，J.Clin.Immunol.，8(2)：81-88(1988))。
此外，本發明涵蓋，本發明包括含有提供與親本抗體(例如，包含親本抗體之CDR的多肽)大體相同之結合特異性之抗原結合結構域且進一步包含毒素多肽之單鏈免疫毒素。本發明單鏈免疫毒素可用於在活體內治療人類癌瘤。
類似地，至少包含與具有抗腫瘤活性之另一蛋白質(例如，淋巴因子或製瘤素)的至少一功能活性部分連接之本發明ABM抗原結合區的融合蛋白可用於在活體內治療人類癌瘤。
本發明提供選擇性殺傷表現細胞表面受體之腫瘤細胞的方法，該等細胞表面受體包括但不限於CD20、Her1(EGFR)、Her2/neu、Her3、Her4、TRAIL受體(例如，TRAILR1、TRAILR2)、TNFR、FGF受體(例如，FGFR1)、IGF受體、PDGF受體、VEGF受體、及其他細胞表面結合受體。此方法包括使本發明改質ABM(結合之，例如，作為免疫毒素；或非結合之)與該等腫瘤細胞反應。此等腫瘤細胞可來自人類癌瘤。
另外，本發明提供在活體內治療癌瘤(例如，人類癌瘤)之方法。此方法包括向受試者投與醫藥有效量之含有至少一個本發明改質ABM(結合之，例如，作為免疫毒素；或非結合之)的組合物。
在又一態樣中，本發明係關於用於治療B-細胞增殖性病症(包括B-細胞淋巴瘤)以及完全或部分由致病性自身抗體引起之自身免疫疾病的基於B-細胞消耗之改良方法，該方法包括向需要其之人類受試者投與治療有效量之本發明ABM。在一較佳實施例中，ABM係具有與鼠類B-Ly1抗體者大體相同之結合特異性的糖改造之抗-CD20抗體。在另一較佳實施例中，該抗體係人類化抗體。在本發明此態樣中，本發明ABM係用於長時間消耗血液正常B細胞。
根據本發明之實踐，受試者可以係人類、馬類、豬類、牛類、鼠類、犬類、貓類以及鳥類受試者。其他溫血動物亦涵蓋在本發明中。
本發明進一步提供抑制人類腫瘤細胞生長、治療受試者之腫瘤以及治療受試者之增殖型疾病的方法。此等方法包括向受試者投與有效量之本發明組合物。
在一實施例中，本發明係關於用於治療或預防癌症、癌前病況或病損或自身免疫病症之本發明ABM。在又一實施例中，本發明係關於用作治療或預防癌症、癌前病況或病損或自身免疫疾病之藥物的本發明ABM。癌症可以係(例如)B-細胞淋巴瘤、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸部癌症、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌症、胃癌(stomach cancer，gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵癌瘤管、子宮內膜癌瘤、子宮頸癌瘤、***癌瘤、外陰癌瘤、何傑金氏病、食道癌症、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、***癌、膀胱 癌、腎或輸尿管癌、腎細胞癌瘤、腎盂癌瘤、間皮瘤、肝細胞癌、膽管癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞淋巴瘤、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊柱瘤、腦幹膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤、包括任何上述癌症之難治癒形式或一或多種上述癌症之組合。癌前病況或病損包括(例如)由口腔白斑、光化性角化病(日光性角化病)、結腸或直腸之癌前息肉、胃黏膜上皮異型增生、腺瘤型異型增生、遺傳性非息肉病性結腸癌症候群(HNPCC)、巴瑞特氏食道症、膀胱異型增生及癌前子宮頸病況組成之群。
較佳地，癌症係選自由B-細胞淋巴瘤、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、***癌、腎癌及腦癌組成之群。自身免疫病之實例症係如上提供者。
又一實施例係本發明ABM用於製造治療或預防癌症或治療或預防癌前病況或病損之藥物的用途。癌症及癌前病況或病損係如上定義。
因此，可顯見，本發明涵蓋用於治療人類癌瘤之醫藥組合物、組合、用途及方法。舉例而言，本發明包括用於治療人類癌瘤之醫藥組合物，其包含醫藥有效量之本發明抗體及醫藥上可接受之載劑。
本發明ABM組合物可使用習用投與方式(包括但不限於靜脈內、腹膜腔內、口服、淋巴內)投與或直接投與至腫瘤中。靜脈內投與較佳。
在本發明一態樣中，藉由將具有期望純度之抗體與任選醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.編輯(1980))混合來製備含有本發明ABM之治療調配物以用於儲存，該等調配物呈凍乾調配物或水性溶液形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑需在所使用之劑量及濃度下對接 受者無毒，並包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯苄烷銨；氯化苯銨松寧；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間-甲苯酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、雙糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；鼇合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成異荷離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
例示性抗-CD20 ABM調配物闡述於WO98/56418，其明確以引用方式併入本文中。此公開案闡述一包含40毫克/毫升利妥昔單抗、25mM乙酸鹽、150mM海藻糖、0.9%苄醇、0.02%聚山梨醇酯20，pH 5.0之液體多劑量調配物，其在2至8℃儲存時具有最低兩年之半衰期。另一感興趣之抗-CD20調配物包含存於9.0毫克/毫升氯化鈉、7.35毫克/毫升二水合檸檬酸鈉、0.7毫克/毫升聚山梨醇酯80及無菌注射用水，pH 6.5之10毫克/毫升利妥昔單抗。在本發明中，利妥昔單抗可由本發明改質ABM替代。
適於皮下投與之凍乾調配物闡述於WO 97/04801中。此等凍乾調配物可用適宜稀釋劑重構成具有高蛋白質濃度且該重構調配物可經皮下投與給本文擬治療之哺乳動物。
本文調配物亦可按需要包含一種以上用於所治療的特定適應症之活性化合物，較佳為彼等具有相互間不會產生不利影響之互補活性之化合物。舉例而言，會需要進一步提供細胞毒性劑、化療劑、細胞 因子或免疫抑制劑(例如作用於T細胞者，如環孢素或可結合T細胞之抗體，例如，可結合LFA-1者)。這些其他作用劑之有效量取決於調配物中所存在拮抗劑之量、疾病或病症或治療之類型及上文所討論的其他因素。這些作用劑通常以與先前相同的劑量使用並使用先前所用投與途徑投與或以約1至99%的之前所採用劑量使用。
此等活性成份亦可裝入分別(例如)藉由凝聚技術或藉由介面聚合製備之微膠囊中，例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，此等系統呈膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微滴乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或粗滴乳液形式。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A編輯(1980)中。
也可製備成緩釋製劑。緩釋製劑之適宜實例包括含有該拮抗劑之固態疏水聚合物之半透明基質，該等基質係呈成型物件形式，例如，膜或微膠囊。緩釋基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸2-羥乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林組成之可注射微球體)、以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用於活體內投與之調配物必須為無菌的。此可易於藉由過濾過無菌過濾膜達成。
本發明組合物可呈多種劑型，其包括但不限於液體溶液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、栓劑、聚合物微膠囊或微泡、脂質體以及可注射或可輸注之溶液。較佳形式取決於投與方式及治療應用。
本發明組合物較佳亦包括業內已知之習用的醫藥上可接受之載劑及佐劑，例如人類血清白蛋白、離子交換劑、氧化鋁、卵磷脂、緩 衝物質，例如磷酸鹽、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀以及鹽或電解質，例如硫酸魚精蛋白。
對本發明醫藥組合物最有效之投與方式及劑量方案取決於疾病之嚴重程度及進程，患者之健康狀況及對治療之反應以及主治醫師之判斷。因此，組合物之劑量應對逐個患者進行滴定。然而，本發明組合物之有效劑量一般在自約0.01至約2000毫克/公斤之範圍內。
本文所述分子可呈多種劑型，其包括但不限於液體溶液、或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、栓劑、聚合物微膠囊或微泡、脂質體及可注射或可輸注溶液。較佳形式取決於投與方式及治療應用。
在某些情形中，本發明劑量可藉助預測性生物標記物確定。預測性生物標記物係用於確定(即，觀察及/或定量)腫瘤相關基因或蛋白質之表現及/或激活模式或腫瘤相關傳訊途徑之細胞組份之分子標記物。闡明靶向療法在腫瘤組織中之生物學作用並將此等作用與臨床反應關聯起來有助於鑑別在腫瘤中起作用之主要生長及存活途徑，從而確定可能應答者之概況且反過來為設計克服治療抗性之策略提供基本依據。舉例而言，當改質ABM係對EGFR具有特異性之抗體時，用於抗-EGFR療法之生物標記物可包含一或多種處於引起細胞增殖病症之EGFR下游傳訊途徑之分子，其包括但不限於Akt、RAS、RAF、MAPK、ERK1、ERK2、PKC、STAT3、STAT5(Mitchell，Nature Biotech.22：363-364(2004)；Becker，Nature Biotech 22：15-18(2004)；Tsao及Herbst，Signal 4：4-9(2003))。用於抗-EGFR療法之生物標記物亦可包括生長因子受體，例如EGFR、ErbB-2(HER2/neu)及ErbB-3(HER3)，且可係患者反應對抗-EGFR療法之陽性或陰性預測劑。舉例而言，生長因子受體ErbB-3(HER3)經確定係抗-EGFR抗體ABX-EGF之陰性預測性生物標記物(美國專利申請公開案第2004/0132097 A1號)。
預測性生物標記物可藉由業內熟知的細胞分析量測，該等分析包括但不限於免疫組織化學分析、流式細胞術、免疫螢光、捕獲及檢測分析以及反相分析及/或美國專利申請公開案第2004/0132097 A1號中列示之分析，該公開案之全文內容以引用方式併入本文中。抗-EGFR療法之預測性生物標記物本身可根據美國專利申請公開案第2003/0190689A1號(其之全文內容以引用方式併入本文中)中列示之技術鑑別。
因此，在一態樣中，本發明提供用於治療與經改變或失調之靶標抗原細胞傳訊及/或經改變之調介一或多種靶標抗原之交聯及/或寡聚作用之能力有關之病症的方法，該方法包括在用一或複數個可檢測病症之預測性生物標記物之表現及/或激活的試劑治療之前於需要該治療之人類受試者中分析來自該人類受試者之樣品，藉此預測對改質ABM療法之反應，其中該病症與經改變或失調之靶標抗原細胞傳訊及/或經改變之調介一或多種靶標抗原交聯及/或寡聚作用之能力有關(例如癌症)；確定一或多種預測性生物標記物之表現及/或激活模式，其中該模式可預測人類受試者對改質ABM療法之反應；並向經預測可對改質ABM治療產生陽性反應之人類受試者投與治療有效量之包含本發明改質ABM的組合物。本文所用經預測可對改質ABM治療產生陽性反應之人類受試者係改質ABM會對疾病或病症產生可量測作用且對於其改質ABM療法之益處超過不良反應(例如，毒性)之受試者，其中該疾病或病症與經改變或失調之靶標抗原細胞傳訊及/或經改變之調介一或多種靶標抗原交聯及/或寡聚作用之能力有關(例如，腫瘤衰退/收縮)。本文所用樣品表示來自生物體(尤其為人類)之任何生物樣品，包括已自如乳腺、肺、胃腸道、皮膚、子宮頸、卵巢、***、腎、腦、頭頸部等器官或任何其他身體器官或組織取出之一或多種細胞，如任何來源之單細胞、組織或活體組織檢查樣品，以及其 他身體樣品，包括但不限於塗片、唾液、切片、腦脊液、膽汁、血液、淋巴液、尿液以及糞便。
包含本發明改質ABM之組合物可以與優良醫學實踐相一致之方式調配、配料及投與。在這方面，需考慮因素包括：所治療之特定疾病或病症、所治療之特定哺乳動物、個體患者之臨床病況、疾病或病症起因、作用劑之遞送位點、投與方法、投與時間安排以及醫務人員熟知的其他因素。待投與之拮抗劑的治療有效量可由該等考慮因素控制。
作為一般主張，每劑量非經腸投與之抗體的治療有效量係在約0.1至20毫克/公斤患者體重/天之範圍內，其中所用拮抗劑之典型起始範圍係在約2至10毫克/公斤之範圍內。
亦較佳地，該改質ABM係以自約1.0毫克/公斤至約15毫克/公斤之治療有效量使用。
亦更佳地，該改質ABM係以自約1.5毫克/公斤至約12毫克/公斤之治療有效量使用。
亦更佳地，該改質ABM係以自約1.5毫克/公斤至約4.5毫克/公斤之治療有效量使用。
亦更佳地，該改質ABM係以自約4.5毫克/公斤至約12毫克/公斤之治療有效量使用。
最佳地，該改質ABM係以約1.5毫克/公斤之治療有效量使用。
亦最佳地，該改質ABM係以約4.5毫克/公斤之治療有效量使用。
亦最佳地，該改質ABM係以約12毫克/公斤之治療有效量使用。
在一較佳實施例中，該改質ABM係抗體，較佳為人類化抗體。對於此一非結合之抗體適宜劑量係在(例如)自約20毫克/平方米至約1000毫克/平方米之範圍內。在一實施例中，該抗體之劑量不同於目前推薦之利妥昔單抗的劑量。舉例而言，人們可投與給患者一或多個 劑量之大體少於375毫克/平方米的抗體，例如，當劑量係在自約20毫克/平方米至約250毫克/平方米(例如自約50毫克/平方米至約200毫克/平方米)範圍之內時係如此。
此外，人們可投與一或多個起始劑量之抗體，之後投與一或多個後續劑量，其中後續劑量中抗體之毫克/平方米劑量需超過起始劑量中抗體之毫克/平方米劑量。舉例而言，起始劑量可在自約20毫克/平方米至約250毫克/平方米(例如，自約50毫克/平方米至約200毫克/平方米)之範圍內而後續劑量可在自約250毫克/平方米至約1000毫克/平方米之範圍內。
然而，如上所述此等表明，改質ABM之量需經受大量治療判斷之檢驗。選擇適宜劑量及時序安排方面之關鍵因素係所得結果，如上所述。例如，對於進行中及急性疾病之治療會需要相對較高之劑量。為獲得最有效之結果，根據疾病或病症，拮抗劑需在盡可能接近疾病或病症首次徵候、診斷、出現或發生時或在疾病或病症減輕期間投與。
本發明改質ABM可藉由任何適宜方式(包括非經腸、皮下、腹膜腔內、肺內、和鼻內)投與，並且，若期望，對於局部免疫抑制治療，可採用病變內方式用藥。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下投與。此外，拮抗劑適當可藉由脈動輸注以(例如)逐漸降低拮抗劑劑量之方式投與。較佳地，此定量給藥應部分地視投與期的長短而藉由注射(最佳係藉由靜脈內或皮下注射)投與。
人們可與本文拮抗劑一起投與其他化合物，例如細胞毒性劑、化療劑、免疫抑制劑及/或細胞因子。該聯合投與包括使用分開調配物或單個醫藥調配物之共同投與及以任一順序進行之連續投與，其中較佳地在一時間段內兩種(或所有)活性作用劑可同時發揮其生物活性。
應清楚，達成治癒所需之本發明組合物的劑量可藉由時序安排最優化來進一步降低。
根據本發明實踐，醫藥載劑可為脂質載劑。該脂質載劑可為磷脂。進一步，該脂質載劑可為脂肪酸。同樣，該脂質載劑可為去垢劑。本文所用去垢劑可為會改變液體表面張力(一般為使之降低)之任何物質。
在本發明一實例中，該去垢劑可為非離子型去垢劑。非離子型去垢劑之實例包括但不限於聚山梨醇酯80(亦稱作吐溫80或(聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯)、Brij以及Triton(例如，Triton WR-1339及Triton A-20)。
另一選擇，該去垢劑可為離子型去垢劑。離子型去垢劑之實例包括但不限於烷基三甲基溴化銨。
另外，根據本發明，該脂質載劑可為脂質體。本申請案中所有「脂質體」係含有任何本發明分子或其組合之任何膜結合之媒劑。
以下實列會更為詳細地闡釋本發明。下文給出之製劑及實例旨在使熟習此項技術者更清楚地瞭解及實施本發明。然而，本發明並不侷限於由例示性實施例界定之範圍，該等實施例僅欲作為本發明單獨態樣之舉例說明，且功能等效方法涵蓋於本發明範圍內。實際上，除本文所述實施例外，熟習此項技術者可根據上述闡釋及相關附圖明瞭本發明的各種修改方案。此等修改方案均涵蓋於隨附申請專利範圍內。
實例
除非另有說明，否則在以下實例中提及具體胺基酸殘基位置編號時均係根據Kabat編號系統進行編號。
實例1
材料及方法
重組抗體B-Ly1之選殖及表現
使表現B-Ly1之雜交瘤細胞(參見例如，Poppema,S.等人，1987，Proceedings of the 9 th Biotest Symposium，Institute of Education，London,(Sonneborn,H.H.及Tills,D編輯)；Ling，N.R等人，1987，In Leucocyte Typing Conference III：White cell differentiation antigens，302-355，Oxford University Press，Oxford.(A.J.McMichael編輯)；Knapp,W.1990.Leucocyte Typing Conference IV Proceedings，Oxford University Press，Oxford)生長於含有10% FBS及4mM L-麩胺醯胺之RPMI中。收集成活力>90%之6x106細胞並使用Qiagen RNAeasy midi套組分離總RNA。藉由RT-PCR擴增編碼B-Ly1可變輕鏈及重鏈之cDNA。RT-PCR反應係使用以下條件實施：第一鏈cDNA合成，50℃，30分鐘；初始變性，95℃，15分鐘；30個循環，每個循環：94℃，1分鐘；45℃，1分鐘；72℃，1.5分鐘；及最終延伸步驟，72℃，10分鐘。PCR產物之預期大小可藉由電泳確認。將PCR產物選殖入適宜大腸桿菌載體並藉由DNA定序確認可變輕鏈及重鏈編碼基因之分離。
對於嵌合B-Ly1表現載體之構建，藉由額外PCR反應將合成之訊號序列及適宜限制酶切位點融合至可變鏈上。最終確認正確的可變鏈DNA序列後，可將其與相應之人類IgG1恆定區組合。構建好基因後，使用兩個分開之載體(一個載體對應一條鏈)進行選殖，使基因處於MPSV啟動子控制下並位於合成之polyA位點上游，從而得到質粒pETR1808(重鏈表現載體)及pETR1813(輕鏈表現載體)。每一載體攜帶一EBV OriP序列。
之藉由用磷酸鈣轉染法以載體pETR1808及pETR1813共轉染HEK293-EBNA細胞來產生嵌合B-Ly1。藉由磷酸鈣法轉染指數生長之HEK293-EBNA細胞。使用補充有10% FCS之DMEM培養基在T培養瓶 中以單層貼壁培養物形式培養細胞，在50及80%融合間轉染。對於T75培養瓶之轉染，在轉染前24小時將8x106個細胞接種於補充有FCS(終濃度10% V/V)、250微克/毫升新黴素之14毫升DMEM培養基中，並將細胞置於具有5% CO2氣氛之37℃培養箱中，過夜培養。對每一待轉染之T75培養瓶，藉由混合47微克總質粒載體DNA(在輕鏈及重鏈表現載體之間均分)、235微升1M CaCl2溶液並加入水使終體積達469微升來製備DNA、CaCl2及水之溶液。在此溶液中，加入469微升之50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4溶液(pH 7.05)，立即混合10秒鐘並使之在室溫靜置20秒。懸浮液用12毫升補充有2% FCS之DMEM稀釋，並加入T75中代替現有培養基。細胞在37℃、5% CO2下培育約17至20小時，隨後用12毫升DMEM(10% FCS)替代培養基。對於未經改質抗體「chB-Ly1」之製備，細胞僅用比例為1：1之抗體表現載體pETR1808及pETR1813轉染。對於糖改造抗體「chB-Ly1-ge」之製備，細胞用四個質粒共轉染，分別為：兩個用於抗體表現(pETR1808及pETR1813)；一個用於融合GnTIII多肽表現(pETR1519)且另一個用於甘露糖苷酶II表現(pCLF9)，比例為4：4：1：1。轉染後第5天，收集上清液，以1200rpm離心5分鐘，隨後以4000rpm進行10分鐘的第二次離心並保持在4℃。
利用在Superdex 200管柱(Amersham Pharmacia)進行之三步連續層析步驟(蛋白質A層析、離子交換層析法及尺寸排除層析)將緩衝液交換成磷酸緩衝鹽溶液並收集來自此最後一步之單體抗體峰，藉此自培養物上清液中純化chB-Ly1及chB-Ly1-ge。使用分光光度計由280奈米之吸光度評估抗體濃度。
寡糖分析
藉由PNGaseF消化以酶促方式自抗體上釋放寡糖，其中將抗體固定於PVDF膜上或溶液中。
製備所得含有經釋放寡糖之消化溶液直接用於MALDI/TOF-MS分析或在製備用於MALDI/TOF-MS分析之樣品前進一步用EndoH糖苷酶消化。
用於PVDF膜固定之抗體的寡糖釋放方法
將用PVDF(Immobilon P，Millipore，Bedford，Massachusetts)膜製成之96-孔板的各孔用100微升甲醇濕潤且利用施加至Multiscreen真空歧管(Millipore，Bedford，Massachusetts)上之真空將液體吸過PVDF膜。將PVDF膜用300微升水洗滌3次。然後各孔用50微升RCM緩衝液(8M Urea、360mM Tris、3.2mM EDTA，pH 8.6)洗滌。將30至40微克之抗體上樣至含有10微升RCM緩衝液之孔中。然後藉由施加真空將該孔中液體吸過膜，且隨後將該膜用50微升RCM緩衝液洗滌兩次。二硫橋鍵之還原藉由加入50微升存於RCM之0.1M二硫蘇糖醇並在37℃培育1小時實施。
還原後，施加真空以自孔中去除二硫蘇糖醇。各孔用300微升水洗滌3次，然後藉由加入50微升存於RCM緩衝液之0.1M碘乙酸並在室溫於暗處培育30分鐘實施半胱胺酸殘基之羧甲基化作用。
羧甲基作用後，用真空吸各孔且隨後用300微升水洗滌3次。然後藉由在室溫培育100微升1%之聚乙烯吡咯啶酮360水溶液1小時開封阻PVDF膜，以防止糖苷內切酶之吸附。然後藉由溫和真空去除阻斷劑之後用300微升水洗滌三次。
藉由加入2.5mU肽-N-糖化酶F(重組N-聚糖酶，GLYKO，Novato，CA)及0.1mU唾液酸酶(GLYKO，Novato，CA)來釋放N連接之寡糖，以去除任何潛在帶電荷之單糖殘基，終體積為25微升(存於20mM NaHCO3，pH 7.0)。消化在37℃實施3小時。
用於溶液中抗體之寡糖釋放方法
將40至50微克之抗體與2.5mU PNGaseF(Glyko，U.S.A.)混合於2 mM Tris，pH 7.0中，終體積為25微升，且將該混合物在37℃培育3小時。
利用糖苷內切酶H消化PNGaseF釋放之寡糖以將雜合體二等分寡糖結構分配至MALDI/TOF-MS中性寡糖峰
隨後用糖苷內切酶H(EC 3.2.1.96)消化PNGaseF釋放之寡糖。對於EndoH消化，將15mU EndoH(Roche，Switzerland)加入PNGaseF消化液(上述用於存於溶液之抗體的方法)以得到30微升之終體積，並將該混合物在37℃下培育3小時。EndoH在N連接之寡糖之殼二糖核心的N-乙醯葡糖胺殘基之間進行裂解。該酵素可僅消化寡聚甘露糖及大部分雜合體型聚糖，而複合體型寡糖未受到水解。
用於MALDI/TOF-MS之樣品的製備
加入乙酸使終濃度達150mM，之後將含有釋放之寡糖的酶促消化液進一步在室溫培育3小時，且隨後使之流過裝入micro-bio-spin層析管柱(BioRad，Switzerland)之0.6毫升之陽離子交換樹脂(AG50W-X8樹脂，氫型，100至200目，BioRad，Switzerland)以去除陽離子及蛋白質。將1微升所得樣品加至不銹鋼製目標板中，且在該板上與1微升sDHB基質混合。sDHB基質係藉由將2毫克2,5-二羥基苯甲酸加0.1毫克5-甲氧基水楊酸溶解在1毫升乙醇/10mM氯化鈉水溶液1：1(v/v)中製備。對樣品實施空氣乾燥，加入0.2微升乙醇，並最終使樣品在空氣中重結晶。
MALDI/TOF-MS
用於獲取質譜之MALDI-TOF質譜儀係Voyager Elite(Perspective Biosystems)。該儀器以線性組態作業，具有20kV之加速度及80ns之延遲。使用寡糖標準之外部校準進行離子之質量數確定。對來自200次雷射發射之波譜求和以獲得最終之波譜。
全血B細胞消耗
將495微升將來自健康供體之肝素化血液等分至5毫升聚苯乙烯管中，加入5微升100倍濃縮之抗體樣品(終濃度為1至1000奈克/毫升)或僅加入PBS且將各管在37℃下培育。24小時後，將50微升血液轉移至新鮮管中並用抗-CD3-FITC、抗-CD19-PE及抗-CD45-CyChrome(Becton-Dickinson)在室溫於暗處染色15分鐘。分析之前，在各管中加入500微升FACS緩衝液(含有2% FCS及5mM EDTA之PBS)。以流式細胞法藉由對CD45-CyChrome設定臨限值分析血液樣品之CD3-FITC及CD19-PE螢光。藉由繪示CD19+ B細胞對CD3+ T細胞之比例來確定B細胞消耗。
抗-CD20抗體對Raji細胞之結合
將存於180微升FACS緩衝液(含有2% FCS及5mM EDTA之PBS)之200,000個細胞轉移至5毫升聚苯乙烯管中。接下來，加入20微升10倍濃縮之抗-CD20抗體樣品(終濃度為1至5000奈克/毫升)或僅加入PBS，且將各管在4℃培育30分鐘。隨後，樣品用FACS緩衝液洗滌兩次並以300 x g離心3分鐘。吸走上清液並使細胞吸收於100微升FACS緩衝液中。然後，加入1微升抗-Fc-特異性F(ab')2-FITC片段(Jackson Immuno Research Laboratories，USA)並將各管在4℃培育30分鐘。樣品用FACS緩衝液洗滌兩次並使之吸收於500微升含有0.5微克/毫升PI之FACS緩衝液中，供流式細胞術分析使用。藉由繪示針對抗體濃度之幾何平均螢光來確定結合。
實例2
高同源性接受體方法
藉由對小鼠B-ly1蛋白質序列與人類種系序列之集合進行比對並挑選顯示最高序列一致性之人類序列來實施高同源性抗體接受體框架搜索。此處，選擇來自VBase資料庫之序列VH1_10(基因座1-e，Acc.No.DP-88)作為重鏈框架接受體序列，且選擇來自IMGT資料庫之 IGKV2-40(Acc.No X59314)序列作為輕鏈之框架接受體。在該兩個接受體框架上，接入小鼠重鏈及輕鏈可變結構域的3個互補決定區(CDR)。由於框架4區不係種系V基因可變區的一部分，故該位置之比對需單獨進行。區對於重鏈選擇JH4，且對於輕鏈選擇JK4區。經設計之免疫球蛋白結構域的分子模型構建顯示，CDR外側有一點潛在需要鼠類胺基酸殘基而非人類胺基酸殘基。在人類框架中重新引入鼠類胺基酸殘基會產生所謂回復突變。舉例而言，27 Kabat位之人類接受體胺基酸殘基回復突變成酪胺酸殘基。人類化抗體變體經設計以納入或刪去回復突變。人類化抗體輕鏈並不需要任何回復突變。設計好蛋白質序列後，如下文詳述合成編碼此等蛋白質之DNA序列。
混合框架法
為避免在人類接受體框架之關鍵胺基酸殘基位置(對保留良好抗原結合親和力或抗體功能具有關鍵作用)引入回復突變，研究確定完整框架區1(FR1)或框架區1(FR1)與2(FR2)一起是否能夠由已在彼等天然人類種系序列之重要位置具有供體殘基或功能等效殘基之人類抗體序列替換。就此目的，將小鼠B-ly1序列之VH框架1及2單獨與人類種系序列進行比對。此處，最高序列一致性並不重要，且對於接受體框架之選擇並未使用最高序列一致性，取而代之設想若干關鍵殘基之匹配更重要。彼等關鍵殘基包括殘基24、71及94(Kabat編號)，亦及彼等27、28及30位(Kabat編號)殘基，該等殘基位於Kabat之CDR1定義以外，但常與抗原結合有關。選擇IMGT序列IGHV3-15(Acc No X92216)作為適宜者。已設計好蛋白質序列後，如下文詳述合成編碼此等蛋白質之DNA序列。使用此方法，為保留良好的抗原結合水平，對於輕鏈或重鏈不需要回復突變。
抗體基因之合成
已設計好人類化抗體V區之胺基酸序列後，須合成DNA序列。各 個框架區之DNA序列資料可在人類種系序列資料庫中找到。CDR區之DNA序列係取自相應鼠類cDNA資料。利用此等序列，可實質組裝成完整DNA序列。有此DNA序列資料後，藉由引入沉默突變、形成限制內切酶之識別位點將診斷限制酶切位點引入實際序列中。為獲得物理DNA鏈，實施基因合成(例如，Wheeler等人，1995)。在此方法中，由感興趣基因設計寡核苷酸，以使一系列寡核苷酸源自編碼鏈，且另一系列源自非編碼鏈。每一寡核苷酸之3'及5'端(行中最靠前及最靠後者除外)始終顯示為源自相對鏈的兩個引物之互補序列。在將此等寡核苷酸置於適用於任何熱穩定聚合酶之反應緩衝液中並加入Mg2+、dNTP及DNA聚合酶時，每一寡核苷酸自其3'端延伸。一引物新形成之3'端隨後與相對鏈之下一引物退火，且進一步在適合模板依賴性DNA鏈延伸之條件下延伸其序列。將最終產物選殖入用於大腸桿菌繁殖之習用載體中。
抗體產生
使用標準分子生物學技術將人類重鏈及輕鏈前導序列(用於分泌)加在上述可變區序列的上游，且隨後將此等分別連在人類IgG1κ恆定重鏈及輕鏈序列的上游。將所得全長抗體重鏈及輕鏈DNA序列亞選殖入哺乳動物表現載體(一個用於輕鏈且一個用於重鏈)中處於MPSV啟動子控制下並位於合成之polyA位點上游，每一載帶有EBV OriP序列，如上文實例1所述。如上文實例1所述產生抗體，即用哺乳動物抗體重鏈及輕鏈表現載體共轉染HEK293-EBNA、轉染後5至7天收集條件培養基並藉由蛋白質A親和層析、隨後藉由離子交換層析且最終藉由尺寸排除層析步驟純化分泌之抗體以分離到純淨之單體IgG1抗體。將抗體調配在25mM磷酸鉀、125mM氯化鈉、100mM甘胺酸溶液(pH 6.7)中。人類化抗體變體之糖改造變體係藉由共轉染抗體表現載體與GnT-III糖基轉移酶表現載體或與GnT-III表現載體加高爾基體甘 露糖苷酶II表現載體產生，如上文實例1對嵌合抗體所述。如上文對非糖改造抗體所述者純化及製備糖改造抗體。如下文所述藉由MALDI/TOF-MS分析連接至抗體Fc區之寡糖。
寡糖分析
根據用於溶液中抗體之寡糖釋放方法，將40至50微克抗體與2.5mU PNGaseF(Glyko，U.S.A.)混合於2mM Tris，pH7.0中，使終體積為25微升，並將該混合物在37℃下培育3小時。
用於MALDI/TOF-MS之樣品的製備
加入乙酸使終濃度達150mM，之後將含有釋放之寡糖的酶促消化液在室溫下進一步培育3小時，且隨後使之流過裝入micro-bio-spin層析管柱(BioRad，Switzerland)之0.6毫升陽離子交換樹脂(AG50W-X8樹脂，氫型，100至200目，BioRad，Switzerland)以去除陽離子及蛋白質。將1微升所得樣品加至不銹鋼目標板中，並於該板上與1微升sDHB基質混合。sDHB基質係藉由將2毫克2,5-二羥基苯甲酸加0.1毫克5-甲氧基水楊酸溶解在1毫升乙醇/10mM氯化鈉水溶液1：1(v/v)中製備。對樣品實施空氣乾燥，加入0.2微升乙醇，並最終使樣品在空氣下重新結晶。
MALDI/TOF-MS
用於獲取質譜之MALDI-TOF質譜儀係Voyager Elite(Perspective Biosystems)。該儀器以線性組態作業，具有20kV之加速度及80ns之延遲。使用寡糖標準之外部校準進行離子之質量數確定。對來自200次雷射發射之波譜求和以獲得最終之波譜。
抗原結合分析
使用基於流式細胞術之分析測試純化之單體人類化抗體變體對Raji B-細胞淋巴瘤靶標細胞上人類CD20之結合，如上文實例1中對嵌合B-ly1抗體所述者。
單體IgG1糖變體對NK細胞及FcγRIIIA-表現CHO細胞系之結合
自新鮮分離之外周血單核細胞(PBMC)中分離人類NK細胞，施加負選擇以富集CD16-及CD56-陽性細胞(MACS系統，Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach/Germany)。由CD56表現確定之純度在88至95%之間。將新鮮分離之NK細胞在不含鈣及鎂離子之PBS中(3x105細胞/毫升)於37℃培育20分鐘以去除NK細胞結合IgG。以106細胞/毫升在不同濃度存於PBS(0.1% BSA)之抗-CD20抗體(0、0.1、0.3、1、3、10微克/毫升)存在下培育細胞。洗滌若干次後，藉由與1：200 FITC-結合之F(ab')2山羊抗人類之F(ab')2特異性IgG(Jackson ImmunoReasearch，West Grove，PA/USA)及抗-人類CD56-PE(BD Biosciences，Allschwil/Switzerland)一起培育來檢測抗體結合。加入濃度為10微克/毫升之抗-FcγRIIIA 3G8 F(ab')2片段(Ancell，Bayport，MN/USA)以競爭抗體糖變體(3微克/毫升)之結合。在FACSCalibur(BD Biosciences，Allschwil/Switzerland)上對CD56-陽性細胞確定有關結合之抗體變體的螢光強度。藉由電穿孔法(280V，950μF，0.4公分)用編碼FcγRIIIA-Val158 α-鏈及γ-鏈之表現載體轉染CHO細胞。藉由加入6微克/毫升嘌呤黴素選擇轉染子並由FACS對106個細胞使用10微升FITC-結合之-抗-FcγRIII 3G8單株抗體(BD Biosciences，Allschwil/Switzerland)分析穩定純系。IgG1對FcγRIIIA-Val158-表現CHO細胞之結合類似於上文對NK細胞結合所述者實施。
ADCC分析
使用人類外周血單核細胞(PBMC)作為效應細胞並使用Histopaque-1077(Sigma Diagnoticss公司，St.Louis，MO63178 USA)且實質按照製造商說明書製備。簡言之，用肝素化注射器採集志願者之靜脈血。血液用PBS(不含有Ca++或Mg++)稀釋1：0.75至1.3並於Histopaque-1077上分層。將梯度以400 x g在室溫(RT)無間斷離心30分 鐘。收集含有PBMC中間相並用PBS(50毫升/來自兩個梯度之細胞)洗滌並藉由RT下以300 x g離心10分鐘收集。用PBS重懸沉澱後，計數PBMC並藉由RT下以200 x g離心10分鐘再次洗滌。然後將細胞重懸於適宜培養基中供後續程序使用。
用於ADCC分析之效應細胞：靶標物比對於PBMC及NK細胞分別係25：1及10：1。在AIM-V培養基中製備適宜濃度之效應細胞以在圓底96孔板之每孔中加入50微升。靶標細胞系生長於含有10% FCS之DMEM的人類B淋巴瘤細胞(例如，Raji細胞)。靶標細胞在PBS中洗滌，計數並以3x105/毫升重懸於AIM-V以在每微孔之100微升中有30,000個細胞。將抗體稀釋於AIM-V中，向預先鋪板之靶標細胞中加入50微升並使之在RT下於10分鐘內結合至靶標上。然後加入效應細胞並將培養板在37℃下於含有5% CO2之加濕氣氛中培育4小時。藉由使用細胞毒性檢測套組(Cytotoxicity Detection Kit，Roche Diagnostics，Rotkreuz，Switzerland)自受損細胞量測乳酸脫氫酶(LDH)釋放評定靶標細胞之殺傷。培育4小時後，將培養板以800 x g離心。100微升將來自各孔之上清液轉移至新的透明平底96孔板中。將100微升來自套組之有色受質緩衝液加入各孔中。在ELISA讀板器中於490奈米下在至少10分鐘內使用SOFTmax PRO軟體(分子Devices，Sunnyvale，CA94089，USA)確定顏色反應之Vmax值。僅含有靶標及效應細胞但不含抗體之空中量測自發LDH釋放。自僅含有靶標細胞及1% Triton X-100之孔測定最大釋放。特異性抗體調介之殺傷的百分比如下計算：((x-SR)/(MR-SR)*100，其中x係具體抗體濃度下Vmax之平均值，SR係自發釋放之Vmax的平均值且MR係最大釋放之Vmax的平均值。
補體依賴性細胞毒性分析
計數靶標細胞，用PBS洗滌，以1x106個細胞/毫升重懸於AIM- V(Invitrogen)。於平底96孔板之各孔中鋪板50微升細胞。於AIM-V中製備抗稀釋液並以50微升加至細胞中。使抗體在室溫下於10分鐘內結合至細胞上。剛剛解凍人類血清補體(Quidel)，用AIM-V稀釋3倍並以50微升加至各孔中。兔補體(Cedarlane Laboratories)如製造商所述製備，用AIM-V稀釋3倍並以50微升加至各孔中。作為對照，將補體源於加入分析前在56℃下加熱30分鐘。
將分析培養板在37℃培育2小時。細胞殺傷藉由量測LDH釋放確定。簡言之，將該等培養板以300 x g離心3分鐘。將每孔50微升上清液轉移至新96孔板中並加入50微升來自細胞毒性套組(Roche)之分析試。利用以ELISA讀板器進行之動力學量測確定與上清液中LDH濃度相對應之Vmax。最大釋放藉由在1% Trition X-100存在下培育細胞確定。
全血B-細胞消耗分析
如上文實例1所述進行全血中抗-CD20抗體之正常B-細胞消耗。
凋亡分析
以10微克/毫升(相對於抗原結合之飽和條件)將抗體與靶標細胞(靶標細胞濃度為5x105細胞/毫升)過夜(16至24小時)培育藉此分析抗體之凋亡效力。樣品用AnnV-FITC染色並藉由FACS分析。分析一式三份實施。
藉由流式細胞術根據凋亡標記物(如膜聯蛋白V及磷脂醯絲胺酸)之出現實施檢測。陰性對照(無凋亡誘發)不包含任何抗體，而僅含有磷酸緩衝鹽溶液。陽性對照(最大凋亡)含有5微莫耳強凋亡誘導物喜樹鹼(CPT)。
結果與討論
對抗體變體B-HH1、B-HH2、B-HH3(與人類化B-ly1輕鏈(BKV1)複合)與親本嵌合抗體chB-ly1之人類CD20抗原抗體之結合的比較(上 文實例1所述)顯示，所有抗體均具有類似之EC50值，但B-HH1構造以較變體B-HH2及B-HH3(圖11)為低之強度/化學計量結合。B-HH1可能因其人類CDR1及CDR2區(Kabat定義)以及28位(Kabat編號)之Ala/Thr多態性而不同於B-HH2及B-HH3部分。此表明，28位、完整CDR1及/或完整CDR2對抗體/抗原相互作用具有重要性。
B-HL1、B-HH1以及嵌合chB-ly1親本抗體之比較顯示，在B-HL1構造中缺乏任何結合活性，且B-HH1與B-ly1相比具有約一半之結合強度/化學計量(圖12)。B-HL1以及B-HH1二者根據源自人類VH1類之接受體框架設計。在其他差異中，B-HL1構造之71位(Kabat編號)具有明顯差異，表明其對抗原結合之推定重要性。71位胺基酸係決定重鏈CDR2之正則環結構之殘基之一。此處，丙胺酸或其功能等效物(例如，白胺酸、纈胺酸或蘇胺酸(參見例如，Morea等人，Methods 20：267-279(2000)))似乎對抗原結合具有重要性，而精胺酸似乎不利於抗原結合。
在比較圖2及9至13之抗原結合數據時，BHH2-BKV1、BHL8-BKV1及BHL11-BKV1變體在不同人類化抗體變體測試中顯示出對人類細胞表面上人類CD20之良好結合親和力。儘管對抗原結合具有類似EC50值，但此等變體在其誘發CD20陽性靶標細胞中凋亡之特性中明顯不同(參見圖4至6、14、15)。由於原始B-ly1抗體顯示出低凋亡誘發，因此本發明發明人確定了親本B-ly1抗體構造與B-HL8及B-HH2構造之間的差異。在B-HH2重鏈中鑑別出7個不存在於B-HL8或親本B-ly1重鏈中之殘基：Gln1、Ala9、Val11、Lys12、Ser16、Val20以及Met48。所有7個此等殘基均位於VH結構域之框架區。除Gln1外，不大可能發生直接抗原接觸。為確定單個此等殘基是否會單獨響應於新形成之凋亡誘導性質，故產生了7個B-HL8重鏈變體，其可能會恢復B-HH2構造之凋亡特性：B-HL11(具有突變E1Q)、B-HL12(G9A， V48M)、B-HL13(L11V，V48M)、B-HL14(V12K，V48M)、B-HL15(G16S，V48M)、B-HL16(L20V，V48M)以及B-HL17(V48M)。參見SEQ ID NO：32、34、36、38、40、42及44(呈現於序列表之該等序列並未根據Kabat編號，但其Kabat編號可易於由普通技術者確定)。此等變體之抗原結合性質就EC50值及化學計量而言並無明顯差異(參見2)。然而，在其誘發凋亡能力方面觀察到顯著差異(圖4至6、14、15及24)。具有L11V、V48M改質之構造，即B-HL13明顯增強了誘發凋亡之能力(參見圖24)。然而單獨的V48M改質不具有顯著效應(參見圖5)。因此，11及12 Kabat位之殘基以最大程度影響到凋亡特性。此等殘基不會直接影響抗原結合，而是影響VH與CH1結構域之間的介面且從而經由肘角度之改質起作用。
B-HL4構造係源自B-HH2抗體，其中用人類種系序列IGHV1-45(Acc No X92209)替換B-HH2之FR1。此構造顯示出大大減弱之抗原結合能力，儘管僅在FR1內4個位置具有不同胺基酸。此等殘基位於2、14、28及30位(Kabat編號)。在此等位置中，28及30位可能為有影響之位置，乃因其係Chothia CDR1定義的一部分。在變體B-HH8及9(二者均具有BKV1輕鏈)中，與親本B-ly1序列相比28及30位經改質。如圖22中所見，若蘇胺酸28或蘇胺酸30存在，結合性質並不會明顯受損(圖22)。在人類化輕鏈中未引入回復突變，該輕鏈中接入完整Kabat CDR1、CDR2及CDR3。在凋亡誘發方面(參見圖14、15及21)，最有效之變體係人類化B-ly1變體BHH2-BKV1(甚至較原始chB-ly1更有效且較具有利妥昔單抗一致序列之抗體，C2B8有效的多)。可恢復增強之凋亡的其他人類化變體係：B-HL13及B-HL14(BHL8之衍生物)、BHH8(「混合框架」)、BHH9(「混合框架」，具有一個回復突變以檢查S30T之影響)以及B-HH6(B-HH2之M34I衍生物)。變體BHH4係另一未引入額外非人類序列之人類化B-ly1變體。變體B-HH5、B-HH6及B- HH7係具有部分人類化Kabat CDR1區之B-HH2構造的衍生物。
人類化B-ly1抗體之重要性質為，其係II型抗-CD20抗體，如Cragg,M.S.及Glennie,M.J.，Blood 103(7)：2738-2743(2004年4月)所定義。因此其在與CD20結合時不會誘發產生對自CD20+人類細胞表面上以非離子型去垢劑提取CD20的任何明顯之抗性，該提取使用Polyak,M.J.及Deans,J.P.，Blood 99(9)：3256-3262(2002)中就此目的闡述之分析進行。與C2B8抗體(另一具有利妥昔單抗一致序列之抗-CD20抗體(參見頒予Reff之美國專利公開案第2003 0003097號))相比，其誘發明顯減弱之對CD20非離子型去垢劑提取之抗性。如對II型抗-CD20抗體所期望之，人類化B-ly1不具有任何明顯之補體調介之溶解活性且展示出較抗-CD20抗體C2B8(具有利妥昔單抗一致序列之嵌合IgG1)低得多之補體調介之溶解活性。人類化B-ly1抗體(變體B-HH2 B-KV1)的另一重要性質為，其在同型凝集分析中相當有效。在此分析中，將CD20陽性人類細胞(Daudi細胞)於細胞培養基中在37℃於5% CO2氣氛中在Deans等人詳述之哺乳動物細胞培養箱中培育多達24小時，其中抗體濃度為1微克/毫升且平行濃度為5微克/毫升。作為比較，細胞之平行對照培育在一致條件下用抗-CD20抗體，C2B8實施。在不同時間點(包括培育8小時及24小時)，使用顯微鏡目測檢查細胞。觀察到，靜置之人類化B-ly1抗體出現強烈的同型凝集，其中聚集體明顯大於彼等藉由加入C2B8對照抗體誘發者。此外，且與為II型抗-CD20抗體相一致，在CD20陽性人類細胞與人類化B-ly1抗體一起培育時，其相對於一致條件下之對照(使用具有利妥昔單抗一致序列之C2B8嵌合IgG1抗體)誘發更高水平之凋亡。
人類化抗體之糖改造變體由在哺乳動物細胞中共表現GnTIII糖基轉移酶與抗體基因產生。此引起了抗體Fc區上連接之非岩藻糖基化寡糖(包括二等分非岩藻糖基化寡糖)部分的增加，如已在WO 2004/065540中闡述之(圖17至19)。相對於非糖改造抗體且相對於C2B8抗體，該等糖改造抗體具有明顯更高水平之對人類FcγRIII受體之結合(圖20)亦及更強之ADCC活性(圖16)。該人類化B-ly1抗體在全血分析中誘發人類B-細胞消耗方面亦較對照C2B8抗體更有效(圖16)。對於非糖改造之B-ly1抗體及其糖改造形式二者均如此。糖改造抗體在全血分析中消耗B細胞方面較C2B8對照抗-CD20抗體更有效約1000倍。此比較對於B-ly1抗體非糖改造形式及糖改造人類化形式二者均具有重要性，乃因在將Fc受體依賴性活性(例如ADCC加補體調介之溶解加凋亡誘發)組合之分析中顯示，兩種形式之B-ly1明顯較C2B8更有效，但兩種形式之B-ly1具有顯著降低之補體調介之溶解活性。ADCC、Fc受體依賴性細胞殺傷活性及凋亡誘發以人類化B-ly1抗體變體的此優良活性形式出現。此外，在凋亡分析中，此II型抗-CD20抗體之糖改造及非糖改造形式二者均有效，其中具有增強之對Fcγ受體的結合親和力之Fc-經改造變體在凋亡誘發方面較非Fc-經改造變體更有效，且所有變體均明顯較對照抗體C2B8更有效。II型抗-CD20抗體調介之增強之同型凝集及凋亡誘發的精確機制仍不清楚且共存的對CD20陽性細胞表面其他分子(例如Fcγ受體)之結合會影響此重要性質。因此展示如下事實具有重要性：已在其Fc區就增強之Fcγ受體(包括FcγRIII)結合親和力接受改造且具有相關之ADCC活性增強的型II抗-CD20抗體仍能夠誘發強凋亡(甚至強於非Fc-經改造抗體)及同型凝集。凋亡誘發具有重要作用，乃因在活體內，體內存在可發現目標CD20陽性細胞但接近FcγRIII陽性細胞較血液中更困難(例如，淋巴結)之部位。在該等部位，抗-CD20抗體自身進行之凋亡誘發對於抗-CD20抗體療法在人類中的良好功效會具有決定性作用，對於經由B-細胞消耗法進行之血液學惡性腫瘤(例如非何傑金氏病淋巴瘤及B-細胞慢性淋巴細胞白血病)之治療及自身免疫疾病(例如類風濕性關節痛 及狼瘡)之治療二者均如此。人類化Fc-經改造II型抗-CD20抗體的增強之對FcγRIII的結合親和力及更強之ADCC亦會係此等療法相當重要之特徵。最後，此II型抗-CD20抗體(包括人類化及Fc-經改造變體)的減弱之或可忽略之補體調介之溶解活性亦會具有重要性，乃因已證實抗-CD20抗體的較強之補體激活與增強之不利之副作用有關。
實例3
為進一步檢查影響凋亡活性之殘基，生成6個BHH2重鏈變體：BHH2-A(V11L)(SEQ ID NO：124)、BHH2-B(K12V)(SEQ ID NO：125)、BHH2-C(A9G)(SEQ ID NO：126)、BHH2-D(E10G)(SEQ ID NO：127)、BHH2-E(T110I)(SEQ ID NO：128)以及BHH2-F(S112I)(SEQ ID NO：129)。藉由本文上文所述方法對此等變體構進行有關靶標抗原(CD20)結合之測試。所有6個變體構造均保留結合活性。
亦藉由本文上文所述方法對此等重鏈變體構造實施有關凋亡作用之測試。該等構造中的5個：BHH2-B、BHH2-C、BHH2-D、BHH-2E、及BHH-2F具有與BHH2親本構造相同之凋亡潛力。然而，BHH2-A(V11L)誘發凋亡之能力與BHH2相比明顯降低(參見圖23)。
亦藉助產生以下5個變體檢查人類化B-ly1輕鏈(BKV1)中單胺基酸取代之凋亡作用：BKV-10(P40A)(SEQ ID NO：130)、BKV-11(A80P)(SEQ ID NO：131)、BKV-12(V83F)(SEQ ID NO：132)、BKV-13(E105A)(SEQ ID NO：133)以及BKV-14(I106A)(SEQ ID NO：134)。藉由本文上文所述方法對構造BKV-11、BKV-12、BKV-13以及BKV-14實施有關靶標抗原(CD20)結合之測試，且確定所有4個均保留結合活性。亦藉由本文上文所述方法對此等4個輕鏈變體構造實施有關凋亡作用之測試。BKV-11、BKV-12及BKV-13之凋亡潛力未因其各自取代而改變。然而，BKV-14與BKV1相比展示出降低之誘發凋亡之能力(參見例如，圖25)。
本說明書中提到的所有出版物，例如教科書、雜誌文章、GenBank條目及公開之申請案以及專利申請案均以引用方式併入本文中，其併入程度如同明確地及單獨地指出將每一個別出版物或專利申請案以引文方式併入。
<110> 瑞士商克雷雅生物公司
<120> 具有經改變細胞傳訊活性之改質抗原結合分子
<130> 1975.056TW01
<140> 095131256
<141> 2005-08-25
<150> US 60/711,454
<151> 2005-08-26
<160> 134
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH1構造
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<213> 人工序列
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<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH1構造
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH2構造
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<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH2構造
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<213> 人工序列
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<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH3構造
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<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH3構造
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<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH4構造
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<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH4構造
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH5構造
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<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH5構造
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<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH6構造
<400> 11
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<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH6構造
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Figure TWI615407BD00035
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH7構造
<400> 13
Figure TWI615407BD00036
<210> 14
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH7構造
<400> 14
Figure TWI615407BD00037
Figure TWI615407BD00038
Figure TWI615407BD00039
<210> 15
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH8構造
<400> 15
Figure TWI615407BD00040
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH8構造
<400> 16
Figure TWI615407BD00041
<210> 17
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH9構造
<400> 17
Figure TWI615407BD00042
Figure TWI615407BD00043
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH9構造
<400> 18
Figure TWI615407BD00044
<210> 19
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL1構造
<400> 19
Figure TWI615407BD00045
<210> 20
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL1構造
<400> 20
Figure TWI615407BD00046
Figure TWI615407BD00047
<210> 21
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL2構造
<400> 21
Figure TWI615407BD00048
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL2構造
<400> 22
Figure TWI615407BD00049
Figure TWI615407BD00050
<210> 23
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL3構造
<400> 23
Figure TWI615407BD00051
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL3構造
<400> 24
Figure TWI615407BD00052
<210> 25
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL4構造
<400> 25
Figure TWI615407BD00053
Figure TWI615407BD00054
<210> 26
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL4構造
<400> 26
Figure TWI615407BD00055
<210> 27
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL8構造
<400> 27
Figure TWI615407BD00056
<210> 28
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL8構造
<400> 28
Figure TWI615407BD00057
Figure TWI615407BD00058
<210> 29
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL10構造
<400> 29
Figure TWI615407BD00059
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL10構造
<400> 30
Figure TWI615407BD00060
Figure TWI615407BD00061
<210> 31
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL11構造
<400> 31
Figure TWI615407BD00062
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL11構造
<400> 32
Figure TWI615407BD00063
<210> 33
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL12構造
<400> 33
Figure TWI615407BD00064
Figure TWI615407BD00065
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL12構造
<400> 34
Figure TWI615407BD00066
Figure TWI615407BD00067
<210> 35
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL13構造
<400> 35
Figure TWI615407BD00068
<210> 36
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL13構造
<400> 36
Figure TWI615407BD00069
Figure TWI615407BD00070
<210> 37
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL14構造
<400> 37
Figure TWI615407BD00071
<210> 38
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL14構造
<400> 38
Figure TWI615407BD00072
<210> 39
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL15構造
<400> 39
Figure TWI615407BD00073
Figure TWI615407BD00074
<210> 40
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL15構造
<400> 40
Figure TWI615407BD00075
Figure TWI615407BD00076
<210> 41
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL16構造
<400> 41
Figure TWI615407BD00077
<210> 42
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL16構造
<400> 42
Figure TWI615407BD00078
Figure TWI615407BD00079
<210> 43
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL17構造
<400> 43
Figure TWI615407BD00080
<210> 44
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HL17構造
<400> 44
Figure TWI615407BD00081
<210> 45
<211> 57
<212> DNA
<213> 人類
<400> 45
Figure TWI615407BD00082
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> 人類
<400> 46
Figure TWI615407BD00083
<210> 47
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-KV1
<400> 47
Figure TWI615407BD00084
<210> 48
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-KV1
<400> 48
Figure TWI615407BD00085
Figure TWI615407BD00086
<210> 49
<211> 66
<212> DNA
<213> 人類
<400> 49
Figure TWI615407BD00087
<210> 50
<211> 22
<212> PRT
<213> 人類
<400> 50
Figure TWI615407BD00088
<210> 51
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之I-HHD構造
<400> 51
Figure TWI615407BD00089
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之I-HHD構造
<400> 52
Figure TWI615407BD00090
Figure TWI615407BD00091
<210> 53
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之M-HHA構造
<400> 53
Figure TWI615407BD00092
<210> 54
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之M-HHA構造
<400> 54
Figure TWI615407BD00093
Figure TWI615407BD00094
<210> 55
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IF5-VH-小鼠/人類嵌合多肽
<400> 55
Figure TWI615407BD00095
Figure TWI615407BD00096
<210> 56
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B9E9-VH-小鼠/人類嵌合多肽
<400> 56
Figure TWI615407BD00097
Figure TWI615407BD00098
<210> 57
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C2B8-VH-小鼠/人類嵌合多肽
<400> 57
Figure TWI615407BD00099
<210> 58
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H7-VH-小鼠/人類嵌合多肽
<400> 58
Figure TWI615407BD00100
<210> 59
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B-ly1-VH-小鼠/人類嵌合多肽
<400> 59
Figure TWI615407BD00101
<210> 60
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F2-VH-小鼠/人類嵌合多肽
<400> 60
Figure TWI615407BD00102
Figure TWI615407BD00103
<210> 61
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7D8-VH-小鼠/人類嵌合多肽
<400> 61
Figure TWI615407BD00104
Figure TWI615407BD00105
<210> 62
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11B8-VH-小鼠/人類嵌合多肽
<400> 62
Figure TWI615407BD00106
Figure TWI615407BD00107
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 63
Figure TWI615407BD00108
<210> 64
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 64
Figure TWI615407BD00109
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之序列binding molecule
<400> 65
Figure TWI615407BD00110
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 66
Figure TWI615407BD00111
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 67
Figure TWI615407BD00112
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 68
Figure TWI615407BD00113
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 69
Figure TWI615407BD00114
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 70
Figure TWI615407BD00115
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 71
Figure TWI615407BD00116
<210> 72
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 72
Figure TWI615407BD00117
<210> 73
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 73
Figure TWI615407BD00118
<210> 74
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 74
Figure TWI615407BD00119
<210> 75
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 75
Figure TWI615407BD00120
<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 76
Figure TWI615407BD00121
<210> 77
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 77
Figure TWI615407BD00122
<210> 78
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 78
Figure TWI615407BD00123
<210> 79
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之8至13 Kabat位之Vh序列
<400> 79
Figure TWI615407BD00124
<210> 80
<211> 987
<212> DNA
<213> 人類
<400> 80
Figure TWI615407BD00125
Figure TWI615407BD00126
<210> 81
<211> 328
<212> PRT
<213> 人類
<400> 81
Figure TWI615407BD00127
Figure TWI615407BD00128
Figure TWI615407BD00129
<210> 82
<211> 618
<212> DNA
<213> 人類
<400> 82
Figure TWI615407BD00130
<210> 83
<211> 613
<212> DNA
<213> 人類
<400> 83
Figure TWI615407BD00131
<210> 84
<211> 546
<212> DNA
<213> 人類
<400> 84
Figure TWI615407BD00132
Figure TWI615407BD00133
<210> 85
<211> 460
<212> DNA
<213> 人類
<400> 85
Figure TWI615407BD00134
<210> 86
<211> 877
<212> DNA
<213> 人類
<400> 86
Figure TWI615407BD00135
Figure TWI615407BD00136
<210> 87
<211> 557
<212> DNA
<213> 人類
<400> 87
Figure TWI615407BD00137
<210> 88
<211> 727
<212> DNA
<213> 人類
<400> 88
Figure TWI615407BD00138
Figure TWI615407BD00139
<210> 89
<211> 514
<212> DNA
<213> 人類
<400> 89
Figure TWI615407BD00140
<210> 90
<211> 412
<212> DNA
<213> 人類
<400> 90
Figure TWI615407BD00141
<210> 91
<211> 870
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> n is a,c,g,or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (824)..(824)
<223> n is a,c,g,or t
<400> 91
Figure TWI615407BD00142
Figure TWI615407BD00143
<210> 92
<211> 724
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<222> (560)..(560)
<223> n is a,c,g,or t
<400> 92
Figure TWI615407BD00144
Figure TWI615407BD00145
<210> 93
<211> 288
<212> DNA
<213> 人類
<400> 93
Figure TWI615407BD00146
<210> 94
<211> 626
<212> DNA
<213> 人類
<400> 94
Figure TWI615407BD00147
<210> 95
<211> 299
<212> DNA
<213> 人類
<400> 95
Figure TWI615407BD00148
<210> 96
<211> 410
<212> DNA
<213> 人類
<400> 96
Figure TWI615407BD00149
<210> 97
<211> 700
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a,c,g,or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(46)
<223> n is a,c,g,or t
<400> 97
Figure TWI615407BD00150
<210> 98
<211> 650
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<222> (621)..(621)
<223> n is a,c,g,or t
<400> 98
Figure TWI615407BD00151
Figure TWI615407BD00152
<210> 99
<211> 388
<212> DNA
<213> 人類
<400> 99
Figure TWI615407BD00153
<210> 100
<211> 294
<212> DNA
<213> 人類
<400> 100
Figure TWI615407BD00154
<210> 101
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 101
Figure TWI615407BD00155
<210> 102
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 102
Figure TWI615407BD00156
<210> 103
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 103
Figure TWI615407BD00157
<210> 104
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 104
Figure TWI615407BD00158
Figure TWI615407BD00159
<210> 105
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 105
Figure TWI615407BD00160
<210> 106
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 106
Figure TWI615407BD00161
<210> 107
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 107
Figure TWI615407BD00162
<210> 108
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 108
Figure TWI615407BD00163
<210> 109
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 109
Figure TWI615407BD00164
<210> 110
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 110
Figure TWI615407BD00165
<210> 111
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 111
Figure TWI615407BD00166
<210> 112
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 112
Figure TWI615407BD00167
<210> 113
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 113
Figure TWI615407BD00168
<210> 114
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 114
Figure TWI615407BD00169
<210> 115
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 115
Figure TWI615407BD00170
<210> 116
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 116
Figure TWI615407BD00171
<210> 117
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 117
Figure TWI615407BD00172
<210> 118
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 118
Figure TWI615407BD00173
<210> 119
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 119
Figure TWI615407BD00174
<210> 120
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 120
Figure TWI615407BD00175
<210> 121
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 121
Figure TWI615407BD00176
<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 122
Figure TWI615407BD00177
<210> 123
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之108至113 Kabat位之Vh序列
<400> 123
Figure TWI615407BD00178
<210> 124
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH2A構造
<400> 124
Figure TWI615407BD00179
Figure TWI615407BD00180
<210> 125
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH2B構造
<400> 125
Figure TWI615407BD00181
<210> 126
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH2C構造
<400> 126
Figure TWI615407BD00182
<210> 127
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH2D構造
<400> 127
Figure TWI615407BD00183
Figure TWI615407BD00184
<210> 128
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH2E構造
<400> 128
Figure TWI615407BD00185
Figure TWI615407BD00186
<210> 129
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-HH2F構造
<400> 129
Figure TWI615407BD00187
Figure TWI615407BD00188
<210> 130
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-KV10構造
<400> 130
Figure TWI615407BD00189
<210> 131
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-KV11構造
<400> 131
Figure TWI615407BD00190
<210> 132
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-KV12構造
<400> 132
Figure TWI615407BD00191
<210> 133
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-KV13構造
<400> 133
Figure TWI615407BD00192
Figure TWI615407BD00193
<210> 134
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/人類改質抗原結合分子之B-KV14構造
<400> 134
Figure TWI615407BD00194
Figure TWI615407BD00195

Claims (31)

  1. 一種經修飾之抗-CD20抗體或其抗原結合片段，其中相較於嵌合B-Ly1抗體與CD20複合時，該經修飾之抗體或其抗原結合片段與CD20複合時具有增強之誘發細胞凋亡之能力，且其中該經修飾之抗體或其抗原結合片段包含：第一肽，其包含SEQ ID NO：125、126或127之重鏈可變區序列多肽；及第二肽，其包含SEQ ID NO：48之輕鏈可變區序列。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含第一肽，其包含SEQ ID NO：125之重鏈可變區序列；及第二肽，其包含SEQ ID NO：48之輕鏈可變區序列。
  3. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含第一肽，其包含SEQ ID NO：126之重鏈可變區序列；及第二肽，其包含SEQ ID NO：48之輕鏈可變區序列。
  4. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含第一多肽，其包含SEQ ID NO：127之重鏈可變區序列；及第二多肽，其包含SEQ ID NO：48之輕鏈可變區序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含經糖改質而具有增加之二等分複合體寡糖(bisected complex oligosaccharide)之Fc區。
  6. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含經糖改質(glycoengineer)而具有降低之岩藻糖殘基之Fc區。
  7. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具有N-連接寡糖之Fc區，該N-連接寡糖 係經修飾以增強至少一種效應功能，或增強Fc受體結合親和力，或增強至少一種效應功能及增強Fc受體結合親和力。
  8. 如請求項7之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段Fc區之至少20%之寡糖為二等分非岩藻糖基化(bisected,nonfucosylated)寡醣。
  9. 如請求項7之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc區之至少50%之寡糖為非岩藻糖基化寡醣。
  10. 一種宿主細胞，其表現如請求項5至9中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該宿主細胞包含一或多個編碼該重鏈及輕鏈可變區序列之多核苷酸及至少一個編碼多肽之多核苷酸，該多肽具有β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III活性，其表現量足以糖改質(glycoengineer)Fc區。
  11. 如請求項10之宿主細胞，其中該宿主細胞進一步表現編碼具有甘露糖苷酶II活性之多肽之多核苷酸。
  12. 如請求項10之宿主細胞，其中該宿主細胞所製造之該抗體或其抗原結合片段由於該糖改質作用而展示出增強之Fc受體結合親和力。
  13. 如請求項12之宿主細胞，其中該Fc受體係FcγRIIIA受體。
  14. 如請求項10之宿主細胞，其中該宿主細胞所製造之該抗體或其抗原結合片段由於該糖改質作用而展示出增強之效應功能。
  15. 如請求項14之宿主細胞，其中該增強之效應功能係增強之Fc介導之細胞毒性。
  16. 如請求項14之宿主細胞，其中該增強之效應功能係增強之抗體依賴性細胞毒性。
  17. 如請求項10之宿主細胞，其包含至少一個編碼第一及第二多肽之經轉染多核苷酸，其中該第一及第二多肽為： 第一多肽：包含SEQ ID NO：125、126或127之之重鏈可變區序列；及第二多肽：包含SEQ ID NO：48之輕鏈可變區序列；其中該多核苷酸包含編碼人類免疫球蛋白Fc區之等價區之序列。
  18. 一種醫藥組合物，其包含有效量之如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受載劑。
  19. 一種如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製備治療血液惡性腫瘤或自體免疫疾病之藥物。
  20. 如請求項19之用途，其中該血液惡性腫瘤係B細胞淋巴瘤、非何傑金氏病淋巴瘤或B細胞慢性淋巴細胞白血病。
  21. 如請求項19之用途，其中該自體免疫疾病係類風濕性關節炎或狼瘡。
  22. 如請求項19或20之用途，其中該血液惡性腫瘤係B細胞淋巴瘤。
  23. 一種經分離之多核苷酸，其包含編碼SEQ ID NO：125之重鏈可變區之序列，且進一步包含一編碼SEQ ID NO：48之輕鏈可變區之序列。
  24. 一種經分離之多核苷酸，其包含一編碼SEQ ID NO：126之重鏈可變區之序列，且進一步包含一編碼SEQ ID NO：48之輕鏈可變區之序列。
  25. 一種經分離之多核苷酸，其包含一編碼SEQ ID NO：127之重鏈可變區之序列，且進一步包含一編碼SEQ ID NO：48之輕鏈可變區之序列。
  26. 一種表現載體，其包含如請求項23至25中任一項之多核苷酸。
  27. 一種宿主細胞，其包含如請求項26之表現載體。
  28. 一種於宿主細胞中製造抗-CD20抗體或其抗原結合片段之方法， 該抗-CD20抗體或其抗原結合片段具有含經修飾寡糖之Fc區及經改質而具有增加之效應功能，該方法包含：培養宿主細胞，該宿主細胞係經改質，以表現一或多個編碼該抗體或其抗原結合片段之核酸，及表現至少一個編碼具有β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III活性之多肽之核酸；及分離該抗體或其抗原結合片段；其中該抗體或其抗原結合片段係如請求項5至9中任一項之經修飾抗體或其抗原結合片段。
  29. 如請求項28之方法，其中該宿主細胞係經進一步改質以表現編碼具有甘露糖苷酶II活性之多肽之核酸。
  30. 如請求項28之方法，其中與未經修飾之寡糖相比，該經修飾寡糖具有降低之岩藻糖基化作用。
  31. 如請求項28之方法，其中該宿主細胞所製造之抗體或其抗原結合片段之Fc區具有比例升高之二等分非岩藻糖基化寡醣。
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Families Citing this family (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
NZ556286A (en) 2005-02-07 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
CN101613409B (zh) 2005-06-17 2014-06-04 英克隆有限责任公司 抗-PDGFRα抗体
US20070071745A1 (en) * 2005-08-26 2007-03-29 Pablo Umana Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity
CA2641310C (en) 2006-02-03 2013-08-20 Imclone Systems Incorporated Igf-ir antagonists as adjuvants for treatment of prostate cancer
AR062223A1 (es) * 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
NZ581468A (en) 2007-06-25 2012-09-28 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Methods of modifying antibodies, and modified antibodies with improved functional properties
KR101234436B1 (ko) * 2007-09-05 2013-02-18 로슈 글리카트 아게 유형 ⅰ 및 유형 ⅱ 항-ｃｄ２０ 항체를 사용하는 병용 치료요법
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
US20090110688A1 (en) * 2007-10-24 2009-04-30 Georg Fertig Combination therapy of type ii anti-cd20 antibody with a proteasome inhibitor
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
JP2011507897A (ja) * 2007-12-21 2011-03-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド リツキシマブ抵抗性関節リウマチ患者の治療
WO2009121690A1 (en) * 2008-03-13 2009-10-08 Biotest Ag Agent for treating disease
MX2010010026A (es) * 2008-03-13 2011-03-21 Biotest Ag Agente para tratar enfermedad.
SG190627A1 (en) * 2008-03-13 2013-06-28 Biotest Ag Agent for treating disease
AR072947A1 (es) * 2008-03-25 2010-10-06 Glycart Biotechnology Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 de tipo ii con citotoxicidad, celular dependiente de anticuerpos (ccda) aumentada, composicion farmaceutica, anticuerpo anti-cd20 de tipo ii
SG190572A1 (en) * 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
CA2726087A1 (en) * 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2010153578A (ru) * 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
RU2011104348A (ru) * 2008-07-08 2012-08-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение
SG194362A1 (en) * 2008-09-29 2013-11-29 Biotest Ag Composition for treating disease
AR075982A1 (es) * 2009-03-31 2011-05-11 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo afucosilado y una o mas de las citoquinas seleccionadas de gm- csf humano, m -csf humano y/o il-3 humano y composicion
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
MX2011010169A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-1/anti-c-met.
MX2011010166A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-3/anti-c-met.
US8815242B2 (en) * 2009-05-27 2014-08-26 Synageva Biopharma Corp. Avian derived antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
TWI409079B (zh) 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
AU2010281867A1 (en) * 2009-08-14 2012-02-02 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated CD20 antibody with fludarabine and/or mitoxantrone
TWI412375B (zh) 2009-08-28 2013-10-21 Roche Glycart Ag 人類化抗ｃｄｃｐ１抗體
TW201113037A (en) 2009-08-28 2011-04-16 Hoffmann La Roche Antibodies against CDCP1 for the treatment of cancer
KR20120060877A (ko) * 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
RU2015153109A (ru) 2009-09-16 2019-01-15 Дженентек, Инк. Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применения
AU2010306677B2 (en) * 2009-10-15 2013-05-23 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
GB0920944D0 (en) 2009-11-30 2010-01-13 Biotest Ag Agents for treating disease
DK2516469T3 (en) 2009-12-22 2016-05-02 Roche Glycart Ag ANTI-HER3 antibodies and uses thereof
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
CA2795544A1 (en) 2010-04-27 2011-11-03 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a mtor inhibitor
KR20130100118A (ko) 2010-08-03 2013-09-09 아비에 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CN103153341B (zh) 2010-08-03 2015-05-27 霍夫曼-拉罗奇有限公司 慢性淋巴细胞性白血病(cll)生物标志物
TW201208703A (en) * 2010-08-17 2012-03-01 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated CD20 antibody with an anti-VEGF antibody
WO2012025530A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
CA2819436A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a mdm2 inhibitor
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
ES2549638T3 (es) 2011-02-28 2015-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteínas de unión a antígeno
MX2014002996A (es) 2011-09-23 2014-05-28 Roche Glycart Ag Anticuerpos anti - egfr/anti - igf-1r bisespecificos.
KR102239138B1 (ko) * 2011-09-30 2021-04-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자
US20130302274A1 (en) * 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
KR20140127854A (ko) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체
WO2014001324A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Hoffmann-La Roche Ag Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
RU2015100656A (ru) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
CA2890263C (en) 2012-11-01 2020-03-10 Abbvie Inc. Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
EP2914629A1 (en) 2012-11-05 2015-09-09 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
AR094403A1 (es) 2013-01-11 2015-07-29 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos anti-her3
JP6636803B2 (ja) 2013-02-05 2020-01-29 エンクマフ エスアーエールエル Ｂｃｍａに対する抗体の選択のための方法
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
BR112015022210A8 (pt) 2013-03-13 2018-01-23 Genentech Inc formulações de anticorpo
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
MX2016003593A (es) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
WO2015082446A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using an anti-cdcp1 antibody and a taxane
WO2015095410A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and an anti-cd20 antibody
PT3148581T (pt) 2014-05-30 2020-01-06 Henlix Biotech Co Ltd Anticorpos antirrecetor do fator de crescimento epidérmico (egfr)
BR112017004393A2 (pt) 2014-09-15 2018-02-27 Genentech Inc formulações de anticorpo
PL3262071T3 (pl) 2014-09-23 2020-08-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposób stosowania immunokoniugatów anty-CD79b
WO2016073664A1 (en) * 2014-11-05 2016-05-12 The University Of Chicago Methods and compositions pertaining to human cerebral cavernous malformations
EP3227332B1 (en) 2014-12-03 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
EP4238994A3 (en) * 2015-05-11 2024-02-07 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods of treating lupus nephritis
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
EP3313442B1 (en) * 2015-06-24 2019-10-16 H. Hoffnabb-La Roche Ag Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
EP3108897A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
CN115505042A (zh) 2015-06-26 2022-12-23 赛诺菲生物技术公司 单克隆抗il-1racp抗体
JP2018520153A (ja) 2015-06-29 2018-07-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 臓器移植における使用のためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体
SI3331910T1 (sl) 2015-08-03 2020-07-31 Engmab Sarl Monoklonska protitelesa proti humani antigen dozorevanja limfocitov B (BCMA)
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
JP7325186B2 (ja) 2015-12-09 2023-08-14 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗薬物抗体の形成を減少させるためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体
WO2017148880A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Obinutuzumab variants having altered cell death induction
MA44507A (fr) * 2016-04-01 2019-02-06 Amgen Inc Récepteurs chimères de flt3 et leurs procédés d'utilisation
WO2017184553A1 (en) * 2016-04-18 2017-10-26 Baylor College Of Medicine Cancer gene therapy targeting cd47
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
TW201902512A (zh) 2016-06-02 2019-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療方法
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3257866A1 (en) 2016-06-17 2017-12-20 Academisch Medisch Centrum Modified anti-tnf antibody and use thereof in the treatment of ibd
US10148939B2 (en) 2016-07-19 2018-12-04 Gopro, Inc. Mapping of spherical image data into rectangular faces for transport and decoding across networks
BR112019008426A2 (pt) 2016-11-02 2019-09-03 Engmab Sarl anticorpo biespecífico contra bcma e cd3 e um fármaco imunológico para uso combinado no tratamento de mieloma múltiplo
EP3559034B1 (en) 2016-12-20 2020-12-02 H. Hoffnabb-La Roche Ag Combination therapy of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and 4-1bb (cd137) agonists
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
WO2019020606A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag POLYTHERAPY WITH BET INHIBITOR, BCL-2 INHIBITOR AND ANTI-CD20 ANTIBODY
CN111278461A (zh) * 2017-08-16 2020-06-12 百时美施贵宝公司 可前药化抗体、其前药以及使用和制备方法
CN111511762A (zh) 2017-08-21 2020-08-07 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019175071A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Therapeutic combination of 4-1 bb agonists with anti-cd20 antibodies
US20220009959A1 (en) * 2018-11-26 2022-01-13 North Carolina State University Peptide ligands for capture of host cell proteins
MX2021006573A (es) 2018-12-06 2021-07-15 Genentech Inc Tratamiento conjunto de linfoma difuso de linfocitos b grandes que comprende un inmunoconjugado anti-cd79b, un agente alquilante y un anticuerpo anti-cd20.
JP2022536602A (ja) 2019-05-14 2022-08-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド 濾胞性リンパ腫を処置するための抗ｃｄ７９ｂ免疫複合体の使用方法
MX2021015540A (es) * 2019-06-19 2022-02-10 Hoffmann La Roche Metodo para la generacion de una celula que expresa un anticuerpo trivalente mediante la integracion dirigida de multiples casetes de expresion en una organizacion definida.
US20220275065A1 (en) * 2019-07-31 2022-09-01 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Multivalent dna antibody constructs and use thereof
KR20220062304A (ko) 2019-09-12 2022-05-16 제넨테크, 인크. 루푸스 신장염을 치료하는 조성물과 방법
JP7413519B2 (ja) 2019-10-18 2024-01-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を処置するための抗ｃｄ７９ｂ免疫抱合体の使用方法
CN111411079A (zh) * 2020-03-27 2020-07-14 北京时合生物科技有限公司 细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用
TW202206111A (zh) 2020-04-24 2022-02-16 美商建南德克公司 使用抗ｃｄ７９ｂ免疫結合物之方法
MX2023007846A (es) 2021-01-06 2023-07-07 F Hoffmann La Roche Ag Tratamiento conjunto que usa un anticuerpo biespecifico contra pd1-lag3 y un anticuerpo biespecifico de linfocitos t cd20.
IL305283A (en) 2021-03-15 2023-10-01 Genentech Inc Compositions and methods for the treatment of lupus nephritis
IL308351A (en) 2021-05-12 2024-01-01 Genentech Inc Methods for using anti-CD79B immunoconjugates to treat diffuse large B-cell lymphoma
WO2023019092A1 (en) 2021-08-07 2023-02-16 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005044859A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
JPH11510170A (ja) 1995-07-27 1999-09-07 ジェネンテック インコーポレーテッド タンパク質の処方
US6001358A (en) * 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
UA76934C2 (en) * 1996-10-04 2006-10-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Reconstructed human anti-hm 1.24 antibody, coding dna, vector, host cell, method for production of reconstructed human antibody, pharmaceutical composition and drug for treating myeloma containing reconstructed human anti-hm 1.24 antibody
EP0999853B1 (en) 1997-06-13 2003-01-02 Genentech, Inc. Stabilized antibody formulation
SK14812000A3 (sk) 1998-04-03 2001-08-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chimérny reťazec protilátky, chimérna protilátka, v oblasť, humanizovaný reťazec protilátky, humanizovaná protilátka, dna, expresný vektor, hostiteľ, spôsob prípravy a liečivo
AU3657899A (en) * 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
ATE428732T1 (de) * 1998-05-20 2009-05-15 Kyowa Hakko Kogyo Kk Gen rekombinante antikörper
BR9916765A (pt) * 1999-01-05 2001-09-25 Unilever Nv Processo para produzir um material imunoadsorvente, uso de uma proteìna que é ligada por meio de uma ligação covalente a um fragmento de anticorpo, material imunadsorvente, uso de um material, e, kit de teste diagnóstico
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
JP4795619B2 (ja) * 2000-07-31 2011-10-19 バイオレックス・セラピューティクス インコーポレイテッド ウキクサにおける生物学的に活性なポリペプチド類の発現
AU2002213357A1 (en) 2000-10-20 2002-05-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
RU2306952C2 (ru) * 2001-01-31 2007-09-27 Байоджен Айдек Инк. Лечение в-клеточных злокачественных опухолей с использованием комбинации применений, связанных с антителами, уменьшающими количество b-клеток, и с иммуномодулирующими антителами
US20030003097A1 (en) * 2001-04-02 2003-01-02 Idec Pharmaceutical Corporation Recombinant antibodies coexpressed with GnTIII
US7321026B2 (en) * 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
NZ592087A (en) * 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
IL159422A0 (en) * 2001-09-20 2004-06-01 Cornell Res Foundation Inc Methods and compositions for treating or preventing skin disorders using binding agents specific for prostate-specific membrane antigen
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
ES2402527T3 (es) 2001-12-27 2013-05-06 Glycofi, Inc. Procedimientos para obtener estructuras de carbohidrato de tipo mamífero mediante ingeniería genética
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
CA2476166C (en) * 2002-02-14 2011-11-15 Immunomedics, Inc. Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US20040132101A1 (en) * 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
KR101070518B1 (ko) 2002-03-19 2011-10-05 스티칭 디엔스트 랜드보위쿤디그 온데조에크 식물에서의 ｇｎｔⅲ 발현
PT1490405E (pt) * 2002-03-21 2007-11-07 Lilly Co Eli Anticorpos humanos anti-ligando de hfas antagonistas e fragmentos dos mesmos
US20030190689A1 (en) 2002-04-05 2003-10-09 Cell Signaling Technology,Inc. Molecular profiling of disease and therapeutic response using phospho-specific antibodies
AU2003251597A1 (en) 2002-06-19 2004-01-06 Abgenix, Inc. Method for predicting response to epidermal growth factor receptor-directed therapy
EP1534335B9 (en) * 2002-08-14 2016-01-13 Macrogenics, Inc. Fcgammariib-specific antibodies and methods of use thereof
SI1539966T1 (sl) 2002-09-12 2010-10-29 Greenovation Biotech Gmbh Postopek za produkcijo proteinov
AU2003298799A1 (en) * 2002-12-02 2004-06-23 Abgenix, Inc. Antibodies directed to phospholipase a2 and uses thereof
CA2549932C (en) 2002-12-20 2013-08-20 Greenovation Biotech Gmbh Production of heterologous glycosylated proteins in bryophyte cells
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7960512B2 (en) * 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
ES2574993T3 (es) 2003-01-22 2016-06-23 Roche Glycart Ag Construcciones de fusión y uso de las mismas para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y función efectora
CA2513113A1 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
EP1603948A1 (en) * 2003-03-14 2005-12-14 Pharmacia Corporation Antibodies to igf-i receptor for the treatment of cancers
KR20060027801A (ko) * 2003-06-05 2006-03-28 제넨테크, 인크. Ｂ 세포 장애에 대한 조합 요법
EP1660534A2 (en) * 2003-08-22 2006-05-31 MedImmune, Inc. Humanization of antibodies
US7968690B2 (en) * 2003-12-23 2011-06-28 Rinat Neuroscience Corp. Agonist anti-trkC antibodies and methods using same
AU2005214988A1 (en) * 2004-02-17 2005-09-01 Absalus, Inc. Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus
US7501121B2 (en) * 2004-06-17 2009-03-10 Wyeth IL-13 binding agents
MX2007002883A (es) * 2004-09-13 2007-06-15 Macrogenics Inc Anticuerpos humanizados contra el virus de nilo occidental y usos terapeuticos y profilacticos del mismo.
TW200635607A (en) * 2004-12-15 2006-10-16 Elan Pharm Inc Humanized Aβ antibodies for use in improving cognition
WO2006133148A2 (en) * 2005-06-03 2006-12-14 Genentech, Inc. Method of producing antibodies with modified fucosylation level
US20070071745A1 (en) * 2005-08-26 2007-03-29 Pablo Umana Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005044859A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function

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