NO345919B1 - Modifiserte antigen-bindende molekyler med endret celle-signaliseringsaktivitet - Google Patents

Modifiserte antigen-bindende molekyler med endret celle-signaliseringsaktivitet Download PDF

Info

Publication number
NO345919B1
NO345919B1 NO20081328A NO20081328A NO345919B1 NO 345919 B1 NO345919 B1 NO 345919B1 NO 20081328 A NO20081328 A NO 20081328A NO 20081328 A NO20081328 A NO 20081328A NO 345919 B1 NO345919 B1 NO 345919B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
amino acid
region
antigen
cancer
Prior art date
Application number
NO20081328A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20081328L (no
Inventor
Pablo Umaña
Ekkehard Mössner
Original Assignee
Roche Glycart Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37865318&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO345919(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Roche Glycart Ag filed Critical Roche Glycart Ag
Publication of NO20081328L publication Critical patent/NO20081328L/no
Publication of NO345919B1 publication Critical patent/NO345919B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Description

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse angår antigen-bindende molekyler (ABM’er). I spesielle utførelsesformer angår foreliggende oppfinnelse rekombinante monoklonale antistoffer eller fragmenter, omfattende kimære, primatiserte eller humaniserte antistoffer eller fragmenter, som har endret evne til å mediere cellesignalerings-aktivitet ved et mål-antigen og/eller endret evne til å mediere kryssbinding av ett eller flere mål-antigener. I tillegg angår foreliggende oppfinnelse nukleinsyremolekyler som koder for slike ABM’er og vektorer og vertsceller omfattende slike nukleinsyremolekyler. Oppfinnelsen angår videre fremgangsmåter for fremstilling av ABM’ene ifølge oppfinnelsen og fremgangsmåter for anvendelse av disse ABM’ene ved behandling av sykdom. I tillegg angår foreliggende oppfinnelse ABM’er med modifisert glykosylering som har forbedrede terapeutiske egenskaper, omfattende antistoffer med økt Fcreseptorbinding og økt effektorfunksjon.
Kjent teknikk
Antistoffer, også betegnet immunglobuliner, har en grunnleggende struktur omfattende fire polypeptidkjeder: to identiske tunge (H) kjeder paret med to identiske lette (L) kjeder. Hver tunge og lette kjede omfatter en variabel region (VH og VL, henholdsvis) og en konstant region (CH og CL, henholdsvis). CH-regionen har 3 domener (CH1, CH2 og CH3), mens den mindre CL-regionen kun har ett domene (ganske enkelt referert til som CL). Hver VH og VL-region omfatter 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er) flankert av 4 struktur (”framework”)-regioner i følgende rekkefølge: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. CDR’ene er den mest variable delen av V-regionen og bestemmer antigenspesifisiteten av antistoffet. Sammen danner en paret VH og VL det antigen-bindende setet og bivalente antistoffer har to slike antigen-bindende seter. Det skal bemerkes at denne grunnleggende antistoffstrukturen kan modifiseres på forskjellige måter (f.eks. ved generering av fragmenter med strukturen) mens den fortsatt beholder eller til og med forbedrer ønskede funksjoner og/eller antigenbindende aktivitet.
Grenseflaten mellom VH og CH1-domenene omfatter konserverte aminosyrer. Denne kontaktflaten kan beskrives som et "molekylært kuleledd." Dette leddet bestemmer "albue-bevegelsen" og også den såkalte "albue-vinkelen" av VH og VL-regionene med hensyn til CH1 og CL-regionene, og forhindrer dannelse av en rigid forbindelse mellom V og C-regionene (Lesk og Chotia, Nature (1988) 335(8):188-190)). Hylsen i kuleleddet dannes av aminosyrerester i VH struktur (”framework”)-regionen, spesielt de ved posisjonene 11, 110 og 112 (i henhold til nummereringssystemet ifølge Kabat et al., (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4<th >ed. (Public Health Services, NIH, Washington, DC)). (Se Lesk og Chotia, Nature (1988) 335(8):188-190.) “Kulen” i dette kuleleddet finnes i CH1-domenet og dannes hovedsakelig av de to aminosyrene i posisjonene 148 og 149 (Se Landolfi et al., J. Immunol. (2001) 166:1748-1754; Lesk og Chotia, Nature (1988) 335(8):188-190) (hvor CH1-restene som danner "kulen" er nummerert 149 og 150, henholdsvis)). Forskjeller i aminosyrene ved disse posisjonene kan diktere albue-vinkelen som blir dannet mellom V og C-regionene og derfor orienteringen av VH-VL-dimeren (se Lesk og Chotia, Nature (1988) 335(8):188-190). Aminosyrerestene som innehar disse VH-posisjonene er høyst konserverte på tvers av immunoglobulinsekvenser (se f.eks., Lesk og Chotia, Nature (1988) 335(8):188-190). Alle restene involvert i dette leddet (f.eks. posisjonene 11, 110, 112, 148 og 149), er lokalisert i struktur (”framework”)-regionene (f.eks. restene 11, 110 og 112) eller det konstante domenet (f.eks. 148 og 149 (i henhold til Landolfi et al.; posisjonene 149 og 150 i henhold til Lesk og Chotia) og synes ikke å være direkte involvert i antigenbinding. Landolfi et al., J. Immunol. (2001) 166:1748-1754.
I tillegg til å mediere effektorfunksjoner slik som antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC) og komplementavhengig cytotoksisitet (CDC), kan monoklonale antistoffer modulere cellulære funksjoner ved å indusere eller hemme cellesignaleringsveier. For eksempel er monoklonale antistoffer vist å mediere antigen kryssbinding, aktivere dødsreseptorer (f.eks. ved å lette oligomerisering av reseptorer eller etterligne ligand-binding) og blokkere ligandmediert cellesignalering ved cellevekst differensiering og/eller proliferasjons reaksjonsveier (se, f.eks., Ludwig et al., Oncogene (2003) 22: 9097-9106).
Apoptose eller programmert celledød, kan utløses av mange forskjellige mekanismer. For eksempel kan aktivering av signaleringsveier gjennom cellemembran-bundne "dødsreseptorer," f.eks. medlemmer av tumornekrosefaktor reseptor (TNFR)-superfamilien, føre til induksjon av apoptose. Likeledes kan dimerisering eller kryssbinding av overflateantigen, f.eks. CD20, også indusere apoptose (se, f.eks., Ludwig et al., Oncogene (2003) 22: 9097-9106).
WO 2003/024388 beskriver fremgangsmåter og sammensetninger for å behandle eller forebygge hudlidelser ved anvendelse av bindingsmidler spesifikke for prostataspesifikt membranantigen.
Det er fortsatt behov for forbedrede terapeutiske metoder for målretting av antigener forbundet med cellesignalering, omfattende, men ikke begrenset til, induksjon av apoptose, for behandling av sykdom hos primater, omfattende, men ikke begrenset til, mennesker.
KORT OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
Med utgangspunkt i det veldige terapeutiske potensialet av modifiserte antigen-bindende molekyler (ABM’er) som har endret evne til å mediere cellesignalerings aktivitet ved et mål-antigen og/eller endret evne til å mediere kryssbinding av ett eller flere mål-antigener, utviklet foreliggende oppfinnere slike ABM’er, så vel som en fremgangsmåte for fremstilling av slike ABM’er. Denne fremgangsmåten omfatter, blant annet, fremstilling av rekombinante, kimære antistoffer eller kimære fragmenter derav. Effektiviteten av disse modifiserte ABM’ene blir ytterligere forbedret ved å legge til rette glykosyleringsprofilen av antistoff Fc-regionen.
I et første aspekt angår gjeldende oppfinnelse et modifisert antigenbindende molekyl som spesifikt binder til human CD20 omfattende en tungkjede variabel region omfattende minst én aminosyrerestsubstitusjon i rammeverkregionen 1 (FR1) av nevnte tungkjede variabel region som er en erstatning av en aminosyrerest i én eller flere av Kabatposisjoner 9, 10, 11 eller 12 sammenlignet med tungkjede variable regionen ifølge SEKV ID NR: 4. Nevnte erstatning resulterer i endret cellesignaleringsaktivitet til et målantigen når nevnte modifiserte antigenbindende molekyl er kompleksert med nevnte målantigen. Nevnte endrete cellesignaleringsaktivitet er økt agonistaktivitet og hvor nevnte økte agonistaktivitet er induksjon av apoptose.
Nevnte substitusjon i FR1 av nevnte tungkjede variabel region kan omfatte en erstatning av aminosyreresten i Kabatposisjon 9 med aminosyreresten glysin; en erstatning av aminosyreresten i Kabatposisjon 10 med aminosyreresten glysin; en erstatning av aminosyreresten i Kabatposisjon 11 med aminosyreresten leucin; eller en erstatning av aminosyreresten i Kabatposisjon 12 med aminosyreresten valin.
Det antigenbindende molekylet kan omfatte en tungkjede variabel region valg fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 126, 127, 125 og 124. Nevnte antigenbindende molekyl kan omfatte den lettkjede variable regionen valg fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 48, 130, 131, 132, 133 og 134.
Det modifiserte antigenbindende molekylet kan videre omfatte en human Fc-region. Nevnte Fc-region kan være modifisert til å ha en redusert proporsjon av fucoserester sammenlignet med en ikke-modifisert Fc-region; å ha en økt proporsjon av GlcNAc-rester til fucoserester sammenlignet med en ikke-modifisert Fc-region; å ha en økt Fc-reseptorbindingsaffinitet sammenlignet med en ikkemodifisert Fc-region; og å ha en økt effektorfunksjon sammenlignet med en ikkemodifisert Fc-region.
I et annet aspekt angår den gjeldende oppfinnelsen et polynukleotid som koder for den tungkjede variable regionen. Oppfinnelsen angår også et polynukleotid som koder for den lettkjede variable regionen. Oppfinnelsen angår også en vektor omfattende polynukleotidet. Vektoren kan være polycistronisk.
I et annet aspekt angår den gjeldende oppfinnelsen en vertscelle omfattende vektoren polynukleotidet. Nevnte vert kan være konstruert til å uttrykke minst én nukleinsyre som koder for et polypeptid som har β(1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III-aktivitet. Nevnte polypeptid som har β(1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III-aktivitet kan være et fusjonspolypeptid videre omfattende Golgilokaliseringsdomenet fra et heterologt Golgioppholdende polypeptid. Nevnte Golgilokaliseringsdomene kan være valgt fra lokaliseringsdomenet til mannosidase II, lokaliseringsdomenet til β(1,2)-N-acetylglukosaminyltransferase I, lokaliseringsdomenet til β(1,2)-Nacetylglukosaminyltransferase II, lokaliseringsdomenet til mannosidase I, og lokaliseringsdomenet til α1-6 kjernefucosyltransferase
I et annet aspekt angår den gjeldende oppfinnelsen en fremgangsmåte for å produsere det modifiserte antigenbindende molekylet som spesifikt binder til human CD20. Fremgangsmåten omfatter dyrkning av vertscellen under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte polynukleotid og utvinning av nevnte modifiserte antigenbindende molekyl fra dyrkningsmediumet.
I et annet aspekt angår den gjeldende oppfinnelsen et modifisert antigenbindende molekyl som binder spesifikt til human CD20 oppnåelig fra vertscellen. Oppfinnelsen angår også en farmasøytisk sammensetning omfattende det modifiserte antigenbindende molekylet som tidligere beskrevet eller oppnåelig ved fremgangsmåten og en farmasøytisk akseptabel bærer.
I et annet aspekt angår den gjeldende oppfinnelsen et modifisert antigenbindende molekyl som tidligere beskrevet eller oppnåelig ved fremgangsmåten for anvendelse i behandling eller forebygging av kreft eller en precancerøs tilstand eller lesjon. Nevnte precancerøse tilstand eller lesjon kan være valgt fra gruppen bestående av oral leukoplakia, aktinisk keratose (solar keratose), precancerøse polypper av tarm eller rektum, gastrisk epitelial dysplasi, adenomatøs dysplasi, arvelig nonpolypose kolonkreftsyndrom (HNPCC), Barretts øsofagus, blæredysplasi, og precancerøse cervikale tilstander. Nevnte kreft kan være valgt fra gruppen bestående av B-cellelymfom, brystkreft, blærekreft, hodeog halskreft, hudkreft, pankreatisk kreft, lungekreft, eggstokkreft, kolonkreft, prostatakreft, nyrekreft og hjernekreft.
Følgelig angår oppfinnelsen i ett aspekt et modifisert antigen-bindende molekyl omfattende en tung kjede eller lett kjede variabel region omfattende minst én aminosyrerest-substitusjon i minst én struktur (”framework”)-region av nevnte tunge kjede eller lette kjede variable region sammenlignet med den tunge kjede eller lette kjede variable regionen av et parentalt antigen-bindende molekyl, hvor nevnte substitusjon resulterer i endret cellesignalerings aktivitet ved et mål-antigen når nevnte modifiserte antigen-bindende molekyl er kompleksert med nevnte målantigen. I en bestemt utførelsesform er den endrede cellesignalerings aktiviteten apoptose. I én utførelsesform har det modifiserte antigen-bindende molekylet en økt evne til å indusere apoptose. I en annen utførelsesform har det modifiserte antigen-bindende molekylet en redusert evne til å indusere apoptose.
I et annet aspekt angår oppfinnelsen et modifisert antigen-bindende molekyl omfattende en tung kjede eller lett kjede variabel region omfattende minst én aminosyrerest-substitusjon i minst én struktur (”framework”)-region av nevnte tung kjede eller lett kjede variabel region sammenlignet med den tunge kjede eller lette kjede variable regionen av et parentalt antigen-bindende molekyl, hvor nevnte modifiserte antigen-bindende molekyl har endret evne til å mediere kryssbinding av ett eller flere mål-antigener som et resultat av nevnte substitusjon.
I én utførelsesform omfatter det modifiserte antigen-bindende molekylet ifølge foreliggende oppfinnelse en substitusjon i FR1 av den tunge kjede variable regionen. I en annen utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning valgt fra gruppen bestående av minst 2, minst 3 eller minst 4 aminosyrer.
I én utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av hele FR1 av den tunge kjede variable regionen. I en ytterligere utførelsesform blir hele FR1 erstattet av en kjønnscelle VH FR1. I spesielle utførelsesformer omfatter kjønnscelle VH FR1 en aminosyresekvens ved Kabat posisjonene 8 til 13 valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:63, SEKV ID NR:64, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR:66, SEKV ID NR:67, SEKV ID NR:68, SEKV ID NR:69, SEKV ID NR:70, SEKV ID NR:71, SEKV ID NR:72, SEKV ID NR:73, SEKV ID NR:74, SEKV ID NR:75, SEKV ID NR:76, SEKV ID NR:77, SEKV ID NR:78, SEKV ID NR:79, SEKV ID NR:101, SEKV ID NR:102, SEKV ID NR:103, SEKV ID NR:104 og SEKV ID NR:105.
I én utførelsesform omfatter den modifiserte ABM en substitusjon i FR1 av den tunge kjede variable regionen som omfatter en erstatning av en aminosyrerest ved én eller flere av Kabat posisjonene 8, 9, 10, 11, 12 eller 13.
I en spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i FR1 av den tunge kjede variable regionen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 8. I en mer spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen i FR1 av den tunge kjede variable regionen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 8 med en aminosyrerest valgt fra gruppen bestående av arginin og glysin.
I en annen spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i FR1 av den tunge kjede variable regionen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 9. I en mer spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen i FR1 av den tunge kjede variable regionen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 9 med en aminosyrerest valgt fra gruppen bestående av alanin, prolin, glysin, serin og histidin.
I én spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i FR1 av den tunge kjede variable regionen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 10. I en mer spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 10 med en aminosyrerest valgt fra gruppen bestående av glutamat, treonin, glysin, alanin og valin.
I en annen spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i FR1 av den tunge kjede variable regionen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 11. I en spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 11 med hvilken som helst aminosyre unntatt leucin. I en annen spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 11 med en ikke-polar aminosyre. I en annen spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 11 med en aminosyrerest valgt fra gruppen bestående av valin, leucin, isoleucin, serin og fenylalanin. I en spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 11 med en leucin.
I en annen spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i FR1 av den tunge kjede variable regionen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 12. I en spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 12 med en aminosyrerest valgt fra gruppen bestående av lysin, valin, leucin og isoleucin.
I en annen spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i FR1 av den tunge kjede variable regionen en erstatning av aminosyrerestene ved Kabat posisjonene 11 og 12. I en spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 11 med en valin og ved Kabat posisjon 12 med et lysin; en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 11 med en leucin og ved Kabat posisjon 12 med en valin; en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 11 med en valin og ved Kabat posisjon 12 med en isoleucin; eller en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 11 med en valin og ved Kabat posisjon 12 med en valin.
I en annen spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i FR1 av den tunge kjede variable regionen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 13. I en spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 13 med en aminosyrerest valgt fra gruppen bestående av lysin, arginin, glutamin og glutamat.
I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse omfatter substitusjonen i ABM erstatning av minst én aminosyrerest i FR4 av den tunge kjede variable regionen. I en spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i FR4 av den tunge kjede variable regionen en erstatning av en aminosyrerest ved én eller flere av Kabat posisjonene 110 eller 112.
I en spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 110 med en aminosyre valgt fra gruppen bestående av leucin, isoleucin, treonin eller serin. I en mer spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 110 med en isoleucin.
I en annen utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 112 med en aminosyre valgt fra gruppen bestående av valin, leucin, isoleucin eller treonin. I en mer spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyreresten ved Kabat posisjon 112 med en isoleucin.
I ett aspekt angår foreliggende oppfinnelse videre et modifisert antigenbindende molekyl omfattende et CH1-domene omfattende minst én aminosyrerest-substitusjon sammenlignet med CH1-domenet av et parentalt polypeptid, hvor substitusjonen resulterer i endret cellesignalerings aktivitet av et mål-antigen når det modifiserte antigen-bindende molekylet er kompleksert med mål-antigenet.
I et annet aspekt angår foreliggende oppfinnelse videre et modifisert antigen-bindende molekyl omfattende et CH1-domene omfattende minst én aminosyrerest-substitusjon sammenlignet med CH1-domenet av et parentalt polypeptid, hvor det antigen-bindende molekylet har endret evne til å mediere kryssbinding av ett eller flere mål-antigener som et resultat av substitusjonen.
I en spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i CH1 en erstatning av en aminosyrerest ved én eller flere av posisjonene 148, 149 eller 150. I en mer spesifikk utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av aminosyrerest posisjon 149 med et leucin. I en annen utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av hele CH1-domenet. I en annen utførelsesform omfatter substitusjonen en erstatning av et IgG CH1-domene med et IgM CH1-domene.
I et annet aspekt angår oppfinnelsen et modifisert antigen-bindende molekyl omfattende minst én aminosyre-substitusjon, hvor nevnte substitusjon omfatter en erstatning av en aminosyrerest i den lette kjeden i regionen av grenseflaten mellom de variable og konstante regionene, hvor substitusjonen resulterer i endret cellesignalerings aktivitet av et mål antigen-bindende molekyl når nevnte modifiserte antigen-bindende molekyl er kompleksert med nevnte mål-antigen.
I et annet aspekt angår oppfinnelsen et modifisert antigen-bindende molekyl omfattende minst én aminosyresubstitusjon, hvor nevnte substitusjon omfatter en erstatning av en aminosyrerest i den lette kjeden i regionen av grenseflaten mellom de variable og konstante regionene, hvor nevnte modifiserte antigenbindende molekyl har endret evne til å mediere kryssbinding av ett eller flere målantigener som et resultat av nevnte substitusjon.
I en spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i den lette kjede variable region av ABM en erstatning av en aminosyre ved én eller flere av Kabat posisjonene 10, 12, 39, 40, 41, 80, 81, 83, 84, 103, 105, 106 og 108. I en spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i den lette kjede variable regionen av ABM en erstatning av en aminosyrerest ved én eller flere av Kabat posisjonene 40, 80, 83, 105 eller 106.
I en annen spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i den lette kjeden av ABM en erstatning av en aminosyrerest ved én eller flere av Kabat posisjonene 40, 80, 83, 105 eller 106 med en ikke-polar aminosyre.
I en annen spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i den lette kjeden av ABM en erstatning av en aminosyrerest ved Kabat posisjon 40 med en alanin.
I en annen spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i den lette kjeden av ABM en erstatning av en aminosyrerest ved Kabat posisjon 80 med en prolin.
I en annen spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i den lette kjeden av ABM en erstatning av en aminosyrerest ved Kabat posisjon 83 med en fenylalanin.
I en annen spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i den lette kjeden av ABM en erstatning av en aminosyrerest ved Kabat posisjon 105 med en alanin.
I en annen spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i den lette kjeden av ABM en erstatning av en aminosyrerest ved Kabat posisjon 106 med en alanin. I en mer spesiell utførelsesform omfatter substitusjonen i den lette kjeden av ABM en erstatning av en aminosyrerest ved Kabat posisjon 106, hvor det antigenbindende molekylet blir redusert i dets evne til å indusere apoptose.
I noen utførelsesformer omfatter substitusjonene ifølge foreliggende oppfinnelse en kombinasjon av hvilke som helst av aminosyrerest-erstatningene i de tunge og/eller lette kjede variable og/eller konstante regionene som beskrevet her.
I ett aspekt resulterer aminosyresubstitusjonen(e) i de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse i endret cellesignalerings aktivitet for et målantigen når det modifiserte ABM er kompleksert med mål-antigenet.
I ett aspekt ifølge oppfinnelsen er den endrede cellesignalerings aktiviteten økt agonist-aktivitet. I én utførelsesform er den økte agonist-aktiviteten valgt fra gruppen bestående induksjon av apoptose og induksjon av celledifferensiering.
I et annet aspekt ved oppfinnelsen er den endrede cellesignalerings aktiviteten økt antagonist-aktivitet. I én utførelsesform er antagonistaktiviteten blokkering av en cellesignaleringsvei valgt fra gruppen bestående av celleoverlevelse, cellevekst, celleproliferasjon og angiogenese.
I et ytterligere aspekt binder det modifiserte antigen-bindende molekylet ifølge foreliggende oppfinnelse spesifikt til human CD20. I et annet aspekt binder det modifiserte antigen-bindende molekylet spesifikt til et medlem av den humane TNF-reseptor superfamilien. I en spesiell utførelsesform er TNF reseptorsuperfamilien valgt fra gruppen bestående av TNFR1, CD95, TRAILR1, TRAILR2, EDAR og p75NGFR.
I et annet aspekt ved oppfinnelsen binder det modifiserte antigen-bindende molekylet spesifikt til en reseptor-tyrosinkinase. I en spesiell utførelsesform er reseptor tyrosinkinasen valgt fra gruppen bestående av HER1 (EGFR1), HER2/neu, HER3, HER4, IGF-1R, FGFR, PDGFR, VEGFR1, VEGFR2 og VEGFR3. I en mer spesifikk utførelsesform er reseptor tyrosinkinasen HER1 (EGFR1).
I et annet aspekt angår foreliggende oppfinnelse videre en modifisert ABM som kan velges fra, men er ikke begrenset til, gruppen bestående av et helt antistoff, et Fab-fragment eller et fusjonsprotein derav, et F(ab')2-fragment eller et fusjonsprotein derav, en minibody, en dimer (”diabody”), en trimer (”triabody”) og en tetramer. I en spesiell utførelsesform er den modifiserte ABM kimær eller fullstendig human. I en mer spesiell utførelsesform er den kimære modifiserte ABM humanisert. I en annen spesiell utførelsesform er den modifiserte ABM multispesifikk. I en mer spesiell utførelsesform er den modifiserte ABM bispesifikk.
I et annet aspekt omfatter det parentale antigen-bindende molekylet ifølge foreliggende oppfinnelse en tung kjede variabel region valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:55, SEKV ID NR:56, SEKV ID NR:57, SEKV ID NR:58, SEKV ID NR:59, SEKV ID NR:60, SEKV ID NR:61 og SEKV ID NR:62.
I et annet aspekt omfatter det parentale antigen-bindende molekylet ifølge foreliggende oppfinnelse en lett kjede valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR:130, SEKV ID NR:131, SEKV ID NR:132, SEKV ID NR:133 og SEKV ID NR:134.
I et ytterligere aspekt angår foreliggende oppfinnelse også en modifisert ABM videre omfattende en human Fc-region. I henhold til én utførelsesform er Fcregionen av den modifiserte ABM modifisert til å ha endrede oligosakkarider. I en mer spesifikk utførelsesform er Fc-regionen modifisert til å ha en redusert proporsjon av fukoserester sammenlignet med en ikke-modifisert Fc-region. I en annen spesifikk utførelsesform har Fc-regionen en økt proporsjon av todelte (”bisected”) oligosakkarider sammenlignet med en ikke-modifisert Fc-region. I en annen spesifikk utførelsesform er de modifiserte oligosakkaridene todelt kompleks. I en annen spesifikk utførelsesform har de modifiserte oligosakkaridene en økt proporsjon av todelte, ikke-fukosylerte oligosakkarider i Fc-regionen sammenlignet med en ikke-modifisert Fc-region. I en annen spesifikk utførelsesform har Fcregionen en økt proporsjon av GlcNAc-rester til fukoserester i den modifiserte Fcregionen sammenlignet med en ikke-modifisert Fc-region. I en annen spesifikk utførelsesform er de todelte, ikke-fukosylerte oligosakkaridene hybride. I en annen spesifikk utførelsesform er de todelte, ikke-fukosylerte oligosakkaridene kompleks.
I henhold til et annet aspekt er mål-antigenet ifølge foreliggende oppfinnelse en celleoverflate-reseptor valgt fra gruppen bestående av en membrantransport reseptor, en G-protein-bundet reseptor og en enzymbundet reseptor. I en spesiell utførelsesform er membrantransport reseptoren en kanalbundet reseptor. I en annen spesiell utførelsesform er den enzymbundne reseptoren valgt fra gruppen bestående av reseptor guanylyl cyklaser, reseptortyrosinkinaser, tyrosin-kinase assosierte reseptorer, reseptor tyrosin fosfataser og reseptor serin/treonin kinaser.
I et annet aspekt angår oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning omfattende den modifiserte ABM ifølge oppfinnelsen. Det er antatt at den farmasøytiske sammensetningen videre kan omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer, en adjuvans eller en kombinasjon derav.
Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for behandling av en sykdom som kan behandles ved endret cellesignalerings aktivitet hos en pasient, idet fremgangsmåten omfatter å administrere til pasienten en terapeutisk effektiv mengde av en farmasøytisk sammensetning omfattende en modifisert ABM ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer.
I et annet aspekt angår oppfinnelsen et isolert polynukleotid som koder for et polypeptid omfattende en tung kjede eller lett kjede variabel region, hvor den tunge kjede eller lette kjede variable regionen omfatter minst én aminosyrerestsubstitusjon i minst én struktur (”framework”)-region sammenlignet med en parental tung kjede eller lett kjede variabel region og hvor substitusjonen resulterer i endret cellesignalerings aktivitet for et mål-antigen når polypeptidet er kompleksert med mål-antigenet.
I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen et isolert polynukleotid som koder for et polypeptid omfattende en tung kjede eller lett kjede variabel region, hvor den tunge kjede eller lette kjede variable regionen omfatter minst én aminosyrerestsubstitusjon i minst én struktur (”framework”)-region sammenlignet med en parental tung kjede eller lett kjede variabel region og hvor polypeptidet har endret evne til å mediere kryssbinding av ett eller flere mål-antigener som et resultat av substitusjonen.
I én utførelsesform koder et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse for et polypeptid, hvor polypeptidet omfatter en antistoff tung kjede eller lett kjede. I en annen utførelsesform koder et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse for et polypeptid, hvor polypeptidet omfatter et fusjonsprotein. Foreliggende oppfinnelse angår også polypeptider kodet for av polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse.
Foreliggende oppfinnelse angår også en vektor omfattende et polynukleotid ifølge oppfinnelsen og en vertscelle omfattende vektoren.
Oppfinnelsen angår videre et polynukleotid som koder for et polypeptid omfattende en tung kjede eller lett kjede variabel region som omfatter minst én aminosyrerest-substitusjon i minst én struktur (”framework”)-region av den tunge kjede eller lette kjede variable regionen sammenlignet med den tunge kjede eller lette kjede variable regionen av et parentalt antigen-bindende molekyl, hvor polypeptidet er en modifisert ABM ifølge oppfinnelsen.
Foreliggende oppfinnelse angår også en vertscelle konstruert til å uttrykke minst én nukleinsyre som koder for et polypeptid som har β(1,4)-N-acetylglukosaminyltransferase III-aktivitet i en mengde tilstrekkelig til å modifisere oligosakkaridene i Fc-regionen av et polypeptid produsert av vertscellen, hvor polypeptidet er en modifisert ABM ifølge oppfinnelsen. I én utførelsesform er polypeptidet som har β(1,4)-N-acetylglukosaminyltransferase III-aktivitet et fusjonspolypeptid. I en spesiell utførelsesform omfatter fusjonspolypeptidet det katalytiske domenet av β(1,4)-N-acetylglukosaminyltransferase III. I en annen utførelsesform omfatter fusjonspolypeptidet videre Golgi lokaliserings-domenet fra et heterologt polypeptid som finnes i Golgi. Golgi lokaliserings-domenet kan velges fra, men er ikke begrenset til, gruppen bestående av lokaliserings-domenet fra mannosidase II, lokaliserings-domenet fra β(1,2)-N-acetylglukosaminyltransferase I, lokaliserings-domenet fra β(1,2)-N-acetylglukosaminyltransferase II, lokaliserings-domenet fra mannosidase I og lokaliserings-domenet fra α1-6 kjerne fucosyltransferase.
I en annen utførelsesform omfatter det modifiserte ABM en region ekvivalent med Fc-regionen av en human IgG.
I en ytterligere utførelsesform oppviser den modifiserte ABM produsert av vertscellen ifølge foreliggende oppfinnelse økt Fc-reseptor bindingsaffinitet og/eller økt effektorfunksjon som et resultat av oligosakkarid-modifikasjonen. Ifølge foreliggende oppfinnelse, er den økte effektorfunksjonen valgt fra gruppen bestående av økt Fc-mediert cellulær cytotoksisitet, økt binding til NK-celler, økt binding til makrofager, økt binding til polymorfonukleære celler, økt binding til monocytter, økt direkte signalering som induserer apoptose, økt dendrittisk cellemodning og økt T-celle-priming. I én utførelsesform er Fc-reseptoren Fcγaktiverende reseptor. I en annen utførelsesform er Fc-reseptoren FcγRIIIA-reseptor.
Vertscellen ifølge foreliggende oppfinnelse kan velges fra gruppen som omfatter, men er ikke begrenset til, en CHO-celle, en HEK293-EBNA-celle, en BHK-celle, en NSO-celle, en SP2/0-celle, en YO myelomcelle, en P3X63 mus myelomcelle, en PER-celle, en PER.C6-celle eller en hybridomcelle.
I et annet aspekt angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en modifisert ABM omfattende en tung kjede eller lett kjede variabel region omfattende minst én aminosyrerest-substitusjon i minst én struktur (”framework”)-region av den tunge kjede eller lette kjede variable regionen sammenlignet med den tunge kjede eller lette kjede variable regionen av en parental ABM, hvor substitusjonen resulterer i endret cellesignalerings aktivitet av et mål-antigen når den modifiserte ABM er kompleksert med mål-antigenet, idet fremgangsmåten omfatter: (i) dyrking av vertscellen ifølge foreliggende oppfinnelse under betingelser som tillater ekspresjon av polynukleotidet; og (ii) utvinne det modifiserte ABM fra dyrkningsmediet.
I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en modifisert ABM omfattende en tung kjede eller lett kjede variabel region omfattende minst én aminosyrerest-substitusjon i minst én struktur (”framework”)-region av den tunge kjede eller lette kjede variable regionen sammenlignet med den tunge kjede eller lette kjede variable regionen av et parentalt antigenbindende molekyl, hvor det modifiserte antigen-bindende molekylet har endret evne til å mediere kryssbinding som et resultat av substitusjonen, idet fremgangsmåten omfatter: (i) dyrking av vertscellen ifølge foreliggende oppfinnelse under betingelser som tillater ekspresjon av polynukleotidet; og (ii) utvinne det modifiserte ABM fra dyrkningsmediet.
I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å endre evnen av en ABM til å lette dannelse av komplekser omfattende mål-antigenet for ABM, idet fremgangsmåten omfatter: erstatte minst én aminosyrerest i minst én tung kjede eller lett kjede variabel region struktur (”framework”)-region av en parental ABM. I én utførelsesform øker ABM induksjon av apoptose i en celle som uttrykker mål-antigenet. I en annen utførelsesform øker ABM induksjon av celledifferensiering i en celle som uttrykker mål-antigenet.
Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for å indusere apoptose i en celle, idet fremgangsmåten omfatter å bringe cellen i kontakt med en modifisert ABM omfattende en tung kjede eller lett kjede variabel region som omfatter minst én aminosyrerest-substitusjon i minst én struktur (”framework”)-region av nevnte tung kjede eller lett kjede variabel region sammenlignet med den tunge kjede eller lette kjede variable regionen av en parental ABM, hvor den modifiserte ABM har økt evne til å indusere apoptose sammenlignet med det parentale polypeptidet. I en spesiell utførelsesform er cellen en tumorcelle. I én utførelsesform finner kontakt-trinnet sted in vivo.
I et annet aspekt angår foreliggende oppfinnelse også fremgangsmåte for behandling av en sykdom eller lidelse som kan behandles ved endret cellesignalerings aktivitet av et mål-antigen, idet fremgangsmåten omfatter å administrere til et individ med behov for dette en terapeutisk effektiv mengde av en modifisert ABM, hvor den modifiserte ABM omfatter en tung kjede eller lett kjede variabel region omfattende minst én aminosyresubstitusjon i minst én struktur (”framework”)-region av den tunge kjede eller lette kjede variable regionen sammenlignet med den tunge kjede eller lette kjede variable regionen av en parental ABM, og hvor substitusjonen resulterer i endret cellesignalerings aktivitet av et mål-antigen når den modifiserte ABM er kompleksert med mål-antigenet.
I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av en sykdom eller lidelse som kan behandles ved endret evne til å mediere kryssbinding av ett eller flere mål-antigener, idet fremgangsmåten omfatter å administrere til et individ med behov for dette en terapeutisk effektiv mengde av en modifisert ABM, hvor den modifiserte ABM omfatter en tung kjede eller lett kjede variabel region omfattende minst én aminosyresubstitusjon i minst én struktur (”framework”)-region av den tunge kjede eller lette kjede variable regionen sammenlignet med den tunge kjede eller lette kjede variable regionen av en parental ABM og hvor den modifiserte ABM har endret evne til å mediere kryssbinding av ett eller flere mål-antigener som et resultat av substitusjonen.
I en spesiell utførelsesform omfatter den modifiserte ABM administrert ifølge foreliggende oppfinnelse en tung kjede variabel region valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:4, SEKV ID NR:36 og SEKV ID NR:38.
I ett aspekt er sykdommen eller lidelsen som skal behandles med en modifisert ABM ifølge foreliggende oppfinnelse en celleproliferasjonslidelse. I én utførelsesform er celleproliferasjonslidelsen kreft. I et annet aspekt er sykdommen eller lidelsen som skal behandles med en modifisert ABM ifølge foreliggende oppfinnelse en B-cellelidelse. I en spesifikk utførelsesform er B cellelidelsen et B celle-lymfom.
Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelse av en modifisert ABM ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av kreft.
I en spesiell utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse også anvendelse av en modifisert ABM ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av kreft, hvor nevnte kreft er valgt fra gruppen bestående av B-celle lymfom, brystkreft, blærekreft, hode-hals kreft, hudkreft, pankreaskreft, lungekreft, eggstokkreft, kolonkreft, prostatakreft, nyrekreft og hjernekreft.
I en annen spesiell utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse også anvendelse av en modifisert ABM ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av kreft, hvor nevnte antigenbindende molekyl blir anvendt i en terapeutisk effektiv mengde fra ca.1,0 mg/kg til ca. 15 mg/kg. I en ytterligere utførelsesform er den terapeutisk effektive mengden fra ca.1,5 mg/kg til ca.12 mg/kg. I en ytterligere utførelsesform er den terapeutisk effektive mengden fra ca. 1,5 mg/kg til ca. 4,5 mg/kg. I en ytterligere utførelsesform er den terapeutisk effektive mengden fra ca. 4,5 mg/kg til ca. 12 mg/kg. I en ytterligere utførelsesform er den terapeutisk effektive mengden ca.1,5 mg/kg. I en ytterligere utførelsesform er den terapeutisk effektive mengden ca.4,5 mg/kg. I en ytterligere utførelsesform er den terapeutisk effektive mengden ca. 12 mg/kg.
Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av kreft omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen til en pasient med behov for dette. I en spesiell utførelsesform er kreften valgt fra gruppen bestående av B-celle lymfom, brystkreft, blærekreft, hode-hals kreft, hudkreft, pankreaskreft, lungekreft, eggstokkreft, kolonkreft, prostatakreft, nyrekreft og hjernekreft.
Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av en prekankrøs tilstand eller lesjon omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av den farmasøytiske sammensetningen ifølge krav 85 eller 158 til en pasient med behov for dette. I en spesiell utførelsesform er den prekankrøse tilstanden eller lesjonen valgt fra gruppen bestående av oral leukoplaki, aktinisk keratose (solar keratose), prekankrøse polypper i kolon eller rektum, gastrisk epiteldysplasi, adenomatøs dysplasi, hereditær non-polypøs kolonkreft syndrom (HNPCC), Barretts øsofagus, blære dysplasi og prekankrøse lidelser i cervix.
Foreliggende oppfinnelse angår også et modifisert antigen-bindende molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse for anvendelse ved behandling eller forebygging av kreft. I en spesiell utførelsesform er kreften valgt fra gruppen bestående av B-celle lymfom, brystkreft, blærekreft, hode-hals kreft, hudkreft, pankreaskreft, lungekreft, eggstokkreft, kolonkreft, prostatakreft, nyrekreft og hjernekreft.
Foreliggende oppfinnelse angår også et modifisert antigen-bindende molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse for anvendelse ved behandling eller forebygging av en prekankrøs tilstand eller lesjon. I en spesiell utførelsesform er den prekankrøse tilstanden eller lesjonen valgt fra gruppen bestående av oral leukoplaki, aktinisk keratose (solar keratose), prekankrøse polypper i kolon eller rektum, gastrisk epiteldysplasi, adenomatøs dysplasi, hereditær non-polypøs kolonkreft syndrom (HNPCC), Barretts øsofagus, blære dysplasi og prekankrøse lidelser i cervix.
Foreliggende oppfinnelse angår også et modifisert antigen-bindende molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse for anvendelse ved behandling av en lidelse som er relatert til endret cellesignalerings aktivitet og/eller endret kryssbinding av ett eller flere mål-antigener.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
FIG 1. Aminosyresekvenssammenstilling av forskjellige anti-CD20 antistoff tung kjede variabel region-konstruksjoner. Aminosyresekvensen av variabel kjede tung region av monoklonalt antistoff 1F5 blir anvendt som referansesekvensen. Forskjeller i aminosyrer fra 1F5 er skravert.
FIG 2. Binding av forskjellige humaniserte anti-CD20 antistoffer til Raji B-celler. Den parentale (kimære) B-ly1 blir sammenlignet med de to humaniserte tung kjede variantene som ble identifisert å indusere sterk apoptose (BHH2 og BHH6), så vel som derivatene av (humanisert, ikke-apoptotiske) B-HL8-varianten som ble antatt å gjenopprette denne effekten (B-HL11 til 17). Alle humaniserte tung kjede varianter ble paret med samme BKV1 humaniserte lett kjede variant.
FIG 3. Binding av rituximab (O) og chB-ly1 (Δ) til CD20 på Raji B-lymfomceller.
FIG 4. Sammenligning av antistoff-avhengig apoptose ved tre anti-CD20 antistoffer. chB-ly1wt representerer en kimær B-ly1 antistoff-konstruksjon som har en murin variabel region og en human konstant region. BHH2-BKV1 representerer en humanisert variant omfattende murine B-ly1 CDR’er og humane struktur (”framework”)-regioner avledet fra VH1 klasse human kjønnscelle V-gener for den tunge kjeden og paret med BKV1 humanisert B-ly1 lett kjede. BHL8-BKV1wt representerer en humanisert variant omfattende murine B-ly1 CDR’er og humane struktur-regioner avledet fra to forskjellige human kjønnscelle V-gener og paret med BKV1 humanisert B-ly1 lett kjede.
FIG 5. Sammenligning av antistoff-avhengig apoptose ved fem humaniserte varianter av B-ly1 anti-CD20 antistoffet. BHH2-BKV1 representerer en humanisert variant omfattende murine B-ly1 CDR’er og humane struktur (”framework”)-regioner avledet fra VH1 klasse for den tunge kjeden (BHH2) og paret med BKV1 humanisert B-ly1 lett kjede. BHL8-BKV1wt representerer en humanisert variant omfattende murine B-ly1 CDR’er og humane struktur (”framework”)-regioner avledet fra to forskjellige humane kjønnscelle V-gener og paret med BKV1 humanisert B-ly1 lett kjede. BHL14-BKV1 representerer et derivat av BHL8, med en valin til lysin-substitusjon ved Kabat posisjon 12 og en valin til metioninsubstitusjon ved Kabat posisjon 48 av den tunge kjede variable regionen og paret med BKV1 lett kjede-konstruksjonen. BHL15-BKV1 W1 er også avledet fra BHL8, med en glysin til serin-substitusjon ved Kabat posisjon 16, og en valin til metioninsubstitusjon ved Kabat posisjon 48 av den tunge kjede variable regionen og paret med BKV1 lett kjede-konstruksjonen. BHL16-BKV1 W1 er avledet fra BHL8, med en leucin til valin-substitusjon ved Kabat posisjon 20 og en valin til metioninsubstitusjon ved Kabat posisjon 48 av den tunge kjede variable regionen og paret med BKV1 lett kjede-konstruksjonen. BHL17-BKV1 W1 er avledet fra BHL8, med en valin til metionin-substitusjon ved Kabat posisjon 48 av den tunge kjede variable regionen og paret med BKV1 lett kjede-konstruksjonen.
FIG 6. Sammenligning av antistoff-avhengig apoptose i Z-138 celler ved C2B8 anti-CD20 monoklonalt antistoff og to humaniserte varianter av B-ly1 antistoff, BHH2-BKV1 og BHL13-BKV1. BHH2-BKV1 representerer en humanisert variant omfattende murine B-ly1 CDR’er og humane struktur (”framework”)-regioner avledet fra VH1 klasse human kjønnscelle V-gener for den tunge kjeden og paret med BKV1 humanisert B-ly1 lett kjede. BHL13-BKV1 er avledet fra BHL8 (se Figur 5, ovenfor), med en leucin til valin-substitusjon ved Kabat posisjon 11 og en valin til metionin-substitusjon ved Kabat posisjon 48 i den tunge kjede variable regionen og paret med en BKV1 lett kjede.
FIG 7. B-celle deplesjon ved rituximab (◊) og chB-ly1 (■) i helblod for de tre forskjellige klassene av FcγRIIIa-158V/F genotype: (A) helblod fra en F/F-donor, homozygot for lavere affinitet reseptoren; (B) helblod fra en F/V-donor, heterozygot for affinitet reseptoren; og (C) helblod fra en volum/volum-donor, homozygot for høyere affinitet-reseptoren.
FIG 8. MALDI-TOF profil av et glykokonstruert, kimært B-ly1-antistoff. (A) Tabell som viser i detaljer prosentdelene av spesifikke topper; (B) Spekter for glykokonstruert kimær B-ly1; (C) Spekter for glykokonstruert kimær B-Ly1 behandlet med Endo-H.
FIG 9. Binding av forskjellige humaniserte anti-CD20-antistoffer til Raji B-celler. Forskjellene mellom B-HH2-konstruksjonen og B-HL8 og B-HL11-konstruksjonene er lokalisert i struktur (”framework”) 1 og 2-regionene hvor alle tre CDR’ene er identiske. B-HL8 og B-HL11 har deres FR1 og FR2-sekvenser avledet fra den humane VH3-klassen, mens den fullstendige B-HH2 strukturen (”framework”) er avledet fra human VH1. B-HL11 er et derivat av B-HL8 med enkeltmutasjonen Glu1 Gln, hvor Gln er aminosyreresten i B-HH2-konstruksjonen. Dette betyr at Glu1 Gln utvekslingen ikke endrer bindingsaffinitet eller intensitet. De andre forskjellene mellom B-HH2 og B-HL8 er 14 FR rester, av hvilke én eller flere vil påvirke antigen-bindende atferd for dette antistoffet.
FIG 10. Binding av det humaniserte anti-CD20-antistoffet BHL4-BKV1 til Raji målceller. B-HL4-konstruksjonen er avledet fra B-HH2-antistoffet ved å erstatte FR1 av B-HH2 med den fra den humane kjennscelle-sekvensen IGHV1-45 (Aksesjon nr. X92209). Denne konstruksjonen viser sterkt redusert antigenbindende evne, til tross for at den har ulike aminosyrer ved kun fire posisjoner innenfor FR1. Disse restene er lokalisert i posisjonene 2, 14, 28 og 30 i henhold til Kabat nummerering. Av disse synes posisjonene 28 og 30 å være innflytelsesrike posisjoner, ettersom de er del av Chotia-definisjonen av CDR1.
FIG 11. Sammenligning av bindings atferden mellom B-HH1, B-HH2, B-HH3 (alle paret med BKV1 humanisert B-ly1 lett kjede) og det parentale antistoffet B-ly1. Dataene viser at alle Abs viser en lignende EC50-verdi, men B-HH1-konstruksjonen binder med en lavere intensitet/støkiometri enn variantene B-HH2 og B-HH3. B-HH1 kan skjelnes fra B-HH2 og B-HH3 ved dens delvis humane CDR1 og CDR2-regioner (Kabat definisjon), så vel som Ala/Thr-polymorfisme i posisjon 28 (Kabat nummerering). Dette indikerer at den ene eller andre av posisjon 28, den fullstendige CDR1 og/eller den fullstendige CDR2 er viktig for antistoff/antigen-interaksjon.
FIG 12. Sammenligning av bindings atferd mellom B-HL1, B-HH1 og det parentale antistoffet B-ly1. Dataene viste fravær av enhver bindingsaktivitet i B-HL1-konstruksjonen og ca. halvparten av bindingsintensitet /støkiometri av B-HH1 sammenlignet med B-ly1. Både B-HL1, så vel som B-HH1, er utformet basert på akseptor-strukturer (”framework”) avledet fra den humane VH1-klassen. Blant andre forskjeller er posisjon 71 (Kabat nummerering) av B-HL1-konstruksjonen en påfallende forskjell, som indikerer dens antatte betydning for antigenbinding.
FIG 13. Sammenligning av bindings atferden mellom anti-CD20 antistoff tung kjede-konstruksjon B-HL2, og B-HL3 til dets antigen. I begge tilfeller ble den murine VL-sekvensen kombinert med de humaniserte tunge kjedene. Dataene viste at B-HL2 og B-HL3-konstruksjonene ikke fremviser CD-20 bindingsaktivitet.
FIG 14. Apoptotisk effekt av anti-CD20-antistoffer på Z-138 MCL-celler. FIG 15. Apoptose ved anti-CD20-antistoffer. Analysedetaljer: 5 x 10<5 >celler/brønn ble platet ut i 24-brønns plater (5 x 10<5 >celler/ml) i dyrkningsmedium.
10 μg/ml endelig konsentrasjon av det respektive antistoffet, PBS for den negative kontrollen eller 5mM Camptothecin (CPT) positiv kontroll ble tilsatt til brønnene. Prøver ble inkubert o/n (16 t), merket med AnnV-FITC og analysert ved FACS. Forsøk ble utført in triplo. (*): Signal for PBS alene subtrahert (PBS alene ga 8% og 2% AnnV+ for PR-1 og Z-138-celler, henholdsvis). Antistoffer anvendt var: C2B8 (kimært, ikke-glykokonstruert); BHH2-BKV1 (humanisert, ikkeglykokonstruert). Bemerk: dette forsøket involverer ikke noen ytterligere effektorceller, bare mål pluss antistoff eller kontroller.
FIG 16. Målcelle-dreping ved anti-CD20 antistoffer med immune effektorceller. Analysedetaljer: B-celle deplesjon i normalt helblod ble bestemt ved inkubering natten over og analyse for CD19+/CD3+ ved FACS. ADCC ble bestemt ved anvendelse av PBMC’er som effektorer med en 4 timers inkubering og et 25:1 effektor:mål-forhold. Mål-dreping ble målt ved Calcein-retensjon relativt til detergent-lysis (100%) og til lysis uten antistoff (0%). Antistoffer anvendt var:
C2B8 (kimært, ikke-glykokonstruert form); BHH2-BKV1-wt (humanisert, ikkeglykokonstruert form av BHH2-BKV1); BHH2-BKV1-GE (humanisert, glykokonstruert form av BHH2-BKV1).
FIG 17. MALDI/TOF-MS-profil av PNGaseF-frigjorte Fc-oligosakkarider av umodifisert, ikke-glykokonstruert BHH2-BKV1 humanisert IgG1 B-ly1 anti-humant CD20-antistoff.
FIG 18. MALDI/TOF-MS-profil av PNGaseF-frigjorte Fc-oligosakkarider av glykokonstruert BHH2-BKV1g1 humanisert IgG1 B-ly1 anti-humant CD20 antistoff. Glykokonstruksjonen ble utført ved koekspresjon i vertsceller av antistoffgener og et gen som koder for et enzym med β-1,4-N-acetylglukosaminyltransferase III (GnT-III) katalytisk aktivitet.
FIG 19. MALDI/TOF-MS profil av PNGaseF-frigjorte Fc-oligosakkarider av glykokonstruert BHH2-BKV1g2 humanisert IgG1 B-ly1 anti-human CD20-antistoff. Glykokonstruksjon ble utført ved koekspresjon i vertsceller av antistoff-gener og gener som koder for et enzym med β-1,4-N-acetylglukosaminyltransferase III (GnT-III) katalytisk aktivitet og som koder for et enzym med Golgi α-mannosidase II katalytisk aktivitet.
FIG 20. Binding av ikke-glykokonstruerte og glykokonstruerte (g2 versjon; se Figurene 17 - 19 for glykosyleringsprofiler) antistoffer til human FcgammaRIIIareseptor fremvist på overflaten av CHO-celler som uttrykker rekombinant CD16.
FIG 21. Apoptotisk effekt av ikke-Fc konstruerte og Fc-konstruerte anti-CD20-antistoffer på Z-138 MCL-celler. Analysedetaljer: 5 x 10<5 >celler/brønn ble platet ut i 24-brønns plater (5 x 10<5 >celler/ml) i dyrkningsmedium.10 μg/ml endelig konsentrasjon av det respektive antistoffet eller PBS for den negative kontrollen, ble tilsatt til brønnene. Prøver ble inkubert o/n (16 t), merket med AnnV-FITC og analysert ved FACS. Forsøk ble utført in triplo. Antistoffer anvendt var: C2B8 = rituximab (kimær, ikke-glykokonstruert form); BHH2-BKV1 (humanisert, ikkeglykokonstruert -se Figur 17 - 19 for glykosyleringsprofil); BHH2-BKV1g1 (humanisert, glykokonstruert); BHH2-BKV1g2 (humanisert, glykokonstruert).
Bemerk: dette forsøket omfatter ikke noen ytterligere effektorceller, bare mål pluss antistoff eller kontroller. (*): Signal for PBS alene ble subtrahert.
FIG 22. Binding av forskjellige humaniserte anti-CD20-antistoffer til Raji B-celler. Den humaniserte tunge kjede konstruksjonen BHH2 blir sammenlignet med derivatene derav BHH4 og BHH7. Også vist er varianter som stiler til innvirkningen på Kabat posisjonene 28 og 30 (BHH8 og BHH9).
FIG 23. Effekt av enkel aminosyre utveksling på apoptose ved anti-CD20 antistoffer på Z-138 MCL-celler. Analysedetaljer: 5 x 10<5 >celler/brønn ble platet ut i 24-brønns plater (5 x 10<5 >celler/ml) i dyrkningsmedium.10 μg/ml endelig konsentrasjon av det respektive antistoffet eller PBS for den negative kontrollen (ingen Ab), ble tilsatt til brønnene. Prøver ble inkubert o/n (16 t), merket med AnnV-FITC og analysert ved FACS. Forsøk ble utført in triplo. Antistoffer anvendt var: C2B8 (kimær, ikke-glykokonstruert), BHH2 (humanisert, ikke-glykokonstruert), BHH2-A (et derivat av BHH2 med en valin til leucin-substitusjon ved Kabat posisjon 11) og BHH2-B (et derivat av BHH2 med en lysin til valin-substitusjon ved Kabat posisjon 12), de sistnevnte tre paret med en BKV1 lett kjede. KD for antigenbinding forblir uendret ved substitusjon. Bemerk: dette forsøket omfatter ikke noen ytterligere effektorceller, bare mål pluss antistoff eller kontroller.
FIG 24. Effekt av enkelt aminosyre utveksling på apoptose ved tidligere inaktive anti-CD20 antistoffer på Z-138 MCL-celler. Analysedetaljer: 5 x 10<5 >celler/brønn ble platet ut i 24-brønns plater (5 x 10<5 >celler/ml) i dyrkningsmedium.
10 μg/ml endelig konsentrasjon av det respektive antistoffet eller PBS for den negative kontrollen, ble tilsatt til brønnene. Prøver ble inkubert o/n (16 t), merket med AnnV-FITC og analysert ved FACS. Forsøk ble utført in triplo. Antistoffer anvendt var: C2B8 (kimær, ikke-glykokonstruert), BHL8 (humanisert, ikkeglykokonstruert), BHL13 (et derivat av BHL8 med en leucin til valin-substitusjon ved Kabat posisjon 11 og en valin til metionin-substitusjon ved Kabat posisjon 48) og BHL14 (et derivat av BHL8 med en valin til lysin-substitusjon ved Kabat posisjon 12 og en valin til metionin-substitusjon ved Kabat posisjon 48), de sistnevnte tre paret med en BKV1 lett kjede. Bemerk: dette forsøket omfatter ikke noen ytterligere effektorceller, bare mål pluss antistoff eller kontroller.
FIG 25. Effekt av enkelt aminosyre utveksling innenfor den lette kjeden på apoptose ved anti-CD20 antistoffer på Z-138 MCL-celler. Analysedetaljer: 5 x 10<5 >celler/brønn ble platet ut i 24-brønns plater (5 x 10<5 >celler/ml) i dyrkningsmedium.
10 μg/ml endelig konsentrasjon av det respektive antistoffet, PBS for den negative kontrollen (ingen Ab) eller 5mM Camptothecin (CPT) for den positive kontrollen ble tilsatt til brønnene. Prøver ble inkubert o/n (16 t), merket med AnnV-FITC og analysert ved FACS. Forsøk ble utført in triplo. Antistoffer anvendt var: BHH2-A (et derivat av BHH2 med en valin til leucin-substitusjon ved Kabat posisjon 11) paret med en BKV1 lett kjede, BHH6 (et derivat av BHH2 med en metionin til isoleucinsubstitusjon ved Kabat posisjon 34) paret med en BKV1 lett kjede og BHH6 paret med en BKV14 lett kjede (et derivat av BKV1 med en isoleucin til alaninsubstitusjon ved Kabat posisjon 106).
FIG 26. Tredimensjonal avbildning av et molekylært “kuleledd” ved grenseflaten mellom VH og CH1-domenene.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Betegnelser blir anvendt her som generelt anvendt på området, dersom ikke noe annet er definert som følger og heri.
Som anvendt her refererer betegnelsen antigen-bindende molekyl (ABM) i dens videste forstand til et molekyl som spesifikt binder en antigen determinant. Med "spesifikt binder" menes at bindingen er selektiv for antigenet og kan skjelnes fra uønskede eller uspesifikke interaksjoner. Som anvendt her skal betegnelsen modifisert antigen-bindende molekyl (eller modifisert ABM) referere til en ABM omfattende minst én aminosyrerest-substitusjon i den tunge kjede variable regionen og/eller CH1-regionen og/eller minst én aminosyrerest-substitusjon i den lette kjede variable regionen og/eller CL-region.
Som anvendt her er betegnelsen antistoff ment å omfatte hele antistoffmolekyler, omfattende monoklonale, polyklonale og multispesifikke (f.eks., bispesifikke) antistoffer, så vel som antistoffragmenter som har Fc-regionen og beholder bindingsspesifisitet og fusjonsproteiner som omfatter en region ekvivalent med Fc-regionen av et immunglobulin og som beholder bindingsspesifisitet. Også omfattet er antistoffragmenter som beholder bindingsspesifisitet omfattende, men ikke begrenset til, VH-fragmenter, VL-fragmenter, Fab-fragmenter, F(ab’)2-fragmenter, scFv-fragmenter, Fv-fragmenter, minibodies, dimerer, trimerer og tetramerer (se, f.eks., Hudson og Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)). Også omfattet er humaniserte, primatiserte og kimære antistoffer. Som anvendt her angir helt antistoff et immunglobulin-molekyl omfattende to tunge kjeder og to lette kjeder som hver omfatter en variabel og konstant region.
Som anvendt her skal betegnelsen variabel region referere til det N-terminale domenet av en immunglobulin tung eller lett kjede. I henhold til én utførelsesform av oppfinnelsen kan en modifisert ABM omfatte et funksjonelt fragment av en variabel region.
Som anvendt her skal betegnelsen tung kjede variabel region referere til det N-terminale domenet av en immunglobulin tung kjede. I ett eksempel er den tunge kjede variable regionen definert ved Kabat posisjonene 1 til 113 (med mulige insersjoner ved bestemte rester som angitt av Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)). I henhold til én utførelsesform av oppfinnelsen, kan en modifisert ABM omfatte et funksjonelt fragment av en tung kjede variabel region.
Som anvendt her skal betegnelsen tung kjede konstant region referere til det C-terminale domenet av en immunglobulin tung kjede. Det er fem naturlig forekommende klasser av tung kjede konstante regioner: IgA, IgG, IgE, IgD og IgM. I ett eksempel omfatter den tunge kjede konstante regionen et CH1-domene, et CH2-domene og et CH3-domene.
Som anvendt her skal betegnelsen CH1-region referere til det domenet av den tunge kjeden av et immunglobulin som er nøyaktig C-terminalt for den variable regionen og N-terminalt for hengselsregionen. I et immunglobulin av IgG-typen, for eksempel, er CH1 normalt definert ved Kabat posisjonene 114 til 228.
Som anvendt her er betegnelsen apoptose ment å referere til programmert celledød, som er karakterisert ved visse cellulære hendelser slik som nukleær fragmentering og/eller dannelse av apoptotiske legemer ved fusjon av cytoplasma, plasmamembraner og/eller organeller.
Som anvendt her skal betegnelsen agonist-aktivitet referere til aktivitet av et middel (f.eks. et antigen-bindende molekyl) når det interagerer med (for eksempel binder til) et molekyl forbundet med en celleoverflate og initierer eller induserer en reaksjon.
Som anvendt her skal betegnelsen antagonist-aktivitet referere til aktivitet av et middel (f.eks. et antigen-bindende molekyl) når det interagerer med (for eksempel binder til) et molekyl på en celle og forhindrer initiering eller induksjon av en reaksjon eller stanser en pågående reaksjon.
Som anvendt her refererer betegnelsene fusjon og kimær, når anvendt i referanse til polypeptider slik som ABM’er, til polypeptider omfattende aminosyresekvenser avledet fra to eller flere heterologe polypeptider, slik som andeler av antistoffer fra forskjellige arter. For kimære ABM’er, for eksempel, kan de ikke-antigen-bindende komponentene avledes fra en rekke arter, omfattende primater slik som sjimpanser og mennesker. Den konstante regionen av det kimære ABM er mest foretrukket hovedsakelig identisk med den konstante regionen av et naturlig humant antistoff; den variable regionen av det kimære antistoffet er mest foretrukket avledet fra et ikke-humant (dvs. donor) antigenbindende molekyl som spesifikt binder et antigen av interesse. Den kimære ABM kan omfatte hele donor variabel region; alternativt kan det kimære antistoffet omfatte et humanisert eller primatisert antistoff. Humaniserte antistoffer er en spesielt foretrukket form av fusjon eller kimært antistoff.
Som anvendt her blir betegnelsen humanisert anvendt for å referere til et antigen-bindende molekyl avledet fra et ikke-humant antigen-bindende molekyl, for eksempel et murint antistoff, som beholder eller hovedsakelig beholder de antigenbindende egenskapene av det parentale molekylet men som er mindre immunogent for mennesker. Dette kan oppnås ved forskjellige metoder omfattende (a) binding av hele de ikke-humane variable domenene på humane konstant regioner for å danne kimære antistoffer, (b) binding kun av de ikkehumane CDR’ene på humane struktur (”framework”) og konstante regioner med eller uten bibehold av kritiske struktur-rester (f.eks. de som er viktige for å beholde god antigen bindingsaffinitet eller antistoff-funksjoner) eller (c) transplantere hele de ikke-humane variable domenene, men "skjule" dem med en human-lignende del ved erstatning av overflate-rester. Slike metoder er beskrevet i Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Morrison og Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994).
Det er generelt 3 komplementaritetsbestemmende regioner eller CDR’er, (CDR1, CDR2 og CDR3) i hver av de tunge og lette kjede variable domenene av et antistoff, som er flankert av fire struktur (”framework”) subregioner (dvs. FR1, FR2, FR3 og FR4) i hver av de tunge og lette kjede variable domenene av et antistoff: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. En omtale av humaniserte antistoffer kan finnes, blant annet, i U.S. Patent nr. 6,632,927 og i publisert US-søknad nr.2003/0175269.
Tilsvarende blir, som anvendt her, betegnelsen primatisert anvendt for å referere til et antigen-bindende molekyl avledet fra et ikke-primat antigen-bindende molekyl, for eksempel et murint antistoff, som beholder eller hovedsakelig beholder antigen-bindende egenskaper av det parentale molekylet men som er mindre immunogent i primater.
I tilfellet hvor det er to eller flere definisjoner av en betegnelse som blir anvendt og/eller akseptert innenfor området, skal definisjonen av betegnelsen som anvendt her omfatte alle slike betydninger dersom ikke noe annet eksplisitt er angitt. Et spesifikt eksempel er anvendelse av betegnelsen "komplementaritetsbestemmende region" ("CDR") for å beskrive de ikkepåfølgende antigen kombinerings-setene funnet innenfor den variable regionen av både tung og lett kjede polypeptider. Denne spesielle regionen er beskrevet av Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) og av Chotia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), hvor definisjonene omfatter overlappende eller underklasser av aminosyrerester når sammenlignet med hverandre. Allikevel, skal anvendelse av den ene eller andre definisjon for å referere til en CDR av et antistoff eller varianter derav være innenfor omfanget av betegnelsen som definert og anvendt her. De passende aminosyrerestene som omspenner CDR’ene som definert ved hver av de ovenfor omtalte referansene er angitt nedenfor i Tabell I som en sammenligning. De nøyaktige rest numrene som omspenner en spesiell CDR vil variere avhengig av sekvensen og størrelsen av CDR. Fagfolk på området kan rutinemessig bestemme hvilke rester som omspenner en bestemt CDR gitt aminosyresekvensen av den variable regionen av antistoffet.
TABELL 1. CDR definisjoner<1>
<1>Nummerering av alle CDR-definisjonene i Tabell 1 er i henhold til
nummereringskonvensjonene angitt av Kabat et al. (se nedenfor).
<2>"OxAbM" angir CDR’ene som definert ved Oxford
Molecular’s "AbM" antistoff modellerings programvare.
Kabat et al. definerte også et nummereringsystem for variabelt domene sekvenser som er anvendbart til hvilket som helst antistoff. Fagfolk på området kan utvetydig anvise dette systemet for "Kabat nummerering" til hvilken som helst variabelt domene-sekvens, uten avhengighet av noen eksperimentelle data utover selve sekvensen. Som anvendt her angir "Kabat nummerering" nummereringssystemet angitt av Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Dersom ikke spesifisert på annen måte, er referanser til nummereringen av spesifikke aminosyrerest-posisjoner i en ABM i henhold til Kabat nummereringsystemet. Sekvensene i sekvenslisten er ikke nummerert i henhold til Kabat nummereringsystemet.
Som anvendt her refererer et polypeptid som har "GnTIII-aktivitet" til polypeptider som er i stand til å katalysere tilføyelse av en N-acetylglukosamin (GlcNAc)-rest i β-1-4-binding til det β-bundne mannosid av trimannosyl-kjernen av N-bundne oligosakkarider. Dette omfatter fusjonspolypeptider som har enzymatisk aktivitet lik, men ikke nødvendigvis identisk med, en aktivitet av β(1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III også kjent som β-1,4-mannosyl-glykoprotein 4-beta-N-acetylglucosaminyl-transferase (EC 2,4,1,144), i henhold til Nomenclature Comitee ved International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), som målt i et bestemt biologisk forsøk, med eller uten doseavhengighet. I tilfellet hvor doseavhengighet eksisterer, trenger det ikke være identisk med den for GnTIII, men heller hovedsakelig lik dose-avhengigheten i en gitt aktivitet sammenlignet med GnTIII (dvs. kandidat-polypeptidet vil vise større aktivitet eller ikke mer enn ca. 25 ganger mindre og, fortrinnsvis, ikke mer enn ca. ti ganger mindre aktivitet og mest foretrukket, ikke mer enn ca. tre ganger mindre aktivitet i forhold til GnTIII.)
Som anvendt her angir betegnelsen variant (eller analog) et polypeptid som atskiller seg fra et spesifikt angitt polypeptid ifølge oppfinnelsen ved aminosyreinsersjoner, delesjoner og substitusjoner, dannet ved anvendelse av, for eksempel, rekombinant DNA-teknikker. Varianter av ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter kimære, primatiserte eller humaniserte antigen-bindende molekyler hvor én eller flere av aminosyrerestene er modifisert ved erstatning, addisjon og/eller delesjon på en slik måte at det ikke hovedsakelig påvirker antigen bindingsaffinitet. Veiledning for bestemmelse av hvilke aminosyrerester som kan erstattes, tilføyes eller deleteres uten å oppheve aktiviteter av interesse, kan finnes ved å sammenligne sekvensen av det bestemte polypeptidet med den for homologe peptider og begrense antall aminosyresekvensendringer foretatt i regioner med høy homologi (konserverte regioner) eller ved å erstatte aminosyrer med konsensussekvens.
Alternativt kan rekombinante varianter som koder for disse samme eller lignende polypeptidene syntetiseres eller selekteres ved anvendelse av "redundansen" i den genetiske koden. Forskjellige kodon-substitusjoner, slik som de stille endringene som gir forskjellige restriksjonsseter, kan innføres for å optimalisere kloning inn i et plasmid eller viral vektor eller ekspresjon i et spesielt prokaryot eller eukaryot system. Mutasjoner i polynukleotidsekvensen kan reflekteres i polypeptidet eller domener av andre peptider tilføyd til polypeptidet for å modifisere egenskapene av hvilken som helst del av polypeptidet, for å endre egenskaper slik som ligandbinding affiniteter, interkjede affiniteter eller nedbrytning/turnover hastighet.
Som anvendt her skal aminosyrerest-substitusjon referere til erstatning av én eller flere aminosyrer i en referansesekvens (f.eks. et parentalt molekyl, slik som et antigen-bindende molekyl). I én utførelsesform kan aminosyrerestsubstitusjon oppnås ved, for eksempel en punktmutasjon i sekvensen av en nukleinsyre som koder for et polypeptid sammenlignet med en parental sekvens. I en annen utførelsesform kan substitusjon av en aminosyrerest oppnås ved å erstatte hele struktur (”framework”)-regionen av det parentale polypeptidet med, for eksempel en struktur-region fra en kjønnscelle VH-sekvens som omfatter den ønskede aminosyren i posisjonen som skal substitueres i referanse til den parentale.
"Konservative" aminosyresubstitusjoner er de utført ved å erstatte én aminosyre med en annen aminosyre som har lignende strukturelle og/eller kjemiske egenskaper, dvs. konservative aminosyreerstatninger og kan fremstilles på grunnlag av likhet i polaritet, ladning, oppløselighet, hydrofobisitet, hydrofilitet og/eller den amfipatiske naturen av restene omfattet. For eksempel omfatter ikkepolare (hydrofobe) aminosyrer glysin, alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin; polare nøytrale aminosyrer omfatter serin, treonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin; positivt ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin; og negativt ladete (sure) aminosyrer omfatter asparaginsyre og glutaminsyre. "Insersjoner" eller "delesjoner" er fortrinnsvis i området ca. 1 til 20 aminosyrer, mer foretrukket 1 til 10 aminosyrer. Variasjonen tillat kan bestemmes eksperimentelt ved systematisk å foreta insersjoner, delesjoner eller substitusjoner av aminosyrer i et polypeptid-molekyl ved anvendelse av rekombinant DNA-teknikker og analysere de resulterende rekombinante variantene for aktivitet.
Som anvendt her refererer betegnelsen parentalt antigen-bindende molekyl, eller parentalt molekyl til et polypeptid som har en bestemt aminosyresekvens kodet for av en polynukleotidsekvens. Sekvensen av det parentale molekylet (dvs., den parentale sekvensen) tjener som en referansesekvens for fremstilling av aminosyrerest-substitusjoner som endrer evnen av det resulterende molekylet (f.eks. et modifisert antigen-bindende molekyl) til å indusere eller blokkere cellesignalerings aktivitet og/eller kryssbinding av antigen. Likeledes tjener aktiviteten av et parentalt molekyl som referanse ved bestemmelse av hvorvidt en substitusjon har en effekt på cellesignalerings aktivitet og/eller kryssbinding av antigen og, hvor relevant, omfanget av denne effekten. En sekvens inneholdende én eller flere aminosyre-substitusjoner sammenlignet med den parentale sekvensen (f.eks., en modifisert ABM) kan på sin side tjene som en parental sekvens for ytterligere substitusjoner.
Som anvendt her skal betegnelsen endret cellesignalerings ativitet referere til en økning eller reduksjon i evnen av en ABM til å indusere eller hemme cellesignalerings aktivitet av et mål-antigen.
Som anvendt her skal betegnelsen endret kryssbinding av ett eller flere mål-antigener referere til en økning eller reduksjon i evnen av en ABM til å bringe nærmere hverandre og/eller i tettere nærhet med andre membranassosierte molekyler og/eller inn i en mer fordelaktig konformasjon for interaksjon, målantigener som er i stand til å danne komplekser (f.eks. gjennom kryssbinding av proteiner eller oligomerisering av membran-assosierte reseptorer) for å initiere cellesignaleringsveier.
Som anvendt her er cellesignalerings mekanisme eller cellesignalerings aktivitet ment å referere til hele signalerings (dvs. signaltransduksjon)-veien som fører til en bestemt cellulær hendelse eller biologisk funksjon, så vel som hvilket som helst signaleringstrinn langs veien.
Med en nukleinsyre eller polynukleotid som har en nukleotidsekvens minst, for eksempel 95% "identisk" med en referanse-nukleotidsekvens ifølge foreliggende oppfinnelse, er det ment at nukleotidsekvensen av polynukleotidet er identisk med referansesekvensen bortsett fra at polynukleotidsekvensen kan omfatte opptil fem punktmutasjoner for hver 100 nukleotider av referansenukleotidsekvensen. Med andre ord, for å oppnå et polynukleotid som har en nukleotidsekvens minst 95% identisk med en referanse-nukleotidsekvens, kan opptil 5% av nukleotidene i referansesekvensen deleteres eller substitueres med et annet nukleotid, eller flere nukleotider opptil 5% av de totale nukleotidene i referansesekvensen kan inserteres i referansesekvensen.
Som et praktisk spørsmål kan, hvorvidt hvilket som helst spesielt nukleinsyremolekyl eller polypeptid er minst 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med en nukleotidsekvens eller polypeptidsekvens ifølge foreliggende oppfinnelse, bestemmes konvensjonelt ved anvendelse av kjente datamaskinprogrammer. En foretrukket metode for å bestemme den beste totale matchen mellom en spørsmål-sekvens (en sekvens ifølge foreliggende oppfinnelse) og en underlagt sekvens også referert til som en global sekvenssammenstilling, kan bestemmes ved anvendelse av FASTDB datamaskinprogrammet basert på algoritmen ifølge Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). I en sekvenssammenstilling er spørsmål-sekvensen og den underlagte sekvensen begge DNA-sekvenser. En RNA-sekvens kan sammenlignes ved omdannelse av U'er til T'er. Resultatet av nevnte globale sekvenssammenstilling er i prosent identitet. Foretrukne parametere anvendt i en FASTDB sammenstilling av DNA-sekvenser for å beregne prosent identitet er: Matriks=Enhetlig, k-tuppel=4, Mismatch straff=1, Joining straff=30, Randomisering Gruppe Lengde=0, Cutoff Score=1, Gap straff=5, Gap Størrelse straff 0,05, Vindu størrelse=500 eller lengden av den aktuelle nukleotidsekvensen, hvilken enn som er kortest.
Dersom den underlagte sekvensen er kortere enn spørsmål-sekvensen på grunn av 5' eller 3' delesjoner, ikke på grunn av indre delesjoner, må en manuell korreksjon foretas for resultatene. Dette er fordi FASTDB programmet ikke gjør rede for 5’ og 3’-trunkeringer av den underlagte sekvensen ved beregning av prosent identitet. For underlagte sekvenser trunkert ved 5’ eller 3’-endene, relativt til spørsmål-sekvensen, blir prosent identitet korrigert ved å beregne antall baser av spørsmål-sekvensen som er 5’ og 3’ for den underlagte sekvensen, som ikke er matchet/sammenstilt, som en prosent av de totale basene av spørsmålsekvensen. Hvorvidt et nukleotid er matchet/sammenstilt blir bestemt ved resultater av FASTDB sekvenssammenstillingen. Denne prosentdelen blir deretter subtrahert fra prosent identitet, beregnet ved det ovennevnte FASTDB-programmet ved anvendelse av de angitte parametrene, for å nå et endelig prosentidentitet score. Dette korrigerte scoret er det som anvendes for formålet ifølge foreliggende oppfinnelse. Kun baser utenfor 5’ og 3’-basene av den underlagte sekvensen, som fremvist ved FASTDB sammenstillingen, som ikke er matchet/sammenstilt med spørsmål-sekvensen, blir beregnet for formålene for manuell regulering av prosent identitet-score.
For eksempel blir en underlagt sekvens på 90 baser sammenstilt med en spørsmål-sekvens på 100 baser for å bestemme prosent identitet. Delesjonene forekommer ved 5’-enden av den underlagte sekvensen og derfor viser ikke FASTDB-sammenstillingen en matchet/sammenstilling av de første 10 basene ved 5’-enden. De 10 uparete basene representerer 10% av sekvensen (antall baser ved 5’ og 3’-endene ikke matchet/totalt antall i spørsmål-sekvensen) så 10% blir subtrahert fra prosent identitet-scoret beregnet ved FASTDB-programmet. Dersom de gjenværende 90 basene ble perfekt matchet ville den endelige prosent identitet være 90%. I et annet eksempel blir en 90 basers underlagt sekvens sammenlignet med en 100 basers spørsmål-sekvens. Denne gangen er delesjonene indre delesjoner slik at det ikke er noen baser på 5 ’ eller 3’-enden av den underlagte sekvensen som ikke er matchet/sammenstilt med spørsmålet. I dette tilfellet er prosent identitet beregnet ved FASTDB ikke manuelt korrigert. Igjen er det kun baser på 5’ og 3’-enden av den underlagte sekvensen som ikke er matchet/sammenstilt med spørsmål-sekvensen som det blir manuelt korrigert for. Ingen andre manuelle korreksjoner blir foretatt for formålene ifølge foreliggende oppfinnelse.
Med et polypeptid som har en aminosyresekvens minst, for eksempel 95% ”identisk” med en spørsmål-aminosyresekvens ifølge foreliggende oppfinnelse, er det ment at aminosyresekvensen av det underlagte polypeptidet er identisk med spørsmål-sekvensen bortsett fra at den underlagte polypeptidsekvensen kan omfatte opptil fem aminosyreendringer pr. hver 100 aminosyrer av spørsmålaminosyresekvensen. Med andre ord, for å oppnå et polypeptid som har en aminosyresekvens minst 95% identisk med en spørsmål-aminosyresekvens, kan opptil 5% av aminosyrerestene i den underlagte sekvensen bli insertert, deletert eller substituert med en annen aminosyre. Disse endringene av referansesekvensen kan forekomme ved de amino eller karboksyterminale posisjonene av referanse-aminosyresekvensen eller hvor som helst mellom de terminale posisjonene, innfelt enten individuelt blant rester i referansesekvensen eller i én eller flere sammenhengende grupper innenfor referansesekvensen.
Som et praktisk spørsmål kan, hvorvidt hvilket som helst bestemt polypeptid er minst 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med et referansepolypeptid bestemmes konvensjonelt ved anvendelse av kjente datamaskinprogrammer. En foretrukket metode for å bestemme den beste totale matchen mellom en spørsmål-sekvens (en sekvens ifølge foreliggende oppfinnelse) og en underlagt sekvens også referert til som en global sekvenssammenstilling, kan bestemmes ved anvendelse av FASTDB datamaskinprogrammet basert på algoritmen ifølge Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). I en sekvenssammenstilling er spørsmål og den underlagte sekvensen enten begge nukleotidsekvenser eller begge aminosyresekvenser. Resultatet av nevnte globale sekvenssammenstilling er i prosent identitet. Foretrukne parametere anvendt i en FASTDB aminosyresammenstilling er: Matriks=PAM 0, k tuppel=2, Mismatch straff=1, Joining straff=20, Randomisering Gruppe Lengde=O, Cutoff Score=1, Vindu Størrelse=sekvenslengde, Gap straff=5, Gap Størrelse straff=0,05, Vindu Størrelse=500 eller lengden av den underlagte aminosyresekvensen, hvilken som enn er kortere.
Dersom den underlagte sekvensen er kortere enn spørsmål-sekvensen på grunn av N- eller C-terminale delesjoner, ikke på grunn av indre delesjoner, må en manuell korreksjon utføres, av resultatene. Dette er fordi FASTDB-programmet ikke gjør rede for N- og C<:>terminale trunkeringer av den underlagte sekvensen ved beregning av global prosent identitet. For underlagte sekvenser trunkert ved de N-og C-termale endene, relativt til spørsmål-sekvensen, blir prosent identitet korrigert ved å beregne antall rester av spørsmål-sekvensen som er N- og C-terminal for den underlagte sekvensen, som ikke er matchet/sammenstilt med en korresponderende underlagt rest, som en prosent av de totale basene av spørsmål-sekvensen. Hvorvidt en rest er matchet/sammenstilt blir bestemt ved resultater av FASTDB-sekvenssammenstillingen. Denne prosentdelen blir deretter subtrahert fra prosent identitet, beregnet ved ovennevnte FASTDB-program ved anvendelse av de angitte parametrene, for å nå et endelig prosent identitet score. Dette endelige prosent identitet-score er det som blir anvendt for formålene ifølge foreliggende oppfinnelse. Bare rester på de N- og C-terminale endene av den underlagte sekvensen, som ikke er matchet/sammenstilt med spørsmålsekvensen, blir tatt i betraktning for formålene for å manuelt justere prosent identitet-scoret. Det vi si, kun spørsmål rest-posisjoner utenfor de fjerneste N- og C-terminale restene av den underlagte sekvensen.
For eksempel blir en underlagt sekvens på 90 aminosyrerester sammenstilt med en spørsmål-sekvens på 100 rester for å bestemme prosent identitet.
Delesjon forekommer ved den N-terminale enden av den underlagte sekvensen og derfor viser ikke FASTDB-sammenstillingen en matching/sammenstilling av de første 10 restene ved den N-terminale enden. De 10 uparete restene representerer 10% av sekvensen (antall rester ved de N- og C-terminale endene ikke matchet/totalt antall rester i spørsmål-sekvensen) så 10% blir subtrahert fra prosent identitet scoret beregnet ved FASTDB-programmet. Hvis de resterende 90 restene ble perfekt matchet ville den endelige prosent identiteten være 90%. I et annet eksempel blir en 90 resters underlagt sekvens sammenlignet med en spørsmål-sekvens på 100 rester. Denne gangen er delesjonene indre delesjoner slik at det ikke er noen rester ved de N- eller C-terminale endene av den underlagte sekvensen som ikke er matchet/sammenstilt med spørsmålsekvensen. I dette tilfellet blir prosent identitet beregnet ved FASTDB ikke manuelt korrigert. Enda en gang blir kun rest-posisjoner utenfor de N- og C-terminale endene av den underlagte sekvensen, som fremvist i FASTDB-sammenstillingen, som ikke er matchet/sammenstilt med spørsmål-sekvensen manuelt korrigert for. Ingen andre manuelle korreksjoner skal foretas for formålene ifølge foreliggende oppfinnelse.
En nukleinsyre som "hybridiserer under stringente betingelser" til en nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen, refererer som anvendt her til et polynukleotid som hybridiserer i en inkubering over natten ved 42° C i en løsning omfattende 50% formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natriumcitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 7,6), 5x Denhardt's løsning, 10% dekstransulfat og 20 μg/ml denaturert, klippet laksesperm DNA, fulgt av vasking av filtrene i 0,1x SSC ved ca.
65°C.
Som anvendt her skal betegnelsen Fc-region referere til en C-terminal region av en IgG tung kjede. Selv om grensene for Fc-regionen av en IgG tung kjede kunne variere litt, er den humane IgG tung kjede Fc-regionen vanligvis definert til å strekke seg fra aminosyreresten i posisjon Cys226 til den karboksylterminale enden.
Som anvendt her skal betegnelsen region ekvivalent med Fc-regionen av et immunglobulin omfatte naturlig forekommende alleliske varianter av Fc-regionen av et immunglobulin så vel som varianter som har endringer som gir substitusjoner, addisjoner eller delesjoner men som ikke vesentlig reduserer evnen av immunglobulinet til å mediere effektorfunksjoner (slik som antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet). For eksempel kan én eller flere aminosyrer deleteres fra den N-terminale eller C-terminale enden av Fc-regionen av et immunglobulin uten vesentlige tap av biologisk funksjon. Slike varianter kan velges i henhold til generelle regler kjent på området slik at de har minimal effekt på aktivitet. (Se, f.eks., Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)). I én utførelsesform kan en region ekvivalent med Fc-regionen også danne del av et heterologt fusjonsprotein. I noen utførelsesformer omfatter en region ekvivalent med Fc-regionen også en tilsvarende region fra en annen klasse av immunglobulin tung kjede (f.eks., IgA, IgE, IgD og IgM).
Som anvendt her refererer betegnelsen Golgi lokaliserings- domene til aminosyresekvensen av et polypeptid som finnes i Golgi som er ansvarlig for forankring av polypeptidet ved lokalisering innenfor Golgi-komplekset. Generelt omfatter lokaliserings-domener aminoterminale ”haler” av et enzym.
Som anvendt her angir betegnelsen effektorfunksjon de biologiske aktivitetene som kan tilskrives Fc-regionen (en nativ sekvens Fc-region eller aminosyresekvensvariant Fc-region) av et antistoff. Eksempler på antistoff effektorfunksjoner omfatter, men er ikke begrenset til, Fc-reseptor bindingsaffinitet, antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), antistoff-avhengig cellulær fagocytose (ADCP), cytokinsekresjon, immunkompleks-mediert antigen opptak ved antigenpresenterende celler, nedregulering av celleoverflate-reseptorer, osv.
Som anvendt her er betegnelsene konstruere, konstruert, konstruksjon, glykokonstruere, glykokonstruert, glykokonstruksjon og glykosylerings konstruksjon antatt å omfatte hvilken som helst manipulering av glykosyleringsmønsteret av et naturlig forekommende eller rekombinant polypeptid, slik som et antigenbindende molekyl (ABM) eller fragment derav.
Glykosylerings konstruksjon omfatter metabolsk konstruksjon av glykosyleringsmaskineriet for en celle, omfattende genetiske manipuleringer av oligosakkarid synteseveiene for å oppnå endret glykosylering av glykoproteiner uttrykt i celler. I én utførelsesform er glykosylerings konstruksjonen en endring i glykosyltransferase-aktivitet. I en spesiell utførelsesform resulterer konstruksjonen i endret glukosaminyltransferase-aktivitet og/eller fukosyltransferase-aktivitet.
Som anvendt her omfatter betegnelsen vertscelle hvilken som helst type av cellulært system som kan konstrueres for å danne polypeptidene og antigenbindende molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse. Vertsceller omfatter dyrkede celler, f.eks. mammalske dyrkede celler, slik som CHO-celler, BHK-celler, HEK293-EBNA-celler, NS0-celler, SP2/0-celler, Y0 myelomceller, P3X63 mus myelomceller, PER-celler, PER.C6-celler eller hybridomceller, gjærceller, insektceller og planteceller, for bare å nevne noen få, men også celler omfattet innenfor et transgent dyr, transgen plante eller dyrket plante eller dyrevev. I én utførelsesform er vertscellen konstruert for å tillate fremstilling av et antigenbindende molekyl med modifiserte glykoformer. I en foretrukket utførelsesform er det antigenbindende molekylet et antistoff, antistoffragment eller fusjonsprotein. I visse utførelsesformer har vertscellene blitt ytterligere manipulert til å uttrykke økte nivåer av ett eller flere polypeptider som har GnT-III aktivitet. I andre utførelsesformer har vertscellene blitt konstruert til å ha eliminert, redusert eller hemmet kjerne α1,6-fukosyltransferase-aktivitet. Betegnelsen kjerne α1,6-fucosyltransferase-aktivitet omfatter både ekspresjon av kjerne α1,6-fukosyltransferase-genet så vel som interaksjon av kjerne α1,6-fukosyltransferaseenzymet med dets substrat.
Som anvendt her omfatter betegnelsen Fc-mediert cellulær cytotoksisitet antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet og cellulær cytotoksisitet mediert av et oppløselig Fc-fusjonsprotein inneholdende en human Fc-region. Det er en immunmekanisme som fører til lysering av ”antistoff-målrettede celler” ved ”humane immun effektorceller”, hvor:
De humane immun-effektorcellene er en populasjon av leukocytter som fremviser Fc-reseptorer på deres overflate gjennom hvilke de binder til Fcregionen av antistoffer eller av Fc- fusjonsproteiner og utfører effektorfunksjoner. En slik populasjon kan omfatte, men er ikke begrenset til, mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) og/eller naturlige dreper (NK)-celler.
De antistoff-målrettede cellene er celler bundet av antistoffene eller Fcfusjonsproteiner. Antistoffene eller Fc fusjon-proteiner binder til målceller gjennom protein-delen N-terminalt for Fc-regionen.
Som anvendt her er betegnelsen økt Fc-mediert cellulær cytotoksisitet definert som enten en økning i antallet ”antistoff-målrettede celler” som blir lysert i et gitt tidsrom og ved en gitt konsentrasjon av antistoff, eller Fc-fusjonsprotein i mediet som omgir målcellene, ved mekanismen for Fc-mediert cellulær cytotoksisitet definert ovenfor, og/eller en reduksjon i konsentrasjonen av antistoff, eller Fc-fusjonsprotein, i mediet som omgir målcellene, nødvendig for å oppnå lysis av et gitt antall av ”antistoff-målrettede celler” i et gitt tidsrom ved mekanismen for Fc-mediert cellulær cytotoksisitet. Økningen i Fc-mediert cellulær cytotoksisitet er relativt til den cellulære cytotoksisiteten mediert av samme antistoff eller Fc- fusjonsprotein produsert av samme type av vertsceller, ved anvendelse av samme standard produksjons-, rensing, formulering og lagringsmetoder som er kjent for fagfolk på området men som ikke har blitt frembrakt ved vertsceller glykokonstruert til å uttrykke glykosyltransferase GnT-III ved fremgangsmåtene beskrevet her.
Med antistoff som har økt antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) menes et antistoff, som denne betegnelsen er definert her, som har økt ADCC som bestemt ved hvilken som helst egnet metode kjent for fagfolk på området. Ett akseptert in vitro ADCC-forsøk er som følger:
1) forsøket anvender målceller som er kjent å uttrykke mål-antigenet gjenkjent av den antigenbindende regionen av antistoffet;
2) forsøket anvender humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er), isolert fra blod fra en tilfeldig valgt frisk donor, som effektorceller;
3) forsøket blir utført i henhold til følgende fremgangsmåte:
i) PBMC’ene blir isolert ved anvendelse av standard tetthet sentrifugeringsmetoder og blir suspendert ved 5 x 10<6 >celler/ml i RPMI celledyrkningsmedium;
ii) målcellene blir dyrket ved standard vevskulturmetoder, høstet fra den eksponensielle vekstfasen med en viabilitet høyere enn 90%, vasket i RPMI celledyrkningsmedium, merket med 100 mikrocurie av <51>Cr, vasket to ganger med celledyrkningsmedium og resuspendert i celledyrkningsmedium med en tetthet på 10<5 >celler/ml;
iii) 100 μl av den endelige målcellesuspensjon ovenfor blir overført til hver brønn i en 96-brønns mikrotiterplate;
iv) antistoffet blir seriefortynnet fra 4000 ng/ml til 0,04 ng/ml i celledyrkningsmedium og 50 μl av de resulterende antistoffløsningene blir tilsatt til målcellene i den 96-brønns mikrotiterplaten, for testing in triplo av forskjellige antistoffkonsentrasjoner som dekker hele konsentrasjonsområdet ovenfor;
v) for kontroller for maksimal frigjøring (MR), mottar 3 ytterligere brønner i platen inneholdende de merkede målcellene 50 μl av en 2% (volum/volum) vandig løsning av ikke-ionisk detergent (Nonidet, Sigma, St. Louis), istedenfor antistoffløsningen (punkt iv ovenfor);
vi) for kontroller for spontan frigjøring (SR), mottar 3 ytterligere brønner i platen inneholdende de merkede målcellene 50 μl av RPMI celledyrkningsmedium istedenfor antistoffløsningen (punkt iv ovenfor);
vii) den 96-brønns mikrotiterplaten blir deretter sentrifugert ved 50 x g i 1 minutt og inkubert i 1 time ved 4°C;
viii) 50 μl av PBMC-suspensjonen (punkt i ovenfor) blir tilsatt til hver brønn, hvilket gir et effektor:målcelle-forhold på 25:1 og platene blir plassert i en inkubator under 5% CO2 -atmosfære ved 37<0>C i 4 timer;
ix) den cellefri supernatanten fra hver brønn blir høstet og den eksperimentelt frigjorte radioaktiviteten (ER) blir kvantifisert ved anvendelse av en gammateller;
x) prosentdelen av spesifikk lysis blir beregnet for hver antistoffkonsentrasjon i henhold til formelen (ER-MR)/(MR-SR) x 100, hvor ER er gjennomsnittlig radioaktivitet kvantifisert (se punkt ix ovenfor) for denne antistoffkonsentrasjonen, MR er gjennomsnittlig radioaktivitet kvantifisert (se punkt ix ovenfor) for MR-kontrollene (se punkt v ovenfor) og SR er gjennomsnittlig radioaktivitet kvantifisert (se punkt ix ovenfor) for SR-kontrollene (se punkt vi ovenfor);
4) ”økt ADCC” er definert som enten en økning i maksimal prosentdel av spesifikk lysis observert innenfor antistoffkonsentrasjonsområdet testet ovenfor, og/eller en reduksjon i konsentrasjonen av antistoff nødvendig for å oppnå halvparten av den maksimale prosentdelen av spesifikk lysis observert innenfor antistoffkonsentrasjonsområdet testet ovenfor. Økningen i ADCC er relativ til ADCC, målt med forsøket ovenfor, mediert av samme antistoff, fremstilt av samme type vertsceller, ved anvendelse av samme standard fremstilling, rensing, formulering og lagringsmetoder som er kjent for fagfolk på området men som ikke har blitt frembrakt av vertsceller konstruert til å overuttrykke GnT-III.
Antigen-bindende molekyler med tung kjede og/eller lett kjede aminosyresubstitusjoner
I ett aspekt angår foreliggende oppfinnelse ABM’er omfattende modfiserte tung kjede og/eller lett kjede V-regioner og/eller C-regioner og det funnet at evnen til disse ABM’ene til å indusere cellesignalerings aktivitet for et mål-antigen og/eller mediere kryssbinding av mål-antigen kan forbedres (dvs. induseres eller økes) eller reduseres (dvs. hemmes eller minskes) ved slike modifikasjoner. Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polypeptider, omfattende ABM’er, som har modifisert tung kjede og/eller lett kjede V-regioner og/eller C-regioner, nukleinsyresekvenser (f.eks. vektorer) som koder for slike polypeptider, fremgangsmåter for fremstilling av polypeptider som har modifisert tung kjede og/eller lett kjede V-regioner og/eller C-regioner og fremgangsmåter for anvendelse av de samme ved behandling av forskjellige sykdommer og lidelser.
Det er kjent at mange mekanismer er involvert i den terapeutiske effektiviteten av antistoffer, omfattende antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), komplement-avhengig cytotoksisitet (CDC) og induksjon av vekststans eller apoptose og blokkering eller hemming av cellevekst, celleproliferasjon, celleoverlevelse og/eller andre cellulære hendelser. For eksempel er tilfeller av induksjon av celledød og andre cellesignalerings hendelser ved agonistiske monoklonale antistoffer rapportert. Cerisano et al., viste induksjon av kaspaseuavhengig celledød karakterisert ved apoptose-lignende trekk (omfattende fosfatidyl-serin (PS) eksponering, morfologiske endringer og/eller propidium-jodid (PI)-opptak), så vel som homotypisk aggregering av Ewing's sarkom celler, ved stimulering med agonistiske antistoffer mot transmembran glykoproteinet, CD99 (f.eks., anti-CD99 013 MAb og O662 MAb) (Cerisano et al., Oncogene 23: 5664-5674 (2003)). Likeledes rapporterte Hahn et al om aktivering av MAPK signaleringsveier ved engasjement av CD99 med anti-CD99 monoklonale antistoffer (f.eks. DN16 og YG32), som førte til homotypisk aggregering av celler (Hahn et al., FEBS Letters 470: 350-354 (2000)). Pettersen et al. identifiserte et nytt funksjonelt domene av CD99 som kunne aktiveres av det anti-CD99 monoklonale antistoffet, Ad20, hvilken aktivering induserte apoptose i transformerte T-celler (Pettersen et al., J. Immunol. 166:4931-4942 (2001)). Monoklonale antistoffer mot CD47 (f.eks. B6H12) kan også indusere kaspaseuavhengig celledød, som er forbundet med cytoskjellett reorganisering signaleringsveier (Mateo et al., Blood 100:2882-2890 (2002)).
I andre eksempler har visse antistoffer mot CD20 (f.eks. rituximab og tositumomab) og CD52 (CAMPATH-1H) blitt vist å direkte indusere apoptose i tumorceller. Se Ludwig et al., Oncogene 22: 9097-9106 (2003). For rituximab og mange andre monoklonale antistoffer med liten eller ingen signaleringsaktivitet (anti-CD19, CD21, CD22 og Her2), ble evne til å indusere apoptose eller vekststans forbedret ved kjemisk omdannelse av antistoffene til IgG-IgG homodimerer. Ghetie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:7509-14 (1997). Det ble spekulert på at forøkningen skyldtes økt negativ signalering og/eller hyper kryssbinding ved de tetravalente antistoff homodimerene. Ghetie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:7509-14 (1997). Kryssbinding og økt apoptose har også blitt oppnådd gjennom anvendelse av sekundære antistoffer eller Fc-reseptor-bærende hjelpe-celler. Se Jazhirehi og Bonavida, Oncogene 24:2121-43 (2005).
Uten ønske om å være bundet av teori, har foreliggende oppfinnere bestemt at modifikasjoner av aminosyrerestene i ”albue” hengselsregionen av et antigen-bindende molekyl kan påvirke evnen av ABM til å indusere eller hemme signaleringsaktivitet og/eller kryssbinding av mål-antigen. Vinkelen av albuehengselsregionen kontrollerer orienteringen av V-regionen med hensyn til C-regionen av et immunglobulin og som sådan, letter interaksjonene av antistoffer med antigen og effektorproteiner. Se Lesk og Chotia, Nature 335: 188-90 (1988). Lesk og Chotia identifisert restene som utgjør det molekylære kuleleddet av albuehengselsregion i antistoffer, dvs. Kabat posisjonene 11, 110 og 112 i VH-regionen og posisjonene 149 og 150 i CH1-regionen og la merke til den høye graden av konservering på tvers av antistoffer av rester som utgjør dette leddet. Lesk og Chotia, Nature 335: 188-90 (1988). Imidlertid foretok de ikke modifikasjoner i kuleledd-restene eller restene i nærheten av disse. Landolfi et al. viste at modifikasjoner av Kabat posisjonene 10-13 i AF2, et nøytraliserende antistoff mot human IFNγ, resulterte i et betydelig tap av nøytraliserende aktivitet av antistoffet, men påvirket ikke binding av antistoffet til dets mål-antigen. Landolfi et al., J. Immunol. 166: 1748-54 (2001). Imidlertid viste ikke Landolfi et al. en effekt på evnen av et antistoff til å indusere cellesignalering eller til å mediere antigen kryssbinding.
Med en multivalent ABM tillater evnen til å endre orienteringen av de antigen-bindende setene justering av nærheten av de bundne antigen-enhetene når det er kompleksert med de multiple antigen-bindende setene. Nærheten av antigen-enhetene til hverandre letter større eller mindre interaksjon (f.eks. kryssbinding, dimerisering, osv.) mellom antigen-enhetene. For eksempel dersom albue-vinkelen av hvert VH/VL-CH1/CL-par i en ABM er orientert slik at de antigen-bindende setene blir brakt nærmere hverandre, vil de bundne antigenenhetene (f.eks., celleoverflate reseptor-molekyler) også bringes nærmere hverandre eller bringes i en konformasjon som er mer fordelaktig for interaksjon. Denne nærheten eller konformasjonelle endringen kan mediere interaksjoner, for eksempel kryssbinding og oligomerisering, mellom de bundne antigenene. På den annen side kan orientering av de antigen-bindende setene slik at de er lengre fra hverandre eller har en mindre fordelaktig konformasjon forhindre dem i å interagere.
Aminosyrerester ved VL-CL-grenseflaten kan også modifiseres til å påvirke orienteringen av det antigen-bindende setet. For eksempel er Kabat-restene 40, 80, 83, 105 og 106 i de lette kjede variable region strukturene (”framework”) plassert ved VL/CL-grenseflaten.
Aktiviteten av hvilke som helst cellesignalerings mekanismer kan påvirkes (dvs. induseres eller hemmes) av ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse. I ett aspekt ifølge oppfinnelsen, er cellesignalerings mekanismene involvert de initiert gjennom celleoverflate reseptorproteiner omfattende ionekanal-bundne, G-proteinbundne og enzym-bundne celleoverflate reseptorproteiner. Se generelt, Kapittel 15: Cell Signaling i MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, Alberts et al., eds., (3d ed.
1994). Følgelig omfatter, for eksempel, cellesignalerings aktiviteter ifølge foreliggende oppfinnelse, men er ikke begrenset til, de som fører til apoptose, celledifferensiering, cellevekst, celleproliferasjon og celleoverlevelse, så vel som hvilke som helst av signaleringstrinnene langs reaksjonsveien. I én utførelsesform finner cellesignaleringsaktiviteten sted gjennom en enzym-bundet reseptor; i en spesiell utførelsesform er den enzym-bundne reseptoren en reseptortyrosinkinase. I en annen utførelsesform finner cellesignaleringsaktiviteten sted gjennom en ionekanal-bundet reseptor.
De modifiserte tung kjede eller lett kjede V-regionene og/eller C-regionene av ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse skiller seg fra de tilsvarende ikke modifiserte parentale polypeptid (f.eks. et parentalt antigen-bindende molekyl)-regionene med minst én aminosyresubstitusjon. Det "parentale," "utgangs-", eller "ikke-modifiserte" polypeptidet omfatter foretrukket minst en andel av en antistoff tung kjede eller lett kjede og kan fremstilles ved anvendelse av teknikker tilgjengelig på området for fremstilling av polypeptider omfattende en tung kjede V-region eller CH1-region eller del derav og/eller en lett kjede V eller C-region eller del derav. I spesifikke utførelsesformer er det parentale polypeptidet et antigenbindende molekyl og omfatter minst en del av en VH eller VL-region. I visse utførelsesformer kan en modifisert tung kjede og/eller lett kjede V region fremstilles (f.eks. i henhold til metodene beskrevet her) og kan fusjoneres til et foretrukket heterologt polypeptid, slik som en antistoff-Fc. I én utførelsesform av oppfinnelsen omfatter en modifisert ABM eller fragment derav et fusjonsprotein, hvor en modifisert tung kjede V-region eller fragment derav er fusjonert til en tung kjede konstant region valgt fra gruppen bestående av IgA, IgG, IgE, IgD og IgM eller et fragment eller derivat derav. I en spesiell utførelsesform, er den tunge kjede konstante regionen IgG. I en annen utførelsesform av oppfinnelsen, omfatter en modifisert ABM eller fragment derav et fusjonsprotein, hvor en modifisert lett kjede V-region eller fragment derav er fusjonert til en lett kjede konstant region valgt fra gruppen bestående av IgA, IgG, IgE, IgD og IgM eller et fragment eller derivat derav. I en spesiell utførelsesform er den lette kjede konstante regionen IgG. I spesifikke utførelsesformer omfatter polypeptidene ifølge oppfinnelsen et helt antistoff (f.eks. IgG) omfattende lette kjeder og tunge kjeder som har en modifisert tung kjede og/eller lett kjede V-region.
Polynukleotider som koder for et polypeptid omfattende en modifisert tung kjede V-region eller CH1-region eller lett kjede V-region eller CL-region kan fremstilles ved metoder kjent på området ved anvendelse av veiledningen i henhold til foreliggende spesifikasjon for spesielle sekvenser. Disse metodene omfatter, men er ikke begrenset til, fremstilling ved seterettet (eller oligonukleotidmediert) mutagenese, PCR-mutagenese og kassett mutagenese av en tidligere fremstilt nukleinsyre som koder for polypeptidet. Seterettet mutagenese er en foretrukket metode for fremstilling av substitusjonsvarianter. Denne teknikken er velkjent på området (se f.eks. Carter et al., Nucleic Acids Res.13: 4431-4443 (1985) og Kunkel et. al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 82: 488 (1987). I korthet blir, ved utførelse av seterettet mutagenese av DNA, utgangs-DNA endret ved først å hybridisere et oligonukleotid som koder for den ønskede mutasjonen til en enkeltrådet av slikt utgangs-DNA. Etter hybridisering blir en DNA-polymerase anvendt for å syntetisere en fullstendig andre tråd, ved anvendelse av det hybridiserte oligonukleotidet som en primer og ved anvendelse av den enkeltrådete av utgangs-DNA som et templat. Således blir oligonukleotidet som koder for den ønskede mutasjonen inkorporert i det resulterende dobbelttrådete DNA.
PCR-mutagenese er også egnet for fremstilling av aminosyresekvensvarianter av det ikke-modifiserte utgangs-polypeptidet (se f.eks. Vallette et. al., Nuc. Acids Res.17: 723-733 (1989)). I korthet, når små mengder av templat-DNA blir anvendt som utgangsmateriale i en PCR, kan primere som avviker litt i sekvens fra den korresponderende regionen i et templat DNA anvendes for å danne relativt store mengder av et spesifikt DNA-fragment som skiller seg fra templat-sekvensen kun i de posisjonene hvor primerene skiller seg fra templatet.
En annen fremgangsmåte for fremstilling av ABM-varianter, kassett mutagenese, er basert på teknikken beskrevet av Wells et al., Gene 34: 315-323 (1985). Utgangsmaterialet er plasmidet (eller annen vektor) omfattende utgangs polypeptid-DNA som skal modifiseres. Kodonet(kodonene) i utgangs-DNA som skal muteres blir identifisert. Det må være et unikt restriksjonsendonuklease-sete på hver side av det identifiserte mutasjons-setet(setene). Hvis ingen slike restriksjonsseter finnes, kan de dannes ved anvendelse av den ovenfor beskrevne oligonukleotid-medierte mutagenesemetoden for å innføre dem ved passende steder i utgangs polypeptid-DNA. Plasmid-DNA blir kløyvet ved disse setene for å linearisere det. Et dobbeltrådet oligonukleotid som koder for sekvensen av DNA mellom restriksjonssetene men inneholdende de(n) ønskede mutasjonen(e) blir syntetisert ved anvendelse av standardmetoder, hvor de to trådene av oligonukleotidet blir syntetisert separat og deretter hybridisert sammen ved anvendelse av standardteknikker. Dette dobbeltrådete oligonukleotidet blir referert til som kassetten. Denne kassetten er utformet til å ha 5’ og 3’ -ender som er kompatible med endene av det lineariserte plasmidet, slik at det kan ligeres direkte til plasmidet. Dette plasmidet inneholder nå den muterte DNA-sekvensen.
Alternativt eller i tillegg kan den ønskede aminosyresekvensen som koder for en polypeptid-variant bestemmes og en nukleinsyresekvens som koder for slik aminosyresekvensvariant kan fremstilles syntetisk.
Aminosyresekvensen av det parentale polypeptidet kan modifiseres for å fremstille en ABM som har en modifisert tung kjede V-region og/eller modifisert CH1-region og/eller en modifisert lett kjede V-region og/eller modifisert CL-region, med endret evne til å indusere cellesignalerings aktivitet av et mål-antigen når den modifiserte ABM er kompleksert med (f.eks. bundet til) mål-antigenet. Cellesignalerings aktiviteten kan være agonist-aktivitet eller antagonist-aktivitet. I henhold til ett aspekt ifølge oppfinnelsen blir agonist-aktivitet indusert av et modifisert antigen-bindende molekyl når det binder til en cellemembran-assosiert reseptor og initierer en cellesignaleringsvei. I en spesifikk utførelsesform er cellesignaleringsveien en reaksjonsvei for apoptose. I en annen utførelsesform er cellesignaleringsvei en celledifferensiering reaksjonsvei. I henhold til et annet aspekt ved oppfinnelsen, oppstår antagonist-aktivitet ved et modifisert antigenbindende molekyl, for eksempel når ABM binder til en cellemembran-assosiert reseptor og forhindrer induksjon av en cellesignaleringsvei eller forstyrrer et pågående signal. Antagonist-aktivitet kan oppnås, for eksempel ved å blokkere binding og påfølgende signaltransduksjon av en endogen ligand og/eller ved å forhindre kryssbinding eller oligomerisering av reseptorer eller andre molekyler som ville være nødvendig for induksjon av en cellesignaleringsvei. I én utførelsesform er cellesignaleringsveien som er hemmet eller avbrutt en cellevekst reaksjonsvei. I en annen utførelsesform er cellesignaleringsveien som er hemmet eller avbrutt en celledeling reaksjonsvei. I en annen utførelsesform er cellesignaleringsveien som er hemmet eller avbrutt en celleoverlevelse reaksjonsvei.
Likeledes kan aminosyresekvensen av det parentale polypeptidet også modifiseres for å danne en ABM som har en modifisert tung kjede V-region eller modifisert C-region (f.eks. en modifisert CH1-region) og/eller en modifisert lett kjede V-region og/eller modifisert CL-region, med endret evne til å mediere kryssbinding av ett eller flere mål-antigener når det modifiserte ABM er kompleksert med (f.eks. bundet til) mål-antigenet(-antigenene). I én utførelsesform blir de bundne mål-antigenene (f.eks., celleoverflatereseptor-molekyler) bragt nærmere hverandre og/eller i en mer fordelaktig konformasjon for interaksjon enn de ville vært ved det tilsvarende ikke-modifiserte parentale ABM, hvilket derved øker kryssbinding og oligomerisering mellom de bundne antigenene. I en annen utførelsesform blir de bundne mål-antigenene (f.eks., celleoverflatereseptormolekyler) holdt lengre borte fra hverandre og/eller i en mindre fordelaktig konformasjon for interaksjon enn de ville vært ved det tilsvarende ikke-modifiserte parentale ABM, for derved å redusere eller forhindre kryssbinding og oligomerisering mellom de bundne antigenene. I en spesiell utførelsesform fører den økte kryssbindingen eller oligomeriseringen til økt apoptose. I en annen utførelsesform resulterer den økte kryssbindingen eller oligomeriseringen til økt celledifferensiering. I en annen utførelsesform resulterer reduksjonen i kryssbinding eller oligomerisering i redusert cellevekst, redusert celledeling eller redusert celleoverlevelse.
Vesentlige modifikasjoner av de biologiske egenskapene av den tunge kjede V-regionen eller CH1-region eller lett kjede V-region eller CL- region, kan oppnås ved seleksjon av substitusjoner som avviker betydelig i deres effekt med hensyn til å opprettholde (a) strukturen av polypeptid-ryggraden i området av substitusjonen, for eksempel som et flak (”sheet”) eller helisk konformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten av molekylet ved mål-setet eller (c) omfanget av sidekjeden. Naturlig forekommende rester er delt opp i klasser basert på felles egenskaper av sidekjedene:
(1) hydrofob: met, ala, val, leu, ile;
(2) nøytral hydrofil: cys, ser, thr;
(3) sur: asp, glu;
(4) basisk: asn, gln, his, lys, arg;
(5) rester som påvirker kjede orientering: gly, pro; og
(6) aromatisk: trp, tyr, phe.
Ikke-konservative substitusjoner vil medføre å skifte ut et medlem av én av disse klassene med et medlem av en annen klasse. Konservative substitusjoner vil medføre å skifte ut et medlem av én av disse klassene med et annet medlem av samme klasse.
Eksempler på polypeptider omfattende modifiserte ABM’er
I ett aspekt angår foreliggende oppfinnelse antigen-bindende molekyler med aminosyre-modifikasjoner som endrer evnen av ABM’ene til å indusere cellesignalerings aktivitet og/eller til å mediere kryssbinding av antigener. I én utførelsesform omfatter modifikasjonen av ABM minst én aminosyrerestsubstitusjon i minst én struktur (”framework”)-region av den tunge kjede eller lette kjede variable regionen sammenlignet med et parentalt molekyl. I en spesiell utførelsesform erstatter substitusjonen en aminosyrerest i tung kjede FR1. I en foretrukket utførelsesform omfatter modifikasjonen av ABM en substitusjon av en aminosyrerest ved én eller flere av Kabat posisjonene 8, 9, 10, 11, 12 eller 13 i den tunge kjede variable regionen. I en annen utførelsesform omfatter modifikasjonen av ABM en substitusjon av en aminosyrerest i tung kjede FR4. I en spesiell utførelsesform omfatter modifikasjonen av ABM en substitusjon av en aminosyrerest ved én eller flere av Kabat posisjonene 110 eller 112 i den tunge kjeden variable regionen. I en annen utførelsesform omfatter modifikasjon av ABM minst én aminosyrerest-substitusjon i den lette kjeden ved grenseflaten mellom V og C-regionene. I en mer spesiell utførelsesform omfatter modifikasjonen av ABM en substitusjon av en aminosyrerest ved én eller flere av Kabat posisjonene 40, 80, 83, 105 eller 106.
I én utførelsesform kan en aminosyre substitueres ved å frembringe en punktmutasjon i den parentale sekvensen som resulterer i den ønskede endringen i aminosyreresten(e). Alternativt kan modifikasjonen av ABM omfatte å erstatte en hel struktur (”framework”)-region av et parentalt molekyl med en struktur-region som omfatter en ønsket aminosyrerest ved en bestemt posisjon. I en spesiell utførelsesform omfatter modifikasjonen av ABM å erstatte FR1 fra et parentalt molekyl med FR1 kodet for av en kjønnscelle variabel gensekvens.
I en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter ABM minst en CH1-region og modifikasjon av ABM omfatter minst én aminosyrerest-substitusjon sammenlignet med et parentalt polypeptid. I en spesiell utførelsesform omfatter modifikasjonen av ABM substitusjon av én eller flere av aminosyrerestene i posisjonene 148, 149 og/eller 150 i den tunge kjede konstante regionen.
I et annet aspekt angår oppfinnelsen modifiserte antigen-bindende molekyler omfattende én eller flere trunkerte CDR’er av et parentalt antigenbindende molekyl. Slike trunkerte CDR’er vil inneholde, minimum, de spesifisitetbestemmende aminosyrerestene for den gitte CDR. Med "spesifisitetbestemmende rest" menes de restene som er direkte involvert i interaksjonen med antigenet. Generelt deltar bare ca. en femtedel til en tredjedel av restene i en gitt CDR i binding til antigen. De spesifisitet-bestemmende restene i en spesiell CDR kan identifiseres ved, for eksempel beregning av interatomiske kontakter fra tredimensjonal modellering og bestemmelse av sekvens variabiliteten ved en gitt rest-posisjon i henhold til metodene beskrevet i Padlan et al., FASEB J.9(1):133-139 (1995).
Følgelig angår oppfinnelsen også et isolert polynukleotid omfattende minst én komplementaritetsbestemmende region av et parentalt molekyl eller en variant eller trunkert form derav inneholdende i det minste de spesifisitet-bestemmende restene for nevnte komplementaritetsbestemmende region, hvor nevnte isolerte polynukleotid koder for et fusjonspolypeptid. Fortrinnsvis koder slike isolerte polynukleotider for et fusjonspolypeptid som er et modifisert antigen-bindende molekyl. I én utførelsesform omfatter polynukleotidet tre komplementaritetsbestemmende regioner av parentalt molekyl eller varianter eller trunkerte former derav inneholdende i det minste de spesifisitet-bestemmende restene for hver av nevnte tre komplementaritetsbestemmende regionene. I en annen utførelsesform koder polynukleotidet for hele den variable regionen av den lette eller tunge kjeden av et kimært (f.eks. humanisert) antistoff. Oppfinnelsen angår videre polypeptidene kodet for av slike polynukleotider.
I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen et modifisert antigenbindende molekyl omfattende minst én komplementaritetsbestemmende region av et parentalt molekyl eller en variant eller trunkert form derav inneholdende i det minste de spesifisitet-bestemmende restene for nevnte komplementaritetsbestemmende region og omfattende en sekvens avledet fra et heterologt polypeptid. I én utførelsesform omfatter det modifiserte antigenbindende molekylet tre komplementaritetsbestemmende regioner av det parentale molekylet eller varianter eller trunkerte former derav inneholdende i det minste de spesifisitet-bestemmende restene for hver av nevnte tre komplementaritetsbestemmende regionene. I et annet aspekt omfatter det modifiserte antigen-bindende molekylet den variable regionen av en antistoff lett eller tung kjede. I én spesielt anvendelig utførelsesform, er det antigen-bindende molekylet et kimært, f.eks. humanisert, antistoff. Oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for fremstilling av slike modifiserte antigen-bindende molekyler og anvendelse av de samme ved behandling av sykdom, omfattende celleproliferasjonslidelser.
Det er kjent at mange mekanismer er involvert i den terapeutiske effektiviteten av antistoffer, omfattende antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), komplement-avhengig cytotoksisitet (CDC) og induksjon av vekststans, celledifferensiering eller apoptose.
Foreliggende oppfinnelse angår modifiserte ABM’er som har økt evne til å indusere apoptose sammenlignet med det korresponderende ikke-modifiserte parentale ABM. For eksempel kan en parental ABM som har liten eller ingen evne til å indusere apoptose modifiseres ifølge foreliggende oppfinnelse for å fremstille en modifisert ABM som har evne til å indusere apoptose eller som har en økt evne til å indusere apoptose. Foreliggende oppfinnelse angår også modifiserte ABM’er som har økt evne til å indusere vekststans eller celledifferensiering sammenlignet med det tilsvarende ikke-modifiserte parentale ABM. For eksempel kan en parental ABM som har liten eller ingen evne til å indusere vekststans eller celledifferensiering modifiseres ifølge foreliggende oppfinnelse for å fremstille en modifisert ABM som har evne til å indusere vekststans eller differensiering eller som har en økt evne til å indusere vekststans eller differensiering.
Med hensyn til anti-CD20 antistoffer spesielt, indikerer for eksempel, majoriteten av eksperimentelle bevis at rituximab opererer gjennom konvensjonelle effektormekanismer målt ved CDC og ADCC-forsøk. Tilsvarende er det vist at resistensen av forskjellige lymfomceller mot rituximab in vivo er en funksjon av deres sensitivitet for CDC in vitro. Derimot krever virkemåte in vivo av et annet anti-CD20 antistoff som er godkjent for terapeutisk anvendelse, B1, hverken komplement eller naturlig drepe (NK)-celle-aktivitet. Snarere skyldes effektiviteten av B1 in vivo dets evne til å indusere potent apoptose. Generelt kan anti-CD20 monoklonale antistoffer deles inn i to distinkte kategorier basert på deres virkningsmekanisme ved fjerning av lymfomceller. Type I anti-CD20 antistoffer anvender primært komplement til å drepe målceller, mens Type II-antistoffer virker ved forskjellige mekanismer, primært apoptose. Rituximab og 1F5 er eksempler på Type I anti-CD20 antistoffer, mens B1 er et eksempel på et Type II-antistoff. Se, f.eks., Cragg, M.S. og Glennie, M.J., Blood 103(7):2738-2743 (April 2004); Teeling, J.L. et al., Blood 104(6):1793-1800 (September 2004).
U.S. Patentsøknad Pub. nr. 2005/0123546 ved Umaña et al. beskriver det første kjente tilfellet hvor et Type I anti-CD20 antistoff ble konstruert til å ha økte effektorfunksjoner slik som ADCC og til å generere potent apoptose-evne, hvilket effektivt endret et Type I anti-CD20-antistoff til et Type II anti-CD20-antistoff. I én utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse et modifisert anti-CD20 antistoff omfattende en substitusjon i en tung kjede eller lett kjede variabel region sammenlignet med et Type I parentalt anti-CD20-antistoff, hvor substitusjonen(e) resulterer i økt induksjon av apoptose ved det modifiserte anti-CD20-antistoffet. I en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse konstruerte Type II anti-CD20 antistoffer som har økt ADCC som et resultat av konstruksjon for økt effektorfunksjon og uten tap av vesentlig evne til å indusere apoptose. I én utførelsesform omfatter type II anti-CD20 antistoffene en substitusjon i én eller flere aminosyrer i den tunge kjede eller lette kjede variable regionen sammenlignet med et parentalt molekyl. I en annen utførelsesform er type I og/eller Type II anti-CD20 antistoffene konstruert til å ha et endret glykosyleringsmønster i Fcregionen. I en spesiell utførelsesform omfatter den endrede glykosyleringen av det modifiserte ABM et økt nivå av todelte (”bisected”) kompleks-rester i Fc-regionen. I en annen spesiell utførelsesform omfatter den endrede glykosyleringen av det modifiserte ABM et redusert nivå av fukoserester i Fc-regionen. Se U.S. Patentsøknad Pub. nr.20040093621 ved Shitara et al.. I en annen utførelsesform har type I eller Type II anti-CD20 antistoffene gjennomgått polypeptidkonstruksjon som vist i U.S. Pat. nr. 6,737,056 ved Presta eller U.S. Patentsøknad Pub. nr.
2004 0185045 (Macrogenics) eller U.S. Patentsøknad Pub. nr. 2004 0132101 (Xencor). Oppfinnelsen angår videre fremgangsmåter for fremstilling av slike konstruerte Type I eller Type II-antistoffer og fremgangsmåter for anvendelse av slike antistoffer ved behandling av forskjellige B-celle lidelser, omfattende B-celle lymfomer.
Kimære og humaniserte modifiserte ABM’er
Kimære mus/humane antistoffer er beskrevet. Se for eksempel, Morrison, S. L. et al., PNAS I1:6851-6854 (November 1984); Europeisk Patent Publikasjon nr. 173494; Boulianna, G. L, at al., Nature 312:642 (Desember 1984); Neubeiger, M. S. et al., Nature 314:268 (mars 1985); Europeisk Patent Publikasjon nr.
125023; Tan et al., J. Immunol. 135:8564 (November 1985); Sun, L. K et al., Hybridoma 5(1):517 (1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986). Se generelt, Muron, Nature 312:597 (Desember 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5(3) (mars 1985); Marx, Science 229:455 (August 1985); og Morrison, Science 229:1202-1207 (September 1985). Robinson et al., i PCT Publikasjonsnummer WO/88104936 beskriver et kimært antistoff med human konstant region og murin variabel region, som har spesifisitet for en epitop av CD20; den murine delen av det kimære antistoffet ifølge referansene ved Robinson er avledet fra 2H7 mus monoklonalt antistoff (gamma 2b, kappa). Selv om det i referansen bemerkes at det beskrevne kimære antistoffet er en "prime kandidat" for behandling av B celle lidelser, kan denne meddelelsen ikke betraktes som mer enn et forslag til de på området for å bestemme hvorvidt dette forslaget er nøyaktig for dette bestemte antistoffet, spesielt fordi referansen mangler eventuelle data for å underbygge en påstand om terapeutisk effektivitet og viktigst, data for anvendelse av høyere pattedyr slik som primater eller mennesker.
Fremgangsmåter for fremstilling av kimære antistoffer er tilgjengelig for de på området. For eksempel kan de lette og tunge kjedene uttrykkes separat, ved anvendelse av, for eksempel immunglobulin lett kjede og immunglobulin tung kjede i separate plasmider eller i en enkelt (f.eks. polysistronisk) vektor. Disse kan deretter renses og settes sammen in vitro til fullstendige antistoffer; metoder for gjennomføring av slik sammensetting er beskrevet. Se for eksempel Scharff, M., Harvey Lectures 69:125 (1974). In vitro reaksjonsparametere for fremstilling av IgG antistoffer fra reduserte isolert lette og tunge kjeder er også beskrevet. Se for eksempel Sears et al., Biochem.16(9):2016-25 (1977).
I en spesielt foretrukket utførelsesform er den kimære ABM ifølge foreliggende oppfinnelse et humanisert antistoff. Metoder for humanisering av ikke-humane antistoffer er kjent på området. For eksempel kan humaniserte ABM’er ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles i henhold til metodene ifølge U.S. Pat. nr.5,225,539 ved Winter; U.S. Pat. nr.6,180,370 ved Queen et al.; U.S. Pat. nr.6,632,927 ved Adair et al.; U.S. Pat. søknad Pub. nr.2003/0039649 ved Foote; U.S. Pat. søknad Pub. nr.2004/0044187 ved Sato et al.; eller U.S. Pat. søknad Pub. nr.2005/0033028 ved Leung et al.. Fortrinnsvis har et humanisert antistoff én eller flere aminosyrerester inkorporert i det fra en kilde som er ikkehuman. Disse ikke-humane aminosyrerestene blir ofte referert til som ”import” rester, som typisk er tatt fra et ”import” variabelt domene. Humanisering kan hovedsakelig utføres ved å følge metoden ifølge Winter og medarbeidere (Jones et al., Nature, 321:522- 525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), ved å erstatte hypervariabel region sekvenser med de tilsvarende sekvensene av et humant antistoff. Følgelig er slike ”humaniserte” antistoffer kimære antistoffer (U.S. Pat. nr.4,816,567) hvor hovedsakelig mindre enn et intakt humant variabelt domene er substituert med den tilsvarende sekvensen fra en ikke-human art. I praksis er humaniserte antistoffer typisk humane antistoffer hvor noen hypervariabel region-rester og muligens noen FR-rester er substituert med rester fra analoge seter i gnagerantistoffer. De aktuelle humaniserte anti-CD20 antistoffene vil omfatte konstante regioner av humant immunglobulin.
Valget av humane variable domener, både lette og tunge, som skal anvendes ved fremstilling av de humaniserte antistoffene er svært viktig for å redusere antigenisitet. I henhold til den såkalte ”beste tilpasning”-metoden, blir sekvensen av det variable domenet for et gnager-antistoff screenet mot hele bibliotek av kjente human variabelt domene-sekvenser. Den humane sekvensen som er nærmest den fra gnageren blir deretter akseptert som den humane struktur (”framework”)-regionen (FR) for det humaniserte antistoffet (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chotia et al., J. MoI. Biol., 196:901 (1987)). En annen metode for å selektere den humane struktur (”framework”)-sekvensen er å sammenligne sekvensen av hver individuell subregion av den fullstendige gnager strukturen (dvs. FR1, FR2, FR3 og FR4) eller en eller annen kombinasjon av de individuelle subregionene (f.eks. FR1 og FR2) mot et bibliotek av kjente humane variabel region-sekvenser som svarer til denne struktur (”framework”)-subregionen (f.eks. som bestemt ved Kabat nummerering) og velge den humane sekvensen for hver subregion eller kombinasjon som er den nærmeste til den fra gnageren (Leung U.S. Patentsøknad Publikasjon nr. 2003/0040606 A1, publisert 27. feb., 2003). En annen metode anvender en spesiell struktur (”framework”)-region avledet fra konsensus-sekvensen av alle humane antistoffer av en spesiell undergruppe av lette eller tunge kjeder. Den samme strukturen kan anvendes for mange forskjellige humaniserte antistoffer (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
Det er videre viktig at antistoffer blir humanisert med bibehold av høy affinitet for antigenet og andre fordelaktige biologiske egenskaper. For å oppnå dette målet blir humaniserte antistoffer, i henhold til en foretrukket metode, fremstilt ved en fremgangsmåte for analyse av de parentale sekvensene og forskjellige konseptuelle humaniserte produkter ved anvendelse av tredimensjonale modeller av de parentale og humaniserte sekvensene.
Tredimensjonale immunglobulinmodeller kan fremstilles ved anvendelse av datamaskinprogrammer velkjente for fagfolk på området (f.eks. InsightII, accelrys inc (tidligere MSI) eller ved http://swissmodel.expasy.org/ beskrevet av Schwede et al., Nucleic Acids Res.2003 (13):3381-3385). Undersøkelse av disse modellene tillater analyse av den sannsynlige rollen til restene i funksjonen av kandidat immunoglobulin-sekvensen, dvs. analysen av rester som påvirker evnen av kandidat-immunglobulinet til å binde dets antigen. På denne måten kan FR-rester velges ut og kombineres fra mottager og import-sekvensene slik at de ønskede antistoffegenskapene, slik som opprettholdt affinitet for mål-antigenet(antigenene), blir oppnådd. Generelt er hypervariabel region-restene direkte og mest hovedsakelig involvert i påvirkning av antigenbinding.
I en annen utførelsesform er de antigen-bindende molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse konstruert til å ha forbedret bindingsaffinitet i henhold til, for eksempel metodene beskrevet i U.S. Patenstsøknad Pub. nr. 2004/0132066 ved Balint et al..
I en foretrukket utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse et isolert polynukleotid omfattende en sekvens som koder for et polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i Tabellene 3 og/eller 5, nedenfor. Oppfinnelsen angår videre en isolert nukleinsyre omfattende en sekvens minst 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med en nukleotidsekvens vist i Tabellene 2 og/eller 4, nedenfor. I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen en isolert nukleinsyre omfattende en sekvens som koder for et polypeptid som har en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med en aminosyresekvens i Tabellene 3 og/eller 5, nedenfor. Oppfinnelsen omfatter også en isolert nukleinsyre omfattende en sekvens som koder for et polypeptid som har aminosyresekvensen ifølge hvilke som helst av konstruksjonene i Tabellene 3 og/eller 5, med konservative aminosyresubstitusjoner. I visse utførelsesformer kan ethvert av polynukleotidene eller polypeptidene ifølge Tabellene 2-5 utelukkes. Derfor omfatter ikke, for eksempel, i visse utførelsesformer, det modifiserte ABM og/eller polynukleotidet som koder for det modifiserte ABM, noen av eller alle SEKV ID NR:3, SEKV ID NR:4, SEKV ID NR:35, SEKV ID NR:36, SEKV ID NR:37 eller SEKV ID NR:38. I et annet eksempel omfatter ikke, i visse utførelsesformer, den modifiserte ABM ifølge foreliggende oppfinnelse noen av eller alle av SEKV ID NR:55-62.
I en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens som vist i Tabellene 3 og/eller 5, nedenfor. Oppfinnelsen angår videre et isolert polypeptid omfattende en sekvens kodet for av en nukleotidsekvens vist i Tabellene 2 og/eller 4, nedenfor. I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identisk med en aminosyresekvens i Tabellene 3 og/eller 5, nedenfor. Oppfinnelsen omfatter også et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens av hvilke som helst av konstruksjonene i Tabellene 3 og/eller 5, med konservative aminosyresubstitusjoner. I visse utførelsesformer kan hvilke som helst av polynukleotidene eller polypeptidene ifølge Tabellene 2- 5 utelukkes. Derfor omfatter ikke, for eksempel i visse utførelsesformer, polypeptidet en aminosyresekvens svarende til eller kodet for av hvilken som helst eller alle av SEKV ID NR:3, SEKV ID NR:4, SEKV ID NR:35, SEKV ID NR:36, SEKV ID NR:37 eller SEKV ID NR:38. I et annet eksempel omfatter ikke, i visse utførelsesformer, den modifiserte ABM ifølge foreliggende oppfinnelse noen av eller alle av SEKV ID NR:55-62.
TABELL 2
TABELL 3
TABELL 5
I en annen spesiell utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse et isolert polynukleotid omfattende en sekvens som koder for et polypeptid som har en aminosyresekvens avledet fra en parental sekvens vist i FIG. 1 og Tabell 6 og omfattende minst én aminosyresubstitusjon i minst én tung kjede FR-region. I en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens avledet fra en parental sekvens vist i FIG. 1 og Tabell 6 og omfattende minst én aminosyresubstitusjon i minst én tung kjede FR-region.
TABELL 6
I ett aspekt kan de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte en substitusjon av en hel struktur (”framework”)-region sammenlignet med en parental ABM. Følgelig angår, for eksempel, foreliggende oppfinnelse ytterligere et isolert polynukleotid omfattende en sekvens som koder for et polypeptid som har minst én tung kjede FR avledet fra en human kjønnscelle VH-sekvens. I en foretrukket utførelsesform er den humane VH kjønnscellesekvensen i FR1-regionen eller i Kabat posisjonene 8-13 avledet fra hvilken som helst av sekvensene identifisert i Tabell 7, nedenfor. Disse sekvensene er tilgjengelige fra IMGT database (http://imgt.cines.fr:8104/textes/IMGTrepertoire) og hver sekvens som identifisert ved dens aksesjonsnummer er uttrykkelig inntatt her ved referanse i sin helhet.
TABELL 7
I en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse et isolert polynukleotid omfattende en sekvens som koder for et polypeptid omfattende en aminosyresekvens ved Kabat posisjonene 8 til 13 av den tunge kjede variable regionen eller hvilken som helst undergruppe derav (f.eks. posisjonene 9 til 12, posisjonene 10-12, osv.) i henhold til hvilke som helst av sekvensene presentert i Tabell 8 nedenfor. I en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens ved Kabat posisjonene 8 til 13 eller hvilken som helst undergruppe derav (f.eks., posisjonene 9 til 12, 10 til 12, osv.) i henhold til hvilke som helst av sekvensene presentert i Tabell 8 nedenfor.
TABELL 8
I en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse et isolert polynukleotid omfattende en sekvens som koder for et polypeptid omfattende en aminosyresekvens ved Kabat posisjonene 108 til 113 av den tunge kjede variable regionen eller hvilken som helst undergruppe derav (f.eks., posisjonene 110 til 112, posisjonene 110 og 112, osv.). I en spesiell utførelsesform er sekvensen i posisjonene 108 til 113 som vist i Tabell 9 nedenfor. I en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens ved Kabat posisjonene 108 til 113 eller hvilken som helst undergruppe derav (f.eks., posisjonene 110 til 112, posisjonene 110 og 112, osv.) i henhold til hvilke som helst av sekvensene presentert i Tabell 9 nedenfor.
TABELL 9
I en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor og/eller en vertscelle som omfatter ett eller flere isolerte polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse.
Generelt kan hvilken som helst type av dyrket cellelinje anvendes for å uttrykke ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse. I en foretrukket utførelsesform blir CHO-celler, HEK293-EBNA-celler, BHK-celler, NS0-celler, SP2/0-celler, YO myelomceller, P3X63 mus myelomceller, PER-celler, PER.C6-celler eller hybridomceller, andre pattedyrceller, gjærceller, insektceller eller planteceller anvendt som bakgrunns-cellelinje for fremstilling av de konstruerte vertscellene ifølge oppfinnelsen.
Modifiserte ABM’er videre omfattende Fc-regioner og Fc region-varianter
I én utførelsesform kan ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfattende én eller flere aminosyresubstitusjoner i de tunge kjede V og/eller CH1-regionene og/eller lette kjede V og/eller C-regionene, videre omfatte en human Fcregion. I en spesifikk utførelsesform er den humane konstante regionen IgG1, som angitt i SEKV ID NR 80 og 81 og angitt nedenfor:
IgG1 Nukleotidsekvens (SEKV ID NR:80)
Imidlertid er varianter og isoformer av den humane Fc-regionen også omfattet av foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan variant Fc-regioner egnet for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse fremstilles i henhold til metodene vist i U.S. Pat. nr. 6,737,056 ved Presta (Fc region-varianter med endret effektorfunksjon på grunn av én eller flere aminosyremodifikasjoner); eller i U.S. Patentsøknader nr. 60/439,498; 60/456,041; 60/514,549; eller WO 2004/063351 (variant Fc-regioner med økt bindingsaffinitet på grunn av aminosyremodifikasjon); eller i U.S. Patentsøknad nr.10/672,280 eller WO 2004/099249 (Fc-varianter med endret binding til FcgammaR på grunn av aminosyremodifikasjon).
I et annet aspekt ved oppfinnelsen kan ABM’ene, som omfatter én eller flere aminosyresubstitusjoner i den tunge kjede V og/eller CH1-regionene og/eller lette kjede V og/eller C-regionene videre omfatte en Fc region-variant. En Fcregion kan konstrueres til å produsere en variant med endret bindingsaffinitet for én eller flere FcR’er. For eksempel kan én eller flere aminosyrerester av Fcregionen modifiseres for å endre (f.eks. øke eller redusere) binding til en FcR, som beskrevet i U.S. Provisional Pat. Appl. nr. 60/678,776. Generelt vil det foretas en aminosyresubstitusjon ved én eller flere av Fc-region-restene identifisert som å påvirke FcR-binding for å fremstille en slik Fc-region-variant. I foretrukne utførelsesformer vil ikke mer enn én til omtrent ti Fc region-rester deleteres eller substitueres. Fc-regionene her omfattende én eller flere aminosyremodifikasjoner (f.eks. substitusjoner) vil fortrinnsvis beholde minst ca. 80% og fortrinnsvis minst ca. 90% og mest foretrukket minst ca.95%, av den parentale Fc region-sekvensen eller av en nativ sekvens human Fc-region.
Det kan også dannes Fc-regioner modifisert ved aminosyre-insersjon, hvilke varianter har endret effektorfunksjon. For eksempel kan minst én aminosyrerest (f.eks. én til to aminosyrerester og generelt ikke mer enn ti rester) innføres i umiddelbar nærhet til én eller flere av Fc-region posisjonene identifisert her som å påvirke FcR-binding. Med i umiddelbar nærhet til menes innenfor én til to aminosyrerester av en Fc-region-rest identifisert her. Slike Fc-region varianter kan fremvise forbedret eller redusert FcR-binding og/eller effektorfunksjon. For å fremstille slike insersjons-varianter, kan en evaluere en kokrystall struktur av et polypeptid omfattende en bindingsregion av en FcR (f.eks. det ekstracellulære domenet av FcR av interesse) og Fc-regionen inn i hvilken aminosyreresten(e) skal inserteres (se f.eks. Sondermann et al. Nature 406:261 (2000); Deisenhofer, Biochemistry 20 (9): 2361-2370 (1981); og Burmeister et al., Nature 3442: 379-383, (1994)) for å rasjonelt utforme en modifisert Fc-region som oppviser, f.eks. forbedret FcR-bindingevne.
Ved å innføre de passende aminosyresekvens-modifikasjonene i en parental Fc-region, kan det frembringes en variant Fc-region som (a) medierer én eller flere effektorfunksjoner i nærvær av humane effektorceller mer eller mindre effektivt og/eller (b) binder en Fc γ-reseptor (FcγR) eller Fc neonatal reseptor (FcRn) med bedre affinitet enn det parentale polypeptidet. Slike modifiserte Fcregioner vil generelt omfatte minst én aminosyremodifikasjon i Fc-regionen.
I foretrukne utførelsesformer er den parentale polypeptid Fc-regionen en human Fc-region, f.eks. en nativ human IgG1 (A og ikke-A allotyper), IgG2, IgG3 eller IgG4 og alle allotyper kjent eller funnet fra hvilken som helst art. Fc-region. Slike regioner har sekvenser slik som de beskrevet i U.S. Provisional Patentsøknad nr.60/678,776.
I visse utførelsesformer har, for å fremstille en ABM omfattende én eller flere aminosyresubstitusjoner i den tunge kjede V og/eller CH1-regionene og/eller lette kjede V og/eller CH1-regionene og/eller den lette kjede V og/eller C-regionene og videre omfattende en modifisert Fc-region med forbedret effektorfunksjon (f.eks. ADCC), det parentale polypeptidet foretrukket preeksisterende ADCC-aktivitet (f.eks. det parentale polypeptidet omfatter en human IgG1 eller human IgG3 Fc-region). En modifisert Fc-region med forbedret ADCC medierer i noen utførelsesformer, ADCC hovedsakelig mer effektivt enn et antistoff med en nativ sekvens IgG1 eller IgG3 Fc-region.
I spesielle utførelsesformer, blir aminosyremodifikasjon(er) innført i CH2-domenet av den parentale Fc-regionen.
Polypeptidene ifølge oppfinnelsen som har modifiserte Fc-regioner kan underlegges én eller flere ytterligere modifikasjoner, avhengig av den ønskede eller tilsiktede anvendelsen av polypeptidet. Slike modifikasjoner kan involvere, for eksempel ytterligere endring av aminosyresekvensen (substitusjon, insersjon og/eller delesjon av aminosyrerester), fusjon til heterologt polypeptid(er) og/eller kovalente modifikasjoner. Slike ytterligere modifikasjoner kan fremstilles før, samtidig med eller etter, aminosyremodifikasjonen(e) beskrevet ovenfor som resulterer i en endring av Fc reseptorbinding og/eller effektorfunksjon.
Alternativt eller i tillegg kan det være anvendelig å kombinere aminosyremodifikasjoner med én eller flere ytterligere aminosyremodifikasjoner som endrer CIq-binding og/eller komplementavhengig cytoksisitetsfunksjon av Fcregionen. Utgangs-polypeptidet av spesiell interesse i dette henseende er ett som binder til CIq og oppviser komplementavhengig cytotoksisitet (CDC).
Aminosyresubstitusjoner beskrevet her kan tjene til å endre evnen av utgangspolypeptidet til å binde til CIq og/eller modifisere dets komplement-avhengige cytotoksisitets-funksjon (f.eks. redusere og fortrinnsvis avskaffe disse effektorfunksjonene). Imidlertid er polypeptider omfattende substitusjoner ved én eller flere av de beskrevne posisjonene med forbedret CIq-binding og/eller komplementavhengig cytotoksisitet (CDC)-funksjon omfattet her. For eksempel kan utgangs-polypeptidet være ute av stand til å binde CIq og/eller mediere CDC og kan modifiseres i henhold til læren heri slik at det oppnår disse ytterligere effektorfunksjonene. Videre kan polypeptider med pre-eksisterende CIqbindingsaktivitet, som eventuelt i tillegg har evne til å mediere CDC modifiseres slik at én av eller begge disse aktivitetene blir forbedret. Aminosyremodifikasjoner som endrer CIq og/eller modifiserer dens komplementavhengige cytotoksisitetsfunksjon er beskrevet, for eksempel i WO00/42072.
Som beskrevet ovenfor kan det utformes en Fc-region eller del derav med endret effektorfunksjon, f.eks. ved å modifisere CIq-binding og/eller FcR-binding og derved endre CDC-aktivitet og/eller ADCC-aktivitet. For eksempel kan det fremstilles en modifisert Fc-region med forbedret CIq-binding og forbedret FcγRIII-binding (f.eks. som har både forbedret ADCC-aktivitet og forbedret CDC-aktivitet). Alternativt kan det, når det er ønsket at effektorfunksjon reduseres eller fjernes, konstrueres en modifisert Fc-region med redusert CDC-aktivitet og/eller redusert ADCC-aktivitet. I andre utførelsesformer kan en øke kun én av disse aktivitetene og eventuelt også redusere den andre aktiviteten, f.eks. for å fremstille en modifisert Fc-region med forbedret ADCC-aktivitet men redusert CDC-aktivitet og omvendt.
En annen type av aminosyresubstitusjon tjener til å endre glykosyleringsmønsteret av polypeptidet. Dette kan oppnås, for eksempel ved å deletere én eller flere karbohydratgrupper funnet i polypeptidet og/eller tilføye ett eller flere glykosyleringsseter som ikke er til stede i polypeptidet. Glykosylering av polypeptider er typisk enten N-bundet eller O-bundet. N-bundet angir binding av karbohydratgruppen til sidekjeden av en asparaginrest. Peptidsekvensene asparagin-X-serin og asparagin-X-treonin, hvor X er hvilken som helst aminosyre bortsett fra prolin, er gjenkjennelsessekvenser for enzymatisk binding av karbohydratgruppen til asparagin-sidekjeden. Følgelig danner tilstedeværelse av den ene eller den andre av disse peptidsekvensene i et polypeptid et potensielt glykosyleringssete. O-bundet glykosylering refererer til binding av ett av sukrene N-aceylgalaktosamin, galaktose eller xylose til en hydroksyaminosyre, mest vanlig serin eller treonin, selv om 5-hydroksyprolin eller 5-hydroksylysin også kan anvendes.
I noen utførelsesformer tilveiebringer foreliggende oppfinnelse sammensetninger omfattende en modifikasjon av et parentalt polypeptid som har en Fc-region, hvor den modifiserte Fc-regionen omfatter minst én overflaterest aminosyremodifikasjon (se f.eks. Deisenhofer, Biochemistry 20(9):2361-70 (1981) og WO00/42072). I andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende oppfinnelse sammensetninger omfattende en modifikasjon av et parentalt polypeptid som har en Fc-region, hvor den modifiserte Fc-regionen omfatter minst én aminosyremodifikasjon i en ikke-overflate rest. I ytterligere utførelsesformer omfatter foreliggende oppfinnelse en variant av et parentalt polypeptid som har en Fc-region, hvor varianten omfatter minst én overflate aminosyremodifikasjon og minst én ikke-overflate aminosyremodifikasjon.
Den terapeutiske effektiviteten av de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse kan ytterligere forbedres ved å produsere dem i en vertscelle som er glykokonstruert til å ha endret ekspresjon av minst én glykoprotein-modifiserende glykosyltransferase. I én utførelsesform uttrykker den glykokonstruerte vertscellen videre én eller flere av de følgende: et polynukleotid som koder for et polypeptid som har GnTIII-aktivitet, et polynukleotid som koder for et polypeptid som har ManII-aktivitet eller et polynukleotid som koder for et polypeptid som har GalT-aktivitet. I en foretrukket utførelsesform uttrykker vertscellen et polynukleotid som koder for et polypeptid som har GnTIII-aktivitet eller ManII-aktivitet. I en annen foretrukket utførelsesform uttrykker vertscellen et polynukleotid som koder for et polypetid som har GnTIII-aktivitet så vel som et polynukleotid som koder for et polypeptid som har ManII-aktivitet. I enda en annen foretrukket utførelsesform er polypeptidet som har GnTIII-aktivitet et fusjonspolypeptid omfattende Golgi lokalisering domene fra et polypeptid som finnes i Golgi. I en annen foretrukket utførelsesform resulterer ekspresjon av de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse i en vertscelle som uttrykker et polynukleotid som koder for et polypeptid som har GnTIII-aktivitet, i modifiserte ABM’er med økt Fc-reseptor bindingsaffinitet og økt effektorfunksjon. Følgelig angår foreliggende oppfinnelse i én utførelsesform en vertscelle omfattende (a) en isolert nukleinsyre omfattende en sekvens som koder for et polypeptid som har GnTIII-aktivitet; og (b) et isolert polynukleotid som koder for en ABM ifølge foreliggende oppfinnelse, slik som et kimært, primatisert eller humanisert antistoff som binder human CD20. I en foretrukket utførelsesform er polypeptidet som har GnTIII-aktivitet et fusjonspolypeptid omfattende det katalytiske domenet av GnTIII og Golgi lokaliserings-domene er lokaliserings-domenet fra mannosidase II. Fremgangsmåte for fremstilling av slike fusjons-polypeptider og anvendelse av dem for å produsere antistoffer med økte effektorfunksjoner er beskrevet i U.S. Provisional Pat. Appl. nr. 60/495,142 og U.S. Pat. Appl. Publ. nr.2004/0241817. I en annen foretrukket utførelsesform er den kimære ABM et kimært antistoff eller et fragment derav, som har bindingsspesifisitet av det murine B-Ly1 antistoffet. I en spesielt foretrukket utførelsesform omfatter det kimære antistoffet en human Fc. I en annen foretrukket utførelsesform er antistoffet primatisert eller humanisert.
I én utførelsesform kan ett eller flere polynukleotider som koder for en ABM ifølge foreliggende oppfinnelse uttrykkes under kontroll av en konstitutiv promoter eller, alternativt, et regulert ekspresjonssystem. Egnede regulerte ekspresjonssystemer omfatter, men er ikke begrenset til, et tetracyklin-regulert ekspresjonssystem, et ecdyson induserbart ekspresjonssystem, et lac-switch ekspresjonssystem, et glukokortikoid-induserbart ekspresjonssystem, et temperatur-induserbart promoter-system og et metallotionein metall-induserbart ekspresjonssystem. Hvis mange forskjellige nukleinsyrer som koder for en ABM ifølge foreliggende oppfinnelse er omfattet innenfor vertscellesystemet, kan noen av dem uttrykkes under kontroll av en konstitutiv promoter, mens andre blir uttrykt under kontroll av en regulert promoter. Det maksimale ekspresjonsnivået anses å være det høyest mulige nivået av stabil polypeptid-ekspresjon som ikke har en signifikant ugunstig effekt på celleveksthastighet og vil bestemmes ved anvendelse av rutinemessig eksperimentering. Ekspresjonsnivåer blir bestemt ved metoder generelt kjent på området, omfattende Western blot-analyse ved anvendelse av et antistoff spesifikt for ABM eller et antistoff spesifikt for et peptidmerke fusjonert til ABM; og Northern blot-analyse. I et ytterligere alternativ kan polynukleotidet være operativt bundet til et rapportørgen; ekspresjonsnivåene av en modifisert ABM som har hovedsakelig samme bindingsspesifisitet for et parentalt antistoff blir bestemt ved å måle et signal korrelert med ekspresjonsnivået av rapportørgenet. Rapportørgenet kan transkriberes sammen med nukleinsyren(e) som koder for nevnte fusjonspolypeptid som et enkelt mRNA-molekyl; deres respektive kodende sekvenser kan være bundet enten ved et ”internal ribosome entry site” (IRES) eller ved en cap-uavhengig translasjonsenhancer (CITE). Rapportørgenet kan bli translatert sammen med minst én nukleinsyre som koder for en modifisert ABM som har hovedsakelig samme bindingsspesifisitet for et parentalt antistoff slik at en enkelt polypeptidkjede blir dannet. Nukleinsyrene som koder for ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være operativt bundet til rapportørgenet under kontroll av en enkelt promoter, slik at nukleinsyren som koder for fusjonspolypeptidet og rapportørgenet blir transkribert til et RNA-molekyl som blir alternativt splicet til to separate budbringer RNA (mRNA)-molekyler; ett av de resulterende mRNA’ene blir translatert til nevnte reporterprotein og det andre blir translatert til nevnte fusjonspolypeptid.
Ekspresjon av modifiserte ABM’er
Metoder som er velkjente for fagfolk på området kan anvendes for å konstruere ekspresjonsvektorer inneholdende den kodende sekvensen av en modifisert ABM som har hovedsakelig samme bindingsspesifisitet som et parentalt antistoff sammen med passende transkripsjonelle/translasjonelle kontrollsignaler. Disse metodene omfatter in vitro rekombinant DNA-teknikker, synteseteknikker og in vivo rekombinasjon/genetisk rekombinasjon. Se for eksempel teknikkene beskrevet i Maniatis et al., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989) og Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates og Wiley Interscience, N.Y (1989).
En rekke vert-ekspresjonsvektor-systemer kan anvendes for å uttrykke den kodende sekvensen av ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis blir pattedyrceller anvendt som vertscellesystemer transfektert med rekombinant plasmid-DNA eller kosmid DNA-ekspresjonsvektorer inneholdende den kodende sekvensen av proteinet av interesse og den kodende sekvensen av fusjonspolypeptidet. Mest foretrukket blir CHO-celler, HEK293-EBNA-celler, BHK-celler, NS0-celler, SP2/0-celler, YO myelomceller, P3X63 mus myelomceller, PER-celler, PER.C6-celler eller hybridomceller, andre pattedyrceller, gjærceller, insektceller eller planteceller anvendt som vertscellesystem. Noen eksempler på ekspresjonssystemer og seleksjonsmetoder er beskrevet i de følgende referansene og referansene deri: Borth et al., Biotechnol Bioen.71(4):266-73 (2000-2001), i Werner et al., Arzneimittelforschung/Drug Res.48/8: 870-80 (1998), i Andersen og Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), i Chadd og Chamow, Curr. Op. Biotechnol.12:188-194 (2001) og i Giddings, Curr. Op.
Biotechnol. 12: 450-454 (2001). I alternative utførelsesformer kan andre eukaryote vertscelle-systemer være omfattet, inkludert gjærceller transformert med rekombinante gjær-ekspresjonsvektorer inneholdende den kodende sekvensen for en ABM ifølge foreliggende oppfinnelse, slik som ekspresjonssystemene beskrevet i U.S. Pat. søknad nr.60/344,169 og WO 03/056914 (metoder for fremstilling av human-lignende glykoprotein i en ikke-human eukaryot vertscelle); insektcelle-systemer infisert med rekombinant virus-ekspresjonsvektorer (f.eks. baculovirus) inneholdende den kodende sekvensen av en modifisert ABM som har hovedsakelig samme bindingsspesifisitet som et parentalt antistoff; plantecellesystemer infisert med rekombinante virus-ekspresjonsvektorer (f.eks. blomkål mosaikkvirus, CaMV; tobakkmosaikkvirus, TMV) eller transformert med rekombinante plasmid ekspresjonsvektorer (f.eks. Ti-plasmid) inneholdende den kodende sekvensen av ABM ifølge oppfinnelsen, omfattende, men ikke begrenset til, ekspresjonssystemene beskrevet i U.S. Pat. nr.6,815,184 (metoder for ekspresjon og sekresjon av biologisk aktive polypeptider fra genetisk konstruert andemat); WO 2004/057002 (produksjon av glykosylerte proteiner i bryofytt planteceller ved innføring av et glykosyl transferase-gen) og WO 2004/024927 (metoder for generering av ekstracellulært heterologt ikke-plante protein i mose protoplast); og U.S. Pat. søknader nr.60/365,769, 60/368,047 og WO 2003/078614 (glykoprotein-prosessering i transgene planter omfattende et funksjonelt mammalsk-GnTIII-enzym); eller mammalske systemer infisert med rekombinant virus ekspresjonsvektorer (f.eks. adenovirus, vaccinia virus) omfattende cellelinjer konstruert til å inneholde multiple kopier av DNA’et som koder for en modifisert ABM som har hovedsakelig samme bindingsspesifisitet som et parentalt antistoff enten stabilt amplifisert (CHO/dhfr) eller ustabilt amplifisert i double-minute kromosomer (f.eks. murine cellelinjer). I én utførelsesform er vektoren omfattende polynukleotidet(polynukleotidene) som koder for ABM ifølge oppfinnelsen polycistronisk. Også er, i én utførelsesform, ABM beskrevet ovenfor et antistoff eller et fragment derav. I en foretrukket utførelsesform er ABM et humanisert antistoff.
For fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, er stabil ekspresjon generelt foretrukket fremfor transient ekspresjon fordi den typisk oppnår mer reproduserbare resultater og også er mer mottagelig for storskala produksjon. Heller enn å anvende ekspresjonsvektorer som inneholder virale origo for replikasjon, kan vertsceller transformeres med de respektive kodende nukleinsyrene kontrollert av passende ekspresjonskontrollelementer (f.eks. promoter, enhancer, sekvenser, transkripsjonsterminatorer, polyadenyleringsseter, osv.) og en selekterbar markør. Etter innføring av fremmed DNA, kan konstruerte celler få vokse i 1-2 dager i et anriket medium og blir deretter skiftet til et selektivt medium. Den selekterbare markøren i det rekombinante plasmidet gir resistens mot seleksjonen og tillater seleksjon av celler som har stabilt integrert plasmidet i deres kromosomer og vokser for å danne foci som i sin tur kan klones og ekspanderes til cellelinjer.
Flere seleksjonssystemer kan anvendes, omfattende, men ikke begrenset til, herpes simplex virus thymidin kinase (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hypoksantin-guanin fosforibosyltransferase (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)) og adenin fosforibosyltransferase (Lowy et al., Cell 22:2,17 (1980))-gener, som kan anvendes i tk-, hgprt- eller aprt- celler, henholdsvis. Likeså kan antimetabolitt-resistens anvendes som grunnlag for seleksjon for dhfr, som overbringer resistens mot metotrexat (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, som gir resistens mot mykofenolsyre (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, som gir resistens mot aminoglykosidet G-418 (Colberre-Garapin et al., J. MoI Biol.150:1 (1981)); og hygro, som gir resistens mot hygromycin (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)-gener. Nylig har ytterligere selekterbare gener blitt beskrevet, dvs. trpB, som tillater celler å anvende indol istedenfor tryptofan; hisD, som tillater celler å anvende histinol istedenfor histidin (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); glutamin syntase-systemet; og ODC (ornitin dekarboksylase) som gir resistens mot ornitin dekarboksylase-inhibitoren, 2-(difluormetyl)-DL-ornitin, DFMO (McConlogue, i: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)).
Ekspresjon av modifiserte ABM’er omfattende Fc-regioner med endret glykosylering
I et annet aspekt angår foreliggende oppfinnelse videre en fremgangsmåte for modifikasjon av glykosyleringsprofilen av de modifiserte ABM’ene omfattende minst én aminosyresubstitusjon i V eller CH1-regionen som er produsert av en vertscelle, omfattende å uttrykke i nevnte vertscelle en nukleinsyre som koder for et modifisert ABM ifølge oppfinnelsen og en nukleinsyre som koder for et polypeptid med GnTIII-aktivitet eller en vektor omfattende slike nukleinsyrer. Fortrinnsvis er det modifiserte polypeptidet IgG eller et fragment derav omfattende Fc-regionen. I en spesielt foretrukket utførelsesform er ABM et humanisert antistoff eller et fragment derav. I en annen utførelsesform er vertscellen konstruert til å ko-uttrykke en ABM ifølge oppfinnelsen, GnTIII og mannosidase II (ManII).
De modifiserte ABM’ene produsert av vertscellene ifølge oppfinnelsen viser økt Fc reseptor-bindingsaffinitet og/eller økt effektorfunksjon som et resultat av modifikasjonen. I en spesielt foretrukket utførelsesform er ABM et humanisert antistoff eller et fragment derav inneholdende Fc-regionen. Fortrinnsvis er den økte Fc reseptorbindingsaffiniteten økt binding til en Fcγ-aktiverende reseptor, slik som FcγRIIIa-reseptoren. Den økte effektorfunksjonen er foretrukket en økning i én eller flere av de følgende: økt antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet, økt antistoff-avhengig cellulær fagocytose (ADCP), økt cytokinsekresjon, økt immunkompleks-mediert antigen opptak ved antigenpresenterende celler, økt Fc-mediert cellulær cytotoksisitet, økt binding til NK-celler, økt binding til makrofager, økt binding til polymorfonukleære celler (PMNs), økt binding til monocytter, økt kryssbinding av mål-bundne antistoffer, økt direkte signalering som induserer apoptose, økt dendrittisk cellemodning eller økt T-celle-priming.
Effektorfunksjoner kan måles og/eller bestemmes ved forskjellige analyser kjent for fagfolk på området. Forskjellige analyser for å måle effektorfunksjoner, omfattende Fc-reseptor bindingsaffinitet og komplementavhengig cytotoksisitet, er beskrevet i US søknad publikasjon nr. 2004/0241817A1. Cytokinsekresjon kan måles, for eksempel ved anvendelse av en sandwich-ELISA, se, f.eks. McRae et al., J. Immunol. 164: 23-28 (2000) og cytokin-sandwich ELISA-metoden tilgjengelig ved www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols eller ved metodene beskrevet i Takahashi et al., British J. Pharmacol.137: 315-322 (2002). Dendrittisk celle-modning, for eksempel, kan bestemmes ved anvendelse av forsøk som angitt av Kalergis og Ravetch, J. Exp. Med. 195: 1653-59 (2002). Eksempler på fagocytose og antigenopptak/presentasjons-forsøk er gitt av Gresham et al., J. Exp. Med. 191: 515-28 (2000); Krauss et al., J. Immunol.153: 1769-77 (1994); og Rafiq et al., J. Clin. Invest. 110: 71-79 (2002) og Hamano et al., J. Immunol. 164: 6113-19 (2000). Nedregulering av celleoverflate-reseptorer kan måles, for eksempel ved metoder angitt av Liao et al., Blood 83: 2294-2304 (1994). Generelle metoder, fremgangsmåter og forsøk, kan finnes i CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J.E., ed., (2d ed., 1998). Det er innenfor fagfolks kunnskap på området å tilpasse de ovenfor refererte metodene, fremgangsmåtene og analysene for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse.
Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for fremstilling av en ABM ifølge foreliggende oppfinnelse, som har modifiserte oligosakkarider i en vertscelle omfattende (a) dyrking av en vertscelle konstruert til å uttrykke minst én nukleinsyre som koder for et polypeptid som har GnTIII-aktivitet under betingelser som tillater fremstilling av en ABM ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor nevnte polypeptid som har GnTIII-aktivitet blir uttrykt i en mengde tilstrekkelig til å modifisere oligosakkaridene i Fc-regionen av nevnte ABM produsert av nevnte vertscelle; og (b) isolering av nevnte ABM. I en foretrukket utførelsesform er polypeptidet som har GnTIII-aktivitet et fusjonspolypeptid omfattende det katalytiske domenet av GnTIII. I en spesielt foretrukket utførelsesform omfatter fusjonspolypeptidet videre Golgi lokaliserings-domenet fra et polypeptid som finnes i Golgi.
Foretrukket er Golgi lokaliserings-domenet lokaliserings-domenet fra mannosidase II eller GnTI. Alternativt er Golgi lokaliserings-domenet valgt fra gruppen bestående av: lokaliserings-domenet fra mannosidase I, lokaliseringsdomenet fra GnT-II og lokaliserings-domenet fra α 1-6 kjerne fukosyltransferase. ABM’ene fremstilt ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse har økt Fc reseptor-bindingsaffinitet og/eller økt effektorfunksjon. Fortrinnsvis er den økte effektorfunksjonen én eller flere av de følgende: økt Fc-mediert cellulær cytotoksisitet (omfattende økt antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet), økt antistoff-avhengig cellulær fagocytose (ADCP), økt cytokinsekresjon, økt immunkompleks-mediert antigenopptak ved antigenpresenterende celler, økt binding til NK-celler, økt binding til makrofager, økt binding til monocytter, økt binding til polymorfonukleære celler, økt direkte signalering som induserer apoptose, økt kryssbinding av mål-bundne antistoffer, økt dendrittisk cellemodning eller økt T-celle-priming. Den økte Fc-reseptorbindingsaffiniteten er fortrinnsvis økt binding til Fc-aktiverende reseptorer slik som FcγRIIIa. I en spesielt foretrukket utførelsesform er ABM et humanisert antistoff eller et fragment derav.
I en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse en modifisert ABM som har hovedsakelig samme bindingsspesifisitet som et parentalt antistoff produsert ved metodene ifølge oppfinnelsen som har en økt proporsjon av todelte (”bisected”) oligosakkarider i Fc-regionen av nevnte polypeptid. Det er antatt at en slik ABM omfatter antistoffer og fragmenter derav omfattende Fc-regionen. I en foretrukket utførelsesform er ABM et humanisert antistoff. I én utførelsesform er prosentdelen av todelte oligosakkarider i Fc-regionen av ABM minst 50%, mer foretrukket, minst 60%, minst 70%, minst 80% eller minst 90% og mest foretrukket minst 90-95% av de totale oligosakkaridene. I enda en annen utførelsesform har ABM fremstilt ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen en økt proporsjon av ikke fukosylerte oligosakkarider i Fc-regionen som et resultat av modifikasjon av dens oligosakkarider ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse. I én utførelsesform er prosentdelen av ikke fukosylerte oligosakkarider minst 50%, fortrinnsvis, minst 60% til 70%, mest foretrukket minst 75%. De ikke fukosylerte oligosakkaridene kan være av den hybride eller komplekse typen. I en spesielt foretrukket utførelsesform har ABM produsert av vertscellene og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen en økt proporsjon av todelte, ikke fukosylerte oligosakkarider i Fc-regionen. De todelte, ikke fukosylerte oligosakkaridene kan være enten hybride eller komplekse. Spesifikt kan fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for fremstilling av ABM’er hvor minst 15%, mer foretrukket minst 20%, mer foretrukket minst 25%, mer foretrukket minst 30%, mer foretrukket minst 35% av oligosakkaridene i Fc-regionen av AMB er todelte, ikke fukosylerte.
Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for å produsere polypeptider hvor minst 15%, mer foretrukket minst 20%, mer foretrukket minst 25%, mer foretrukket minst 30%, mer foretrukket minst 35% av oligosakkaridene i Fc-regionen av polypeptidet er todelt hybrid ikke fukosylert.
I en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse en modifisert ABM som har hovedsakelig samme bindingsspesifisitet som et parentalt antistoff konstruert til å ha økt effektorfunksjon og/eller økt Fc reseptor-bindingsaffinitet, fremstilt ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Foretrukket er den økte effektorfunksjonen én eller flere av de følgende: økt Fc-mediert cellulær cytotoksisitet (omfattende økt antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet), økt antistoff-avhengig cellulær fagocytose (ADCP), økt cytokinsekresjon, økt immunkompleks-mediert antigen opptak ved antigenpresenterende celler, økt binding til NK-celler, økt binding til makrofager, økt binding til monocytter, økt binding til polymorfonukleære celler, økt direkte signalering som induserer apoptose, økt kryssbinding av mål-bundne antistoffer, økt dendrittisk cellemodning eller økt T-celle-priming. I en foretrukket utførelsesform er den økte Fc reseptorbindingsaffiniteten økt binding til en Fc-aktiverende reseptor, mest foretrukket FcγRIIIa. I én utførelsesform er ABM et antistoff, et antistoffragment inneholdende Fc-regionen eller et fusjonsprotein som omfatter en region ekvivalent med Fcregionen av et immunglobulin. I en spesielt foretrukket utførelsesform er ABM et humanisert antistoff.
Farmasøytiske sammensetninger omfattende modifiserte ABM’er Foreliggende oppfinnelse angår videre farmasøytiske sammensetninger omfattende ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse og en farmasøytisk akseptabel bærer.
Hvilket som helst konvensjonelt bærermateriale kan anvendes.
Bærermaterialet kan være et organisk eller uorganisk egnet for eteral, perkutan eller parenteral administrering. Egnede bærere omfatter vann, gelatin, gummi arabicum, laktose, stivelse, magnesiumstearat, talkum, vegetabilske oljer, polyalkylen-glykoler, petroleum gelé og lignende. Videre kan de farmasøytiske preparatene inneholde andre farmasøytisk aktive midler. Ytterligere tilsetningsmidler slik som smaksgivende midler, stabiliseringsmidler, emulgeringsmidler, buffere og lignende kan tilsettes i henhold til akseptert praksis for farmasøytisk formulering.
Uttrykket ”farmasøytisk akseptabel” blir anvendt her for å referere til de forbindelsene, materialene, sammensetningene og/eller doseringsformene som er, innenfor omfanget av trygg medisinsk bedømmelse, egnet for anvendelse i kontakt med vevene fra mennesker og dyr uten for høy toksisitet, irritasjon, allergisk respons eller annet problem eller komplikasjon, som er i samsvar med et rimelig nytte/risiko forhold.
Foreliggende oppfinnelse angår videre slike farmasøytiske sammensetninger for anvendelse ved behandling eller forebygging av kreft. Foreliggende oppfinnelse angår videre en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av kreft omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av den farmasøytiske sammensetningen ifølge oppfinnelsen.
Fortrinnsvis er kreften valgt fra gruppen bestående av brystkreft, blærekreft, hode-hals kreft, hudkreft, pankreaskreft, lungekreft, eggstokkreft, kolonkreft, prostatakreft, nyrekreft og hjernekreft.
Foreliggende oppfinnelse angår videre slike farmasøytiske sammensetninger for anvendelse ved behandling eller forebygging av en prekankrøs tilstand eller lesjon. Foreliggende oppfinnelse angår videre en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av en prekankrøs tilstand eller lesjon omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av den farmasøytiske sammensetningen ifølge oppfinnelsen.
Fortrinnsvis er den prekankrøse tilstanden eller lesjonen valgt fra gruppen bestående av oral leukoplaki, aktinisk keratose (solar keratose), prekankrøse polypper i kolon eller rektum, gastrisk epiteldysplasi, adenomatøs dysplasi, hereditær non-polypøs kolonkreft syndrom (HNPCC), Barretts øsofagus, blære dysplasi og prekankrøse lidelser i cervix.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av vertscellesystemer for fremstilling av glykoformer av de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse, som har økt Fc reseptorbindingsaffinitet, fortrinnsvis økt binding til Fc-aktiverende reseptorer og/eller som har økte effektorfunksjoner, omfattende antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet. Glykokonstruksjonsmetodene som kan anvendes med de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet mer detaljert i U.S. Pat. nr.6,602,684 og Provisional U.S. Patentsøknad nr. 60/441,307 og WO 2004/065540. De modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse kan alternativt glykokonstrueres til å ha reduserte fukoserester i Fc-regionen i henhold til teknikkene beskrevet i EP 1176 195 A1.
Fremstilling av cellelinjer for produksjon av modifiserte ABM’er med endret glykosyleringsmønster
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer vertscelle-ekspresjonssystemer for fremstilling av de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse som har modifiserte glykosyleringsmønstere. Spesielt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse vertscellesystemer for fremstilling av glykoformer av de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse som har en forbedret terapeutisk verdi. Derfor tilveiebringer oppfinnelsen vertscelle-ekspresjonssystemer valgt eller konstruert til å uttrykke et polypeptid som har GnT-III-aktivitet. I én utførelsesform er polypeptidet som har GnT-III-aktivitet et fusjonspolypeptid omfattende Golgi lokaliserings-domenet fra et heterologt polypeptid som finnes i Golgi. Spesifikt kan slike vertscelle-ekspresjonssystemer konstrueres til å omfatte et rekombinant nukleinsyremolekyl som koder for et polypeptid som har GnT-III, operativt bundet til et konstitutiv eller regulert promotersystem.
I én spesifikk utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en vertscelle som er konstruert til å uttrykke minst én nukleinsyre som koder for et fusjonspolypeptid som har GnT-III-aktivitet og omfatter Golgi lokaliseringsdomenet fra et heterologt polypeptid som finnes i Golgi. I ett aspekt blir vertscellen konstruert med et nukleinsyremolekyl omfattende minst ett gen som koder for et fusjonspolypeptid som har GnT-III-aktivitet og omfattende Golgi lokaliseringsdomenet av et heterologt polypeptid som finnes i Golgi.
Generelt kan hvilken som helst type av dyrket cellelinje, omfattende cellelinjene beskrevet ovenfor, anvendes som en bakgrunn for å konstruere vertscellelinjene ifølge foreliggende oppfinnelse. I en foretrukket utførelsesform blir CHO-celler, BHK-celler, NS0-celler, SP2/0-celler, YO myelomceller, P3X63 mus myelomceller, PER-celler, PER.C6-celler eller hybridomceller, andre pattedyrceller, gjærceller, insektceller eller planteceller anvendt som bakgrunnscellelinjen for fremstilling av de konstruerte vertscellene ifølge oppfinnelsen.
Oppfinnelsen er forutsatt å omfatte hvilke som helst konstruerte vertsceller som uttrykker et polypeptid som har GnT-III-aktivitet, omfattende et fusjonspolypeptid som omfatter Golgi lokaliserings-domenet fra et heterologt polypeptid som finnes i Golgi som definert her.
En eller flere nukleinsyrer som koder for et polypeptid som har GnT-III-aktivitet kan uttrykkes under kontroll av en konstitutiv promoter eller, alternativt, et regulert ekspresjonssystem. Slike systemer er velkjent på området og omfatter systemene beskrevet ovenfor. Dersom mange forskjellige nukleinsyrer som koder for fusjonspolypeptider som har GnT-III-aktivitet og omfattende Golgi lokaliseringsdomenet fra et heterologt polypeptid som finnes i Golgi er omfattet innenfor vertscellesystemet, kan noen av dem uttrykkes under kontroll av en konstitutiv promoter, mens andre blir uttrykt under kontroll av en regulert promoter.
Ekspresjonsnivåer av fusjonspolypeptidene som har GnT-III-aktivitet blir bestemt ved metoder generelt kjent på området, omfattende Western blot-analyse, Northern blot-analyse, rapportørgenekspresjons-analyse eller måling av GnT-III-aktivitet. Alternativt kan det anvendes et lektin som binder til biosyntetiske produkter av GnT-III, for eksempel E4-PHA lektin. Alternativt kan det anvendes et funksjonelt forsøk som måler den økte Fc reseptorbindingen eller økt effektorfunksjon mediert av antistoffer produsert av cellene konstruert med nukleinsyren som koder for et polypeptid med GnT-III-aktivitet.
Identifikasjon av transfektanter eller transformanter som uttrykker proteinet som har et modifisert glykosyleringsmønster
Vertscellene som inneholder den kodende sekvensen av et modifisert ABM ifølge foreliggende oppfinnelse og som uttrykker de biologisk aktive genproduktene kan identifiseres ved minst fire generelle metoder; (a) DNA-DNA eller DNA-RNA hybridisering; (b) nærvær eller fravær av ”markør”-gen-funksjoner; (c) analysere nivået av transkripsjon som målt ved ekspresjon av de respektive mRNA-transkriptene i vertscellen; og (d) deteksjon av genproduktet som målt ved immunanalyse eller ved dets biologiske aktivitet.
Ved den første metoden kan tilstedeværelsen av den kodende sekvensen av et modifisert ABM ifølge oppfinnelsen og den kodende sekvensen av polypeptidet som har GnT-III-aktivitet detekteres ved DNA-DNA eller DNA-RNA hybridisering ved anvendelse av prober omfattende nukleotidsekvenser som er homologe med de respektive kodende sekvensene, henholdsvis eller deler eller derivater derav.
Ved den andre metoden kan det rekombinante ekspresjonsvektor/ vertssystemet identifiseres og selekteres basert på nærvær eller fravær av visse ”markør”-gen-funksjoner (f.eks. tymidin kinase-aktivitet, resistens mot antibiotika, resistens mot metotrexat, transformasjons-fenotype, okklusjonslegeme-dannelse i baculovirus, osv.). For eksempel hvis den kodende sekvensen av den modifiserte ABM ifølge oppfinnelsen eller et fragment derav og den kodende sekvensen av polypeptidet som har GnT-III-aktivitet blir insertert i en markør-gensekvens av vektoren, kan rekombinanter inneholdende de respektive kodende sekvensene identifiseres ved fravær av markørgen-funksjonen. Alternativt kan et markørgen plasseres i tandem med de kodende sekvensene under kontroll av samme eller ulik promoter anvendt for å kontrollere ekspresjon av de kodende sekvensene. Ekspresjon av markøren som respons på induksjon eller seleksjon indikerer ekspresjon av den kodende sekvensen av det modifiserte ABM ifølge oppfinnelsen og den kodende sekvensen av polypeptidet som har GnT-III-aktivitet.
Ved den tredje metoden kan transkripsjonell aktivitet for den kodende regionen av det modifiserte ABM ifølge oppfinnelsen eller et fragment derav og den kodende sekvensen av polypeptidet som har GnT-III-aktivitet bedømmes ved hybridiseringsforsøk. For eksempel kan RNA isoleres og analyseres ved Northern blot ved anvendelse av en probe homolog til de kodende sekvensene av det modifiserte ABM ifølge oppfinnelsen eller et fragment derav og den kodende sekvensen av polypeptidet som har GnT-III-aktivitet eller spesielle deler derav. Alternativt kan totale nukleinsyrer fra vertscellen ekstraheres og analyseres for hybridisering til slike prober.
Ved den fjerde metoden kan ekspresjon av proteinprodukteter bedømmes immunologisk, for eksempel ved Western blots, immunanalyser slik som radioimmuno-presipitering, enzym-linked immunoassays og lignende. Den beste testen for suksess for ekspresjonssystemet omfatter imidlertid deteksjon av de biologisk aktive genproduktene.
Fremstilling og anvendelse av modifiserte ABM’er som har økt effektorfunksjon omfattende antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet
I foretrukne utførelsesformer tilveiebringer foreliggende oppfinnelse glykoformer av kimære modifiserte ABM’er som har hovedsakelig samme bindingsspesifisitet som det murine B-Ly1 antistoffet og som har økt effektorfunksjon omfattende antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet.
Glykosylerings-konstruksjon av antistoffer er tidligere beskrevet. Se, f.eks. U.S. Patent nr.6,602,684.
Kliniske forsøk med ukonjugerte monoklonale antistoffer (mAbs) for behandling av noen typer av kreft har nylig gitt lovende resultater. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Et kimært, ukonjugert IgG1 er godkjent for lavgradig eller follikulært B-celle non-Hodgkins lymfom. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm.12:223-25 (1997), mens en annen ukonjugert mAb, en humanisert IgG1 som målretter faste brysttumorer, også har vist lovende resultater i fase III kliniske forsøk. Deo et al., Immunology Today 18:121 (1997). Antigenene fra disse to mAbs blir uttrykt i stort monn i deres respektive tumorceller og antistoffene medierer potent tumordestruksjon ved effektorceller in vitro og in vivo. I motsetning til dette kan mange andre ukonjugerte mAbs med fine tumor-spesifisiteter ikke utløse effektorfunksjoner med tilstrekkelig potens til å være klinisk anvendelige. Frost et al., Cancer 80:311-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother.19:184-91 (1996). For noen av disse svakere mAbs, blir supplement cytokinterapi for tiden testet.
Tilsetning av cytokiner kan stimulere antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) ved å øke aktiviteten og antallet av sirkulerende lymfocytter. Frost et al., Cancer 80:311-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother.19: 184-91 (1996). ADCC, et lytisk angrep på antistoff-målrettede celler, blir utløst ved binding av leukocyttreseptorer til den konstante regionen (Fc) av antistoffer. Deo et al., Immunology Today 18:121 (1997).
En ulik, men komplementær, metode for å øke ADCC-aktivitet av ukonjugert IgG1 er å konstruere Fc-regionen av antistoffet. Proteinkonstruksjonstudier har vist at FcγR’er interagerer hovedsakelig med hengselsregionen av IgG CH2-domenet. Lund et al., J. Immunol.157:4963-69 (1996). Imidlertid krever FcγR-binding også tilstedeværelse av oligosakkarider kovalent bundet ved den konserverte Asn 297 i CH2-regionen. Lund et al, J. Immunol.157:4963-69 (1996); Wright og Morrison, Trends Biotech.15:26-31 (1997), hvilket indikerer at både oligosakkarid og polypeptid begge direkte bidrar til interaksjonssetet eller at oligosakkaridet er nødvendig for å opprettholde en aktiv CH2 polypeptidkonformasjon. Modifikasjon av oligosakkaridstrukturen kan derfor undersøkes som en metode for å øke affiniteten av interaksjonen.
Et IgG-molekyl bærer to N-bundne oligosakkarider i dets Fc-region, ett på hver tunge kjede. Som hvilket som helst glykoprotein, blir et antistoff produsert som en populasjon av glykoformer som har samme polypeptid-ryggrad men har forskjellige oligosakkarider bundet til glykosyleringssetene. Oligosakkaridene normalt funnet i Fc-regionen av serum IgG er av kompleks bi-antenne type (Wormald et al., Biochemistry 36:130-38 (1997), med et lavt nivå av terminal sialinsyre og todelt N-acetylglukosamin (GIcNAc) og en vekslende grad av terminal galaktosylering og kjerne fukosylering. Noen undersøkelser indikerer at minimal karbohydratstruktur nødvendig for FcγR-binding ligger innenfor oligosakkarid-kjernen. Lund et al., J. Immunol.157:4963-69 (1996)
De mus- eller hamster-avledete cellelinjene anvendt i industrien og den akademiske verden for produksjon av ukonjugerte terapeutiske mAbs binder normalt de nødvendige oligosakkarid-determinantene til Fc-seter. IgG’er uttrykt i disse cellelinjene mangler imidlertid de todelte GIcNAc funnet i lave mengder i serum IgG. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). I motsetning til dette ble det observert at et rotte myelom-produsert, humanisert IgG1 (CAMPATH-1H) omfattet et todelt GIcNAc i noen av dens glykoformer. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). Det rottecelle-avledete antistoffet nådde en lignende maksimal in vitro ADCC-aktivitet som CAMPATH-1H-antistoffer produsert i standard cellelinjer, men ved betydelig lavere antistoff-konsentrasjoner.
CAMPATH-antigenet er normalt til stede ved høye nivåer på lymfomceller og dette kimære mAb har høy ADCC-aktivitet i fravær av et todelt GIcNAc. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). I den N-bundne glykosylering reaksjonsveien, blir et todelt GIcNAc tilsatt ved GnT-III. Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986).
Tidligere studier anvendte en enkelt antistoff-produserende CHO-cellelinje, som tidligere var konstruert til å uttrykke, på en eksternt-regulert måte, forskjellige nivåer av et klonet GnT-III-gen enzym (Umana, P., et al., Nature Biotechnol.
17:176-180 (1999)). Denne fremgangsmåten etablerte for første gang en streng korrelasjon mellom ekspresjon av GnT-III og ADCC-aktiviteten av det modifiserte antistoffet. Følgelig omfatter oppfinnelsen et rekombinant, kimært antistoff eller et fragment derav med bindingsspesifisitet av det murine B-Ly1 antistoffet, som har endret glykosylering som er et resultat av økt GnT-III-aktivitet. Den økte GnT-III-aktiviteten resulterer i en økning i prosentdelen av todelte oligosakkarider, så vel som en reduksjon i prosentdelen av fukoserester i Fc-regionen av det modifiserte ABM. Dette antistoffet eller fragment derav, har økt Fc-reseptorbindingsaffinitet og økt effektorfunksjon. I tillegg angår oppfinnelsen antistoffragmenter og fusjonsproteiner omfattende en region som er ekvivalent med Fc-regionen av immunglobuliner.
Terapeutiske anvendelser av modifiserte ABM’er fremstilt i henhold til fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.
I videste forstand kan de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for å målrette celler in vivo eller in vitro som uttrykker et mål-antigen, spesielt, hvor nevnte mål-antigen blir uttrykt på celleoverflaten. Cellene som uttrykker et mål-antigen kan målrettes for diagnostiske eller terapeutiske formål. I ett aspekt kan de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for å endre cellesignalerings aktivitet i celler som uttrykker et mål-antigen. I et annet aspekt kan de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for å endre kryssbinding og/eller oligomerisering av ett eller flere mål-antigener. Mål-antigener for de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være celleoverflate-reseptorer omfattende, men ikke begrenset til CD20, CD21, CD22, CD19, CD47, CD99, CD2, CD45, Her1 (EGFR), Her2/neu, Her3, Her4, TRAIL-reseptorer (f.eks. TRAILR1, TRAILR2), TNFR, FGF-reseptorer (f.eks. FGFR1), IGF-reseptorer, PDGF-reseptorer, VEGF-reseptorer og andre celleoverflate-assosierte reseptorer. I en spesiell utførelsesform er mål-antigenet CD20. De modifiserte ABM’ene ifølge oppfinnelsen tjener også til å stanse cellesyklusen, bevirke apoptose av målcellene (f.eks. tumorceller), hemme angiogenese og/eller bevirke differensiering av målceller.
I et annet aspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av en sykdom som kan behandles ved endret cellesignalerings aktivitet av et målantigen og/eller ved endret evne til å mediere kryssbinding av ett eller flere målantigener omfattende administrering av en terapeutisk effektiv mengde av en modifisert ABM ifølge foreliggende oppfinnelse til et individ med behov for dette. I en spesifikk utførelsesform er det modifiserte ABM et antistoff. I en mer spesifikk utførelsesform er antistoffet humanisert. Eksempler på sykdommer for hvilke de modifiserte ABM’ene kan administreres omfatter, men er ikke begrenset til, celleproliferasjonssykdommer eller lidelser, autoimmune sykdommer eller lidelser og sykdommer eller lidelser relatert til bakterie- eller viral infeksjon.
I én utførelsesform er sykdommen eller lidelsen en celleproliferasjonslidelse. Eksempler på celleproliferasjonslidelser som kan behandles ved en ABM ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, neoplasmer, kreft, maligne sykdommer og/eller tumorer lokalisert i abdomen, ben, bryst, fordøyelsessystemet, lever, bukspyttkjertel, peritoneum, endokrine kjertler (binyre, paratyroidea, hypofyse, testikler, eggstokk, thymus, tyroidea), øye, hode og hals, nervesystem (sentral og perifert), lymfatisk system, bekken, hud, bløtvev, milt, torakal region og urogenitalsystem. Spesielle neoplasmer, kreft, maligne sykdommer og/eller tumorer som kan behandles med ABM’ene ifølge oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til, epidermal og platecelle karsinomer, gliom, pankreaskreft, eggstokkreft, prostatakreft, brystkreft, blærekreft, hode-hals kreft, nyrecelle-karsinomer, kolonkreft, kolorektal kreft, lungekreft, hjernetumor, ondartet melanom, leukemi, lymfomer, T-celle lymfomer, multippelt myelom, magekreft, cancer cervicis uteri, endometriekarsinom, øsofaguskreft, leverkreft, hudkreft, urinveis karsinom, choriokarsinom, faryngeal kreft, strupekreft, thecomatosis, androblastom, endometriehyperplasi, endometriose, embryom, fibrosarkom, Kaposis sarkom, hemangiom, kavernøst hemangiom, angioblastoma, retinoblastom, astrocytom, nevrofibrom, oligodendrogliom, medulloblastom, ganglioneuroblastom, gliom, rhabdomyosarkom, hamartoblastoma, osteogent sarkom, leiomyosarkom, tyroidea sarkom, Ewings sarkom og Wilms tumor.
Tilsvarende kan andre celleproliferasjonslidelser også behandles med de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på slike celleproliferasjonslidelser omfatter, men er ikke begrenset til: hypergammaglobulinemi, lymfoproliferative lidelser, paraproteinemier, purpura, sarkoidose, Sezary Syndrom, Waldenstrøms makroglobulinemi, Gauchers sykdom, histiocytose og hvilken som helst annen celleproliferasjonssykdom, i tillegg til neoplasi, lokalisert i et organsystem listet opp ovenfor.
Eksempler på autoimmune sykdommer eller lidelser omfatter, men er ikke begrenset til, immunmedierte trombocytopenier, slik som akutt idiopatisk trombocytopenisk purpurea og kronisk idiopatisk trombocytopenisk purpurea, dermatomyositt, Sydenhams chorea, lupus nefritt, revmatisk feber, polyglandulære syndromer, Henoch-Schønlein purpura, post-streptokokk nefritt, erythema nodosum, Takayasus arteritt, Addisons sykdom, erythema multiforme, polyarteritis nodosa, ankyloserende spondylitt, Goodpastures syndrom, thromboangitis ubiterans, primær biliær cirrhose, Hashimotos thyreoiditt, tyrotoksikose, kronisk aktiv hepatitt, polymyositt/dermatomyositt, polykondritt, pamphigus vulgaris, Wegeners granulomatose, membranøs nefropati, amyotrofisk lateralsklerose, tabes dorsalis, polymyaglia, pernisiøs anemi, hurtig progredierende glomerulonefritt og fibroserende alveolitt, inflammatoriske responser slik som inflammatoriske hudsykdommer omfattende psoriasis og dermatitt (f.eks. atopisk dermatitt); systemisk sklerodermi og sklerose; responser forbundet med inflammatorisk tarmsykdom (slik som Crohns sykdom og colitis ulcerosa); åndenødssyndrom (omfattende åndenødssyndrom hos voksne; ARDS); dermatitt; meningitt; encefalitt; uveitt; kolitt; glomerulonefritt; allergiske lidelser slik som eksem og astma og andre lidelser som omfatter infiltrering av T-celler og kronisk inflammatoriske responser; aterosklerose; leukocytt adhesjon defisitt; revmatoid artritt; systemisk lupus erythematosus (SLE); diabetes mellitus (f.eks. diabetes mellitus type 1 eller insulinavhengig diabetes mellitus); multippel sklerose; Reynauds syndrom; autoimmun tyreoiditt; allergisk encefalomyelitt; Sjorgens syndrom; juvenil diabetes; og immunresponser forbundet med akutt og forsinket hypersensitivitet mediert av cytokiner og T-lymfocytter typisk funnet ved tuberkulose, sarkoidose, polymyositt, granulomatose og vaskulitt; pernisiøs amenia (Addisons sykdom); sykdommer som omfatter leukocytt diapedese; inflammatorisk lidelse i sentralnervesystemet (CNS); multippel organskade syndrom; hemolytisk anemi (omfattende, men ikke begrenset til cryoglobinemia eller Coombs positiv anemi); myasthenia gravis; antigen-antistoff kompleksmedierte sykdommer; anti-glomerulær-basal-membran sykdom; antifosfolipid syndrom; allergisk neuritt; Graves sykdom; Lambert-Eaton Myasteni syndrom; bulløs pemphigoid; pemfigus; autoimmun polyendokrinopati; Reiters sykdom; ”stiff man” syndrom; Behcet sykdom; kjempecelle arteritt; immunkompleks nefritt; IgA nefropati; IgM polyneuropatier; immunologisk trombocytopen purpura (ITP) eller autoimmun trombocytopeni osv.
De modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre behandlinger eller terapeutiske midler for å behandle lidelser som kan behandles ved å øke eller redusere cellesignalerings aktivitet og/eller kryssbinding av ett eller flere mål-antigener. I én utførelsesform kan modifiserte ABM’er ifølge foreliggende anvendes alene for å målrette og drepe tumorceller in vivo. De modifiserte ABM’ene kan også anvendes sammen med et passende terapeutisk middel for å behandle humant karsinom. For eksempel kan de modifiserte ABM’ene anvendes i kombinasjon med standard eller konvensjonelle behandlingsmetoder slik som kjemoterapi, strålingsterapi eller kan være konjugert eller bundet til et terapeutisk medikament eller toksin, så vel som til et lymfokin eller en tumor-hemmende vekstfaktor, for levering av det terapeutiske midlet til setet for karsinomet. I spesielle utførelsesformer omfatter konjugatene av de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse (1) immunotoksiner (konjugater av den modifiserte ABM og en cytotoksisk gruppe) og (2) merkede (f.eks. radioaktivt merket, enzym-merket eller fluorkrom-merket) modifiserte ABM’er hvor merket tilveiebringer en metode for å identifisere immunkomplekser som omfatter det merkede ABM. De modifiserte ABM’ene kan også anvendes for å indusere lysis gjennom den naturlige komplement-prosessen og for å interagere med antistoff-avhengige cytotoksiske celler normalt til stede.
Den cytotoksiske gruppen av immunotoksinet kan være et cytotoksisk medikament eller et enzymatisk aktivt toksin av bakteriell eller planteopprinnelse eller et enzymatisk aktivt fragment (”A-kjede”) av et slikt toksin. Enzymatisk aktive toksiner og fragmenter derav anvendt er difteria A-kjede, ikke-bindende aktive fragmenter av difteritoksin, eksotoksin A-kjede (fra Pseudomonas aeruginosa), ricin A-kjede, abrin A-kjede, modeccin A-kjede, alfa-sarcin, Aleurites fordiiproteiner, diantin-proteiner, Phytolacca americana-proteiner (PAPI, PAPII og PAP-S), momordica charantia-inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis-inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, fenomycin og enomycin. I en annen utførelsesform er de modifiserte ABM’ene konjugert til småmolekyl antikreft-medikamenter.
Konjugater av det modifiserte ABM og slike cytotoksiske grupper er fremstilt ved anvendelse av en rekke bifunksjonelle protein koblingsmidler. Eksempler på slike reagenser er SPDP, IT, bifunksjonelle derivater av imidoestere slik som dimetyl adipimidat HCl, aktive estere slik som disuccinimidyl-suberat, aldehyder slik som glutaraldehyd, bis-azido-forbindelser slik som bis (p-azidobenzoyl)-heksandiamin, bis-diazonium-derivater slik som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin, diisocyanater slik som tolylen-2,6-diisocyanat og bis-aktive fluor-forbindelser slik som 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen. Den lyserende delen av et toksin kan være bundet til Fab-fragmentet av de modifiserte ABM’ene. Ytterligere passende toksiner er kjent på området, som bevist i f.eks. publisert U.S. Patentsøknad nr. 2002/0128448.
I én utførelsesform er det antigen-bindende molekylet ifølge foreliggende oppfinnelse konjugert til en ytterligere gruppe, slik som et radioaktivt merke eller et toksin. Slike konjugerte modifiserte ABM’er kan fremstilles ved en rekke metoder som er velkjent på området.
En rekke radionuklider er anvendbare for foreliggende oppfinnelse og fagfolk på området har evne til å lett bestemme hvilket radionuklid som er mest passende under en rekke omstendigheter. For eksempel er <131>jod en velkjent radionuklide anvendt for målrettet immunterapi. Imidlertid kan den kliniske anvendeligheten av <131>jod være begrenset ved mange faktorer omfattende: åtte dagers fysisk halveringstid; dehalogenering av iodinert antistoff både i blodet og ved tumorseter; og emisjonsegenskaper (f.eks. stor gamma komponent) som kan være suboptimal for lokalisert doseavsetning i tumor. Med tilkomst av bedre chelaterende midler, har anledningen til å feste metall-chelaterende grupper til proteiner økt mulighetene for å anvende andre radionuklider slik som <111>indium og <90>yttrium.<90>Yttrium gir mange fordeler for anvendelse i radioimmunterapeutiske anvendelser: den 64 timers halveringstiden til <90>yttrium er lang nok til å tillate antistoffakkumulering ved tumor og, i motsetning til f.eks.<131>jod, er <90>yttrium en ren beta-emitter med høy energi uten noen ledsagende gamma-bestråling ved dens nedbrytning, med en rekkevidde i vev på 100 til 1000 cellediametere. Videre tillater den minimale mengden av gjennomtrengende stråling poliklinisk administrering av <90>yttrium-merkede antistoffer. I tillegg er internalisering av merket antistoff ikke nødvendig for celledreping og lokal emisjon av ioniserende stråling skulle være dødelig for nærliggende tumorceller som mangler mål-antigenet.
Effektive enkeltbehandlings doser (dvs. terapeutisk effektive mengder) av <90>yttrium-merkede modifiserte ABM’er ifølge foreliggende oppfinnelse strekker seg fra mellom ca. 5 og ca. 75 mCi, mer foretrukket mellom ca. 10 og ca. 40 mCi.
Effektive enkeltbehandlings ikke-marg (”non-marrow”) ablative doser av <131>jodmerkede ABM’er ifølge foreliggende oppfinnelse strekker seg fra mellom ca. 5 og ca. 70 mCi, mer foretrukket mellom ca. 5 og ca. 40 mCi. Effektive enkeltbehandlings ablative doser (dvs. kan kreve autolog benmargstransplantasjon) av <131>jod-merkede antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse strekker seg fra mellom ca.30 og ca.600 mCi, mer foretrukket mellom ca. 50 og mindre enn ca. 500 mCi. I forbindelse med et kimært antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, på grunn av den lengre sirkulerende halveringstiden visà-vis murine antistoffer, strekker en effektiv enkeltbehandling ikke-marg ablative doser av <131>jod-merkede kimære antistoffer seg fra mellom ca. 5 og ca. 40 mCi, mer foretrukket mindre enn ca. 30 mCi. Avbildningskriterier for, f.eks. <111>indiummerket er typisk mindre enn ca. 5 mCi.
Med hensyn til radioaktivt merkede antistoffer, kan behandling dermed også finne sted ved anvendelse av en enkelt terapeutisk behandling eller ved anvendelse av multiple behandlinger. På grunn av radionuklid-komponenten er det foretrukket, før behandling, at perifere stamceller (”PSC”) eller benmarg (”BM”) blir ”høstet” for pasienter som opplever potensielt dødelig benmarg-toksisitet som skyldes stråling. BM og/eller PSC blir høstet ved anvendelse av standardteknikker og deretter spylt og frosset for mulig reinfusjon. I tillegg er det mest foretrukket at det, før behandling, utføres et diagnostisk dosimetristudie ved anvendelse av et diagnostisk merket antistoff (f.eks. ved anvendelse av <111>indium) på pasienten, hvor formålet er å sikre at det terapeutisk merkede antistoffet (f.eks. ved anvendelse av <90>yttrium) ikke vil bli unødvendig ”konsentrert” i noe som helst normalt organ eller vev.
I én utførelsesform er en kimær, glykokonstruert modifisert ABM ifølge foreliggende oppfinnelse, konjugert til ricin A-kjede. Mest fordelaktig er ricin A-kjeden deglykosylert og fremstilt gjennom rekombinante metoder. En fordelaktig metode for fremstilling av ricin immunotoksinet er beskrevet i Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987).
Når anvendt for å drepe humane kreftceller in vitro for diagnostiske formål, vil konjugatene typisk tilsettes til celledyrkningsmediet i en konsentrasjon på minst ca. 10 nM. Formulering og administreringsmetode for in vitro anvendelse er ikke kritisk. Vandige formuleringer som er kompatible med kultur eller perfusjonsmediet vil normalt anvendes. Cytotoksisitet kan leses ved konvensjonelle metoder for å bestemme tilstedeværelsen eller omfanget av kreft.
Som beskrevet ovenfor kan et cytotoksisk radiofarmasøytisk middel for behandling av kreft fremstilles ved konjugering av en radioaktiv isotop (f.eks. I, Y, Pr) til en kimær, glykokonstruert og/eller modifisert ABM ifølge foreliggende oppfinnelse. Betegnelsen ”cytotoksisk gruppe” som anvendt her skal omfatte slike isotoper.
I en annen utførelsesform blir liposomer fylt med et cytotoksisk medikament og liposomene blir belagt med ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse. Fordi mange av mål-molekylene for de modifiserte ABM’ene ifølge foreliggende oppfinnelse uttrykt på celleoverflaten (f.eks. det er mange CD20-molekyler på overflaten av den maligne B-cellen), tillater denne metoden levering av store mengder av medikament til den riktige celletypen.
Teknikker for konjugering av slike terapeutiske midler til antistoffer er velkjent (se f.eks. Arnon et al., ”Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy”, i Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), s.243-56 (Alan R. Liss, Inc.1985); Hellstrom et al., ”Antibodies For Drug Delivery”, i Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), s.623-53 (Marcel Dekker, Inc.1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, i Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), s.475-506 (1985); og Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62:119 58 (1982).
Enda andre terapeutiske anvendelser for ABM’ene ifølge oppfinnelsen omfatter konjugering eller binding, f.eks. ved rekombinante DNA-teknikker, til et enzym som er i stand til å omdanne en prodroge til et cytotoksisk medikament og anvendelse av dette antistoff enzym-konjugatet i kombinasjon med prodrogen for å omdanne prodrogen til et cytotoksisk middel ved tumorstedet (se f.eks. Senter et al., "Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro og in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989); og Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy," FASEB J.4:188-193 (1990)).
Enda en annen terapeutisk anvendelse for ABM’ene ifølge oppfinnelsen omfatter anvendelse, enten ukonjugert, i nærvær av komplement eller som del av et antistoff-medikament eller antistoff toksin-konjugat, for å fjerne tumorceller fra benmargen hos kreftpasienter. I henhold til denne metoden kan autolog benmarg renses ex vivo ved behandling med antistoffet og margen infuseres tilbake til pasienten (se f.eks. Ramsay et al., "Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)).
Videre er det antatt at oppfinnelsen omfatter et enkelt-kjede immuntoksin omfattende antigen-bindende domener som tillater hovedsakelig samme spesifisitet av binding som et parentalt antistoff (f.eks. polypeptider omfattende CDR’ene av det parentale antistoffet) og videre omfattende et toksin polypeptid. Enkelt-kjede immuntoksinene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å behandle humant karsinom in vivo.
Tilsvarende kan et fusjonsprotein omfattende minst den antigenbindende regionen av en ABM ifølge oppfinnelsen bundet til minst en funksjonelt aktiv del av et andre protein som har anti-tumor aktivitet, f.eks. et lymfokin eller onkostatin, anvendes for å behandle humant karsinom in vivo.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for selektiv dreping av tumorceller som uttrykker celleoverflate-reseptorer omfattende, men ikke begrenset til CD20, Her1 (EGFR), Her2/neu, Her3, Her4, TRAIL-reseptorer (f.eks. TRAILR1, TRAILR2), TNFR, FGF-reseptorer (f.eks. FGFR1), IGF-reseptorer, PDGF-reseptorer, VEGF-reseptorer og andre celleoverflate-assosierte reseptorer. Denne fremgangsmåten omfatter omsetning av den modifiserte ABM ifølge oppfinnelsen (konjugert, f.eks. som et immunotoksin eller ukonjugert) med nevnte tumorceller. Disse tumorcellene kan være fra et humant karsinom.
I tillegg tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av karsinomer (for eksempel humane karsinomer) in vivo. Denne fremgangsmåten omfatter å administrere til et subjekt en farmasøytisk effektiv mengde av en sammensetning inneholdende minst én av de modifiserte ABM’ene ifølge oppfinnelsen (konjugert, f.eks. som et immunotoksin eller ukonjugert).
I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen en forbedret fremgangsmåte for behandling av B-celle proliferative lidelser omfattende B-celle lymfom, så vel som en autoimmun sykdom frembrakt helt eller delvis av patogene autoantistoffer, basert på B-celle deplesjon omfattende å administrere en terapeutisk effektiv mengde av en ABM ifølge foreliggende oppfinnelse til et menneske med behov for dette. I en foretrukket utførelsesform er ABM et glykokonstruert anti-CD20 antistoff med en bindingsspesifisitet hovedsakelig lik den for det murine B-Ly1-antistoffet. I en annen foretrukket utførelsesform er antistoffet humanisert. I dette aspektet ifølge oppfinnelsen blir ABM’ene ifølge oppfinnelsen anvendt for å depletere blodet for normale B-celler i en lengre periode.
I henhold til utøvelse av foreliggende oppfinnelse, kan subjektet kan være et humant, ekvin, svin, bovin, murin, canin, felin og fugle- subjekter. Andre varmblodige dyr er også omfattet i foreliggende oppfinnelse.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre fremgangsmåter for å hemme veksten av humane tumorceller, behandle en tumor i et subjekt og behandle en proliferativ type sykdom i et subjekt. Disse fremgangsmåtene omfatter å administrere til subjektet en effektiv mengde av sammensetningen ifølge oppfinnelsen.
I én utførelsesform angår oppfinnelsen en ABM ifølge foreliggende oppfinnelse for anvendelse ved behandling eller forebygging av kreft, en prekankrøs tilstand eller lesjon eller en autoimmun lidelse. I enda en annen utførelsesform angår oppfinnelsen en ABM ifølge foreliggende oppfinnelse for anvendelse som et medikament for behandling eller forebygging av kreft, en prekankrøs tilstand eller lesjon eller en autoimmun sykdom. Kreften kan for eksempel være B-celle lymfom, lungekreft, ikke-småcellet lunge (NSCL)-kreft, bronkioalveolær celle lungekreft, benkreft, pankreaskreft, hudkreft, kreft i hode eller hals, hud- eller intraokulært melanom, livmorkreft, eggstokkreft, rektal kreft, kreft i analregionen, magekreft, gastrisk kreft, kolonkreft, brystkreft, livmorkreft, karsinom i egglederen, karsinom i endometriet, karsinom i livmorhalsen, karsinom i vagina, karsinom i vulva, Hodgkins Sykdom, kreft i spiserøret, kreft i tynntarmen, kreft i det endokrine systemet, kreft i skjoldbruskkjertelen, kreft i biskjoldbruskkjertelen, kreft i binyren, sarkom i bløtvev, kreft i urinrøret, kreft i penis, prostatakreft, kreft i blæren, kreft i nyre eller urinleder, nyrecelle-karsinom, karsinom i nyrebekkenet, mesoteliom, hepatocellulær kreft, gallekreft, kronisk eller akutt leukemi, lymfocyttiske lymfomer, neoplasmer i sentralnervesystemet (CNS), spinal akse tumorer, hjernestammegliom, glioblastoma multiforme, astrocytomer, schwannomer, ependymomer, medulloblastomer, meningiomer, platecellekarsinomer, hypofyseadenomer, omfattende refraktære versjoner av hvilke som helst av de ovennevnte kreftformene eller en kombinasjon av én eller flere av de ovennevnte kreftformene. Den prekankrøse tilstanden eller lesjonen omfatter for eksempel gruppen bestående av oral leukoplaki, aktinisk keratose (solar keratose), prekankrøse polypper i kolon eller rektum, gastrisk epiteldysplasi, adenomatøs dysplasi, hereditær non-polypøs colon cancer syndrom (HNPCC), Barretts øsofagus, blære dysplasi og prekankrøse cervikale tilstander.
Fortrinnsvis er kreften valgt fra gruppen bestående av B-celle lymfom, brystkreft, blærekreft, hode-hals kreft, hudkreft, pankreaskreft, lungekreft, eggstokkreft, kolonkreft, prostatakreft, nyrekreft og hjernekreft. Eksempler på autoimmunlidelser er gitt, ovenfor.
Enda en annen utførelsesform er anvendelse av ABM ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av kreft eller for behandling eller forebygging av en prekankrøs tilstand eller lesjon. Kreft og prekankrøs tilstand eller lesjon er definert som ovenfor.
Det er derfor innlysende at foreliggende oppfinnelse omfatter farmasøytiske sammensetninger, kombinasjoner, anvendelser og fremgangsmåter for behandling av humane karsinomer. For eksempel omfatter oppfinnelsen farmasøytiske sammensetninger for anvendelse ved behandling av humane karsinomer omfattende en farmasøytisk effektiv mengde av et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse og en farmasøytisk akseptabel bærer.
ABM sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan administreres ved anvendelse av konvensjonelle administreringsmetoder omfattende, men ikke begrenset til, intravenøs, intraperitoneal, oral, intralymfatisk eller administrering direkte inn i tumoren. Intravenøs administrering er foretrukket.
I ett aspekt ifølge oppfinnelsen blir terapeutiske formuleringer inneholdende ABM’ene ifølge oppfinnelsen fremstilt for lagring ved blanding et antistoff som har den ønskede graden av renhet med valgfrie farmasøytisk akseptable bærere, tilsetningsmidler eller stabiliseringsmidler (Remington's Pharmaceutical sciences 16th utgave, Osol, A. Ed. (1980)), i form av lyofiliserte formuleringer eller vandige løsninger. Akseptable bærere, tilsetningsmidler eller stabiliseringsmidler er ikke toksiske for mottagere ved dosene og konsentrasjonene anvendt og omfatter buffere slik som fosfat, citrat og andre organiske syrer; antioksidanter omfattende askorbinsyre og metionin; konserveringsmidler (slik som oktadecyldimetylbenzylammoniumklorid; heksametoniumklorid; benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid; fenol, butyl eller benzylalkohol; alkyl-parabener slik som metyl eller propylparaben; katekol; resorcinol; cykloheksanol; 3-pentanol; og m-kresol); lavmolekylvekt (mindre enn ca.10 rester) polypeptider; proteiner, slik som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner; hydrofile polymerer slik som polyvinylpyrrolidon; aminosyrer slik som glysin, glutamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin; monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater omfattende glukose, mannose eller dekstriner; chelaterende midler slik som EDTA; sukkere slik som sukrose, mannitol, trehalose eller sorbitol; saltdannende motioner slik som natrium; metallkomplekser (f.eks. Zn-protein-komplekser); og/eller ikke-ioniske surfaktanter slik som TWEEN<TM>, PLURONICS<TM >eller polyetylenglykol (PEG).
Eksempler på anti-CD20 ABM-formuleringer er beskrevet i WO98/56418. Denne publikasjonen beskriver en flytende multidoseformulering omfattende 40 mg/ml rituximab, 25 mM acetat, 150 mM trehalose, 0,9% benzylalkohol, 0,02% polysorbat 20 ved pH 5,0 som har en minimum holdbarhet på to år ved lagring ved 2-8<o>C. En annen anti-CD20 formulering av interesse omfatter 10 mg/ml rituximab i 9,0 mg/ml natriumklorid, 7,35 mg/ml natriumcitrat dihydrat, 0,7 mg/ml polysorbat 80 og Sterilt vann for Injeksjon, pH6,5. I foreliggende oppfinnelse vil rituximab erstattes av en modifisert ABM ifølge foreliggende oppfinnelse.
Lyofiliserte formuleringer tilpasset for subkutan administrering er beskrevet i WO97/04801. Slike lyofiliserte formuleringer kan rekonstitueres med et egnet fortynningsmiddel til en høy proteinkonsentrasjon og den rekonstituerte formuleringen kan administreres subkutant til pattedyret som skal behandles her.
Formuleringen her kan også inneholde mer enn én aktiv forbindelse som nødvendig for den spesielle indikasjonen som behandles, fortrinnsvis slike med komplementære aktiviteter som ikke negativt påvirker hverandre. For eksempel kan det kan være ønskelig å ytterligere gi et cytotoksisk middel, kjemoterapeutisk middel, cytokin eller immunosuppressivt middel (f.eks. ett som virker på T-celler, slik som cyklosporin eller et antistoff som binder T-celler, f.eks. ett som binder LFA-1). Den effektive mengden av slike andre midler avhenger av mengden av antagonist til stede i formuleringen, typen av sykdom eller lidelse eller behandling og andre faktorer beskrevet ovenfor. Disse blir generelt anvendt i samme doser og med administreringsmetoder som anvendt ovenfor eller ca. fra 1 til 99% av de hittil anvendte dosene.
De aktive bestanddelene kan også være sperret inne i mikrokapsler fremstilt, for eksempel ved coacervation teknikker eller ved grenseflate polymerisasjon, for eksempel hydroksymetylcellulose eller gelatin-mikrokapsler og poly-(metylmetacylat) mikrokapsler, henholdsvis, i kolloidale medikamentleveringssystemer (for eksempel liposomer, albumin mikrokuler, mikroemulsjoner, nano-partikler og nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er beskrevet i Remington’s Pharmaceutical sciences 16. utgave, Osol, A. Ed. (1980).
Preparater med forlenget frigjøring kan fremstilles. Egnede eksempler på preparater med forlenget frigjøring omfatter semipermeable matrikser av faste hydrofobe polymerer inneholdende antagonisten, hvilke matrikser er i form av formede artikler, f.eks. filmer eller mikrokapsler. Eksempler på matrikser med forlenget frigjøring omfatter polyestere, hydrogeler (for eksempel poly(2-hydroksyetyl-metakrylat) eller poly(vinylalkohol)), polylaktider (U.S. Pat. nr.
3,773,919), kopolymerer av L-glutaminsyre og γetyl-L-glutamat, ikke-nedbrytbar etylen-vinylacetat, nedbrytbar melkesyre-glykolsyre-kopolymerer slik som LUPRON DEPOT<TM >(injiserbare mikrokuler sammensatt av melkesyre-glykolsyrekopolymer og leuprolid-acetat) og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre.
Formuleringene som skal anvendes for in vivo administrering må være sterile. Dette blir lett oppnådd ved filtrering gjennom sterilfiltreringsmembraner.
Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan være i en rekke doseringsformer som omfatter, men er ikke begrenset til, flytende løsninger eller suspensjon, tabletter, piller, pulvere, suppositorier, polymere mikrokapsler eller mikrovesikler, liposomer og injiserbar eller infuserbare løsninger. Den foretrukne formen avhenger av administreringsmetoden og den terapeutiske anvendelsen.
Sammensetningene ifølge oppfinnelsen omfatter også fortrinnsvis konvensjonelle farmasøytisk akseptable bærere og adjuvanser kjent på området slik som humant serumalbumin, ionebyttere, alumina, lechitin, buffersubstanser slik som fosfater, glysin, sorbinsyre, kaliumsorbat og salter eller elektrolytter slik som protaminsulfat.
Den mest effektive administreringsmetoden og doseregimet for de farmasøytiske sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse avhenger av alvorlighetsgraden og, forløpet av sykdommen, pasientens helse og respons på behandling og bedømmelsen ved den behandlende legen. Følgelig skulle dosene av sammensetningene titreres for den individuelle pasienten. Allikevel vil en effektiv dose av sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse generelt være i området fra ca.0,01 til ca.2000 mg/kg.
Molekylene beskrevet her kan være i en rekke doseformer som omfatter, men er ikke begrenset til, flytende løsninger eller suspensjoner, tabletter, piller, pulvere, suppositorier, polymere mikrokapsler eller mikrovesikler, liposomer og injiserbar eller infuserbare løsninger. Den foretrukne formen avhenger av administreringsmetoden og den terapeutiske anvendelsen.
Dosene ifølge foreliggende oppfinnelse kan, i noen tilfeller, bestemmes ved anvendelse av prediktive biomarkører. Prediktive biomarkører er molekylære markører som blir anvendt for å bestemme (dvs. observere og/eller kvantifisere) et mønster for ekspresjon og/eller aktivering av tumorrelaterte gener eller proteiner eller cellulære komponenter av en tumorrelatert signaleringsvei. Klarlegging av de biologiske effektene av målrettede terapier i tumorvev og korrelering av disse effektene med klinisk respons bidrar til å identifisere de dominerende vekst og overlevelses veiene som fungerer i tumorer, hvilket derved etablerer en profil for sannsynlige respondere og omvendt gir et rasjonale for utforming av strategier for å overvinne resistens mot behandling. Når for eksempel det modifiserte ABM er et antistoff spesifikt for EGFR, kan biomarkører for anti-EGFR-terapi omfatte ett eller flere molekyler som er i EGFR nedstrøms signaleringvei som fører til en celleproliferasjonslidelse omfattende, men ikke begrenset til, Akt, RAS, RAF, MAPK, ERK1, ERK2, PKC, STAT3, STAT5 (Mitchell, Nature Biotech.22: 363-364 (2004); Becker, Nature Biotech 22: 15-18 (2004); Tsao og Herbst, Signal 4: 4-9 (2003)). Biomarkører for anti-EGFR-behandling kan også omfatte vekstfaktorreseptorer slik som EGFR, ErbB-2 (HER2/neu) og ErbB-3 (HER3) og kan være positive eller negative prediktorer for pasientrespons på anti-EGFR-behandling. For eksempel ble vekstfaktor-reseptoren ErbB-3 (HER3) bestemt å være en negativ prediktiv biomarkør for anti-EGFR-antistoffet ABX-EGF (U.S. Patentsøknad Publ. nr.2004/0132097 A1).
Prediktive biomarkører kan måles ved cellulære analyser som er velkjent på området omfattende, men ikke begrenset til immunohistokjemi, strømningscytometri, immunofluorescens, binding-og-deteksjonsanalyse og reversert fase-analyser og/eller analyser angitt i U.S. Patentsøknad Publ. nr.
2004/0132097 A1. Prediktive biomarkører for anti-EGFR-behandling kan i seg selv identifiseres i henhold til teknikkene angitt i U.S. Patentsøknad Publ. nr.
2003/0190689A1.
Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse i ett aspekt en fremgangsmåte for behandling av en lidelse som er relatert til endret eller dysregulert cellesignalering ved et mål-antigen og/eller endret evne til å mediere kryssbinding og/eller oligomerisering av ett eller flere mål-antigener omfattende å predikere en respons på behandling med en modifisert ABM i et humant subjekt med behov for behandling ved å analysere en prøve fra det humane subjektet før behandling med én eller en rekke reagenser som detekterer ekspresjon og/eller aktivering av prediktive biomarkører for lidelse som er relatert til endret eller dysregulert cellesignalering ved et mål-antigen og/eller endret evne til å mediere kryssbinding og/eller oligomerisering av ett eller flere mål-antigener (slik som kreft); bestemmelse av et mønster for ekspresjon og/eller aktivering av én eller flere av de prediktive biomarkørene, hvor mønsteret predikerer det humane subjektets respons på modifisert ABM-terapi; og administrere til et humant subjekt som er forutsagt å respondere positivt på modifisert ABM-terapi en terapeutisk effektiv mengde av en sammensetning omfattende en modifisert ABM ifølge foreliggende oppfinnelse. Som anvendt her er et humant subjekt som er forutsagt å respondere positivt på modifisert ABM-behandling ett for hvilket den modifiserte ABM vil har en målbar effekt på sykdommen eller lidelsen som er relatert til endret eller dysregulert cellesignalering ved et mål-antigen og/eller endret evne til å mediere kryssbinding og/eller oligomerisering av ett eller flere mål-antigener (f.eks. tumorregresjon/skrumping) og for hvilket fordelene av modifisert ABM-terapi ikke oppveies av ugunstige effekter (f.eks. toksisitet). Som anvendt her betyr en prøve hvilken som helst biologisk prøve fra en organisme, spesielt et menneske, omfattende én eller flere celler, omfattende enkeltceller av hvilken som helst opprinnelse, vev eller biopsiprøver som er fjernet fra organer slik som bryst, lunge, mage-tarm-kanal, hud, livmorhals, eggstokk, prostata, nyre, hjerne, hode og hals eller hvilket som helst annet organ eller vev fra kroppen og andre prøver fra kroppen omfattende, men ikke begrenset til, smears, sputum, sekresjoner, cerebrospinalvæske, galle, blod, lymfevæske, urin og feces.
Sammensetningen omfattende en ABM ifølge foreliggende oppfinnelse vil formuleres, doseres og administreres på en måte i overensstemmelse med god medisinsk praksis. Faktorer av betydning i denne sammenheng omfatter den spesielle sykdommen eller lidelsen som behandles, det spesielle pattedyret som behandles, den kliniske tilstanden for den individuelle pasienten, årsaken til sykdommen eller lidelsen, setet for levering av midlet, administreringsmetoden, tidsplanleggingen av administrering og andre faktorer kjent for praktiserende leger. Den terapeutisk effektive mengden av antagonisten som skal administreres vil bli bestemt ved slike betraktninger.
Som en generell påstand vil den terapeutisk effektive mengden av antistoffet administrert parenteralt pr. dose være i området ca.0,1 til 20 mg/kg av pasientens kroppsvekt pr. dag, hvor det typisk innledende området av antagonist som anvendes er i området ca.2 til 10 mg/kg.
Også foretrukket blir den modifiserte ABM anvendt i en terapeutisk effektiv mengde fra ca.1,0 mg/kg til ca.15 mg/kg.
Også mer foretrukket blir den modifiserte ABM anvendt i en terapeutisk effektiv mengde fra ca.1,5 mg/kg til ca.12 mg/kg.
Også mer foretrukket blir den modifiserte ABM anvendt i en terapeutisk effektiv mengde fra ca.1,5 mg/kg til ca.4,5 mg/kg.
Også mer foretrukket blir den modifiserte ABM anvendt i en terapeutisk effektiv mengde fra ca.4,5 mg/kg til ca.12 mg/kg.
Mest foretrukket blir den modifiserte ABM anvendt i en terapeutisk effektiv mengde på ca.1,5 mg/kg.
Også mest foretrukket blir den modifiserte ABM anvendt i en terapeutisk effektiv mengde på ca.4,5 mg/kg.
Også mest foretrukket blir den modifiserte ABM anvendt i en terapeutisk effektiv mengde på ca.12 mg/kg.
I en foretrukket utførelsesform er den modifiserte ABM et antistoff, fortrinnsvis et humanisert antistoff. Egnede doser for et slikt ukonjugert antistoff er for eksempel i området fra ca.20 mg/m<2 >til ca.1000 mg/m<2>. I én utførelsesform skiller dosen av antistoffet seg fra den som for øyeblikket anbefales for rituximab. For eksempel kan det administreres til pasienten én eller flere doser med hovedsakelig mindre enn 375 mg/m<2 >av antistoffet, f.eks. hvor dosen er i området fra ca.20 mg/m<2 >til ca.250 mg/m<2>, for eksempel fra ca.50 mg/m<2 >til ca.200 mg/m<2>.
Videre kan det administreres én eller flere innledende doser av antistoffet fulgt av én eller flere påfølgende doser, hvor mg/m<2 >dose av antistoffet i den påfølgende dosen(e) overstiger mg/m<2 >dose av antistoffet i den innledende dosen(e). For eksempel kan den innledende dosen være i området fra ca.20 mg/m<2 >til ca.250 mg/m<2 >(f.eks. fra ca.50 mg/m<2 >til ca.200 mg/m<2>) og den påfølgende dosen kan være i området fra ca.250 mg/m<2 >til ca.1000 mg/m<2>.
Som angitt ovenfor er imidlertid disse foreslåtte mengdene av modifisert ABM underlagt en hel del terapeutisk varsomhet. Den viktigste faktoren ved valg av en passende dose og tidsplanlegging er resultatet oppnådd, som angitt ovenfor. For eksempel kan relativt høyere doser være nødvendig initielt for behandling av pågående og akutte sykdommer. For å oppnå de mest effektive resultatene, avhengig av sykdommen eller lidelsen, blir antagonisten administrert så nært opptil det første tegnet, diagnosen, tilsynekomsten eller forekomsten av sykdommen eller lidelsen som mulig eller under remisjoner av sykdommen eller lidelsen.
Den modifiserte ABM ifølge foreliggende oppfinnelse blir administrert ved hvilken som helst egnet metode, omfattende parenteral, subkutan, intraperitoneal, intrapulmonal og intranasal og, om ønsket for lokal immunosuppressiv behandling, intralesjonal administrering. Parenterale infusjoner omfatter intramuskulær, intravenøs, intraarteriell, intraperitoneal eller subkutan administrering. I tillegg kan antagonisten hensiktsmessig administreres ved puls infusjon, f.eks. med avtagende doser av antagonisten. Fortrinnsvis blir doseringen gitt ved injeksjoner, mest foretrukket intravenøse eller subkutane injeksjoner, avhengig delvis av hvorvidt administreringen er kortvarig eller kronisk.
Andre forbindelser kan administreres, slik som cytotoksiske midler, kjemoterapeutiske midler, immunosuppressive midler og/eller cytokiner med antagonistene her. Den samlede administreringen omfatter ko-administrering, ved anvendelse av separate formuleringer eller en enkelt farmasøytisk formulering og etterfølgende administrering i den ene eller den andre rekkefølgen, hvor det foretrukket er en tidsperiode mens begge (eller alle) de aktive midlene samtidig utøver deres biologiske aktiviteter.
Det ville være tydelig at dosen av sammensetningen ifølge oppfinnelsen nødvendig for å oppnå helbredelse kan bli ytterligere redusert med optimalisering av tidsplanleggingen.
I henhold til utøvelse av oppfinnelsen, kan den farmasøytiske bæreren være en lipidbærer. Lipidbæreren kan være et fosfolipid. Videre kan lipidbæreren være en fettsyre. Lipidbæreren kan også være en detergent. Som anvendt her er en detergent hvilken som helst substans som endrer overflatespenningen av en væske, generelt reduserer den.
I ett eksempel ifølge oppfinnelsen kan detergenten være en ikke-ionisk detergent. Eksempler på ikke-ioniske detergenter omfatter, men er ikke begrenset til, polysorbat 80 (også kjent som Tween 80 eller (polyoksyetylensorbitanmonooleat), Brij og Triton (for eksempel Triton WR 1339 og Triton A 20).
Alternativt kan detergenten være en ionisk detergent. Et eksempel på en ionisk detergent omfatter, men er ikke begrenset til, alkyltrimetylammoniumbromid.
I tillegg kan, i henhold til oppfinnelsen, lipidbæreren være et liposom. Som anvendt i foreliggende søknad er et ”liposom” hvilken som helst membranbundet vesikkel som inneholder hvilke som helst molekyler ifølge oppfinnelsen eller kombinasjoner derav.
Eksemplene nedenfor forklarer oppfinnelsen mer detaljert. De følgende fremstillingene og eksemplene er gitt for å sette fagfolk på området i stand til å tydeligere forstå og å utføre foreliggende oppfinnelse. Foreliggende oppfinnelse er imidlertid ikke begrenset i omfang av de eksemplifiserte utførelsesformene, som er ment kun som illustrasjoner av enkeltaspekter ifølge oppfinnelsen og fremgangsmåter som er funksjonelt ekvivalente er innenfor omfanget av oppfinnelsen. Faktisk vil forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til de beskrevet her bli tydelige for fagfolk på området fra foregående beskrivelse og ledsagende tegninger. Slike modifikasjoner skal være innenfor omfanget av de tilhørende kravene.
EKSEMPLER
Dersom ikke angitt på annen måte er referanser til nummereringen av spesifikke aminosyrerest-posisjoner i de følgende eksemplene i henhold til Kabat nummereringsystemet.
EKSEMPEL 1
Materialer og metoder
Kloning og ekspresjon av rekombinant antistoff B-Ly1
B-Ly1-uttrykkende hybridomceller (se, f.eks., Poppema, S., et al., 1987, Proceedings of the 9<th >Biotest Symposium, Institute of Education, London, (Sonneborn, H.H. og Tills, D, Eds.); Ling, N.R, et al., 1987, I Leucocyte Typing Conference III: White cell differentiation antigens, 302-355, Oxford University Press, Oxford. (A.J. McMichael, Ed.); Knapp, W. 1990. Leukocyte Typing Conference IV Proceedings, Oxford University Press, Oxford) ble dyrket i RPMI inneholdende 10% FBS og 4 mM L-glutamin.6 x 10<6 >celler med en viabilitet > 90% ble høstet og totalt RNA ble isolert ved anvendelse av et Qiagen RNAeasy midi kit. cDNA som koder for de variable lette og tunge kjedene av B-Ly1 ble amplifisert ved RT-PCR. RT-PCR-reaksjonen ble utført ved anvendelse av de følgende betingelsene: 30 min ved 50 °C for første tråd-cDNA-syntese; 15 min ved 95 °C initiell denaturering; 30 sykluser på 1 min ved 94 °C, 1 min ved 45 °C, 1,5 min ved 72 °C; og et endelig elongeringstrinn i 10 min ved 72 °C. Den forventede størrelsen av PCR-produktene ble bekreftet ved gelelektroforese. PCR-produktene ble klonet inn i egnede E. coli-vektorer og DNA-sekvensering bekreftet at genene som koder for de variable lette og tunge kjedene var isolert.
For konstruksjon av kimære B-Ly1 ekspresjonsvektorer, ble syntetiske signalsekvenser og passende restriksjonsseter fusjonert til variable kjeder ved ytterligere PCR-reaksjoner. Etter en endelig bekreftelse av den korrekte DNA-sekvensen av de variable kjedene, ble de kombinert med de tilsvarende humane IgG1 konstante regionene. Straks genene var konstruert, ble de klonet under kontroll av MPSV-promoteren og oppstrøms for et syntetisk polyA.sete, ved anvendelse av to separate vektorer, én for hver kjede, hvilket resulterer i plasmidene pETR1808 (tung kjede ekspresjonsvektor) og pETR1813 (lett kjede ekspresjonsvektor). Hver vektor inneholdt en EBV OriP-sekvens.
Kimær B-Ly1 ble fremstilt ved å kotransfektere HEK293-EBNA-celler med vektorene pETR1808 og pETR1813 ved anvendelse av en kalsiumfosfattransfeksjonsmetode. Eksponensielt voksende HEK293-EBNA-celler ble transfektert ved kalsiumfosfat-metoden. Celler ble dyrket som adherente monolagkulturer i T-kolber ved anvendelse av DMEM dyrkningsmedium supplert med 10% FCS og ble transfektert når de var mellom 50 og 80% konfluente. For transfeksjon av en T75-kolbe, ble 8 millioner celler sådd ut 24 timer før transfeksjon i 14 ml DMEM dyrkningsmedium supplert med FCS (ved 10% volum/volum endelig), 250 μg/ml neomycin, og celler ble plassert ved 37°C i en inkubator med en 5% CO2 atmosfære natten over. For hver T75-kolbe som skulle transfekteres, ble en løsning av DNA, CaCl2 og vann fremstilt ved å blande 47 μg totalt plasmidvektor-DNA fordelt likt mellom de lette og tunge kjede ekspresjonsvektorene, 235 μl av en 1M CaCl2-løsning og tilsetning av vann til et endelig volum på 469� μl. Til denne løsningen ble 469 μl av en 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4 -løsning ved pH 7,05 tilsatt, blandet umiddelbart i 10 sek og fikk stå ved romtemperatur i 20 sek. Suspensjonen ble fortynnet med 12 ml DMEM supplert med 2% FCS og tilsatt til T75 istedenfor det eksisterende mediet. Cellene ble inkubert ved 37°C, 5% CO2 i ca.17 til 20 timer, deretter ble medium erstattet med 12 ml DMEM, 10% FCS. For fremstilling av umodifisert antistoff “chB-Ly1”, ble cellene transfektert med kun antistoff ekspresjonsvektorene pETR1808 og pETR1813 i et 1:1-forhold. For fremstilling av de glykokonstruerte antistoffet “chB-Ly1-ge”, ble cellene kotransfektert med fire plasmider, to for antistoffekspresjon (pETR1808 og pETR1813), ett for et fusjon GnTIII polypeptid ekspresjon (pETR1519) og ett for mannosidase II-ekspresjon (pCLF9) ved et forhold på 4:4:1:1, henholdsvis. Ved dag 5 etter transfeksjon, ble supernatant høstet, sentrifugert i 5 min ved 1200 rpm, fulgt av en andre sentrifugering i 10 min ved 4000 rpm og holdt ved 4°C.
chB-Ly1 og chB-Ly1-ge ble renset fra kultursupernatant ved anvendelse av tre sekvensielle kromatografiske trinn, Protein A-kromatografi, kationbytterkromatografi og et størrelseseksklusjonskromatografi-trinn på en Superdex 200-kolonne (Amersham Pharmacia) ved å skifte bufferen til fosfatbuffer saltoppløsning og oppsamle den monomere antistoff-toppen fra dette siste trinnet. Antistoffkonsentrasjon ble beregnet ved anvendelse av et spektrofotometer fra absorbansen ved 280 nm.
Oligosakkarid-analyse
Oligosakkarider ble enzymatisk frigjort fra antistoffene ved PNGaseF-kløyving, hvor antistoffene enten er immobilisert på en PVDF-membran eller i løsning.
Den resulterende kløyvede løsningen inneholdende de frigjorte oligosakkaridene ble enten klargjort direkte for MALDI/TOF-MS-analyse eller ble ytterligere kløyvet med EndoH glykosidase før prøvepreparering for MALDI/TOF-MS-analyse.
Oligosakkarid frigjøringsmetode for PVDF membran-immobiliserte antistoffer
Brønnene i en 96-brønns plate fremstilt med en PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts)-membran ble fuktet med 100 μl metanol og væsken ble trukket gjennom PVDF-membranen ved anvendelse av vakuum anvendt for Multiscreen vakuum samlerør (Millipore, Bedford, Massachusetts). PVDF-membranene ble vasket tre ganger med 300 μl vann. Brønnene ble deretter vasket med 50 μl RCM-buffer (8M Urea, 360 mM Tris, 3,2 mM EDTA, pH 8,6). Mellom 30-40 μg antistoff ble fylt i en brønn inneholdende 10 μl RCM-buffer. Væsken i brønnen ble trukket gjennom membranen ved å påføre vakuum og membranen ble deretter vasket to ganger med 50 μl RCM-buffer. Reduksjon av disulfidbroer ble foretatt ved tilsetning av 50 μl 0,1 M ditiotreitol i RCM og inkubering ved 37°C i 1 time.
Etter reduksjon, ble et vakuum anvendt for å fjerne ditiotreitol-løsningen fra brønnen. Brønnene ble vasket tre ganger med 300 μl vann før utførelse av karboksymetylering av cysteinrestene ved tilsetning av 50 μl 0,1 M jodeddiksyre i RCM-buffer og inkubering ved romtemperatur i mørke i 30 min.
Etter karboksymetylering ble brønnene trukket opp med vakuum og deretter vasket tre ganger med 300 μl vann. PVDF-membranen ble deretter blokkert, for å forhindre adsorpsjon av endoglykosidasen, ved inkubering av 100 μl av en 1% vandig løsning av polyvinylpyrrolidon 360 ved romtemperatur i 1 time. Blokkeringsreagenset ble deretter fjernet ved forsiktig vakuum fulgt av tre vaskinger med 300 μl vann.
N-bundne oligosakkarider ble frigjort ved tilsetning av 2,5 mU peptid-N-glykosydase F (rekombinat N-Glykanase, GLYKO, Novato, CA) og 0,1 mU Sialidase (GLYKO, Novato, CA), for å fjerne eventuelle potensielt ladete monosakkarid-rester, i et endelig volum på 25 μl i 20mM NaHCO3, pH7,0). Kløyving ble utført i 3 timer ved 37°C.
Metode for frigjøring av oligosakkarider for antistoffer i løsning
Mellom 40 og 50 μg antistoff ble blandet med 2,5 mU PNGaseF (Glyko, U.S.A.) i 2 mM Tris, pH 7,0 i et endelig volum på 25 μl og blandingen ble inkubert i 3 timer ved 37°C.
Anvendelse av endoglykosidase H-kløyving av PNGaseF-frigjorte oligosakkarider for anvisning av hybride todelte oligosakkarid-strukturer til MALDI/TOF-MS nøytrale oligosakkarid-topper
Oligosakkaridene frigjort ved PNGaseF ble deretter kløyvet med endoglykosidase H (EC 3,2,1,96). For EndoH-kløyvingen, ble 15 mU EndoH (Roche, Sveits) tilsatt til PNGaseF-kløyvingen (antistoff i løsning metode ovenfor), hvilket gir et endelig volum på 30 μl og blandingen ble inkubert i 3 timer ved 37°C. EndoH kløyver mellom N-acetylglukosamin-restene av chitobiose-kjernen av N-bundne oligosakkarider. Enzymet kan bare kløyve oligomannose og de fleste hybrid type-glykaner, mens kompleks type oligosakkarider ikke blir hydrolysert.
Prøve-preparering for MALDI/TOF-MS
De enzymatiske kløyvingene inneholdende de frigjorte oligosakkaridene ble inkubert i ytterligere 3 timer ved rom etter tilsetning av eddiksyre til en endelig konsentrasjon på 150 mM og ble deretter ført gjennom 0,6 ml kationbytterresin (AG50W-X8 resin, hydrogen form, 100-200 nett, BioRad, Sveits) pakket inn i en mikro-bio-spin kromatografikolonne (BioRad, Sveits) for å fjerne kationer og proteiner. En mikroliter av den resulterende prøven ble applisert på en mål-plate av rustfritt stål og blandet på platen med 1 μl sDHB matriks. sDHB matriks ble preparert ved oppløsning av 2 mg 2,5-dihydroksybenzosyre pluss 0,1 mg 5-metoksysalicylsyre i 1 ml etanol/10 mM vandig natriumklorid 1:1 (volum/volum). Prøvene ble lufttørket, 0,2 μl etanol ble applisert og prøvene ble til slutt tillat å rekrystallisere under luft.
MALDI/TOF-MS
MALDI-TOF massespektrometeret anvendt for å oppnå massespektra var et Voyager Elite (Perspective Biosystems). Instrumentet ble kjørt i lineær konfigurasjon, med en akselerasjon på 20 kV og 80 ns forsinkelse. Ytre kalibrering ved anvendelse av oligosakkaridstandarder ble anvendt for masse angivelse av ionene. Spektrene fra 200 laserskudd ble summert for å oppnå det endelige spektret.
Helblod B-celle deplesjon
495 μl heparinisert blod fra en frisk donor ble alikvotert inn i 5 ml polystyrenrør, 5 μl 100 ganger konsentrerte antistoffprøver (1-1000 ng/ml endelig konsentrasjon) eller kun PBS ble tilsatt og rørene ble inkubert ved 37°. Etter 24 timer ble 50 μl blod overført til et nytt rør og merket med anti-CD3-FITC, anti-CD19-PE og anti-CD45-CyChrome (Becton-dickinson) i 15 min ved romtemperatur i mørke. Før analyse ble 500 μl FACS-buffer (PBS inneholdende 2% FCS og 5mM EDTA) tilsatt til rørene. CD3-FITC og CD19-PE fluorescens av blodprøvene ble strømningcytometrisk analysert ved å sette en terskel for CD45-CyChrome. B celle-deplesjon ble bestemt ved plotting av forholdet av CD19<+ >B-celler til CD3<+ >T-celler.
Binding av anti-CD20-antistoffer til Raji-celler
200,000 celler i 180 μl FACS-buffer (PBS inneholdende 2% FCS og 5mM EDTA) ble overført til 5 ml polystyrenrør. Deretter ble 20 μl av 10 ganger konsentrerte anti-CD20 antistoff-prøver (1-5000 ng/ml endelig konsentrasjon) eller kun PBS tilsatt, og rørene ble inkubert ved 4°C i 30min. Deretter ble prøver vasket to ganger med FACS-buffer og pelletert ved 300 x g i 3min. Supernatant ble aspirert av og celler ble tatt opp i 100 μl FACS-buffer. Deretter ble 1 μl anti-Fcspesifikke F(ab’)2-FITC fragmenter (Jackson Immuno Research Laboratories, USA) tilsatt og rørene ble inkubert ved 4°C i 30min. Prøver ble vasket to ganger med FACS-buffer og tatt opp i 500 μl FACS-buffer inneholdende 0,5 μg/ml PI for analyse ved strømningscytometri. Binding ble bestemt ved å plotte geometrisk gjenomsnittlig fluorescens mot antistoff-konsentrasjonene.
EKSEMPEL 2
Høy homologi akseptor-metode
Høy homologi antistoff akseptor-struktur (”framework”)-søket ble utført ved sammenstilling av mus B-ly1 proteinsekvensen med en samling av humane kjønnscelle-sekvenser og velge den humane sekvensen som viste den høyeste sekvensidentiteten. Her ble sekvensen VH1_10 (locus 1-e, Aksesjon nr. DP-88) fra Vbase-databasen valgt som den tunge kjede struktur (”framework”) akseptorsekvensen og IGKV2-40 (Aksesjon nr X59314)-sekvensen fra IMGT-databasen ble valgt som struktur (”framework”)-akseptoren for den lette kjeden. På disse to akseptor-strukturene, ble de tre komplementaritetsbestemmende regionene (CDR’ene) fra mus tunge og lette variable domener bundet. Siden struktur (”framework”) 4-regionen ikke er del av den variable regionen av kjønnscelle V-genet, ble sammenstillingen for denne posisjonen utført individuelt. JH4-regionen ble valgt for den tunge kjeden og JK4-regionen ble valgt for den lette kjeden. Molekylær modellering av det utformede immunglobulin-domenet avslørte ett sted som potensielt krever de murine aminosyrerestene istedenfor de humane utenfor CDR’en. Gjeninnføring av murine aminosyrerester inn i den humane strukturen (”framework”) ville generere de såkalte tilbakemutasjonene. For eksempel ble den humane akseptor-aminosyreresten ved Kabat posisjon 27 mutert tilbake til en tyrosin-rest. Humaniserte antistoff-varianter ble utformet som enten omfattet eller utelot tilbakemutasjoner. Humanisert antistoff lett kjede krevde ikke noen tilbakemutasjoner. Etter utforming av proteinsekvensene, ble DNA-sekvenser som koder for disse proteinene syntetisert som detaljert beskrevet nedenfor.
Blandet struktur (”framework”)-metode
For å unngå innføring av tilbakemutasjoner ved kritiske aminosyrerestposisjoner (kritisk for å beholde god antigen bindingsaffinitet eller antistofffunksjoner) av den humane akseptor-strukturen (”framework”), ble det undersøkt hvorvidt enten hele struktur (”framework”)-region 1 (FR1) eller struktur-regionene 1 (FR1) og 2 (FR2) sammen, kunne erstattes av humane antistoff-sekvenser som allerede har donor-rester, eller slike som er funksjonelt ekvivalente, ved de viktige posisjonene i den naturlige humane kjønnscelle-sekvensen. For dette formål ble VH strukturene (”framework”) 1 og 2 fra mus B-ly1-sekvensen sammenstilt individuelt med humane kjønnscellesekvenser. Her var høyeste sekvensidentitet ikke viktig, og ble ikke anvendt, for valg av akseptor-strukturer, men istedet ble matching av mange kritiske rester antatt å være viktigere. De kritiske restene omfatter restene 24, 71 og 94 (Kabat-nummerering) og også restene i posisjonene 27, 28 og 30 (Kabat-nummerering), som ligger utenfor CDR1-definisjonen ved Kabat, men ofte er involvert i antigenbinding. IMGT-sekvensen IGHV3-15 (Aksesjon nr X92216) ble valgt som egnet. Etter å ha utformet proteinsekvensene, ble DNA-sekvenser som koder for disse proteinene syntetisert som detaljert beskrevet nedenfor. Ved anvendelse av denne metoden var ingen tilbakemutasjoner nødvendige verken for den lette eller tunge kjeden, for å beholde egnede nivåer av antigenbinding.
Syntese av antistoff-genene
Etter å ha utformet aminosyresekvensen av den humaniserte antistoff V-regionen, måtte DNA-sekvensen fremstilles. DNA-sekvens-dataene for for de individuelle struktur (”framework”)-regionene ble funnet i databasene for humane kjønnscellelinje-sekvenser. DNA-sekvensen av CDR-regionene ble tatt fra de tilsvarende murine cDNA-dataene. Med disse sekvensene ble hele DNA-sekvensen praktisk talt satt sammen. Ved hjelp av disse DNA-sekvensdataene, ble diagnostiske restriksjonsseter innført i den virtuelle sekvensen, ved innføring av stille mutasjoner, for å danne gjenkjennelsesseter for restriksjonsendonukleaser. For å oppnå den fysiske DNA-kjeden, ble gensyntese utført (f.eks. Wheeler et al. 1995). Ved denne metoden blir oligonukleotider konstruert fra genene av interesse, slik at en serie av oligonukleotider blir avledet fra den kodende tråden og en andre serie er fra den ikke-kodende tråden. 3’ og 5’endene av hvert oligonukleotid (bortsett fra det aller første og siste i rekken) fremviser alltid komplementære sekvenser med to primere avledet fra den motsatte tråden. Når disse oligonukleotidene anbringes inn i en reaksjonsbuffer egnet for hvilken som helst varmestabil polymerase og det tilsettes Mg<2+>, dNTPs og en DNA polymerase, blir hvert oligonukleotid forlenget fra dets 3’-ende. Den nydannede 3’-enden av én primer hybridiserer til neste primer av den motsatte tråden og forlenger dens sekvens ytterligere under betingelser egnet for templatavhengig DNA-kjedeforlengelse. Sluttproduktet ble klonet inn i en konvensjonell vektor for propagering i E. coli.
Antistoff-produksjon
Human tunge og lette kjede ledersekvenser (for sekresjon) ble tilføyd oppstrøms for de ovennevnte variabel region-sekvensene og disse ble deretter forbundet oppstrøms for human IgG1 kappa konstant tung og lett kjede-sekvenser, henholdsvis, ved anvendelse av standard molekylærebiologiske teknikker. De resulterende fullstendige antistoff tung og lett kjede DNA-sekvensene ble subklonet inn i mammalske ekspresjonsvektorer (én for den lette kjeden og én for den tunge kjeden) under kontroll av MPSV-promoteren og oppstrøms for et syntetisk polyA-sete, hvor hver vektor bærer en EBV OriP sekvens, som beskrevet i Eksempel 1 ovenfor. Antistoffer ble produsert som beskrevet i Eksempel 1 ovenfor, dvs. ved kotransfeksjon av HEK293-EBNA med mammalske antistoff tung og lett kjede ekspresjonsvektorer, høsting av det kondisjonerte dyrkningsmediet 5 til 7 dager etter transfeksjon og rensing av de sekreterte antistoffene ved Protein A affinitetskromatografi, fulgt av kationebytterkromatografi og et endelig størrelseseksklusjonskromatografi-trinn for å isolere rene monomere IgG1-antistoffer. Antistoffene ble formulert i en 25 mM kaliumfosfat, 125 mM natriumklorid, 100 mM glysin-løsning ved pH 6,7. Glykokonstruerte varianter av de humaniserte antistoff-variantene ble fremstilt ved kotransfeksjon av antistoff ekspresjonsvektorene sammen med en GnT-III glykosyltransferase ekspresjonsvektorer eller sammen med en GnT-III ekspresjonsvektor pluss en Golgi mannosidase II ekspresjonsvektor, som beskrevet for det kimære antistoffet i Eksempel 1 ovenfor. Glykokonstruerte antistoffer ble renset og formulert som beskrevet ovenfor for de ikke-glykokonstruerte antistoffene. Oligosakkaridene bundet til Fc-regionen av antistoffene ble analysert ved MALDI/TOF-MS som beskrevet nedenfor.
Oligosakkaridanalyse
Oligosakkarid frigjøringsmetode for antistoffer i løsning Mellom 40 og 50 μg antistoff ble blandet med 2,5 mU PNGaseF (Glyko, U.S.A.) i 2 mM Tris, pH7,0 i et endelig volum på 25 mikroliter og blandingen ble inkubert i 3 timer ved 37°C.
Prøvepreparering for MALDI/TOF-MS
De enzymatiske kløyvingene inneholdende de frigjorte oligosakkaridene ble inkubert i ytterligere 3 timer ved romtemperatur etter tilsetning av eddiksyre til en endelig konsentrasjon på 150 mM og ble deretter ført gjennom 0,6 ml kationbytterresin (AG50W-X8 resin, hydrogen form, 100-200 maske, BioRad, Sveits) pakket inn i en mikro-bio-spin kromatografikolonne (BioRad, Sveits) for å fjerne kationer og proteiner. En mikroliter av den resulterende prøven ble applisert på en mål-plate av rustfritt stål og blandet på platen med 1 μl sDHB matriks. sDHB matriks ble fremstilt ved oppløsning av 2 mg 2,5-dihydroksybenzosyre pluss 0,1 mg 5-metoksysalicylsyre i 1 ml etanol/10 mM vandig natriumklorid 1:1 (volum/volum). Prøvene ble lufttørket, 0,2 μl etanol ble applisert og prøvene ble til slutt tillat å rekrystallisere under luft.
MALDI/TOF-MS
MALDI-TOF massespektrometeret anvendt for å oppnå massespektra var et Voyager Elite (Perspective Biosystems). Instrumentet ble kjørt i lineær konfigurasjon, med en akselerasjon på 20 kV og 80 ns forsinkelse. Ytre kalibrering ved anvendelse av oligosakkaridstandarder ble anvendt for masse angivelse av ionene. Spektrene fra 200 laserskudd ble summert for å oppnå det endelige spektret.
Antigenbindings-analyse
De rensede, monomere humaniserte antistoff-variantene ble testet for binding til human CD20 på Raji B-celle lymfom-målceller ved anvendelse av et strømningscytometri-basert forsøk, som beskrevet for det kimære B-ly1 antistoffet i Eksempel 1 ovenfor.
Binding av monomere IgG1 glykovarianter til NK-celler og FcγRIIIA-uttrykkende CHO-cellelinje
Humane NK-celler ble isolert fra nylig isolerte mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ved anvendelse av en negativ seleksjon anrikning for CD16-og CD56-positive celler (MACS system, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach/Tyskland). Renheten bestemt ved CD56-ekspresjon var mellom 88-95 %. Nylig isolerte NK-celler ble inkubert i PBS uten kalsium og magnesiumioner (3 x 10<5 >celler/ml) i 20 minutter ved 37°C for å fjerne NK celle-assosiert IgG. Celler ble inkubert ved 10<6 >celler/ml ved forskjellige konsentrasjoner av anti-CD20 antistoff (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 μg/ml) i PBS, 0,1% BSA. Etter mange vaskinger ble antistoff-binding detektert ved inkubering med 1:200 FITC-konjugert F(ab’)2 geit anti-human, F(ab’)2 spesifikk IgG (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA/USA) og anti-human CD56-PE (BD Biosciences, Allschwil/Sveits). Anti-FcgammaRIIIA 3 G8F(ab’)2-fragmentene (Ancell, Bayport, MN/USA) ble tilsatt ved en konsentrasjon på 10 μg/ml for å konkurrere med binding av antistoff glykovarianter (3 μg/ml). Fluorescens-intensiteten med henvisning til de bundne antistoff-variantene ble bestemt for CD56-positive celler på en FACSCalibur (BD Biosciences, Allschwil /Sveits). CHO-celler ble transfektert ved elektroporering (280 V, 950 μF, 0,4 cm) med en ekspresjonsvektor som koder for FcgammaRIIIA-Val158 α-kjeden og γ-kjeden. Transfektanter ble selektert ved tilsetning av 6 μg/ml puromycin og stabile kloner ble analysert ved FACS ved anvendelse av 10 μl FITC-konjugert-anti-FcgammaRIII 3G8 monoklonalt antistoff (BD Biosciences, Allschwil/Sveits) i 10<6 >celler. Binding av IgG1 til FcgammaRIIIA-Val158-uttrykkende CHO-celler ble utført analogt med NK celle-bindingen beskrevet ovenfor.
ADCC analyse
Humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ble anvendt som effektorceller og ble fremstilt ved anvendelse av Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178 USA) og hovedsakelig ifølge produsentens instruksjoner. I korthet ble venøst blod tatt med hepariniserte sprøyter fra frivillige. Blodet ble fortynnet 1:0,75-1,3 med PBS (ikke inneholdende Ca++ eller Mg++) og lagt på Histopaque-1077. Gradienten ble sentrifugert ved 400 x g i 30 min ved romtemperatur (RT) uten avbrudd. Interfasen inneholdende PBMC ble oppsamlet og vasket med PBS (50 ml pr. celler fra to gradienter) og høstet ved sentrifugering ved 300 x g i 10 minutter ved RT. Etter resuspensjon av pelleten med PBS, ble PBMC tellet og vasket en gang til ved sentrifugering ved 200 x g i 10 minutter ved RT. Cellene ble deretter resuspendert i passende medium for de påfølgende prosedyrene.
Effektor til mål-forholdet anvendt for ADCC analysen var 25:1 og 10:1 for PBMC og NK-celler, henholdsvis. Effektorcellene ble preparert i AIM-V medium i passende konsentrasjon til å tilsette 50 μl pr. brønn i rundbunnet 96-brønns plater. Målceller var humane B-lymfomceller (f.eks. Raji-celler) dyrket i DMEM inneholdende 10% FCS. Målceller ble vasket i PBS, tellet og resuspendert i AIM-V ved 0,3 million pr. ml for å tilsette 30,000 celler i 100 μl pr. mikrobrønn. Antistoffer ble fortynnet i AIM-V, tilsatt i 50 μl til de forhånds utsådde målcellene og tillat å binde til målene i 10 minutter ved RT. Deretter ble effektorcellene tilsatt og platen ble inkubert i 4 timer ved 37°C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO2. Dreping av målceller ble bedømt ved måling av laktat dehydrogenase (LDH)-frigjøring fra skadede celler ved anvendelse av Cytotoksisitet Deteksjons-kit (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Sveits). Etter inbubering i 4 timer ble platene sentrifugert ved 800 x g. 100 μl supernatant fra hver brønn ble overført til en ny transparent flatbunnet 96-brønns plate. 100 μl farge substrat-buffer fra settet ble tilsatt pr. brønn. Vmaks-verdiene for fargereaksjonen ble bestemt i en ELISA-leser ved 490 nm i minst 10 min ved anvendelse av SOFTmax PRO programvare (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Spontan LDH-frigjøring ble målt fra brønner inneholdende kun mål og effektorceller men ingen antistoffer. Maksimal frigjøring ble bestemt fra brønner inneholdende kun målceller og 1% Triton X-100. Prosentdel av spesifikk antistoff-mediert dreping ble beregnet som følger: ((x – SR)/(MR – SR)*100, hvor x er gjennomsnittet av Vmaks ved en spesifikk antistoff-konsentrasjon, SR er gjennomsnittet av Vmaks for den spontane frigjøringen og MR er gjennomsnittet av Vmaks for den maksimala frigjøringen.
Komplement-avhengig cytotoksisitet-analyse
Målceller ble tellet, vasket med PBS, resuspendert i AIM-V (Invitrogen) ved 1 million celler pr. ml. 50 μl celler ble platet pr. brønn i en flatbunnet 96-brønns plate. Antistoff-fortynninger ble fremstilt i AIM-V og tilsatt i 50 μl til cellene. Antistoffer fikk binde til cellene i 10 minutter ved romtemperatur. Humant serum komplement (Quidel) ble nytint, fortynnet 3-ganger med AIM-V og tilsatt i 50 μl til brønnene. Kanin komplement (Cedarlane Laboratories) ble fremstilt som beskrevet av produsenten, fortynnet 3 ganger med AIM-V og tilsatt i 50 μl til brønnene. Som en kontroll ble komplement kilder oppvarmet i 30 min ved 56°C før tilsetning til analysen.
Analyseplatene ble inkubert i 2 timer ved 37°C. Dreping av celler ble bestemt ved å måle LDH-frigjøring. I korthet ble platene sentrifugert ved 300 x g i 3 min. 50 μl supernatant pr. brønn ble overført til en ny 96-brønns plate og 50 μl av analysereagens fra Cytotoksisitet Kit (Roche) ble tilsatt. En kinetisk måling med ELISA-leseren bestemte Vmaks korresponderende med LDH-konsentrasjon i supernatanten. Maksimal frigjøring ble bestemt ved inkubering av cellene i nærvær av 1% Trition X-100.
Helblod B-celle deplesjon-forsøk
Normal B-celle deplesjon i helblod ved anti-CD20 antistoffene ble utført som beskrevet i Eksempel 1 ovenfor.
Apoptose-forsøk
Den apoptotiske potensen av antistoffene ble analysert ved inkubering av antistoffet ved 10 μg/ml (mettende betingelser med hensyn til antigenbinding) med målcellene (ved en målcelle-konsentrasjon på 5 x 10<5 >celler/ml) natten over (16-24 t). Prøver ble merket med AnnV-FITC og analysert ved FACS. Forsøk ble utført in triplo.
Deteksjon blir utført ved strømningscytometri ved å følge opptreden av apoptotiske markører som annexin V og fosfatidy serin. Negativ kontroll (ingen apoptose indusert) inneholder ikke noe antistoff, men kun fosfatbufret saltoppløsning. Positiv kontroll (maksimal apoptose) inneholder 5 mikromolar av det sterke apoptose-induceren Camptothecin (CPT).
Resultater og diskusjon
Sammenligning av bindingen til humant CD20-antigen av antistoffvariantene B-HH1, B-HH2, B-HH3, kompleksert med den humaniserte B-ly1 lett kjede (BKV1) og det parentale, kimære antistoffet chB-ly1 (beskrevet i Eksempel 1 ovenfor) viser at alle antistoffene har en lignende EC50-verdi, men B-HH1konstruksjonen binder med en lavere intensitet/støkiometri enn variantene B-HH2 og B-HH3 (Figur 11). B-HH1 kan skjelnes fra B-HH2 og B-HH3 ved dens delvis humane CDR1 og CDR2-regioner (Kabat-definisjon), så vel som Ala/Thrpolymorfisme i posisjon 28 (Kabat-nummerering). Dette indikerer at den ene eller andre av posisjon 28, den fullstendige CDR1 og/eller den fullstendige CDR2 er viktig for antistoff/antigen-interaksjon.
Sammenligning av B-HL1, B-HH1 og det kimære chB-ly1 parentale antistoffet viste fravær av enhver bindingsaktivitet i B-HL1-konstruksjonen og omtrent halvparten av bindingsintensitet /støkiometri av B-HH1 sammenlignet med B-ly1 (Figur 12). Både B-HL1 så vel som B-HH1 er konstruert basert på akseptorstrukturer (”framework”) avledet fra den humane VH1-klassen. Blant andre forskjeller, er posisjon 71 (Kabat-nummerering) av B-HL1-konstruksjonen en påfallende forskjell, som indikerer dens antatte betydning for antigenbinding. Aminosyren i posisjon 71 er én av restene som bestemmer den kanoniske løkkestrukturen av CDR2 av den tunge kjeden. Her synes alanin eller en funksjonell ekvivalent derav (f.eks., leucin, valin eller treonin (se, f.eks., Morea et al., Methods 20: 267-279 (2000)) å være viktig for antigenbinding, mens arginin synes å være ugunstig for antigenbinding.
Ved sammenligning av antigenbindings-data fra Figurene 2 og 9 til 13, viser BHH2-BKV1, BHL8-BKV1 og BHL11-BKV1-variantene god bindingsaffinitet, blant de forskjellige humaniserte antistoff-variantene testet, til human CD20 på overflaten av humane celler. Til tross for lignende EC50-verdier for antigenbinding, avviker disse variantene sterkt i deres atferd med hensyn til å indusere apoptose i CD20-positive målceller (se Figurene 4 – 6, 14, 15). Siden det opprinnelige B-ly1-antistoffet viste lav induksjon av apoptose, bestemte foreliggende oppfinnere forskjellene mellom den parentale B-ly1 antistoff-konstruksjonen og B-HL8 og B-HH2-konstruksjonene. Syv rester ble identifisert i B-HH2 tung kjede som ikke var til stede i B-HL8 eller parental B-ly1 tunge kjeder: Gln1, Ala9, Val11, Lys12, Ser16, Val20 og Met48. Alle disse syv restene er lokalisert i struktur (”framework”)-regionene av VH-domenet. Sannsynlighet for direkte antigen-kontakt var usannsynlig, bortsett fra for Gln1. For å bestemme om én enkelt av disse restene alene var ansvarlig for den nylig dannede apoptose-induserende egenskapen, ble syv varianter av B-HL8 tung kjede dannet, som potensielt kunne gjenopprette den apoptotiske atferden av B-HH2-konstruksjonen: B-HL11(som har mutasjonen E1Q), B-HL12(G9A, V48M), B-HL13(L11V, V48M), B-HL14(V12K, V48M), B-HL15(G16S, V48M), B-HL16(L20V, V48M) og B-HL17(V48M). Se SEKV ID NR: 32, 34, 36, 38, 40, 42 og 44 (hvilke, som presentert i sekvenslisten ikke er nummerert i henhold til Kabat, men hvis Kabat nummerering lett kan bestemmes av fagfolk). De antigen-bindende egenskapene av disse variantene er ikke drastisk forskjellig med hensyn til EC50-verdier og støkiometri (se Figur 2). Imidlertid kan en tydelig forskjell finnes i deres evne til å indusere apotose (Figurene 4 - 6, 14, 15 og 24). Konstruksjonen med L11V, V48M-modifikasjonene, B-HL13, økte betydelig evnen til å indusere apoptose (se Figur 24). V48M-modifikasjon alene hadde imidlertid ikke synlig effekt (se Figur 5). Følgelig påvirket restene ved Kabatposisjonene 11 og 12 den apoptotiske atferden i størst grad. Disse restene påvirker ikke antigenbindingen direkte, men påvirker heller grenseflaten mellom VH og CH1-domenene og virker følgelig gjennom en modifikasjon av ”albue”-vinkelen.
B-HL4-konstruksjonen er avledet fra B-HH2-antistoffet ved å erstatte FR1 av B-HH2 med den fra den humane kjønnscelle-sekvensen IGHV1-45 (Aksesjon nr X92209). Denne konstruksjonen viser sterkt redusert antigen-bindende evne, til tross for at den har forskjellige aminosyrer ved kun fire posisjoner innenfor FR1. Disse restene er lokalisert i posisjonene 2, 14, 28 og 30 (Kabat-nummerering). Av disse kunne posisjon 28 og 30 være en innflytelsesrik posisjon, siden den er del av Chotia-definisjonen av CDR1. I variantene B-HH8 og 9 (begge med BKV1 lett kjede), er posisjonene 28 og 30 modifisert sammenlignet med den parentale B-ly1-sekvensen. Som sett i Figur 22 lider ikke bindingsegenskapen betydelig dersom treonin 28 eller treonin 30 er til stede (Figur 22). Ingen tilbakemutasjoner ble innført i den humaniserte lette kjeden, som hadde den fullstendige Kabat CDR1, CDR2 og CDR3 bundet. Ved induksjon av apoptose (se Figurene 14, 15 og 21), var den mest potente varianten humanisert B-ly1-variant BHH2-BKV1 (enda mer potent enn den opprinnelige chB-ly1 og mye mer potent enn et antistoff med en sekvens identisk med rituximab, C2B8). Andre humaniserte varianter som kan oppnå økt apoptose er: B-HL13 og B-HL14 (derivater av BHL8), BHH8 ("blandet struktur (”framework”)"), BHH9 (“blandet struktur”) med én tilbakemutasjon for å undersøke effekten av S30T) og B-HH6 (M34I derivat av B-HH2). Variant BHH4 er en annen humanisert B-ly1-variant som ikke innfører ytterligere ikke-humane sekvenser. Variantene B-HH5, B-HH6 og B-HH7 er derivater av B-HH2-konstruksjonen med en delvis humanisert Kabat CDR1-region.
Viktige egenskaper av det humaniserte B-ly1-antistoffet er at det er et type II anti-CD20-antistoff som definert i Cragg, M.S. og Glennie, M.J., Blood 103(7):2738-2743 (April 2004). Det induserte derfor ikke, ved binding til CD20, noen signifikant resistens mot ikke-ionisk detergent ekstraksjon av CD20 fra overflaten av CD20+ humane celler, ved anvendelse av analysen beskrevet for dette formål i Polyak, M.J. og Deans, J.P., Blood 99(9):3256-3262 (2002). Det induserte betydelig mindre resistens mot ikke-ionisk detergent ekstraksjon av CD20 enn C2B8-antistoffet (et annet anti-CD20-antistoff med en sekvens identisk med rituximab (Se U.S. Pat. Publ. nr.2003 0003097 ved Reff)). Som forventet av et type II anti-CD20-antistoff, hadde ikke det humaniserte B-ly1 noen signifikant komplement-mediert lysis-aktivitet og fremviste mye lavere komplement-mediert lysis-aktivitet enn anti-CD20-antistoffet C2B8 (kimær IgG1 med identisk sekvens med rituximab). En annen viktig egenskap av det humaniserte B-ly1-antistoffet (variant B-HH2 B-KV1) var at det var svært potent i den homotypiske aggregeringsanalysen. I denne analysen ble CD20-positive humane celler, Daudiceller, inkubert i celledyrkningsmedium i opptil 24 timer ved 37<o>C i en 5% CO2-atmosfære i en pattedyrcelle inkubator som beskrevet i detalj i Deans et al., med antistoffet i en konsentrasjon på 1 mikrogram pr. ml og parallelt i en konsentrasjon på 5 mikrogram pr. ml. Som en sammenligning ble parallell kontrollinkubering av cellene utført under identiske betingelser ved anvendelse av anti-CD20-antistoffet, C2B8. Ved forskjellige tidspunkter, omfattende 8 timer og 24 timers inkubering, ble cellene inspisert visuelt ved anvendelse av et mikroskop. Det ble funnet at det humaniserte B-ly1-antistoffet førte til sterk homotypisk aggregering, hvor aggregater var betydelig større enn de indusert ved tilsetning av kontrollantistoffet C2B8. I tillegg, og i overensstemmelse med at antistoffet er anti-CD20 type II, induserte det høyere nivåer av apoptose når CD20-positive humane celler ble inkubert med det humaniserte B-ly1 antistoffet, relativt til en kontroll under identiske betingelser ved anvendelse av det C2B8 kimære IgG1-antistoffet med identisk sekvens som rituximab.
Glykokonstruerte varianter av de humaniserte antistoffene ble fremstilt ved koekspresjon av GnTIII glykosyltransferase, sammen med antistoff-genene, i pattedyrceller. Dette førte til en økning i fraksjonen av ikke-fukosylerte oligosakkarider bundet til Fc-regionen av antistoffene, omfattende todelte ikkefukosylerte oligosakkarider, som er beskrevet i WO 2004/065540 (Figurene 17-19). De glykokonstruerte antistoffene hadde betydelig høyere nivåer av binding til human FcgammaRIII-reseptorer (Figur 20) og også høyere ADCC-aktivitet (Figur 16), relativt til det ikke-glykokonstruerte antistoffet og relativt til C2B8-antistoffet. Det humaniserte B-ly1-antistoffet var også mer potent med hensyn til å indusere human B-celle deplesjon i en helblod-analyse (Figur 16) enn kontroll C2B8-antistoffet. Dette var riktig både for det ikke-glykokonstruerte B-ly1-antistoffet og for den glykokonstruerte versjon av det. Det glykokonstruerte antistoffet var omtrent 1000 ganger mer potent enn C2B8-kontroll anti-CD20 antistoffet med hensyn til å depletere B-celler i helblod-analysen. Denne sammenligningen er viktig både for de ikke-glykokonstruerte og for de glykokonstruerte humaniserte formene av B-ly1-antistoff, fordi det viste at i forsøk som kombinerte Fc reseptoravhengige aktiviteter, slik som ADCC, pluss komplement-mediert lysis, pluss induksjon av apoptose, at begge formene av B-ly1 var betydelig mer potent enn C2B8, selv om begge formene av B-ly1 har dramatisk lavere komplement-mediert lysis-aktivitet. ADCC, Fc reseptor-avhengig celle-drepings-aktiviteter og apoptoseinduksjon var til stede i denne overlegne aktiviteten av de humaniserte B-ly1-antistoff-variantene. Videre var, i apoptose-analysen, både de glykokonstruerte og ikke-glykokonstruerte formene av dette type II anti-CD20-antistoffet potente, hvor de Fc-konstruerte variantene med økt bindingsaffinitet for Fcgamma-reseptorer var enda mer potente i apoptose-induksjon enn den ikke-Fc-konstruerte varianten og hvor alle varianter var betydelig mer potente enn kontroll-antistoffet C2B8. Den nøyaktige mekanismen for forbedret homotypisk aggregering og induksjon av apoptose mediert av type II anti-CD20 antistoffer er ikke kjent og ledsagende binding til andre molekyler på overflaten av CD20-positive celler, slik som Fc gamma-reseptorer, kan innvirke på denne viktige egenskapen. Det var derfor viktig å vise at anti-CD20 antistoffer av type II som er konstruert i deres Fc-region for økt bindingsaffinitet til Fc gamma-reseptorer, omfattende FcgammaRIII og med en assosiert økning i ADCC-aktivitet, fortsatt var i stand til å indusere sterk apoptose, til og med høyere enn den ikke-Fc-konstruerte og homotypisk aggregering. Induksjon av apoptopse er viktig siden det, in vivo, er steder i kroppen hvor de målrettede CD20-positive cellene kan finnes, men hvor tilgang til FcgammaRIII-positive celler er vanskeligere enn i blod (for eksempel lymfeknuter).
På disse stedene kan induksjon av apoptose ved anti-CD20-antistoffet i seg selv, være viktig for god effektivitet av anti-CD20 antistoffbehandling for mennesker, både for behandling av maligne hematologiske sykdommer slik som non-Hodgkins lymfomer og B-celle kronisk lymfocyttisk leukemi og for behandling av autoimmune sykdommer slik som revmatoid artritt og lupus gjennom en metode for B-celle deplesjon. Den økte bindingsaffiniteten til FcgammaRIII og høyere ADCC av det humaniserte, Fc-konstruerte type II anti-CD20-antistoffet kan også være en svært viktig egenskap for slike terapier. Til slutt kan den reduserte eller ubetydelige komplement-medierte lysisaktiviteten av denne type II anti-CD20-antistoff, omfattende humaniserte og Fc-konstruerte varianter, også være viktig, siden høyere komplement-aktivering ved anti-CD20-antistoffer har blitt korrelert med økte, uønskede bivirkninger.
EKSEMPEL 3
For å ytterligere undersøke rester som innvirker på apoptotisk aktivitet, ble seks varianter av BHH2 tung kjede dannet: BHH2-A (V11L) (SEKV ID NR: 124), BHH2-B (K12V) (SEKV ID NR: 125), BHH2-C (A9 G) (SEKV ID NR: 126), BHH2-D (E10 G) (SEKV ID NR: 127), BHH2-E (T110I) (SEKV ID NR: 128) og BHH2-F (S112I) (SEKV ID NR: 129). Disse variant-konstruksjonene ble testet for binding til mål-antigen (CD20) ved metoder beskrevet her ovenfor. Alle seks variantkonstruksjonene beholdt bindingsaktivitet.
Disse tung kjede variant-konstruksjonene ble også testet for apoptotisk effekt ved metoder beskrevet her ovenfor. Fem av konstruksjonene, BHH2-B, BHH2-C, BHH2-D, BHH-2E og BHH-2F, hadde samme apoptiske potensiale som den parentale konstruksjonen BHH2. Imidlertid var evnen av BHH2-A (V11L) til å indusere apoptose betydelig redusert sammenlignet med BHH2 (se Figur 23).
Den apoptotiske effekten av enkelt aminosyre-subsitusjoner i den humaniserte B-ly1 lette kjeden (BKV1) ble også undersøkt gjennom fremstilling av fem varianter: BKV-10 (P40A) (SEKV ID NR:130), BKV-11 (A80P) (SEKV ID NR:131), BKV-12 (V83F) (SEKV ID NR:132), BKV-13 (E105A) (SEKV ID NR:133) og BKV-14 (I106A) (SEKV ID NR:134). Konstruksjonene BKV-11, BKV-12, BKV-13 og BKV-14 ble testet for binding til mål-antigen (CD20) ved metoder beskrevet her ovenfor og det ble bestemt at alle fire beholdt bindingsaktivitet. Disse fire lett kjede variant-konstruksjonene ble også testet for apoptotisk effekt ved metoder beskrevet her ovenfor. Det apoptotiske potensiale av BKV-11, BKV-12 og BKV-13 var uendret ved deres respektive substiusjoner. Imidlertid viste BKV-14 en redusert evne til å indusere apoptose sammenlignet med BKV1 (se, f.eks., Figur 25).

Claims (20)

PATENTKRAV
1. Modifisert antigenbindende molekyl som spesifikt binder til human CD20 omfattende en tungkjede variabel region omfattende minst én aminosyrerestsubstitusjon i rammeverkregionen 1 (FR1) av nevnte tungkjede variabel region som er en erstatning av en aminosyrerest i én eller flere av Kabatposisjoner 9, 10, 11 eller 12 sammenlignet med tungkjede variable regionen ifølge SEKV ID NR: 4, hvor nevnte erstatning resulterer i endret cellesignaleringsaktivitet til et målantigen når nevnte modifiserte antigenbindende molekyl er kompleksert med nevnte målantigen, hvor nevnte endrete cellesignaleringsaktivitet er økt agonistaktivitet og hvor nevnte økte agonistaktivitet er induksjon av apoptose.
2. Modifisert antigenbindende molekyl ifølge krav 1, hvor nevnte substitusjon i FR1 av nevnte tungkjede variabel region omfatter
(i) en erstatning av aminosyreresten i Kabatposisjon 9 med aminosyreresten glysin;
(ii) en erstatning av aminosyreresten i Kabatposisjon 10 med aminosyreresten glysin
(iii) en erstatning av aminosyreresten i Kabatposisjon 11 med aminosyreresten leucin; eller
(iv) en erstatning av aminosyreresten i Kabatposisjon 12 med aminosyreresten valin.
3. Modifisert antigenbindende molekyl ifølge krav 1 eller krav 2, hvor det antigenbindende molekylet omfatter en tungkjede variabel region valg fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 126, 127, 125 og 124.
4. Modifisert antigenbindende molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor nevnte antigenbindende molekyl omfatter den lettkjede variable regionen valg fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 48, 130, 131, 132, 133 og 134.
5. Modifisert antigenbindende molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4 videre omfattende en human Fc-region.
6. Modifisert antigenbindende molekyl ifølge krav 5, hvor nevnte Fc-region er modifisert til
(i) å ha en redusert proporsjon av fucoserester sammenlignet med en ikkemodifisert Fc-region;
(ii) å ha en økt proporsjon av GlcNAc-rester til fucoserester sammenlignet med en ikke-modifisert Fc-region;
(iii) å ha en økt Fc-reseptorbindingsaffinitet sammenlignet med en ikke-modifisert Fc-region; og
(iv) å ha en økt effektorfunksjon sammenlignet med en ikke-modifisert Fc-region.
7. Polynukleotid som koder for en tungkjede variabel region ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3.
8. Polynukleotid som koder for en lettkjede variabel region ifølge krav 4.
9. Vektor omfattende et polynukleotid ifølge krav 7 eller krav 8.
10. Vektor ifølge krav 9, som er polycistronisk.
11. Vertscelle omfattende vektoren ifølge krav 10 eller et polynukleotid ifølge krav 7 eller krav 8.
12. Vertscelle, hvor nevnte vert er konstruert til å uttrykke minst én nukleinsyre som koder for et polypeptid som har β(1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III-aktivitet.
13. Vertscelle ifølge krav 12, hvor nevnte polypeptid som har β(1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III-aktivitet er et fusjonspolypeptid videre omfattende Golgilokaliseringsdomenet fra et heterologt Golgioppholdende polypeptid.
14. Vertscelle ifølge krav 13, hvor nevnte Golgilokaliseringsdomene er valgt fra lokaliseringsdomenet til mannosidase II, lokaliseringsdomenet til β(1,2)-N-acetylglukosaminyltransferase I, lokaliseringsdomenet til β(1,2)-N-acetylglukosaminyltransferase II, lokaliseringsdomenet til mannosidase I, og lokaliseringsdomenet til α1-6 kjernefucosyltransferase.
15. Fremgangsmåte for å produsere et modifisert antigenbindende molekyl som spesifikt binder til human CD20 ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 omfattende:
(i) dyrkning av vertscellen ifølge et hvilket som helst av kravene 11 til 14 under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte polynukleotid; og
(ii) utvinning av nevnte modifiserte antigenbindende molekyl fra dyrkningsmediumet.
16. Modifisert antigenbindende molekyl som binder spesifikt til human CD20 oppnåelig fra vertscellen ifølge et hvilket som helst av kravene 11 til 14.
17. Farmasøytisk sammensetning omfattende det modifiserte antigenbindende molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 eller 16, eller oppnåelig ved fremgangsmåten ifølge krav 15 og en farmasøytisk akseptabel bærer.
18. Modifisert antigenbindende molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 eller 16, eller oppnåelig ved fremgangsmåten ifølge krav 15 for anvendelse i behandling eller forebygging av kreft eller en precancerøs tilstand eller lesjon.
19. Modifisert antigenbindende molekyl for anvendelse ifølge krav 18, hvor nevnte precancerøse tilstand eller lesjon er valgt fra gruppen bestående av oral leukoplakia, aktinisk keratose (solar keratose), precancerøse polypper av tarm eller rektum, gastrisk epitelial dysplasi, adenomatøs dysplasi, arvelig nonpolypose kolonkreftsyndrom (HNPCC), Barretts øsofagus, blæredysplasi, og precancerøse cervikale tilstander.
20. Modifisert antigenbindende molekyl for anvendelse ifølge krav 18, hvor nevnte kreft er valgt fra gruppen bestående av B-cellelymfom, brystkreft, blærekreft, hode- og halskreft, hudkreft, pankreatisk kreft, lungekreft, eggstokkreft, kolonkreft, prostatakreft, nyrekreft og hjernekreft.
NO20081328A 2005-08-26 2006-08-25 Modifiserte antigen-bindende molekyler med endret celle-signaliseringsaktivitet NO345919B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US71145405P 2005-08-26 2005-08-26
PCT/IB2006/003294 WO2007031875A2 (en) 2005-08-26 2006-08-25 Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20081328L NO20081328L (no) 2008-05-23
NO345919B1 true NO345919B1 (no) 2021-10-18

Family

ID=37865318

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20081328A NO345919B1 (no) 2005-08-26 2006-08-25 Modifiserte antigen-bindende molekyler med endret celle-signaliseringsaktivitet
NO20210557A NO20210557A1 (no) 2005-08-26 2021-05-04 Modifiserte antigen-bindende molekyler med endret celle-signaliseringsaktivitet

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20210557A NO20210557A1 (no) 2005-08-26 2021-05-04 Modifiserte antigen-bindende molekyler med endret celle-signaliseringsaktivitet

Country Status (19)

Country Link
US (2) US20070071745A1 (no)
EP (3) EP2395024B1 (no)
JP (3) JP5373396B2 (no)
KR (2) KR101379568B1 (no)
CN (2) CN101291954B (no)
AR (1) AR055137A1 (no)
AU (1) AU2006290433B2 (no)
BR (2) BRPI0615397B1 (no)
CA (1) CA2619298C (no)
CL (2) CL2010000823A1 (no)
HK (1) HK1185357A1 (no)
IL (1) IL189756A (no)
NO (2) NO345919B1 (no)
PH (1) PH12012502376B1 (no)
RU (2) RU2547931C2 (no)
SG (1) SG192479A1 (no)
TW (2) TWI615407B (no)
WO (1) WO2007031875A2 (no)
ZA (1) ZA200802500B (no)

Families Citing this family (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1555411A (zh) 2001-08-03 2004-12-15 ���迨�����＼���ɷݹ�˾ 抗体-依赖性细胞毒性增大的抗体糖基化变体
EP1622942B1 (en) 2003-05-01 2014-11-19 ImClone LLC Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
RS55723B1 (sr) 2003-11-05 2017-07-31 Roche Glycart Ag Molekuli koji se vezuju za antigen sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom
EP2402374A1 (en) 2005-02-07 2012-01-04 GlycArt Biotechnology AG Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
US8128929B2 (en) 2005-06-17 2012-03-06 Imclone Llc Antibodies against PDGFRa
CN101291954B (zh) * 2005-08-26 2013-03-27 罗氏格黎卡特股份公司 具有改变的细胞信号传导活性的修饰的抗原结合分子
AP2008004569A0 (en) 2006-02-03 2008-08-31 Imclone Systems Inc IGR-IR antagonists as adjuvants for treatment of prostrate cancer
AR062223A1 (es) * 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
WO2009000099A2 (en) 2007-06-25 2008-12-31 Esbatech Ag Methods of modifying antibodies, and modified antibodies with improved functional properties
WO2009030368A1 (en) * 2007-09-05 2009-03-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with type i and type ii anti-cd20 antibodies
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
US20090110688A1 (en) * 2007-10-24 2009-04-30 Georg Fertig Combination therapy of type ii anti-cd20 antibody with a proteasome inhibitor
BRPI0819593A2 (pt) * 2007-12-21 2015-05-05 Genentech Inc "método para tratamento de um paciente com artrite reumatóide (ra)"
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
RU2540018C2 (ru) * 2008-03-13 2015-01-27 Биотест Аг Средство для лечения заболевания
WO2009121690A1 (en) * 2008-03-13 2009-10-08 Biotest Ag Agent for treating disease
CN102027016A (zh) * 2008-03-13 2011-04-20 生物测试股份公司 一种治疗疾病的试剂
NZ587284A (en) * 2008-03-25 2012-05-25 Roche Glycart Ag Use of a type ii anti-cd20 antibody with increased antibody dependent cellular cytotoxicity (adcc) in combination with cyclophosphamide, vincristine and doxorubicine for treating non-hodgkin' s lymphomas
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
CA2722466A1 (en) * 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2009256250B2 (en) * 2008-06-03 2013-05-30 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2725666A1 (en) * 2008-06-03 2009-12-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
NZ590074A (en) * 2008-07-08 2012-12-21 Abbott Lab Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR20110061630A (ko) * 2008-09-29 2011-06-09 바이오테스트 아게 질병 치료용 조성물
US20100247484A1 (en) * 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
JP5501439B2 (ja) 2009-04-02 2014-05-21 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 完全長抗体と単鎖Ｆａｂフラグメントとを含む多重特異的抗体
EP2417159A1 (en) 2009-04-07 2012-02-15 Roche Glycart AG Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
KR101456326B1 (ko) 2009-04-07 2014-11-12 로슈 글리카트 아게 3가, 이중특이적 항체
MX2011010158A (es) 2009-04-07 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-2/anti-c-met.
US8815242B2 (en) * 2009-05-27 2014-08-26 Synageva Biopharma Corp. Avian derived antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
CA2769595A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with fludarabine and/or mitoxantrone
TWI409079B (zh) 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
TWI412375B (zh) 2009-08-28 2013-10-21 Roche Glycart Ag 人類化抗ｃｄｃｐ１抗體
TW201113037A (en) 2009-08-28 2011-04-16 Hoffmann La Roche Antibodies against CDCP1 for the treatment of cancer
IN2012DN02737A (no) * 2009-09-01 2015-09-11 Abbott Lab
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
CN104945509A (zh) 2009-09-16 2015-09-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含卷曲螺旋和/或系链的蛋白质复合体及其用途
KR20140015139A (ko) * 2009-10-15 2014-02-06 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
GB0920944D0 (en) 2009-11-30 2010-01-13 Biotest Ag Agents for treating disease
HUE029026T2 (en) 2009-12-22 2017-01-30 Roche Glycart Ag Anti-HER3 antibodies and their applications
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
EP2563391B1 (en) 2010-04-27 2020-08-26 Roche Glycart AG Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a mtor inhibitor
CA2807014A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2806855A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 F. Hoffmann - La Roche Ag Chronic lymphocytic leukemia (cll) biomarkers
TW201208703A (en) * 2010-08-17 2012-03-01 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated CD20 antibody with an anti-VEGF antibody
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
TW201211252A (en) 2010-08-26 2012-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
WO2012080389A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a mdm2 inhibitor
EP2655413B1 (en) 2010-12-23 2019-01-16 F.Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
EP2681240B1 (en) 2011-02-28 2017-08-16 F. Hoffmann-La Roche AG Monovalent antigen binding proteins
EP2681239B8 (en) 2011-02-28 2015-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding proteins
KR101684750B1 (ko) 2011-09-23 2016-12-08 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항-egfr/항-igf-1r 항체
KR102366029B1 (ko) * 2011-09-30 2022-02-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자
US20130302274A1 (en) 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
UY34558A (es) 2011-12-30 2013-07-31 Abbvie Inc Proteínas de unión específicas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17
BR112014019579A2 (pt) 2012-02-10 2019-10-15 Genentech, Inc Anticorpo de cadeia única, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo de cadeia única, heteromultímero e método de produção do heteromultímero
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
AU2013337775B2 (en) 2012-11-01 2017-03-30 Abbvie Inc. Anti-VEGF/DLL4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
WO2014067642A1 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Mab Discovery Gmbh Method for the production of multispecific antibodies
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
US9180185B2 (en) 2013-01-11 2015-11-10 Hoffman-La Roche Inc. Combination therapy of anti-HER3 antibodies
PL2953972T3 (pl) 2013-02-05 2021-03-08 Engmab Sàrl Metoda wyboru przeciwciał przeciwko bcma
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
BR112015022210A8 (pt) 2013-03-13 2018-01-23 Genentech Inc formulações de anticorpo
CN105324396A (zh) 2013-03-15 2016-02-10 艾伯维公司 针对IL-1β和/或IL-17的双重特异性结合蛋白
WO2015052230A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
WO2015082446A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using an anti-cdcp1 antibody and a taxane
BR112016013741A2 (pt) 2013-12-17 2017-10-03 Genentech Inc Usos de antagonistas de ligação de eixo de pd-1 e um anticorpo de anti-cd20, e kit compreendendo os mesmos
AU2015266664B2 (en) 2014-05-30 2020-04-30 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) antibodies
CN106794247B (zh) 2014-09-15 2022-12-02 豪夫迈·罗氏有限公司 抗体配制剂
EP3689910A3 (en) 2014-09-23 2020-12-02 F. Hoffmann-La Roche AG Method of using anti-cd79b immunoconjugates
WO2016073664A1 (en) * 2014-11-05 2016-05-12 The University Of Chicago Methods and compositions pertaining to human cerebral cavernous malformations
ES2764111T3 (es) 2014-12-03 2020-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
CN107592812A (zh) 2015-05-11 2018-01-16 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗狼疮性肾炎的组合物和方法
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
WO2016207312A1 (en) * 2015-06-24 2016-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
EP3108897A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
CN108026172B (zh) 2015-06-26 2022-04-29 赛诺菲生物技术公司 单克隆抗il-1racp抗体
MX2017016645A (es) 2015-06-29 2018-11-09 Genentech Inc Anticuerpo anti-cd20 de tipo ii para su uso en el trasplante de órganos.
KR20180042271A (ko) 2015-08-03 2018-04-25 잉맵 에스에이알엘 Bcma에 대응하는 단일클론 항체
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CN115920030A (zh) 2015-12-09 2023-04-07 豪夫迈·罗氏有限公司 Ii型抗cd20抗体用于降低抗药物抗体形成
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
EP3423491A1 (en) 2016-03-01 2019-01-09 H. Hoffnabb-La Roche Ag Obinutuzumab variants having altered cell death induction
IL296966A (en) * 2016-04-01 2022-12-01 Amgen Inc Chimeric flt-3 receptors and methods of using them
WO2017184553A1 (en) * 2016-04-18 2017-10-26 Baylor College Of Medicine Cancer gene therapy targeting cd47
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3257866A1 (en) 2016-06-17 2017-12-20 Academisch Medisch Centrum Modified anti-tnf antibody and use thereof in the treatment of ibd
US10277886B2 (en) 2016-07-19 2019-04-30 Gopro, Inc. Mapping of spherical image data into rectangular faces for transport and decoding across networks
MX2019004621A (es) 2016-11-02 2019-11-28 Engmab Sarl Anticuerpo biespecifico contra bcma y cd3 y un farmaco inmunologico para uso combinado en el tratamiento del mieloma multiple.
BR112019007267A2 (pt) 2016-12-20 2019-07-09 Hoffmann La Roche anticorpo biespecífico anti-cd20/anti-cd3, produto farmacêutico, composição farmacêutica que compreende um anticorpo biespecífico anti-cd20/anti-cd3, uso de combinação de anticorpo biespecífico anti-cd20/anti-cd3 e um agonista de 4-1bb e método de tratamento ou retardamento da progressão de câncer em pacientes
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
MX2019014274A (es) 2017-06-02 2020-01-23 Hoffmann La Roche Metodo de tratamiento.
CN110869391A (zh) 2017-07-26 2020-03-06 豪夫迈·罗氏有限公司 用BET抑制剂,Bcl-2抑制剂和抗CD20抗体的组合疗法
CN111278461A (zh) * 2017-08-16 2020-06-12 百时美施贵宝公司 可前药化抗体、其前药以及使用和制备方法
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
KR20200132913A (ko) 2018-03-13 2020-11-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 4-1bb 작용제와 항-cd20 항체의 치료 조합
CN112996801A (zh) * 2018-11-26 2021-06-18 北卡罗来纳州大学 用于捕获宿主细胞蛋白的肽配体
AU2018451747A1 (en) 2018-12-06 2021-06-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of diffuse large B-cell lymphoma comprising an anti-CD79b immunoconjugates, an alkylating agent and an anti-CD20 antibody
TW202108178A (zh) 2019-05-14 2021-03-01 美商建南德克公司 使用抗CD79b免疫結合物治療濾泡性淋巴瘤之方法
AU2020296247A1 (en) * 2019-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the generation of a trivalent antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization
US20220275065A1 (en) * 2019-07-31 2022-09-01 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Multivalent dna antibody constructs and use thereof
MX2022002963A (es) 2019-09-12 2022-04-06 Genentech Inc Composiciones y metodos para tratar nefritis lupica.
BR112022007216A2 (pt) 2019-10-18 2022-08-23 Genentech Inc Métodos para tratamento de linfoma difuso, kit e imunoconjugado
CN111411079A (zh) * 2020-03-27 2020-07-14 北京时合生物科技有限公司 细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用
BR112022021441A2 (pt) 2020-04-24 2022-12-13 Genentech Inc Métodos para tratar linfoma folicular e linfoma difuso de grandes células b e kits
AU2022206061A1 (en) 2021-01-06 2023-07-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy employing a pd1-lag3 bispecific antibody and a cd20 t cell bispecific antibody
WO2022198192A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
CN117396232A (zh) 2021-05-12 2024-01-12 基因泰克公司 使用抗cd79b免疫缀合物治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法
KR20240046524A (ko) 2021-08-07 2024-04-09 제넨테크, 인크. 미만성 거대 b-세포 림프종을 치료하기 위해 항-cd79b 면역접합체를 사용하는 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997017446A2 (en) * 1995-11-07 1997-05-15 Idec Pharmaceutical Corporation HUMANIZED ANTIBODIES TO HUMAN gp39, COMPOSITIONS CONTAINING AND THERAPEUTIC USE THEREOF
WO2003024388A2 (en) * 2001-09-20 2003-03-27 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and compositions for treating and preventing skin disorders using binding agents specific for psma
WO2005044859A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
CA2226575C (en) 1995-07-27 2011-10-18 Genentech, Inc. Stabile isotonic lyophilized protein formulation
UA76934C2 (en) * 1996-10-04 2006-10-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Reconstructed human anti-hm 1.24 antibody, coding dna, vector, host cell, method for production of reconstructed human antibody, pharmaceutical composition and drug for treating myeloma containing reconstructed human anti-hm 1.24 antibody
WO1999060025A1 (fr) * 1998-05-20 1999-11-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticorps recombines de gene
DE69810481T2 (de) 1997-06-13 2003-09-25 Genentech Inc Stabilisierte antikörperformulierung
ES2364266T3 (es) 1998-04-03 2011-08-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticuerpo humanizado hacia el factor tisular humano (tf) y procedimiento para construir el anticuerpo humanizado.
PT1071700E (pt) * 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
WO2000040968A1 (en) * 1999-01-05 2000-07-13 Unilever Plc Binding of antibody fragments to solid supports
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
AU8822601A (en) 2000-07-31 2002-02-13 Biolex Inc Expression of biologically active polypeptides in duckweed
US20020128448A1 (en) 2000-10-20 2002-09-12 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant IgG3 Rituxan and therapeutic use thereof
RU2306952C2 (ru) * 2001-01-31 2007-09-27 Байоджен Айдек Инк. Лечение в-клеточных злокачественных опухолей с использованием комбинации применений, связанных с антителами, уменьшающими количество b-клеток, и с иммуномодулирующими антителами
WO2002079255A1 (en) * 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceuticals Corporation RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII
US7321026B2 (en) * 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
CN1555411A (zh) * 2001-08-03 2004-12-15 ���迨�����＼���ɷݹ�˾ 抗体-依赖性细胞毒性增大的抗体糖基化变体
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
KR101001243B1 (ko) 2001-12-27 2010-12-17 글리코파이, 인크. 포유동물-유형 탄수화물 구조의 설계 방법
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
WO2003068821A2 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Immunomedics, Inc. Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US20040132101A1 (en) * 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EP1485492B1 (en) 2002-03-19 2011-12-21 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Gntiii (udp-n-acetylglucosamine:beta-d mannoside beta(1,4)-n-acetylglucosaminyltransferase iii) expression in plants
DE60315815T2 (de) * 2002-03-21 2008-05-21 Eli Lilly And Co., Indianapolis ANTAGONISTISCHE HUMANE ANTI-hFAS-LIGAND-ANTIKÖRPER UND FRAGMENTE DAVON
US20030190689A1 (en) 2002-04-05 2003-10-09 Cell Signaling Technology,Inc. Molecular profiling of disease and therapeutic response using phospho-specific antibodies
US20040132097A1 (en) 2002-06-19 2004-07-08 Bacus Sarah S. Method for predicting response to epidermal growth factor receptor-directed therapy
CA2495251C (en) 2002-08-14 2018-03-06 Macrogenics, Inc. Fc.gamma.riib-specific antibodies and methods of use thereof
ES2347325T3 (es) 2002-09-12 2010-10-28 Greenovation Biotech Gmbh Metodo de produccion de proteinas.
CA2508214A1 (en) * 2002-12-02 2004-06-17 Abgenix, Inc. Antibodies directed to phospholipase a2 and uses thereof
AU2003294912B2 (en) 2002-12-20 2009-06-04 Greenovation Biotech Gmbh Production of heterologous glycosylated proteins in bryophyte cells
US7960512B2 (en) * 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
NZ541503A (en) 2003-01-22 2008-09-26 Glycart Biotechnology Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased Fc receptor binding affinity and effector function
CA2513113A1 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
BRPI0408317A (pt) * 2003-03-14 2006-03-07 Pharmacia Corp anticorpos do receptor de igf-i para o tratamento de cáncer
PT2272868E (pt) * 2003-06-05 2015-07-07 Genentech Inc Terapêutica de combinação para distúrbios de células b
EP1660534A2 (en) * 2003-08-22 2006-05-31 MedImmune, Inc. Humanization of antibodies
SG166768A1 (en) * 2003-12-23 2010-12-29 Rinat Neuroscience Corp Agonist anti-trkc antibodies and methods using same
WO2005079479A2 (en) * 2004-02-17 2005-09-01 Absalus, Inc. Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus
US7501121B2 (en) * 2004-06-17 2009-03-10 Wyeth IL-13 binding agents
US7572456B2 (en) * 2004-09-13 2009-08-11 Macrogenics, Inc. Humanized antibodies against West Nile Virus and therapeutic and prophylactic uses thereof
WO2006066089A1 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
EP1888638A2 (en) * 2005-06-03 2008-02-20 Genentech, Inc. Method of producing antibodies with modified fucosylation level
CN101291954B (zh) * 2005-08-26 2013-03-27 罗氏格黎卡特股份公司 具有改变的细胞信号传导活性的修饰的抗原结合分子

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997017446A2 (en) * 1995-11-07 1997-05-15 Idec Pharmaceutical Corporation HUMANIZED ANTIBODIES TO HUMAN gp39, COMPOSITIONS CONTAINING AND THERAPEUTIC USE THEREOF
WO2003024388A2 (en) * 2001-09-20 2003-03-27 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and compositions for treating and preventing skin disorders using binding agents specific for psma
WO2005044859A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function

Also Published As

Publication number Publication date
KR101379568B1 (ko) 2014-04-08
ZA200802500B (en) 2023-04-26
KR20080040036A (ko) 2008-05-07
JP2013116120A (ja) 2013-06-13
EP2395023A2 (en) 2011-12-14
RU2482132C2 (ru) 2013-05-20
TWI615407B (zh) 2018-02-21
EP1931712A2 (en) 2008-06-18
TW200804423A (en) 2008-01-16
SG192479A1 (en) 2013-08-30
CN103204935A (zh) 2013-07-17
US20070071745A1 (en) 2007-03-29
HK1185357A1 (en) 2014-02-14
JP2009505650A (ja) 2009-02-12
EP2395023A3 (en) 2012-02-01
EP2395024B1 (en) 2018-12-19
BRPI0615397B1 (pt) 2023-10-03
EP2395024A2 (en) 2011-12-14
AU2006290433B2 (en) 2012-06-07
TWI478940B (zh) 2015-04-01
PH12012502376A1 (en) 2016-01-11
KR101460932B1 (ko) 2014-11-12
CA2619298C (en) 2017-07-04
EP2395023B1 (en) 2019-04-03
NO20210557A1 (no) 2008-05-23
CN101291954A (zh) 2008-10-22
RU2012139197A (ru) 2014-03-20
BRPI0615397A2 (pt) 2011-05-17
EP2395024A3 (en) 2012-02-22
JP2015078191A (ja) 2015-04-23
AU2006290433A1 (en) 2007-03-22
PH12012502376B1 (en) 2016-01-11
JP5373396B2 (ja) 2013-12-18
US20150344584A1 (en) 2015-12-03
AR055137A1 (es) 2007-08-08
EP1931712B1 (en) 2018-12-05
JP5912090B2 (ja) 2016-04-27
BR122020020335B1 (pt) 2023-10-03
RU2008111068A (ru) 2009-10-10
CA2619298A1 (en) 2007-03-22
CL2010000823A1 (es) 2011-01-07
CL2010000822A1 (es) 2011-01-07
TW201527324A (zh) 2015-07-16
WO2007031875A2 (en) 2007-03-22
CN103204935B (zh) 2014-12-10
IL189756A (en) 2017-08-31
CN101291954B (zh) 2013-03-27
JP6081974B2 (ja) 2017-02-15
WO2007031875A3 (en) 2008-02-14
KR20130119988A (ko) 2013-11-01
NO20081328L (no) 2008-05-23
RU2547931C2 (ru) 2015-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2395024B1 (en) Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity
US20230212303A1 (en) Antigen binding molecules with increased fc receptor binding affinity and effector function
AU2006226060A1 (en) Antigen binding molecules directed to MCSP and having increased Fc receptor binding affinity and effector function
AU2012216702B2 (en) Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: ROCHE GLYCART AG, CH