TW202031897A - 抗c5抗體及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明的目的為提供抗C5抗體及其使用方法。本發明提供抗C5抗體及其使用方法。在一些實施例中,本發明的分離的抗C5抗體在中性pH比在酸性pH下以較高親和性結合至C5的β鏈內的抗原決定基。本發明亦提供編碼本發明的抗C5抗體的分離的核酸。本發明亦提供包括本發明的核酸的宿主細胞。本發明亦提供製造抗體的方法,包括培養本發明的宿主細胞以便製造抗體。本發明更提供製造抗C5抗體的方法,包括使動物對多肽免疫,所述多肽包括C5的β鏈的MG1-MG2域。本發明的抗C5抗體可作為藥物使用。
Description
本發明係關於抗C5抗體及其使用方法。
補體系統在免疫複合物之清除中及在對於傳染媒介、外來抗原、病毒感染細胞及腫瘤細胞的免疫反應中扮演重要角色。大約有25至30種補體蛋白,其被發現為血漿蛋白及膜輔因子之複雜集合。補體成分藉由與一系列交錯複雜的酶切割及膜結合反應達成它們的免疫防禦功能,造成之補體級聯(complement cascade)導致具有調理素(opsonic)、免疫調節及細胞溶解功能之產物的產生。
目前,普遍接受補體系統可藉由三種不同的途徑被活化:經典途徑、凝集素(lectin)途徑和替代途徑。這些途徑共享許多補體,雖然它們在起始步驟不同,但它們會合及共享負責目標細胞的活化及破壞之相同的末端補體成分(C5至C9)。
經典途徑通常藉由抗原-抗體複合物的形成被活化。獨立地,活化凝集素途徑的第一個步驟為特定凝集素的結合,例如甘露醣結合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)、H-纖維膠凝蛋白(H-ficolin)、M-纖維膠凝蛋白、L-纖維膠凝蛋白以及C型凝集素CL-11。相反地,替代途徑自發地經歷低程度的轉換活化(turnover activation),其可容易地在外來或其它異常的表面(細菌、酵母菌、經病毒感染的細胞或受損組織)上擴張。這些途徑會合在補體成分C3被活性蛋白分解酶切割而產生C3a及C3b的位置。
C3a為一種過敏毒素(anaphylatoxin),C3b結合至細菌及其它細胞,也結合至特定的病毒及免疫複合物,且標記它們以從循環中移除之(已知為調理素(opsonin)的作用)。C3b亦與其它成分形成複合物以形成C5轉化酶,其切割C5成C5a及C5b。
C5是在正常血清中發現之190 kDa的蛋白,其濃度約為80μg/ml(0.4μM)。C5係經糖基化,其約1.5至3%的質量屬於醣。成熟的C5為115 kDa的α鏈以雙硫鍵連接至75 kDa的β鏈之異二聚體(heterodimer)。C5被合成作為1676個胺基酸的單鏈前驅物蛋白(pro-C5前驅物)(請參照,例如美國專利號6,355,245及美國專利號7,432,356)。pro-C5前驅物被切割以產生作為胺基末端片段的β鏈以及作為羧基末端片段的α鏈。α鏈及β鏈多肽片段係藉由雙硫鍵彼此連接並構成成熟的C5蛋白。
當補體途徑活化時,成熟的C5被切割成C5a及C5b片段。C5a被C5轉化酶自C5的α鏈切割作為胺基末端片段,包括α鏈的前74個胺基酸。成熟的C5的剩餘部分為片段C5b,其包含剩下的α鏈以雙硫鍵鍵結至β鏈。C5a的11 kDa的質量之大約20%屬於醣。
C5a為另一種過敏毒素,C5b與C6、C7、C8及C9結合以形成膜攻擊複合物(membrane attack complex, MAC,C5b-9,末端補體複合物(membrane attack complex, TCC))於目標細胞的表面。當數量充足的MAC***至目標細胞膜中,MAC孔洞被形成以調節目標細胞快速的滲透性細胞溶解。
承前述,C3a及C5a為過敏毒素,它們可觸發肥大細胞去顆粒作用(degranulation),其釋放組織胺及其它發炎反應的媒介,造成平滑肌收縮、血管滲透性上升、白血球活化及其它發炎反應現象,包括細胞增生導致的細胞過多(hypercellularity)。C5a亦可當作趨向性(chemotactic)肽,其用於吸引顆粒細胞,例如:嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球及單核球至補體活化的位置。
C5a的活性係藉由血漿酶羧肽酶N(carboxypeptidase N)調節,其從C5a移除羧基末端的精胺酸形成C5a-des-精胺酸(C5a-des-Arg)衍生物,C5a-des-精胺酸僅顯示1%的過敏毒素活性及未經修飾之C5a的多形核(polymorphonuclear)趨向活性。
雖然適當發揮功能的補體系統提供針對感染性微生物的穩固防禦,但補體的不當調控或活化已牽連到多種疾病之致病性,包含,例如:類風濕性關節炎(RA);狼瘡腎炎;局部缺血-再灌注損傷;陣發性夜間血紅素尿症(PNH);非典型性溶血性***候群(aHUS);緻密沈積物疾病(DDD);黃斑變性(例如:老年性黃斑變性(AMD));溶血、肝酶提高及低血小板(HELLP)症候群;血栓性血小板減少性紫癜症(TTP);自發性流產;少免疫性血管炎(Pauci-immune vasculitis);表皮溶解水疱症;復發性流產;多發性硬化(MS);創傷性腦損傷;及由心肌梗塞、心肺繞通及血液透析所導致的損傷(請參照,例如Holers等人,Immuno
.Rev.
223:300-316(2008))。因此,抑制補體級聯過度或不受控制的活化可提供臨床益處給患有這些疾病的患者。
陣發性夜間血紅素尿症(PNH)是一種罕見血液疾病,其中紅血球細胞受損(compromised),因此與正常紅血球細胞相比,其更快地被破壞。PNH起因於具有體細胞突變於PIG-A(磷脂醯肌醇多醣A型(phosphatidylinositol glycan class A))基因之造血幹細胞的克隆增殖,PIG-A基因位於X染色體上。於PIG-A的突變造成初期阻礙於醣基磷脂醯肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)的合成,其為許多蛋白錨定至細胞表面所需之分子。因此,PNH血球細胞缺乏GPI錨定蛋白,其包含補體調節蛋白CD55及CD59。在正常情況下,這些補體調節蛋白阻礙MAC形成於細胞表面上,因而防止紅血球細胞溶解。GPI錨定蛋白的缺失導致PNH中的補體調節溶血反應。
PNH的特徵為溶血性貧血(紅血球細胞數量減少)、血紅素尿症(血紅蛋白出現於尿中,睡眠後特別明顯)以及血紅素血症(血紅蛋白出現於血液中)。患有PNH的個體已知具有陣發,其在本文定義為黑尿的發生率。溶血性貧血歸因於補體成分對紅血球細胞的血管內破壞。其它已知的症狀包括吞咽困難、疲勞、***功能障礙、血栓形成及復發性腹痛。
Eculizumab為針對對抗補體蛋白C5之人類單株抗體,且為第一個批准可用於陣發性夜間血紅素尿症(PNH)及非典型性溶血性***候群(aHUS)的治療之療法(請參照,例如Dmytrijuk等人,The Oncologist
13(9):993-1000 (2008))。Eculizumab抑制C5轉化酶將C5切割成C5a及C5b,其防止末端補體複合物C5b-9的產生。C5a及C5b-9均導致末端補體調節現象,其為PNH及aHUS的特徵(請亦參照WO 2005/074607、WO 2007/106585、WO 2008/069889以及WO 2010/054403)。
許多報導已描述抗C5抗體,例如WO 95/29697描述抗C5抗體其結合至C5的α鏈但不結合至C5a,且阻止C5的活化。而WO 2002/30985描述一種抗C5單株抗體,其抑制C5a的形成。另一方面,WO 2004/007553描述一種抗C5抗體,其辨識C5轉化酶之蛋白水解位置於C5的α鏈上,且抑制C5轉化為C5a及C5b。WO 2010/015608描述一種抗C5抗體,其具有至少為1 x107
M-1
的親和常數。
抗體(IgGs)結合至新生Fc受體(FcRn),且具有長的血漿滯留時間(retention time)。IgGs結合至FcRn通常是在酸性環境(例如pH6.0)下觀測,且很少在中性環境(例如pH7.4)下觀測。一般而言,IgGs非特定地藉由胞吞作用(endocytosis)併入細胞中,且藉由在胞內體的酸性環境下結合至胞內的(endosomal)FcRn返回細胞表面。接著,IgGs在血漿的中性環境下自FcRn解離。未結合至FcRn的IgGs在溶酶體中被分解。當IgG在酸性環境下的FcRn結合能力藉由導入突變於其Fc區中而消除時,IgG將不會自胞內體再循環至血漿中,導致IgG的血漿滯留顯著受損。為了改善IgGs的血漿滯留,一種增加其在酸性環境下與FcRn的結合之方法已被報導,當IgG在酸性環境下的FcRn結合能力藉由導入一胺基酸取代至其Fc區中而提升時,IgG較有效率地自胞內體再循環至血漿,因而顯示改善的血漿滯留。其間,亦有報導指出在中性環境下具有提升之FcRn結合的IgG,在中性環境血漿中不會自FcRn解離,甚至當它藉由在酸性環境下結合至FcRn而返回細胞表面時,因此它的血漿滯留維持不變,或應該說是較差(請參照,例如Yeung等人,J Immunol.
182(12): 7663-7671 (2009);Datta-Mannan等人,J Biol. Chem.
282(3):1709-1717 (2007);Dall'Acqua等人,J. Immunol.
169(9):5171-5180 (2002))。
近來,以pH依賴性方式結合至抗原的抗體已被報導(請參照,例如WO 2009/125825及WO 2011/122011)。這些抗體在血漿中性環境下強烈地結合至抗原,以及在胞內的酸性環境下自抗原解離。在自抗原解離後,當藉由FcRn再循環至血漿時,抗體變得可再次與抗原結合,因此,單一個抗體分子可重複地結合至多個抗原分子。一般而言,抗原的血漿滯留較具有上述FcRn調節的再循環機制之抗體短得多,因此,當抗原結合至抗體時,抗原通常顯示延長的血漿滯留,導致抗原的血漿濃度的增加。另一方面,已有報導顯示上述抗體,其以pH依賴性方式結合至抗原,比起典型抗體,可較快速地自血漿消除抗原,因為在FcRn調節的再循環步驟中,它們在胞內體內自抗原解離。WO 2011/111007亦描述電腦模擬分析顯示具有針對抗C5之pH依賴性結合的抗體可延長抗原消減 (knockdown)。
本發明提供抗C5抗體及其使用方法。
在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體結合至C5的β鏈中的抗原決定基(epitope)。在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體結合至C5的β鏈的MG1-MG2域(domian)中的抗原決定基。在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體結合至C5的β鏈(序列辨識號:40)的胺基酸33-124所組成的片段中的抗原決定基。在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體結合至C5的β鏈(序列辨識號:40)中的抗原決定基,其包括至少一擇自於胺基酸47-57、70-76及107-110所組成之群組的片段。在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體結合至C5的β鏈(序列辨識號:40)的片段中的抗原決定基,其包括至少一擇自於序列辨識號:40的Glu48、Asp51、His70、His72、Lys109及His110所組成之群組的胺基酸殘基。在又一些實施例中,相較於酸性pH,抗體在中性pH以較高親和性結合至C5。在又一些實施例中,相較於在pH5.8,抗體在pH7.4以較高親和性結合至C5。在另一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體結合至與表2所述之抗體相同的抗原決定基。在另一些實施例中,相較於在pH5.8,抗體在pH7.4以較高親和性結合至與表2所述之抗體相同的抗原決定基。在又一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體結合至與表7或8所述之抗體相同的抗原決定基。在又一些實施例中,相較於在pH5.8,抗體在pH7.4以較高親和性結合至與表7或8所述之抗體相同的抗原決定基。
在特定的實施例中,本發明之抗C5抗體與包括擇自於(a) 序列辨識號:1之VH及序列辨識號:11之VL;(b) 序列辨識號: 5之VH及序列辨識號:15之VL;(c) 序列辨識號:4 之VH及序列辨識號:14之VL;(d) 序列辨識號: 6之VH及序列辨識號: 16之VL;(e) 序列辨識號:2之VH及序列辨識號:12之VL;(f) 序列辨識號: 3之VH及序列辨識號: 13之VL;(g) 序列辨識號:9之VH及序列辨識號:19之VL;(h) 序列辨識號:7之VH及序列辨識號: 17之VL;(i) 序列辨識號:8之VH及序列辨識號:18之VL;以及(j) 序列辨識號:10之VH及序列辨識號:20之VL的VH及VL對的抗體爭取和C5結合。在又一些實施例中,相較於酸性pH,抗C5抗體在中性pH以較高親和性結合至C5。在又一些實施例中,相較於在pH5.8,抗C5抗體在pH7.4以較高親和性結合至C5。
在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體具有擇自於下列所組成之群組的特徵:(a)抗體接觸C5(序列辨識號:39)的胺基酸D51及K109;(b) 抗體對C5(序列辨識號:39)的親和性大於抗體對由序列辨識號:39之E48A取代所構成的C5突變體的親和性;或(c)抗體在pH7.4結合至由序列辨識號:39的胺基酸序列所組成之C5蛋白,但在pH7.4未結合至由具有H72Y取代之序列辨識號:39的胺基酸序列所組成的C5蛋白。在又一些實施例中,相較於酸性pH,抗體在中性pH以較高親和性結合至C5。在又一些實施例中,相較於在pH5.8,抗體在pH7.4以較高親和性結合至C5。
在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體抑制C5的活化。在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體抑制C5變異體R885H的活化。在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體為單株抗體。在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體為人類、人源化(humanized)或嵌合(chimeric)抗體。在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體為結合至C5的抗體片段。在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體為全長IgG1或IgG4抗體。
在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體包括(a) HVR-H3,包括胺基酸序列DX1
GYX2
X3
PTHAMX4
X5
,其中X1
為G或A,X2
為V、Q或D,X3
為T或Y,X4
為Y或H,X5
為L或Y (序列辨識號: 128);(b) HVR-L3,包括胺基酸序列QX1
TX2
VGSSYGNX3
,其中X1
為S、C、N或T,X2
為F或K,X3
為A、T或H (序列辨識號: 131);以及(c) HVR-H2,包括胺基酸序列X1
IX2
TGSGAX3
YX4
AX5
WX6
KG,其中X1
為C、A或G,X2
為Y或F,X3
為T、D或E,X4
為Y、K或Q,X5
為S、D或E,X6
為A或V (序列辨識號: 127)。
在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體包括(a)HVR-H1,包括胺基酸序列SSYYX1
X2
,其中X1
為M或V,X2
為C或A (序列辨識號: 126);(b)HVR-H2,包括胺基酸序列X1
IX2
TGSGAX3
YX4
AX5
WX6
KG,其中X1
為C、A或G,X2
為Y或F,X3
為T、D或E,X4
為Y、K或Q,X5
為S、D或E,X6
為A或V (序列辨識號: 127);以及(c)HVR-H3,包括胺基酸序列DX1
GYX2
X3
PTHAMX4
X5
,其中X1
為G或A,X2
為V、Q或D,X3
為T或Y,X4
為Y或H,X5
為L或Y (序列辨識號: 128)。 在又一些實施例中,抗體包括(a)HVR-L1,包括胺基酸序列X1
ASQX2
IX3
SX4
LA,其中X1
為Q或R,X2
為N、Q或G,X3
為G或S,X4
為D、K或S (序列辨識號: 129);(b)HVR-L2,包括胺基酸序列GASX1
X2
X3
S,其中X1
為K、E或T,X2
為L或T,X3
為A、H、E或Q (序列辨識號: 130);以及(c)HVR-L3,包括胺基酸序列QX1
TX2
VGSSYGNX3
,其中X1
為S、C、N或T,X2
為F或K,X3
為A、T或H (序列辨識號: 131)。
在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體包括(a)HVR-L1,包括胺基酸序列X1
ASQX2
IX3
SX4
LA,其中X1
為Q或R,X2
為N、Q或G,X3
為G或S,X4
為D、K或S (序列辨識號: 129);(b) HVR-L2,包括胺基酸序列GASX1
X2
X3
S,其中X1
為K、E或T,X2
為L或T,X3
為A、H、E或Q (序列辨識號: 130);以及(c)HVR-L3,包括胺基酸序列QX1
TX2
VGSSYGNX3
,其中X1
為S、C、N或T,X2
為F或K, X3
為A、T或H (序列辨識號: 131)。
在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體包括重鏈可變域框架FR1,包括序列辨識號: 132至134其中任一之胺基酸序列;FR2包括序列辨識號: 135至136其中任一之胺基酸序列;FR3包括序列辨識號: 137至139其中任一之胺基酸序列;以及FR4包括序列辨識號: 140至141其中任一之胺基酸序列。在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體包括輕鏈可變域框架FR1,包括序列辨識號: 142至143其中任一之胺基酸序列;FR2包括序列辨識號: 144至145其中任一之胺基酸序列;FR3包括序列辨識號: 146至147其中任一之胺基酸序列;以及FR4包括序列辨識號: 148之胺基酸序列。
在一些實施例中,本發明之分離的抗C5抗體包括(a)VH序列,其與序列辨識號: 10、106至110其中任一之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性;(b)VL序列,其與序列辨識號: 20、111至113其中任一之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性;或(c)如(a)所述之VH序列以及如(b)所述之VL序列。在又一些實施例中,抗體包括序列辨識號: 10、106至110其中任一之VH序列。在又一些實施例中,抗體包括序列辨識號: 20、111至113其中任一之VL序列。
本發明提供一抗體,包括序列辨識號: 10、106至110其中任一之VH序列以及序列辨識號: 20、111至113其中任一之VL序列。
本發明亦提供編碼本發明之抗C5抗體之分離的核酸。本發明亦提供包括本發明之核酸的宿主細胞。本發明亦提供抗體之製造方法,包括培養本發明之宿主細胞使得抗體被製造。
本發明更提供一抗C5抗體之製造方法。在一些實施例中,方法包括使動物對多肽免疫,上述多肽包括C5的β鏈的MG1-MG2域(序列辨識號:43)。在一些實施例中,方法包括使動物對多肽免疫,上述多肽包括對應於C5的β鏈(序列辨識號:40)的位置33至124之胺基酸的區域。在一些實施例中,方法包括使動物對多肽免疫,上述多肽包括至少一擇自於C5的β鏈(序列辨識號:40)的胺基酸47至57、70至76及107至110的片段。在一些實施例中,方法包括使動物對多肽免疫,上述多肽包括C5的β鏈(序列辨識號:40)的片段,其包括至少一擇自於Glu48、Asp51、His70、His72、Lys109以及His110之胺基酸。
本發明亦提供一醫藥配方,包括本發明之抗C5抗體以及醫藥上可接受之載體。
在本文所述或引用之技術或步驟通常為所屬領域之技術人員熟知且常使用的傳統方法,例如,舉例而言,如Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編輯(2003));the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames及G.R. Taylor編輯(1995)), Harlow 及Lane編輯(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987));Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984);Methods in Molecular Biology, Humana Press;Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press;Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987);Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press;Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths及D.G. Newell編輯, 1993-8) J. Wiley及Sons;Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir及C.C. Blackwell編輯);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及M.P. Calos編輯, 1987);PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編輯, 1994);Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan等人編輯, 1991);Short Protocols in Molecular Biology (Wiley及Sons, 1999);Immunobiology (C.A. Janeway及P. Travers, 1997);Antibodies (P. Finch, 1997);Antibodies: A Practical Approach (D. Catty.編輯, IRL Press, 1988-1989);Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd及C. Dean編輯, Oxford University Press, 2000);Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);The Antibodies (M. Zanetti及J. D. Capra編輯, Harwood Academic Publishers, 1995);以及Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita等人編輯, J.B. Lippincott Company, 1993)中所述被廣泛利用的方法。
Ⅰ. 定義
除非另有定義,在本文所使用的技術和科學術語具有之意義與本發明所屬領域之技術人員通常理解的相同。Singleton 等人, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons(New York, N.Y. 1994)以及March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)提供本領域之技術人員對於本申請所使用的許多術語之概括性指導。在本文所引用之文獻,包含專利申請及出版物,均以參考方式完整併入本文。
為了解釋本說明書,將使用以下定義,並且只要適當,以單數形式使用的術語也可以包含複數,且反之亦然。應理解的是,在本文所使用的術語僅是為了描述具體的實施例,並未有限制的意圖。在以下所述的任何定義與以參考方式併入本文中的任何文獻衝突的情況下,將以下述之定義為准。
用於本文目的之“受體人類框架”是包含衍生自下文定義的人類免疫球蛋白框架或人類共有框架的輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架的胺基酸序列之框架。“衍生自”人類免疫球蛋白框架或人類共有框架的受體人類框架可包括其相同的胺基酸序列,或者它可包含胺基酸序列改變。在一些實施例中,胺基酸改變的數目是10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少、或2個或更少。在一些實施例中,VL受體人類框架在序列上與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列相同。
“親和性”指分子(例如,抗體)的單一結合部位與其結合配偶體(例如,抗原)之間非共價相互作用的總計強度。除非另有說明,在本文所使用的“結合親和性”指內在的結合親和性,其反映結合對(例如,抗體及抗原)的成員之間的1:1相互作用。分子X對其配偶體Y的親和性一般可藉由解離常數(dissociation constant, Kd)來表示。親和性可藉由本領域公知的方法來測量,包含本文中描述的那些。用於測量結合親和性之具體說明及示例性的實施例將於下文中描述。
“親和性成熟”抗體指與不具有這類改變的親本抗體(parent antibody)相比,在一個或多個高變異區(hypervariable region, HVR)中具有一個或多個改變的抗體,這類改變導致抗體對抗原的親和性的改善。
術語“抗C5抗體”及“結合至C5的抗體"指一抗體,其能夠以足夠的親和性結合C5使得抗體可以在標靶C5中用作為診斷及/或治療劑。在一實施例中,例如藉由放射免疫測定(RIA)測量,抗C5抗體與不相關的非C5蛋白結合的程度小於該抗體與C5的結合的約10%。在特定實施例中,結合至C5的抗體具有≤1μM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM、或≤0.001 nM (例如10-8
M或更小、例如由10-8
M至10-13
M、例如由10-9
M至10-13
M)之解離常數(Kd)。在特定實施例中,抗C5抗體結合至C5的抗原決定基,其與來自不同物種的C5之間為保守的(conserved)。
術語“抗體”在本文中以最廣泛的含義使用並涵蓋多種抗體結構,包含但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如,雙特異性抗體)及抗體片段,只要它們展現所希望的抗原結合活性。
“抗體片段”指除完整抗體以外之包括完整抗體的部分的分子,其結合該完整抗體所結合的抗原。抗體片段的實例包含但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2
;雙抗體(diabody);線性抗體;單鏈抗體分子(例如,scFv);以及從抗體片段形成之多特異性抗體。
“結合相同抗原決定基的抗體”作為參考抗體是指在競爭測定(competition assay)中,將參考抗體與其抗原的結合阻斷之抗體,及/或相反地,參考抗體在競爭測定中將抗體與其抗原的結合阻斷。本文提供示例性競爭測定。
術語“嵌合(chimeric)”抗體指一抗體其中部分的重鏈及/或輕鏈來自特定來源或物種,而重鏈及/或輕鏈的其餘部分則來自不同的來源或物種。
抗體的“種類”指其重鏈所具有的恆定域(constant domain)或恆定區(constant region)的類型。存在五個主要種類的抗體:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,這些種類中的數種可進一步劃分為亞型(subgroup)(同型(isotype)),例如,IgG1
、IgG2
、IgG3
、IgG4
、IgA1
及IgA2
。對應於不同種類的免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
本文所使用的術語“細胞毒劑(cytotoxic agent)”指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒劑包含但不限於放射性同位素(例如,At211
、I131
、I125
、Y90
、Re186
、Re188
、Sm153
、Bi212
、P32
、Pb212
以及Lu的放射性同位素);化療劑或藥物(例如,甲氨喋呤、阿黴素(adriamicin)、長春花屬生物鹼(長春新生物鹼(vincristine)、長春花生物鹼(vinblastine)、依妥普賽(etoposide))、艾黴素(doxorubicin)、氮芥***酸(melphalan)、絲裂黴素C、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑);生長抑制劑;酶及其片段,例如核溶解酶;抗生素;毒素,例如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素,包含其片段及/或變異體;及下文揭露的多種抗腫瘤或抗癌劑。
“效應物功能”指可歸因於抗體的Fc區的那些生物活性,其隨抗體同型(isotype)而不同。抗體效應物功能的例子包含:Clq結合及補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity, CDC);Fc受體結合;抗體依賴性細胞調節細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體)的負調控;及B細胞活化。
試劑,例如醫藥配方,的“有效量”指在劑量及所需的時間內,可有效達成希望的治療或預防結果的量。
術語“抗原決定基”包含能夠被抗體結合之任何決定位(determinant)。抗原決定基是被標靶該抗原之抗體結合的抗原的區域,且包含特定的胺基酸,其直接接觸抗體。抗原決定基決定位可包含分子(例如胺基酸、醣支鏈、磷酸基或磺醯基)的化學活性表面群集,且可具有特定的三維結構特性,及/或特定電荷特性。一般而言,對特定目標抗原具有特異性的抗體在蛋白及/或巨分子的複合混合物中將優先地辨識目標抗原上的抗原決定基。
本文的術語“Fc區”是用來定義免疫球蛋白重鏈的C末端區域,其包含至少一部分的恆定區。此術語包含天然序列Fc區和變異體Fc區。在一實施例中,人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈的羧基末端。然而,Fe區的C末端賴胺酸(Lys447)可存在或不存在。除非本文另有說明,Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號是按照EU編號系統,亦稱為EU指數,如Kabat 等人,Sequences of Proteins of Immunological Intere
st 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。
“框架”或“FR”指高變異區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域的FR一般由四個FR域所組成:FRl、FR2、FR3及FR4。因此,HVR和FR序列一般按以下順序出現在VH(或VL)中:FRl-Hl(LI)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語“全長抗體”、“完整抗體”及“全抗體”在本文中可互換使用,指具有實質上(substantially)相似於天然抗體結構的結構或具有包含本文定義之Fc區的重鏈的抗體。
術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和"宿主細胞培養物"可互換使用,指已將外源核酸引入其中的細胞,包含這類細胞的子代。宿主細胞包含“轉化體”及“轉化細胞”,其包含最初轉化的細胞及從其衍生的子代,並不考慮傳代數。子代的核酸含量可以不與親本細胞完全相同,而可包含突變。本文包含具有與在最初轉化的細胞中篩選或選擇之相同功能或生物活性之突變體後代。
“人類抗體”是具有對應於由人類或人類細胞產生的抗體或衍生自非人類來源的胺基酸序列者,上述非人類來源的胺基酸序列利用人類抗體庫或其它人類抗體編碼序列。人類抗體的此定義具體排除了包括非人類抗原結合殘基的人源化抗體。
“人類共有框架”是代表人類免疫球蛋白VL或VH框架序列的選擇中最常出現之胺基酸殘基的框架。一般而言,人類免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來自可變域序列的亞型。通常,序列的亞型是Kabat 等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest
, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3中的亞型。在一實施例中,對於VL,亞型是如Kabat 等人, supra
中的亞型kappa I。在一實施例中,對於VH,亞型是如Kabat 等人, supra
.中的亞型III。
“人源化(humanized)”抗體指包括來自非人類HVR的胺基酸殘基以及來自人類FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在特定實施例中,人源化抗體將包括實質上全部之至少一個且通常為兩個的可變域,其中全部或實質上全部之HVR (例如,CDRs)對應於非人類抗體的那些,而全部或實質上全部之FR對應於人類抗體的那些。人源化抗體可選擇地包括源自人類抗體的抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)的"人源化形式"指已進行人源化之抗體。
本文所用的術語“高變異區”或“HVR”指抗體可變域在序列上高變異(“互補決定區”或“CDR”)、及/或形成結構上定義的環(“高變異環”)、及/或包含抗原接觸殘基(“抗原接觸”)的每一區域。一般而言,抗體包括六個HVR:三個在VH中(H1、H2、H3),三個在VL中(L1、L2、L3)。本文中示例性HVR包含:(a) 出現於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(Hl)、53-55(H2)以及96-101(H3) (Chothia,J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987))的高變異環;(b) 出現於胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)以及95-102(H3) (Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest
, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991))的CDR;(c) 出現於胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)以及93-101(H3) (MacCallum等人,J. Mol. Biol.
262:732-745 (1996))的抗原接觸;以及(d) (a)、(b)及/或(c)之組合,包含HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)以及94-102(H3)。
除非另有說明,本文中HVR殘基及在可變域中的其它殘基(例如,FR殘基)依照Kabat等人,supra
編號。
“免疫偶聯物”是與一或多種異源(heterogeneous)分子(包含但不限於細胞毒劑)偶聯的抗體。
“個體(individual)”或“對象(subject)”是哺乳動物。哺乳動物包含但不限於飼養的動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類(例如人類及非人類靈長類,如猴)、兔及齧齒類(例如小鼠和大鼠)。在特定實施例中,個體或對象為人類。
“分離的”抗體是已從其天然環境的成分分離的抗體。在一些實施例中,抗體被純化至大於95%或99%的純度,其藉由例如,電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或反相HPLC)方法進行測定。評估抗體純度的方法的綜述可參照,例如,Flatman等人,J. Chromatogr. B
848:79-87 (2007)。
“分離的”核酸指已從其天然環境的成分分離的核酸分子。分離的核酸包括包含在通常含有該核酸分子的細胞中的核酸分子,但該核酸分子存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置的染色體位置上。
“編碼抗C5抗體的分離的核酸”指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)的一或多個核酸分子,包含於單一載體或分開的載體中的此種核酸分子,以及存在於宿主細胞中的一或多個位置的此種核酸分子。
本文所用的術語“單株抗體”指獲得自實質上同源的(homogeneous)抗體族群的抗體,即,包括相同的族群及/或結合至相同抗原決定基的單獨抗體,除了例如:包含天然存在的突變或在產生單株抗體製備期間出現之可能的變異體抗體(這類變異體通常以較小量存在)以外。不同於通常包含針對不同決定位(抗原決定基)的不同抗體之多株抗體的製備,單株抗體製備的每一單株抗體是針對抗原上的單一決定位。因此,修飾詞“單株”指獲取自實質上同源的抗體族群的抗體特徵,而不解釋為需要藉由任何具體方法以生產抗體。例如,將根據本發明被使用的單株抗體可藉由多種技術加以製備,其包含但不限於融合瘤技術、重組DNA法、噬菌體展示法以及利用含有全部或部分人類免疫球蛋白基因座(loci)的轉殖基因動物的方法,這類方法及其它用以製造單株抗體的示例性方法將於文中描述。
“裸抗體”指未與異源部分(例如細胞毒性部分)或放射標記偶聯的抗體。裸抗體可存在於醫藥配方中。
“天然抗體”指具有不同結構之天然存在的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG抗體為約150,000道爾頓(dalton)的異源四聚體醣蛋白,由雙硫鍵結的兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈所組成。從N至C末端,每一重鏈具有可變區(VH),也稱為可變重鏈域或重鏈可變域,隨後是三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。相似地,從N至C末端,每一輕鏈具有可變區(VL),也稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域,隨後是恆定輕鏈(CL)域。根據其恆定域的胺基酸序列,抗體的輕鏈可歸類於兩種類型之一,稱為κ及λ。
術語“藥品仿單(package insert)”用來指通常包含在治療產品的商業包裝中的說明,其包含關於適應症、用法、劑量、施用、結合療法、禁忌症的資訊及/或有關這類治療產品的使用之警告。
相對於參考多肽序列的“百分比(%)胺基酸序列相同性”定義為在比對序列及在必要時引入缺口(gap)以達到最大的百分比序列相同性之後,且不將任何保守取代視為序列相同性的部分的情況下,候選序列中與參考多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。可以以本技術領域之內的各種方式以達到以測定百分比胺基酸序列相同性為目的之比對,例如,使用公開可取得的電腦軟體,如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域之技術人員可以決定用於比對序列的適當參數,包含在所比較的序列的全長內達到最大比對所需的任一演算法。然而,就本文的目的,%胺基酸序列相同性值是利用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.編寫,且原始程式碼已隨用戶文件提交美國版權辦公室,Washington D.C., 20559,它在美國版權辦公室註冊在美國版權註冊號TXU510087之下。ALIGN-2程式可公開取得於Genentech, Inc., South San Francisco, California,或者可從原始程式碼編譯。ALIGN-2程式應編譯用在UNIX作業系統上,包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變動。
在利用ALIGN-2以進行胺基酸序列比較的情況下,給定的胺基酸序列A比上、以及或相對給定的胺基酸序列B的%胺基酸序列相同性(或者其可表達為給定的胺基酸序列A,其具有或包括特定%胺基酸序列相同性比上、以及或相對給定的胺基酸序列B)以下列計算:100乘以分數X/Y,其中X是在該程式的A及B比對中藉由序列比對程式ALIGN-2評分為相同匹配(match)的胺基酸殘基數目,以及其中Y是B中的胺基酸殘基的總數。應理解的是,在胺基酸序列A的長度不等於胺基酸序列B的長度時,A比上B的%胺基酸序列相同性將不等於B比上A的%胺基酸序列相同性。除非明確地另有說明,本文中使用的所有%胺基酸序列相同性值均是如前面段落中所述利用ALIGN-2電腦程式所得。
術語“醫藥配方”指一製備物,其處於允許包含在其中的活性成分的生物活性有效的此種形式,且其不包含對將要施用該配方的對象具有不可接受的毒性之附加成分。
“醫藥上可接受之載體”指醫藥配方中除了活性成分以外的一成分,其對對象無毒性。醫藥上可接受之載體包含但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
本文所用的術語“C5” 涵蓋來自任一脊椎動物源的任一天然C5,包含哺乳動物,例如靈長類(例如,人類及猴)以及齧齒類(例如,小鼠和大鼠)。除非另有說明,術語“C5”是指具有序列辨識號:39所示之胺基酸序列以及包含序列辨識號:40所示之β鏈序列的人類C5蛋白。此術語涵蓋“全長”未經處理的C5以及由細胞內加工產生的任一形式之C5。此術語亦涵蓋C5之天然存在的變異體,例如,剪接(splice)變異體或等位基因(allelic)變異體。示例性人類C5的胺基酸序列如序列辨識號:39(“野生型”或“WT”C5)所示。示例性人類C5的β鏈的胺基酸序列如序列辨識號:40所示。示例性人類C5的β鏈的MG-1、MG-2及MG1-MG2域的胺基酸序列分別如序列辨識號:41、42及43所示。示例性恆河猴及鼠類C5的胺基酸序列分別如序列辨識號:44及105所示。序列辨識號:39、40、43、44及105的胺基酸殘基1至19對應於訊息序列,其在細胞內加工中被移除因此未出現於對應之示例性胺基酸序列中。
本文所使用的“處理”(及其語法的變形)指試圖改變受處理的個體的自然病程之臨床干預,且可以為了預防而進行或在臨床病理的過程中進行。希望得到的處理作用包含但不限於防止疾病的發生或復發、減輕症狀、減少疾病的任一直接或間接的病理結果、防止轉移、降低疾病進展的速率、改善或緩和疾病狀態以及緩減或改善的預後。在一些實施例中,本發明的抗體用以延遲疾病的發展或減慢疾病的進展。
術語“可變區”或“可變域”指涉及結合抗體至抗原的抗體重鏈或輕鏈的域。天然抗體的重鏈及輕鏈的可變域(分別為VH和VL)通常具有相似的結構,每一域包括四個保守的框架區(FR)及三個高變異區(HVR)(請參照,例如Kindt等人,Kuby Immunology
, 6th
ed., W.H. Freeman and Co.,第91頁(2007))。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合的特異性。此外,結合至特定抗原的抗體,可使用來自結合該抗原之抗體的VH或VL域以分別篩選互補的VL或VH域資料庫加以分離。請參照,例如Portolano等人,J. Immunol.
150:880-887 (1993);Clarkson 等人,Nature
352:624-628 (1991)。
本文使用的術語“載體”指一核酸分子,其能夠繁殖與它連接的另一核酸。此術語包含作為自主複製核酸結構的載體,以及併入它已引入的宿主細胞之基因組中的載體。特定載體能夠指示與它們有效連接的核酸之表現。這類載體在本文中稱為“表現載體”。
II. 組成及方法
在一態樣中,發明是,部分地,以抗C5抗體及其使用為基礎。在特定實施例中,提供結合至C5的抗體。本發明的抗體有益於,例如,疾病的診斷及處理。
A. 示例性抗C5抗體
在一態樣中,發明提供結合至C5之分離的抗體。在特定實施中,本發明的抗C5抗體結合至C5的β鏈內的抗原決定基。在特定實施中,抗C5抗體結合至C5的β鏈的MG1-MG2域內的抗原決定基。在特定實施中,抗C5抗體結合至由C5的β鏈的胺基酸19至180所組成的片段內的抗原決定基。在特定實施中,抗C5抗體結合至C5的β鏈的MG1域(序列辨識號:40(序列辨識號:41)的胺基酸20至124)內的抗原決定基。在特定實施中,抗C5抗體結合至由C5(序列辨識號:40)的β鏈的胺基酸33至124所組成的片段內的抗原決定基。在另一實施例中,抗C5抗體未結合至較由C5的β鏈的胺基酸33至124所組成的片段短之片段,例如,由C5(序列辨識號:40)的β鏈的胺基酸45至124、52至124、33至111、33至108或45至111所組成的片段。
在另一態樣中,發明提供顯示pH依賴性結合特性之抗C5抗體。如本文所使用,措詞“pH依賴性”是指抗體顯示“相較於在中性pH,在酸性pH與C5之結合降低”(就本揭露之目的,兩種用辭均可互換使用)。例如,“具有pH依賴性結合特性”的抗體包含相較於在酸性pH,在中性pH以較高親和性結合至C5的抗體。在特定實施例中,相較於在酸性pH,本發明的抗體在中性pH以至少2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之親和性結合至C5。在一些實施例中,相較於在pH5.8,抗體在pH7.4以較高親和性結合至C5。在又一些實施例中,相較於在pH5.8,本發明之抗體在pH7.4以至少2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之親和性結合至C5。
抗體對C5的“親和性”,就本揭露之目的,是以抗體的KD之術語表示。抗體的KD是指抗體-抗原相互作用的平衡解離常數。一抗原結合至其抗原的KD值越大,其對那特定抗原的結合親和性越弱。因此,如文中所用,“相較於酸性pH,在中性pH具較高親和性”(或等同表述“pH依賴性結合”)是指抗體在酸性pH下結合至C5的KD大於抗體在中性pH下結合至C5的KD。例如,在本發明的內容中,若抗體在酸性pH下結合至C5的KD至少大於抗體在中性pH下結合至C5的KD之兩倍,抗體被視為相較於酸性pH,在中性pH以較高親和性結合至C5。因此,本發明包含在酸性pH結合至C5的KD至少大於抗體在中性pH結合至C5的KD之2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之抗體。在另一實施例中,抗體在中性pH的KD值可為10-7
M、10-8
M、10-9
M、10-10
M、10-11
M、10-12
M或更小。在另一實施例中,抗體在酸性pH的KD值可為10-9
M、10-8
M、10-7
M、10-6
M或更大。
在又一些實施例中,若抗體在pH5.8下結合至C5的KD至少大於抗體在pH7.4下結合至C5的KD之兩倍,抗體被視為相較於酸性pH,在中性pH以較高親和性結合至C5。在一些實施例中,提供之抗體在pH5.8結合至C5的KD至少大於抗體在pH7.4結合至C5的KD之3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍。在另一實施例中,抗體在pH7.4的KD值可為10-7
M、10-8
M、10-9
M、10-10
M、10-11
M、10-12
M或更小。在另一實施例中,抗體在pH5.8的KD值可為10-9
M、10-8
M、10-7
M、10-6
M或更大。
抗體對於特定抗原之結合特性亦可藉由抗體的kd來表示。抗體的kd指抗體對於特定抗原之解離速率常數,以秒的倒數表示(即sec-1
)。kd值增加表示抗體對其抗原之結合較弱。本發明因此包含,相較於中性pH,在酸性pH以較高kd值與C5結合的抗體。本發明包含在酸性pH結合至C5的kd至少大於在中性pH結合至C5的kd之2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之抗體。在另一實施例中,抗體的kd值在中性pH可為10-2
1/s、10-3
1/s、10-4
1/s、10-5
1/s、10-6
1/s或更小。在另一實施例中,抗體的kd值在酸性pH可為10-3
1/s、10-2
1/s、10-1
1/s或更大。本發明亦包含相較於在pH7.4,在pH5.8以較大kd值結合至C5的抗體。本發明包含在pH5.8結合至C5的kd至少大於在pH7.4結合至C5的kd之3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之抗體。在另一實施例中,抗體在pH7.4的kd值可為10-2
1/s、10-3
1/s、10-4
1/s、10-5
1/s、10-6
1/s或更小。在另一實施例中,抗體在pH5.8的kd值可為10-3
1/s、10-2
1/s、10-1
1/s或更大。
在特定實施中,“相較於在中性pH,在酸性pH與C5之結合降低”以在酸性pH抗體結合至C5之KD值比上在中性pH抗體結合至C5之KD值的比值來表示(或反之亦然)。例如,就本發明之目的,若抗體具有2或更大的酸性/中性KD比值,則該抗體可被視為“相較於在中性pH,在酸性pH與C5之結合降低”。在一些特定示例性實施例中,本發明之抗體的pH5.8/pH7.4 KD比值可為2或更大。在一些特定示例性實施例中,本發明之抗體的酸性/中性KD比值可為2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更大。在另一實施例中,抗體在中性pH的KD值可為10-7
M、10-8
M、10-9
M、10-10
M、10-11
M、10-12
M或更小。在另一實施例中,抗體在酸性pH的KD值可為10-9
M、10-8
M、10-7
M、10-6
M或更大。在進一步的例子中,就本發明之目的,若抗體的pH5.8/pH7.4 KD比值為2或更大,則抗體可被視為“相較於在中性pH,在酸性pH與C5之結合降低”。在一些特定示例性實施例中,本發明之抗體的pH5.8/pH7.4 KD比值可為3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更大。在另一實施例中,抗體在pH7.4的KD值可為10-7
M、10-8
M、10-9
M、10-10
M、10-11
M、10-12
M或更小。在另一實施例中,抗體在pH5.8的KD值可為10-9
M、10-8
M、10-7
M、10-6
M或更大。
在特定例子中,“相較於在中性pH,在酸性pH與C5之結合降低”以在酸性pH抗體結合至C5之kd值比上在中性pH抗體結合至C5之kd值的比值來表示(或反之亦然)。例如,就本發明之目的,若抗體具有2或更大的酸性/中性kd比值,則該抗體可被視為“相較於在中性pH,在酸性pH與C5之結合降低”。在一些特定示例性實施例中,本發明之抗體的pH5.8/pH7.4 kd比值可為2或更大。在一些特定示例性實施例中,本發明之抗體的酸性/中性kd比值可為2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更大。在又一些實施例中,抗體的pH5.8/pH7.4 kd比值可為2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更大。在另一實施例中,抗體在中性pH的kd值可為10-2
1/s、10-3
1/s、10-4
1/s、10-5
1/s、10-6
1/s或更小。在又一實施例中,抗體在pH7.4的kd值可為10-2
1/s、10-3
1/s、10-4
1/s、10-5
1/s、10-6
1/s或更小。在另一實施例中,抗體在酸性pH的kd值可為10-3
1/s、10-2
1/s、10-1
1/s或更大。在又一實施例中,抗體在pH5.8的kd值可為10-3
1/s、10-2
1/s、10-1
1/s或更大。
如本文中使用,用詞“酸性pH”是指4.0至6.5的pH。用詞“酸性pH”包含4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4以及6.5中任一之pH值。在特定態樣中,“酸性pH”為5.8。
如本文中使用,用詞“中性pH”是指6.7至約10.0的pH。用詞“中性pH”包含6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9以及10.0中任一之pH值。在特定態樣中,“中性pH”為7.4。
KD值及kd值,如本文中表示,可利用表面電漿共振基礎之生物感知器加以測定,以表徵抗體-抗原的相互作用(請參照,例如,文中的實施例3)。KD值及kd值可於25℃或37℃測定。
在特定實施例中,本發明的抗C5抗體結合至C5的β鏈內的抗原決定基,其由MG1域(序列辨識號:41)所組成。在特定實施例中,本發明的抗C5抗體結合至C5的β鏈(序列辨識號:40)內的抗原決定基,其包括至少一擇自於胺基酸47-57、70-76以及107-110所組成之群組的片段。在特定實施例中,本發明的抗C5抗體結合至C5的β鏈(序列辨識號:40)的片段內的抗原決定基,其包括至少一擇自於Thr47、Glu48、Ala49、Phe50、Asp51、Ala52、Thr53、Lys57、His70、Val71、His72、Ser74、Glu76、Val107,Ser108、Lys109及His110所組成之群組的胺基酸。在特定實施例中,本發明的抗C5抗體結合至C5的β鏈(序列辨識號:40)的片段內的抗原決定基,其包括至少一擇自於Glu48、Asp51、His70、His72、Lys109及His110所組成之群組的胺基酸。在特定實施例中,相較於其對野生型C5的結合,本發明的抗C5抗體對C5突變體的結合降低,其中C5突變體具有至少一胺基酸取代在擇自於Glu48、Asp51、His72及Lys109所組成之群組的位置。在另一實施例中,相較於其對野生型C5的pH依賴性結合,本發明的抗C5抗體對C5突變體的pH依賴性結合降低,其中C5突變體具有至少一胺基酸取代在擇自於His70、His72及His110所組成之群組的位置。在又一實施例中,在C5突變體中,在擇自於Glu48、Asp51及Lys109的位置之胺基酸是被丙胺酸所取代,以及在擇自於His70、His72及His110的位置之胺基酸是被酪胺酸所取代。
在特定實施例中,本發明的抗C5抗體及一抗體競爭與C5結合,此抗體包括擇自於: (a)序列辨識號:1的VH及序列辨識號:11的VL;(b)序列辨識號:22的VH及序列辨識號:26的VL;(c)序列辨識號:21的VH及序列辨識號:25的VL;(d)序列辨識號:5的VH及序列辨識號:15的VL;(e)序列辨識號:4的VH及序列辨識號:14的VL;(f)序列辨識號:6的VH及序列辨識號:16的VL;(g)序列辨識號:2的VH及序列辨識號:12的VL;(h)序列辨識號:3的VH及序列辨識號:13的VL;(i)序列辨識號:9的VH及序列辨識號:19的VL;(j)序列辨識號:7的VH及序列辨識號:17的VL;(k)序列辨識號:8的VH及序列辨識號:18的VL;(l)序列辨識號:23的VH及序列辨識號:27的VL;以及(m)序列辨識號:10的VH及序列辨識號:20的VL的VH及VL對。
在特定實施例中,本發明的抗C5抗體結合C5並接觸序列辨識號:39的胺基酸Asp51(D51)。在又一些實施例中,本發明的抗C5抗體結合C5並接觸序列辨識號:39的胺基酸Lys109(K109)。在又一實施例中,本發明的抗C5抗體結合C5並接觸序列辨識號:39的胺基酸Asp51(D51)以及胺基酸 Lys109 (K109)。
在特定實施例中,相較於其對野生型C5的結合,本發明的抗C5抗體對C5突變體的結合降低,其中C5突變體具有序列辨識號:39的Glu48Ala(E48A)取代。在另一實施例中,相較於其對野生型C5的pH依賴性結合,本發明的抗C5抗體對C5突變體的pH依賴性結合降低,其中C5突變體具有序列辨識號:39的Glu48Ala(E48A)取代。
在又一實施例中,抗C5抗體結合至由序列辨識號:39的胺基酸序列所組成的C5蛋白,但未結合至由帶有H72Y取代之序列辨識號:39的胺基酸序列所組成的C5蛋白;其中C5蛋白以及經H72Y取代之C5蛋白是在相同條件下製備及篩選。在又一實施例中,抗C5抗體在pH7.4結合至由序列辨識號:39的胺基酸序列所組成的C5蛋白,但在pH7.4未結合至由帶有H72Y取代之序列辨識號:39的胺基酸序列所組成的C5蛋白。
不受限於特定的理論,可推測當C5上的一胺基酸殘基被另一胺基酸取代時,抗C5抗體對C5的結合降低(或幾乎消失),其代表C5上的該胺基酸殘基對抗C5抗體及C5之間的相互作用是重要的,以及抗體可辨識在C5上的該胺基酸周圍之抗原決定基。
本發明已發現一群與另一抗體競爭或結合至相同抗原決定基的抗C5抗體可展現pH依賴性結合特性。在胺基酸當中,組胺酸,具有約為6.0至6.5之pKa值,在中性及酸性pH之間可具有不同的質子解離狀態。因此,C5上的組胺酸殘基可助於抗C5抗體及C5之間的pH依賴性相互作用。不受限於特定的理論,可推測抗C5抗體可辨識在C5上的組胺酸殘基周圍的構象結構,其改變取決於pH。這推測可與下述之實驗結果一致:當C5上的組胺酸殘基被另一胺基酸取代時,抗C5抗體的pH依賴性降低(或幾乎消失)(即,在中性pH下,具有pH依賴性結合特性的抗C5抗體以與野生型C5結合之相似的親和性結合至C5的組胺酸突變體,而在酸性pH下,相同的抗體以較結合至野生型C5高的親和性結合至C5的組胺酸突變體)。
在特定實施例中,本發明的抗C5抗體結合至來自多於一個物種之C5。在又一些實施例中,抗C5抗體結合至來自人類及非人類動物之C5。在又一些實施例中,抗C5抗體結合至來自人類及猴(例如,恆河猴(cynomolgus)、恆河獼猴(rhesus macaque)、狨猿(marmoset)、黑猩猩或狒狒。
在一態樣中,本發明提供抑制C5的活化之抗C5抗體。在特定實施例中,提供抗C5抗體,其防止C5裂解以形成C5a及C5b,因此防止與C5a關聯的過敏毒素活性之產生,亦防止與C5b關聯的C5b-9膜攻擊複合物(MAC)之組合。在特定實施例中,提供抗C5抗體,其阻礙C5轉化酶將C5轉化成C5a及C5b。在特定實施例中,提供抗C5抗體,其阻礙C5轉化酶接近C5上的裂解位置。在特定實施例中,提供抗C5抗體,其阻礙由C5的活化所造成之溶血活性。在又一些實施例中,本發明的抗C5抗體藉由經典途徑及/或替代途徑抑制C5的活化。
在一態樣中,本發明提供抗C5抗體,其抑制C5變異體的活化。C5變異體是指C5之基因的變異體,其是由於基因的變異,例如突變、多態性(polymorphism)或等位基因的變異引起。基因的變異可包括一或多個核苷酸的刪除、取代或***。C5 變異體可包括一或多個基因的變異於C5中。在特定實施例中,C5 變異體具有相似於野生型C5的生物活性。此種C5變異體可包括至少一擇自於V145I、R449G、V802I、R885H、R928Q、D966Y、S1310N及E1437D所組成之群組的變異。於此,R885H,例如,是指一基因的變異,其在位置885的精胺酸被組胺酸取代。在特定實施例中,本發明的抗C5抗體抑制野生型C5以及至少一擇自於V145I、R449G、V802I、R885H、R928Q、D966Y、S1310N及E1437D所組成之群組的C5變異體的活化。
在一態樣中,本發明提供抗C5抗體,包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個擇自於(a) 包括序列辨識號:45至54中任一之胺基酸序列的HVR-H1;(b) 包括序列辨識號:55至64中任一之胺基酸序列的HVR-H2;(c) 包括序列辨識號:65至74中任一之胺基酸序列的HVR-H3;(d) 包括序列辨識號:75至84中任一之胺基酸序列的HVR-L1;(e) 包括序列辨識號:85至94中任一之胺基酸序列的HVR-L2;及(f) 包括序列辨識號:95至104中任一之胺基酸序列的HVR-L3的高變異區(HVRs)。
在一態樣中,本發明提供一抗體,包括至少一個、至少兩個、或全部三個擇自於(a) 包括序列辨識號:45至54中任一之胺基酸序列的HVR-H1;(b) 包括序列辨識號:55至64中任一之胺基酸序列的HVR-H2;及(c) 包括序列辨識號:65至74中任一之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列。在一實施例中,抗體包括HVR-H3,其包括序列辨識號:65至74中任一之胺基酸序列。在另一實施例中,抗體包括HVR-H3,其包括序列辨識號:65至74中任一之胺基酸序列、以及HVR-L3,其包括序列辨識號: 95至104中任一之胺基酸序列的。在又一實施例中,抗體包括HVR-H3,其包括序列辨識號:65至74中任一之胺基酸序列、HVR-L3,其包括序列辨識號: 95至104中任一之胺基酸序列、以及HVR-H2,其包括序列辨識號:55至64中任一之胺基酸序列。在又一實施例中,抗體包括(a) 包括序列辨識號:45至54中任一之胺基酸序列的HVR-H1;(b) 包括序列辨識號:55至64中任一之胺基酸序列的HVR-H2;及(c) 包括序列辨識號:65至74中任一之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供一抗體,包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a) 包括序列辨識號:75至84中任一之胺基酸序列的HVR-L1;(b) 包括序列辨識號:85至94中任一之胺基酸序列的HVR-L2;及(c) 包括序列辨識號:95至104中任一之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。在一實施例中,抗體包括(a) 包括序列辨識號:75至84中任一之胺基酸序列的HVR-L1;(b) 包括序列辨識號:85至94中任一之胺基酸序列的HVR-L2;以及(c) 包括序列辨識號:95至104中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中,本發明之抗體包括(a) VH域,其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i) 包括序列辨識號:45至54中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(ii) 包括序列辨識號: 55至64中任一之胺基酸序列HVR-H2、及(iii) 包括序列辨識號: 65至74中任一之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列;以及(b) VL域,其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i) 包括序列辨識號:75至84中任一之胺基酸序列的HVR-L1、(ii) 包括序列辨識號:85至94中任一之胺基酸序列的HVR-L2、及(c) 包括序列辨識號:95至104中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。
在另一態樣中,本發明提供一抗體,包括(a) 包括序列辨識號:45至54中任一之胺基酸序列的HVR-H1;(b) 包括序列辨識號: 55至64中任一之胺基酸序列的HVR-H2;(c) 包括序列辨識號: 65至74中任一之胺基酸序列的HVR-H3;(d) 包括序列辨識號: 75至84中任一之胺基酸序列的HVR-L1;(e) 包括序列辨識號: 85至94中任一之胺基酸序列的HVR-L2;及(f) 包括序列辨識號: 95至104中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中,本發明提供一抗C5抗體包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個擇自於(a) 包括序列辨識號:45、54、117、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1;(b) 包括序列辨識號:55、64、118-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2;(c) 包括序列辨識號:65、74、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3;(d) 包括序列辨識號:75、84、122、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1;(e) 包括序列辨識號:85、94、123-124、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2;及(f) 包括序列辨識號:95、104、125、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3之HVR。
在一態樣中,本發明提供一抗體,包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a) 包括序列辨識號:45、54、117、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1;(b) 包括序列辨識號:55、64、118-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2;及(c) 包括序列辨識號:65、74、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR 序列。在一實施例中,抗體包括HVR-H3,其包括序列辨識號:65、74、121、128中任一之胺基酸序列。在另一實施例中,抗體包括:HVR-H3,其包括序列辨識號:65、74、121、128中任一之胺基酸序列,以及HVR-L3,其包括序列辨識號:95、104、125、131中任一之胺基酸序列。在又一實施例中,抗體包括:HVR-H3,其包括序列辨識號:65、74、121、128中任一之胺基酸序列、HVR-L3,其包括序列辨識號:95、104、125、131中任一之胺基酸序列、以及HVR-H2,其包括序列辨識號:55、64、118-120、127中任一之胺基酸序列。在又一實施例中,抗體包括(a) 包括序列辨識號:45、54、117、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1;(b) 包括序列辨識號:55、64、118-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2;及(c) 包括序列辨識號: 65、74、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一態樣中,本發明提供一抗體包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a) 包括序列辨識號:75、84、122、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1;(b) 包括序列辨識號:85、94、123-124、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2:及(c) 包括序列辨識號:95、104、125、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。在一實施例中,抗體包括(a) 包括序列辨識號:75、84、122、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1;(b) 包括序列辨識號:85、94、123-124、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2;及(c) 包括序列辨識號:95、104、125、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中,本發明之抗體包括(a) VH域,其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i) 包括序列辨識號:45、54、117、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(ii) 包括序列辨識號:55、64、118-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2、及(iii) 包括序列辨識號:65、74、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR 序列;以及(b) VL域,其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i) 包括序列辨識號:75、84、122、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1 comprising the胺基酸序列、(ii) 包括序列辨識號:85、94、123-124、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2、及(c) 包括序列辨識號: 95、104、125、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。
在另一態樣中,發明提供一抗體,包括:(a)包括序列辨識號:45、54、117、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1;(b) 包括序列辨識號:55、64、118-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2;(c) 包括序列辨識號:65、74、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3;(d) 包括序列辨識號: 75、84、122、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1;(e) 包括序列辨識號:85、94、123-124、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2;及(f) 包括序列辨識號:95、104、125、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在一些特定實施例中,如以上提供之抗C5抗體的任一或多個胺基酸在下列HVR位置被取代:(a) 於HVR-H1 (序列辨識號: 45)中,在位置5及6;(b) 於HVR-H2 (序列辨識號: 55)中,在位置1、3、9、11、13及15;(c) 於HVR-H3 (序列辨識號: 65)中,在位置2、5、6、12及13;(d) 於HVR-L1 (序列辨識號: 75)中,在位置1、5、7及9;(e) 於HVR-L2 (序列辨識號: 85)中,在位置4、5及6;以及(f) 於HVR-L3 (序列辨識號: 95)中,在位置2、4及12。
在一些特定實施例中,取代為保守取代,如本文中所提供。在一些特定實施例中,下列取代的任一或多個可以任何組合進行:(a)於HVR-H1 (序列辨識號: 45)中,M5V或C6A;(b) 於HVR-H2 (序列辨識號: 55)中,C1A或G、Y3F、T9D或E、Y11K或Q、S13D或E、或A15V;(c) 於HVR-H3 (序列辨識號: 65)中,G2A、V5Q或D、T6Y、Y12H、或L13Y;(d) 於HVR-L1 (序列辨識號: 75)中,Q1R、N5Q或G、G7S、D9K或S;(e) 於HVR-L2 (序列辨識號: 85)中,K4T或E、L5T、或A6H、A6E、或A6Q;(f) 於HVR-L3 (序列辨識號: 95)中,C2S、C2N、或C2T、F4K;或A12T或A12H。
以上取代之所有可能的組合被分別為HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的共有序列之序列辨識號:126、127、128、129、130及131所涵蓋。
在上述之任一實施例中,抗C5抗體是經人源化的(humanized)。在一實施例中,抗C5 抗體包括如上述之任一實施例中的HVR,且更包括受體人類框架,例如,人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。在另一實施例中,抗C5抗體包括如上述之任一實施例中的HVR,且更包括VH或VL,其包括FR序列,其中FR序列如下。對於重鏈可變域,FR1包括序列辨識號:132至134中任一之胺基酸序列,FR2包括序列辨識號:135至136中任一之胺基酸序列,FR3包括序列辨識號:137至139中任一之胺基酸序列,FR4包括序列辨識號:140至141中任一之胺基酸序列。對於輕鏈可變域,FR1包括序列辨識號:142至143中任一之胺基酸序列,FR2包括序列辨識號:144至145中任一之胺基酸序列,FR3包括序列辨識號:146至147中任一之胺基酸序列,FR4包括序列辨識號:148之胺基酸序列。
在另一態樣中,一抗C5抗體包括重鏈可變域(VH)序列,其對於序列辨識號: 1至10中任一之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VH序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號: 1至10任一者中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號: 1至10中任一者中的VH序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VH包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:45至54中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:55至64中任一之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:65至74中任一之胺基酸序列的HVR-H3之HVR。
在另一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括輕鏈可變域(VL),其對於序列辨識號: 11至20中任一之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VL序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:11至20任一者中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號: 11至20中任一者中的VL序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VL包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:75至54中任一之胺基酸序列的HVR-L1、(b) 包括序列辨識號:85至94中任一之胺基酸序列的HVR-L2、及(c) 包括序列辨識號:95至104中任一之胺基酸序列的HVR-L3之HVR。
在另一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括如以上提供之任一實施例中的VH,以及如以上提供之任一實施例中的VL。在一實施例中,抗體分別包括序列辨識號:1至10中任一者中的VH序列以及序列辨識號:11至20中任一者中的VL序列,其包含那些序列的轉譯後修飾。
在另一態樣中,一抗C5抗體包括重鏈可變域(VH)序列,其對於序列辨識號:10、106至110中任一之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VH序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:10、106至110任一者中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:10、106至110中任一者中的VH序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VH包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:45、54、117、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:55、64、118-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:65、74、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3之HVR。
在另一態樣中,一抗C5抗體包括VH序列,其對於序列辨識號:10、106至110中任一之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VH序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:10、106至110任一者中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:10、106至110中任一者中的VH序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VH包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:45、54、117、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:55、64、118-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:65、74、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3之HVR。
在另一態樣中,一抗C5抗體包括VH序列,其對於序列辨識號:10之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,VH序列為序列辨識號:10之胺基酸序列。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VH序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:10中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:10中的VH序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VH包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:54之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:64之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:74之胺基酸序列的HVR-H3之HVR。
在另一態樣中,一抗C5 抗體包括VH序列,其對於序列辨識號:106之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,VH序列為序列辨識號:106之胺基酸序列。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VH序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:106中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:106中的VH序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VH包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:117之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:118之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:121之胺基酸序列的HVR-H3之HVR。
在另一態樣中,, 一抗C5抗體包括VH序列,其對於序列辨識號:107之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,VH序列為序列辨識號:107之胺基酸序列。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VH序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:107中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:107中的VH序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VH包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:117之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:119之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:121之胺基酸序列的HVR-H3之HVR。
在另一態樣中,一抗C5 抗體包括VH序列,其對於序列辨識號:108之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,VH序列為序列辨識號:108之胺基酸序列。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VH序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:108中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:108中的VH序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VH包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:117之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:118之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:121之胺基酸序列的HVR-H3之HVR。
在另一態樣中,一抗C5 抗體包括VH序列,其對於序列辨識號:109之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,VH序列為序列辨識號:109之胺基酸序列。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VH序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:109中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:109中的VH序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VH包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:117之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:118之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:121之胺基酸序列的HVR-H3之HVR。
在另一態樣中,一抗C5 抗體包括VH序列,其對於序列辨識號:110之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,VH序列為序列辨識號:110之胺基酸序列。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VH序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:110中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:110中的VH序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VH包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:117之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:120之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:121之胺基酸序列的HVR-H3之HVR。
在另一態樣中,提供一抗C5 抗體,其中抗體包括輕鏈可變域(VL),其對於序列辨識號:20、111-113中任一之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VL序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號: 20、111-113任一者中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號: 20、111-113中任一者中的VL序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VL包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:75、84、122、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1、(b) 包括序列辨識號:85、94、123-124、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2、及(c) 包括序列辨識號:95、104、125、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3之HVR。
在另一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括VL,其對於序列辨識號:20之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,VL序列為序列辨識號:20之胺基酸序列。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VL序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:20中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:20中的VL序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VL包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:84之胺基酸序列的HVR-L1、(b) 包括序列辨識號:94之胺基酸序列的HVR-L2、及(c) 包括序列辨識號:104之胺基酸序列的HVR-L3之HVR。
在另一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括VL,其對於序列辨識號:111之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,VL序列為序列辨識號:111之胺基酸序列。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VL序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:111中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:111中的VL序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VL包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:122之胺基酸序列的HVR-L1、(b) 包括序列辨識號:123之胺基酸序列的HVR-L2、及(c) 包括序列辨識號:125之胺基酸序列的HVR-L3之HVR。
在另一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括VL,其對於序列辨識號:112之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,VL序列為序列辨識號:112之胺基酸序列。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VL序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:112中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:112中的VL序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VL包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:122之胺基酸序列的HVR-L1、(b) 包括序列辨識號:123之胺基酸序列的HVR-L2、及(c) 包括序列辨識號:125之胺基酸序列的HVR-L3之HVR。
在另一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括VL,其對於序列辨識號:113之胺基酸序列,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列相同性。在一些特定實施例中,VL序列為序列辨識號:113之胺基酸序列。在一些特定實施例中,具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%之相同性的VL序列,相對於參考序列,包含取代(例如,保守取代)、***或刪除,但包括那序列的抗C5抗體保有結合至C5的能力。在一些特定實施例中,在序列辨識號:113中,總計1至10個胺基酸是經取代、***及/或刪除。在一些特定實施例中,取代、***或刪除發生於HVR外的區域中(即,在FR中)。可選地,抗C5抗體包括序列辨識號:113中的VL序列,其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中,VL包括一個、兩個或三個擇自於:(a) 包括序列辨識號:122之胺基酸序列的HVR-L1、(b) 包括序列辨識號:124之胺基酸序列的HVR-L2、及(c) 包括序列辨識號:125之胺基酸序列的HVR-L3之HVR。
在另一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括如以上提供之任一實施例中的VH,以及如以上提供之任一實施例中的VL。在一實施例中,抗體分別包括序列辨識號:10、106至110中任一者中的VH序列以及序列辨識號:20、111至113中任一者中的VL序列,其包含那些序列的轉譯後修飾。在一實施例中,抗體包括序列辨識號:10的VH序列,以及序列辨識號:20的VL序列。在一實施例中,抗體包括序列辨識號:106的VH序列,以及序列辨識號:111的VL序列。在另一實施例中,抗體包括序列辨識號:107的VH序列,以及序列辨識號:111的VL序列。在又一實施例中,抗體包括序列辨識號:108的VH序列,以及序列辨識號:111的VL序列。在另一實施例中,抗體包括序列辨識號:109的VH序列,以及序列辨識號:111的VL序列。在另一實施例中,抗體包括序列辨識號:109的VH序列,以及序列辨識號:112的VL序列。在另一實施例中,抗體包括序列辨識號:109的VH序列,以及序列辨識號:113的VL序列。在另一實施例中,抗體包括序列辨識號:110的VH序列,以及序列辨識號:113的VL序列。
在一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括VH序列,其包含(a) 包括序列辨識號:54之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:64之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:74之胺基酸序列的HVR-H3,以及VL序列,其包含(a) 包括序列辨識號:84之胺基酸序列的HVR-L1;(b) 包括序列辨識號:94之胺基酸序列的HVR-L2;及(c) 包括序列辨識號:104之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括VH序列,其包含(a) 包括序列辨識號:117之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:118之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:121之胺基酸序列的HVR-H3,以及VL序列,其包含(a) 包括序列辨識號:122之胺基酸序列的HVR-L1;(b) 包括序列辨識號:123之胺基酸序列的HVR-L2;及(c) 包括序列辨識號:125之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括VH序列,其包含(a) 包括序列辨識號:117之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:119之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:121之胺基酸序列的HVR-H3,以及VL序列,其包含(a) 包括序列辨識號:122之胺基酸序列的HVR-L1;(b) 包括序列辨識號:123之胺基酸序列的HVR-L2;及(c) 包括序列辨識號:125之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括VH序列,其包含(a) 包括序列辨識號:117之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:118之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:121之胺基酸序列的HVR-H3,以及VL序列,其包含(a) 包括序列辨識號:122之胺基酸序列的HVR-L1;(b) 包括序列辨識號:124之胺基酸序列的HVR-L2;及(c) 包括序列辨識號:125之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中,提供一抗C5抗體,其中抗體包括VH序列,其包含(a) 包括序列辨識號:117之胺基酸序列的HVR-H1、(b) 包括序列辨識號:120之胺基酸序列的HVR-H2、及(c) 包括序列辨識號:121之胺基酸序列的HVR-H3,以及VL序列,其包含(a) 包括序列辨識號:122之胺基酸序列的HVR-L1;(b) 包括序列辨識號:124之胺基酸序列的HVR-L2;及(c) 包括序列辨識號:125之胺基酸序列的HVR-L3。
在一些特定實施例中,本發明之抗C5抗體包括如以上提供之任一實施例中的VH以及包括序列辨識號:33、34、35、114、115及116中任一之胺基酸序列的重鏈恆定區。在一些特定實施例中,本發明之抗C5抗體包括如以上提供之任一實施例中的VL以及包括序列辨識號:36、37及38中任一之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
在另一態樣中,本發明提供一抗體,其結合至與本文中提供之抗C5抗體相同的抗原決定基。例如,在一些特定實施例中,提供之抗體結合至與表2中所述之抗體相同的抗原決定基。如下文之操作實施例所示,表2所述之所有抗C5抗體被分類至C5的相同抗原決定基分格中,且展現pH依賴性結合特性。
在又一態樣中,本發明提供一抗體,其結合至與本文中提供之抗體相同的抗原基定決定位。在又一態樣中,本發明提供一抗體,其結合至與表7或8中所述之抗體相同的抗原決定基。在一些特定實施例中,提供一抗體,其結合至由C5的β鏈(序列辨識號:40)的胺基酸33至124所組成之片段內的抗原決定基。在一些特定實施例中,提供一抗體,其結合至C5的β鏈(序列辨識號:40)內的抗原決定基,其包括至少一擇自於胺基酸47-57、70-76及107-110所組成之群組的片段。在一些特定實施例中,提供一抗體,其結合至C5的β鏈(序列辨識號:40)的片段內的抗原決定基,其包括至少一擇自於Thr47、Glu48、Ala49、Phe50、Asp51、Ala52、Thr53、Lys57、His70、Val71、His72、Ser74、Glu76、Val107、Ser108、Lys109、及His110所組成之群組的胺基酸。在另一實施例中,本發明的抗C5抗體的抗原決定基是構象抗原決定基(conformational epitope)。
在又一態樣中,根據以上任一之實施例的抗C5抗體為單株抗體,包含嵌合、人源化或人類抗體。在一實施例中,抗C5抗體為抗體片段,例如,Fv、Fab、Fab'、scFv、雙抗體(diabody)、或F(ab')2
片段。在另一實施例中,抗體為全長抗體,例如,完整的IgG1或IgG4抗體或如本文所定義之其它抗體種類或同型(isotype)。
在又一態樣中,根據以上任一實施例的抗C5抗體可單一地或組合地合併任一特徵,如以下章節1-7所述:
1. 抗體親和性
在一些特定實施例中,本文提供之抗體具有≤1 µm、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM、或≤0.001 nM (例如10-8
M或更小,例如從10-8
M至10-13
M、例如從10-9
M至10-13
M)之解離常數(Kd)。
在一實施例中,Kd藉由放射性標記抗原結合測定法(radiolabeled antigen binding assay, RIA)進行測量。在一實施例中,RIA是以感興趣的抗體及其抗原的Fab形式實行。例如,藉由在存在未標記抗原的滴定系列的條件下,用最小濃度的(125
I)-標記抗原平衡Fab,然後以抗Fab抗體被覆的盤捕捉結合的抗原,以測量Fab對抗原的溶液結合親和性(請參照,例如Chen 等人,J. Mol. Biol.
293:865-881(1999))。為了確立測定的條件,以於50mM碳酸鈉(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗體(Cappel Labs)被覆MICROTITER®
多孔盤(Thermo Scientific)過夜,接著以於PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室溫(約23℃)進行阻斷2至5小時。在非吸附盤(Nunc#269620)中,將100pM或26pM[125
I]-抗原與連續稀釋的感興趣的Fab(例如,與Presta 等人,Cancer Res.
57:4593-4599 (1997)中抗VEGF抗體,Fab-12的評估一致)混合。接著將感興趣的Fab培養過夜;然而,培養可持續更長的時間(例如,約65小時)以確保達到平衡。此後,將混合物轉移至捕捉盤於室溫下培養(例如,1小時)。接著移除溶液並以含0.1%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20®
)的PBS清洗盤8次。當盤已乾燥,加入150μl/孔的閃爍液(MICROSCINT-20TM
;Packard),且於TOPCOUNTTM
伽馬計數器(Packard)上對盤計數10分鐘。選擇各Fab給出小於或等於最大結合之20%的濃度,用於競爭性結合測定法。
依照另一實施例,Kd是利用BIACORE®
表面電漿共振測定法進行測量。例如,使用BIACORE®
-2000或BIACORE®
-3000 (BIACORE®
, Inc., Piscataway, NJ)的測定法在25℃以固定化抗原CM5晶片在約10個回應單位(RU)下實行。在一實施例中,根據供應商的說明書,以N
-乙基-N'
-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5, BIACORE®
, Inc.)。在以5μl/分鐘的流速注入以獲得約10個回應單位(RU)的偶聯蛋白之前,以10mM乙酸鈉,pH4.8,將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)。在抗原的注入後,注入1M乙醇胺以阻斷未反應基團。為了進行動力學測量,將兩倍連續稀釋的Fab(0.78nM至500nM)在25℃以約25μl/分鐘的流速注入於含0.05聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM
)介面活性劑的PBS(PBST)中。使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE®
Evaluation Software version 3.2)藉由同時擬合結合及解離傳感圖計算結合速率(kon
)及解離速率(koff
)。平衡解離常數(Kd)以比例koff
/kon
計算。請請參照,例如Chen 等人,J. Mol. Biol.
293:865-881 (1999)。若根據上述表面電漿共振測定法,結合速率超過106
M-1
s-1
,那麼結合速率利用螢光淬滅技術加以測定,其在25℃下測量於PBS,pH7.2,中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)的螢光發射強度(激發=295nm;發射=340nm,16nm帶通)的增加或減少,在分光計,例如配備了斷流(stop-flow)裝置的分光光度計(Aviv Instruments)或具攪拌比色管之8000系列SLM-AMINCOTM
分光光度計(ThermoSpectronic),測量抗原的濃度增加的存在下。
2. 抗體片段
在一些特定實施例中,本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包含但不限於,Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2
、Fv、及scFv片段,及如下述之其它片段。對於特定抗體片段的綜述,請參照Hudson等人,Nat. Med.
9:129-134 (2003)。對於特定scFv片段的綜述,請參照,例如Pluckthün, inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies
, vol. 113, Rosenburg及Moore編輯,(Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994);亦參照WO 93/16185;以及美國專利號5,571,894及5,587,458。對包括補救(salvage)受體結合抗原決定基殘基且具有增加的體內(in vivo
)半生期之Fab及F(ab')2
片段的討論,請參照美國專利號5,869,046。
雙抗體(diobody)是具有兩個抗原結合位的抗體片段,其可為二價的或雙特異性的,請參照,例如EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson等人,Nat. Med.
9:129-134 (2003);及Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:6444-6448 (1993)。三抗體及四抗體也記載於Hudson等人,Nat. Med.
9:129-134 (2003)中。
單域抗體是包括抗體的所有或部分的重鏈可變域或全部或部分的輕鏈可變域之抗體片段。在一些特定實施例中,單域抗體是人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA;請參照,例如美國專利號6,248,516)。
可藉由多種技術形成抗體片段,包含但不限於完整抗體的蛋白水解消化,以及藉由重組宿主細胞(例如,E. coli
或噬菌體)的產生,如本文中所述。
3. 嵌合及人源化抗體
在一些特定實施例中,本文提供之抗體為嵌合抗體。特定嵌合抗體記載於,例如,美國專利號4,816,567;及Morrison等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:6851-6855 (1984))。在一例子中,嵌合抗體包括非人類可變區(例如,源自小鼠、大鼠、齧齒類、兔或非人類靈長類,像是猴的可變區)以及人類恆定區。在又一例子中,嵌合抗體為“類別交換的(class switched)”抗體,其中類別或亞類(subclass)已自親本抗體的類別或亞類改變。嵌合抗體包含其抗原結合片段。
在一些特定實施例中,嵌合抗體為人源化抗體。通常,非人類抗體經人源化以降低對人類的免疫原性,同時保有親本非人類抗體的特異性及親和性。一般而言,人源化的抗體包括一或多個可變域,其中HVR,例如,CDR(或其部分)源自非人類抗體,以及FR(或其部分)源自人類抗體序列。人源化抗體可選地也包括人類恆定區的至少一部分。在一些實施例中,人源化的抗體中的一些FR殘基被來自非人類抗體(例如,HVR殘基源自的抗體)對應之殘基取代,例如,以恢復或提高抗體特異性或親和性。
人源化抗體及製備其的方法綜述於,例如,Almagro and Fransson,Front. Biosci.
13:1619-1633 (2008),以及進一步描述於,例如Riechmann等人,Nature
332:323-329 (1988);Queen等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
86:10029-10033 (1989);美國專利號5,821,337、7,527,791、6,982,321及7,087,409;Kashmiri等人,Methods
36:25-34 (2005) (描述特異性決定區(SDR)移);Padlan,Mol. Immunol.
28:489-498 (1991) (描述“表面重修”);Dall'Acqua等人,Methods
36:43-60 (2005) (描述“FR改組”);以及Osbourn等人,Methods
36:61-68 (2005)以及Klimka等人,Br. J. Cancer
83:252-260 (2000)(描述FR改組的“導向選擇”方法)。
可用於人源化的人類框架區包含但不限於:使用“最適”方法選擇的框架區(請參照,例如,Sims 等人,J. Immunol.
151:2296 (1993);源自特定的亞型的輕鏈或重鏈可變區的人類抗體的共有序列之框架區(請參照,例如,Carter等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:4285 (1992);及Presta等人,J. Immunol.
151:2623 (1993);人類成熟(體細胞突變的)框架區或人類種系框架區(請參照,例如,Almagro及Fransson,Front. Biosci.
13:1619-1633 (2008));以及源自篩選FR資料庫的框架區(請參照,例如,Baca等人,J. Biol. Chem.
272:10678-10684 (1997)以及Rosok等人,J. Biol. Chem.
271:22611-22618 (1996))。
4. 人類抗體
在一些特定實施例中,本文提供之抗體為人類抗體。人類抗體可利用各種習知的技術加以製造。人類抗體大致的描述於van Dijk及van de Winkel,Curr. Opin. Pharma.
5:368-74 (2001)以及Lonberg,Curr. Opin. Immunol.
20:450-459 (2008)。
人類抗體可藉由向已經過修飾因而因應抗原攻擊產生完整人類抗體或具有人類可變區的完整抗體之基因轉殖動物施用免疫原,來製備人抗體。這類動物通常包含全部或部分的人類免疫球蛋白基因座,其取代了內源免疫球蛋白基因座,或其存在於染色體外或隨機整合於動物的染色體內。在這類基因轉殖小鼠中,內源免疫球蛋白基因座一般已不活化。關於自基因轉殖動物獲取人類抗體的方法之綜述,請參照Lonberg,Nat. Biotech.
23:1117-1125 (2005)。請亦參照,例如美國專利號6,075,181及6,150,584,其描述XENOMOUSETM
技術;美國專利號5,770,429,其描述HuMab®技術;美國專利號7,041,870,其描述K-M MOUSE®技術,以及美國專利公開號US 2007/0061900,其描述VelociMouse®技術)。藉由這類動物產生的完整抗體的人類可變區可進一步修飾,例如,藉由與不同人類恆定區組合。
人類抗體也可藉由基於融合瘤的方法形成。用於產生人類單株抗體的人類骨髓瘤及小鼠-人融合骨髓瘤細胞系已經描述。(請參照,例如Kozbor,J. Immunol.
133:3001 (1984);Brodeur等人,Monoclonal antibody Production Techniques and Applications
, pp. 51-63 (Dekker, Inc., New York, 1987);以及Boerner等人,J. Immunol
. 147:86 (1991)。藉由人類B細胞融合瘤技術產生的人抗體也在Li等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
103:3557-3562 (2006)中描述。其它方法包含那些描述於,例如,美國專利號7,189,826(描述由融合瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue
26(4):265-268 (2006) (描述人-人融合瘤)的方法。人融合瘤技術(Trioma技術)也描述於Vollmers,Histology and Histopathology
20(3):927-937 (2005)以及Vollmers,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology
27(3):185-191 (2005)。
亦可藉由分離選自源自人類噬菌體展示資料庫的Fv株可變域序列產生人類抗體。接著可將這類可變域序列與所需人類恆定域組合。下文描述自抗體資料庫選擇人類抗體的技術。
5. 源自資料庫的抗體
可藉由在組合資料庫中篩選具有所需活性的抗體以分離本發明的抗體。例如,本領域中已知多種用於產生噬菌體展示資料庫並且在這類資料庫中篩選具有所需結合特徵的抗體的方法。這類方法綜述於,例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology
178:1-37 (O'Brien等人,ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) ,且進一步於,例如McCafferty等人,Nature
348:552-554; Clackson等人,Nature
352:624-628 (1991);Marks等人,J. Mol. Biol.
222:581-597 (1992);Marks,Meth.Mol. Biol.
248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003);Sidhu等人,J. Mol. Biol.
338(2):299-310 (2004);Lee等人,J. Mol. Biol.
340(5):1073-1093 (2004);Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
101(34):12467-12472 (2004);Lee等人,J. Immunol. Methods
284(1-2):119-132 (2004)中描述。
在特定的噬菌體展示方法中,VH及VL基因的庫(repertoire)是藉由聚合酶連鎖反應(PCR)分別選殖並隨機地重組於噬菌體資料庫中,之後可藉由如Winter等人,Ann. Rev. Immunol.
12:433-455 (1994)所述在其中篩選抗原結合噬菌體。噬菌體通常呈現單鏈Fv(ScFv)片段或Fab片段形式的抗體片段。來自免疫來源的資料庫無需建構融合瘤,即可提供免疫原的高親和性抗體。或者,天然庫可被轉殖(cloned)(例如,自人類)以在無任何免疫的情況下,提供針對廣泛範圍的非自體抗原以及自體抗原的抗體單一來源,如Griffiths等人,EMBO J,
12:725-734 (1993)所述。最後,也可藉由從幹細胞轉殖未重排的V基因片段,並使用含有隨機序列的PCR引子來編碼高度變異CDR3區,以及實現體外(in vitro
)重排以合成地產生天然資料庫,如Hoogenboom,J. Mol. Biol.
227:381-388 (1992)所述。描述人類抗體噬菌體資料庫的專利公開物包含,例如:美國專利號5,750,373,以及美國專利公開號2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936以及2009/0002360。
自人類抗體資料庫分離的抗體或抗體片段被視為本文的人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在一些特定實施例中,本為提供之抗體為多特異性抗體,例如,雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位置具有結合特異性的單株抗體。在一些特定實施例中,結合特異性的其中之一是針對C5而另一種是針對任一其它抗原。在一些特定實施例中,雙特異性抗體可結合至C5的兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體也可用以將細胞毒性劑定位於表現C5的細胞。雙特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。
製造多特異性抗體的技術包含但不限於,具有不同特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表達(co-expression)(請參照Milstein及Cuello,Nature
305:537 (1983))、WO 93/08829、以及Traunecker等人,EMBO J.
10:3655 (1991)),及“knob-in-hole”工程改造(請參照,例如美國專利號5,731,168)。也可藉由以下方法製得多特異性抗體:工程改造用於製備抗體Fc-異二聚分子的靜電導引作用(WO 2009/089004A1);將兩種或兩種以上抗體或片段交聯(請參照,例如美國專利號 4,676,980,以及Brennan等人,Science
229:81 (1985));使用白胺酸拉鍊以產生雙特異性抗體(請參照,例如Kostelny等人,J. Immunol.
148(5):1547-1553 (1992));利用“雙抗體” 技術來產生雙特異性抗體片段(請參照,例如Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:6444-6448 (1993));及利用單鏈Fv (scFv)雙體(請參照,例如Gruber等人,J. Immunol.
152:5368 (1994));以及製備三特異性抗體,如,例如Tutt等人,J. Immunol.
147:60 (1991)中所述。
本文中也包含具有三個或三個以上的功能性抗原結合位置的工程改造抗體,其包含“章魚抗體(Octopus antibodies)” (請參照,例如US 2006/0025576)。
本文中的抗體或片段亦包含“雙重作用FAb”或“DAF”,其包括結合至C5以及另一不同抗原的抗原結合位置(請參照,例如,US 2008/0069820)。
7. 抗體變異體
在一些特定實施例中,本文提供之抗體的胺基酸序列變異體為經設想的。例如,提高抗體的結合親和性及/或其它生物性質可為理想的。可藉由引入適當的修飾至編碼抗體的核苷酸序列、或藉由肽合成,製備抗體的胺基酸序列變異體。此類修飾包含,例如,在抗體的胺基酸序列內刪除、及/或***及/或取代殘基。可以使得刪除、***及取代的任何組合達到最終的構建體中,前提為最終構建體具有期望的特徵,例如,抗原結合。
a. 取代、***及刪除變異體
在一些特定實施例中,提供具有一或多個胺基酸取代的抗體變異體。取代誘變(mutagenesis)的感興趣的位置包含HVR及FR。表1中的標題“優選取代”下顯示保守取代。表1中的標題“示例性取代”下提供更實質的改變,並參考胺基酸側鏈類別在下文進一步描述。可將胺基酸取代引入至感興趣的抗體及篩選到期望的活性之產物中,例如,保留的/改善的抗體結合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
表1
原始殘基 | 示例性取代 | 優選取代 |
Ala (A) | Val; Leu; Ile | Val |
Arg (R) | Lys; Gln; Asn | Lys |
Asn (N) | Gln; His; Asp, Lys; Arg | Gln |
Asp (D) | Glu; Asn | Glu |
Cys (C) | Ser; Ala | Ser |
Gln (Q) | Asn; Glu | Asn |
Glu (E) | Asp; Gln | Asp |
Gly (G) | Ala | Ala |
His (H) | Asn; Gln; Lys; Arg | Arg |
Ile (I) | Leu; Val; Met; Ala; Phe;正白胺酸 | Leu |
Leu (L) | 正白胺酸; Ile; Val; Met; Ala; Phe | Ile |
Lys (K) | Arg; Gln; Asn | Arg |
Met (M) | Leu; Phe; Ile | Leu |
Phe (F) | Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr | Tyr |
Pro (P) | Ala | Ala |
Ser (S) | Thr | Thr |
Thr (T) | Val; Ser | Ser |
Trp (W) | Tyr; Phe | Tyr |
Tyr (Y) | Trp; Phe; Thr; Ser | Phe |
Val (V) | Ile; Leu; Met; Phe; Ala;正白胺酸 | Leu |
可根據共同的側鏈特性將胺基酸分類為:(1) 疏水的:正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性親水的:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性的:Asp、Glu;(4)鹼性的:His、Lys、Arg;(5)影響鏈方位的殘基:Gly、Pro;以及(6) 芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將使得這些類別中之一的成員與另一類別交換。
取代變異體的一類涉及取代親本抗體(例如,人源化的或人類抗體)的一或多個高變異區殘基。一般而言,選擇用於進一步研究的產生之變異體將在特定生物性質(例如,增加的親和性、降低的免疫原性)中相對於親本抗體具有修飾(例如改善)及/或將具有實質上保留的親本抗體的特定生物性質。示例性的取代變異體是親和性成熟的抗體,其可方便地被產生,例如,使用像是那些本文所述基於噬菌體展示的親和性成熟技術。簡言之,突變一或多個HVR殘基並且在噬菌體上展示變異體抗體,以及就特別的生物活性(例如,結合親和性)進行篩選。
可以在HVR中形成修改(alteration)(例如,取代),例如,以改善抗體親和性。此類修改可形成在HVR“熱點”中,即由在體細胞成熟過程中以高頻率經歷突變的密碼子所編碼的殘基(請參照,例如,Chowdhury,Methods Mol. Biol.
207:179-196 (2008),及/或接觸抗原的殘基,且測試獲得的變異體VH或VL之結合親和性。藉由建構以及從第二資料庫重新選擇的親和性成熟已在,例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology
178:1-37 (O'Brien等人,ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)中描述。在親和性成熟的一些實施例中,藉由多種方法中的任一種(例如,易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸定向誘變)將多樣性引入至選擇用於成熟的可變基因中。接著產生第二資料庫。然後篩選資料庫以辨識具有期望的親和性的任一抗體變異體。引入多樣性的另一種方法涉及HVR定向方法,其中隨機化數個HVR殘基(例如,一次4至6個殘基)。涉及抗原結合的HVR殘基可特異地被辨識,例如使用丙胺酸掃描誘變或建立模型。CDR-H3及CDR-L3特別常被標靶。
在一些特定的實施例中,取代、***或刪除可發生在一或多個HVR內,只要此類修改未實質地降低抗體結合抗原的能力。例如,可在HVR中形成未實質地降低結合親和性的保守修改(例如,如本文提供的保守取代)。此類修改可,例如,在HVR中的抗原接觸殘基之外。在以上提供的變異體VH和VL序列的特定實施例中,每一HVR或未被修改,或含有不多於一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種可用於辨識可被標靶用於誘變的抗體的殘基或區域的方法稱為“丙胺酸掃描誘變”,如Cunningham,Science
244:1081-1085 (1989)所述。在此方法中,殘基或一群殘基(例如,帶電的殘基,像是arg、asp、his、lys及glu)可被辨識並被中性或帶負電的胺基酸(例如,丙胺酸或多聚丙胺酸)取代,以測定是否影響抗體與抗原的相互作用。可在顯示對於初始取代的功能性敏感的胺基酸位置引入更多的取代。替代地、或額外地,抗原抗體複合物的晶體結構辨識抗體及抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰的殘基可被標靶或消除,作為作為取代的候選對象。變異體可被篩選以測定它們是否包含期望的性質。
胺基酸序列***物包含長度範圍從一個殘基至包含100個或更多殘基的多肽之胺基-及/或羧基-末端融合物,以及單一或多個胺基酸殘基的序列內***物。末端***物的例子包含具有N末端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子的其它***變異體包含抗體的N或C末端對酶(例如,ADEPT)或多肽的融合,其增加抗體的血清半生期。
b. 糖基化變異體
在一些特定的實施例中,本文提供的抗體被修改以增加或減少抗體被糖基化的程度。可藉由修改胺基酸序列使得一或多個糖基化位置被製造或移除,以方便地完成對抗體的糖基化位置之添加或刪除。
當抗體包括Fc區時,可以修改附著於其的糖。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包括分支的、二天線(biantennary)的寡糖,其一般藉由N連接附著至Fc區的CH2域的Asn297,請參照,例如,Wright等人,TIBTECH
15:26-32 (1997)。寡糖可包含多種糖,例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸,以及附著至二天線寡糖結構的“主幹”中的GIcNAc的岩藻糖。在一些實施例中,可在本發明的抗體中的寡糖形成修飾,以產生具有特定改善性質的抗體變異體。
在一實施例中,提供的抗體變異體具有糖結構,其缺少附著(直接或間接)至Fc區的岩藻糖。例如,此類抗體中岩藻糖的量可為從1 %至80 %、從1 %至65 %、從5 %至65 %或從20 %至40%。岩藻糖的量是藉由計算糖鏈內在Asn297處的平均岩藻糖的量,相對於如藉由MALDI-TOF質譜分析測量之附著於Asn297的所有糖基結構的總和(例如,複合物、雜合物及高甘露糖結構)加以測定,例如,如WO 2008/077546中所述。Asn297指位於Fc區中約在位置297(Fc區殘基的Eu編號)的天冬醯胺殘基;然而,由於抗體中微小的序列變異,Asn297也可位於位置297的約±3 個胺基酸上游或下游,即位置294及300之間。此類岩藻糖化變異體可具有改善的ADCC功能,請參照,例如,美國專利公開號2003/0157108(Presta, L.);2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。涉及“去岩藻糖化的”或“岩藻糖缺乏的”抗體變異體的公開刊物的例子包含:US 2003/0157108;WO 2000/61739;WO 2001/29246;US 2003/0115614;US 2002/0164328;US 2004/0093621;US 2004/0132140;US 2004/0110704;US 2004/0110282;US 2004/0109865;WO 2003/085119;WO 2003/084570;WO 2005/035586;WO 2005/035778;WO 2005/053742;WO 2002/031140;Okazaki等人,J. Mol. Biol.
336:1239-1249 (2004);Yamane-Ohnuki等人,Biotech. Bioeng.
87:614 (2004)。能夠生產去岩藻糖化的抗體的細胞系的例子包含蛋白岩藻糖化缺乏的Lecl3 CHO細胞(Ripka等人,Arch. Biochem. Biophys.
249:533-545 (1986);US 2003/0157108, Presta, L;及WO 2004/056312, Adams等人,特別是在實施例11),以及敲除(knockout)細胞系,像是α-1,6-岩藻糖轉移酶基因、FUT8
、敲除CHO細胞(請參照,例如,Yamane-Ohnuki等人,Biotech
.Bioeng.
87:614 (2004);Kanda等人,Biotechnol. Bioeng
. 94(4):680-688 (2006);及WO2003/085107)。
更提供具有等分(bisected)寡糖的抗體變異體,例如,其中附著至抗體Fc區的二天線寡糖被GIcNAc等分。此類抗體變異體可具有降低的岩藻糖化及/或改善的ADCC功能。此類抗體變異體的例子描述於,例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)、美國專利號6,602,684(Umana等人);及US 2005/0123546(Umana等人)中。也提供了在附著至Fc區的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變異體。此類抗體變異體可具有改善的CDC功能。此類抗體變異體描述於,例如WO 1997/30087(Patel等人);W0 1998/58964(Raju, S);及WO 1999/22764(Raju, S)中。
c. Fc區變異體
在一些特定的實施例中,可將一或多個胺基酸修飾引入至本文提供的抗體的Fc區中,從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包括人類Fc區序列(例如,人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區),其在一或多個胺基酸位置包括胺基酸修飾(例如,取代)。
在一些特定的實施例中,本發明設想具有一些但並非全部效應物(effector)功能的抗體變異體,這使得其為應用的理想的候選者,所述應用中抗體的體內半生期是重要的,然而特定效應物功能(像是補體及ADCC)為不必要或有害的。可進行體外及/或體內細胞毒性測定法以確認CDC及/或ADCC活性的降低/耗盡。例如,可進行Fc受體(FcR)結合測定法以確保抗體缺少FcγR結合(因此可能缺少ADCC活性),但保留FcRn結合能力。調節ADCC的主要細胞,NK細胞,僅表達FcγRIII,然而單核細胞表FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上的FcR表達總結於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol.
9:457-492 (1991)的464頁上的表3中。用於評估感興趣的分子的ADCC活性的體外測定的非限制性例子描述於美國專利號5,500,362 (請參照,例如Hellstrom等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
83:7059-7063 (1986))及Hellstrom等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
82:1499-1502 (1985);美國專利號5,821,337(請參照,Bruggemann等人,J. Exp. Med.
166:1351-1361 (1987))中。備或者,可採用非放射性測定法(請參照,例如,流式細胞術的ACTI™非放射性細胞毒性測定法(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA);及CytoTox 96®
非放射性細胞毒性測定法(Promega, Madison, WI))。用於此類測定法之有用的效應物細胞包含周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地、或額外地,感興趣的分子的ADCC活性可在體內評估,例如在動物模型中,像是Clynes等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
95:652-656 (1998)中所公開。也可進行Clq結合測定法以確定抗體不能結合Clq並因此缺少CDC活性。請參照,例如,WO 2006/029879及WO 2005/100402中的Clq及C3c結合ELISA。為了評估補體活化,可進行CDC測定法(請參照,例如,Gazzano-Santoro等人,J. Immunol. Methods
202:163 (1996);Cragg等人,Blood
101:1045-1052 (2003);及Cragg等人,Blood
103:2738-2743 (2004))。FcRn結合及體內清除/半生期測定也可使用本領域已知的方法進行(請參照,例如,Petkova等人,Int'l. Immunol.
18(12):1759-1769 (2006))。
具有降低的效應物功能的抗體包含在Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中的一或多個具有取代的那些抗體(美國專利號6,737,056)。此類Fc突變體包含在胺基酸位置265、269、270、297及327中的兩個或多個具有取代的Fc突變體,包含具有殘基265及297取代為丙胺酸的所謂的“DANA”Fc突變體(美國專利號7,332,581)。
對FcR具有改善或減弱的結合之特定抗體變異體已被描述。(請參照,例如美國專利號6,737,056;WO 2004/056312;及Shields等人,J. Biol. Chem.
9(2):6591-6604 (2001))。
在特定的一些實施例中,抗體變異體包括具有提高ADCC的一個或多個胺基酸取代的Fc區,例如,在Fc區的位置298、333及/或334(殘基的EU編號)的取代。
在一些實施例中,在Fc區中形成改變,其導致改變的(即改善或減弱的)Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC),例如,如美國專利號6,194,551、WO 1999/51642,及Idusogie等人,J. Immunol.
164:4178-4184 (2000)中所述。
對新生兒Fc受體(FcRn)具有增加的半生期及改善的結合之抗體描述於US2005/0014934(Hinton等人)中,所述新生兒Fc受體負責將母體IgG傳送至胎兒(Guyer等人,J. Immunol.
117:587 (1976)及Kim等人,J. Immunol.
24:249 (1994))。那些抗體包括具有一個或多個取代於其中的Fc區,其改善Fc區對FcRn的結合。此類Fc變異體包含在Fc區殘基:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、 376、378、380、382、413、424或434的一或多個具有取代的那些,例如Fc區殘基434的取代(美國專利號7,371,826)。
關於Fc區變異體的其它例子,請亦參照Duncan,Nature
322:738-40 (1988);美國專利號US 5,648,260;美國專利號US 5,624,821;及WO 1994/29351。
d)半胱胺酸改造的抗體變異體
在一些特定的實施例中,產生半胱胺酸改造的抗體是理想的,例如,“thioMAb”,於其中抗體的一或多個殘基被半胱胺酸殘基所取代。在特別的實施例中,被取代的殘基存在於抗體的易接近位置。藉由以半胱胺酸取代那些殘基,從而將反應性硫醇基團放置於抗體的易接近位置並可用於偶聯抗體至其它部分,像是藥物部分或連接藥物部分,以創造免疫偶聯物,如本文中進一步所述。在一些特定的實施例中,下列殘基的任一或多個可被半胱胺酸取代:輕鏈的V205(Kabat編號);重鏈的A118(EU編號);及重鏈Fc區的S400(EU編號)。半胱胺酸改造的抗體可以,例如美國專利號7,521,541,所述加以產生。
e)抗體衍生物
在一些特定的實施例中,本文提供的抗體可進一步被修飾,以包含本領域已知且容易獲得的額外的非蛋白質部分(moiety)。適於抗體的衍生化的部分包含,但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包含但不限於,聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三𠮿(poly-1,3,6-trioxane)、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(同聚物或隨機共聚物),及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇同聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烷化多元醇(例如,丙三醇)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛可在生產中具有優勢由於其在水中的穩定性。多聚物可具有任一分子量,且可為分支或無分支的。附著於抗體的多聚物的數目可不同,且如果附著多於一個多聚物,它們可以是相同或不同的分子。一般而言,用於衍生化的多聚物的數量及/或類型可根據,包含但不限於,考慮待改善的抗體的特別的性質或功能、抗體衍生物是否將在定義的條件下用於療法中等加以決定。
在另一實施例中,提供一抗體及可藉由暴露於輻射選擇性地被加熱的非蛋白質部分的偶聯物。在一實施例中,非蛋白質部分是碳納米管(Kam等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
102:11600-11605 (2005))。輻射可具有任何波長,且包含但不限於,不傷害普通細胞的波長,但其加熱非蛋白質部分至接近抗體-非蛋白質部分的細胞被殺死之溫度。
B.重組方法及組合物
可使用重組方法及組合物產生抗體,例如,如US 4,816,567中所述。在一實施例中,提供一編碼本文所述的抗C5抗體的分離的核酸。此類核酸可編碼包括VL的胺基酸序列及/或包括抗體的VH的胺基酸序列(例如,抗體的輕及/或重鏈)。在又一實施例中,提供包括此類核酸的一或多個載體(例如,表達載體)。在又一實施例中,提供一包括此類核酸的宿主細胞。在此一實施例中,宿主細胞包括(例如已經轉化具有):(1)載體,包括核酸,其編碼包括抗體的VL的胺基酸序列及包括抗體的VH的胺基酸序列,或(2)第一載體,包括核酸,其編碼包括抗體的VL的胺基酸序列,及第二載體,包括核酸,其編碼包括抗體的VH的胺基酸序列。在一實施例中,宿主細胞為真核生物,例如,中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴球細胞(例如,Y0、NS0、Sp20細胞)。在一實施例中,提供一製備抗C5抗體的方法,其中所述方法包括在適於抗體的表達的條件下培養如上文提供之包括編碼抗體的核酸的宿主細胞,及可選地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
為了抗C5抗體的重組生產,例如,如上文所述之編碼抗體的核酸,被分離並***至一或多個載體中用於進一步選殖及/或在宿主細胞中表達。使用常規流程可容易地分離及定序此類核酸(例如,藉由使用寡核苷酸探針,其能夠特異性地結合至編碼抗體的重鏈及輕鏈的基因)。
用於編碼抗體的載體的選殖或表達的合適的宿主細胞包含本文所述的原核或真核細胞。例如,可在細菌中生產抗體,特別是當不需糖基化及Fc效應物功能時。對於在細菌中表達抗體片段及多肽,請參照,例如,US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(請亦參照Charlton,Methods in Molecular Biology, Vol. 248
(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254,其描述在大腸桿菌中抗體片段的表達)。在表達後,抗體可從可溶級分的細菌細胞糊中分離並可進一步純化。
除了原核生物,真核微生物像是絲狀真菌或酵母,是編碼抗體的載體的合適的選殖或表達宿主,包含真菌及酵母菌株,其糖基化途徑已經“人源化”,導致具有部分或全部人類糖基化模式的抗體之產生。請參照Gerngross,Nat. Biotech.
22:1409-1414 (2004)及Li等人,Nat. Biotech.
24:210-215 (2006)。
適於糖基化抗體的表達之宿主細胞亦源自多細胞生物(無脊椎生物及脊椎生物)。無脊椎生物細胞的例子包含植物及昆蟲細胞。已鑒定多種桿狀病毒株,其可與昆蟲細胞共同使用,特別地用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞的轉染(transfection)。
植物細胞培養物也可用作宿主。請參照,例如美國專利號5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978及6,417,429(描述用於在基因轉殖植物中產生抗體的PLANTIB0DIES™技術)。
脊椎動物細胞也可用作宿主。例如,可使用適應於懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的其它例子為經SV40轉化的猴腎臟CVl細胞系(COS-7);人類胚胎腎臟細胞系(293或如,例如,Graham等人,J. Gen Virol.
36:59 (1977)中所述之293細胞);幼倉鼠腎臟細胞(BHK);小鼠支持細胞(如,例如Mather,Biol. Reprod.
23:243-251 (1980)中所述的TM4細胞);猴腎臟細胞(CVl);非洲綠猴腎臟細胞(VERO-76);人類子宮頸癌細胞(HELA);犬腎臟細胞(MDCK;水牛鼠肝臟細胞(BRL 3A);人類肺臟細胞(W138);人類肝臟細胞(Hep G2);小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562);如,例如Mather等人,Annals N.Y. Acad. Sci
. 383:44-68 (1982)中所述的TRI細胞;MRC 5細胞;及FS4細胞。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,其包含DHFR-
CHO細胞(Urlaub等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:4216 (1980));及骨髓瘤細胞系,像是Y0、NS0及Sp2/0。適合用於抗體產生的特定哺乳動物宿主細胞系的綜述請參照,例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology, Vol. 248
(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)。
多株抗體較佳是藉由在動物中多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原及佐劑以產生。使用雙功能或衍生試劑(例如,馬來醯亞胺苯甲醯磺基琥珀醯亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(藉由半胱胺酸殘基偶聯)、N-羥基琥珀醯亞胺(藉由賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2
、或R1
N═C═NR,其中R及R1
是不同的烷基)以偶聯相關抗原至蛋白是有用的,所述蛋白對將被免疫的物種(例如,鎖眼帽貝血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)為免疫的。
藉由將,例如100µg或5µg蛋白或偶聯物(分別對兔及小鼠而言)與3倍體積的弗氏完全佐劑組合,且在多個位置皮內注射溶液使動物(通常為非人類哺乳類)對抗原、免疫原性偶聯物或衍生物免疫。1個月後,藉由在多個位置皮下注射,利用1/5至1/10的原始量的弗氏完全佐劑中的肽或偶聯物對動物進行加強免疫。加強注射後第7-14天,將動物放血,測定血清的抗體滴定濃度。加強免疫動物直至達到滴定濃度平臺(titer plateaus)。較佳地,以相同抗原的偶聯物對動物進行加強免疫,但偶聯至不同的蛋白及/或藉由不同的交聯劑。偶聯物亦可在重組細胞培養物中以蛋白質融合物的形式產生。凝聚劑像是明礬,亦適合用於增強免疫反應。
單株抗體可從實質上均質的抗體族群獲得,即包括族群的單個抗體為相同的,除了可以少量存在之可能自然地發生的突變及/或轉譯後修飾(例如,異構化、醯胺化)。因此,修飾詞“單株”表示抗體的特性,它不是分散的抗體的混合物。
例如,單株抗體可用Kohler等人,Nature
256(5517): 495-497 (1975)最先描述之融合瘤方法形成。在融合瘤方法中,小鼠或其它合適的宿主動物,例如倉鼠,經如本文所述免疫接種以誘導淋巴球,其產生或能夠產生將特異性結合至免疫接種用蛋白的抗體。或者,淋巴球可在體外受免疫。
免疫試劑通常將包含抗原的蛋白或其融合變異體。一般而言,若所需為人類來源的細胞,則使用外周血液淋巴細胞(PBL),或若所需為非人類哺乳動物來源的細胞,則使用脾細胞或淋巴結細胞。接著使用合適的融合劑,例如聚乙二醇,將淋巴細胞與永生細胞系融合以形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103)。
永生細胞系通常是經轉化的哺乳動物細胞,特別是齧齒類、牛及人來源的骨髓瘤細胞。通常,使用大鼠或小鼠的骨髓瘤細胞系。由此製備的融合瘤細胞被接種及生長於合適的培養基中,其較佳包含一或多種抑制未融合、親本骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。例如,若親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT),融合瘤的培養基通常將包含次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸腺嘧啶(HAT培養基),這些物質防止HGPRT-缺陷型細胞的生長。
較佳的永生骨隨瘤細胞為有效地融合、支持藉由選擇的抗體-製造細胞支持抗體的穩定高度產生的那些,且對於培養基(像是HAT培養基)敏感。於這些之中,較佳為小鼠骨髓瘤系,例如自MOPC-21及MPC-11鼠腫瘤獲得的那些,可從Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA取得,以及可從American Type Culture Collection, Manassas, Virginia USA取得的SP-2細胞(及其衍生物,例如X-63-Ag8-653)。人類骨髓瘤及鼠-人類雜骨髓瘤細胞系亦已被描述用於人類單株抗體的製造(Kozbor等人,J Immunol
. 133(6):3001-3005 (1984);Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications;Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63)。
測定融合瘤細胞生長的培養基中是否產生對抗抗原的單株抗體。較佳地,藉由融合瘤細胞產生的單株抗體的結合特異性,是藉由免疫沉澱法或藉由體外結合檢測(例如,放射性免疫測定(RIA)或酶連接免疫吸附測定(ELISA))加以測定。此類技術及檢測為本領域習知的。結合親合力可藉由Munson,Anal Biochem
. 107(1):220-239 (1980)的Scatchard分析進行測定。
在辨識出具有想要的特異性、親和性及/或活性的融合瘤細胞後,這些殖株可利用標準方法(Goding,supra)藉由限制稀釋程序及生長加以次選殖。適於此目的培養基包含,例如,D-MEM或RPMI-1640培養基。此外,融合瘤細胞可生長於體內作為哺乳動物中的腫瘤。
藉由傳統免疫球蛋白純化程序像是,例如蛋白A-瓊脂糖、羥磷石灰層析、膠體電泳、透析或親合性層析,將由次殖株分泌的單株抗體從培養基、腹水(ascites fluid)或血清合適地分離。
可藉由免疫針對一抗原的適當的宿主動物產生抗體。在一實施例中,抗原為包括全長的C5的多肽。在一實施例中,抗原為包括C5的β鏈(序列辨識號: 40)的多肽。在一實施例中,抗原為包括C5的β鏈的MG1-MG2域(序列辨識號: 43)的多肽。在一實施例中,抗原為包括C5的β鏈的MG1域(序列辨識號: 41)的多肽。在一實施例中,抗原為包括對應於C5的β鏈位置19至180的胺基酸的區域之多肽。在一實施例中,抗原為包括對應於C5的β鏈位置33至124的胺基酸的區域之多肽。在一實施例中,抗原為包括至少一擇自於C5的β鏈(序列辨識號: 40)的胺基酸47-57、70-76及107-110的片段之多肽。在一實施例中,抗原為包括C5的β鏈的片段之多肽,其包括至少一擇自於Thr47、Glu48、Ala49、Phe50、Asp51、Ala52、Thr53、Lys57、His70、Val71、His72、Ser74、Glu76、Val107、Ser108、Lys109及His110所組成之群組的胺基酸。在一實施例中,抗原為包括C5的β鏈的片段之多肽,其包括至少一擇自於Glu48、Asp51、His70、His72、Lys109及His110所組成之群組的胺基酸。本發明亦包含藉由免疫針對上述抗原的動物所產生之抗體。抗體可單一地或組合地合併任一特徵,如上“示例性抗C5抗體”所述。
C. 測定
可藉由本領域習知的多種測定法辨識、篩選或表徵本文提供之抗C5抗體的物理/化學性質及/或生物活性。
1. 結合測定及其它測定
在一態樣中,例如,藉由習知方法,像是ELISA、西方點墨、BIACORE®
等,針對其抗原結合活性測試本發明的抗體。
在另一態樣中,可使用競爭測定以辨識與本文所述的抗C5抗體競爭結合至C5的抗體。在一些特定的實施例中,當這類競爭抗體過量存在時,它阻礙(例如,降低)參考抗體對C5的結合至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或更多。在一些例子中,結合被抑制至少80%、85%、90%、95%或更多。在一些特定的實施例中,這類競爭抗體結合至與被本文所述的抗C5抗體(例如,如表2所述之抗體)結合的相同的抗原決定基(例如,線性或構象抗原決定基)。用於定位抗體結合的抗原決定基之詳細示例性方法在Morris,“Epitope Mapping Protocols,” inMethods in Molecular Biology
vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) (1996)中提供。
在一示例性競爭測定中,固定的C5培養於一溶液中,其包括結合至C5的第一標記(參考)之抗體,以及經測試其與第一抗體競爭結合至C5的能力的第二未標記之抗體。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為控制組,固定的C5培養於包括第一標記之抗體但不包括第二標記之抗體的溶液中。在允許第一抗體結合至C5的條件下培養後,移除過量未結合的抗體,以及測量與固定的C5結合的標記量。若相對於控制組樣品,在測試樣品中與固定的C5結合的標記量實質上減少,那麼其表示第二抗體與第一抗體競爭結合至C5。請參照,Harlow及Lane,Antibodies: A Laboratory Manual
ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1988)。
在另一示例性競爭測定中,使用BIACORE®
分析藉由第二(參考)抗C5抗體以判定測試的抗C5抗體競爭結合至C5的能力。在又一態樣中,根據廠商的建議操作BIACORE®器材(例如,BIACORE® 3000),利用習知的標準技術將C5蛋白捕捉於CM5 BIACORE®晶片上,以製造C5被覆的表面。一般200至800共振單位的C5會連接至晶片(該量給予簡單可測量程度的結合,但可容易地由所使用的測試抗體的濃度飽和)。待評估它們彼此競爭的能力的兩種抗體(即,測試及參考抗體)以1:1的摩爾比例的結合位置在合適的緩衝液中混合以產生測試混合液。當在結合位置的基礎上計算濃度時,測試或參考抗體的分子量被假設為對應的抗體的總分子量除以該抗體上C5結合位置的數量。測試混合液中每種抗體(即,測試及參考抗體)的濃度應足夠高以容易地使捕捉於BIACORE®
晶片上的C5分子上抗體的結合位置飽和。混合液中的抗體具有相同的摩爾濃度(在結合基礎上),通常是在1.00及1.5微摩爾之間(在結合位點的基礎上)。亦製備包含單獨的測試抗體及單獨的參考抗體的不同溶液。在這些溶液中的測試抗體及參考抗體應在與測試混合液相同的緩衝液中以及在相同的濃度及條件下。使包含測試抗體及參考抗體的測試混合液通過C5被覆的BIACORE®
晶片上,並記錄結合的總量。接著以去除結合的測試或參考抗體而不破壞晶片結合的C5之方式處理晶片。通常,這藉由30 mM的HCl處理晶片60秒加以完成。然後使單獨測試抗體的溶液通過C5被覆的表面上,且記錄結合量。再次處理晶片以去除所有的結合抗體而不破壞晶片結合的C5。接著使單獨參考抗體的溶液通過C5被覆的表面上,且記錄結合量。接著計算測試抗體及參考抗體的混合液的最大理論結合,其是當僅通過C5表面時,每種抗體(及,測試及參考)的結合的總和。若實際記錄的混合液結合少於此理論最大值,那麼測試抗體及參考抗體彼此競爭與C5結合。因此,一般而言,競爭測試抗C5抗體在上述BIACORE®
阻斷測定中結合至C5,使得在測定期間及在參考抗C5抗體的存在下,記錄的結合是最大理論結合的80%及0.1%之間(例如,80%至4%),具體地是在最大理論結合的75%及0.1%之間(例如,75%至4%),更具體地是組合的測試及參考抗體的最大理論結合(如上定義)的70%及0.1%之間(例如70%至4%)。
在一些特定的實施例中,本發明的抗C5抗體與包括擇自於抗體CFA0341及CFA0330的VH及VL對的抗體競爭結合C5。在一些實施例中,抗C5抗體與擇自於: CFA0538、CFA0501、CFA0599、CFA0307、CFA0366、CFA0675、及CFA0672的抗體競爭結合C5。在一些實施例中,抗C5抗體與抗體CFA0329競爭結合C5。在一些實施例中,抗C5抗體與抗體CFA0666競爭結合C5。
在一些特定的實施例中,本發明的抗C5抗體與包括抗體CFA0305或305LO5的VH及VL對的抗體競爭結合C5。
在又一些實施例中,相較於酸性pH,抗C5抗體在中性pH以較高親和性結合至C5。在一些特定的實施例中,本發明的抗C5抗體與包括擇自於:CFA0538、CFA0501、CFA0599、CFA0307、CFA0366、CFA0675及CFA0672的VH及VL對的抗體競爭結合C5。在一些實施例中,抗C5抗體與抗體CFA0666競爭結合C5。在又一些實施例中,相較於在pH5.8,抗C5抗體在pH7.4以較高親和性結合至C5。
在又一些實施例中,相較於酸性pH,抗C5抗體在中性pH以較高親和性結合至C5。在一些特定的實施例中,本發明的抗C5抗體與包括抗體CFA0305或305LO5的VH及VL對的抗體競爭結合C5。在又一些實施例中,相較於在pH5.8,抗C5抗體在pH7.4以較高親和性結合至C5。
在一些特定的實施例中,本發明的抗C5抗體與包括擇自於序列辨識號:22的VH及序列辨識號:26的VL、或序列辨識號:21的VH及序列辨識號:25的VL的VH及VL對之抗體競爭結合C5。在一些實施例中,抗C5抗體與包括擇自於:(a) 序列辨識號:5的VH及序列辨識號:15的VL;(b) 序列辨識號:4的VH及序列辨識號:14的VL;(c) 序列辨識號:6的VH及序列辨識號:16的VL;(d) 序列辨識號:2的VH及序列辨識號:12的VL;(e) 序列辨識號:3的VH及序列辨識號:13的VL;(f) 序列辨識號:1的VH及序列辨識號:11的VL;(g) 序列辨識號:9的VH及序列辨識號:19的VL;(h) 序列辨識號:7的VH及序列辨識號:17的VL;及(i) 序列辨識號:8的VH及序列辨識號:18的VL的VH及VL對之抗體競爭結合C5。在一些實施例中,抗C5抗體與包括序列辨識號:23的VH及序列辨識號:27的VL的抗體競爭結合C5。在一些實施例中,抗C5抗體與包括序列辨識號:7的VH及序列辨識號:17的VL的抗體競爭結合C5。
在一些特定的實施例中,本發明的抗C5抗體與包括擇自於:(a) 序列辨識號:1的VH及序列辨識號:11的VL;(b) 序列辨識號:22的VH及序列辨識號:26的VL;(c) 序列辨識號:21的VH及序列辨識號:25的VL;(d) 序列辨識號:5的VH及序列辨識號:15的VL;(e) 序列辨識號:4的VH及序列辨識號:14的VL;(f) 序列辨識號:6的VH及序列辨識號:16的VL;(g) 序列辨識號:2的VH及序列辨識號:12的VL;(h) 序列辨識號:3的VH及序列辨識號:13的VL;(i) 序列辨識號:9的VH及序列辨識號:19的VL;(j) 序列辨識號:7的VH及序列辨識號:17的VL;(k) 序列辨識號:8的VH及序列辨識號:18的VL;(l) 序列辨識號:23的VH及序列辨識號:27的VL;及(m) 序列辨識號:10的VH及序列辨識號:20的VL的VH及VL對之抗體競爭結合C5。
在一些特定的實施例中,本發明的抗C5抗體與包括擇自於:(a) 序列辨識號:22的VH及序列辨識號:26的VL;(b) 序列辨識號:21的VH及序列辨識號:25的VL;(c) 序列辨識號:5的VH及序列辨識號:15的VL;(d) 序列辨識號:4的VH及序列辨識號:14的VL;(e) 序列辨識號:6的VH及序列辨識號:16的VL;(f) 序列辨識號:2的VH及序列辨識號:12的VL;(g) 序列辨識號:3的VH及序列辨識號:13的VL;(h) 序列辨識號:9的VH及序列辨識號:19的VL;(i) 序列辨識號:7的VH及序列辨識號:17的VL;(j) 序列辨識號:8的VH及序列辨識號:18的VL;(k) 序列辨識號:23的VH及序列辨識號:27的VL的VH及VL對之抗體競爭結合C5。
在一些特定的實施例中,本發明的抗C5抗體與包括擇自於序列辨識號:1的VH及序列辨識號:11的VL、或序列辨識號:10的VH及序列辨識號:20的VL的VH及VL對之抗體競爭結合C5。
在又一些實施例中,相較於酸性pH,抗C5抗體在中性pH以較高親和性結合至C5。在一些特定的實施例中,抗C5抗體在中性pH比在酸性pH以較高親和性結合至C5,且與包括擇自於:(a) 序列辨識號:1的VH及序列辨識號:11的VL;(b) 序列辨識號:5的VH及序列辨識號:15的VL;(c) 序列辨識號:4的VH及序列辨識號:14的VL;(d) 序列辨識號:6的VH及序列辨識號:16的VL;(e) 序列辨識號:2的VH及序列辨識號:12的VL;(f) 序列辨識號:3的VH及序列辨識號:13的VL;(g) 序列辨識號:9的VH及序列辨識號:19的VL;(h) 序列辨識號:7的VH及序列辨識號:17的VL;(i) 序列辨識號:8的VH及序列辨識號:18的VL;及(j) 序列辨識號:10的VH及序列辨識號:20的VL的VH及VL對之抗體競爭結合C5。在又一些實施例中,相較於在pH5.8,抗C5抗體在pH7.4以較高親和性結合至C5。
在一些實施例中,抗C5抗體在中性pH比在酸性pH以較高親和性結合至C5,且與包括擇自於:(a) 序列辨識號:5的VH及序列辨識號:15的VL; (b) 序列辨識號:4的VH及序列辨識號:14的VL;(c) 序列辨識號:6的VH及序列辨識號:16的VL;(d) 序列辨識號:2的VH及序列辨識號:12的VL;(e) 序列辨識號:3的VH及序列辨識號:13的VL;(f) 序列辨識號:1的VH及序列辨識號:11的VL;(g) 序列辨識號:9的VH及序列辨識號:19的VL;(h) 序列辨識號:7的VH及序列辨識號:17的VL;及(i) 序列辨識號:8的VH及序列辨識號:18的VL的VH及VL對之抗體競爭結合C5。在又一些實施例中,相較於在pH5.8,抗C5抗體在pH7.4以較高親和性結合至C5。
在一些實施例中,抗C5抗體在中性pH比在酸性pH以較高親和性結合至C5,且與包括擇自於:序列辨識號:1的VH及序列辨識號:11的VL、或序列辨識號:10的VH及序列辨識號:20的VL的VH及VL對之抗體競爭結合C5。在又一些實施例中,相較於在pH5.8,抗C5抗體在pH7.4以較高親和性結合至C5。
在一些特定的實施例中,本發明的抗C5抗體是否結合至特定的抗原決定基可如下測定:在293細胞中表達C5上的胺基酸(丙胺酸除外)被丙胺酸取代之C5點突變體,且藉由ELISA、西方點墨或BIACORE®
測試抗C5抗體對C5突變體的結合;其中相較於其對野生型C5的結合,抗C5抗體對C5突變體的實質上降低或消失的結合代表抗C5抗體結合至包括C5上的那個胺基酸的抗原決定基。在一些特定的實施例中,C5上將被丙胺酸取代的胺基酸擇自由C5(序列辨識號:40)的β鏈的Glu48、Asp51、His70、His72、Lys109及His110所組成之群組。在又一些實施例中,C5上將被丙胺酸取代的胺基酸為C5(序列辨識號:40)的β鏈的Asp51或Lys109。
在另一實施例中,具有pH依賴性結合特性的抗C5抗體是否結合至特定的抗原決定基可如下測定:在293細胞中表達C5上的組胺酸殘基被另一胺基酸(例如,酪胺酸)取代之C5點突變體,且藉由ELISA、西方點墨或BIACORE®
測試抗C5抗體對C5突變體的結合;其中相較於其在酸性pH下對C5突變體的結合,抗C5抗體在酸性pH下對野生型C5的實質上降低的結合代表抗C5抗體結合至包括C5上的那個組胺酸殘基的抗原決定基。在又一些實施例中,相較於其在中性pH下對C5突變體的結合,抗C5抗體在中性pH下對野生型C5的結合實質上未降低。在一些特定的實施例中,C5上將被另一胺基酸取代之組胺酸殘基擇自由C5(序列辨識號:40)的β鏈的His70、His72及His110所組成之群組。在又一實施例中,組胺酸殘基His70被酪胺酸取代。
2. 活性測定
在一樣態中,提供測定以辨識關於抗C5抗體具有的生物活性。生物活性可包含,例如,抑制C5的活化、防止C5的裂解以形成C5a及C5b、阻礙C5轉化酶接近C5上的裂解位置、阻礙由C5的活化所導致的溶血活性等。亦提供於體內及/或體外具有這類生物活性的抗體。
在一些特定的實施例中,測試本發明的抗體的這類生物活性。
在一些特定的實施例中,測試抗體是否抑制C5裂解成C5a及C5b是由如,例如Isenman等人,J Immunol
. 124(1):326-331 (1980)中所述的方法測定。在另一實施例中,這是藉由特異性偵測裂解的C5a及/或C5b蛋白的方法,例如ELISA或西方點墨進行測定。在測試抗體存在(或與測試抗體接觸之後)而偵測到C5的裂解產物(C5a及/或C5b)的量減少的情況下,該測試抗體被認定為可抑制C5的裂解的抗體。在一些特定的實施例中,C5a的濃度及/或生理活性可藉由,例如,趨化測定、RIA或ELISA之方法進行測量(請參照,例如Ward及ZvaiflerJ. Clin. Invest.
50(3):606-616 (1971))。
在一些特定的實施例中,測試抗體是否阻礙C5轉化酶接近C5是由用以偵測C5轉化酶及C5之間的蛋白相互作用之方法測定,例如,ELISA或BIACORE®
。在測試抗體存在(或與測試抗體接觸之後)而相互作用減少的情況下,該測試抗體被認定為可阻礙C5轉化酶接近C5的抗體。
在一些特定的實施例中,C5活性可測量為,它在對象的體液中的細胞溶解能力的函數。可藉由本領域習知的方法,例如,常規的溶血測定,像是Kabat及Mayer(編輯),Experimental Immunochemistry, 2nd Edition, 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), pages 135-139所述的溶血測定、或該測定的常規變異,像是如Hillmen等人(2004),N. Engl. J. Med
. 350(6): 552-559 (2004)中描述的雞紅血球溶血方法,測量C5的細胞溶解能力或其下降。在一些特定的實施例中,利用CH50eq測定定量C5活性或其抑制。CH50eq測定是用於測量血清中的總經典補體活性的方法。此測試為細胞溶解測定(lytic assay),其利用抗體敏化的紅血球作為經典補體途徑的活化劑,並使用測試血清的多種稀釋以判斷得到50%細胞溶解(CH50)所需的量。溶血的百分比可,例如使用分光光度計,加以測定。CH50eq測定提供末端補體複合物(TCC)形成的間接測量,由於TCC本身直接地負責測量到的溶血。C5活化的抑制亦可使用操作實施例中例舉及示例的方法進行偵測及/或測量。利用這些或其它類型的測定,能夠抑制C5的活化的候選抗體可被篩選。在一些特定的實施例中,相較在相似條件下負控制組的效果,C5活化的抑制包含在測定中至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%、或更多C5活性的減少。在一些實施例中,其代表抑制至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%、或更多的C5活化。
D. 免疫偶聯物
本發明亦提供免疫偶聯物,其包括本文之抗C5抗體偶聯至一或多個細胞毒性劑,例如,化療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如,細菌、真菌、植物或動物來源的蛋白毒素、酶活性毒素、或其片段)或放射性同位素。
在一實施例中,免疫偶聯物是抗體-藥物偶聯物(ADC),其中抗體與一或多種藥物偶聯,包含但不限於美登木素生物鹼(maytansinoid)(請參照,美國專利號5,208,020、5,416,064及歐洲專利EP 0 425 235 B1);auristatin例如單甲基auristatin藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(請參照,美國專利號5,635,483及5,780,588及7,498,298);尾海兔素 (dolastatin);加利車黴素(calicheamicin)或其衍生物(請參照,美國專利號5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001及5,877,296;Hinman等人,Cancer Res.
53:3336-3342 (1993);及Lode等人,Cancer Res.
58:2925-2928 (1998));蒽環類抗生素例如道諾黴素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(請參照Kratz等人,Current Med. Chem.
13:477-523 (2006);Jeffrey等人,Bioorganic & Med. Chem. Letters
16:358-362 (2006) ;Torgov 等人,Bioconj. Chem.
16:717-721 (2005);Nagy等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
97:829-834 (2000);Dubowchik等人,Bioorg. & Med. Chem. Letters
12:1529-1532 (2002);King等人,J. Med. Chem.
45:4336-4343 (2002);及美國專利號6,630,579);甲氨蝶呤;長春地辛(vindesine);紫杉烷(taxane)例如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、Iarotaxel、tesetaxel、及ortataxe;單端孢黴素(trichothecene);及CC1065。
在另一實施例中,免疫偶聯物包括如本文所述的抗體偶聯至酶活性毒素或其片段,其包含但不限於白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲毒蛋白(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒蛋白(gelonin)、米托黴素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)和單端孢黴素(trichothecene)。
在另一實施例中,免疫偶聯物包括本文所述的抗體偶聯至放射性原子以形成放射性偶聯物。多種放射性同位素可用於製造放射性偶聯物。例子包含At211
, I131
, I125
, Y90
, Re186
, Re188
, Sm153
, Bi212
, P32
, Pb212
及Lu的放射性同位素。在使用放射性偶聯物進行檢測時,它可包括供閃爍法研究用的放射性原子,例如tc99m或I123,或供核磁共振(NMR)成像(又稱為磁共振成像,mri)用的自旋標記物,例如再次的碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可使用多種雙功能蛋白偶合劑以形成抗體及細胞毒劑的偶聯物,例如N-琥珀醯亞氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞氨基-4-(N-馬來醯亞氨基甲基)環己烷-I-羧酸酯(SMCC)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(例如鹽酸己二醯亞氨酸二甲酯)的雙功能衍生物、活性酯類(例如辛二酸二琥珀醯亞氨基酯)、醛類(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(例如雙(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如,可以如Vitetta等人,Science
238:1098 (1987)中所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苄基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於將放射性核苷酸與抗體偶聯的示例性螯合劑。請參照WO94/11026。連接子(linker)可為有利於在細胞中釋放細胞毒性藥物的“可切割連接子”。例如,可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫化物連接子(Chari等人,Cancer Res.
52:127-131 (1992);美國專利號5,208,020)。
本文的免疫偶聯物或ADC明確設想,但不限於用交聯劑製備的此類偶聯物,所述交聯劑包含但不限於 BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、及sulfo-SMPB,及SVSB(琥珀醯亞氨基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯),其為市售的(例如,取自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)。
E. 用於診斷及偵測的方法及組合物
在一些特定的實施例中,本文提供之任一抗C5抗體對偵測C5在生物樣品中的存在是有用的。用詞“偵測”,如本文所使用,涵蓋定量或定性偵測。在一些特定的實施例中,生物樣品包括細胞或組織,例如血清、全血液、血漿、切片樣品、組織樣品、細胞懸浮液、唾液、痰、口腔液、腦脊髓液、羊膜液、腹水、乳汁、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿液、汗、淚液、胃液、關節液、腹腔液、眼內液及黏液。
在一實施例中,提供用於診斷或偵測方法霧中的抗C5抗體。在又一態樣中,提供在生物樣品中偵測C5的存在的方法。在一些特定的實施例中,此方法包括在允許抗C5抗體結合至C5的條件下,使生物樣品與如本文所述之抗C5抗體接觸,以及偵測是否有複合物形成於抗C5抗體及C5之間。此種方法可為體外或體內的方法。在一實施例中,抗C5抗體被用以選擇適合抗C5抗體療法的對象,例如,在C5為用於患者的選擇之生物標記的情況下。
在一些特定的實施例中,提供標記的抗C5抗體。標記包含但不限於,直接被偵測的標記或部分(例如,螢光、發色、電子密集、化學發光及放射性標記),以及間接(例如藉由酶反應或分子相互作用)被偵測的部分,像是酶或配體。示例性標記包含但不限於,放射性同位素32
P、14
C、125
I、3
H及131
I、螢光團如稀土螯合物或螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯(dansyl)、傘形酮(umbellifeixme)、螢光素酶(luceriferase),例如,螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利號4,737,456)、螢光素(luciferin)、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶解酶、糖類氧化酶,例如,葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、雜環氧化酶如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶,結合利用過氧化氫以氧化染料前驅物的酶如HRP、乳過氧化酶、或微過氧化酶(microperoxidase)、生物素/親和素、自旋標記物、噬菌體標記、穩定的自由基等。
F. 醫藥配方
如本文所述的抗C5抗體的醫藥配方藉由將具有所需程度純度的這種抗體與一或多種可選的醫藥上可接受的載體(Remington's Pharmaceutical Sciences
16th edition, Osol, A. Ed. (1980))混合,以凍乾配方或水溶液的形式製備。醫藥上可接受的載體通常在所使用的劑量及濃度對接受者無毒,且包含但不限於:緩衝劑,如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其它有機酸;抗氧化劑,包含抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(如氯化十八烷基二甲基苄銨;氯化六羥季銨;苯紮氯銨;苄索氯銨;苯酚;丁醇或苄醇;對羥基苯甲酸烷酯,如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;及間甲酚);低分子量(小於約10個殘基)多肽;蛋白質,如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,如聚乙烯吡咯啶酮;胺基酸,如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸;單糖、雙糖和其它糖類,包含葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,如EDTA;糖類,如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成鹽平衡離子,如鈉;金屬複合體(例如Zn-蛋白質複合體);及/或非離子表面活性劑,如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性醫藥上可接受的載體尚包含藥物間質分散劑,如可溶性中性-活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如,人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白,如rHuPH20 (HYLENEX®
, Baxter International, Inc.))。特定的示例性sHASEGP及使用方法,包含rHuPH20,描述於美國專利公開號2005/0260186及2006/0104968中。在一態樣中,sHASEGP與一或多種額外的葡糖胺聚糖酶,例如軟骨素酶,組合。
示例性凍乾的抗體配方描述於美國專利號6,267,958中。水溶液抗體配方包含描述於美國專利號6,171,586及WO 2006/044908中的那些,後者配方包含組胺酸-醋酸鹽緩衝液。
本文的配方亦可包含多於一種的活性成分,若為被治療的特定適應症所需,較佳地具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。此種活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。
可將活性成分截留於例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合所製備的微膠囊中,例如,羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊,分別地,在膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或在粗滴乳狀液中。這類技術揭露於Remington's Pharmaceutical Sciences
16th edition, Osol, A. Ed. (1980)中。
可製備持續釋放配方。持續釋放配方的合適例子包含含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質,所述基質呈成形物品,例如薄膜或微膠囊形式。
將被用於體內施用的配方通常為無菌的。無菌可例如,藉由通過無菌過濾膜的過濾,而輕易地實現。
G.治療方法和組合物
本文提供的任一抗C5抗體可用於治療方法。
在一態樣中,提供用作藥物的抗C5抗體。在又一態樣中,提供用於治療疾病的抗C5抗體。在一些特定的實施例中,提供用於治療方法中的抗C5抗體。在一些特定的實施例中,本發明提供抗C5抗體,其用於治療具有疾病的個體的方法,所述方法包括對個體施用有效量的抗C5抗體。在這樣一實施例中,所述方法尚包括對個體施用有效量的至少一種額外的治療劑。根據以上任一實施例的“個體”較佳為人類。
在又一態樣中,本發明提供抗C5抗體在生產或製備藥物中的用途。在一實施例中,藥物是用於疾病的治療。在又一實施例中,藥物是用於治療疾病的方法中,其包括向具有疾病的個體施用有效量的藥物。在這樣一實施例中,所述方法尚包括對個體施用有效量的至少一種額外的治療劑。根據以上任一實施例的“個體”較佳為人類。
在又一態樣中,本發明提供用於治療疾病的方法。在一實施例中,方法包括向具有所述疾病的個體施用有效量的抗C5抗體。在這樣一實施例中,所述方法尚包括對個體施用有效量的至少一種額外的治療劑。根據以上任一實施例的“個體”較佳為人類。
在又一態樣中,本發明提供醫藥配方,其包括任一本文提供的抗C5抗體,例如,用於任一以上的治療方法。在一實施例中,醫藥配方包括任一本文提供的抗C5抗體及醫藥上可接受的載體。在另一實施例中,醫藥配方包括任一本文提供的抗C5抗體以及至少一種額外的治療劑。
在又一態樣中,醫藥配方是用於疾病的治療。在一實施例中,醫藥配方被施用於具有疾病的個體。根據以上任一實施例的“個體”較佳為人類。
在又一態樣中,本發明提供用於製備藥物或醫藥配方的方法,包括將本文提供的任一抗C5抗體與醫藥上可接受的載體混合,例如,使用於以上任一治療方法中。在一實施例中,用於製備藥物或醫藥配方的方法更包括添加至少一種額外的治療劑至藥物或醫藥配方中。
在治療中,本發明的抗體可被單獨使用或與其它試劑組合使用。例如,本發明的抗體可與至少一種額外的治療劑共同施用(co-administered)。
如上述這樣的組合療法包含組合施用(其中兩種或更多的治療劑被包含在相同或分開的配方中),及分別施用,在這情況下,本發明的抗體的施用可以發生在額外的治療劑及/或試劑的施用前、同時及/或之後。在一實施例中,抗C5抗體的施用及額外治療劑的施用在約一個月內,或約一、二或三個星期內,或約一、二、三、四、五或六天內彼此發生。
本發明的抗體(以及任一額外的治療劑)可藉由任何合適的方法施用,包含腸胃外施用、肺內施用及鼻內施用,並且,若局部治療需要,病變內施用。腸胃外輸注包含肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定,可藉由任何適合途徑,例如藉由注射,例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程,包含但不限於,單次施用或在多個時間點多次施用、推注施用及脈衝輸注。
本發明的抗體將以與良好醫療實踐相符的方式進行配方、配量及施用。在此背景下考慮的因素包含待治療的特定病症、待治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床狀態、病症的原因、遞送試劑的位置、施用方法、施用時間安排、及醫療從業者已知的其它因素。抗體不需要、但可選地,與目前用於預防或治療問題病症的一或多種試劑一起配製。其它試劑的有效量取決於配方中存在的抗體量、病症或治療的類型、及以上討論的其它因素。這些一般以相同劑量,及使用如本文所述的施用途徑,或以本文所述的劑量的約1至99%,或以藉由經驗/臨床確定合適的任一劑量及任一途徑加以使用。
為了疾病的預防或治療,本發明的抗體的合適劑量(當單獨或與一或多種其它額外的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的種類、疾病的嚴重性及進程、抗體是以預防或治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對抗體的反應、及主治醫師的判斷。抗體以一次性治療或經過一系列治療合適地施用於患者。根據疾病的類型及嚴重性,約1 μg/kg至15 mg/kg(例如,0.l mg/kg-10mg/kg)的抗體可為用於對患者施用的最初候選劑量,無論,例如,藉由一次或多次分別施用,或藉由連續輸注。一典型的每日劑量可在約1 μg/kg至100mg/kg或更多的範圍內,其取決於上文提及的因素。為了重複施用數日或更久,根據病症,通常將持續治療直至出現疾病症狀的理想抑制。抗體的一示例性劑量應為約0.05mg/kg-約10mg/kg的範圍內。因此,約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg (或其任意組合)的一或多個劑量可施用於患者。這樣的劑量可間隔地,例如每週或每三周施用(例如,以使得患者接受約2至約20,或例如約6個劑量的抗體)。可施用最初較高的負荷劑量,接著是一或多個較低的劑量。此療法的進展可藉由常規方法及測定容易進行監測。
應理解的是,上述任一配方或治療方法可利用本發明的免疫偶聯物以替代或添加至抗C5抗體加以實行。
F.製品
在本發明的另一態樣中,提供一種製品,其包含可用於治療、預防及/或診斷上述病症的材料。製品包括容器及於容器上或與容器結合的標籤或藥品仿單(package insert)。適合的容器包含,例如,瓶子、小瓶、注射器、IV溶液包等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。容器裝有組合物,所述組合物是單獨地或與可有效用於治療、預防及/或診斷病症的另一組合物結合,對於症狀的治療有效的組合物,且可具有無菌的存取口(例如,容器可具有可被皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中至少一活性試劑為本發明的抗體。標籤或藥品仿單標明組合物是用於治療特定的病症。此外,所述製品可包含(a)包含組合物於其中的第一容器,其中組合物包括本發明的抗體;及(b)包含組合物於其中的第二容器,其中組合物包括另外的細胞毒性劑或其它的治療劑。在本發明的此實施例中的製品,可更包括標明組合物可用於治療特定症狀的藥品仿單。替代地或額外地,製品可更包括第二(或第三)容器,其包括醫藥上可接受的緩衝劑,如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer氏溶液及葡萄糖溶液。從商業及用戶立場,它尚可包涵所需的其它材料,包含其它緩衝劑、稀釋劑、濾膜、針頭及注射器。
應理解的是,上述任一製品可包含本發明的免疫偶聯物以替代或添加至抗C5抗體。
實施例
以下是本發明的方法及組合物的例子。應理解的是,根據以上提供的一般性描述,可實施多種其它的實施例。
實施例1
C5的製備
1.1. 重組的人類及恆河猴C5的表達及純化
利用FreeStyle293-F細胞系(Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA)短暫地表達重組的人類C5(NCBI GenBank存取編號: NP_001726.2,SEQ ID NO: 39)。表達人類C5的條件培養基以相等體積的milliQ水被稀釋,接著使用於Q-sepharose FF或Q-sepharose HP陰離子交換管柱(GE healthcare, Uppsala, Sweden),然後以NaCl梯度洗提。收集包含人類C5的級分,接著調整鹽濃度及pH分別至80mM NaCl以及pH6.4。將得到的樣品使用於SP-sepharose HP陽離子交換管柱(GE healthcare, Uppsala, Sweden),並以NaCl梯度洗提。收集包含人類C5的級分,並施加於CHT陶瓷羥磷石灰管柱(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)。接著將人類C5洗提液使用於Superdex 200膠體過濾管柱(GE healthcare, Uppsala, Sweden)。收集包含人類C5的級分並儲存於-150℃。
重組的恆河猴C5(NCBI GenBank 存取編號: XP_005580972,SEQ ID NO: 44)的表達及純化以與人類部分相同之方式實行。
1.2. 從血漿純化恆河猴C5(cynoC5)
將來自恆河猴的血漿樣品使用於SSL7-瓊脂糖(Invivogen, San Diego, CA, USA),接著以100mM醋酸鈉,pH3.5,洗提。包含cynoC5的級分立即被中和且一前一後地施加於蛋白質A HP管柱(GE healthcare, Uppsala, Sweden)以及肽M瓊脂糖(Invivogen, San Diego, CA, USA)。接著將流經的級分使用於Superdex 200膠體過濾管柱(GE healthcare, Uppsala, Sweden)。收集包含cynoC5的級分並儲存於-80℃。
實施例2
抗C5抗體的生產
2.1. 抗體篩選
以下列方式製備、選擇及測定抗C5抗體:
以人類C5及/或猴C5(50-100 µg/劑量/兔)皮內地免疫12至16周大的NZW兔。在2個月的期間重複此劑量4-5次。在最後的免疫的一星期後,收集經免疫的兔子的脾臟及血液。抗原特異性的B細胞被標記抗原染色,並被FCM細胞分類器分類(FACS aria III, BD),以1個細胞/孔的密度與25,000個細胞/孔的EL4細胞一起分盤於96孔盤中(European Collection of Cell Cultures),以及將活化的兔子T細胞條件培養基稀釋20倍,並培養7-12天。預先以絲裂黴素C(Sigma, Cat No. M4287)處理EL4細胞2小時並清洗3次。藉由培養兔子胸腺細胞於包含植物血球凝集素-M(Roche, Cat No. 1 1082132-001)、佛波醇12-肉荳蔻酸酯13-乙酸酯(Sigma, Cat No. P1585)及2% FBS的RPMI-1640中以製備兔子T細胞條件培養基。在培養後,收集B細胞培養上清液供進一步分析,以及冷凍保存沉澱物(pellet)。
使用ELISA測定以測試B細胞培養上清液中抗體的特異性。以50nM的PBS將被覆生物素(GeneScript, Cat No. Z02043)於384孔MAXISorp (Nunc, Cat No. 164688)上,放置常溫1小時。接著以稀釋5倍的Blocking One (Nacalai Tesque, Cat No. 03953-95)阻斷盤。以NHS-PEG4-Biotin (PIERCE, Cat No. 21329)標記人類或猴子C5,並添加至經阻斷的ELISA盤,培養1小時並清洗。將B細胞培養上清液加至ELISA盤,培養1小時並清洗。藉由山羊的抗-兔子IgG-辣根過氧化酶(BETHYL, Cat No. A120-111P)接著加入ABTS (KPL, Cat No. 50-66-06)偵測結合。
使用ELISA測定以評估抗體對C5的pH依賴性結合。將經PBS(-)稀釋至1 µg/ml的山羊抗-兔子IgG-Fc(BETHYL, Cat No. A120-111A)加至384孔MAXISorp (Nunc, Cat No. 164688),於室溫下培養1小時,並以稀釋5倍的Blocking One (Nacalai Tesque, Cat No. 03953-95)進行阻斷。在培養後,清洗盤並加入B細胞培養上清液。將盤培養1小時、清洗,並加入500pM生物素化的人類或猴子C5且培養1小時。在培養後,清洗盤並以pH7.4 MES緩衝液(20 mM MES、150 mM NaCl及1.2 mM CaCl2
)或pH5.8 MES緩衝液(20 mM MES、150 mM NaCl及1 mM EDTA)於室溫下培養1小時。在培養後,藉由生物素-辣根過氧化酶偶聯物(Thermo Scientific, Cat No. 21132)接著加入ABTS (KPL, Cat No. 50-66-06)以偵測生物素化C5的結合。
使用Octet RED384系統(Pall Life Sciences)以評估抗體對C5的親和性及pH依賴性結合。將B細胞培養上清液分泌的抗體承裝於蛋白質A生物感測探針(Pall Life Sciences)上,並浸至50nM在pH7.4 MES緩衝液中的人類或猴子C5,以分析結合動力學。解離動力學在pH7.4 MES緩衝液以及pH5.8 MES緩衝液皆進行分析。
總共篩選41,439個B細胞系對人類或猴子C5的親和性及pH依賴性結合,677個系被選擇且指定為CFA0001- 0677。使用ZR-96 Quick-RNA套組(ZYMO RESEARCH, Cat No. R1053)將選擇的細胞系的RNA從冷凍保存沉澱物中加以純化。藉由反轉錄PCR將選擇的細胞系中編碼抗體重鏈可變區的DNA放大,並與編碼F760G4 (序列辨識號:33)或F939G4 (序列辨識號:34)重鏈恆定區的DNA重組。藉由反轉錄PCR將編碼抗體輕鏈可變區的DNA放大,並與編碼k0MTC輕鏈恆定區 (序列辨識號:36)的DNA重組。分別地,合成已存在的人源化抗C5抗體的重鏈及輕鏈基因,eculizumab(EcuH-G2G4,序列辨識號:29及EcuL-k0,序列辨識號:30)。將編碼VH的DNA(EcuH,序列辨識號:31)框架內地(in-frame)融合至編碼經修飾的人類IgG4 CH的DNA(F760G4,序列辨識號:33),以及將編碼VL的DNA(EcuL,序列辨識號:32)框架內地(in-frame)融合至編碼k0輕鏈恆定區的DNA(序列辨識號:37)。將各個融合的編碼序列轉殖到表達載體中。在FreeStyle™ 293-F細胞(Invitrogen)中表達抗體,並且從培養上清液中純化以評估功能活性。使用如實施例5.1所述的脂質體細胞溶解測定,藉由測試補體活性的抑制評估抗體的中和活性。
2.2. 藉由三明治ELISA進行抗原決定基分格
選擇具有高親和性、pH依賴性或中和活性的抗C5抗體用於進一步分析。使用三明治ELISA測定將選擇的抗體分類至不同的抗原決定基分格中,其結合至C5蛋白的相同或重疊的抗原決定基。將未標記的捕捉抗體以PBS(-)稀釋至1 µg/ml,並加入384孔MAXISorp盤(Nunc, Cat No. 164688)中。將盤在室溫下培養1小時,並以稀釋5倍的Blocking One (Nacalai Tesque, Cat No. 03953-95)進行阻斷。將盤培養1小時、清洗,以及加入2nM的人類C5並培養1小時。在培養後,清洗盤且加入標記的偵測抗體(1µg/mL,藉NHS-PEG4-Biotin生物素化)。在1小時培養後,藉由生物素-辣根過氧化酶偶聯物(Thermo Scientific, Cat No. 21132)接著加入ABTS (KPL, Cat No. 50-66-06)以偵測生物素化抗體的結合。
所有的抗C5抗體被用作捕捉抗體以及偵測抗體,且全面地配對。如第1圖所示,相互競爭的抗體被分類至7個抗原決定基分格:CFA0668、CFA0334及CFA0319被分至抗原決定基A中,CFA0647、CFA0589、CFA0341、CFA0639、CFA0635、CFA0330及CFA0318被分至抗原決定基B中,CFA0538、CFA0501、CFA0599、CFA0307、CFA0366、CFA0305、CFA0675、CFA0666及CFA0672被分至抗原決定基C中,eculizumab及CFA0322被分至抗原決定基D中,CFA0329被分至抗原決定基E中,CFA0359及CFA0217被分至抗原決定基F中,以及CFA0579、CFA0328及CFA0272被分至抗原決定基G中。第1圖顯示抗C5嵌合抗體的一些抗原決定基分格。表2列出被分類至抗原決定基C的抗C5抗體的VH及VL的序列。
表2
分類至抗原決定基C的抗C5抗體
2.3. 人源化及最適化
為了降低抗體的潛在免疫源性,實行抗C5抗體的一些可變區的人源化。藉由常規CDR移植(graft)方法(Nature
321:522-525 (1986))將抗C5兔子抗體的互補決定區(CDR)移植到同源的人類抗體框架(FR)上。合成編碼人源化VH及VL的基因,且分別與經修飾的人類IgG4 CH (SG402,序列辨識號:35)及人類CL (SK1,序列辨識號:38)重組,並將各個重組序列轉殖於表達載體中。
檢測一些突變及突變組合以辨識改善了一些先導抗體的結合特性的突變及突變組合。接著引入多個突變至人源化可變區,以加強在中性pH對C5的結合親和性、或以降低在酸性pH對C5的結合親和性。最適化變異體的其中之一,305LO5(VH,序列辨識號:10;VL,序列辨識號:20;HVR-H1,序列辨識號:54;HVR-H2,序列辨識號:64;HVR-H3,序列辨識號:74;HVR-L1,序列辨識號:84;HVR-L2,序列辨識號:94;及HVR-L3,序列辨識號:104),因而從CFA0305產生。
抗體被表達於HEK293細胞中且藉由蛋白質A進行純化,所述HEK293細胞與重鏈及輕鏈表達載體的混合物共轉染(co-transfected)。
實施例3
抗C5抗體的結合特徵
3.1. 重組抗體的表達及純化
使用FreeStyle293-F細胞系(Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA)短暫地表達重組抗體。利用常規方法使用蛋白質A從表達抗體的條件培養基實行純化。視需要進一步實施膠體過濾。
3.2. pH依賴性的評估
利用BIACORE®
T200儀器(GE Healthcare)在pH7.4及pH5.8下於37℃評估抗C5抗體對重組人類C5的動力學參數。使用胺偶合套組(GE Healthcare)根據GE Healthcare建議的設置,將ProA/G(Pierce)固定於CM4感測晶片上。將抗體及分析物稀釋於各自的電泳緩衝液中,ACES pH7.4及pH5.8 (20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2
、0.05% Tween 20、0.005% NaN3
)。各個抗體被ProA/G捕捉於感測表面上。抗體捕捉程度通常為60-90共振單位(RU)。接著,以10及20 nM或20及40 nM的濃度注射重組人類C5,接續為解離。利用25 mM NaOH再生表面。利用BIACORE®
T200 評估軟體,2.0版本(GE Healthcare)以1:1結合模型擬合(fit)感測圖,以測定在兩種pH條件下的動力學參數。第2A及2B圖顯示所有抗體的感測圖。表3列出抗體的結合速率(ka)、解離速率(kd)及結合親和性(KD)。除了CFA0330 (VH,序列辨識號:21及VL,序列辨識號:25)及A0341 (VH,序列辨識號:22及VL,序列辨識號:26)之外的所有抗體,相較在pH7.4,在pH 5.8顯示相對快的解離速率。
表3
在pH7.4及pH5.8的條件下,抗C5抗體的動力學參數
3.3. 交叉反應性檢查
為了觀測抗C5抗體對人類C5(hc5)及恆河猴C5(cynoC5)的交叉反應性,實行BIACORE®
動力學測定。測定的設置與實施例3.2所述相同,在2、10及50的nM的濃度下注射重組的cynoC5。藉由如實施例3.2所述相同的數據擬合測定動力學參數。t表4列出在pH7.4下的結合動力學及親和性。 表4顯示之針對hC5的動力學參數為實施例3.2的結果。除了CFA0672之外的所有抗C5抗體對於hC5及cynoC5顯示類似的KD。相較對於hC5,CFA0672對於cynoC5的KD弱8倍。
表4
抗C5抗體對hC5及cynoC5在pH7.4下的結合動力學及親和性
實施例4
抗C5抗體的抗原決定基定位
4.1. 抗C5 MAb對C5的β鏈衍生肽的結合
在西方點墨分析中測試抗C5單株抗體(MAb)對C5的β鏈衍生肽的結合。在E. coli
(DH5α, TOYOBO, DNA-903)中表達融合至GST標記(pGEX-4T-1, GE Healthcare Life Sciences, 28-9545-49)的C5肽:19-180、161-340、321-500及481-660。在以1 mM的異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)於37℃培養5小時,且在20000×g離心1分鐘以取得沉澱物之後,收集E. coli
樣品。以樣品緩衝溶液(2ME+) (Wako, 191-13272)使沉澱物懸浮,並用於西方點墨分析。以抗GST抗體(Abcam, ab9085)確認各個肽的表達(第3圖)。箭頭指示GST融合的(GST-fused)C5肽(46-49kDa)。抗C5 MAb: CFA0305、CFA0307、CFA0366、CFA0501、CFA0538、CFA0599、CFA0666、CFA0672及CFA0675,結合至C5的19-180(第3圖)。
4.2. 人類C5的MG1-MG2域(1-225)的表達及純化
利用FreeStyle293-F細胞系(Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA)短暫地表達人類C5的β鏈的重組的MG1-MG2域(序列辨識號: 43)。以1/2體積的milliQ水稀釋表達MG1-MG2域的條件培養基,接著使用於Q-瓊脂糖FF陰離子交換管柱(GE healthcare, Uppsala, Sweden)。調整從陰離子交換管柱流經的級分至pH 5.0,且使用於SP-瓊脂糖HP陽離子交換管柱(GE healthcare, Uppsala, Sweden)以及以NaCl梯度洗提。從洗提液收集包含MG1-MG2域的級分,且接著施加於以1x PBS平衡的Superdex 75膠體過濾管柱(GE healthcare, Uppsala, Sweden)。接著收集(pool)包含MG1-MG2域的級分並儲存於-80℃。
4.3. 對MG1-MG2域的結合能力
利用與實施例3.2所述相同的測定設置測量抗C5抗體對MG1-MG2域的結合能力,除了僅在pH7.4的條件下實行測量之外。在20 nM及40 nM的濃度下注射MG1-MG2域。如第4圖所示,除了eculizumab-F760G4之外的所有抗體顯示結合反應的增加,代表這些抗體為MG1-MG2結合者。Eculizumab-F760G4,已知為α鏈結合者,並未顯示對MG1-MG2域的結合。
4.4. 抗C5 MAb對C5 MG1-MG2域衍生肽的結合
在西方點墨分析中測試抗C5 Mab對MG1-MG2域衍生肽的結合。在E. coli
中表達融合至GST標記的C5肽:33-124、45-124、52-124、33-111、33-108及45-111(序列辨識號:40)。在以1 mM的IPTG於37℃培養5小時,且在20000×g離心1分鐘以取得沉澱物之後,收集E. coli
樣品。以樣品緩衝溶液(2ME+)使沉澱物懸浮,並用於西方點墨分析。以抗GST抗體確認C5衍生肽的表達(第5A圖)。CFA0305僅結合至33-124的肽(第5B圖)。CFA0305結合至重組的人類C5 (rhC5)(約70kDa)的β鏈,其用以作為控制組。第5C圖總結抗C5 MAb對C5衍生肽的反應。
4.5. 抗C5 MAb對C5突變體的結合
由於藉由晶體結構分析預測到C5的β鏈中的三個胺基酸殘基: E48、D51及K109,涉及C5及抗C5-MAb之間的結合,因此在西方點墨分析中分析C5 MAb對人類C5點突變體的結合。藉由脂質轉染(lipofection)在FS293細胞中表達C5點突變體,其中E48、D51及K109中的任一被丙胺酸取代。在脂質轉染5天後收集培養基,且之後用於西方點墨。在還原條件下實行SDS-PAGE,結果如第6圖所示。Eculizumab結合至野生型(WT)C5及三種C5點突變體的α鏈,而CFA0305強烈地結合至WT C5的β鏈、微弱地結合至E48A C5突變體的β鏈,且未結合至D51A及K109A C5突變體的β鏈,這代表這3個胺基酸殘基涉及抗體/抗原相互作用。表5顯示抗C5 MAb(CFA0305、CFA0307、CFA0366、CFA0501、CFA0538、CFA0599、CFA0666、CFA0672及CFA0675)的西方點墨分析的總結。抗C5 MAb被分類至相同的抗原決定基C,但抗體之間的結合形式稍有不同,暗示C5對抗C5 MAb的結合區域彼此接近但並不相同。
表5
抗C5 MAb對C5突變體反應的總結
4.6. 抗C5抗體與C5突變體的BIACORE®
結合分析
為了測試殘基E48、G51及K109確實涉及抗體/抗原的相互作用,實行BIACORE®
結合分析。製備三種C5突變體:E48A、G51A及K109A,如實施例4.5所述。製備包含在FS293細胞中過度表達的突變體C5之培養上清液樣品,以40 µg/ml的突變體C5。為了BIACORE®
結合分析,將樣品以BIACORE®
電泳緩衝液(ACES pH7.4、10 mg/ml BSA、1 mg/ml羧甲基葡聚糖)稀釋10倍,至突變體C5的最終樣品濃度為4 µg/ml。
使用如實施例3.2所述的測定條件,以BIACORE®
T200器材(GE Healthcare)於37℃評估三種C5突變體與抗C5抗體的相互作用。使用包含10 mg/ml BSA、1 mg/ml羧甲基葡聚糖的ACES pH 7.4緩衝液作為電泳緩衝液。Eculizumab- F760G4及305LO5被單株小鼠抗人類IgG、Fc片段特異性抗體(GE Healthcare)捕捉於不同的流路(flow cell)上。流路1用作參考表面。將野生型及突變型C5蛋白以4 µg/ml的濃度注射於感測表面之上,以與被捕捉的抗體相互作用。在每個分析循環的最後,以3M MgCl2
再生感測表面。以Bia Evaluation軟體,版本2.0 (GE Healthcare)分析結果。將參考流路(流路1)及電泳緩衝液的空白注射的曲線從具有捕捉抗體的流路的曲線扣除。
如第7圖所示,三種C5突變體均可以與野生型C5相似的結合輪廓結合至eculizumab。關於305LO5,相較於野生型C5,三種突變體對305LO5均顯示較低的結合反應。305LO5降低D51A及K109A突變體C5的結合至基準線程度。
4.7. C5上有助於抗C5抗體及C5之間的pH依賴性相互作用的His殘基的辨識
晶體結構分析顯示人類C5上的3個組胺酸殘基位在抗體/抗原界面。具有典型pKa約為6.0的組胺酸殘基已知有助於pH依賴性蛋白質-蛋白質相互作用(Igawa等人,Biochim Biophys Acta
1844(11):1943-1950 (2014))。為了探討抗體/抗原界面上的那一個His殘基有助於抗C5抗體及C5之間的pH依賴性相互作用,實行BIACORE®
結合測定。如下製備具有單一His突變(H70Y、H72Y及H110Y)的三種人類C5突變體,以及具有雙His突變(H70Y + H110Y)的突變體:藉由脂質轉染在FS293細胞中表達其中H70、H72及H110中任一被酪胺酸所取代的單一His突變體,以及其中H70及H110均被酪胺酸所取代的雙His突變體。藉由如實施例4.6中所述經修飾的BIACORE®
測定,判定C5 His突變體對305LO5,pH依賴性抗C5抗體,的抗原結合特性。簡言之,在pH7.4解離相之後立即在BIACORE®
測定中加入在pH5.8的額外解離相,以從在pH7.4形成的複合物評估抗體及抗源之間的pH依賴性解離。使用Scrubber 2.0 (BioLogic Software)曲線擬合軟體處理及擬合數據以判定在pH5.8的解離速率。
如第8圖所示,在H70或H110的C5單一His突變體及雙His突變體(H70 + H110)並未影響在中性pH下C5對305LO5的結合。同時,在H72的單一His突變體顯示C5對305LO5的結合顯著減少。C5 His突變體及C5-wt蛋白在pH5.8的解離速率如表6所示。如表6所示,在測試的C5抗原之中,C5-wt顯示在pH5.8下從305LO5最快解離。相較於C5-wt,在H70的單一His突變體在pH5.8顯示幾乎兩倍慢的解離速率,在H110的單一His突變體在pH5.8造成稍慢的解離速率。在H70及H110的雙His突變體在pH依賴性結合上產生較大的影響,在pH5.8具有較C5-wt幾乎慢了3倍的解離速率。
表6
His突變體對結合至305LO5的pH5.8解離速率值
實施例5
抗C5抗體在C5活化上的抑制活性
5.1. 抗C5 MAb對補體活化脂質體細胞溶解的抑制
藉由脂質體細胞溶解測定測試抗C5 MAb的補體活性的抑制。在96孔盤中將30微升的正常人類血清(6.7%) (Biopredic, SER018)與20 µL稀釋的MAb混合,且於25℃在震盪器上培養30分鐘。將經針對二硝基苯基(Autokit CH50, Wako, 995-40801)的抗體敏化的脂質體轉移至每個孔中,並將盤在25℃放置於震盪器上2分鐘。將50微升的基質溶液(Autokit CH50)加至每個孔中,藉由在25℃搖動2分鐘加以混合。將最終混合液在37℃培養40分鐘,之後測量混合液在340 nm的OD。脂質體細胞溶解的百分比定義為100× [(ODMAb
– OD血清及脂質體背景
)]/ [(OD沒有 MAb
– OD血清及脂質體背景
)]。第9A圖顯示抗C5 Mabs:CFA0305、0307、0366、0501、0538、0599、0666、0672及0675,抑制脂質體細胞溶解。兩個非pH依賴性的抗體:CFA0330及0341,亦抑制細胞溶解(第9B圖)。
5.2. 抗C5 MAb對C5a生成的抑制
在脂質體細胞溶解期間,測試抗C5 MAb的C5a生成,以確認抗C5 MAb抑制C5裂解成C5a及C5b。利用C5a ELISA套組(R&D系統,DY2037)定量來自脂質體細胞溶解測定的上清液中的C5a程度。所有MAb劑量依賴地(dose- dependently)抑制上清液中的C5a生成(第10A及10B圖)。
5.3. 抗C5 MAb對補體活化溶血反應的抑制
在溶血測定中測試抗C5 MAb對經典補體活性的抑制。以包含0.5 mM MgCl2
及0.15 mM CaCl2
(GVB++) (Boston BioProducts, IBB-300X)的明膠/佛羅拉(veronal)緩衝的食鹽水清洗雞紅血球細胞(cRBCs) (Innovative research, IC05-0810),之後在4℃以1 µg/ml的抗雞RBC抗體(Rockland 103-4139)敏化15分鐘。接著以GVB++清洗細胞並使其以5×107
cells/ml懸浮於相同緩衝液中。在分開的圓底96孔微量測試盤中,將50 µl正常人類血清(20%) (Biopredic, SER019)與50 µl稀釋的Mab混合,以及在37℃於震盪器上培養30分鐘。接著將60微升的敏化cRBC上清液加至包含血清的孔中,並將抗體混合液在37℃培養30分鐘。在培養後,在4℃將盤以1000×g離心2分鐘。將上清液(100 µl)轉移至平底96孔微量測試盤上的孔,以測量在415nm的OD,其以630nm為參考波長。溶血反應的百分比定義為100× [(ODMAb
– OD血清及 cRBC
)]/ [(OD沒有 MAb
– OD血清及 cRBC 背景
)]。第11圖顯示抗C5 Mab:CFA0305及305LO5,抑制cRBC的溶血反應。
5.4. 抗C5 MAb對替代補體途徑的抑制
以與經典途徑溶血反應測定相似的方式實行替代途徑的溶血反應測定。將從紐西蘭白兔(InVivos)收集的血液與相同體積的Alsever's溶液(Sigma, A3551)混合,且使用混合液作為兔子RBC (rRBC)。以2 mM MgCl2
及10 mM EGTA補充的GVB清洗rRBC,並在7×108
cells/ml使其懸浮於相同緩衝液中。在圓底96孔微量測試盤中,將40 µl正常人類血清(25%) (Biopredic, SER019)與40 µl稀釋的Mab混合,以及在37℃於震盪器上培養30分鐘。接著將20微升的rRBC上清液加至包含血清的孔中,並將抗體混合液在37℃培養60分鐘。在培養後,在4℃將盤以1000×g離心2分鐘。將上清液(70 µl)轉移至平底96孔微量測試盤上的孔,以測量在415nm的OD,其以630nm為參考波長。第12圖顯示抗C5 Mab:CFA0305及CFA0672,抑制rRBC的溶血反應,其代表這些抗體抑制替代補體途徑。
實施例6
抗C5單株抗體(305變異體)的最適化
引入一些突變至抗C5抗體的305LO5的最適化可變區中,以進一步改善其特性,並產生最適化可變區305LO15、305LO16、305LO18、305LO19、305LO20、305LO22、及305LO23。305變異體的VH及VL的胺基酸序列分別列於表7及8中。編碼人源化VH的基因與經修飾的人類IgG1 CH變異體SG115 (序列辨識號:114)及經修飾的人類IgG4 CH變異體SG422 (序列辨識號: 115)或SG429 (序列辨識號: 116)結合。編碼人源化VL的基因與人類CL (SK1,序列辨識號: 38)結合。分別地,合成編碼人源化抗C5抗體的重鏈及輕鏈基因,BNJ441 (BNJ441H,序列辨識號: 149;BNJ441L,序列辨識號: 150),且各自轉殖至表達載體中。
抗體在HEK239細胞中被表達,且藉由蛋白質A加以純化,所述HEK293細胞與重鏈及輕鏈表達載體的組合共轉染。
表7
305變異體的VH胺基酸序列
表8
305 variants305變異體的VL胺基酸序列
實施例7
抗C5抗體(305變異體)的結合特性
抗體 | VH | HVR-H1 | HVR-H2 | HVR-H3 |
305LO5 | 序列辨識號:10 | 序列辨識號:54 SSYYVA | 序列辨識號:64 AIYTGSGATYKASWAKG | 序列辨識號:74 DGGYDYPTHAMHY |
305LO15 | 序列辨識號:106 | 序列辨識號:117 SSYYMA | 序列辨識號:118 AIFTGSGAEYKAEWAKG | 序列辨識號:121 DAGYDYPTHAMHY |
305LO16 | 序列辨識號:107 | 序列辨識號:117 SSYYMA | 序列辨識號:119 AIFTGSGAEYKAEWVKG | 序列辨識號:121 DAGYDYPTHAMHY |
305LO18 | 序列辨識號:108 | 序列辨識號:117 SSYYMA | 序列辨識號:118 AIFTGSGAEYKAEWAKG | 序列辨識號:121 DAGYDYPTHAMHY |
305LO19 | 序列辨識號:109 | 序列辨識號:117 SSYYMA | 序列辨識號:118 AIFTGSGAEYKAEWAKG | 序列辨識號:121 DAGYDYPTHAMHY |
305LO20 | 序列辨識號:109 | 序列辨識號:117 SSYYMA | 序列辨識號:118 AIFTGSGAEYKAEWAKG | 序列辨識號:121 DAGYDYPTHAMHY |
305LO22 | 序列辨識號:109 | 序列辨識號:117 SSYYMA | 序列辨識號:118 AIFTGSGAEYKAEWAKG | 序列辨識號:121 DAGYDYPTHAMHY |
305LO23 | 序列辨識號:110 | 序列辨識號:117 SSYYMA | 序列辨識號:120 GIFTGSGATYKAEWAKG | 序列辨識號:121 DAGYDYPTHAMHY |
抗體 | VL | HVR-L1 | HVR-L2 | HVR-L3 |
305LO5 | 序列辨識號:20 | 序列辨識號:84 QASQNIGSSLA | 序列辨識號:94 GASKTHS | 序列辨識號:104 QSTKVGSSYGNH |
305LO15 | 序列辨識號:111 | 序列辨識號:122 RASQGISSSLA | 序列辨識號:123 GASETES | 序列辨識號:125 QNTKVGSSYGNT |
305LO16 | 序列辨識號:111 | 序列辨識號:122 RASQGISSSLA | 序列辨識號:123 GASETES | 序列辨識號:125 QNTKVGSSYGNT |
305LO18 | 序列辨識號:111 | 序列辨識號:122 RASQGISSSLA | 序列辨識號:123 GASETES | 序列辨識號:125 QNTKVGSSYGNT |
305LO19 | 序列辨識號:111 | 序列辨識號:122 RASQGISSSLA | 序列辨識號:123 GASETES | 序列辨識號:125 QNTKVGSSYGNT |
305LO20 | 序列辨識號:112 | 序列辨識號:122 RASQGISSSLA | 序列辨識號:123 GASETES | 序列辨識號:125 QNTKVGSSYGNT |
305LO22 | 序列辨識號:113 | 序列辨識號:122 RASQGISSSLA | 序列辨識號:124 GASTTQS | 序列辨識號:125 QNTKVGSSYGNT |
305LO23 | 序列辨識號:113 | 序列辨識號:122 RASQGISSSLA | 序列辨識號:124 GASTTQS | 序列辨識號:125 QNTKVGSSYGNT |
利用BIACORE®
T200器材(GE Healthcare)在37℃下,評估針對重組的人類C5的抗C5抗體在三種不同條件下的動力學參數;(1)結合及解離均在pH7.4、(2)結合及解離均在pH5.8、以及(3)結合在pH7.4,但解離在pH5.8。使用胺偶合套組(GE Healthcare)根據GE Healthcare建議的設置,將ProA/G(Pierce)固定於CM1感測晶片上。將條件(1)及(3)的抗體及分析物稀釋於ACES pH7.4緩衝液(20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2
、0.05% Tween 20、0.005% NaN3
)中,將條件(2)的抗體及分析物稀釋於ACES pH5.8緩衝液(20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2
、0.05% Tween 20、0.005% NaN3
)中。各個抗體被ProA/G捕捉於感測表面上。抗體捕捉程度通常為60-90共振單位(RU)。接著,以3至27nM或13.3至120nM注射重組的人類C5,其藉由三倍連續稀釋製備,接續為解離。利用25 mM NaOH再生表面。利用BIACORE®
T200評估軟體,2.0版本(GE Healthcare)以1:1結合模型擬合(fit)感測圖以測定在條件(1)及(2)下的動力學參數,以及以MCK模型的1:1解離擬合感測圖以測定在條件(3)下的解離速率。所有抗體的pH依賴性以條件(2)及(1)下的解離速率的比例表示。.
結合速率(ka)、解離速率(kd)、結合親和性(KD)及pH依賴性列於表9中。相較於在pH7.4,所有抗體在pH 5.8顯示較快的解離速率,且它們的pH依賴性約為20倍。
表9
在pH7.4及pH5.8的條件下,抗C5抗體的動力學參數
利用BIACORE®
T200器材(GE Healthcare)於37℃測定抗C5抗體(BNJ441、eculizumab及305變異體)在pH7.4及pH5.8下對重組的人類C5的結合親和性,以評估pH對抗原結合的影響。使用胺偶合套組(GE Healthcare)根據供應商建議的設置,將山羊的抗人類IgG(Fc)多株抗體(KPL #01-10-20)固定於CM4感測晶片上。將抗體及分析物稀釋於包含20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2
、0.05% Tween 20及0.005% NaN3
的ACES pH7.4緩衝液或ACES pH5.8緩衝液中。利用抗Fc方法將抗體捕捉於感測晶片表面上,捕捉程度通常為50-80共振單位(RU)。在pH7.4的測定條件下,藉由從27 nM開始的3倍連續稀釋以製備重組的人類C5,或在pH5.8的測定條件中,藉由從135 nM開始的3倍連續稀釋加以製備。利用20 mM HCl、0.01% Tween 20再生表面。利用BiaEvaluation 2.0軟體(GE Healthcare)以1:1結合模型處理及擬合數據。
BNJ441、eculizumab及305變異體在pH7.4及pH5.8下對重組的人類C5的結合親和性(KD)列於表10中。305變異體顯示(KD在pH5.8)/(KD在pH 7.4)的比例約為800,比BNJ441高出8倍,其(KD在pH5.8)/(KD在pH 7.4)的比例僅為93。
表10
實施例8
抗C5抗體(305變異體)在C5活化上的抑制活性
8.1. 抗C5 MAb對補體活化脂質體細胞溶解的抑制
藉由脂質體細胞溶解測定測試抗C5 MAb的補體活性的抑制。在96孔盤中將30微升的正常人類血清(6.7%) (Biopredic, SER019)與20 µL稀釋的MAb混合,且於常溫在震盪器上培養30分鐘。將經針對二硝基苯基(Autokit CH50, Wako, 995-40801)的抗體敏化的脂質體溶液轉移至每個孔中,並將盤在37℃放置於震盪器上2分鐘。將50微升的基質溶液(Autokit CH50)加至每個孔中,藉由在37℃搖動2分鐘加以混合。將最終混合液在37℃培養40分鐘,之後測量在340 nm的OD。脂質體細胞溶解的百分比定義為100× [(ODMAb
– OD血清及脂質體背景
)]/ [(OD沒有 MAb
– OD血清及脂質體背景
)]。第13圖顯示抗C5 Mabs:305LO15-SG422、305LO16-SG422、305LO18-SG422、305LO19-SG422、305LO20-SG422及305LO20-SG115,抑制脂質體細胞溶解。兩個具有Fc變異體的抗體:305LO15-SG115及305LO23-SG429,亦抑制脂質體細胞溶解(第14圖)。
測試抗C5 MAb對重組的人類C5 (序列辨識號: 39)的抑制。在96孔盤中,將10微升缺乏C5的人類血清(Sigma, C1163)與20µL稀釋的MAb及20µL的重組的C5 (0.1µg/mL)混合,且於37℃在震盪器上培養1小時。將脂質體(Autokit CH50)轉移至每個孔中,並在37℃放置於震盪器上2分鐘。將50微升的基質溶液(Autokit CH50)加至每個孔中,藉由在37℃搖動2分鐘加以混合。將最終混合液在37℃培養180分鐘,之後測量在340 nm的OD。脂質體細胞溶解的百分比如上述定義。第15圖顯示抗C5 Mabs:305LO22-SG115、305LO22- SG422、305LO23-SG115及305LO23-SG422,抑制脂質體細胞溶解。
8.2. 抗C5 MAb對C5a生成的抑制
在脂質體細胞溶解期間,測試抗C5 MAb的C5a生成,以確認抗C5 MAb抑制C5裂解成C5a及C5b。利用C5a ELISA套組(R&D系統,DY2037)定量來自脂質體細胞溶解測定的上清液中的C5a程度。所有MAb以劑量依賴方式抑制上清液中的C5a生成(第16及17圖)。
8.3. 於恆河猴血漿中測量補體活性
於恆河猴血漿中測量抗C5 MAb對補體活性的抑制。將抗C5 Mab內部施用於猴子(20mg/kg),且週期地收集血漿樣品直到第56天。以包含0.5 mM MgCl2
及0.15 mM CaCl2
(GVB++) (Boston BioProducts, IBB-300X)的明膠/佛羅拉(veronal)緩衝的食鹽水清洗雞紅血球細胞(cRBCs) (Innovative research, IC05-0810),之後在4℃以1 µg/ml的抗雞RBC抗體(Rockland 103-4139)敏化15分鐘。接著以GVB++清洗細胞並使其以1×108
cells/ml懸浮於相同緩衝液中。在分開的圓底96孔微量測試盤中,以敏化的cRBC在37℃培養猴子血漿20分鐘。在培養後,在4℃將盤以1000×g離心2分鐘。將上清液轉移至平底96孔微量測試盤上的孔,以測量在415nm的OD,其以630nm為參考波長。溶血反應的百分比定義為100× [(OD施用後
– OD血漿及 cRBC 背景
)]/ [(OD施用前
– OD血漿及 cRBC 背景
)]。第18圖顯示抗C5 Mab:305LO15-SG422、305LO15-SG115、305LO16-SG422、305LO18-SG422、305LO19-SG422、305LO20- SG422、305LO20-SG115及305LO23-SG115抑制血漿中的補體活性。
8.4. 抗C5 MAb對C5變異體的生物活性的抑制
測試抗C5 MAb對重組的人類C5變異體:V145I、R449G、V802I、R885H、R928Q、D966Y、S1310N及E1437D的抑制。已有報導具有R885H突變於C5中的PNH患者對eculizumab反應較差(請參照,例如,Nishimura等人,New Engl. J. Med.
370:632-639 (2014))。在FS293細胞中表現各個人類C5變異體,且將上清液用於接續的研究。在96孔盤中,將10微升缺乏C5的人類血清(Sigma, C1163)與20µL稀釋的Mab及20µL包含重組的C5變異體(2-3µg/mL)的細胞培養基混合,且於37℃在震盪器上培養0.5小時。將脂質體(Autokit CH50)轉移至每個孔中,並在37℃放置於震盪器上2分鐘。將50微升的基質溶液(Autokit CH50)加至每個孔中,藉由在37℃搖動2分鐘加以混合。將最終混合液在37℃培養90分鐘,之後測量在340 nm的OD。脂質體細胞溶解的百分比如上述定義。第19圖顯示抗C5 MAb (eculizumab)並未抑制R885H C5 變異體,但抑制了其它測試的變異體。第20圖顯示抗C5 Mab (305變異體)抑制測試的所有C5的變異體。
8.5. 抗C5 MAb對補體活化的脂質體細胞溶解的抑制
藉由脂質體細胞溶解測定測試抗C5 Mab對補體活性的抑制。在96孔盤中將30微升的正常人類血清(6.7%) (Biopredic, SER019)與20 µL稀釋的MAb混合,且於常溫在震盪器上培養30分鐘。將經針對二硝基苯基(Autokit CH50, Wako, 995-40801)的抗體敏化的脂質體溶液轉移至每個孔中,並將盤在25℃放置於震盪器上2分鐘。將50微升的基質溶液(Autokit CH50)加至每個孔中,藉由在25℃搖動2分鐘加以混合。將最終混合液在37℃培養45分鐘,之後測量在340 nm的OD。脂質體細胞溶解抑制的百分比定義為100× [(ODMAb
– OD血清及脂質體背景
)]/ [(OD沒有 MAb
– OD血清及脂質體背景
)]。第13圖顯示抗C5 Mabs:305LO15-SG422、305LO16-SG422、305LO18-SG422、305LO19-SG422、305LO20-SG422及305LO20-SG115,抑制脂質體細胞溶解。第21圖顯示抗C5 MAb,BNJ441及305變異體抑制脂質體細胞溶解,且305變異體比BNJ441具有更強的抑制活性。
實施例9
305變異體Fab及人類C5-MG1域複合物的X-射線晶體結構分析
9.1. Expression and purification of the MG1 domain (20-124) of 人類 C5
使用pGEX-4T-1載體(GE healthcare),在E. coli
品系BL21 DE3 pLysS (Promega)中表達藉由凝血酶可切割連接子(GST-MG1)融合至GST標記的MG1域 (序列辨識號:39的胺基酸殘基20-124)。以0.1 Mm的異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)在25℃誘導蛋白質表達5小時。以經lysonase (Merck)及完全蛋白酶抑制劑混合物補充的Bugbuster (Merck)溶解細菌的細胞沉澱物,接著根據供應商的說明書,使用GSTrap管柱(GE healthcare)從可溶級分純化GST-MG1。以凝血酶(Sigma)切割GST標記,進一步以Superdex 75膠體過濾管柱(GE healthcare)純化產生的MG1域。收集包含MG1域的級分並儲存於-80℃。
9.2. 305變異體的Fab片段的製備
藉由常規方法利用木瓜蛋白酶(Roche Diagnostics, Cat No.1047825)製備自305最適化的變異體之一的Fab片段,接續為裝載於蛋白質A管柱(MabSlect SuRe, GE Healthcare)上以移除Fc片段、陽離子交換管柱 (HiTrap SP HP, GE Healthcare)及膠體過濾管柱(Superdex200 16/60, GE Healthcare)。收集包含Fab片段的級分並儲存於−80℃。
9.3. 305變異體Fab及人類C5-MG1域複合物的製備
將純化的重組的人類C5-MG1域與純化的305變異體Fab片段以1:1摩爾比混合。藉由膠體過濾層析(Superdex200 10/300增加,GE Healthcare)使用以25 mM HEPES pH7.5、100 mM NaCl平衡的管柱純化複合物。
9.4. 結晶
將純化的複合物濃縮至約10 mg/Ml,並藉由坐滴蒸氣擴散法(sitting drop vapor diffusion method)結合種晶法(seeding method)在4℃進行結晶。儲存溶液由0.2 M 脫水甲酸鎂、15.0% w/v 聚乙二醇3350所組成。這在幾天內成功產生盤狀的晶體,將晶體浸泡於0.2 M脫水甲酸鎂、25.0% w/v 聚乙二醇3350及20%甘油的溶液中。
9.5. 數據收集及結構判定
藉由BL32XU在SPring-8測量X射線繞射數據。在測量期間,將晶體持續地放置於氮氣流中在−178℃以維持冷凍狀態,且利用貼附於射線的MX-225HS CCD偵測器(RAYONIX)而每次旋轉晶體1.0°,以收集總計180個X射線繞射影像。利用Xia2程式(J. Appl. Cryst.
43:186-190 (2010)、XDS Package (Acta. Cryst.
D66:125-132 (2010))及Scala (Acta. Cryst
. D62:72-82 (2006))實行細胞參數的判定、索引繞射點、及從獲得之繞射影像處理繞射數據,最後得到繞射強度數據達2.11 Å解析度的數據。晶體數據統計如表11所示。
表11
X射線數據收集及改善統計
a;R merge
= ∑hkl
∑j
|Ij
(hkl
) − 〈I
(hkl
)〉|/∑hkl
∑j
|I
(hkl
)|,其中Ij
(hkl
)及〈I
(hkl
)〉分別為測量的強度j
及以hkl
指數反射的平均強度。
b;R
因子= ∑hkl
|F calc
(hkl
)| − |F obs
(hkl
)|/∑hkl
|F obs
(hkl
)|,其中F obs
及F calc
分別為觀測及計算的結構因子振幅。
c;R free
是以5%的隨機預留反射計算。
以程式Phaser (J. Appl. Cryst
. 40:658-674 (2007))藉由分子置換判定結構。Fab域的搜尋模型取自公開的人類IgG4 Fab晶體結構(PDB編碼:1BBJ),以及MG1域的搜尋模型來自公開的人類C5晶體結構(PDB編碼:3CU7,Nat.Immunol.
9:753-760 (2008))。以Coot程式 (Acta Cryst
. D66:486-501 (2010))建造模型,並以程式Refmac5 (Acta Cryst.
D67:355-367 (2011))改善。繞射強度數據在25–2.11 Å的結晶可信度因子(R)為20.42%,具有26.44%的Free R值。結構改善統計如表11所示。
9.6. 305變異體Fab及 C5-MG1域複合物的整體結構
自305最適化的變異體的Fab片(“305 Fab”)以1:1比例結合至人類C5-MG1域(“MG1”),且晶體結構的不對稱單元包含2個複合物,分子1及2,如第22A圖所描繪。可在0.717 Å RMSD以所有殘基中的Cα原子將分子1及2對準好,如第22C圖所示。以下討論的圖示是利用分子1製備。
在第23A及23B圖中,305 Fab接觸區域的抗原決定基是分別定位於MG1胺基酸序列及晶體結構中。抗原決定基包含MG1的氨基酸殘基,其在晶體結構中包含與305 Fab的任一部份距離在4.5 Å之內的一或多個原子。此外,在3.0 Å之內的抗原決定基強調於第23A圖中。
9.7. E48、D51及K109的相互作用
如實施例4.5及4.6所述,藉由西方點墨及BIACORE®
結合分析,測試包含305抗體系列的抗C5 Mab對三種人類C5點突變體E48、D51及K109的結合。雖然305變異體強烈地結合至WT C5,但它們僅微弱地結合E48A C5突變體,且並未結合至D51A及K109A突變體。305 Fab及MG1複合物的晶體結構揭示E48、D51及K109三個胺基酸,與305 Fab的距離均在3.0 Å之內,其與Fab形成數個氫鍵,如第24A圖所示。更詳細的檢視,MG1的K109殘基是埋於形成在Fab的重鏈的界面的溝槽中,且藉由三個氫鍵以H-CDR3_G97、H-CDR3_Y100及H-CDR3_T100b以及藉由鹽橋以H-CDR3_D95緊密地與Fab作用(第24D圖)。D51位於MG1及305 Fab的重鏈之間,並與H-CDR1_Ser32及H-CDR2_Ser54形成兩個氫鍵以填充空間(第24C圖)。這些代表C5的K109及D51均為305抗體系列的結合的重要殘基。另一方面,E48在較接近表面的位置且與Fab僅形成一個氫鍵,這暗示其對抗體結合的貢獻較K109及E51的少(第24B圖)。這些關係與人類C5突變體的西方點墨及BIACORE®
結合分析的結果相符(實施例4.5及4.6)。補充說明:對Fab胺基酸的殘基編號是根據Kabat編號架構(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)。
9.8. 人類C5及305抗體系列的H70、H72及H110的相互作用
晶體結構分析揭示人類C5上的三個組胺酸殘基,亦即H70、H72及H110,是包含於305變異體Fab的抗原決定基中,如第23A及25A圖所示。實行BIACORE®
結合分析以研究這些組胺酸殘基對人類C5及305變異體Fab之間的pH依賴性蛋白質-蛋白質相互作用的貢獻,所述305變異體Fab使用人類C5突變體H70Y、H72Y、H110Y及H70Y+H110Y (實施例4.7)。H72Y造成305變異體Fab對C5的結合的完全喪失。C5的這個殘基位於由305 Fab的重鏈的CDR2環及MG1(L73、S74及E76)的環所形成的口袋中,且緊密地填充這個空間,如第25C圖所示。此外,C5的H72殘基與H-CDR2_Y58形成氫鍵。H72Y突變不被預期為可容忍的,由於沒有足夠的空間以容納酪胺酸較龐大的側鏈,與H-CDR2_Y58的氫鍵亦無法被維持。關於H70及H110對pH依賴性的貢獻,H70Y及H110Y突變導致在pH 5.8下305變異體Fab從C5較慢的解離。H70與MG1的T53形成分子內氫鍵,其被認為在pH 5.8下會被破壞,當C5的H70的質子化導致MG1的相互作用界面的對應部分中的構象改變(第25B圖)。關於H110,這個C5殘基的質子化預期將會造成對305 Fab的電荷互斥,其可藉由鄰近的組胺酸殘基H-CDR3_H100c的質子化被增強(第25D圖)。
雖然前述發明已為了清楚理解的目的,藉由說明及例子詳細描述,然此描述及例子不應理解為用以限定本發明的範圍。本文引用的所有專利及科學文獻之內容明確地以參考方式完整併入於此。
無。
第1圖顯示抗C5抗體的抗原決定基分格(epitope binning),如實施例2.2所述。分類至相同抗原決定基分格中的抗體以粗線框起。
第2A圖顯示抗C5抗體在pH7.4(實線)以及pH5.8(虛線)下的BIACORE®
感測圖以評估pH依賴性,如實施例3.2所述。CFA0305、CFA0307、CFA0366、CFA0501、CFA0538及CFA0599為分類至抗原決定基C中的抗體,如實施例2.2所述。
第2B圖顯示抗C5抗體在pH7.4(實線)以及pH5.8(虛線)下的BIACORE®
感測圖以評估pH依賴性,如實施例3.2所述。CFA0666、CFA0672及CFA0675為分類至抗原決定基C中的抗體,以及CFA0330及CFA0341為分類至抗原決定基B中的抗體,如實施例2.2所述。305LO5為CFA0305的人源化抗體,如實施例2.3所述。
第3圖顯示針對融合GST標記之C5的β鏈衍伸片段(序列辨識號:40的胺基酸19至180、161至340、321至500及481至660)之西方點墨(Western Blot)分析,如實施例4.1所述。CFA0305、CFA0307、CFA0366、CFA0501、CFA0538、CFA0599、CFA0666、CFA0672及CFA0675為分類至抗原決定基C中的抗體。抗GST抗體為正控制組,GST融合的(GST-fused)C5片段(46至49kDa)的位置以箭頭標示。
第4圖顯示抗C5抗體對C5的β鏈的MG1-MG2域之BIACORE®
感測圖,如實施例4.3所述。上欄顯示CFA0305(實線)、CFA0307(虛線)、CFA0366(虛線-點線)以及eculizumab(點線)之結果。中間欄顯示CFA0501(實線)、CFA0599(虛線)、CFA0538(虛線-點線)以及eculizumab(點線)之結果。下欄顯示CFA0666(實線)、CFA0672(虛線)、 CFA0675(虛線-點線)以及eculizumab(點線)之結果。CFA0305、CFA0307、CFA0366、CFA0501、CFA0538、CFA0599、CFA0666、CFA0672以及CFA0675為分類至抗原決定基C中的抗體,Eculizumab為抗C5抗體的控制組。
第5A圖顯示針對融合GST標記之MG1-MG2域衍伸之肽片段(序列辨識號:40的胺基酸33至124、45至124、52至124、33至111、33至108及45至111)之西方點墨分析,如實施例4.4所述。抗GST抗體被使用作為反應的抗體,GST融合之C5片段(35至37kDa)的位置以箭頭標示。
第5B圖顯示針對融合GST標記之MG1-MG2域衍伸之肽片段(序列辨識號:40的胺基酸33至124、45至124、52至124、33至111、33至108及45至111)之西方點墨分析,如實施例4.4所述。CFA0305被使用作為反應的抗體。
第5C圖總結抗C5抗體對C5的β鏈衍伸片段之結合反應,如實施例4.4所述。結合至被分類於抗原決定基C的抗C5抗體(CFA0305、CFA0307、CFA0366、CFA0501、CFA0538、CFA0599、CFA0666、CFA0672以及CFA0675)的片段以灰色表示,以及不結合至它們的片段以白色表示。
第6圖顯示針對在β鏈的E48、D51及K109被丙氨酸取代(分別為E48A、D51A及K109A)之C5點突變體之西方點墨分析,如實施例4.5所述。在左欄,eculizumab(抗C5抗體,α鏈結合物)被使用作為反應之抗體且C5的α鏈(約113kDa)的位置以箭頭標示。在右欄,CFA0305(被分類至抗原決定基C,β鏈結合物)被使用作為反應之抗體且C5的β鏈(約74kDa)的位置以箭頭標示。
第7圖呈現BIACORE®
感測圖,其顯示eculizumab- F760G4(上欄)或305LO5(下欄)與C5突變體的相互作用,如實施例4.6所述。感測圖是藉由分別注入C5-wt(粗曲線)、C5-E48A(短的虛曲線)、C5-D51A(長的虛曲線)及C5-K109A(細曲線)於固定有eculizumab-F760G4或305LO5之感測器表面上而獲得。Eculizumab為抗C5抗體的控制組,305LO5為CFA0305(被分類至抗原決定基C)之人源化抗體,如實施例2.3所述。
第8圖呈現BIACORE®
感測圖,其顯示305LO5與C5的His突變體的相互作用以評估pH依賴性,如實施例4.7所述。感測圖是藉由分別注入C5-wt(粗曲線)、C5-H70Y(長的虛曲線)、C5-H72Y(短的虛曲線)、C5-H110Y(點曲線)及C5-H70Y+H110Y(細曲線)於固定有305LO5之感測器表面上而獲得。抗體/抗原複合物可在pH7.4解離,接著在pH5.8(箭頭指示)進一步解離以評估pH依賴性的相互作用。
第9A圖顯示藉由抗C5抗體抑制補體活化的脂質體(liposome)細胞溶解,如實施例5.1所述。結果顯示CFA0305、CFA0307、CFA0366、CFA0501、CFA0538、CFA0599、CFA0666、CFA0672及CFA0675被分類至抗原決定基C,如實施例2.2所述。
第9B圖顯示藉由抗C5抗體抑制補體活化的脂質體細胞溶解,如實施例5.1所述。結果顯示抗體CFA0330及CFA0341被分類至抗原決定基B,如實施例2.2所述。
第10A圖顯示藉由抗C5抗體抑制C5a的產生,如實施例5.2所述。在如第9A圖所述之脂質體細胞溶解測定(liposome lysis assay)中所獲得之上清液中定量C5a濃度。
第10B圖顯示藉由抗C5抗體抑制C5a的產生,如實施例5.2所述。在如第9B圖所述之脂質體細胞溶解測定中所獲得之上清液中定量C5a濃度。
第11圖顯示藉由抗C5抗體抑制補體活化的溶血反應,如實施例5.3所述。補體藉由經典途徑被活化。
第12圖顯示藉由抗C5抗體抑制補體活化的溶血反應,如實施例5.4所述。補體藉由替代途徑被活化。
第13圖顯示藉由抗C5抗體抑制補體活化的脂質體細胞溶解,如實施例8.1所述。顯示抗體305LO15-SG422、305LO16- SG422、305LO18-SG422、305LO19-SG422、305LO20-SG422及305LO20-SG115的結果。
第14圖顯示藉由抗C5抗體抑制補體活化的脂質體細胞溶解,如實施例8.1所述。顯示抗體305LO15-SG115及305LO23- SG429的結果。
第15圖顯示藉由抗C5抗體抑制補體活化的脂質體細胞溶解,如實施例8.1所述。顯示抗體305LO22-SG115、305LO22- SG422、305LO23-SG115及305LO23-SG422的結果。
第16圖顯示藉由抗C5抗體抑制C5a的產生,如實施例8.2所述。在如第13圖所述之脂質體細胞溶解測定中所獲得之上清液中定量C5a濃度。
第17圖顯示藉由抗C5抗體抑制C5a的產生,如實施例8.2所述。在如第14圖所述之脂質體細胞溶解測定中所獲得之上清液中定量C5a濃度。
第18圖顯示藉由抗C5抗體抑制猴子血漿中的補體活性,如實施例8.3所述。投予抗C5抗體至恆河猴(cynomolgus monkey)中,以及在溶血反應測定中量測猴子血漿中的補體活性。
第19圖顯示藉由抗C5抗體(eculizumab)抑制野生型C5(WT)以及C5變異體(V145I、R449G、V802I、R885H、R928Q、D966Y、S1310N及E1437D)的生物活性,如實施例8.4所述。
第20圖顯示藉由抗C5抗體(305變異體)抑制野生型C5(WT)以及C5變異體(V145I、R449G、V802I、R885H、R928Q、D966Y、S1310N及E1437D)的生物活性,如實施例8.4所述。
第21圖顯示藉由抗C5抗體(BNJ441及305變異體)抑制補體活化的脂質體細胞溶解,如實施例8.5所述。
第22A及22B圖顯示305 Fab結合至人類C5(hC5)-MG1域的晶體結構,如實施例9.6所述。第22A圖顯示不對稱單元,MG以表面示意圖顯示,305 Fab以帶狀物顯示(深灰:重鏈,淺灰:輕鏈)。第22B圖顯示重疊的分子1及2(深灰:分子1,淺灰:分子2)。
第23A及23B圖顯示位於MG1域上的305 Fab接觸區域之抗原決定基,如實施例9.6所述。第23A圖顯示MG1胺基酸序列中的抗原決定基定位(epitope mapping)(深灰:比3.0Å接近,淺灰:比4.5Å接近)。第23B圖顯示晶體結構中的抗原決定基定位(深灰球狀:比3.0Å接近,淺灰棒狀:比4.5Å接近)。
第24A圖顯示E48、D51及K109(棒狀圖像)與305 Fab(表面圖像)相互作用的近視圖,如實施例9.7所述。
第24B圖顯示E48及其周圍環境的相互作用(深灰點線:與Fab的氫鍵,淺灰點線:水調節的氫鍵),如實施例9.7所述。
第24C圖顯示D51及其周圍環境的相互作用(深灰點線:與Fab的氫鍵),如實施例9.7所述。
第24D圖顯示K109及其周圍環境的相互作用(深灰點線:與Fab的氫鍵,淺灰點線:與H-CDR3_D95的鹽橋),如實施例9.7所述。
第25A圖顯示H70、H72及H110(棒狀圖像)與305 Fab(表面圖像)相互作用的近視圖,如實施例9.8所述,在與第24A圖相同之方位。
第25B、25C及25D圖顯示各個組胺酸殘基(分別為H70、H72及H110)及其周圍環境的相互作用,如實施例9.8所述。這些組胺酸殘基以棒狀及網狀圖像指出,在第25B及25C圖中氫鍵以點線指出。第25D圖顯示H110以及H-CDR3_H100c之間的距離(點線)。
無。
Claims (15)
- 一種分離的核酸,其編碼結合至C5的一抗體,其中該抗體在中性pH比在酸性pH下以較高親和性結合至C5的β鏈內的一抗原決定基。
- 如申請專利範圍第1項所述之分離的核酸,其中該抗體在pH 7.4比在pH 5.8下以較高親和性結合至由C5的β鏈(序列辨識號:40)的胺基酸33-124所組成的一片段內的一抗原決定基,且其中該抗原決定基包括擇自於胺基酸47-57、70-76及107-110所組成之群組的至少一片段。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之分離的核酸,其中該抗體結合至C5的β鏈(序列辨識號:40)的一片段內的一抗原決定基,其包括擇自於Glu48、Asp51、His70、His72、Lys109及His110所組成之群組的至少一胺基酸。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之分離的核酸,其中該抗體抑制C5的活化。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之分離的核酸,其中該抗體抑制C5變異體R885H的活化。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之分離的核酸,其中該抗體為一人類、人源化或嵌合抗體。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之分離的核酸,其中該抗體為一結合至C5的抗體片段。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之分離的核酸,其中該抗體為一全長IgG1或IgG4抗體。
- 一種宿主細胞,包括如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之分離的核酸。
- 一種製造抗體的方法,包括:培養如申請專利範圍第9項所述之宿主細胞,以製造該抗體。
- 一種製造抗C5抗體的方法,包括:以一多肽使一非人類動物免疫,其中該多肽包括C5的β鏈的MG1-MG2域(序列辨識號:43)。
- 如申請專利範圍第11項所述之製造抗C5抗體的方法,其中該多肽包括對應於C5的β鏈(序列辨識號:40)在位置33至124之胺基酸的區域。
- 如申請專利範圍第11或12項所述之製造抗C5抗體的方法,其中該多肽包括擇自於C5的β鏈(序列辨識號:40)的胺基酸47-57、70-76及107-110的至少一片段。
- 如申請專利範圍第11或12項所述之製造抗C5抗體的方法,其中該多肽包括C5的β鏈(序列辨識號:40)的一片段,其包括擇自於Glu48、Asp51、His70、His72、Lys109及His110的至少一胺基酸。
- 如申請專利範圍第11或12項所述之製造抗C5抗體的方法,其中該抗C5抗體結合一片段內的一抗原決定基,該片段包括擇自於Glu48、Asp51、His70、His72、Lys109及His110的至少一胺基酸。
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KR102469853B1 (ko) | 2008-04-11 | 2022-11-22 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자 |
AU2011337704B2 (en) | 2010-11-30 | 2017-06-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly |
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RU2746356C2 (ru) | 2014-12-19 | 2021-04-12 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Антитела к с5 и способы их применения |
KR20170110129A (ko) | 2015-02-05 | 2017-10-10 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용 |
TW201718014A (zh) | 2015-10-12 | 2017-06-01 | 諾華公司 | C5抑制劑於移植相關微血管病之用途 |
PL3390442T3 (pl) * | 2015-12-18 | 2024-03-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania |
US11359009B2 (en) | 2015-12-25 | 2022-06-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-myostatin antibodies and methods of use |
US20190023775A1 (en) | 2016-01-11 | 2019-01-24 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment |
KR20190005966A (ko) | 2016-05-10 | 2019-01-16 | 제넨테크, 인크. | 폴리펩타이드의 재조합 생산 동안 트리설파이드 결합을 감소시키기 위한 방법 |
US10633434B2 (en) | 2016-06-14 | 2020-04-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-C5 antibodies |
MY187848A (en) * | 2016-06-17 | 2021-10-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-c5 antibodies and methods of use |
CN116251182A (zh) | 2016-08-05 | 2023-06-13 | 中外制药株式会社 | 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物 |
WO2018044858A2 (en) * | 2016-08-29 | 2018-03-08 | The Cleveland Clinic Foundation | C5 immunization for autologous anti-c5 antibody production |
BR112019011769A2 (pt) * | 2016-12-16 | 2019-11-12 | Samsung Bioepis Co Ltd | composição de anticorpo anti-c5 aquosa estável |
JP7191833B2 (ja) | 2017-01-30 | 2022-12-19 | 中外製薬株式会社 | 抗スクレロスチン抗体およびその使用 |
EP4223774A3 (en) * | 2017-01-31 | 2023-09-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | A pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a c5-related disease and a method for treating or preventing a c5-related disease |
JP7364221B2 (ja) * | 2017-03-06 | 2023-10-18 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | 抗c5抗体およびその使用 |
EP3630819B1 (en) | 2017-05-22 | 2023-10-11 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of protein-losing enteropathy in patients |
JP2021501134A (ja) | 2017-10-26 | 2021-01-14 | アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)および非典型溶血性***症候群(aHUS)の処置のための抗C5抗体の投薬量および投与 |
CN111556895A (zh) * | 2017-11-14 | 2020-08-18 | 中外制药株式会社 | 抗-c1s抗体及使用方法 |
AU2018383751A1 (en) | 2017-12-13 | 2020-06-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-C5 antibody combinations and uses thereof |
AU2019245243A1 (en) | 2018-03-29 | 2020-09-03 | Genentech, Inc | Modulating lactogenic activity in mammalian cells |
EP3803407A1 (en) * | 2018-05-24 | 2021-04-14 | Sigma-Aldrich Co. LLC | Quantitative analysis of proteins |
EP3802593A1 (en) | 2018-05-31 | 2021-04-14 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) in pediatric patients |
EP3802603A1 (en) | 2018-06-04 | 2021-04-14 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of atypical hemolytic uremic syndrome (ahus) in pediatric patients |
WO2020006266A1 (en) | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods of producing anti-c5 antibodies |
KR20210038697A (ko) | 2018-08-01 | 2021-04-07 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | C5-관련 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물 및 c5-관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법 |
US20220177556A1 (en) * | 2018-09-06 | 2022-06-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Humanized anti-c5 antibodies and uses thereof |
US20220056115A1 (en) * | 2018-09-17 | 2022-02-24 | Kyoto University | Administration of an anti-c5 agent for treatment of hepatic injury or failure |
US20200095307A1 (en) | 2018-09-21 | 2020-03-26 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the treatment of neuromyelitis optica |
CA3118282A1 (en) | 2018-10-30 | 2020-05-07 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Subcutaneous dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) |
US20210388070A1 (en) * | 2018-10-30 | 2021-12-16 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Co-administration of a hyaluronidase and anti-c5 antibody for treatment of complement-associated conditions |
WO2020154626A1 (en) | 2019-01-25 | 2020-07-30 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of atypical hemolytic uremic syndrome (ahus) |
AU2020223298A1 (en) | 2019-02-14 | 2021-09-02 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-C5 antibodies for treatment of generalized myasthenia gravis |
JP2022528820A (ja) * | 2019-04-19 | 2022-06-16 | 中外製薬株式会社 | 試料中のポリペプチドの検出または捕捉において使用するための抗体、および組成物、ならびに試料中のポリペプチドの検出または捕捉のための方法 |
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WO2020242849A1 (en) | 2019-05-24 | 2020-12-03 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating vitiligo using an anti-c5 antibody |
MX2022001153A (es) | 2019-07-31 | 2022-02-22 | Hoffmann La Roche | Regimen de dosificacion y administracion para el tratamiento o prevencion de enfermedades relacionadas con c5 mediante el uso del anticuerpo anti-c5 crovalimab. |
US20220275070A1 (en) | 2019-07-31 | 2022-09-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Dosage and administration regimen for the treatment or prevention of c5-related diseases by the use of the anti-c5 antibody crovalimab |
WO2021067526A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Complement inhibitors for treating drug-induced complement-mediated response |
KR20220110827A (ko) | 2019-12-09 | 2022-08-09 | 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 | 시신경척수염 스펙트럼 장애의 치료를 위한 항-c5 항체 |
US20230043576A1 (en) | 2019-12-23 | 2023-02-09 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating pregnancy-associated atypical hemolytic uremic syndrome using an anti-c5 antibody |
CN111234016B (zh) * | 2020-02-23 | 2021-09-07 | 北京康普美特创新医药科技有限责任公司 | 一种抗补体c5分子的全人源单克隆抗体及应用 |
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JP2023519776A (ja) | 2020-03-31 | 2023-05-15 | 中外製薬株式会社 | 多重特異性抗原結合分子を製造するための方法 |
CN113563467A (zh) * | 2020-04-28 | 2021-10-29 | 上海普铭生物科技有限公司 | 针对人补体蛋白c5的抗体及其应用 |
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CN115667925A (zh) | 2020-05-15 | 2023-01-31 | 阿雷克森制药公司 | 使用细胞外囊泡来检测补体激活的方法以及其用于评估和/或监测补体介导的疾病的治疗的用途 |
EP4157353A1 (en) * | 2020-05-29 | 2023-04-05 | Amgen Inc. | Antibody formulations and uses thereof |
WO2021262329A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Subcutaneous (sc) administration of anti-c5 antibodies for treatment of complement-associated conditions |
WO2021262783A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Genentech, Inc. | Apoptosis resistant cell lines |
EP4178674A1 (en) * | 2020-07-09 | 2023-05-17 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) in pediatric patients |
IL300115A (en) | 2020-08-13 | 2023-03-01 | Alexion Pharma Inc | Dosage and Administration of ANTI-C5 Antibodies for Hematopoietic Stem Cell Transplantation Treatment (HSCT-TMA) |
KR20230056766A (ko) | 2020-08-28 | 2023-04-27 | 제넨테크, 인크. | 숙주 세포 단백질의 CRISPR/Cas9 다중 녹아웃 |
CN116261569A (zh) | 2020-09-21 | 2023-06-13 | 阿雷克森制药公司 | 用于治疗包括狼疮性肾炎(LN)和/或IgA肾病(IgAN)的C5介导的肾小球肾炎(GN)的抗C5抗体的剂量和施用 |
CA3196434A1 (en) | 2020-10-23 | 2022-04-28 | Krista K. JOHNSON | Methods of treating patients having complement disorders using anti-c5 antibodies |
EP4281472A1 (en) | 2021-01-22 | 2023-11-29 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating complement mediated thrombotic microangiopathy using an anti-c5 antibody |
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KR20240010469A (ko) | 2021-05-21 | 2024-01-23 | 제넨테크, 인크. | 관심 재조합 생성물의 생성을 위한 변형된 세포 |
TW202306994A (zh) | 2021-06-04 | 2023-02-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗ddr2抗體及其用途 |
WO2022265915A1 (en) | 2021-06-14 | 2022-12-22 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating dermatomyositis (dm) |
WO2023287991A1 (en) | 2021-07-14 | 2023-01-19 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of myasthenia gravis |
WO2023023220A1 (en) | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating sickle cell disease or beta thalassemia using a complement alternative pathway inhibitor |
TW202346339A (zh) | 2022-04-04 | 2023-12-01 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 藉由使用抗c5抗體克羅伐單抗之治療或預防格林-巴利症候群之劑量及投予方案 |
WO2023194273A1 (en) | 2022-04-04 | 2023-10-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dosage and administration regimen for the treatment or prevention of guillan-barré syndrome by the use of the anti-c5 antibody crovalimab |
WO2023215443A1 (en) * | 2022-05-04 | 2023-11-09 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the treatment of neuromyelitis optica spectrum disorder |
WO2024054436A1 (en) | 2022-09-06 | 2024-03-14 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Diagnostic and prognostic biomarker profiles in patients with hematopoietic stem cell transplant-associated thrombotic microangiopathy (hsct-tma) |
WO2024054408A1 (en) | 2022-09-06 | 2024-03-14 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Supplemental dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating hematopoietic stem cell transplant-associated thrombotic microangiopathy (hsct-tma) |
WO2024072798A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-c5 antibodies for preventing or minimizing cardiac surgery associated acute kidney injury (csa-aki) and/or subsequent major adverse kidney events (make) in patients with chronic kidney disease |
Family Cites Families (276)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE370449B (zh) | 1970-08-29 | 1974-10-14 | Philips Nv | |
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US4769320A (en) | 1982-07-27 | 1988-09-06 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Immunoassay means and methods useful in human native prothrombin and human abnormal prothorombin determinations |
ES521371A0 (es) | 1982-04-12 | 1984-05-16 | Hybritech Inc | Un procedimiento para la purificacion de un anticuerpo. |
US4689299A (en) | 1982-09-30 | 1987-08-25 | University Of Rochester | Human monoclonal antibodies against bacterial toxins |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4737456A (en) | 1985-05-09 | 1988-04-12 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Reducing interference in ligand-receptor binding assays |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US6548640B1 (en) | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
JPS6350741A (ja) | 1986-08-20 | 1988-03-03 | Nippon Tectron Co Ltd | 蛍光偏光分析装置 |
JPH06104071B2 (ja) | 1986-08-24 | 1994-12-21 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 第▲ix▼因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体 |
US4801687A (en) | 1986-10-27 | 1989-01-31 | Bioprobe International, Inc. | Monoclonal antibody purification process using protein A |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
EP0307434B2 (en) | 1987-03-18 | 1998-07-29 | Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. | Altered antibodies |
US5004697A (en) | 1987-08-17 | 1991-04-02 | Univ. Of Ca | Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier |
US5770701A (en) | 1987-10-30 | 1998-06-23 | American Cyanamid Company | Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents |
US5606040A (en) | 1987-10-30 | 1997-02-25 | American Cyanamid Company | Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group |
US5322678A (en) | 1988-02-17 | 1994-06-21 | Neorx Corporation | Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification |
KR0184860B1 (ko) | 1988-11-11 | 1999-04-01 | 메디칼 리써어치 카운실 | 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법) |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
CA2006684C (en) | 1988-12-30 | 1996-12-17 | Charles T. Esmon | Monoclonal antibody against protein c |
US5202253A (en) | 1988-12-30 | 1993-04-13 | Oklahoma Medical Research Foundation | Monoclonal antibody specific for protein C and antibody purification method |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US5208020A (en) | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
CA2026147C (en) | 1989-10-25 | 2006-02-07 | Ravi J. Chari | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
JPH0636741B2 (ja) | 1989-11-08 | 1994-05-18 | 帝人株式会社 | ヒト・プロテインcの分離方法 |
US6150584A (en) | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
WO1991012023A2 (en) | 1990-02-16 | 1991-08-22 | Boston Biomedical Research Institute | Hybrid reagents capable of selectively releasing molecules into cells |
US5770429A (en) | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
ES2113940T3 (es) | 1990-12-03 | 1998-05-16 | Genentech Inc | Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas. |
US5571894A (en) | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
ES2134212T3 (es) | 1991-04-25 | 1999-10-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo humano reconstituido contra el receptor de la interleuquina 6 humano. |
ES2206447T3 (es) | 1991-06-14 | 2004-05-16 | Genentech, Inc. | Anticuerpo humanizado para heregulina. |
GB9114948D0 (en) | 1991-07-11 | 1991-08-28 | Pfizer Ltd | Process for preparing sertraline intermediates |
US7018809B1 (en) | 1991-09-19 | 2006-03-28 | Genentech, Inc. | Expression of functional antibody fragments |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
AU675929B2 (en) | 1992-02-06 | 1997-02-27 | Curis, Inc. | Biosynthetic binding protein for cancer marker |
GB9203459D0 (en) | 1992-02-19 | 1992-04-08 | Scotgen Ltd | Antibodies with germ-line variable regions |
US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
CA2149329C (en) | 1992-11-13 | 2008-07-15 | Darrell R. Anderson | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma |
US5635483A (en) | 1992-12-03 | 1997-06-03 | Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University | Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides |
US5780588A (en) | 1993-01-26 | 1998-07-14 | Arizona Board Of Regents | Elucidation and synthesis of selected pentapeptides |
WO1994029471A1 (en) | 1993-06-10 | 1994-12-22 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviral vectors for treatment of hemophilia |
JPH08511420A (ja) | 1993-06-16 | 1996-12-03 | セルテック・セラピューテイクス・リミテッド | 抗 体 |
IL107742A0 (en) | 1993-11-24 | 1994-02-27 | Yeda Res & Dev | Chemically-modified binding proteins |
US6074642A (en) | 1994-05-02 | 2000-06-13 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis |
US5773001A (en) | 1994-06-03 | 1998-06-30 | American Cyanamid Company | Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis |
US6309636B1 (en) | 1995-09-14 | 2001-10-30 | Cancer Research Institute Of Contra Costa | Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides |
EP2077120A3 (en) | 1994-10-07 | 2009-07-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Rheumatoid arthritis remedy containing il-6 antagonist as active ingredient |
DE4436561C1 (de) | 1994-10-13 | 1996-03-14 | Deutsche Spezialglas Ag | Verfahren zur Veränderung der Durchbiegung von anodisch gebondeten flächigen Verbundkörpern aus Glas und Metall oder Halbleitermaterialien |
CZ298790B6 (cs) | 1994-10-21 | 2008-01-30 | Kishimoto@Tadamitsu | Farmaceutický prípravek pro prevenci nebo lécení kachexie |
US5789199A (en) | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
US6485943B2 (en) | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The University Of Chicago | Method for altering antibody light chain interactions |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US5840523A (en) | 1995-03-01 | 1998-11-24 | Genetech, Inc. | Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US5830478A (en) | 1995-06-07 | 1998-11-03 | Boston Biomedical Research Institute | Method for delivering functional domains of diphtheria toxin to a cellular target |
US5712374A (en) | 1995-06-07 | 1998-01-27 | American Cyanamid Company | Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates |
US5714586A (en) | 1995-06-07 | 1998-02-03 | American Cyanamid Company | Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates |
US6267958B1 (en) | 1995-07-27 | 2001-07-31 | Genentech, Inc. | Protein formulation |
US5783186A (en) | 1995-12-05 | 1998-07-21 | Amgen Inc. | Antibody-induced apoptosis |
GB9603256D0 (en) | 1996-02-16 | 1996-04-17 | Wellcome Found | Antibodies |
CA2259163C (en) | 1996-07-19 | 2004-07-06 | Amgen Inc. | Nt-3 and bdnf analogs having improved circulating life and/or absorption |
US5990286A (en) | 1996-12-18 | 1999-11-23 | Techniclone, Inc. | Antibodies with reduced net positive charge |
US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
US6884879B1 (en) | 1997-04-07 | 2005-04-26 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
US20070059302A1 (en) | 1997-04-07 | 2007-03-15 | Genentech, Inc. | Anti-vegf antibodies |
HU226175B1 (en) | 1997-04-17 | 2008-06-30 | Amgen Inc | Human ob protein suspension, process for producing thereof and use for production of pharmaceutical composition |
US6171586B1 (en) | 1997-06-13 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
DE69830315T2 (de) | 1997-06-24 | 2006-02-02 | Genentech Inc., San Francisco | Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung |
US6040498A (en) | 1998-08-11 | 2000-03-21 | North Caroline State University | Genetically engineered duckweed |
RU2221809C2 (ru) | 1997-10-03 | 2004-01-20 | Тугаи Сейяку Кабусики Кайся | Способ получения природного гуманизированного антитела |
ATE419009T1 (de) | 1997-10-31 | 2009-01-15 | Genentech Inc | Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen |
US6610833B1 (en) | 1997-11-24 | 2003-08-26 | The Institute For Human Genetics And Biochemistry | Monoclonal human natural antibodies |
ATE531812T1 (de) | 1997-12-05 | 2011-11-15 | Scripps Research Inst | Humanisierung von nager-antikörpern |
US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
ATE375365T1 (de) | 1998-04-02 | 2007-10-15 | Genentech Inc | Antikörper varianten und fragmente davon |
SK14812000A3 (sk) | 1998-04-03 | 2001-08-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Chimérny reťazec protilátky, chimérna protilátka, v oblasť, humanizovaný reťazec protilátky, humanizovaná protilátka, dna, expresný vektor, hostiteľ, spôsob prípravy a liečivo |
AU3657899A (en) | 1998-04-20 | 1999-11-08 | James E. Bailey | Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity |
GB9809951D0 (en) | 1998-05-08 | 1998-07-08 | Univ Cambridge Tech | Binding molecules |
EP1105427A2 (en) | 1998-08-17 | 2001-06-13 | Abgenix, Inc. | Generation of modified molecules with increased serum half-lives |
US6475718B2 (en) | 1998-09-08 | 2002-11-05 | Schering Aktiengesellschaft | Methods and compositions for modulating the interaction between the APJ receptor and the HIV virus |
MXPA01005515A (es) | 1998-12-01 | 2003-07-14 | Protein Design Labs Inc | Anticuerpos humanizados para gamma-interferon. |
HUP0104865A3 (en) | 1999-01-15 | 2004-07-28 | Genentech Inc | Polypeptide variants with altered effector function |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US6972125B2 (en) | 1999-02-12 | 2005-12-06 | Genetics Institute, Llc | Humanized immunoglobulin reactive with B7-2 and methods of treatment therewith |
EP2275540B1 (en) | 1999-04-09 | 2016-03-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
US7125978B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Medicago Inc. | Promoter for regulating expression of foreign genes |
AU782626B2 (en) | 1999-10-04 | 2005-08-18 | Medicago Inc. | Method for regulating transcription of foreign genes |
EP1229125A4 (en) | 1999-10-19 | 2005-06-01 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE |
SE9903895D0 (sv) | 1999-10-28 | 1999-10-28 | Active Biotech Ab | Novel compounds |
AU784983B2 (en) | 1999-12-15 | 2006-08-17 | Genentech Inc. | Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes |
AU767394C (en) | 1999-12-29 | 2005-04-21 | Immunogen, Inc. | Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use |
ES2528794T3 (es) | 2000-04-11 | 2015-02-12 | Genentech, Inc. | Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos |
JP2004511426A (ja) | 2000-05-03 | 2004-04-15 | ミュンヘン バイオテク アーゲー | 活性化血管部位に関連する陽イオン性の診断薬、画像化剤、および治療薬 |
PT2275449T (pt) | 2000-06-16 | 2016-12-27 | Human Genome Sciences Inc | Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a blys |
US7064191B2 (en) | 2000-10-06 | 2006-06-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for purifying antibody |
CA2424602C (en) | 2000-10-06 | 2012-09-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Antibody composition-producing cell |
US6946292B2 (en) | 2000-10-06 | 2005-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity |
EP2281840A3 (en) | 2000-10-10 | 2012-05-23 | Genentech, Inc. | Inhibition of complement C5 activation for the treatment and prevention of delayed xenograft or acute vascular rejection |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
JP3523245B1 (ja) | 2000-11-30 | 2004-04-26 | メダレックス,インコーポレーテッド | ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物 |
EP2341060B1 (en) | 2000-12-12 | 2019-02-20 | MedImmune, LLC | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
YU80903A (sh) | 2001-04-13 | 2006-05-25 | Biogen Inc. | Antitela vla-1 |
US7667004B2 (en) | 2001-04-17 | 2010-02-23 | Abmaxis, Inc. | Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor |
ATE407204T1 (de) | 2001-06-22 | 2008-09-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Zellproliferationsinhibitoren mit anti-glypican-3-antikörper |
US20040161741A1 (en) | 2001-06-30 | 2004-08-19 | Elazar Rabani | Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification |
NZ592087A (en) | 2001-08-03 | 2012-11-30 | Roche Glycart Ag | Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity |
CN100391537C (zh) | 2001-08-17 | 2008-06-04 | 建南德克公司 | 结合至c5和c5a但不阻止c5b形成的补体途径抑制剂 |
US20030049203A1 (en) | 2001-08-31 | 2003-03-13 | Elmaleh David R. | Targeted nucleic acid constructs and uses related thereto |
US7320789B2 (en) | 2001-09-26 | 2008-01-22 | Wyeth | Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof |
ES2326964T3 (es) | 2001-10-25 | 2009-10-22 | Genentech, Inc. | Composiciones de glicoproteina. |
CN100374457C (zh) | 2001-11-14 | 2008-03-12 | 森托科尔公司 | 抗il-6抗体、组合物、方法和用途 |
US20040093621A1 (en) | 2001-12-25 | 2004-05-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd | Antibody composition which specifically binds to CD20 |
US6684637B2 (en) | 2002-01-25 | 2004-02-03 | Sunpower, Inc. | Parallel slot heat exchanger |
EP1573002A4 (en) | 2002-02-11 | 2008-07-16 | Genentech Inc | ANTIBODY VARIANTS WITH ACCELERATED ANTIGEN ASSOCIATED SPEEDS |
AR038568A1 (es) | 2002-02-20 | 2005-01-19 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-a beta y su uso |
WO2003074679A2 (en) * | 2002-03-01 | 2003-09-12 | Xencor | Antibody optimization |
US7691568B2 (en) | 2002-04-09 | 2010-04-06 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Antibody composition-containing medicament |
CA2481837A1 (en) | 2002-04-09 | 2003-10-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Production process for antibody composition |
US20040110704A1 (en) | 2002-04-09 | 2004-06-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cells of which genome is modified |
ATE503829T1 (de) | 2002-04-09 | 2011-04-15 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins |
AU2003236019A1 (en) | 2002-04-09 | 2003-10-20 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism |
AU2003236018A1 (en) | 2002-04-09 | 2003-10-20 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa |
EP1513879B1 (en) | 2002-06-03 | 2018-08-22 | Genentech, Inc. | Synthetic antibody phage libraries |
AU2003256266A1 (en) | 2002-06-12 | 2003-12-31 | Genencor International, Inc. | Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target |
DK1512015T3 (da) | 2002-06-12 | 2009-07-06 | Genencor Int | Fremgangsmåder til forbedring af bindingsegenskaber hos et molekyle |
ITMI20021527A1 (it) | 2002-07-11 | 2004-01-12 | Consiglio Nazionale Ricerche | Anticorpi anti componente c5 del complemento e loro uso |
CA2492524A1 (en) | 2002-08-15 | 2004-02-26 | Epitomics, Inc. | Humanized rabbit antibodies |
US7361740B2 (en) | 2002-10-15 | 2008-04-22 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
DE60332957D1 (de) | 2002-12-16 | 2010-07-22 | Genentech Inc | Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen |
AU2004205631A1 (en) | 2003-01-16 | 2004-08-05 | Genentech, Inc. | Synthetic antibody phage libraries |
CA2515081A1 (en) | 2003-02-07 | 2004-08-19 | Protein Design Labs, Inc. | Amphiregulin antibodies and their use to treat cancer and psoriasis |
EP1601697B1 (en) | 2003-02-28 | 2007-05-30 | Lonza Biologics plc | Antibody purification by Protein A and ion exchange chromatography |
RU2399381C2 (ru) | 2003-02-28 | 2010-09-20 | Антидженикс Инк. | Использование лектинов для активации олигомеризации гликопротеидов и антигенных молекул |
US7871607B2 (en) | 2003-03-05 | 2011-01-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases |
US20060104968A1 (en) | 2003-03-05 | 2006-05-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases |
GB2401040A (en) | 2003-04-28 | 2004-11-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for treating interleukin-6 related diseases |
KR20060027801A (ko) | 2003-06-05 | 2006-03-28 | 제넨테크, 인크. | B 세포 장애에 대한 조합 요법 |
AU2004273791A1 (en) | 2003-09-05 | 2005-03-31 | Genentech, Inc. | Antibodies with altered effector functions |
US20080241884A1 (en) | 2003-10-08 | 2008-10-02 | Kenya Shitara | Fused Protein Composition |
AU2004280065A1 (en) | 2003-10-09 | 2005-04-21 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase |
WO2005035753A1 (ja) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体 |
US7820800B2 (en) | 2003-11-05 | 2010-10-26 | Ares Trading S.A. | Process for the purification of IL-18 binding protein |
EA036531B1 (ru) | 2003-11-05 | 2020-11-19 | Роше Гликарт Аг | Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение |
KR101520209B1 (ko) | 2003-11-06 | 2015-05-13 | 시애틀 지네틱스, 인크. | 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물 |
CA2545603A1 (en) | 2003-11-12 | 2005-05-26 | Biogen Idec Ma Inc. | Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto |
JPWO2005053742A1 (ja) | 2003-12-04 | 2007-06-28 | 協和醗酵工業株式会社 | 抗体組成物を含有する医薬 |
CA2546054C (en) | 2003-12-10 | 2014-05-13 | Medarex, Inc. | Interferon alpha antibodies and their uses |
SV2006001990A (es) | 2004-01-09 | 2006-01-30 | Pfizer | Anticuerpos contra madcam |
US20050169921A1 (en) | 2004-02-03 | 2005-08-04 | Leonard Bell | Method of treating hemolytic disease |
US20070116710A1 (en) | 2004-02-03 | 2007-05-24 | Leonard Bell | Methods of treating hemolytic anemia |
DE602005020743D1 (de) | 2004-02-11 | 2010-06-02 | Warner Lambert Co | Verfahren zur behandlung von osteoarthritis mit anti-il-6 antikörpern |
EP2053062A1 (en) | 2004-03-24 | 2009-04-29 | Xencor, Inc. | Immunoglobin variants outside the Fc region |
US20050260711A1 (en) | 2004-03-30 | 2005-11-24 | Deepshikha Datta | Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids |
MXPA06011199A (es) | 2004-03-31 | 2007-04-16 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados. |
US7785903B2 (en) | 2004-04-09 | 2010-08-31 | Genentech, Inc. | Variable domain library and uses |
CA2885854C (en) | 2004-04-13 | 2017-02-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Anti-p-selectin antibodies |
WO2005112564A2 (en) | 2004-04-15 | 2005-12-01 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Germline and sequence variants of humanized antibodies and methods of making and using them |
KR100620554B1 (ko) | 2004-06-05 | 2006-09-06 | 한국생명공학연구원 | Tag-72에 대한 인간화 항체 |
AR049390A1 (es) | 2004-06-09 | 2006-07-26 | Wyeth Corp | Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos |
CA2568952C (en) | 2004-06-18 | 2019-05-21 | Ambrx, Inc. | Novel antigen-binding polypeptides and their uses |
EP1773391A4 (en) | 2004-06-25 | 2009-01-21 | Medimmune Inc | INCREASING THE PRODUCTION OF RECOMBINANT ANTIBODIES IN MAMMALIAN CELLS BY MUTAGENESIS ON THE SITE |
EP1919950A1 (en) | 2004-07-15 | 2008-05-14 | Xencor, Inc. | Optimized fc variants |
EA012464B1 (ru) | 2004-08-04 | 2009-10-30 | Эпплайд Молекьюлар Эволюшн, Инк. | Антитело против cd20 и его применение |
MX2007002883A (es) | 2004-09-13 | 2007-06-15 | Macrogenics Inc | Anticuerpos humanizados contra el virus de nilo occidental y usos terapeuticos y profilacticos del mismo. |
EP1799718A1 (en) | 2004-09-14 | 2007-06-27 | National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) | Vaccine |
TWI380996B (zh) | 2004-09-17 | 2013-01-01 | Hoffmann La Roche | 抗ox40l抗體 |
US7563443B2 (en) | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
EP1791565B1 (en) | 2004-09-23 | 2016-04-20 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
JO3000B1 (ar) | 2004-10-20 | 2016-09-05 | Genentech Inc | مركبات أجسام مضادة . |
US7462697B2 (en) | 2004-11-08 | 2008-12-09 | Epitomics, Inc. | Methods for antibody engineering |
US20070135620A1 (en) | 2004-11-12 | 2007-06-14 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
US20090061485A1 (en) | 2004-12-22 | 2009-03-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of Producing an Antibody Using a Cell in Which the Function of Fucose Transporter Is Inhibited |
ATE461211T1 (de) | 2004-12-23 | 2010-04-15 | Novo Nordisk As | Liganden mit antikörperbindender affinität |
GB0502358D0 (en) | 2005-02-04 | 2005-03-16 | Novartis Ag | Organic compounds |
US10011858B2 (en) | 2005-03-31 | 2018-07-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association |
DK2824183T3 (da) | 2005-04-08 | 2020-09-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af bispecifikke antistoffer |
EP1885755A4 (en) | 2005-05-05 | 2009-07-29 | Univ Duke | TREATMENTS OF AUTOIMMUNE DISEASES BY ANTI-CD19 ANTIBODIES |
ES2534760T3 (es) | 2005-08-19 | 2015-04-28 | Wyeth Llc | Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y sus usos en el tratamiento de ELA y otros trastornos asociados con GDF-8 |
ES2577292T3 (es) | 2005-11-07 | 2016-07-14 | Genentech, Inc. | Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso |
WO2007060411A1 (en) | 2005-11-24 | 2007-05-31 | Ucb Pharma S.A. | Anti-tnf alpha antibodies which selectively inhibit tnf alpha signalling through the p55r |
CA2631212A1 (en) | 2005-11-28 | 2007-07-05 | Medimmune, Llc | Antagonists of hmgb1 and/or rage and methods of use thereof |
US20070237764A1 (en) | 2005-12-02 | 2007-10-11 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with restricted diversity sequences |
AU2006326283B2 (en) * | 2005-12-12 | 2012-01-19 | Ac Immune S.A. | Therapeutic vaccine |
HUE034269T2 (en) | 2005-12-29 | 2018-02-28 | Janssen Biotech Inc | Human anti-IL-23 antibodies, preparations, methods and applications |
RU2445975C2 (ru) | 2006-03-02 | 2012-03-27 | Алексион Фармасьютикалз, Инк. | Продление срока выживаемости аллотрансплантата путем ингибирования активности комплемента |
PL2596807T3 (pl) | 2006-03-08 | 2016-06-30 | Archemix Llc | Aptamery wiążące dopełniacza i środki anty-C5 użyteczne w leczeniu zaburzeń ocznych |
EP4316465A3 (en) | 2006-03-15 | 2024-04-24 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients by an inhibitor of complement |
DK3056568T3 (da) | 2006-03-31 | 2021-11-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Fremgangsmåder til kontrollering af antistoffers blodfarmakokinetik |
ES2654040T3 (es) | 2006-03-31 | 2018-02-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Método de modificación de anticuerpos para la purificación de anticuerpos biespecíficos |
NZ611859A (en) | 2006-04-05 | 2014-12-24 | Abbvie Biotechnology Ltd | Antibody purification |
CA2651567A1 (en) | 2006-05-09 | 2007-11-22 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with optimized scaffolds |
CN101500608A (zh) | 2006-06-08 | 2009-08-05 | 中外制药株式会社 | 炎性疾病的预防或治疗药 |
EP2471816A1 (en) | 2006-08-30 | 2012-07-04 | Genentech, Inc. | Multispecific antibodies |
CA3163418A1 (en) | 2006-10-06 | 2008-05-22 | Jeffrey S. Isenberg | Prevention of tissue ischemia, related methods and compositions |
US20100034194A1 (en) | 2006-10-11 | 2010-02-11 | Siemens Communications Inc. | Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks |
US20080226635A1 (en) | 2006-12-22 | 2008-09-18 | Hans Koll | Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof |
JP2010521194A (ja) * | 2007-03-22 | 2010-06-24 | ノバルティス アーゲー | C5抗原およびその使用 |
CN100592373C (zh) | 2007-05-25 | 2010-02-24 | 群康科技(深圳)有限公司 | 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法 |
BRPI0813954A2 (pt) | 2007-06-29 | 2020-10-06 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | análise de aminoácidos no fluido do corpo através de cromatografia líquida-espectometria de massa |
CN106519025B (zh) | 2007-09-26 | 2021-04-23 | 中外制药株式会社 | 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法 |
CL2008002886A1 (es) | 2007-09-26 | 2009-12-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Region constante de un anticuerpo humano; anticuerpo anti-receptor de interleucina-6 (il-6) y composicion farmaceutica que la comprende. |
PE20140132A1 (es) | 2007-09-26 | 2014-02-14 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo anti-receptor de il-6 |
AU2008305851B2 (en) | 2007-09-28 | 2014-12-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-glypican-3 antibody having improved kinetics in plasma |
US8414893B2 (en) | 2007-12-21 | 2013-04-09 | Amgen Inc. | Anti-amyloid antibodies and uses thereof |
PT2235064E (pt) | 2008-01-07 | 2016-03-01 | Amgen Inc | Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática |
KR102469853B1 (ko) | 2008-04-11 | 2022-11-22 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자 |
EP2816059A1 (en) | 2008-05-01 | 2014-12-24 | Amgen, Inc | Anti-hepcidin antibodies and methods of use |
WO2009152354A1 (en) | 2008-06-14 | 2009-12-17 | Vytronus, Inc. | System and method for delivering energy to tissue |
EA027575B1 (ru) | 2008-08-05 | 2017-08-31 | Новартис Аг | Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающий человеческий белок с5, содержащая их композиция, нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие эту кислоту вектор и клетка-хозяин и применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента |
TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
EP2894165B1 (en) | 2008-11-10 | 2023-01-04 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating complement-associated disorders |
WO2010098863A1 (en) | 2009-02-26 | 2010-09-02 | Lpath, Inc. | Humanized platelet activating factor antibody design using anti-lipid antibody templates |
CN102597005A (zh) | 2009-06-23 | 2012-07-18 | 阿雷克森制药公司 | 与补体蛋白质结合的双特异性抗体 |
CN101875696B (zh) * | 2009-11-11 | 2012-02-08 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗体及其制备方法与应用 |
EP2327725A1 (en) | 2009-11-26 | 2011-06-01 | InflaRx GmbH | Anti-C5a binding moieties with high blocking activity |
WO2011094593A2 (en) | 2010-01-28 | 2011-08-04 | Ab Biosciences, Inc. | Novel lowered affinity antibodies and methods of marking the same |
AU2011223866B2 (en) | 2010-03-01 | 2015-05-21 | Alexion Pharmaceuticals Inc. | Methods and compositions for treating Degos' disease |
TW201206466A (en) * | 2010-03-11 | 2012-02-16 | Rinat Neuroscience Corp | Antibodies with pH dependent antigen binding |
WO2011111007A2 (en) | 2010-03-11 | 2011-09-15 | Rinat Neuroscience Corporation | ANTIBODIES WITH pH DEPENDENT ANTIGEN BINDING |
TWI667257B (zh) | 2010-03-30 | 2019-08-01 | 中外製藥股份有限公司 | 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體 |
CN103108885A (zh) | 2010-04-30 | 2013-05-15 | 阿雷克森制药公司 | 在人中具有降低的免疫原性的抗体 |
AU2011337704B2 (en) | 2010-11-30 | 2017-06-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly |
CA2822288A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Medimmune, Llc | Anti-c5/c5a/c5adesr antibodies and fragments |
MX352889B (es) | 2011-02-25 | 2017-12-13 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo de fc especifico para fcyriib. |
SG195072A1 (en) | 2011-05-21 | 2013-12-30 | Macrogenics Inc | Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3 |
US8961981B2 (en) * | 2011-06-20 | 2015-02-24 | Saint Louis University | Targeting the neuromuscular junction for treatment |
TW201817745A (zh) | 2011-09-30 | 2018-05-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有促進抗原清除之FcRn結合域的治療性抗原結合分子 |
WO2013047748A1 (ja) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | 中外製薬株式会社 | 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
JP6271251B2 (ja) | 2011-10-05 | 2018-01-31 | 中外製薬株式会社 | 糖鎖受容体結合ドメインを含む抗原の血漿中からの消失を促進する抗原結合分子 |
WO2013081143A1 (ja) | 2011-11-30 | 2013-06-06 | 中外製薬株式会社 | 免疫複合体を形成する細胞内への運搬体(キャリア)を含む医薬 |
JP6138108B2 (ja) | 2012-02-24 | 2017-05-31 | 中外製薬株式会社 | FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
SI2825037T1 (sl) | 2012-03-16 | 2019-08-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Glodavci, ki izražajo PH občutljiva zaporedja imunoglobulina |
CN107827979A (zh) | 2012-03-16 | 2018-03-23 | 瑞泽恩制药公司 | 组氨酸工程改造的轻链抗体和用于生成所述抗体的经基因修饰的非人动物 |
HUE037613T2 (hu) * | 2012-03-29 | 2018-09-28 | Novimmune Sa | Anti-TLR4 antitestek és azok felhasználása |
TWI619729B (zh) | 2012-04-02 | 2018-04-01 | 再生元醫藥公司 | 抗-hla-b*27抗體及其用途 |
US20150353630A1 (en) | 2012-05-30 | 2015-12-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens |
WO2014028354A1 (en) | 2012-08-13 | 2014-02-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-pcsk9 antibodies with ph-dependent binding characteristics |
US9133269B2 (en) | 2012-08-24 | 2015-09-15 | Anaptysbio, Inc. | Humanized antibodies directed against complement protein C5 |
TW201418707A (zh) | 2012-09-21 | 2014-05-16 | Alexion Pharma Inc | 補體組分c5拮抗劑之篩選分析 |
CA2899589C (en) * | 2013-01-31 | 2022-02-22 | Seoul National University R & Db Foundation | C5 antibody and method for preventing and treating complement-related diseases |
US9321686B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-04-26 | Forta Corporation | Reinforcement fiber coating compositions, methods of making and treating, and uses for improved adhesion to asphalt and portland cement concrete |
EP2968985A2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-20 | Amgen, Inc. | Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 |
ES2768648T3 (es) | 2013-03-29 | 2020-06-23 | Alexion Pharma Inc | Composiciones y métodos para aumentar la semivida en suero de un agente terapéutico dirigido a C5 del complemento |
US11267868B2 (en) | 2013-04-02 | 2022-03-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc region variant |
US20160184391A1 (en) | 2013-08-16 | 2016-06-30 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of graft rejection by administering a complement inhibitor to an organ prior to transplant |
JP6382641B2 (ja) | 2013-09-11 | 2018-08-29 | 株式会社東芝 | 非水電解質電池及び非水電解質電池の製造方法 |
US9701743B2 (en) | 2014-02-20 | 2017-07-11 | Allergan, Inc. | Complement component C5 antibodies |
NZ711451A (en) | 2014-03-07 | 2016-05-27 | Alexion Pharma Inc | Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics |
JP2016024424A (ja) | 2014-07-24 | 2016-02-08 | 株式会社リコー | 情報処理システム、情報処理装置、情報処理方法、及びプログラム |
RU2746356C2 (ru) | 2014-12-19 | 2021-04-12 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Антитела к с5 и способы их применения |
WO2016117346A1 (en) | 2015-01-22 | 2016-07-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | A combination of two or more anti-c5 antibodies and methods of use |
KR20170110129A (ko) | 2015-02-05 | 2017-10-10 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용 |
TWI805046B (zh) | 2015-02-27 | 2023-06-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途 |
WO2016160756A2 (en) | 2015-03-31 | 2016-10-06 | Alexion Pharmaceuticlas, Inc. | Identifying and treating subpopulations of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) patents |
WO2016178980A1 (en) | 2015-05-01 | 2016-11-10 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Efficacy of an anti-c5 antibody in the prevention of antibody mediated rejection in sensitized recipients of kindney thansplant |
US20180142010A1 (en) | 2015-06-26 | 2018-05-24 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Method for treating a patient in compliance with vaccination with eculizumab or an eculizumab variant |
TW201718014A (zh) | 2015-10-12 | 2017-06-01 | 諾華公司 | C5抑制劑於移植相關微血管病之用途 |
PL3390442T3 (pl) | 2015-12-18 | 2024-03-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania |
US10233252B2 (en) | 2015-12-21 | 2019-03-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation | pH-dependent antibodies targeting the transferrin receptor and methods of use thereof to deliver a therapeutic agent |
US20190023775A1 (en) | 2016-01-11 | 2019-01-24 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment |
EP3408291A1 (en) | 2016-01-25 | 2018-12-05 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Anti-c5 antibodies with enhanced ph switch |
US10633434B2 (en) | 2016-06-14 | 2020-04-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-C5 antibodies |
MY187848A (en) | 2016-06-17 | 2021-10-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-c5 antibodies and methods of use |
EP4223774A3 (en) | 2017-01-31 | 2023-09-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | A pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a c5-related disease and a method for treating or preventing a c5-related disease |
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