TW201730209A - 細胞傷害誘導治療劑 - Google Patents

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Takahiro Ishiguro
Mika Sakurai
Hirotake Shiraiwa
Naoka Hironiwa
Tomoyuki Igawa
Yumiko Kawai
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Abstract

本發明找到一種新的多專一性抗原結合分子，其包含：含有具Glypican3結合活性之抗體可變區之域、及含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域，且維持優良的細胞傷害活性與高安全性。本發明之分子對於表現Glypican3之細胞、組織呈強細胞傷害性，故能製造用以治療或預防各種癌之新的醫藥組合物。

Description

細胞傷害誘導治療劑
本發明係關於多專一性抗原結合分子及其利用等。
抗體在血漿中之安定性高、副作用也少，因此作為醫藥品受到重視(非專利文獻1及非專利文獻2)。抗體不只有結合於抗原之作用、致效劑作用、拮抗劑作用，尚已知會誘導ADCC(Antibody Dependent Cytotoxicity：抗體依存性傷害活性)、ADCP(Antibody Dependent Cell phagocytosis：抗體依存性細胞吞噬作用)、CDC(補體依存性細胞傷害活性)這些利用效應子細胞之細胞傷害活性(也稱為效應子機能)，並發揮針對癌細胞之抗腫瘤效果(非專利文獻3)。藉由使抗體之Fc區結合於存在於NK細胞或巨噬體等效應子細胞上的Fc受體，使得該等效應子細胞對於抗體所結合之標的癌細胞發揮之細胞傷害，為ADCC。補體複合體會結合於抗體之構造中所存在之補體結合部位。存在於該複合體中之補體成分會在抗體所結合之細胞之細胞膜上形成孔，藉此促進水或離子流入細胞內並引起細胞受破壞的細胞傷害，為CDC。至今已有多種呈現優異之抗腫瘤效果之治療用抗體作為癌治療為目的之醫藥品被開發出來(非專利文獻4)，但既有的治療用抗體雖認為具有優異的作 用，但是藉由如此的抗體的投予獲得之治療成績尚未令人滿意。
抗體為了展現ADCC、ADCP、CDC，抗體之Fc區必須和NK細胞、巨噬體等效應子細胞存在之抗體受體(FcγR)及各種補體成分結合。於人，就FcγR之蛋白質家族而言，有人報告了：FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb之同功型(isoform)，其各自的副型(allotype)也有人報告(非專利文獻5)。該等同功型之中，FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa在細胞內域(domain)帶有稱為ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif)之域，會傳達活化信號。另一方面，只有FcγRIIb在細胞內域帶有稱為ITIM(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif)之域，並抑制信號傳達。已知所有的FcγR均會因免疫複合體等而交聯(crosslink)而傳達信號(非專利文獻6)。實際上，當抗體對於癌細胞發揮效應子機能時，在癌細胞膜上結合之多個抗體之Fc區，效應子細胞膜上之FcγR會成為簇集，以效應子細胞傳達活化信號。其結果，會發揮殺細胞效果，但此時FcγR之交聯會受限於存在癌細胞附近的效應子細胞，故免疫活化只在癌細胞局部發生。(非專利文獻7)
天然型之免疫球蛋白係以可變區和抗原結合，並以不變區和FcγR、FcRn、FcαR、FcεR這些受體、補體結合。於IgG之Fc區交互作用之結合分子之一即FcRn會和抗體之重鏈各結合1分子，故據報告：針對IgG型之抗體1分子會結合2分子之FcRn。但是FcγR和FcRn等不同，FcγR是於抗體之 鉸鏈區及CH2域交互作用，針對IgG型之抗體1分子只結合1分子(非專利文獻8)。又，通常天然型之IgG型之抗體係利用其可變區(Fab)認識1個抗原決定基並結合，故只能結合於1個抗原。另一方面，已知癌、發炎涉及多種蛋白質，有時蛋白質彼此會串音(crosstalk)。例如，於免疫疾病，已知涉及數種發炎性細胞介素(TNF、IL1、IL6)(非專利文獻9)。又，已知癌獲得藥劑耐性之機制之一為活化其他受體(非專利文獻10)。在如此的情形，認識1個抗原決定基之通常之抗體無法妨礙多數蛋白質。
作為妨礙多數標靶之分子，已有人研究以1分子結合2種以上之抗原之抗體(Bispecific抗體，雙專一性抗體)。藉由改良天然型之IgG型之抗體，可賦予向不同的2個抗原(第1抗原與第2抗原)之結合活性(非專利文獻11)。所以，不只有以1個分子中和2種以上之抗原之作用，尚有藉由將帶有細胞傷害活性之細胞和癌細胞予以交聯而提高抗腫瘤活性之作用。至今，就Bispecific抗體之分子形態而言，已有人報告：在抗體之N末端、C末端附加抗原結合部位之分子(DVD-Ig、scFv-IgG)、抗體之2個Fab區具有不同序列之分子(共通L鏈Bispecific抗體及混成融合瘤(hybridhybridoma))、一個Fab區認識2個抗原之分子(Two-in-one IgG)、CH3區之迴圈部位成為新抗原結合部位之分子(Fcab)(非專利文獻12及非專利文獻13)。Bispecific抗體皆以Fc區和FcγR交互作用，故保存抗體之效應子機能。因此針對Bispecific抗體認識之任一抗原，會和FcγR同時結合，並對於表現抗原之細胞呈現ADCC活性。
Bispecific抗體所認識之抗原若均為在癌專一性地表現的抗原，則結合於任一抗原均對於癌細胞顯示細胞傷害活性，能期待比起認識一個抗原的通常的抗體醫藥品有更有效率的抗腫瘤效果。但是Bispecific抗體所認識之抗原之中若有任一抗原在正常組織也表現時、為表現於免疫細胞之細胞時，會因為和FcγR之交聯而造成正常組織之傷害、細胞介素之放出(非專利文獻14)。其結果誘導強副作用。
作為Bispecific抗體之一，從1980年代已知有將T細胞作為效應子細胞而動員之細胞傷害作為其抗腫瘤效果之機制的抗體即T細胞重定向抗體(T cell-redirecting抗體)(非專利文獻15、16、17)。和將NK細胞、巨噬體作為效應子細胞而動員之ADCC作為其抗腫瘤效果之機制的抗體不同，T細胞重定向抗體係針對T細胞上之T細胞受體(TCR)複合體之構成次單元之任一者的抗體，尤其是包括結合於CD3 epsilon鏈之抗體、與結合於標的癌細胞上之抗原之抗體的bi-specific抗體。T細胞重定向抗體藉由同時結合於CD3 epsilon鏈與癌抗原，使T細胞接近癌細胞。其結果，據認為因T細胞帶有的細胞傷害作用對於癌細胞發揮抗腫瘤效果。
已知係作為T細胞重定向抗體之一之Catumaxomab，以2個Fab分別和在癌抗原(EpCAM)與T細胞表現之CD3ε鏈結合。Catumaxomab藉由同時結合癌抗原與CD3ε，會誘導T細胞所為之細胞傷害活性，藉由同時結合於癌抗原與FcγR，會誘導NK細胞、巨噬體等抗原提示細胞所致之細胞傷害活性。藉由利用2種細胞傷害活性，Catumaxomab 進行腹腔內投予時，在惡性腹水症顯示高治療效果，於歐洲已獲認可(非專利文獻18)。又，已有人報告利用Catumaxomab投予而出現對於癌細胞反應之抗體之例，顯見會誘導獲得免疫(非專利文獻19)。由此結果，可期待具有T細胞所致之細胞傷害活性以及介由FcγR之NK細胞、巨噬體等細胞所致作用兩者之抗體(尤其稱為三官能(trifunctional)抗體)能有強抗腫瘤效果與獲得免疫誘導，故受人重視。
但是trifunctional抗體即使在癌抗原不存在時仍會同時結合於CD3ε與FcγR，故即使於癌細胞不存在的環境仍會使表現CD3ε之T細胞與表現FcγR之細胞交聯，而大量產生各種細胞介素。由於如此的癌抗原非依存性的各種細胞介素的產生誘導，目前，trifunctional抗體之投予限於腹腔內(非專利文獻20)，由於嚴重的細胞介素風暴(storm)樣的副作用，極難進行全身投予。實際上，在對於非小細胞肺癌患者進行catumaxomab之全身投予所為之第一期臨床試驗，係以5μg/body的極低用量作為最大容許投予量，據報告更多用量的投予會引起各種嚴重的副作用(非專利文獻21)。
如上，習知技術之Bispecific抗體，因為第一抗原即癌抗原(EpCAM)與第二抗原即CD3ε之兩者的抗原會同時結合於FcγR，故在分子結構上不可能避免FcγR與第2抗原之CD3ε之同時結合所致的如此的副作用。
另一方面，由於BiTE(bispecific T-cell engager)與catumaxomab不同，不具有對抗Fcγ受體之結合部位，所以，不會發生癌抗原非依存地表現於T細胞與NK細胞或巨噬體等 之受體交聯的情形。是以，顯示當投予catumaxomab時觀察到的癌抗原非依存性的細胞介素的誘導並不會發生。但是BiTE係欠缺Fc區之低分子量型之改造抗體分子，故比起通常使用於當做治療用抗體的IgG型抗體，會存在對於患者投予之BiTE的血中半衰期顯著短的問題。實際上，對於活體投予之BiTE之血中半衰期據顯示為數小時左右(非專利文獻22、23)，於blinatumomab之臨床試驗係使用迷你泵浦持續進行靜脈內投予，而投予blinatumomab。如此的投予對於患者不僅是便利性顯著不佳的投予法，而且也存在由於機器故障等造成的醫療事故的風險，不能稱得上是理想的治療方法。
近年來，藉由使用對於FcγR之結合活性減小的Fc區，已提供：維持BiTE帶有之強抗腫瘤活性、及不誘導癌抗原非依存性細胞介素風暴等這些在安全性上優良之性質，而且帶有長血中半衰期之新的多胜肽聯合體(專利文獻1)。
另一方面，使習知技術之雙專一性抗體表現時，係使2種H鏈與2種L鏈表現，故其組合據認為有10種組合。其中，有目的之結合專一性之組合為1種。故，為了取得目的之雙專一性抗體，須從10種抗體精製出1種目的抗體，效率極差且困難。
作為解決此問題之方法，已有人報告：藉由對於IgG之H鏈之CH3區施加胺基酸取代，而使異種H鏈之組合，例如使對抗抗原A之H鏈與對抗抗原B之H鏈優先分泌之方法(專利文獻2、3、4、5、6、7及非專利文獻24、25)。此等據報告有：利用"knob；突起"與"hole；空隙"之物理性障礙之方法、利用 電荷排斥之方法。
為了以更良好效率獲得目的分子，據報告：使用即便胺基酸序列相同，仍可結合於2種不同抗原之L鏈之方法(專利文獻8、9)。但是由於使用共通L鏈，對於抗原之親和性(affinity)可能大幅降低，難找出維持向抗原之親和性的共通L鏈。
【先前技術文獻】
【專利文獻】
【專利文獻1】WO2012/073985
【專利文獻2】WO96/27011
【專利文獻3】WO2006/106905
【專利文獻4】WO2007/147901
【專利文獻5】WO2009/089004
【專利文獻6】WO2010/129304
【專利文獻7】WO2013/065708
【專利文獻8】WO98/050431
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本發明有鑑於上述情況，目的為提供：為使T細胞接近目標癌細胞，藉由T細胞所為之對於包括Glypican3表現細胞之目標癌組織之細胞傷害活性來治療癌且產生效率高之分子型即多專一性抗原結合分子、該抗原結合分子之製造方法、及含有該抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物。
本案發明人等找到：一種新的多專一性抗原結合分子，在含有結合於Glypican3之抗體可變區之域與含有結合於T細胞受體複合體之抗體可變區之域找到能使針對兩抗原之親和性提高之共通L鏈，藉此成為產生效率高之分子型，而且維持著BiTE等T細胞重定向抗體帶有之強抗腫瘤活性與不誘導癌抗原非依存的細胞介素風暴等之安全性上之優良性質，且帶有長血中半衰期。再者，發現：具有共通L鏈之多專一性抗原結合分子能將Glypican3表現癌細胞作為目標而帶來細胞傷害。本案發明人等基於此發現，得知：本發明之多專一性抗原結合分子會傷害包含Glypican3表現癌細胞之癌組織。
亦即，本發明提供以下：
[1]一種多專一性抗原結合分子，包含下列域且(1)之可變區與(2)之可變區所含之L鏈可變區為共通之胺基酸序列；(1)含有具Glypican3結合活性之抗體可變區之域、(2)含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域、及(3)含有對於Fcγ受體之結合活性降低之Fc區之域；細胞傷害活性比起Glypican3結合域由序列編號47及48構成且T細胞受體複合體結合域由序列編號49及50構成之雙專一性抗體(GPC3_ERY22_rCE115)為同等或更高。
[2]如[1]之多專一性抗原結合分子，其中，細胞傷害活性為T細胞依存的細胞傷害活性。
[3]如[1]或[2]之多專一性抗原結合分子，其中，T細胞受體複合體結合活性為對於T細胞受體之結合活性。
[4]如[1]至[3]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，T細胞受體複合體結合活性為對於CD3ε鏈之結合活性。
[5]如[1]至[4]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(1)之抗體可變區係包括選自下列(a1)~(a5)中任一H鏈CDR1、CDR2及CDR3之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區；
(a1)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(a2)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(a3)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之 CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(a4)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(a5)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同。
[6]如[1]至[4]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(2)之抗體可變區係包括選自下列(b1)~(b15)中之任一H鏈CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區；
(b1)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：52所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b2)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b3)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：122所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b4)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b5)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：129所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b6)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：132所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b7)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b8)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：144所含之 CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b9)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：164所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b10)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：168所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b11)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：421所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b12)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：424所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b13)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：426所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b14)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：429所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同
(b15)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：430所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同。
[7]如[1]至[4]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(1)及(2)之抗體可變區係包括選自下列(c1)~(c19)中之任一H鏈CDR1、CDR2及CDR3之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區；(c1)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：52所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同； (c2)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：421所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c3)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：426所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c4)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：429所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c5)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：430所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c6)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之 胺基酸序列相同；(c7)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c8)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：144所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c9)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：164所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c10)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：168所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c11)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2 及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c12)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：144所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c13)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：164所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c14)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：168所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c15)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c16)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺 基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：122所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c17)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：129所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c18)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：132所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(c19)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：424所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同。
[8]如[5]至[7]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，CDR1、CDR2及CDR3係依據Kabat編號之CDR1、CDR2及CDR3區。
[9]如[1]至[4]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(1)之抗體可變區係包括選自下列(a1)~(a5)中之任一H鏈可變區之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體 可變區；
(a1)H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列
(a2)H鏈可變區為序列編號：197之胺基酸序列
(a3)H鏈可變區為序列編號：206之胺基酸序列
(a4)H鏈可變區為序列編號：211之胺基酸序列
(a5)H鏈可變區為序列編號：215之胺基酸序列。
[10]如[1]至[4]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(2)之抗體可變區係包括選自下列(b1)~(b15)中之任一H鏈可變區之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區；
(b1)H鏈可變區為序列編號：52之胺基酸序列
(b2)H鏈可變區為序列編號：103之胺基酸序列
(b3)H鏈可變區為序列編號：122之胺基酸序列
(b4)H鏈可變區為序列編號：128之胺基酸序列
(b5)H鏈可變區為序列編號：129之胺基酸序列
(b6)H鏈可變區為序列編號：132之胺基酸序列
(b7)H鏈可變區為序列編號：142之胺基酸序列
(b8)H鏈可變區為序列編號：144之胺基酸序列
(b9)H鏈可變區為序列編號：164之胺基酸序列
(b10)H鏈可變區為序列編號：168之胺基酸序列
(b11)H鏈可變區為序列編號：421之胺基酸序列
(b12)H鏈可變區為序列編號：424之胺基酸序列
(b13)H鏈可變區為序列編號：426之胺基酸序列
(b14)H鏈可變區為序列編號：429之胺基酸序列
(b15)H鏈可變區為序列編號：430之胺基酸序列。
[11]如[1]至[4]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(1)及(2)之抗體可變區係包括選自下列(c1)~(c19)中之任一H鏈可變區之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區；(c1)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：52之胺基酸序列；(c2)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：421之胺基酸序列；(c3)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：426之胺基酸序列；(c4)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：429之胺基酸序列；(c5)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：430之胺基酸序列；(c6)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：197之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：128之胺基酸序列；(c7)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列 編號：206之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：142之胺基酸序列；(c8)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：206之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：144之胺基酸序列；(c9)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：206之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：164之胺基酸序列；(c10)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：206之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：168之胺基酸序列；(c11)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：211之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：142之胺基酸序列；(c12)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：211之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：144之胺基酸序列；(c13)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：211之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：164之胺基酸序列；(c14)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：211之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：168之胺基酸序列；(c15)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序 列編號：215之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：103之胺基酸序列；(c16)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：215之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：122之胺基酸序列；(c17)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：215之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：129之胺基酸序列；(c18)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：215之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：132之胺基酸序列；(c19)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：215之胺基酸序列，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：424之胺基酸序列。
[12]如[1]至[11]中任一項之記載之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之共通L鏈係包括選自下列(d1)~(d11)中之任一CDR1、CDR2及CDR3之組合之共通L鏈、或與其在機能上為同等之共通L鏈；(d1)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(d2)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(d3)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：299所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同； (d4)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：301所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(d5)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：302所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(d6)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：304所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(d7)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：306所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(d8)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：307所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(d9)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：309所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(d10)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：310所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(d11)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：319所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同。
[13]如[1]至[11]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之L鏈可變區係選自下列(d1)~(d11)中之任一L鏈胺基酸序列之可變區；
(d1)由序列編號：53之胺基酸序列構成之L鏈
(d2)由序列編號：223之胺基酸序列構成之L鏈
(d3)由序列編號：299之胺基酸序列構成之L鏈
(d4)由序列編號：301之胺基酸序列構成之L鏈
(d5)由序列編號：302之胺基酸序列構成之L鏈
(d6)由序列編號：304之胺基酸序列構成之L鏈
(d7)由序列編號：306之胺基酸序列構成之L鏈
(d8)由序列編號：307之胺基酸序列構成之L鏈
(d9)由序列編號：309之胺基酸序列構成之L鏈
(d10)由序列編號：310之胺基酸序列構成之L鏈
(d11)由序列編號：319之胺基酸序列構成之L鏈。
[14]如[1]至[4]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(1)及(2)之抗體可變區、及共通L鏈可變區係包括選自下列(e1)~(e25)中之任一H鏈CDR1、CDR2及CDR3、及L鏈CDR1、CDR2及CDR3之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區；(e1)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e2)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：299所含之CDR1、CDR2及CDR3區之 胺基酸序列相同；(e3)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：310所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e4)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：319所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e5)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e6)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺 基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：144所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e7)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：164所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e8)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：168所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e9)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2 及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e10)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：299所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e11)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：144所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e12)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：164所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e13)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及 CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：168所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e14)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e15)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：299所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e16)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之 胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：301所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e17)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：302所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e18)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：304所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e19)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：306所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同； (e20)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：307所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e21)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：309所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e22)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：122所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e23)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2 及CDR3和序列編號：129所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e24)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：132所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同；(e25)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：424所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同。
[15]如[1]至[4]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(1)及(2)之抗體可變區、及共通L鏈可變區係包括選自下列(f1)~(f26)中之任一可變區之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區；(f1)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：197之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含 之H鏈可變區和序列編號：128之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同；(f2)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：197之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：128之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：299所含之可變區之胺基酸序列相同；(f3)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：197之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：128之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：310所含之可變區之胺基酸序列相同；(f4)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：197之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：128之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：319所含之可變區之胺基酸序列相同；(f5)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：206之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：142之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同；(f6)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列 編號：206之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：144之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同；(f7)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：206之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：164之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同；(f8)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：206之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：168之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同；(f9)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：211之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：142之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同；(f10)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：211之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：142之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：299所含之可變區之胺基酸序列相同； (f11)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：211之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：144之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同；(f12)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：211之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：164之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同；(f13)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：211之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：168之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同；(f14)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同；(f15)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：299所含之可變區之胺基酸序列相 同；(f16)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：301所含之可變區之胺基酸序列相同；(f17)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：302所含之可變區之胺基酸序列相同；(f18)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：304所含之可變區之胺基酸序列相同；(f19)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：306所含之可變區之胺基酸序列相同；(f20)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈 之抗體可變區和序列編號：307所含之可變區之胺基酸序列相同；(f21)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：309所含之可變區之胺基酸序列相同；(f22)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：122之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同；(f23)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：129之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同；(f24)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：132之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同；(f25)[1]記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，[1]記載之(2)之抗體可變區所含 之H鏈可變區和序列編號：424之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同；(f26)結合在和(f1)~(f25)中任一多專一性抗原結合分子所結合之Glypican3及T細胞受體複合體上之抗原決定基分別為重複之抗原決定基，且有共通L鏈。
[16]如[1]至[15]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(3)之Fc區為構成序列編號：23~26(IgG1~IgG4)記載之Fc區之胺基酸中任一胺基酸已變異之Fc區。
[17]如[16]之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(3)之Fc區係選自依EU編號指定之下列胺基酸中之至少1個胺基酸已變異之Fc區；220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、332位。
[18]如[16]之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(3)之Fc區係具有選自依EU編號指定之下列胺基酸中之至少1個胺基酸之Fc區；234位之胺基酸為Arg、235位之胺基酸為Ala或Arg、239位之胺基酸為Lys、297位之胺基酸為Ala。
[19]如[16]至[18]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，[1]記載之(3)之Fc區更具有為了促進形成由異二聚體構成 之Fc區之胺基酸變異。
[20]如[19]之多專一性抗原結合分子，其中，由異二聚體構成之Fc區為下列(g1)或(g2)之胺基酸序列之組合；
(g1)和具有序列編號：57之胺基酸序列之不變區之Fc區為相同胺基酸序列與和具有序列編號：58之胺基酸序列之不變區之Fc區為相同胺基酸序列之組合
(g2)和具有序列編號：60或62之胺基酸序列之不變區之Fc區為相同胺基酸序列與和具有序列編號：61之胺基酸序列之不變區之Fc區為相同胺基酸序列之組合。
[21]如[1]至[20]中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，多專一性抗原結合分子為雙專一性抗體。
[22]一種雙專一性抗體，係如以下(h1)~(h25)中任一者所記載：(h1)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，具有由具序列編號424之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h2)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可 變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h3)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號299之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h4)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號301之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h5)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號302之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體； (h6)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號304之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h7)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號306之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h8)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號307之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h9)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結 合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號309之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h10)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號122之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h11)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號129之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h12)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號132之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙 專一性抗體；(h13)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號197之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號128之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號299之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h14)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號197之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號128之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號310之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h15)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號197之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號128之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號319之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h16)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號197之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序 列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號128之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h17)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號211之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號142之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號299之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h18)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號211之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號142之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h19)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號211之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號144之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H 鏈、及具序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h20)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號206之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號144之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h21)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號206之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號142之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h22)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號206之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號164之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h23)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號206 之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具由由具序列編號168之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h24)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號211之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具由具序列編號164之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h25)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號211之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號168之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體。
[23]一種核酸，編碼為如[1]至[20]中任一項之多專一性抗原結合分子、或[21]或[22]之雙專一性抗體。
[24]一種載體，已導入如[23]之核酸。
[25]一種細胞，包含如[23]之核酸、或如[24]之載體。
[26]一種方法，係藉由培養如[25]之細胞，以製造如[1]至[20]中任一項多專一性抗原結合分子、或如[21]或[22]之雙專一性抗體。
[27]一種多專一性抗原結合分子、或雙專一性抗體，係利用如[26]之方法製得。
[28]一種醫藥組合物，包含如[1]至[20]中任一項之多專一性抗原結合分子、或如[21]或[22]之雙專一性抗體、及藥學上可容許之擔體。
[29]如[28]之醫藥組合物，其誘導細胞傷害。
[30]如[29]之醫藥組合物，其中，細胞傷害係T細胞依存的細胞傷害。
[31]如[28]之醫藥組合物，其用在對於必要患者投予如[1]至[20]中任一項之多專一性抗原結合分子、或如[21]或[22]之雙專一性抗體。
本發明係關於本發明之方法使用之套組，含有本發明之多專一性抗原結合分子或依本發明之製造方法製得之多專一性抗原結合分子。又，本發明係關於本發明之多專一性抗原結合分子或依本發明之製造方法製得之多專一性抗原結合分子之用途，使用在製造活化細胞傷害活性之醫藥組合物。又，本發明係關於用以使用在本發明之方法之本發明之多專一性抗原結合分子或依本發明之製造方法製得之多專一性抗原結合分子。在此，多專一性抗原結合分子包括本發明之雙專一性抗體。
又，本發明係關於一種多專一性抗原結合分子， 含有下列域；(1)含有具Glypican3結合活性之抗體可變區之域、及、(2)含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域；且(1)之可變區與(2)之可變區所含之L鏈可變區為共通之胺基酸序列。又，本發明係關於(1)之域，亦即，該多專一性抗原結合分子所含之包含具Glypican3結合活性之抗體之重鏈及/或輕鏈之可變區之域。又，本發明係關於(2)之域，亦即，該多專一性抗原結合分子所含之含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域。(1)及(2)之域之詳情可為上述[1]~[22]記載者。該多專一性抗原結合分子也可為雙專一性抗體。又，該多專一性抗原結合分子也可更包括含有Fc區之域，該Fc區針對Fcγ受體之結合活性也可降低。含有Fc區之域之詳情也可為例如上述[1]~[22]記載者。又，本發明係關於：編碼為該多專一性抗原結合分子或該域之核酸、已導入該核酸之載體、包含該核酸或該載體之細胞、藉由培養該細胞而製造該多專一性抗原結合分子之方法、利用該方法製得之多專一性抗原結合分子或包含對於Glypican3或T細胞受體複合體有結合活性之抗體可變區之域。又，本發明係關於包含該多專一性抗原結合分子及藥學上可容許之擔體之醫藥組合物。該醫藥組合物可為誘導細胞傷害者，該細胞傷害可為T細胞依存的細胞傷害，該多專一性抗原結合分子可為對於必要之患者投予者。
又，本發明提供：一種多專一性抗原結合分子，其結合於和上述[14]之(e1)~(e25)中任一項之多專一性抗原結合分子所結合之Glypican3及T細胞受體複合體上之抗原決定基分別重 複及/或競爭之抗原決定基，並提供一種多專一性抗原結合分子，其結合於和上述[15]之(f1)~(f25)中之任一多專一性抗原結合分子所結合之Glypican3及T細胞受體複合體上之抗原決定基分別重複及/或競爭之抗原決定基。
又，上述[20](g1)及(g2)中，2個Fc區之中，可為：前者之Fc區包括在對於Glypican3有結合活性之抗體H鏈，後者之Fc區包括在對於T細胞受體複合體有結合活性之抗體H鏈，也可：前者之Fc區包括在對於T細胞受體複合體有結合活性之抗體H鏈，後者之Fc區包括在對於Glypican3有結合活性之抗體H鏈。
依本發明，可提供一種新的多專一性抗原結合分子，其為產生效率高之分子型，且維持BiTE帶有之強抗腫瘤活性、及不誘導癌抗原非依存的細胞介素風暴等之安全性上之優良性質，且有長血中半衰期。含有本發明之多專一性抗原結合分子作為有效成分之將細胞傷害活性予以活化之醫藥組合物，能將含有Glypican3表現癌細胞之癌組織作為目標而帶來細胞傷害，能治療或預防各種癌。對於患者而言，可提供安全性高而且身體的負擔少，便利性也高之理想之治療。
第1圖顯示：a：ERY22之示意圖、b：ERY27之示意圖。
第2圖顯示將NCI-H446作為目標細胞時，GPC3_ERY22_rCE115與GPC3_ERY27_hCE115之細胞傷害活性。黑菱(◆)代表 GPC3_ERY22_rCE115，黑三角(▲)代表GPC3_ERY27_hCE115之細胞傷害活性。
第3圖顯示將PC-10作為目標細胞時，GPC3_ERY22_rCE115與GPC3_ERY27_hCE115之細胞傷害活性。黑菱(◆)代表GPC3_ERY22_rCE115，黑三角(▲)代表GPC3_ERY27_hCE115之細胞傷害活性。
第4圖顯示將NCI-H446作為目標細胞時，最適化抗體之細胞傷害活性。
第5圖顯示將NCI-H446作為目標細胞時，最適化抗體之細胞傷害活性。
第6圖顯示將NCI-H446作為目標細胞時，最適化抗體之細胞傷害活性。
第7圖顯示將NCI-H446作為目標細胞時，最適化抗體之細胞傷害活性。
第8圖顯示將NCI-H446作為目標細胞時，最適化抗體之細胞傷害活性。
第9圖顯示將NCI-H446作為目標細胞時，最適化抗體之細胞傷害活性。
第10圖顯示將PC-10作為目標細胞時，最適化抗體之活體內(in vivo)抗腫瘤效果。
第11圖顯示將將NCI-H446作為目標細胞時，最適化抗體之活體內(in vivo)抗腫瘤效果。
第12圖顯示構成IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之Fc區之胺基酸殘基與kabat之EU編號(本說明書也稱為EU INDEX)之關 係圖。
第13-1圖顯示重鏈可變區序列與Kabat等各種編號。
第13-2圖顯示重鏈可變區序列與Kabat等各種編號。
第14圖顯示輕鏈可變區序列與Kabat等各種編號。
以下定義係為了容易了解本說明書說明之本發明而提供。
抗體
本說明書中，抗體係指天然者或部分或完全合成所製造之免疫球蛋白。抗體可從其天然存在之血漿或血清等天然資源或產生抗體之融合瘤細胞之培養上清液單離，或可使用基因重組等方法部分或完全合成。抗體例如免疫球蛋白之同種型(isotype)及此等同種型之次類(subclass)為較佳例。人類免疫球蛋白已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM9種類型(同種型(isotype))。本發明之抗體在該等同種型之中，可含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
製作具有所望結合活性之抗體之方法對於該技術領域之人士為公知。以下列舉製作和屬於GPI固定子(anchor)型受體家族之Glypican3(以下也稱為GPC3)(Int J Cancer.(2003)103(4),455-65)結合之抗體(抗GPC3抗體)之方法。和T細胞受體複合體結合的抗體也可依據下列例示適當製作。
抗GPC3抗體可使用公知方法以多株或單株抗體之形式取得。抗GPC3抗體，宜製作哺乳動物來源的單株抗體。哺乳動物來源的單株抗體，包含由融合瘤產生者，及以基因工 程的方法以含抗體基因之表現載體轉形而得之寄主細胞所產生者等。
單株抗體產生融合瘤，可使用公知技術依例如以下方式製作。亦即，使用GPC3蛋白質當做感作抗原，依通常之免疫方法將哺乳動物免疫。將獲得之免疫細胞以通常的細胞融合法與公知之母細胞融合。其次依照通常之篩選法，篩選單株抗體產生細胞，可選擇產生抗GPC3抗體之融合瘤。
具體而言，單株抗體之製作係依例如以下所示方式實行。首先，藉由表現在RefSeq註冊編號NM_001164617.1(序列編號：1)揭示其核苷酸序列之GPC3基因，取得當做抗體取得之感作抗原使用的以RefSeq註冊編號NP_001158089.1(序列編號：2)表示的GPC3蛋白質。亦即，藉由將編碼為GPC3之基因序列***公知之表現載體，而將適當的寄主細胞轉形。從該寄主細胞中或培養上清液中以公知方法精製所望之人類GPC3蛋白質。為了從培養上清液中取得可溶型之GPC3，例如可使用表現序列編號：2表示之GPC3多胜肽序列當中，為了使GPC3留在細胞膜上使用之相當於GPI固定子序列之構成疏水性區之564-580胺基酸係缺失的蛋白質，以代替表現以序列編號：2表示之GPC3蛋白質。又，經精製的天然GPC3蛋白質也同樣可當做感作抗原使用。
對於哺乳動物免疫時使用之感作抗原，可使用該精製GPC3蛋白質。GPC3之部分胜肽也可當做感作抗原使用。於此時，該部分胜肽可利用人類GPC3之胺基酸序列以化學合成取得。又，也可將GPC3基因之一部分納入表現載體使表現 而取得。再者，使用蛋白質分解酵素將GPC3蛋白質分解也可取得，但是當做部分胜肽使用之GPC3胜肽之區域及大小不限於特別之態樣。較佳區域可從序列編號：2之胺基酸序列當中相當於524~563號胺基酸之胺基酸序列選擇任意序列，更佳為從相當於537~563號之胺基酸之胺基酸序列選擇任意序列。又，較佳為從序列編號：2之胺基酸序列之不包括相當於550~663號胺基酸之胺基酸序列之區域之胺基酸序列選擇任意序列。較佳為從序列編號：2之胺基酸序列中相當於544~553號之胺基酸序列選擇任意序列，更佳為從相當於546~551號之胺基酸序列選擇任意序列。構成當做感作抗原之胜肽的胺基酸的數目至少為5以上，例如6以上或7以上較佳。更具體而言，可將8~50、較佳為10~30個殘基之胜肽當做感作抗原使用。
又，將GPC3蛋白質之所望之部分多胜肽或胜肽與不同的多胜肽融合成的融合蛋白質可利用為感作抗原。為了製造當做感作抗原使用之融合蛋白質，例如可適當利用抗體之Fc片段或胜肽標籤(tag)等。表現融合蛋白質之載體，可藉由將編碼為所望之二種或更多種多胜肽片段之基因於框架內(inframe)融合，並將該融合基因以前述方式***表現載體而製作。融合蛋白質之製作方法記載於Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。可當做感作抗原使用之GPC3之取得方法及使用其之免疫方法，在WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等亦有具體記載。
以該感作抗原免疫之哺乳動物不限於特定動物， 宜考慮與細胞融合使用之母細胞之間的適合性選擇。一般的囓齒類動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠、或兔、猴等較佳。
依公知方法將上述動物以感作抗原免疫。例如就一般方法而言，係藉由將感作抗原對於哺乳動物之腹腔內或皮下注射而投予以實施免疫。具體而言，將以PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理食鹽水等以適當稀釋倍率稀釋過的感作抗原，視所望與通常的佐劑例如佛洛依德完全佐劑混合並乳化後，將該感作抗原對於哺乳動物每4至21日投予數次。又，感作抗原免疫時可以使用適當擔體。尤其使用小分子量之部分胜肽當做感作抗原時，有時以結合有白蛋白、血藍蛋白(keyhole lympet hemocyanin)等擔體蛋白質的該感作抗原胜肽進行免疫為理想。
又，產生所望抗體之融合瘤可使用DNA免疫並依以下方式製作。DNA免疫，係指在免疫動物中投予以能表現編碼為抗原蛋白質之基因的態樣構建之載體DNA的該免疫動物中，藉由感作抗原在該免疫動物之活體內表現，能提供免疫刺激之免疫方法。比起對於免疫動物投予蛋白質抗原之一般免疫方法，DNA免疫可期待如下的優越性。
-可維持如GPC3之膜蛋白質之構造而提供免疫刺激
-無需精製免疫抗原
為了以DNA免疫獲得本發明之單株抗體，首先將表現GPC3蛋白質之DNA對於免疫動物投予。編碼為GPC3之DNA可利用PCR等公知方法合成。將獲得之DNA***適當表現載體並對於免疫動物投予。表現載體例如可以理想地利 用pcDNA3.1等市售表現載體。將載體對於活體投予之方法，可使用一般使用之方法。例如，可藉由將吸附有表現載體之金粒子以基因槍導入免疫動物個體之細胞內而實施DNA免疫。再者，認識GPC3之抗體之製作也可使用國際公開WO2003/104453記載之方法製作。
以此方式將哺乳動物免疫，確認血清中與GPC3結合之抗體力價上升後，從哺乳動物採取免疫細胞以供細胞融合。較佳之免疫細胞尤佳為使用脾細胞。
與前述免疫細胞融合之細胞，可使用哺乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞宜具有為了篩選的適當選擇標記。選擇標記，係指能於特定培養條件下生存之(或無法生存)之形質。選擇標記中，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損(以下簡稱為HGPRT缺損)、或胸腺嘧啶激酶缺損(以下簡稱為TK缺損)等為公知。具HGPRT或TK缺損之細胞，具有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸腺嘧啶感受性(以下簡稱為HAT感受性)。HAT感受性之細胞在HAT選擇培養基中無法合成DNA會死滅，但若與正常細胞融合則會利用正常細胞之補救合成路徑(salvage pathway)繼續合成DNA，故能在HAT選擇培養基中增殖。
HGPRT缺損或TK缺損之細胞，各可以含6硫鳥嘌呤(thioguanine)、8氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)、或5'溴去氧尿嘧啶之培養基選擇。於DNA中納入該等嘧啶類似物之正常細胞會死滅。另一方面，未納入該等嘧啶類似物之該等酵素缺損之細胞，能在選擇培養基中生存。其他稱為G418耐受 性之選擇標記，係利用新黴素耐受性基因提供對於2-去氧鏈黴胺(streptamine)系抗生物質(慶大黴素(gentamycin類似體)之耐受性。對細胞融合為理想的各種骨髓瘤細胞為公知。
如此的骨髓瘤細胞例如可理想地使用P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。
基本上可依照公知方法例如Keller與Milstein等人的方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，實施前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合。
更具體而言，可於例如細胞融合促進劑存在下於通常的營養培養液中實施前述細胞融合。融合促進劑可使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，為更提高融合效率，可視所望添加使用二甲基亞碸等輔助劑。
免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如相對於骨髓瘤細胞將免疫細胞定為1至10倍較佳。前述細胞融合使用之培養液，例如適於前述骨髓瘤細胞株增殖之RPMI1640培養液、MEM培養液、此外，可使用該種細胞培養使用之通常之培養液，再者，可理想地添加胎牛血清(FCS)等血清補液。
將前述培養液中充分混合，並且將預先加溫至約37℃之PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)以通常30至60%(w/v)之濃度添加。藉由將混合液緩慢混合，會形成所望之融合細胞(融合瘤)。接著，逐次添加上述列舉之適當培養液，反複實施離心並去除上清液之操作，可將對於融合瘤之生長不利的細胞融合劑等除去。
以如此方式獲得之融合瘤，可藉由於通常之選擇培養液，例如HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤、胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。為了使所望之融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可使繼續進行使用上述HAT培養液之培養足夠時間(通常該足夠時間為數日至數週)。其次，以通常之極限稀釋法，實施產生所望抗體之融合瘤之篩選及單一選殖。
以如此方式獲得之融合瘤，可利用因應細胞融合使用之骨髓瘤具有之選擇標記的選擇培養液而選擇。例如具HGPRT或TK缺損之細胞，可藉由以HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。亦即，當使用HAT感受性骨髓瘤細胞於細胞融合時，可在HAT培養液中將成功與正常細胞細胞融合的細胞選擇性增殖。為了使所望融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可以繼續使用上述HAT培養液之培養足夠時間。具體而言，一般可藉由數日至數週的培養而選擇所望之融合瘤。其次可利用通常之極限稀釋法，實施產生所望之抗體的融合瘤的篩選及單一選殖。
所望之抗體之篩選及單一選殖，可依照基於公知抗原抗體反應之篩選方法而理想地實施。例如，結合於GPC3 之單株抗體可以結合於在細胞表面表現的GPC3。如此的單株抗體例如可藉由FACS(fluorescence activated cell sorting)篩選。FACS係將與螢光抗體接觸之細胞以雷射光解析，並測定各個細胞發出之螢光，而可測定抗體對於細胞表面之結合的系統。
為了利用FACS篩選產生本發明之單株抗體的融合瘤，首先要製備表現GPC3之細胞。用於篩選之較佳細胞為使GPC3強制表現之哺乳動物細胞。藉由以當做寄主細胞之未經轉形之哺乳動物細胞為對照，可以選擇性檢測抗體對於細胞表面之GPC3的結合活性。亦即，藉由選擇產生未結合於寄主細胞而結合於GPC3強制表現細胞的抗體的融合瘤，可以取得產生GPC3單株抗體之融合瘤。
或抗體對於經固定化之GPC3表現細胞的結合活性可依據ELISA之原理評價。例如，將GPC3表現細胞固定化在ELISA平板的井。使融合瘤之培養上清液接觸井內之固定化細胞，以檢測結合於固定化細胞的抗體。單株抗體為小鼠來源時，與細胞結合之抗體可利用抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。該等篩選所選擇之產生具有對於抗原之結合能力的所望抗體的融合瘤，可利用極限稀釋法等選殖。
以此方式製作之產生單株抗體之融合瘤可在通常之培養液中繼代培養。而且，該融合瘤可於液態氮中長期保存。
將該融合瘤依照通常方法培養，可從其培養上清液取得所望之單株抗體。或可將融合瘤對於與其具適合性之哺乳動物投予使增殖，並從其腹水獲取單株抗體。前者之方法對 於獲得高純度抗體為適當。
從該融合瘤等抗體產生細胞選殖的抗體基因所編碼之抗體也可適當利用。藉由將經選殖的抗體基因納入適當載體並導入寄主，可以表現該基因所編碼的抗體。抗體基因之單離與對於載體之導入、及用於將寄主細胞轉形之方法，例如已由Vandamme等人確立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。下列所述重組抗體之製造方法亦為公知。
例如，可從產生抗GPC3抗體之融合瘤細胞取得編碼為抗GPC3抗體之可變區(V區)之cDNA。為此，通常首先從融合瘤萃取全體RNA。用於從細胞萃取mRNA之方法，例如可利用如下方法。
-胍(guanidine)超離心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)
萃取到的mRNA可使用mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等精製。或如QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等，也有用於從細胞直接萃取全體mRNA之市售套組。使用如此的套組，可從融合瘤取得mRNA。從獲得之mRNA使用反轉錄酵素可合成編碼為抗體V區之cDNA。cDNA可利用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業社製)等合成。又，為了cDNA之合成及放大，可適當利用SMART RACE cDNA放大套組(Clontech製)及使用PCR之5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。又，在如此的cDNA合成之過程中，可在cDNA的兩末端導入後述適當的限制酶部位。
從獲得之PCR產物精製目的之cDNA片段，其次與載體DNA連結。以如此方式製作重組載體，並導入大腸菌等，選擇群落(colony)後，從形成有該群落之大腸菌製備所望之重組載體。並且針對該重組載體是否具有目的cDNA之鹼基序列，可使用公知之方法例如二去氧核苷酸鏈終結法等確認。
為了取得編碼為可變區之基因，利用使用可變區基因放大用引子之5’-RACE法係屬簡便。首先，以從融合瘤細胞萃取之RNA當做模板，合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA庫。5’-RACE cDNA庫之合成可適當使用SMART RACE cDNA放大套組等市售套組。
以獲得之5’-RACE cDNA庫為模板，以PCR法將抗體基因放大。依據公知之抗體基因序列可設計小鼠抗體基因放大用之引子。此等引子為依免疫球蛋白之次類而各不相同的鹼基序列。因此，次類理想為預先使用Iso Strip小鼠單株抗體同種型決定套組(Roche diagnostics)等市售套組決定。
具體而言，當目的為取得例如編碼為小鼠IgG之基因時，可利用將編碼為當做重鏈之γ1、γ2a、γ2b、γ3、當做輕鏈之κ鏈與λ鏈的基因放大的引子。為了放大IgG之可變區基因，一般係利用於3'側之引子黏合有相當於接近可變區之恆定區之部分的引子。另一方面，5'側之引子係利用5’RACE cDNA庫製作套組所附帶的引子。
利用如此放大之PCR產物，可再構成由重鏈與輕 鏈之組合而成的免疫球蛋白。以再構成之免疫球蛋白對於GPC3之結合活性當做指標，可以篩選所望之抗體。例如目的為取得對抗GPC3之抗體時，抗體對於GPC3之結合，更佳為專一性的。與GPC3結合之抗體可藉由例如以下方式篩選；(1)使從融合瘤獲得之含有由cDNA編碼之V區的抗體接觸GPC3表現細胞之步驟、(2)檢測GPC3表現細胞與抗體之間的結合之步驟、及(3)選擇與GPC3表現細胞結合之抗體之步驟。
檢測抗體與GPC3表現細胞之間的結合的方法為公知。具體而言，可利用先前所述FACS等方法，檢測抗體與GPC3表現細胞間之結合。為了評價抗體之結合活性，可適當利用GPC3表現細胞之固定標本。
以結合活性為指標之抗體之篩選方法，亦宜使用利用噬菌體載體之淘選法。從多株抗體表現細胞群，以重鏈與輕鏈之次類之庫的形式取得抗體基因時，利用噬菌體載體之篩選方法係屬有利。編碼為重鏈與輕鏈之可變區之基因，可藉由以適當連結子序列連結，而形成單鏈Fv(scFv)。藉由將編碼為scFv之基因***噬菌體載體，可取得於表面表現scFv之噬菌體。該噬菌體與所望抗原接觸後，藉由回收與抗原結合之噬菌體，可以回收編碼為具目的結合活性之scFv的DNA。該操作可視需要反複實施，而將具所望之結合活性之scFv濃縮。
獲得編碼為目的抗GPC3抗體之V區的cDNA後，將該cDNA以認識***於該cDNA之兩末端的限制酶部位之限制酶消化者。較佳之限制酶，係認識構成抗體基因之鹼基序列 中出現頻度低之鹼基序列並消化。再者，為了將1副本的消化片段以正確方向***載體，宜***提供附著末端之限制酶。藉由將以上述方式經消化之編碼為抗GPC3抗體之V區的cDNA***適當表現載體，可以取得抗體表現載體。此時，若將編碼為抗體恆定區(C區)之基因、與編碼為前述V區之基因於框架內融合，則可取得嵌合抗體。在此，嵌合抗體係指恆定區與可變區之來源不同者。因此，除了小鼠-人類等的異種嵌合抗體，人類-人類同種嵌合抗體也包含在本發明之嵌合抗體。藉由預先在具恆定區之表現載體***前述V區基因，可以構建嵌合抗體表現載體。具體而言，可於例如保持有編碼為所望之抗體恆定區(C區)之DNA的表現載體之5’側，適當配置消化前述V區基因之限制酶之限制酶認識序列。藉由將以相同組合之限制酶消化過的兩者於框架內融合，可以構建嵌合抗體表現載體。
為了製造抗GPC3單株抗體，可以將抗體基因於由表現控制區控制之下表現的方式納入表現載體。用於表現抗體之表現控制區，例如包含增強子或啟動子。又，也可在胺基末端附加適當的信號序列，以使表現的抗體分泌到細胞外。後面記載之實施例係使用具胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列編號：3)之胜肽當做信號序列，但是也可加成其他適當的信號序列。將表現的多胜肽在上述序列之羧基末端部分切斷，切斷的多胜肽可以成熟多胜肽之形式分泌到細胞外。其次，藉由以該表現載體將適當的寄主細胞轉形，可以取得表現編碼為抗GPC3抗體之DNA的重組細胞。
為了表現抗體基因，可將編碼為抗體重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)之DNA納入分別的表現載體。藉由納入有H鏈與L鏈之載體，對於相同寄主細胞同時轉形(co-transfect)，可以表現具備H鏈與L鏈之抗體分子。或可將編碼為H鏈及L鏈之DNA納入單一的表現載體，而將寄主細胞轉形(參照國際公開WO 94/11523)。
用以藉由將經單離之抗體基因導入適當寄主而製作抗體之寄主細胞與表現載體的多數組合為公知。該等表現系均可應用於單離含有本發明之抗體可變區之域。真核細胞當做寄主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言，動物細胞例如以下細胞。
(1)哺乳類細胞、：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Vero等
(2)兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等
(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等
或植物細胞以煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬來源之細胞而得之抗體基因表現系為公知。植物細胞之轉形可以適當利用癒傷組織培養之細胞。
又，真菌細胞可以利用如下的細胞。
酵母：啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等糖化酵母(Saccharomyces)屬、甲醇同化酵母(Pichia pastoris)等Pichia屬
絲狀菌：黑麴黴(Aspergillus niger)等麴菌(Aspergillus)屬
又，利用原核細胞之抗體基因之表現系亦為公 知。例如使用細菌細胞時，可以適當利用大腸菌(E.coli)、枯草菌等細菌細胞。於該等細胞中，以轉形導入含有目的抗體基因之表現載體。藉由將經轉形之細胞於體外培養，可從該轉形細胞之培養物獲取所望之抗體。
重組抗體之產生，除了上述寄主細胞，尚可利用基因轉殖動物。亦即，從導入有編碼為所望抗體之基因的動物，可獲取該抗體。例如，抗體基因藉由於框架內***編碼為乳汁中固有產生之蛋白質的基因內部，可以構建融合基因。乳汁中分泌之蛋白質，例如可利用山羊β酪蛋白等。將含有***有抗體基因之融合基因的DNA片段注入山羊胚，並將該經注入之胚胎導入雌山羊體內。從接受胚胎的山羊產生之基因轉殖山羊(或其子孫)所產之乳汁，可以取得所望之抗體與乳汁蛋白質之融合蛋白質。又，為了增加從基因轉殖山羊產生之含所望之抗體之乳汁量，可對於基因轉殖山羊投予荷爾蒙(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
本說明書記載之抗原結合分子對於人類投予時，該抗原結合分子中之含有抗體可變區之域，可適當採用以降低對於人類之異種抗原性等為目的經人為改變過的基因重組型抗體來源的域。基因重組型抗體例如包含人類化(Humanized)抗體等。該等改造抗體可使用公知方法適當製造。
本說明書記載之用於製作抗原結合分子中的含有抗體可變區之域所使用之抗體之可變區，通常由***在4個框架區(FR)的3個互補性決定區(complementarity-determining region；CDR)構成。CDR係實質上決定抗體之結合專一性之區 域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列，即使在具有不同之結合專一性的抗體之間也常會顯示高度同一性。所以，一般可利用CDR之移植而將某抗體之結合專一性移植到其他抗體。
人類化抗體也稱為再構成(reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外之動物例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體而成之人類化抗體等為公知。為了獲得人類化抗體之一般基因重組方法亦為已知。具體而言，就將小鼠抗體之CDR移植到人類FR的方法而言，例如Overlap Extension PCR為公知。於Overlap Extension PCR，係對於用於合成人類抗體FR之引子中，附加編碼為待移植之小鼠抗體之CDR的鹼基序列。引子各準備4個FR。一般將小鼠CDR移植到人類FR時，選擇與小鼠之FR具高同一性之人類FR時，對於維持CDR機能為有利。亦即，一般較佳為利用與相鄰於待移植之小鼠CDR的FR之胺基酸序列為高同一性之胺基酸序列構成之人類FR。
又，連結之鹼基序列可設計為彼此於框架內連接。藉由各引子，可個別合成人類FR。其結果，可獲得於各FR附加有編碼為小鼠CDR之DNA的產物。各產物之編碼為小鼠CDR之鹼基序列，可設計成彼此重疊。接著，使以人類抗體基因為模板而合成之產物之重疊的CDR部分彼此黏合，進行互補鏈合成反應。利用該反應，人類FR經由小鼠CDR之序列而連結。
最後，將連結有3個CDR與4個FR之V區基因，利用黏合在其5'末端與3'末端並附加有適當之限制酶認識序列 的引子，將其全長放大。藉由將以上述方式獲得之DNA與編碼為人類抗體C區之DNA以於框架內融合之方式***於表現載體中，藉此可製作人類型抗體表現用載體。將該重組載體導入寄主並樹立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼為該人類化抗體之DNA表現，藉此使該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體(參照歐洲專利公開EP 239400、國際公開WO1996/002576)。
以定性或定量測定以上述方式製作之人類化抗體對於抗原之結合活性並進行評價，可以理想地選擇當經由CDR連結時該CDR會形成良好之抗原結合部位的人類抗體之FR。視需要，可以將FR之胺基酸殘基取代，使再構成人類抗體之CDR能形成適當的抗原結合部位。例如，應用將小鼠CDR移植到人類FR時使用之PCR法，可對於FR導入胺基酸序列之突變。具體而言，可對於與FR黏合之引子導入部分的鹼基序列的突變。以如此的引子合成之FR，導入有鹼基序列之突變。以上述方法測定並評價將胺基酸取代過的突變型抗體對於抗原之結合活性，可以選擇具所望性質之突變FR序列(Sato,K.et al.,Cancer Res,1993,53,851-856)。
又，可以將具有人類抗體基因所有曲目的基因轉殖動物(參照國際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)當做免疫動物，以DNA免疫取得所望之人類抗體。
再者，使用人類抗體庫以淘選取得人類抗體之技 術亦為已知。例如，將人類抗體之V區以單鏈抗體(scFv)之形式，以噬菌體呈現法使表現在噬菌體之表面。可以選擇表現與抗原結合之scFv的噬菌體。藉由解析選擇之噬菌體之基因，可以決定編碼為與抗原結合之人類抗體之V區的DNA序列。決定與抗原結合之scFv之DNA序列後，將該V區序列與所望之人類抗體C區之序列於框架內融合後***適當表現載體，可以製作表現載體。將該表現載體導入上述列舉之適當表現細胞中，並使編碼為該人類抗體之基因表現，可取得該人類抗體。該等方法已為公知(參照國際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
含有具Glypican3(GPC3)結合活性之抗體可變區之域
本說明書中，「含有具Glypican3(GPC3)結合活性之抗體可變區之域」係指含和上述GPC3蛋白質或其部分胜肽之一部分或全部專一性結合且互補之區而成之抗體之部分。含抗體可變區之域可由一或多數抗體之可變域提供。較佳為，含抗體可變區之域包含抗體輕鏈可變區(VL)與抗體重鏈可變區(VH)。如此之含抗體可變區之域，例如「scFv(single chain Fv)」、「單鏈抗體(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」或「F(ab')2」等。
含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域
本說明書中，「含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體 可變區之域」係指含和T細胞受體複合體之一部分或全部專一性結合且互補之區而成之T細胞受體複合體抗體之部分。T細胞受體複合體可為T細胞受體自身，也可為和T細胞受體一起構成T細胞受體複合體之適配子(adaptor)分子。適配子宜為CD3。
含具T細胞受體結合活性之抗體可變區之域
本說明書中，「含具T細胞受體結合活性之抗體可變區之域」，係指含和T細胞受體之一部分或全部專一性結合且互補之區而成之T細胞受體抗體之部分。
本發明之域所結合之T細胞受體之部分可以為可變區也可以為不變區，較佳為存在於不變區之抗原決定基。不變區之序列例如RefSeq註冊編號CAA26636.1之T細胞受體α鏈(序列編號：4)、RefSeq註冊編號C25777之T細胞受體β鏈(序列編號：5)、RefSeq註冊編號A26659之T細胞受體γ1鏈(序列編號：6)、RefSeq註冊編號AAB63312.1之T細胞受體γ2鏈(序列編號：7)、RefSeq註冊編號AAA61033.1之T細胞受體δ鏈(序列編號：8)之序列。
含具CD3結合活性之抗體可變區之域
本說明書中，「含具CD3結合活性之抗體可變區之域」，係指含和CD3之一部分或全部專一性結合且互補之區而成之CD3抗體之部分。較佳為該域包括抗CD3抗體之輕鏈可變區(VL)與抗CD3抗體之重鏈可變區(VH)。如此之域，例如「scFv(single chain Fv)」、「單鏈抗體(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」或「F(ab')2」 等。
本發明之含具CD3結合活性之抗體可變區之域只要是結合於存在於構成人CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈序列之抗原決定基即可，可為結合於任一抗原決定基者。本發明中，較佳為使用含有結合於存在人CD3複合體之ε鏈之細胞外區之抗原決定基之抗CD3抗體之輕鏈可變區(VL)與抗CD3抗體之重鏈可變區(VH)之域。如此的域，除了實施例記載之抗CD3抗體之輕鏈可變區(VL)與抗CD3抗體之重鏈可變區(VH)以外，尚有OKT3抗體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77,4914-4917)、各種公知之含CD3抗體之輕鏈可變區(VL)與CD3抗體之重鏈可變區(VH)之CD3結合域可理想地使用。又，可適當使用藉由將構成人CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈依前述方法對於所望動物進行免疫而取得之以具所望性質之抗CD3抗體作為起源之含抗體可變區之域。成為含具CD3結合活性之抗體可變區之域之起源之抗CD3抗體可適當使用如前述適當人化之抗體、人抗體。構成CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈之結構其多核苷酸序列記載於序列編號：9(NM_000073.2)、10(NM_000732.4)及11(NM_000733.3)，其多胜肽序列記載於序列編號：12(NP_000064.1)、13(NP_000723.1)及14(NP_000724.1)(括弧內代表RefSeq註冊編號)。
本發明之抗原結合分子之含抗體可變區之域可結合於相同之抗原決定基。在此，相同之抗原決定基可存在於由序列編號：2或序列編號：14之胺基酸序列構成之蛋白質中。或本發明之抗原結合分子之含抗體可變區之域可結合於彼此 不同的抗原決定基。在此，不同的抗原決定基可存在於由序列編號：2或序列編號：14之胺基酸序列構成之蛋白質中。
專一性
專一性係指專一性結合之分子中其中之一的分子對於其一或多數之結合對象的分子以外之分子未顯示任何顯著結合之狀態。又，含抗體可變區之域也可用在對於某抗原中所含之多數抗原決定基當中特定抗原決定基為專一性的情形。又，含抗體可變區之域所結合之抗原決定基包含在多數不同抗原時，具該含抗體可變區之域之抗原結合分子可以與含該抗原決定基之各種抗原結合。
抗原決定基
意指抗原中所存在之抗原決定基的抗原決定基，意指本說明書揭示之抗原結合分子中之含抗體可變區之域所結合之抗原上之部位。是以，例如抗原決定基可由其結構定義。又，也可利用認識該抗原決定基之抗原結合分子中對於抗原之結合活性將該抗原決定基定義。抗原為胜肽或多胜肽時，可以利用構成抗原決定基之胺基酸殘基指定抗原決定基。又，抗原決定基為糖鏈時，也可依特定之糖鏈構造指定抗原決定基。
直線狀抗原決定基，係含有認識胺基酸一次序列之抗原決定基的抗原決定基。直線狀抗原決定基典型上在固有序列含至少3個，且最普通為至少5個，例如約8~約10個、6~20個胺基酸。
立體構造抗原決定基係與直線狀抗原決定基為對照，為含抗原決定基之胺基酸之一次序列並非所認識之抗原決 定基之單一規定成分之抗原決定基(例如，胺基酸之一次序列不一定由規定抗原決定基之抗體所認識之抗原決定基)。立體構造抗原決定基可能包含相對於直線狀抗原決定基為增大之數目之胺基酸。關於立體構造抗原決定基之認識，抗體係認識胜肽或蛋白質之三維構造。例如當蛋白質分子折疊並形成三維構造時，形成立體構造抗原決定基之某胺基酸及/或多胜肽主鏈成為並排，且抗體可認識抗原決定基。決定抗原決定基之立體構造之方法，例如包含X射線結晶學、二維核磁共振分光學及部位專一性旋轉標定及電磁場磁性共振分光學，但不限於該等。例如，參照Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(編)。
以下例示確認含具有對於GPC3有結合活性之抗體可變區之域之待驗抗原結合分子對於抗原決定基之結合的確認方法，但是確認具有對於T細胞受體複合體有結合活性之含抗體可變區之域的待驗多胜肽聯合體其對於抗原決定基之結合之確認方法，也可依據下列例示適當實施。
例如含具有對於GPC3有抗原活性之抗體可變區之域的待驗抗原結合分子，其認識GPC3分子中存在之線狀抗原決定基之情事，例如可以如下方式確認。為了上述目的，合成由構成GPC3之細胞外域的胺基酸序列構成線狀胜肽。該胜肽可以化學合成。或，利用GPC3之cDNA中編碼為相當於細胞外域的胺基酸序列的區域，以基因工程的方法獲得。其次，評價由構成細胞外域之胺基酸序列構成的線狀胜肽、及含具有對GPC3有結合活性之抗體可變區之域的待驗抗原結合分子之 間的結合活性。例如，可藉由經固定化之線狀胜肽為抗原之ELISA，而評價該抗原結合分子對於該胜肽之結合活性。或，基於該抗原結合分子對於GPC3表現細胞之結合中，由於線狀胜肽所致之抑制的水平，解明對於線狀胜肽之結合活性。由於該等試驗，可以解明該多抗原結合分子對於線狀胜肽之結合活性。
又，含具有對於GPC3有抗原活性之抗體可變區之域的待驗抗原結合分子認識立體構造抗原決定基之情事，可如以下方式確認。為了上述目的，製備表現GPC3之細胞。例如具有含對於GPC3有抗原活性之抗體可變區之域的待驗抗原結合分子當接觸GPC3表現細胞時會強力結合於該細胞，另一方面，該抗原結合分子對於由構成經固定化之GPC3之細胞外域的胺基酸序列構成線狀胜肽實質上不結合時等。在此，實質上不結合，係指為對於人類GPC3表現細胞之結合活性之80%以下、通常50%以下、較佳為30%以下、尤佳為15%以下之結合活性。
測定含針對GPC3之抗原結合域的待驗抗原結合分子對於GPC3表現細胞之結合活性之方法，例如Antibodies A Laboratory Manual記載之方法(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。亦即，可依照以GPC3表現細胞當做抗原之ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)之原理評價。
ELISA格式中，含對於GPC3之抗原結合域的待驗抗原結合分子對於GPC3表現細胞之結合活性，可藉由比較酵 素反應所生成之信號水平而定量的評價。亦即於固定化有GPC3表現細胞之ELISA平板添加待驗抗原結合分子，並且利用認識待驗抗原結合分子之酵素標識抗體而檢測與細胞結合之待驗抗原結合分子。或者，於FACS，製作待驗抗原結合分子之稀釋系列，並藉由決定對於GPC3表現細胞之抗體結合力價(titer)，可比較待驗抗原結合分子對於GPC3表現細胞之結合活性。
待驗抗原結合分子對於懸浮於緩衝液等之細胞表面上表現的抗原的結合，可利用流式細胞計數儀檢測。流式細胞計數儀例如已知有以下裝置。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(均為BD Biosciences公司之商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均為Beckman Coulter公司之商品名)
例如，就含對於GPC3之抗原結合域的待驗抗原結合分子對於抗原之結合活性之理想測定方法，例如以下方法。首先，以認識與表現GPC3之細胞反應之待驗抗原結合分子的經FITC標記的二次抗體染色。將待驗抗原結合分子以適當的 緩衝液稀釋，將該抗原結合分子製備為所望濃度後使用。例如，可使用10μg/ml至10ng/ml之間的任一濃度。其次，利用FACSCalibur(BD公司)測定螢光強度及細胞數。抗體對於該細胞之結合量，係反映在使用CELL QUEST Software(BD公司)解析而得之螢光強度，亦即幾何平均值(Geometric Mean)。亦即，由該幾何平均值，可測定由待驗抗原結合分子之結合量表示之待驗抗原結合分子之結合活性。
含對於GPC3之抗原結合域的待驗抗原結合分子，與抗原結合分子共有抗原決定基之情事，可藉由兩者對於相同抗原決定基之彼此競爭而確認。抗原結合分子間之彼此競爭，可利用交叉阻斷試驗等檢測。例如彼此競爭ELISA分析係較佳的交叉阻斷試驗。
具體而言，交叉阻斷試驗中，係在微滴定平板的井上塗覆的GPC3蛋白質，於成為候選的彼此競爭抗原結合分子存在下、或不存在下預備溫育後，添加待驗抗原結合分子。與井中之GPC3蛋白質結合之待驗抗原結合分子之量，間接相關於與對於相同抗原決定基之結合成為彼此競爭的候選者的彼此競爭抗原結合分子之結合能力。亦即，若競爭抗原結合分子對於相同抗原決定基之親和性愈大，則待驗抗原結合分子對於塗覆有GPC3蛋白質之井之結合活性愈低。
經由GPC3蛋白質而與井結合之待驗抗原結合分子之量，可藉由預先標記抗原結合分子而輕易測定。例如，經生物素標記的抗原結合分子，可利用抗生物素過氧化酶接合體以及適當基質而測定。利用過氧化酶等酵素標記之交叉阻斷試 驗，特別稱為彼此競爭ELISA分析。抗原結合分子能以可檢測或測定之其他標記物質標記。具體而言，放射標記或螢光標記等為公知。
與於候選的彼此競爭抗原結合分子不存在下實施之對照試驗所得之結合活性比較，彼此競爭抗原結合分子若能阻斷含對於GPC3之抗原結合域的待驗抗原結合分子之結合至少20%、較佳為至少20-50%、更佳為至少50%，則該待驗抗原結合分子與彼此競爭抗原結合分子係實質上結合於相同抗原決定基，或對於相同抗原決定基之結合為彼此競爭的抗原結合分子。
含對於GPC3之抗原結合域的待驗抗原結合分子所結合之抗原決定基之構造在鑑定時，待驗多胜肽聯合體與對照抗原結合分子共有抗原決定基之情形，可藉由比較兩者之抗原結合分子對於在構成該抗原決定基之胜肽導入有胺基酸突變之胜肽的結合活性而評價。
如此測定結合活性之方法，例如可藉由比較前述ELISA格式中，待驗抗原結合分子及對照抗原結合分子對於導入有突變的線狀胜肽的結合活性而測定。就ELISA以外之方法而言，也可藉由將對於結合於管柱之該突變胜肽的結合活性，以使待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子流下該管柱後溶出到溶出液中之抗原結合分子進行定量而測定。使突變胜肽例如與GST之融合胜肽吸附於管柱之方法為公知。
又，當鑑定的抗原決定基為立體抗原決定基時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定基之情 事，可藉由以下方法評價。首先，製備表現GPC3之細胞以及表現對於抗原決定基導入有突變之GPC3的細胞。對於該等細胞懸浮於PBS等適當緩衝液而成的細胞懸浮液添加待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子。其次，對於經適當緩衝液洗滌的細胞懸浮液，添加能夠認識待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子的經FITC標記的抗體。利用FACSCalibur(BD公司)測定標記抗體所染色之細胞之螢光強度及細胞數。將待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之濃度以適當緩衝液適當稀釋以製備為所望濃度後使用。例如可使用10μg/ml至10ng/ml之間的任一濃度。標記抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST Software(BD公司)解析所獲得之螢光強度，亦即幾何平均值。亦即藉由獲得該幾何平均值，可以測定以標記抗體之結合量所代表之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之結合活性。
本方法中，例如「實質上不結合於突變GPC3表現細胞」之情事，可藉由以下方法判斷。首先，將已對於表現突變GPC3之細胞結合之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子以標記抗體染色。接著，檢測細胞之螢光強度。螢光檢測使用FACSCalibur當做流式細胞計數儀時，獲得之螢光強度可以使用CELL QUEST Software解析。從抗原結合分子存在下及非存在下之幾何平均值，將其比較值(△幾何平均)依下列計算式計算，可以求得抗原結合分子之結合所致之螢光強度之增加比例。
△幾何平均值=幾何平均值(抗原結合分子存在下)/幾何平均值(抗原結合分子非存在下)
將由解析獲得之反映待驗抗原結合分子對於突變GPC3表現細胞之結合量的幾何平均比較值(突變GPC3分子△幾何平均值)，與反映待驗抗原結合分子對於GPC3表現細胞之結合量的△幾何平均值比較值進行比較。於該情形，求取對於突變GPC3表現細胞及GPC3表現細胞之△幾何平均比較值時使用之待驗抗原結合分子之濃度調整為彼此相同或實質上為相同濃度尤佳。可利用預先確認認識GPC3中之抗原決定基的抗原結合分子當做對照抗原結合分子。
待驗抗原結合分子對於突變GPC3表現細胞之△幾何平均比較值，若比起待驗抗原結合分子對於GPC3表現細胞之△幾何平均比較值之至少80%、較佳為50%、更佳為30%、尤佳為15%還小，則判定為「實質上不結合於突變GPC3表現細胞」。求取幾何平均值(Geometric Mean)之計算式，記載於CELL QUEST Software User’s Guide(BD biosciences公司)。若比較比較值而其實質上可視為相同之程度，則可評價待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之抗原決定基為相同。
Fv(可變片段(variable fragment))
本說明書中，稱為「Fv(variable fragment)」的用語，係指由抗體之輕鏈可變區(VL(light chain variable region))與抗體之重鏈可變區(VH(heavy chain variable region))的配對構成的抗體而來的抗原結合域的最小單位。1988年Skerra與Pluckthun發現藉由在細菌的信號序列的下游***有抗體之基因的大腸 菌中誘導該基因表現，可以於均勻且保持活性的狀態從大腸菌之胞外質區分製備(Science(1988)240(4855),1038-1041)。從胞外質區分製備的Fv，係VH與VL以對於抗原具結合之態樣組合。
本說明書中，Fv例如以下之包含(1)二價之抗原結合域、(2)構成IgG1、IgG2a、IgG3或IgG4之Fc區之胺基酸當中含不具對於Fcγ受體之結合活性之Fc區的域、及(3)至少一價之CD3結合域之抗原結合分子中，輕鏈Fv片段及重鏈Fv片段含以具對於抗原CD3之結合的態樣組合並且構成CD3結合域之一組Fv亦為較佳；二價之scFv當中，一價之scFv以中間為構成CD3結合域之重鏈Fv片段而連結於構成Fc區之其中一個多胜肽，另一個一價之scFv以中間為構成CD3結合域之輕鏈Fv片段而連結於構成Fc區之另一多胜肽而成的二價之抗原結合域為二價之scFv。
scFv、單鏈抗體、或sc(Fv)2
本說明書中，「scFv」、「單鏈抗體」、或「sc(Fv)2」的用語係指在單一多胜肽鏈內，包含來自於重鏈及輕鏈兩者的可變區但是欠缺恆定區之抗體片段。一般而言，單鏈抗體更包含可形成能進行抗原結合的所望之構造的VH域與VL域之間的多胜肽連結子。單鏈抗體於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113卷，Rosenburg、及、Moore編，Springer-Verlag,New York,269~315(1994)中，由Pluckthun詳細考察。同樣地，參照國際專利申請案公開WO1988/001649及美國專利第 4,946,778號及美國專利第5,260,203號。特定態樣中，單鏈抗體也可為雙專一性、及/或人類化。
scFv係構成Fv之VH與VL以胜肽連結子連結成的抗原結合域(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85(16),5879-5883)。利用該胜肽連結子，VH與VL可以保持在接近的狀態。
sc(Fv)2係二個VL與二個VH之4個可變區以胜肽連結子等連結子連結成構成單鏈的單鏈抗體(J Immunol.Methods(1999)231(1-2),177-189)。該二個VH與VL也可來自不同的單株抗體。例如Journal of Immunology(1994)152(11),5368-5374揭示在相同抗原中存在認識二種抗原決定基之雙專一性(bispecific sc(Fv)2)。sc(Fv)2可以利用該技術領域人士公知之方法製作。例如，可藉由將scFv以胜肽連結子等連結子連結而製作。
本說明書中，構成sc(Fv)2之抗原結合域之構成，例如二個VH及二個VL以單鏈多胜肽之N末端側為基點，而依VH、VL、VH、VL([VH]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VL])之順序排列為特徵的抗體，但二個VH與2個VL之順序不特別限於上述構成，可以任意順序排列。例如以下順序之構成。
[VL]連結子[VH]連結子[VH]連結子[VL]
[VH]連結子[VL]連結子[VL]連結子[VH]
[VH]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VL]
[VL]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VH]
[VL]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VH]
針對sc(Fv)2之分子形態，在WO2006/132352已有詳細記載，該技術領域之人士可依據此等記載製作用於製作本說明書揭示之抗原結合分子用的適當所望之sc(Fv)2。
又，本發明之抗原結合分子也可接合PEG等擔體高分子或抗癌劑等有機化合物。又，可以***糖鏈附加序列並且適當附加使糖鏈獲得所望之效果。
結合抗體可變區之連結子，可使用能以基因工程導入之任意胜肽連結子、或合成化合物連結子(例如參照Protein Engineering,9(3),299-305,1996)揭示之連結子等，但本發明中以胜肽連結子較佳。胜肽連結子之長度不特別限定，可以視目的由該技術領域之人士適當選擇，但較佳長度為5個胺基酸以上(上限不特別限定，但通常為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。sc(Fv)2含有3個胜肽連結子時，可全部使用同長度之胜肽連結子，也可使用不同長度之胜肽連結子。
例如為胜肽連結子時：Ser
Gly‧Ser
Gly‧Gly‧Ser
Ser‧Gly‧Gly
Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：15)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：16)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：17)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：18)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：19)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：20)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：21)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：22)
(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：17))n
(Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：18))n
[n為1以上之整數]等。惟，該技術領域之人士可因應目的適當選擇胜肽連結子之長度或序列。
合成化學物連結子(化學交聯劑)為胜肽交聯通常可用之交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、二琥珀醯亞胺基辛二酸酯(DSS)、雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代雙(磺基琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(磺基琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二磺基琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(磺基-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧基羰氧基)乙基]碸(BSOCOES)、雙[2-(磺基琥珀醯亞胺氧基羰氧基)乙基]碸(磺基-BSOCOES)等，該等交聯劑有市售。
結合4個抗體可變區時，通常需要3個連結子，但可全部使用相同連結子也可使用不同的連結子。
Fab、F(ab’)2、或Fab’
「Fab」由一條輕鏈、及一條重鏈之CH1區域及可變區構成。Fab分子之重鏈無法與其他重鏈分子形成雙硫鍵。
「F(ab’)2」及「Fab’」，係指將免疫球蛋白(單株 抗體)以蛋白質分解酵素胃蛋白酶或木瓜酶等處理以製造，在鉸鏈區中之2條H鏈間存在之雙硫鍵的前後消化而生成之抗體片段。例如可製造將IgG以木瓜酶處理，將鉸鏈區中之2條H鏈間存在之雙硫鍵之上游切斷而由VL(L鏈可變區)與CL(L鏈恆定區)構成的L鏈、及由VH(H鏈可變區)與CHγ1(H鏈恆定區中之γ1區)構成之H鏈片段在C末端區以雙硫鍵結合之相同的2個抗體片段。該等2個相同的抗體片段分別稱為Fab'。
「F(ab’)2」包含二條輕鏈、及鏈間之雙硫鍵以形成於2條重鏈間之方式含有CH1域及CH2域之一部分恆定區之二條重鏈。構成本說明書揭示之抗原結合分子之F(ab’)2，可藉由將具所望之抗原結合域的全長單株抗體等以胃蛋白酶等蛋白質分解酵素予以部分消化後，使Fc片段吸附於PROTEIN A管柱而去除以理想地取得。該蛋白質分解酵素只要是藉由適當設定pH等酵素之反應條件而消化全長抗體以限制地產生F(ab’)2者即不特別限定，例如胃蛋白酶或無花果蛋白酶(ficin)等。
Fc區
構成本說明書揭示之抗原結合分子的Fc區，當將單株抗體等抗體以胃蛋白酶等蛋白質分解酵素予以部分消化後，使片段吸附於PROTEIN A管柱、或PROTEIN G管柱後，以適當溶出緩衝液等使溶出可以理想地取得。該蛋白質分解酵素只要是藉由適當設定pH等酵素之反應條件而能消化單株抗體等抗體者即不特別限定，例如胃蛋白酶或無花果蛋白酶(ficin)等。
本說明書記載之抗原結合分子中，包含構成 IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc區的胺基酸當中對於Fcγ受體之結合活性降低的Fc區。
抗體同種型係由恆定區之構造決定。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之各同種型之恆定區，各稱為Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。構成人類Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4之Fc區的多胜肽的胺基酸序列例如序列編號：23、24、25、26。構成各胺基酸序列之胺基酸殘基、與kabat之EU編號(本說明書也稱為EU INDEX)之間的關係如第12圖所示。
Fc區，係指包含二條輕鏈及以鏈間之雙硫鍵形成在2條重鏈間之方式包含CH1域及CH2域間之恆定區之一部分的二條重鏈的F(ab’)2以外的區。構成本說明書揭示之抗原結合分子之Fc區，可藉由將IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體等以胃蛋白酶等蛋白質分解酵素部分消化後，使吸附於PROTEIN A管柱之區分再溶出而理想地取得。該蛋白質分解酵素只要是藉由適當設定pH等酵素之反應條件而消化全長抗體以限制地產生F(ab’)2者即不特別限定，例如胃蛋白酶或無花果蛋白酶(ficin)等。
Fcγ受體
Fcγ受體係指能結合於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區的受體，也意指實質上由Fcγ受體基因所編碼之蛋白質之家族的各成員。人類中，該家族包含：含同功型(isoform)FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)；同功型FcγRIIa(含同種異型(allotype)H131及R131)、FcγRIIb(含FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及含FcγRIIc之FcγRII(CD32)；及含同 功型FcγRIIIa(含同種異型V158及F158)及FcγRIIIb(含同種異型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)，及各種未發現的人類FcγR類或FcγR同功型或同種異型，但不限於該等。FcγR包含人類、小鼠、大鼠、兔及猴來源，但不限於該等，可為各種生物來源。小鼠FcγR類，包含FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(CD16-2)、及各種未發現的小鼠FcγR類或FcγR同功型或同種異型，但不限於該等。如此的Fcγ受體，較佳例有人類FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16)及/或FcγRIIIB(CD16)。FcγRI之多核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：27(NM_000566.3)及28(NP_000557.1)，FcγRIIA之多核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：29(BC020823.1)及30(AAH20823.1)，FcγRI1B之多核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：31(BC146678.1)及32(AAI46679.1)，FcγRIIIA之多核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：33(BC033678.1)及34(AAH33678.1)，FcγRIIIB之多核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：35(BC128562.1)及36(AAI28563.1)(括弧內代表RefSeq註冊編號)。Fcγ受體是否對於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區具結合活性，除了上述記載之FACS或ELISA格式以外，可利用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面等離子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。
又，「Fc配體」或「效應子配體」係指與抗體之Fc區結合而形成Fc/Fc配體複合體之任意生物來源的分子，較佳為多胜肽。Fc配體對於Fc之結合，較佳為誘發1或更多的效應子機能。Fc配體包含Fc受體、FcγR、FcαR、FcεR、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖結合凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌之PROTEIN A、葡萄球菌之蛋白質G及病毒之FcγR，但不限於該等。Fc配體也包含與FcγR相同之Fc受體之家族Fc受體相同體(FcRH)(Davis et al.,(2002)Immunological Reviews 190,123-136)。Fc配體也包含與Fc結合之未曾發現的分子。
對於Fcγ受體之結合活性
Fc區對於FcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及/或FcγIIIB中任一Fcγ受體之結合活性降低之情事，除可藉由上述記載之FACS或ELISA格式，也可利用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面等離子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。
ALPHA篩選，係使用捐出者與接受者2個珠粒的ALPHA技術，依據下列原理實施。結合於捐出者珠粒的分子，會與結合於接受者珠粒之分子於生物學上交互作用，僅有2個珠粒於接近狀態時，檢測到發光信號。由雷射激發之捐出者珠粒內的光敏化劑，會將周邊的氧變換為激發狀態之單線態氧(singlet)。單線態氧會往捐出者珠粒周邊擴散，當到達接近的接受者珠粒時，會引起珠粒內之化學發光反應，最終發出光。當結合於捐出者珠粒之分子與結合於接受者珠粒之分子無交 互作用時，捐出者珠粒產生之單線態氧不會到達接受者珠粒，故不會引起化學發光反應。
例如，經生物素標記之抗原結合分子結合於捐出者珠粒，且於接受者珠粒有以谷胱甘肽S轉移酶(GST)標籤化之Fcγ受體結合。於不存在彼此競爭之具突變Fc區之抗原結合分子時，具野生型Fc區之抗原結合分子會與Fcγ受體交互作用，產生520-620nm之信號。具未經標籤化之突變Fc區的抗原結合分子，會與具野生型Fc區之抗原結合分子彼此競爭Fcγ受體間之交互作用。彼此競爭之結果，可藉由定量表現的螢光減少而決定相對的結合親和性。抗體等抗原結合分子使用Sulfo-NHS-生物素等予以生物素化之方法為公知。就將Fcγ受體以GST標籤化之方法，可適當採用將編碼為Fcγ受體之多核苷酸與編碼為GST之多核苷酸於框架內融合成的融合基因保持於可表現之載體之細胞等中表現，並使用谷胱甘肽管柱精製之方法等。獲得之信號例如可使用GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等軟體，利用非線形迴歸解析，並擬合於單部位彼此競爭(one-site competition)模型而適當解析。
若將觀察交互作用之物質的其中之一(配體)固定在感應晶片的金薄膜上，並從感應晶片的背側照光使在金薄膜與玻璃的境界面發生全反射，則一部分反射光會形成反射強度降低的部分(SPR信號)。若觀察交互作用之物質的其中另一者(分析物)流到感應晶片之表面並且配體與分析物結合，則經固定化的配體分子的質量會增加，且感應晶片表面之溶媒之折射 率會改變。由於該折射率之改變，SPR信號之位置會偏移(反之，若結合解離，會回到信號的位置)。Biacore系統取上述偏移量，亦即在感應晶片表面之質量變化為縱軸，表示質量之時間變化當做測定數據(傳感圖)。從傳感圖的曲線可以求取動力學：結合速度常數(ka)與解離速度常數(kd)，從該常數之比可求取親和性(KD)。BLACORE法也可適用抑制測定法。抑制測定法例如記載於Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010。
本說明書中，對於Fcγ受體之結合活性降低，係例如基於上述解析方法，比起當為對照之抗原結合分子之彼此競爭活性，待驗抗原結合分子之彼此競爭活性顯示50%以下、較佳為45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、20%以下、15%以下、尤佳為10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下之結合活性。
當做對照之抗原結合分子，可以適當使用具IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體之Fc區的多胜肽聯合體。該Fc區之構造，記載於序列編號：37(RefSeq註冊編號AAC82527.1之N末端加成A)、38(RefSeq註冊編號AAB59393.1之N末端加成A)、25(RefSeq註冊編號CAA27268.1之N加成A)、39(RefSeq註冊編號AAB59394.1之N末端加成A)。又，當使用具某特定同種型之抗體之Fc區之突變體的抗原結合分子當做待驗物質時，藉由以具該特定同種型之抗體之Fc區的抗原結合分子當做對照，可以驗證該突 變體具有之突變對於Fcγ受體之結合活性的效果。如上述，可以適當製作已驗證對於Fcγ受體之結合活性降低之具Fc區之突變體之抗原結合分子。
如此的突變體，例如依EU編號於特定胺基酸231A-238S缺失(WO 2009/011941)、C226S、C229S、P238S、(C220S)(J.Rheumatol(2007)34,11)、C226S、C229S(Hum.Antibod.Hybridomas(1990)1(1),47-54)、C226S、C229S、E233P、L234V、L235A(Blood(2007)109,1185-1192)等突變體為公知。
亦即，構成特定同種型之抗體之Fc區的胺基酸，依EU編號指定之下列任一胺基酸；220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、332位經取代之具Fc區之抗原結合分子為理想。Fc區之起源抗體之同種型不特別限定，可以適當利用以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體為起源之Fc區，但較佳為使用以IgG1抗體為起源之Fc區。
例如，構成IgG1抗體之Fc區的胺基酸當中，具施有依EU編號指定之下列任一取代(數字代表依EU編號指定之胺基酸殘基之位置，位於數字前之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基，位於數字後之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基)；
(a)L234F、L235E、P331S、
(b)C226S、C229S、P238S、
(c)C226S、C229S、
(d)C226S、C229S、E233P、L234V、L235A
(e)L234A、L235A或L235R、N297A
(f)L235A或L235R、S239K、N297A
之Fc區、或具231位至238位之胺基酸序列缺失之Fc區的抗原結合分子也可適當使用。
又，構成IgG2抗體之Fc區之胺基酸當中，施以依EU編號指定之下列任一取代(數字代表依EU編號指定之胺基酸殘基之位置，位於數字前之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基，位於數字後之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基)；
(g)H268Q、V309L、A330S、P331S
(h)V234A
(i)G237A
(j)V234A、G237A
(k)A235E、G237A
(l)V234A、A235E、G237A
之具有Fc區的抗原結合分子也可適當使用。
又，如下的抗原結合分子也可適當使用，構成IgG3抗體之Fc區之胺基酸當中，施有依EU編號指定下列任一取代(數字代表依EU編號指定之胺基酸殘基之位置，位於數字前之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基，位於數字後之單 字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基)；
(m)F241A
(n)D265A
(o)V264A。
又，構成IgG4抗體之Fc區之胺基酸當中，施有依EU編號指定下列任一取代(數字代表依EU編號指定之胺基酸殘基之位置，位於數字前之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基，位於數字後之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基)；
(p)L235A、G237A、E318A
(q)L235E
(r)F234A、L235A的具Fc區的抗原結合分子也可適當使用。
其他較佳例，例如構成IgG1抗體之Fc區之胺基酸當中，依EU編號指定之下列任一胺基酸；233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、331位取代為對應的IgG2或IgG4中其EU編號所對應之胺基酸的具Fc區的抗原結合分子。
作為其他理想例，構成IgG1抗體之Fc區之胺基酸中，依EU編號指定之下列任一或更多之胺基酸；234位、235位、297位取代成其他胺基酸之具Fc區之抗原結合分子。取代後存在之胺基酸之種類不特別限定，宜為234位、235位、297位中之任一或更多胺基酸取代為丙胺酸之具Fc區之抗原 結合分子尤佳。
作為其他理想例，例如構成IgG1抗體之Fc區之胺基酸中，依EU編號指定之下列任一胺基酸；265位取代成其他胺基酸之具Fc區之抗原結合分子。取代後存在之胺基酸種類不特別限定，265位之胺基酸取代為丙胺酸之具Fc區之抗原結合分子尤佳。
多專一性抗原結合分子
本發明之「多專一性抗原結合分子」之理想態樣之一可列舉多專一性抗體。當使用針對Fcγ受體之結合活性降低之Fc區作為多專一性抗體之Fc區時，也可以適當使用將多專一性抗體作為起源之Fc區。本發明之多專一性抗體尤佳為雙專一性抗體。在此，雙專一性抗體係指有2種不同之專一性之抗體。IgG型之雙專一性抗體可藉由使將2種產生IgG抗體之融合瘤予以融合而生成的混成融合瘤(hybrid hybridoma(quadroma))分泌(Milstein C et al.Nature(1983)305,537-540)。
又，IgG型雙專一性抗體係藉由將構成目的之二種IgG之L鏈及H鏈的基因共計四種基因導入細胞並使其共表現而分泌。但該等方法產生之IgG之H鏈與L鏈之組合理論上有10種。從10種IgG精製出由目的組合之H鏈L鏈構成的IgG有困難。再者，目的組合者的分泌量在理論上顯著降低，故需要大規模培養，製造上成本會更增加。
所以，本發明之多專一性抗原結合分子可適用促進目的組合之H鏈間及L鏈H鏈間之聯合之技術。
例如：多專一性抗體之聯合化可採用對於抗體H鏈之第2 不變區(CH2)或H鏈之第3不變區(CH3)之界面導入電荷性排斥而抑制非目的之H鏈彼此聯合之技術(WO2006/106905)。
於CH2或CH3之界面導入電荷性排斥而抑制非意圖之H鏈彼此聯合之技術中，在H鏈之另一不變區之界面接觸之胺基酸殘基，例如CH3區之EU編號356號殘基、EU編號439號殘基、EU編號357號殘基、EU編號370號殘基、EU編號399號殘基、EU編號409號殘基對應之區域。
更具體而言例如：可為含有2種H鏈CH3區之抗體，第1H鏈CH3區之以下之(1)~(3)所示之胺基酸殘基之群組選出之1組至3組胺基酸殘基有同種電荷之抗體；(1)為H鏈CH3區所含之胺基酸殘基且EU編號356位及439位之胺基酸殘基、(2)H鏈CH3區所含之胺基酸殘基且EU編號357位及370位之胺基酸殘基、(3)H鏈CH3區所含之胺基酸殘基且EU編號399位及409位之胺基酸殘基。
又，可製作從和上述第1H鏈CH3區為不同之第2H鏈CH3區之前述(1)~(3)所示之胺基酸殘基之群組選出之胺基酸殘基之群組且和前述第1H鏈CH3區有同種電荷之前述(1)~(3)所示之胺基酸殘基之群組所對應之1組至3組胺基酸殘基，具有和前述第1H鏈CH3區之對應之胺基酸殘基有相反電荷之抗體。
上述(1)~(3)記載之各胺基酸殘基於聯合時彼此接近。若為該技術領域中有通常知識者可針對所望之H鏈CH3區或H鏈不變區，利用使用市售軟體之同源性模擬等找到上述(1)~(3)之胺基酸殘基所對應的部位，能適當地將該部位之胺基酸殘基供改變。
上述抗體之「具有電荷之胺基酸殘基」宜從例如：以下(a)或(b)中任一群所含之胺基酸殘基選擇較佳；(a)麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)、(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
上述抗體中，「有同種電荷」，係指例如：2個以上之胺基酸殘基均具上述(a)或(b)中任一群所含之胺基酸殘基。「有相反電荷」，係指例如：2個以上之胺基酸殘基中之至少1個胺基酸殘基具有上述(a)或(b)中任一群所含之胺基酸殘基時，其餘的胺基酸殘基具有不同群所含之胺基酸殘基。
於理想態樣，上述抗體也可第1H鏈CH3區與第2H鏈CH3區利用雙硫鍵交聯。
本發明中供改變的胺基酸殘基不限於上述抗體之可變區或抗體之不變區之胺基酸殘基。若為該技術領域中有通常知識者，可針對多胜肽變異體或異種多聚體，利用使用市售軟體的同源性模擬等，找出形成界面之胺基酸殘基，並以控制聯合之方式將該部位之胺基酸殘基供改變。
本發明之多專一性抗體之聯合化可以更適用其他公知技術。藉由將存在於抗體之其中一H鏈之Fc區之胺基酸側鏈取代成較大側鏈(knob；突起)並將存在於另一H鏈之相對之Fc區之胺基酸側鏈取代成較小側鏈(hole；空隙)，以突起能配置於空隙內的方式，能有效率地使具Fc區之有不同胺基酸之多胜肽彼此之聯合化(WO1996/027011、Ridgway JB et al.,Protein Engineering(1996)9,617-621、Merchant AM et al.Nature Biotechnology(1998)16,677-681、US20130336973)。
此外，本發明之多專一性抗體之形成可更使用其他公知技術。藉由使用抗體之其中一H鏈之CH3之一部分為來自此部分所對應之IgA之序列，另一H鏈之CH3之互補部分導入了來自和此部分對應之IgA之序列而成的strand-exchange engineered domain CH3，能利用CH3的互補的聯合化有效率地引起有不同序列之多胜肽之聯合化(Protein Engineering Design & Selection,23；195-202,2010)。使用此公知技術也能有效率地形成目的之多專一性抗體。
此外，多專一性抗體之形成也可利用以下技術：WO2011/028952、WO2014/018572、Nat Biotechnol.2014 Feb；32(2)：191-8.記載之利用抗體之CH1與CL之聯合化、VH、VL之聯合化之抗體製作技術、WO2008/119353、WO2011/131746記載之使用各別製備之單株抗體彼此而製作雙專一性抗體之技術(Fab Arm Exchange)、WO2012/058768、WO2013/063702記載之控制抗體重鏈之CH3間之聯合之技術、WO2012/023053記載之製作由2種輕鏈與1種重鏈構成之雙專一性抗體之技術、Christoph等(Nature Biotechnology Vol.31,p 753-758(2013))記載之利用分別表現由1條H鏈與1條L鏈構成之抗體之一條鏈之2個細菌細胞株之製作雙專一性抗體之技術等。
又，即使無法有效率地形成目的之多專一性抗體，利用從產生之抗體之中將目的之多專一性抗體予以分離、精製，也可獲得本發明之多專一性抗體。例如有人報告以下方法：藉由於2種H鏈之可變區導入胺基酸取代而賦予等電點(pI) 之差異，可以將2種同體與目的之異體抗體以離子交換層析精製(WO2007114325)。又，作為精製異體之方法，至今已有人報告以下方法：使用Protein A精製由結合於Protein A之小鼠IgG2a之H鏈與不結合於Protein A之大鼠IgG2b之H鏈構成之異二聚化抗體(WO98050431、WO95033844)。又，藉由使用將為IgG與ProteinA之結合部位之EU編號435號及436號之胺基酸殘基取代成Tyr、His等向ProteinA之結合力不同之胺基酸而成的H鏈，或藉由使用依參考實施例5記載之方法取得之向ProteinA之結合力不同的H鏈，使各H鏈與Protein A之交互作用變化，並使用Protein A管柱，也可有效率地只精製異二聚化抗體。
又，也可取得能給予不同之多數H鏈結合能力之共通L鏈並當作多專一性抗體之共通L鏈使用。藉由將如此之共通L鏈與不同之多數H鏈基因導入到細胞以使IgG表現，能為良好效率之多專一性IgG之表現(Nature Biotechnology(1998)16,677-681)。選擇共通H鏈時，也可利用選擇對應於任意不同之H鏈且顯示高結合能力之共通L鏈之方法(WO2004/065611)。
又，作為本發明之Fc區，可適當使用Fc區之C末端之異質性經改善之Fc區。更具體而言，可提供構成IgG1、IgG2、IgG3或IgG4為起源之Fc區之二條多胜肽之胺基酸序列之中，依EU編號指定之446位之甘胺酸、及447位之離胺酸缺失之Fc區。
該等技術也可組合多數，例如組合2個以上使用。 又，該等技術可以對欲使其聯合之2個H鏈適當地分別適用。再者，該等技術也可對於針對上述Fcγ受體之結合活性降低之Fc區組合使用。又，本發明之抗原結合分子也可為將已施加上述改變者作為基礎，分別製作有同一胺基酸序列之抗原結合分子。
本發明之多專一性抗原結合分子如前述，只要包括如下的域即可，其結構不限定：(1)含有具Glypican3結合活性之抗體可變區之域、(2)含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域、及、(3)含有針對Fcγ受體之結合活性降低之Fc區之域。
本發明中，上述各域可利用胜肽鍵直接連結。例如：使用F(ab')2作為(1)及(2)之含抗體可變區之域，使用該等Fc區作為(3)含有針對Fcγ受體之結合活性降低之Fc區之域時，當將(1)及(2)記載之含抗體可變區之域與(3)記載之含Fc區之域以胜肽鍵連結時，已連結之多胜肽形成抗體之結構。為了製作如此的抗體，除了從前述融合瘤之培養液精製以外，也可從安定地保持編碼為構成該抗體之多胜肽之多核苷酸的所望寄主細胞之培養液將該抗體精製。
本發明之理想的具Glypican3結合活性之抗體可變區所含之抗體H鏈可變區，例如：表1記載之抗體H鏈可變區、或CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列和表1記載之抗體H鏈可變區擁有之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列有相同CDR序列之抗體H鏈可變區、或與該可變區為機能上同 等的抗體H鏈可變區。
又，本發明之理想之具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區可以列舉對於T細胞受體有結合活性之抗體可變區。T細胞受體之中CD3較理想，尤其CD3ε較佳。如此之抗體可變區所含之抗體H鏈可變區，例如：表2記載之抗體H鏈可變區、或CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列和表2記載之抗體H鏈可變區擁有之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列具有相同CDR序列之抗體H鏈可變區、或與該可變區為機能上同等之抗體H鏈可變區。
針對構成抗體H鏈胺基酸序列之胺基酸殘基之 CDR區與kabat編號之關係，列舉於第13圖。
本發明之具Glypican3結合活性之抗體可變區與具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區所含之抗體L鏈可變區，宜取得能給予對於Glypican3有結合活性之H鏈與對於T細胞受體複合體有結合活性之H鏈兩者之結合能力的共通L鏈，並將其作為多專一性抗原結合分子之共通L鏈可變區較佳。
本發明使用之共通之L鏈可變區可列舉：表3記載之L鏈可變區、或CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列和表3記載之抗體L鏈可變區擁有之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列有相同CDR序列之抗體L鏈可變區、或與該可變區為機能上同等之抗體L可變區。
構成抗體L鏈胺基酸序列之胺基酸殘基之CDR區 與kabat編號之關係列舉於第14圖。
在此，本發明中，「機能上同等」係指：針對抗原之結合親和性為同等、或作為多專一性抗原結合分子使用時，對於表現Glypican3之細胞或含該細胞之組織之細胞傷害活性為同等。結合親和性及細胞傷害活性可基於本說明書之記載測定。測定細胞傷害活性之細胞可使用表現GPC3之所望之細胞或含該細胞之所望組織，例如可使用表現GPC3之人癌細胞株PC-10或NCI-H446。又，可為抗體不變區對Fcγ受體之結合活性之降低為同等。
例如：和本說明書記載之抗體H鏈可變區(原本之H鏈可變區)為機能上同等之抗體H鏈可變區，係指當和本說明書記載之抗體L鏈可變區組合成原本之H鏈之配對時，結合親和性為同等，或作為多專一性抗原結合分子使用時，對於表現Glypican3之細胞或含該細胞之組織之細胞傷害活性為同等。又，和本說明書記載之抗體L鏈可變區(原本之L鏈可變區)為機能上同等之抗體L鏈可變區，係指當和本說明書記載之抗體H鏈可變區組合作為原本L鏈之配對時，結合親和性同等，或作為多專一性抗原結合分子使用時，對於表現Glypican3之細胞或含該細胞之組織之細胞傷害活性為同等。
又，「同等」不一定須為同程度之活性，也可活性增強。具體而言，可列舉：針對抗原之結合親和性之情形，和成為對照之抗體可變區之結合親和性(親KD值)比較之值(KD值/親KD值)為1.5以下的情形。KD值/親KD值之值較佳為1.3以下，更佳為1.2以下、1.1以下、1.0以下、0.9以下、 0.8以下、0.7以下、0.6以下、或0.5以下。下限無限制，例如10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、或10-6亦可。具體而言，本發明之KD值/親代KD值之值宜為10-6~1.5x10-0，更佳為10-6~10-1，再更佳為10-6~10-2，又更佳為10-6~10-3。細胞傷害活性之情形，可列舉和成為對照之多專一性抗原結合分子之細胞增殖抑制率(親代細胞增殖抑制率)比較之值(細胞增殖抑制率/親代細胞增殖抑制率)為0.7以上的情形。添加之多專一性抗原結合分子之濃度可適當決定，較佳為例如於0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、或1nM，較佳為0.05nM或0.1nM測定。細胞增殖抑制率/親代細胞增殖抑制率之值較佳為0.8以上，更佳為0.9以上、1.0以上、1.2以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上、10以上、或20以上。上限無限制，可為例如10、102、103、104、105、或106。
又，細胞傷害活性的情形，可列舉和相對於原本之多專一性抗原結合分子之細胞之50%增殖抑制濃度(親代細胞50%增殖抑制濃度)比較之值(細胞50%增殖抑制濃度/親代細胞50%增殖抑制濃度)為1.5以下的情形。50%增殖抑制濃度係指：和未添加多專一性抗原結合分子的情形相比，使細胞增殖率減半所須之多專一性抗原結合分子之濃度。「細胞50%增殖抑制濃度/親代細胞50%增殖抑制濃度」之值較佳為1.3以下，更佳為1.2以下、1.1以下、1.0以下、0.9以下、0.8以下、0.7以下、0.6以下、或0.5以下。下限無限制，例如10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、或10-6亦可。具體而言10-6~1.5x10-0較理想，更佳為10-6~10-1，又更佳為10-6~10-2，再更佳為10-6~10-3。
又，針對含具有GPC3結合活性之抗體可變區之域，針對GPC3(例如人GPC3)之KD值例如可為5x10-9M以下，較佳為4x10-9M以下，例如3x10-9M以下、2x10-9M以下、1x10-9M以下、8x10-10M以下、5x10-10M以下、4x10-10M以下、3x10-10M以下、2x10-10M以下、1x10-10M以下、8x10-11M以下、5x10-11M以下、4x10-11M以下、3x10-11M以下、2x10-11M以下、1x10-11M以下、8x10-12M以下、5x10-12M以下、4x10-12M以下、3x10-12M以下、2x10-12M以下、1x10-12M以下、8x10-13M以下、5x10-13M以下、4x10-13M以下、3x10-13M以下、2x10-13M以下、或1x10-13M以下。
又，針對含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域，針對人T細胞受體複合體，例如人T細胞受體，更具體而言例如人CD3ε鏈之KD值，可為例如2x10-7M以下，較佳為1.5x10-7M以下，例如1.4x10-7M以下、1.3x10-7M以下、1.2x10-7M以下、1x10-7M以下、3x10-8M以下、2x10-8M以下、1x10-8M以下、8x10-9M以下、5x10-9M以下、4x10-9M以下、3x10-9M以下、2x10-9M以下、1x10-9M以下、8x10-10M以下、5x10-10M以下、4x10-10M以下、3x10-10M以下、2x10-10M以下、1x10-10M以下、8x10-11M以下、5x10-11M以下、4x10-11M以下、3x10-11M以下、2x10-11M以下、1x10-11M以下、8x10-12M以下、5x10-12M以下、4x10-12M以下、3x10-12M以下、2x10-12M以下、或1x10-12M以下。
本發明之多專一性抗原結合分子較佳為針對人GPC3及人T細胞受體複合體(例如人CD3ε鏈)之KD值各為 5x10-9M以下及2x10-7M以下，更佳為各為1x10-9M以下及5x10-8M以下。
本發明之「機能上同等」之抗體可變區只要是符合上述條件之抗體H鏈可變區及/或抗體L鏈可變區即可，無特殊限定。如此的抗體可變區，例如：可於上述表1~3之可變區之胺基酸序列有1或多數胺基酸(例如1、2、3、4、5或10胺基酸)取代、缺失、附加及/或***。為了在胺基酸序列將1或多數胺基酸取代、缺失、附加及/或***之對於該技術領域中有通常知識者周知的方法已知有對於蛋白質導入變異之方法。例如：若為該技術領域中有通常知識者，可藉由使用部位專一性變異誘發法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,and Nakagawa,M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis.Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol.100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction.Nucleic Acids Res.12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A.82,488-492)等 於胺基酸序列導入適當變異，以製備和有上述機能之抗體可變區為機能上同等之可變區。
改變胺基酸殘基時，希望是變異成保守胺基酸側鏈之性質之另一胺基酸。例如胺基酸側鏈之性質可以列舉：疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、有脂肪族側鏈之胺基酸(G、A、V、L、I、P)、有含羥基之側鏈之胺基酸(S、T、Y)、有含硫原子之側鏈之胺基酸(C、M)、有含羧酸及醯胺之側鏈之胺基酸(D、N、E、Q)、有含鹼之側鏈之胺基酸(R、K、H)、及有含芳香族之側鏈之胺基酸(H、F、Y、W)(括弧內均表示胺基酸之單字母標記)。該等各群內之胺基酸之取代稱為保守性取代。已知具有藉由對於某胺基酸序列利用1或多個胺基酸殘基之缺失、附加及/或取代為其他胺基酸所為之修飾而得之胺基酸序列之多胜肽會維持其生物學活性(Mark,D.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81：5662-6；Zoller,M.J.and Smith,M.,Nucleic Acids Res.(1982)10：6487-500；Wang,A.et al.,Science(1984)224：1431-3；Dalbadie-McFarland,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79：6409-13)。含如此之胺基酸改變之本發明之可變區，和改變前之可變區之CDR序列、FR序列或可變區全體之胺基酸序列有至少70%，更佳為至少75%，更佳為至少80%，更佳為至少85%，又更佳為至少90%，最佳為至少95%之胺基酸序列同一性。本說明書之序列同一性，係定義為：以序列同一性成為最大的方式將序列排列，導入適當間隙(gap)後，和原本H鏈可變區或L鏈可變區之胺基 酸序列之殘基為相同之殘基之比例。胺基酸序列之同一性可以依後述方法決定。
又，「機能上同等之抗體可變區」，可由例如對於由編碼為上述表1~3記載之可變區之胺基酸序列之鹼序列構成之核酸於嚴格條件下雜交的核酸獲得。為了將在嚴格條件下和由編碼為可變區之胺基酸序列之鹼基序列構成之核酸雜交的核酸予以單離，嚴格的雜交條件可列舉：6M尿素、0.4% SDS、0.5 x SSC、37℃之條件或與其同等嚴格的雜交條件。若使用更嚴格的條件，例如：6M尿素、0.4% SDS、0.1 x SSC、42℃之條件，能期待單離相同性更高之核酸。雜交後之洗滌條件例如0.5xSSC(1xSSC係0.15M NaCL、0.015M檸檬酸鈉、pH7.0)、及0.1% SDS、60℃之洗滌，更佳為0.2xSSC、及0.1% SDS、60℃之洗滌，再更佳為0.2xSSC、及0.1% SDS、62℃之洗滌，又更佳為0.2xSSC、及0.1% SDS、65℃之洗滌，更佳為0.1xSSC、及0.1% SDS、65℃之洗滌。已單離之核酸之定序可依後述公知之方法實施。單離之核酸之相同性，在鹼基序列全體至少有50%以上，更佳為70%以上，更佳為90%以上(例如：95%、96%、97%、98%、99%以上)之序列同一性。
也可將上述利用雜交技術之方法改為使用採用依據編碼為可變區之胺基酸序列之鹼基序列資訊合成之引子之基因放大法，例如：聚合酶連鎖反應(PCR)法，可將會和由編碼為可變區之胺基酸序列之鹼基序列構成之核酸於嚴格條件下雜交的核酸予以單離。
鹼基序列及胺基酸序列之同一性可依Karlin與 Altschul之演算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：5873-7)決定。依此演算法，已開發出稱為BLASTN、BLASTX之程式(Altschul et al.,J.Mol.Biol.(1990)215：403-10)。當依據BLAST以BLASTN解析鹼基序列時，參數設為例如score=100、wordlength=12。又，依據BLAST利用BLASTX解析胺基酸序列時，參數設為例如score=50、wordlength=3。使用BLAST與Gapped BLAST程式時，使用各程式的預設參數。該等解析方法之具體手法為公知(NCBI(參照National Center for Biotechnology Information)之BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)之網站；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
本發明之多專一性抗原結合分子所含之有Glypican3結合活性之抗體可變區與有T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之組合，只要有上述活性即不特別限定，本發明中宜為多專一性抗原結合分子之細胞傷害活性和實施例3記載之雙專一性抗體GPC3_ERY22_rCE115為同等或更高之抗原結合分子較佳。在此，「同等」，如上述，不一定要是同程度之活性，活性也可增強。和GPC3_ERY22_rCE115比較為同等，可舉和GPC3_ERY22_rCE115之細胞增殖抑制率(細胞增殖抑制率(GPC3_ERY22_rCE115))比較而得之值(細胞增殖抑制率/細胞增殖抑制率(GPC3_ERY22_rCE115))為0.7以上，較佳為0.8以上、0.9以上、1.0以上、1.2以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上、10以上、或20以上的情形。上限不限制，例如可為10、102、103、104、105、或106。添加之多專一性抗原結合分子之濃度可適當決定，較佳為於例如0.01nM、 0.05nM、0.1nM、0.5nM、或1nM，較佳為0.05nM或0.1nM測定。
又，可舉和針對GPC3_ERY22_rCE115之細胞之50%增殖抑制濃度(50%增殖抑制濃度(GPC3_ERY22_rCE115))比較而得之值(細胞50%增殖抑制濃度/細胞50%增殖抑制濃度(GPC3_ERY22_rCE115))為1.5以下的情形。「細胞50%增殖抑制濃度/細胞50%增殖抑制濃度(GPC3_ERY22_rCE115)」之值較佳為1.3以下，更佳為1.2以下、1.1以下、1.0以下、0.9以下、0.8以下、0.7以下、0.6以下、或0.5以下。下限不限制，可以為例如10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、或10-6。具體而言，宜為10-6~1.5x10-0，更佳為10-6~10-1，更佳為10-6~10-2，又更佳為10-6~10-3。
又，針對人GPC3及人T細胞受體複合體(例如人CD3ε鏈)之理想之具體KD值亦如上述。又，細胞可使用表現GPC3之所望之細胞或含該細胞之所望組織，例如可使用表現GPC3之人癌細胞株PC-10或NCI-H446。
如此之有Glypican3結合活性之抗體可變區與有T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之組合，例如：表4記載之抗體H鏈可變區之組合、或CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列和表4記載之抗體H鏈可變區擁有之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列具同一CDR序列之抗體H鏈可變區之組合、或與該可變區為機能上同等之抗體H鏈可變區之組合。在此，「機能上同等」如上述記載。
對於如此之有Glypican3結合活性之抗體可變區與有T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之組合為理想之共通L鏈，例如：L0000、L0011、L0201、L0203、L0204、L0206、L0208、L0209、L0211、L0212、L0222、或共通L鏈之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列和此等共通L鏈之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列有同一CDR序列之共通L鏈。具體組合，例如：表5記載之抗體H鏈可變區及共通L鏈之組合、或CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列和表5記載之抗體可變區及共通L鏈擁有之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列有同一CDR序列之抗體可變區之組合、或與該可變區為機能上同等之抗體H鏈可變區及共通L鏈之組合。在此「機能上同等」如上述記載。
本發明之多專一性抗原結合分子所含之Fc區只要是對於Fcγ受體之結合活性降低之Fc區即無特殊限制，本發明之理想Fc區，例如：E22Hh之Fc區部分與E22Hk之Fc區部分之組合、E2702GsKsc之Fc區部分與E2704sEpsc之Fc區部分之組合、E2702sKsc之Fc區部分與E2704sEpsc之Fc區部分之組合。
本發明之理想多專一性抗原結合分子可列舉包括對於Glypican3有結合活性之抗體可變區與對於CD3ε有結合活性之抗體可變區之雙專一性抗體。和雙專一性抗體 GPC3_ERY22_rCE115相比較，細胞傷害活性為同等或更高較佳。如此的雙專一性抗體，例如：具表13記載之H鏈及L鏈之雙專一性抗體，或結合於和該抗體所結合之抗原決定基重複之抗原決定基且具有對於上述Fcγ受體之結合活性降低之Fc區之雙專一性抗體。
在此，某抗體是否認識和其他抗體重複之抗原決定基可利用兩者對於抗原決定基之競爭以確認。抗體間之競爭可利用競爭結合分析評價，就其方式可列舉酵素連結免疫吸附檢定法(ELISA)、螢光能量轉移測定法(FRET)、螢光微量測定技術(FMAT(註冊商標))等。和抗原結合之該抗體之量，與和對於重複之抗原決定基之結合競爭之候選競爭抗體(待驗抗體)之結合能力間接相關。亦即，待驗抗體對於重複之抗原決定基之量、親和性愈大，則該抗體向抗原之結合量愈低，待驗抗體向抗原之結合量愈增加。具體而言，同時對於抗原添加經適當標記之該抗體與待評價之抗體，利用標記檢測已結合之該抗體。和抗原結合之該抗體量可藉由預先標記該抗體而輕易測定。此標記無特殊限制，可選擇因應手法之標記方法。標記方法，具體而言可列舉螢光標記、放射標記、酵素標記等。
例如：對於已固定GPC3或CD3ε之珠粒同時添加經螢光標記之該抗體及未標記之該抗體或待驗抗體，以螢光微量測定技術檢測經標記的該抗體。
在此所指「和重複之抗原決定基結合之抗體」，係指就對於經標記之該抗體之結合量因為未標記之該抗體之結合減少50%之濃度(IC50)而言，待驗抗體能於未標記之該抗 體之IC50之通常、100倍，較佳為80倍，更佳為50倍，更佳為30倍，更佳為10倍高之濃度使標識該抗體之結合量減少至少50%之抗體。
具有和上述抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基結合之抗體之抗原結合部位的多專一性抗原結合分子可獲優良的細胞傷害活性。
本發明之多專一性抗原結合分子可依和前述重組抗體之製造方法為相同手法製作。
又，本發明係關於編碼為本發明之抗原結合分子之多核苷酸。本發明之抗原結合分子可以納入任意的表現載體。於表現載體將適當寄主轉形，可製成抗原結合分子之表現細胞。培養抗原結合分子之表現細胞，並從培養上清液回收表現產物，則可與得該多核苷酸所編碼之抗原結合分子。即本發明係關於含編碼為本發明之抗原結合分子之多核苷酸的載體、保持該載體之細胞、及包含培養該細胞並從培養上清液回收抗原結合分子之步驟的抗原結合分子之製造方法。該等可以依照與例如前述重組抗體為同樣的手法獲得。
醫藥組合物
於另一觀點，本發明提供一種將包含含有如下域之多專一性抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合物：(1)含有具Glypican3結合活性之抗體可變區之域、(2)含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域、及(3)含有針對Fcγ受體之結合活性降低之Fc區之域。又，本發明係關於含有該抗原結合分子作為有效成分之誘導細胞傷害之醫藥組合物。本發明之 醫藥組合物會誘導該細胞傷害，尤其T細胞依存性細胞傷害，且宜對於罹有對該活性為預防或治療所必要之疾病之對象或有再發可能性之對象較佳。
又，本發明之將含有以下域之多專一性抗原結合分子作為有效成分之細胞傷害誘導劑及細胞增殖抑制劑，可使用在包括對於對象投予該抗原結合分子之步驟之誘導細胞傷害之方法，或在製造細胞傷害誘導劑及細胞增殖抑制劑時使用及表現該抗原結合分子。
(1)含有具Glypican3結合活性之抗體可變區之域、(2)含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域、及(3)含有針對Fcγ受體之結合活性降低之Fc區之域。
本發明中「包含含有(1)含有具Glypican3結合活性之抗體可變區之域、(2)含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域、及、(3)含有針對Fcγ受體之結合活性降低之Fc區之域之多專一性抗原結合分子作為有效成分」，係指含有該抗原結合分子作為主要活性成分，該抗原結合分子之含有率不限制。
又，視需要可將本發明之多專一性抗原結合分子包封入微膠囊(羥基甲基纖維素、明膠、聚[甲基甲基丙烯酸]等微膠囊)、膠體藥劑運送系(微脂體、白蛋白微球體、微乳劑、奈米粒子及奈米膠囊等)(參照"Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition",Oslo Ed.(1980)等)。再者，藥劑製成緩釋性藥劑之方法亦為公知，該方法可適用在本發明之多專一性 抗原結合分子(J.Biomed.Mater.Res.(1981)15,267-277、Chemtech.(1982)12,98-105、美國專利第3773719號、歐洲專利公開公報EP58481號‧EP133988號、Biopolymers(1983)22,547-556)。
本發明之醫藥組合物、或細胞傷害誘導劑及細胞增殖抑制劑，可經口、非經口投予任一者對於患者投予。較佳為非經口投予。該投予方法具體而言例如注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。注射投予例如靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等。例如以注射投予可將本發明之醫藥組合物、或細胞傷害誘導劑及細胞增殖抑制劑全身或局部投予。又，可依患者年紀、症狀選擇適當投予方法。投予量例如一次投予體重每1kg可從0.0001mg至1000mg之範圍選擇投予量。或，可從例如每位患者在0.001mg/體重至100000mg/體重的範圍選擇投予量。但是本發明之醫藥組合物、或細胞傷害誘導劑及細胞增殖抑制劑不限於該等投予量。
本發明之醫藥組合物、或細胞傷害誘導劑及細胞增殖抑制劑可依常法製劑化(例如Remington's Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)，也可同時含有醫藥上可容許之擔體或添加物。例如界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、保存料、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、黏結劑、崩散劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等。又，不限於該等，可適當使用其他常用的擔體。具體而言，例如：輕質矽酸酐、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲纖維素鈣、羧甲纖維素鈉、 羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯縮醛二乙基胺基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化篦麻子油60、白糖、羧甲纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等可當做擔體。
又，本發明提供藉由使表現Glypican3抗原之細胞和會與該抗原結合之本發明之多專一性抗原結合分子接觸以傷害表現該抗原之細胞、或含該表現細胞之腫瘤組織之方法、或抑制該細胞或腫瘤組織之增殖之方法。會和該抗原結合之多專一性抗原結合分子作為在本發明之細胞傷害誘導劑及細胞增殖抑制劑含有之會和該抗原結合之本發明之抗原結合分子，如上述。會和該抗原結合之本發明之多專一性抗原結合分子所結合之細胞只要是表現該抗原之細胞即可，無特殊限定。
本發明中，「接觸」係藉由在例如試驗管內培養之GPC3抗原表現細胞之培養液中添加該與癌抗原結合之本發明之多專一性抗原結合分子而實行。於該情形，添加之抗原結合分子之形狀，可適當使用溶液或由冷凍乾燥等獲得之固體等形狀。以水溶液添加時，可為純粹僅含本發明之多專一性抗原結合分子之水溶液，也可為含例如上述記載之界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、保存料、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、黏結劑、崩散劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等之溶液。添加濃度不特別限定，就培養液中之最終濃度而言，較佳為1pg/ml至1g/ml之範圍，更佳為1ng/ml至1mg/ml，又更佳為於1μg/ml至1mg/ml。
又，本發明中，「接觸」在另一態樣中，也可藉 由對於將GPC3抗原現細胞移植到體內之非人類動物，或內在具表現該抗原之細胞的動物投予而實行。投予方法可以利用經口、非經口投予任一者實施。特佳為非經口投予的投予方法，該投予方法具體而言，例如注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。注射投予如靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等。例如利用注射投予可將本發明之醫藥組合物、或細胞傷害誘導劑及細胞增殖抑制劑對全身或局部投予。又，可由待驗動物年紀、症狀選擇適當投予方法。以水溶液投予時，可為純粹僅含本發明之多專一性抗原結合分子之水溶液，也可為含有例如上述記載之界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、保存料、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、黏結劑、崩散劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等之溶液。投予量例如一次投予體重每1kg可從0.0001mg至1000mg之範圍選擇投予量。或，可從例如每位患者在0.001mg/體重至100000mg/體重的範圍選擇投予量。但是本發明之多專一性抗原結合分子不限於該等投予量。
由於本發明之多專一性抗原結合分子之接觸引起表現構成該抗原結合分子之具有有Glypican3結合活性之抗體可變區之域所結合之表現Glypican3抗原之細胞中的細胞傷害的評價或測定方法，可適當使用以下方法。就於試管內評價或測定該細胞傷害活性之方法而言，例如細胞傷害性T細胞活性等測定法。本發明之多專一性抗原結合分子是否具T細胞性傷害活性，可以利用公知方法測定(例如Current protocols in Immunology,Chapter 7.Immunologic studies in humans,Editor, John E,Coligan et al.,John Wiley & Sons,Inc.,(1993)等)。活性測定時，使用和Glypican3為不同之抗原且與試驗使用之細胞未表現之抗原結合之抗原結合分子，與本發明之多專一性抗原結合分子同樣當做對照，藉由本發明之多專一性抗原結合分子比起當做對照使用之抗原結合分子顯示較強細胞傷害活性，可以判定活性。
又，為了於活體內評價或測定細胞傷害活性，例如將表現Glypican3抗原的細胞，移植到非人類待驗動物之皮內或皮下後，於當日或次日起每日或數日間隔將待驗抗原結合分子對於靜脈或腹腔內投予。藉由經日測定腫瘤大小，可以將該腫瘤大小的變化的差異規定為細胞傷害活性。與試管內的評價同樣投予成為對照之抗原結合分子，本發明之抗原結合分子之投予群中，腫瘤大小比起對照抗原結合分子之投予群中之腫瘤大小顯著為小時，可判定具細胞傷害活性。
對於表現Glypican3抗原的細胞增殖的抑制效果其評價或測定方法，可理想地使用經放射線同位素標定的胸腺嘧啶攝入細胞之測定或MTT法。又，就評價或測定於活體內之細胞增殖抑制活性的方法而言，可以理想地使用與上述記載於活體內評價或測定細胞傷害活性之方法為相同之方法。
又，本發明提供用於在本發明之方法使用的套組，其包含本發明之多專一性抗原結合分子或依照本發明之製造方法製造之多專一性抗原結合分子。該套組中可以更包裝有藥學上可容許之擔體、介質、記載使用方法之指示書等。
又，本發明係關於本發明之方法使用之本發明之多專一性 抗原結合分子或依照本發明之製造方法所製造之多專一性抗原結合分子。
又，本發明係關於具有GPC3結合活性之分子，包括本發明之多專一性抗原結合分子之具GPC3結合活性之含抗體可變區之域。又，本發明係關於具GPC3結合活性之分子，包括含有該分子所含之H鏈及L鏈各3個CDR(合計6個CDR)之H鏈及L鏈抗體可變區。又，本發明係關於具有T細胞受體複合體結合活性之分子，包括本發明之多專一性抗原結合分子之含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域。又，本發明係關於具T細胞受體複合體結合活性之分子，包括該分子所含之H鏈及L鏈之各3個CDR(合計6個CDR)之各H鏈及L鏈之抗體可變區。該等分子可為抗體也可為含有抗體之抗原結合片段之多胜肽。本發明係關於結合於和該等分子重複或競爭之抗原決定基之抗體或含其抗原結合片段之多胜肽。作為含有抗體之抗原結合片段之多胜肽可適當列舉scFv、單鏈抗體(single chain antibody)、Fv、scFv2(single chain Fv 2)、Fab及F(ab')2等。又，該等分子也可為非多專一性(雙專一性)，也可只結合在GPC3或T細胞受體複合體(例如CD3ε鏈)中的某一者。
該等分子包括：本說明書之實施例具體例示之包含多專一性抗原結合分子之具GPC3結合活性之含抗體可變區之域(包括具GPC3結合活性之H鏈可變區及共通L鏈可變區)之分子、本說明書實施例例示之包含多專一性抗原結合分子之含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域(包括具T 細胞受體複合體結合活性之H鏈可變區及共通L鏈可變區)之分子，此外包括此等分子所含之H鏈及L鏈之各3個CDR(合計6個CDR)且具有和相同抗原蛋白質(GPC3或T細胞受體複合體)結合之活性的分子。
該等分子因為和本發明之多專一性抗原結合分子的CDR共通，故可期待和本發明之多專一性抗原結合分子為重複之抗原決定基結合。因此該等分子藉由和本發明之多專一性抗原結合分子共存，能和本發明之多專一性抗原結合分子競爭。藉此，例如可作為用以抑制本發明之多專一性抗原結合分子之活性(抗原結合活性、細胞傷害活性、抗腫瘤活性等)的調節劑使用。又，藉由預先使此分子和目標蛋白質(GPC3或T細胞受體複合體)結合，檢測添加本發明之多專一性抗原結合分子時因為競爭而游離出來的分子，作為用以檢測本發明之多專一性抗原結合分子已結合於目標蛋白質之檢測劑為有用。此時該等分子也可適當地以螢光物質等標記。或該等分子也可以用於篩選結合於和本發明之多專一性抗原結合分子為重複之抗原決定基的新抗體。如上述，若預先使此分子和目標蛋白質(GPC3或T細胞受體複合體)結合，並添加待驗抗體，使已結合之分子游離出來，則此待驗抗體會成為和本發明之多專一性抗原結合分子重複之抗原決定基的抗體的候選者。藉此，能有效率地篩選新的多專一性抗原結合分子。
該等分子之H鏈可變區及L鏈可變區之CDR之具體組合直接作為本發明之多專一性抗原結合分子之各CDR之組合而使用在本說明書列舉者。該等分子之抗原親和性(KD值) 較佳為就本發明之多專一性抗原結合分子之KD值在本說明書例示之值，但不限定於此。
又，本發明也關於編碼為該等分子之核酸、已導入該核酸之載體、含該核酸或該載體之細胞、藉由培養該細胞以製造該分子之方法、及以該方法製得之分子。
又，本說明書引用之全部先前技術文獻納入本說明書作為參考。
【實施例】
以下依實施例對於本發明更詳細說明，但該等實施例不限制本發明之範圍。
[實施例1]GPC3_ERY22_rCE115之製作與細胞傷害活性之測定
(1-1)GPC3_ERY22_rCE115之製作
將針對癌抗原(GPC3)之IgG作為基本骨架，製作其中一Fab置換成針對CD3 epsilon之結合域之形式之分子。此時，作為基本骨架之IgG之Fc係使用向FcgR(Fcγ受體)之結合性減弱之靜默型Fc。作為針對GPC3之結合域，使用抗GPC3抗體H0000(序列編號：40)/GL4(序列編號：41)。又，作為針對CD3之結合域，使用抗CD3抗體rCE115H/rCE115L(序列編號：42/序列編號：43)。
作為抗體H鏈不變區，使用已去除IgG1之C末端之Gly及Lys的G1d，並將其和H0000/GL4及rCE115H/rCE115L組合使用。又，令抗體H鏈不變區之名稱為H1時，可變區帶有H0000之抗體之H鏈所對應的序列示如H0000-H1。在此，顯 示胺基酸之改變時，係以D356K之方式表示。開頭的字母(D356K之D)代表改變前之胺基酸殘基以單字母表記表示時之字母，接續的數字(D356K之356)係指此改變處之EU編號，最後的字母(D356K之K)係指改變後之胺基酸殘基以單字母表示時之字母。依參考實施例1之方法製備IgG1之C末端之Gly及Lys已除去之G1dh(序列編號：44)、於G1dh導入了L234A/L235A/Y349C/T366W之變異之ERY22_Hk(序列編號：45)、於G1dh導入了L234A/L235A/D356C/T366S/L368A/Y407V之變異之ERY22_Hh(序列編號：46)。於各自之H鏈導入的L234A及L235A之變異會減弱向FcgR(Fcγ受體)之結合性，且Y349C/T366W及D356C/T366S/L368A/Y407V之變異係為了使產生由2個H鏈構成之異二聚化抗體時能有效率地使各H鏈之異體形成而導入。
依參考實施例1製作針對GPC3之Fab之VH域與VL域經置換之異二聚化抗體GPC3_ERY22_rCE115(第1圖a)。
亦即，依照使用和上述方法同樣之附加適當序列之引子的PCR法等該技術領域中有通常知識者公知之方法，製作分別***了編碼為GL4-ERY22_Hk(序列編號：47)、H0000-ERY22_L(序列編號：48)、rCE115H-ERY22_Hh(序列編號：49)、rCE115L-k0(序列編號：50)之多核苷酸的一系列表現載體。
將以下所示組合之表現載體導入到FreeStyle293-F細胞，使目的分子暫時性表現。
目的分子：GPC3_ERY22_rCE115
由已***到表現載體之多核苷酸編碼之多胜肽：GL4-ERY22_Hk、H0000-ERY22_L、rCE115H-ERY22_Hh、rCE115L-k0
(1-2)GPC3_ERY22_rCE115之精製
將獲得之培養上清添加到Anti FLAG M2管柱(Sigma公司)，實施管柱洗滌後實施使用0.1mg/mL FLAG胜肽(Sigma公司)所為之溶出。將含有目的分子之級分添加到HisTrap HP管柱(GE Healthcare公司)，該管柱洗滌後，實施利用咪唑之濃度梯度進行溶出。將含有目的分子之級分利用超過濾濃縮後，將該級分添加到Superdex 200管柱(GE Healthcare公司)，只回收溶出液之單體級分，藉此獲得經精製之各目的分子。
(1-3)使用人末梢血單核球之GPC3_ERY22_rCE115之細胞傷害活性之測定
針對GPC3_ERY22_rCE115檢查活體外(in vitro)之細胞傷害活性。
(1-3-1)人末梢血單核球(PBMC)溶液之製備
使用預先將1,000單位/mL之肝素溶液(Novo‧heparin注5千單位，Novonordic公司)100μL注入的注射器，從健常人自願者(成人)抽取末梢血50mL。將以PBS(-)稀釋2倍後進行4等分而得之末梢血加到預先注入15mL之Ficoll-Paque PLUS並實施離心操作之Leucosep淋巴球分離管(Cat.No.227290、Greiner bio-one公司)中。將該分離管離心分離(2,150rpm、10分鐘、室溫)後分取單核球級分層。以含有10%FBS之Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(SIGMA公司、以下 10%FBS/D-MEM)洗滌單核球級分之細胞1次後，將該細胞使用10%FBS/D-MEM製備成細胞密度為4×106/mL。將以此方式製備之細胞溶液作為人PBMC溶液供以後之試驗。
(1-3-2)細胞傷害活性之測定
細胞傷害活性係以使用xCELLigence即時細胞分析儀(Roche Diagnostics公司)之細胞增殖抑制率評價。目標細胞使用表現人GPC3之NCI-H446人癌細胞株或PC-10人癌細胞株。將NCI-H446或PC-10從培養皿剝離，以成為1×104 cells/well之方式以100μL/well接種在E-Plate 96(Roche Diagnostics公司)板，並使用xCELLigence即時細胞分析儀開始測定活細胞之測定。次日，從xCELLigence即時細胞分析儀取出板，於該板添加製備成各濃度(0.004、0.04、0.4、4、40nM)之各抗體50μL。於室溫使其反應15分鐘後加入(1-2)製備之人PBMC溶液50μL(2×105 cells/well)，將該板再設置於xCELLigence即時細胞分析儀以開使活細胞之測定。反應於5%二氧化碳氣體、37℃之條件下實施，從人PBMC添加72小時後之細胞索引值依下式求出細胞增殖抑制率(%)。計算使用之細胞索引值係使用標準化成即將添加抗體時之細胞索引值為1後之數值。
細胞增殖抑制率(%)=(A-B)×100/(A-1)
A代表未添加抗體之井之細胞索引值之平均值(只有目標細胞與人PBMC)，B代表各井之細胞索引值之平均值。試驗重複三次。
將由人血液製備之PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)作為效應子細胞，測定GPC3_ERY22_rCE115之細胞傷害活性，結果認為有極強的活性(第2圖)。
[實施例2]抗CD3抗體rCE115之H鏈之人化、及共通L鏈化
(2-1)rCE115人化H鏈可變區hCE115HA之設計
實施抗CD3抗體rCE115之H鏈可變區(序列編號：42)之人化。CDR、FR之決定係依照Kabat之定義(Kabat編號)。
首先比較資料庫上之人抗體可變區序列與rCE115大鼠可變區序列以選擇人FR序列。資料庫係利用IMGT Database(http：//www.imgt.org/)及NCBI GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。藉由將rCE115可變區之H鏈之CDR序列和選擇之人FR序列連結，設計人化H鏈可變區序列。命其為人化H鏈可變區序列hCE115HL(序列編號：51)。
於選擇之人H鏈FR3之序列，Kabat編號表示之93號胺基酸殘基為Ala，但rCE115可變區序列之胺基酸殘基為Arg。從大鼠及人之生殖腺序列之資料庫IMGT Database(http：//www.imgt.org/)確認該部位含有Arg之序列少。又，據報告Kabat編號表示之94號胺基酸殘基會形成上核(upper core)而有助於抗體結構之安定化(Ewert等人(Methods.2004 Oct；34(2)：184-99))。由該等資訊，重新設計H鏈FR3之Kabat 93號、94號胺基酸殘基取代為在rCE115可變區序列存在之殘基而得的人化H鏈可變區序列。命其為人化H鏈可變區序列hCE115HA(序列編號：52)。
(2-2)抗CD3抗體rCE115與抗GPC3抗體之共通L鏈L0000之設計
實施抗CD3抗體rCE115之L鏈可變區rCE115L(序列編號：43)與抗GPC3抗體之L鏈可變區GL4(序列編號：41)之FR/CDR曳步(shuffling)。
選擇GL4之FR序列作為L鏈FR序列。L鏈CDR2在rCE115L與GL4為相同。L鏈CDR1從GL4，L鏈CDR3從rCE115L之CDR序列分別選擇。再者，重新設計將選擇之L鏈CDR3之Kabat 94號胺基酸殘基Asp取代成於GL4存在之殘基Val而得的L鏈CDR3。
藉由將上述選擇之FR與CDR予以連結，設計人化L鏈可變區序列。命其為人化L鏈可變區序列L0000(序列編號：53)。
(2-3)針對人GPC3之親和性之評價
評價使用GL4(序列編號：41)與L0000(序列編號：53)作為L鏈可變區時之針對人GPC3之結合活性。分子型係以利用knobs-into-hole而異化之人IgG1之Fc區帶有1個Fab之單臂抗體實施。抗GPC3抗體之H鏈可變區使用H0000(序列編號：40)。
抗GPC3抗體對抗原之親和性與結合速度常數使用利用BiacoreTM-T200(GEHealthcare Japan)所為之表面電漿共振分析之multi-cycle kinetics法測定。運行緩衝液使用HBS-EP+(GEHealthcare Japan)，並使用胺偶聯套組(GEHealthcare Japan)使Protein A/G共價鍵結於CM5晶片(羧 基甲基葡聚糖被覆晶片)。各抗GPC3抗體係製備成在Protein A/G捕捉約100RU。作為分析物使用之人GPC3係使用HBS-EP+，製備成8、16、32、64、128nM。測定先使抗體溶液捕捉於Protein A/G，再以流速30μL/min注射人GPC3溶液3min以使其反應，之後切換成HBS-EP+，測定解離相15min。解離相之測定結束後，以10mM Gly-HCl,pH1.5洗滌，將傳感晶片再生。濃度0之測定係同樣使抗體溶液捕捉於Protein A/G，注射HBS-EP+3min使其反應，之後切換成HBS-EP+，測定解離相15min。解離相之測定結束後以10mM Gly-HCl,pH 1.5洗滌，將傳感晶片再生。從獲得之傳感圖使用Biacore專用之數據解析軟體Biacore T200 Evaluation Software Version 1.0實施速度論的解析，並算出結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd)及速度常數比。結果示於表6。
(2-4)針對人CD3之親和性之評價
評價使用hCE115HA(序列編號：52)作為H鏈可變區，使用L0000(序列編號：53)作為L鏈可變區時針對人CD3之結合活性。分子型係以利用knobs-into-hole異化之人IgG1之Fc區帶有1個Fab之單臂抗體實施。
抗CD3抗體對抗原之親和性與結合速度常數使用利用BiacoreTM-T200(GEHealthcare Japan)所為之表面電漿共 振分析之single-cycle kinetics法測定。運行緩衝液使用HBS-EP+(GEHealthcare Japan)，並使用胺偶聯套組(GEHealthcare Japan)使人CD3共價鍵結於CM4晶片(羧基甲基葡聚糖被覆晶片)。作為分析物使用之抗CD3抗體係使用HBS-EP+，製備成5、20μg/mL。測定先使抗體溶液捕捉於Protein A/G，再以流速20μL/min連續注射5、20μg/mL之抗CD3抗體溶液各3min以使其反應，之後切換成HBS-EP+，測定解離相3min。解離相之測定結束後，以10mM Gly-HCl,pH1.5洗滌，將傳感晶片再生。濃度0之測定係連續各注射HBS-EP+各3min進行2次使其反應，之後切換成HBS-EP+，測定解離相3min。解離相之測定結束後以10mM Gly-HCl,pH 1.5洗滌，將傳感晶片再生。從獲得之傳感圖使用Biacore專用之數據解析軟體Biacore T200 Evaluation Software Version 1.0實施速度論的解析，並算出結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd)及速度常數比。結果示於表7。
(2-5)GPC3_ERY27_hCE115之製作
將針對癌抗原(GPC3)之IgG4作為基本骨架，將其中一Fab之H鏈可變區替換為針對CD3 epsilon之結合域，製作L鏈於兩者的Fab為共通形式的ERY27分子(第1圖b)。此時，作為基本骨架之IgG4之Fc係使用向FcgR(Fcγ受體)之結合性減弱 之靜默型Fc。針對GPC3之結合域之H鏈可變區使用H0000(序列編號：40)，針對CD3之結合域之H鏈可變區使用hCE115HA(序列編號：52)。又，L鏈可變區使用L0000(序列編號：53)。對於各H鏈導入之D356K及K439E之變異，係為了於產生由2個H鏈構成之異二聚化抗體時，能有效率地形成各H鏈之異體而導入(WO2006/106905)。H435R係妨礙向Protein A之結合之改變，係為了能以良好效率地將異體與同體分離而導入(WO/2011/078332)。
依公知方法，製作***了分別編碼為H0000-ERY27_HK(序列編號：54)、hCE115HA-ERY27_HE(序列編號：55)、L0000-k0(序列編號：56)之多核苷酸之一系列表現載體。
將以下所示組合之表現載體導入到FreeStyle293-F細胞，使各目的分子暫時性表現。
目的分子：GPC3_ERY27_hCE115
由***於表現載體之多核苷酸編碼之多胜肽：H0000-ERY27_HK、hCE115HA-ERY27_HE、L0000-k0
(2-6)GPC3_ERY27_hCE115之精製
依實施例1-2記載之方法精製各目的分子。
(2-7)使用人末梢血單核球之細胞傷害活性之測定
(2-7-1)人末梢血單核球(PBMC：Peripheral Blood Mononuclear Cell)溶液之製備
以實施例1-3-1記載之方法製備。
(2-7-2)細胞傷害活性之測定
以實施例1-3-2記載之方法測定。
將從人血液製備之PBMC作為效應子細胞，測定GPC3_ERY27_hCE115之細胞傷害活性，結果：認為因rCE115之H鏈之人化、及共通L鏈化導致活性降低(第2圖)。
[實施例3]為了各種性質之改善之人化雙專一性抗體改變體之製作與評價
實施例2獲得之人化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體GPC3_ERY27_hCE115(序列編號54、55、56)之T細胞依存的細胞傷害活性比起GPC3_ERY22_rCE115(序列編號47、48、49、50)之T細胞依存的細胞傷害活性還低。此據認為係：因為人化及L鏈共通化導致向GPC3及CD3ε鏈之親和性減弱。至今並無針對帶有獨立序列之GPC3及CD3ε鏈抗原使用共通抗體L鏈使針對兩抗原之親和性提高，並使T細胞依存的細胞傷害活性增強之人化雙專一性抗體之報告。故，以前認為：取得顯示和GPC3_ERY22_rCE115有同等或更高藥效之人化抗體雙專一性係為困難。
在如此的狀況中，本案申請人藉由依該技術領域中有通常知識者公知之方法，即製作針對人GPC3及人CD3ε鏈兩抗原之抗體基因之胺基酸殘基之網羅的取代體，並實施各種篩選評價，藉此製作針對人GPC3及人CD3ε鏈之親和性有所改變之人化雙專一性改造抗體。又，依同樣手法，製作物理化學性質改變之人化雙專一性改造抗體。再者，藉由取得為了使親和性及物理化學性質變化之有效果的胺基酸殘基取代，製作和人化前之GPC3_ERY22_rCE115之T細胞依存的細胞傷害 活性帶有同等或更高之TDCC活性之最適化雙專一性抗體。
人化雙專一性抗體最適化之點突變導入、抗體表現精製、抗原親和性測定、T細胞依存的細胞傷害活性測定，係以和實施例1、2同樣的方法實施CDR、FR之決定依照Kabat之定義(Kabat編號)。
又，因應目的，使用下者作為抗體H鏈不變區(編號為EU編號)。使用針對人IgG1導入了L234A/L235A/N297A/D356C/T366S/L368A/Y407V/G446缺損/K447缺損變異之E22Hh(序列編號57)、針對人IgG1導入了L234A/L235A/N297A/Y349C/T366W/G446缺損/K447缺損變異及在緊鄰118之前導入了Ser-Ser***變異之E22Hk(序列編號58)、針對人IgG1導入了D356C/T366S/L368A/Y407V/G446缺損/K447缺損變異之G1dh、針對人IgG1導入了118-215缺損變異及C220S/Y349C/T366W/H435R變異之none-Hi-Kn010G3、針對人IgG4導入了L235R/S239K/N297A/E356K/R409K/H435R/L445P/G446缺損/K447缺損變異之E2702GsKsc(序列編號60)、針對人IgG4導入了K196Q/L235R/S239K/N297A/R409K/K439E/L445P/G446缺損/K447缺損變異之E2704sEpsc(序列編號61)、針對人IgG4導入了L235R/S239K/N297A/E356K/R409K/L445P/G446缺損/K447缺損變異之E2702sKsc(序列編號62)。又，作為抗體L鏈不變區，使用人κ鏈之k0(序列編號63)、針對人κ鏈導入了R108A/T109S變異之E22L(序列編號432)。
EU編號356號Asp取代為Cys之變異、及EU編 號366號The取代為Ser之變異、及EU編號368號Leu取代為Ala之變異、及EU編號407號Tyr取代為Val之變異、及EU編號349號Tyr取代為Cys之變異、及EU編號366號Thr取代為Trp之變異、及在緊鄰118號前***Ser-Ser之變異係為了於產生異抗體時能有效率地使各H鏈之異分子形成者。同樣，EU編號356號Glu取代為Lys之變異及EU編號439號Lys取代為Glu之變異係為了使產生異抗體時各H鏈之異分子能有效率地形成者。藉此，可期待雙專一性抗體之生成效率改善。
EU編號234號Leu取代為Ala之變異、及EU編號235號Leu取代為Ala或Arg之變異、及EU編號239號Ser取代為Lys之變異、及EU編號297號Asn取代為Ala之變異係為了使針對Fcγ受體及補體(C1q)之親和性減弱之變異。藉此，可期待：抑制Fab所為之CD3結合與Fc所為之和Fcγ受體或補體之交聯，能避免因非專一效應子作用增強伴隨細胞介素釋出症狀。
已導入EU編號118-215號缺損變異之H鏈藉由和帶有全長序列之H鏈組合，能製作只有1個Fab之抗體(一價抗體)，對於評價親和性有用。
EU編號409號Arg取代為Lys之變異、及EU編號435號His取代為Arg之變異，各係為了接近人IgG1、及人IgG3之性質之變異。
(3-1)利用點突變所為之人化抗CD3抗體之親和性改變
首先，針對實施例2製作之人化抗人CD3ε鏈抗體序列hCE115HA-ERY27_HE(序列編號：55)，於FR1、FR2、FR3、CDR1、CDR2、CDR3導入點突變，製備改造抗體。然後，測定該等改造抗體針對可溶性人CD3ε鏈之親和性。藉由組合有親和性提高效果之部位，獲得表8所示帶有親和性之改造抗體。
(3-2)人化抗GPC3抗體之親和性改變
首先，針對實施例2製作之抗人GPC3雙專一性抗體序列 H0000-ERY27_HK(序列編號：54)，於CDR1、CDR2、CDR3導入點突變並製備改造抗體。然後，測定該等改造抗體針對可溶性人GPC3之親和性。藉由將有親和性提高效果之部位予以組合，獲得表9所示之帶有親和性之改造抗體。
(3-3)利用點突變所為之pI改變
雙專一性抗體之商用生產須要高度精製。使用離子交換層 析時，據報告改變分子之等電點(pI)係為有效(PLoS One.2013；8(2)：e57479)。所以，針對實施例2製作之人化抗人GPC3抗體序列H0000-ERY27_HK(序列編號：54)，考慮於CDR1、CDR2、CDR3導入已考慮pI改變之點突變，製備改造抗體。然後，測定該等改造抗體針對可溶性人GPC3之親和性。
其結果就維持針對人GPC3之親和性且能使pI降低之可能胺基酸改變而言，找到Kabat編號19位、43位、53位、61位之胺基酸。
藉由將維持針對人GPC3之親和性且有pI降低效果之部位予以組合，獲得表10所示之維持親和性與pI之抗體。
(3-4)點突變所致細胞外基質結合能力改變
據報告向細胞外基質(ECM)等之非專一性結合可能會影響藥物動態(MAbs.2012 Nov-Dec；4(6)：753-60)。所以針對本實施例獲得之改造抗體，依參考實施例4記載之方法實施針對ECM之結合能力。其結果，確認人化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體GPC3_ERY27_hCE115(序列編號54、55、56)之ECM結合能力高。所以，使用關於實施例3-1、3-2、3-3研究之針對人化抗人CD3ε鏈抗體序列hCE115HA-ERY27_HE(序列編號：55)之任意點突變，研究使ECM結合能力減低之組合。其結果，發現Kabat編號11位、16位、52a位、53位、98位及100位之胺基酸維持針對CD3ε之親和性且對於ECM結合能力 降低有影響，獲得了比起人化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體GPC3_ERY27_hCE115改造抗體，ECM結合能力更為減低的抗體(表11)。
(3-5)利用點突變所為之對於SuReTM配體之結合能力改變
已知有依存抗體之可變區序列(VH3)而結合於Protein A之例(J Biomol Tech.2011 Jul；22(2)：50-2)。於人化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體之Protein A精製，去除抗CD3抗體同抗體對於抑制介由CD3之非專一性反應方面係為重 要。故，據認為宜抑制抗CD3抗體同抗體之Protein A結合。係假設商用生產時使用SuReTM配體，故於人化抗CD3抗體H鏈改變體TR01H082-E2702GsKsc及TR01H084-E2702GsKsc(序列編號398及399)之CDR2導入考慮了SuReTM配體結合之點突變並製備改造抗體。該等改造抗體對於SuReTM配體之結合能力依參考實施例5記載之方法實施。其結果，發現Kabat編號19位、57位、59位之胺基酸維持對於CD3ε之親和性且影響對於SureTM配體之結合能力，獲得了相對於TR01H082-E2702GsKsc/L0011-k0(序列編號398及410)、及TR01H084-E2702GsKsc/L0011-k0(序列編號399及410)，對於SuReTM配體之結合能力減低的抗體(表12)。
(3-6)利用各種性質改善之點突變之組合以製作最 適化雙專一性抗體
藉由將實施例3-1至3-5記載之各種性質有改善之點突變予以組合，可以製作最適化之改造抗體。如此之改造抗體，例如製作表13記載之抗體，使用和實施例1為同樣之方法，供T細胞依存性細胞傷害(TDCC)活性評價。其結果記載於第4~9圖。其結果，獲得顯示和人化前之GPC3_ERY22_rCE115顯示同等或更高之T細胞依存的細胞傷害活性的活性的最適化人化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體。
由實施例3-1~3-6可知：對於維持和人化前之 GPC3_ERY22_rCE115之T細胞依存的細胞傷害活性有同等或更高活性之最適化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體之性質方面，例如以下之胺基酸殘基係為重要。
抗人CD3ε鏈抗體中例如11位之Leu、16位之Gly、52a位之Asp、53位之Gln、72位之Ala、78位之Ile、98位之Ala、100位之Gly、102位之Ile。抗人GPC3抗體中例如：19位之Thr、43位之Glu、52a位之Gly、53位之Pro或Glu、55位之Pro、61位之Glu。又，共通抗體L鏈中例如25位之Pro、27a位之Pro、27b位之Pro、33位之Ile、34位之Gln、56位之Arg或Trp、89位之Tyr。(均依Kabat編號)
[實施例4]活體內(in vivo)藥效之評價
針對上述抗體之一部分，也就使用罹癌模式之活體內(in vivo)藥效進行評價。
以實施例3-6記載之試管內(in vitro)分析法，實施已認定為細胞傷害活性之表13所示中之代表抗體的活體內(in vivo)之藥效之評價。活體內之藥效評價係考慮腫瘤塊形成所致之微小環境差異可能帶來的結果，使用GPC3之表現量大約同等但是該抗體所致藥效感受性不同之2種人癌細胞株，亦即PC-10及NCI-H446。將該等細胞株移植到NOD scid小鼠，於已確認腫瘤形成之NOD scid小鼠移入於試管內(in vitro)培養人PBMC以使其增殖之T細胞。對該小鼠實施藉由投予最適化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體所為之治療(稱為T細胞移入模式)。
亦即，於最適化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一 性抗體之PC-10 T細胞移入模式所為之藥效試驗，實施如下列試驗。使用從健常人自願者抽取之血液分離出的PBMC及T cell activation/expansion kit/human(MACS Miltenyi biotec公司)，實施T細胞之擴大培養。將人癌細胞株PC-10 1×107細胞與Matrigel基底膜基質(BD公司)混合，移植到NOD scid小鼠(Clea Japan、♀、6W)之鼠蹊部皮下。移植日定義為day 0。在移植前日對於以腹腔內小鼠投予Anti asialo抗體(和光純藥)0.2mg/隻。移植後13日至15日依腫瘤尺寸與體重分群後，再度以0.2mg/隻對於腹腔內投予Anti asialo GM1抗體。隔日將前述擴大培養所得之T細胞以3×107細胞/隻的量移植到腹腔內。T細胞移植約4小時後，將最適化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體以1mg/kg的量對於尾靜脈內投予。最適化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體之投予只進行1次。
其結果，最適化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體投予群相較於溶劑投予群認為有明顯的抗腫瘤作用(第10圖a,b)。
最適化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體之利用NCI-H446T細胞移入模式所為之藥效試驗也以同樣方法實施。對於NCI-H446以5mg/kg的量將最適化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體對於尾靜脈內進行1次投予。
其結果，認為最適化抗人CD3ε鏈及抗人GPC3雙專一性抗體投予群比起溶劑投予群有較明顯的抗腫瘤作用(第11圖a,b)。
[參考實施例]
[參考實施例1]抗體之表現載體之製作及抗體之表現與精製
胺基酸取代之導入係使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCR或In fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA)等依該技術領域中有通常知識者公知之方法實施，建構表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域中有通常知識者公知之方法決定。將製作之質體對於來自人胎兒腎癌細胞之HEK293H株(Invitrogen)、或FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)進行暫時性導入，並實施抗體表現。從獲得之培養上清使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE Health care)依該技術領域中有通常知識者公知之方法精製抗體。精製抗體濃度，係使用分光光度計測定於280nm之吸光度，並從依獲得之值使用PACE法算出之吸光係數，計算出抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
[參考實施例2]
使用人末梢血單核球作為效應子細胞之各待驗抗體之ADCC活性
針對各待驗抗體依以下方法測定ADCC活性。
使用人末梢血單核球(以下稱為人PBMC)作為效應子細胞，依以下方式測定各待驗抗體之ADCC活性。
(1)人PBMC溶液之製備
使用已預先注入了200μl之1000單位/ml之肝素溶液(Novo heparin注5千單位，Novo nordisc)的注射器，從中外製藥(股)公司所屬之健常人自願者(成人男性)抽取末梢血50 ml。將使用PBS(-)稀釋成2倍之該末梢血分為4等分，加到已預先注入15ml Ficoll-Paque PLUS並離心操作之Leucosep淋巴球分離管(Greiner bio-one)中。對於已分注該末梢血之分離管以2150rpm的速度於室溫10分鐘實施離心分離之操作後，分取單核球級分層。利用含10%FBS之Dulbecco's Modified Eagle's Medium(SIGMA)(以下稱為10%FBS/D-MEM。)將該各分層所含之細胞洗滌1次後，將該細胞懸浮於10%FBS/D-MEM中使細胞密度成為5x106細胞/ml。在培養箱中於37℃培養1小時後，以10%FBS/D-MEM將細胞洗滌1次，使該細胞懸浮於10%FBS/D-MEM中使細胞密度成為2x105細胞/ml。將該細胞懸浮液作為目標細胞，供以後之實驗。
(2)鉻游離試驗(ADCC活性)
ADCC活性以利用鉻釋出法之專一性鉻游離率評價。首先，將製備成各濃度(0、0.004、0.04、0.4、4、40μg/ml)之抗體溶液各添加50μl到96井U底板之各井中。然後，接種目標細胞各50μl(1x104細胞/井)，於室溫靜置15分鐘。將於各井中已加入(1)製備之人PBMC溶液各100μl(5x105細胞/井)之該板，於5%二氧化碳氣體培養箱中於37℃靜置4小時後進行離心操作。該板之各井中之100μl之培養上清之放射活性使用蓋氏計數器測定。依下式求出專一性的鉻游離率：專一性的鉻游離率(%)=(A-C)×100/(B-C)。
於上式，A表示各井中之100μl之培養上清之放射活性(cpm)之平均值。又，B表示目標細胞添加了100μl之2% NP-40水溶液(Nonidet P-40、Nacalai tesque)及50μl之10% FBS/D-MEM培養基之井中之100μl之培養上清之放射活性(cpm)平均值。再者，C表示於目標細胞添加10% FBS/D-MEM培養基150μl之井中之100μl之培養上清之放射活性(cpm)之平均值。試驗重複三次，計算反映了各待驗抗體之ADCC活性之前述試驗之專一性的鉻游離率(%)的平均值及標準偏差。
[參考實施例3]
利用差示掃描型螢光定量法所為之改造抗體之Tm評價
本研究中，以使用Rotor-Gene Q(QIAGEN)之差示掃描型螢光定量法評價改造抗體之Tm(熱改性溫度)。又，本手法，已有人報告和就抗體之熱安定性評價法廣為人知的使用差示掃描型熱量計之Tm評價有良好的相關性(Journal of Pharmaceutical Science 2010；4：1707-1720)。
將5000倍濃度之SYPROTM orange(Molecular Probes)以PBS(Sigma)稀釋後，和抗體溶液混合以製備測定樣本。將各樣本各20μL安置於測定用管，以240℃/hr的升溫速度使溫度從30℃升高到99℃。於470nm(激發波長)/555nm(螢光波長)檢測伴隨升溫之螢光變化。
數據係使用Rotor-Gene Q Series Software(QIAGEN)計算認為有螢光遷移之溫度，定義其值為Tm值。
[參考實施例4]ECM結合能力測定
依WO2012093704記載之方法實施。具體而言，以TBS(TaKaRa、#T903)將BD Matrigel(BD Biosciences、#356237)調整為2mg/mL，各於測定用96井板(Meso Scale Discovery、#L15XB-3(High Bind))分注5μL後，於冷處靜置一晚。然後於 各井中加入150μL之ECL阻斷緩衝液(含有0.05% Tween20、0.5% BSA、0.01%疊氮化鈉之PBS)，於室溫靜置2小時以上。
將山羊抗人IgG(γ)(Invitrogen、#628400)依MSD SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery、#R91AN-2)之操作說明書進行釕化。將其使用ECL稀釋緩衝液(含有0.01% Tween20、0.1% BSA、0.01%疊氮化鈉之PBS)稀釋成終濃度2μg/mL。又，將標準抗體及待驗抗體以PBS-T(含有0.05% Tween20、0.01%疊氮化鈉之PBS)稀釋成終濃度3μg/mL。
於反應用96井板(Thermo scientific、Nunc #145399)按順序添加10μL之ECL稀釋緩衝衝液、20μL之標準抗體及待驗抗體(3μg/mL)、30μL之釕化抗體(2μg/mL)，於遮光下，邊於室溫攪拌邊進行1小時反應。
從測定用96井板傾倒去除ECL阻斷緩衝液，並從反應用96井板添加50μL之樣本溶液，於遮光於下室溫靜置1小時。之後從測定用96井板將樣本溶液傾倒除去，加入2x T緩衝液(4x MSD Read Buffer T(Meso Scale Discovery)以ECL稀釋緩衝液稀釋成二倍者)150μL，立即實施ECL測定。測定使用SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)。
解析係將待驗抗體之螢光強度值除以標準抗體之值，算出令標準抗體為1時之強度並進行比較。
[參考實施例5]SuReTM配體結合能力測定
對於SuReTM配體之結合能力之測定係使用BiacoreTM-T200(GEHealthcare Japan)。運行緩衝液係使用 HBS-EP+(GEHealthcare Japan)，使用胺偶聯套組(GEHealthcare Japan)使Mab Select SuReTM配體(GEHealthcare Japan)共價鍵結於CM5晶片(羧基甲基葡聚糖被覆晶片)。當作分析物使用之抗體使用HBS-EP+製備成5μg/mL。測定係先以流速10μL/min注入5μg/mL之抗體溶液3min使其反應，之後切換成HBS-EP+，測定流過0.5min後之回應(RU)。測定結束後，以10mM Gly-HCl,pH 1.5洗滌，使傳感晶片再生。對照流式細胞，係在晶片上未共價鍵結配體，而實施同樣的實驗，取兩者之回應(RU)之差以解析對於SuReTM配體之結合能力。
和本說明書中之序列編號對應之序列如下表所示。
[產業利用性]
依本發明可提供一種新的多專一性抗原結合分 子，其維持BiTE帶有的強抗腫瘤活性、及不誘導癌抗原非依存性細胞介素風暴等之安全性上之優良性質，且血中半衰期長。含有本發明之抗原結合分子作為有效成分之細胞傷害誘導劑可以將Glypican3表現細胞、含該細胞之腫瘤組織作為目標而誘導細胞傷害。本發明之多專一性抗原結合分子當對於患者投予時，不只安全性高，對身體的負擔也少，便利性也高之理想治療。
<110> 中外製藥股份有限公司(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA)
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<223> An artificially generated sequence
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 432

Claims (31)

  1. 一種多專一性抗原結合分子，包含下列域，且(1)之可變區與(2)之可變區所含之L鏈可變區為共通之胺基酸序列；(1)含有具Glypican3結合活性之抗體可變區之域，(2)含有具T細胞受體複合體結合活性之抗體可變區之域，及(3)含有對於Fcγ受體之結合活性降低之Fc區之域，細胞傷害活性比起Glypican3結合域由序列編號47及48構成且T細胞受體複合體結合域由序列編號49及50構成之雙專一性抗體為同等或更高。
  2. 如申請專利範圍第1項之多專一性抗原結合分子，其中，細胞傷害活性為T細胞依存的細胞傷害活性。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之多專一性抗原結合分子，其中，T細胞受體複合體結合活性為對於T細胞受體之結合活性。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，T細胞受體複合體結合活性為對於CD3ε鏈之結合活性。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區係包括選自下列(a1)~(a5)中任一H鏈CDR1、CDR2及CDR3之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區，(a1)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、 CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(a2)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(a3)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(a4)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(a5)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同。
  6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區係包括選自下列(b1)~(b15)中之任一H鏈CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區，(b1)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：52所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b2)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b3)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：122所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b4)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b5)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：129所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同， (b6)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：132所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b7)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b8)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：144所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b9)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：164所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b10)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：168所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b11)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：421所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b12)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：424所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b13)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：426所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b14)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：429所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(b15)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：430所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同。
  7. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(1)及(2)之抗體可變區係包括選自下列(c1)~(c19)中之任一H鏈CDR1、CDR2及CDR3之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗 體可變區，(c1)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：52所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c2)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：421所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c3)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：426所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c4)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：429所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同， (c5)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：40所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：430所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c6)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c7)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c8)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：144所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同， (c9)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：164所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c10)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：168所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c11)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c12)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：144所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同， (c13)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：164所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c14)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：168所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c15)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c16)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：122所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同， (c17)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：129所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c18)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：132所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(c19)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：424所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同。
  8. 如申請專利範圍第5至7項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，CDR1、CDR2及CDR3係依據Kabat編號之CDR1、CDR2及CDR3區。
  9. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區係包括選自下列(a1)~(a5)中之任一H鏈可變區之抗體可變 區、或與其在機能上為同等之抗體可變區；(a1)H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列(a2)H鏈可變區為序列編號：197之胺基酸序列(a3)H鏈可變區為序列編號：206之胺基酸序列(a4)H鏈可變區為序列編號：211之胺基酸序列(a5)H鏈可變區為序列編號：215之胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區係包括選自下列(b1)~(b15)中之任一H鏈可變區之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區；(b1)H鏈可變區為序列編號：52之胺基酸序列(b2)H鏈可變區為序列編號：103之胺基酸序列(b3)H鏈可變區為序列編號：122之胺基酸序列(b4)H鏈可變區為序列編號：128之胺基酸序列(b5)H鏈可變區為序列編號：129之胺基酸序列(b6)H鏈可變區為序列編號：132之胺基酸序列(b7)H鏈可變區為序列編號：142之胺基酸序列(b8)H鏈可變區為序列編號：144之胺基酸序列(b9)H鏈可變區為序列編號：164之胺基酸序列(b10)H鏈可變區為序列編號：168之胺基酸序列(b11)H鏈可變區為序列編號：421之胺基酸序列(b12)H鏈可變區為序列編號：424之胺基酸序列(b13)H鏈可變區為序列編號：426之胺基酸序列(b14)H鏈可變區為序列編號：429之胺基酸序列 (b15)H鏈可變區為序列編號：430之胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(1)及(2)之抗體可變區係包括選自下列(c1)~(c19)中之任一H鏈可變區之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區；(c1)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：52之胺基酸序列，(c2)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：421之胺基酸序列，(c3)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：426之胺基酸序列，(c4)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：429之胺基酸序列，(c5)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：40之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編 號：430之胺基酸序列，(c6)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：197之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：128之胺基酸序列，(c7)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：206之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：142之胺基酸序列，(c8)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：206之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：144之胺基酸序列，(c9)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：206之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：164之胺基酸序列，(c10)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：206之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：168之胺基酸序列，(c11)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：211之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編 號：142之胺基酸序列，(c12)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：211之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：144之胺基酸序列，(c13)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：211之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：164之胺基酸序列，(c14)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：211之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：168之胺基酸序列，(c15)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：215之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：103之胺基酸序列，(c16)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：215之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：122之胺基酸序列，(c17)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：215之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編 號：129之胺基酸序列，(c18)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：215之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：132之胺基酸序列，(c19)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：215之胺基酸序列，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區為序列編號：424之胺基酸序列。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項之記載之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之共通L鏈係包括選自下列(d1)~(d11)中之任一CDR1、CDR2及CDR3之組合之共通L鏈、或與其在機能上為同等之共通L鏈，(d1)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(d2)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(d3)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：299所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(d4)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：301所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(d5)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：302所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(d6)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：304所含之CDR1、 CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(d7)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：306所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(d8)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：307所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(d9)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：309所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(d10)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：310所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(d11)CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：319所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同。
  13. 如申請專利範圍第1至11項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之L鏈可變區係選自下列(d1)~(d11)中之任一L鏈胺基酸序列之可變區，(d1)由序列編號：53之胺基酸序列構成之L鏈，(d2)由序列編號：223之胺基酸序列構成之L鏈，(d3)由序列編號：299之胺基酸序列構成之L鏈，(d4)由序列編號：301之胺基酸序列構成之L鏈，(d5)由序列編號：302之胺基酸序列構成之L鏈，(d6)由序列編號：304之胺基酸序列構成之L鏈，(d7)由序列編號：306之胺基酸序列構成之L鏈，(d8)由序列編號：307之胺基酸序列構成之L鏈，(d9)由序列編號：309之胺基酸序列構成之L鏈，(d10)由序列編號：310之胺基酸序列構成之L鏈， (d11)由序列編號：319之胺基酸序列構成之L鏈。
  14. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(1)及(2)之抗體可變區、及共通L鏈可變區係包括選自下列(e1)~(e25)中之任一H鏈CDR1、CDR2及CDR3，及L鏈CDR1、CDR2及CDR3之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區，(e1)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e2)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：299所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e3)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之 CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號；128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：310所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e4)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：197所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：128所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：319所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e5)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e6)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之 CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：144所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e7)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：164所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e8)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：206所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：168所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e9)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之 CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e10)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：142所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：299所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e11)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：144所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e12)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之 CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：164所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e13)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：211所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：168所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：223所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e14)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e15)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之 CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：299所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e16)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：301所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e17)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：302所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e18)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之 CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：304所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e19)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：306所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e20)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：307所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e21)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之 CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：103所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：309所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e22)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：122所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e23)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：129所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e24)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之 CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：132所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，(e25)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：215所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：424所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區所含之CDR1、CDR2及CDR3和序列編號：53所含之CDR1、CDR2及CDR3區之胺基酸序列相同。
  15. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(1)及(2)之抗體可變區、及共通L鏈可變區係包括選自下列(f1)~(f26)中之任一可變區之組合之抗體可變區、或與其在機能上為同等之抗體可變區，(f1)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：197之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：128之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序 列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同，(f2)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：197之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：128之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：299所含之可變區之胺基酸序列相同，(f3)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：197之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：128之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：310所含之可變區之胺基酸序列相同，(f4)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：197之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：128之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：319所含之可變區之胺基酸序列相同，(f5)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：206之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：142之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同，(f6)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：206之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列 編號：144之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同，(f7)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：206之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：164之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同，(f8)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：206之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：168之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同，(f9)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：211之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：142之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同，(f10)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：211之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：142之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：299所含之可變區之胺基酸序列相同，(f11)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：211之胺基酸序列相同，申請專利 範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：144之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同，(f12)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：211之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：164之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同，(f13)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：211之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：168之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：223所含之可變區之胺基酸序列相同，(f14)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同，(f15)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：299所含之可變區之胺基酸序列相同，(f16)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之 H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：301所含之可變區之胺基酸序列相同，(f17)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：302所含之可變區之胺基酸序列相同，(f18)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：304所含之可變區之胺基酸序列相同，(f19)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：306所含之可變區之胺基酸序列相同，(f20)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：307所含之可變區之胺基酸序列相同， (f21)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：103之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：309所含之可變區之胺基酸序列相同，(f22)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：122之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同，(f23)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：129之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同，(f24)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：132之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和序列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同，(f25)申請專利範圍第1項記載之(1)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：215之胺基酸序列相同，申請專利範圍第1項記載之(2)之抗體可變區所含之H鏈可變區和序列編號：424之胺基酸序列相同，共通L鏈之抗體可變區和 序列編號：53所含之可變區之胺基酸序列相同，(f26)結合在和(f1)~(f25)中任一多專一性抗原結合分子所結合之Glypican3及T細胞受體複合體上之抗原決定基分別為重複之抗原決定基，且有共通L鏈。
  16. 如申請專利範圍第1至15項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(3)之Fc區為構成序列編號：23~26(IgG1~IgG4)記載之Fc區之胺基酸中任一胺基酸已變異之Fc區。
  17. 如申請專利範圍第16項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(3)之Fc區係選自依EU編號指定之下列胺基酸中之至少1個胺基酸已變異之Fc區：220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、332位。
  18. 如申請專利範圍第16項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(3)之Fc區係具有選自依EU編號指定之下列胺基酸中之至少1個胺基酸之Fc區：234位之胺基酸為Arg、235位之胺基酸為Ala或Arg、239位之胺基酸為Lys、297位之胺基酸為Ala。
  19. 如申請專利範圍第16至18項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，申請專利範圍第1項記載之(3)之Fc區更具有為了促進形成由異二聚體構成之Fc區之胺基酸變異。
  20. 如申請專利範圍第19項之多專一性抗原結合分子，其中，由異二聚體構成之Fc區為下列(g1)或(g2)之胺基酸序列之組合：(g1)和具有序列編號：57之胺基酸序列之不變區之Fc區為相同胺基酸序列與和具有序列編號：58之胺基酸序列之不變區之Fc區為相同胺基酸序列之組合，(g2)和具有序列編號：60或62之胺基酸序列之不變區之Fc區為相同胺基酸序列與和具有序列編號：61之胺基酸序列之不變區之Fc區為相同胺基酸序列之組合。
  21. 如申請專利範圍第1至20項中任一項之多專一性抗原結合分子，其中，多專一性抗原結合分子為雙專一性抗體。
  22. 一種雙專一性抗體，係如以下(h1)~(h25)中任一者所記載：(h1)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，具有由具序列編號424之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h2)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構 成之抗體H鏈、及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h3)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號299之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h4)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號301之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h5)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號302之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h6)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215 之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號304之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h7)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號306之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h8)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號307之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h9)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號103之胺基酸序列之抗體H 鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號309之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h10)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號122之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h11)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號129之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h12)對於Glypican3有結合活性，對於由具有序列編號215之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具有序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號132之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體； (h13)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號197之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號128之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號299之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h14)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號197之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號128之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號310之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h15)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號197之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號128之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號319之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h16)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號197之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結 合活性，並具有由具序列編號128之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號53之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h17)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號211之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號142之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號299之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h18)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號211之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號142之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h19)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號211之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號144之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具序列編號223之胺基酸序列之抗體之 共通L鏈之雙專一性抗體；(h20)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號206之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號144之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h21)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號206之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號142之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h22)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號206之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號164之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h23)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號206之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸 序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具由由具序列編號168之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h24)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號211之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具由具序列編號164之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體；(h25)對於Glypican3有結合活性，對於由具序列編號211之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號61之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及T細胞受體複合體有結合活性，並具有由具序列編號168之胺基酸序列之抗體H鏈可變區與具序列編號60或62之胺基酸序列之不變區構成之抗體H鏈、及具有序列編號223之胺基酸序列之抗體之共通L鏈之雙專一性抗體。
  23. 一種核酸，編碼為如申請專利範圍第1至20項中任一項之多專一性抗原結合分子、或申請專利範圍第21或22項之雙專一性抗體。
  24. 一種載體，已導入如申請專利範圍第23項之核酸。
  25. 一種細胞，包含如申請專利範圍第23項記載之核酸、或如 申請專利範圍第24項之載體。
  26. 一種方法，係藉由培養如申請專利範圍第25項之細胞，以製造如申請專利範圍第1至20項中任一項多專一性抗原結合分子、或如申請專利範圍第21或22項之雙專一性抗體。
  27. 一種多專一性抗原結合分子或雙專一性抗體，係利用如申請專利範圍第26項之方法製得。
  28. 一種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1至20項中任一項之多專一性抗原結合分子、或如申請專利範圍第21或22項之雙專一性抗體、及藥學上可容許之擔體。
  29. 如申請專利範圍第28項之醫藥組合物，其誘導細胞傷害。
  30. 如申請專利範圍第29項之醫藥組合物，其中，細胞傷害係T細胞依存的細胞傷害。
  31. 如申請專利範圍第28項之醫藥組合物，其用在對於必要患者投予如申請專利範圍第1至20項中任一項之多專一性抗原結合分子、或如申請專利範圍第21或22項之雙專一性抗體。
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