ES2307526T3 - Potenciadores de la expresion del antigeno hm1.24. - Google Patents

Abstract

Uso de interferón-alfa o interferón-gamma y un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2 y tiene actividad citotóxica en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece mieloma, en donde el medicamento potencia la expresión del antígeno HM1.24 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2 en células de mieloma.

Description

Potenciadores de la expresión del antígeno HM1.24.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en un aspecto al uso de interferón-\alpha o interferón-\gamma y un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2 y tiene una actividad citotóxica en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece mieloma, en donde el medicamento potencia la expresión del antígeno HM1.24 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2 en células de mieloma.

Técnica anterior

El mieloma, también llamado plasmacitoma y mieloma múltiple, es una enfermedad neoplásica caracterizada por la acumulación de células plasmáticas monoclonales en la médula ósea. El mieloma es una enfermedad en la que las células B o las células plasmáticas terminalmente diferenciadas que producen y segregan inmunoglobulinas aumentan predominantemente en la médula ósea, y en consecuencia se detectan inmunoglobulinas monoclonales o sus cadenas livianas o cadenas pesadas constituyentes en la sangre de pacientes con esta enfermedad.

Para el tratamiento del mieloma, se han usado hasta ahora agentes quimioterapéuticos, pero no se han descubierto agentes terapéuticos eficaces que lleven a una remisión completa de la enfermedad y que prolonguen el período de supervivencia de los pacientes con mieloma, y por lo tanto, la aparición de fármacos que tengan efectos terapéuticos del mieloma se han buscado durante mucho tiempo.

Por otra parte, Goto, T. et al. han descrito un anticuerpo monoclonal (anticuerpo anti-HM1.24 de ratón) que se obtuvo inmunizando ratones con células de mieloma humano (Blood (1994) 84, 1922-1930). Cuando se administró un anticuerpo anti-HM1.24 a un ratón transplantado con células de mieloma humano, el anticuerpo se acumuló en los tejidos del tumor en un modo específico (Masaaki Kosaka et al., Nippon Rinsho (Japan Clinical) (1995) 53, 627-635), pareciendo indicar que el anticuerpo anti-HM1.24 podría aplicarse en el diagnóstico de localización de tumores por marcado radioisotópico, terapias nucleares tales como la radioterapia y similares.

En Blood (1994) 84, 1922-1930 anteriormente mencionado, se ha descrito que el anticuerpo anti-HM1.24 tiene actividad citotóxica in vitro en una línea celular de mieloma humano RPMI8226. También se ha demostrado que el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico que es anticuerpo anti-HM1.24 de ratón convertido en quimérico, y un anticuerpo anti-HM1.24 humanizado reformado se unen específicamente a las células de mieloma y tienen actividad citotóxica (1999) 93, 3922-3920).

Por lo tanto, el antígeno HM1.24 se ha expresado altamente específicamente en células de mieloma que son células B terminalmente diferenciadas y, ya que el anticuerpo anti-HM1.24 que reconoce este antígeno exhibe una actividad destructora de las células en proporción al número de moléculas HM1.24 en la superficie celular, se cree que una inmunoterapia que emplea el anticuerpo anti-HM1.24 es un método eficaz para tratar el mieloma múltiple. Por ende, si la cantidad expresada de antígeno HM1.24, un antígeno del anticuerpo anti-HM1.24, en la superficie celular podría potenciarse, se espera que la administración de una cantidad inferior del anticuerpo proporcione una actividad citotóxica equivalente reduciendo así los efectos colaterales.

Por otra parte, se descubrió que el interferón es una sustancia que exhibe una actividad supresora de proliferación vírica, y se sabe que se clasifica en cuatro grupos de \alpha, \beta, \gamma y \omega, y que tiene una diversidad de actividades biológicas (Pestka, S., et al., Ann. Rev. Biochem. (1987) 56, 727-777; Langer, J. A., et al., Immunology Today (1988) 9, 393-400). No obstante, no se ha descrito que el interferón-\alpha y el interferón-\gamma tuvieron el efecto de aumentar la cantidad expresada de antígeno HM1.24 en células de mieloma.

Por otra parte, los factores reguladores del interferón (IRF)-1 y -2 se identificaron como factores reguladores de la transcripción del gen IFN-\beta. Se sabe que IRF-1 y -2 se unen a la misma secuencia reguladora génica: IRF-1 e IRF-2 actúan en un modo antagonista en el sentido que el IRF-1 actúa como un factor de activación de la transcripción, mientras que el IRF-2 actúa como un factor supresor de la transcripción. Se ha demostrado que las células NIH3T3 en donde el IRF-2 se expresó altamente exhiben densidad de saturación celular potenciada, formación de colonias en el gel de metilcelulosa y una propiedad oncógena en ratones atímicos, y el IRF-2 actúa como un oncogén.

Por otra parte, los últimos avances en la investigación han indicado que el IRF-2 es necesario para la expresión de histona H4 que actúa para controlar el ciclo celular. Se muestra que el IRF-2 también aumenta la expresión de la molécula 1 de adhesión de células vasculares (VCAM-1) en células musculares, y está cada vez más claro que la región ácida (182 a 218) está implicada en la activación de VCAM-1. En base a esto, se sabe que el IRF-2 no solo actúa como un factor de regulación de la transcripción sino también como un factor de activación de la transcripción.

No obstante, no se ha sabido que la proteína IRF-2 se una al promotor (promotor HML.24) del antígeno HM1.24 ni que active dicho promotor.

El documento WO99/18997 enseña que el tratamiento del linfoma con un anticuerpo citotóxico que reconoce el antígeno Hm1.24 específico de la línea de células plasmáticas es potenciado por la administración de un modificador de la respuesta biológica.

Ozaki Shuji et al (1999) Blood 93, 11 p3922-3930 evalúa la actividad del anti-HM1.24 MAb humanizado que media la ADCC de células de mieloma y de líneas celulares.

Ludwig et al. (1998) European Journal of Cancer 34, 1 p12-17 presenta datos sobre la terapia combinada de IFN-alfa en pacientes con mieloma múltiple.

Descripción de la invención

Los métodos actuales para el tratamiento del mieloma no son, como se mencionó anteriormente, aún satisfactorios y, por consiguiente, se espera la aparición de importantes fármacos o métodos terapéuticos que prolonguen la supervivencia del paciente. El tratamiento del mieloma con el anticuerpo anti-HM1.24 probablemente sea un tratamiento terapéutico importante y, en consecuencia, existe la necesidad de métodos que exhiban el efecto del anticuerpo anti-HM1.24 de manera más eficaz.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proveer medios para potenciar el efecto supresor del mieloma del anticuerpo anti-HM1.24, aumentando la cantidad expresada de antígeno HM1.24 en células de mieloma.

Con el fin de proveer dichos métodos, los inventores de la presente invención han llevado a cabo una búsqueda de fármacos que potencien la cantidad expresada de antígeno HM1.24 y, como resultado, han descubierto que el interferón-\alpha o el interferón-\gamma tienen los efectos deseados, y han completado de este modo la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un potenciador de la expresión en la célula de mieloma de una proteína (antígeno HM1.24) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2, comprendiendo dicho potenciador interferón-\alpha o interferón-\gamma como principio activo.

La presente invención provee el uso de interferón-\alpha o interferón-\gamma y un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2 y tiene actividad citotóxica en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece mieloma, en donde el medicamento potencia la expresión del antígeno HM1.24 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2 en células de mieloma.

Un ejemplo típico del mieloma anteriormente mencionado es el mieloma múltiple.

Dicho anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, y preferiblemente tiene actividad citotóxica.

Los inventores de la presente invención han llevado a cabo una búsqueda de agentes de activación del promotor HM1.24, y han descubierto que la proteína IRF-2 tiene la actividad deseada, y han completado así la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención provee además el uso de IRF-2 y un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2 y tiene actividad citotóxica en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que sufre de mieloma, en donde dicho medicamento potencia la expresión del antígeno HM1.24 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2 en células de mieloma.

La presente invención provee además el uso de IRF-2 para potenciar la actividad transcripcional del promotor HM1.24 in vitro.

Breve explicación de los dibujos

La Figura 1 muestra el resultado de un experimento en el que la línea celular de mieloma U266 cultivada en ausencia (parte superior) o presencia (parte inferior) de interferón-\alpha se analizó por citometría de flujo usando IgG (control) humana o anticuerpo anti-HM1.24 como marcador.

La Figura 2 muestra el resultado de un experimento en el que las células de mieloma del paciente cultivadas en ausencia (parte superior) o presencia (parte inferior) de interferón-\alpha se analizaron por citometría de flujo usando IgG (control) humana o anticuerpo anti-HM1.24 como marcador.

La Figura 3 es un gráfico que muestra el resultado de un experimento en el que las células U266 transformadas con un plásmido indicador, en donde se ha insertado la región promotora del gen que codifica el antígeno HM1.24, se cultivaron en ausencia de interferón-\alpha o en presencia de diversas concentraciones de éste, y luego se determinó la actividad de luciferasa.

La Figura 4 es un gráfico que muestra el resultado de un experimento en el que las células U266 o las células HEL transformadas con un plásmido indicador, en donde se ha insertado el segmento desde el punto de iniciación de la transcripción hasta 151 bp en dirección 5' o hasta 77 bp en dirección 5' entre la región promotora del gen que codifica el antígeno HM1.24, se han cultivado en presencia del interferón-\alpha, (1000 U/ml), y luego se determinó la actividad de la luciferasa.

La Figura 5 muestra el resultado de un experimento en donde una línea celular de mieloma U266 cultivada en ausencia (parte superior) o presencia (parte inferior) de interferón-\gamma se analizó por citometría de flujo usando IgG (control) humana o anticuerpo anti-HM1.24 como marcador.

La Figura 6 muestra el resultado de un experimento en el que las células de mieloma del paciente cultivadas en ausencia (parte superior) o presencia (parte inferior) del interferón-\gamma se analizaron por citometría de flujo usando IgG (control) humana o anticuerpo anti-HM1.24 como marcador.

La Figura 7 es un electroforetograma que muestra cambios a través del tiempo en la cantidad de factores de transcripción que se producen agregando IFN-\alpha a las células U266 cultivadas y que se unen a la región promotora HM1.24, y es una fotografía en lugar de un dibujo. NE(-): no se añadió extracto nuclear. 0 h: se añadió el extracto nuclear sin estimulación de IFN-\alpha. 0,5-8 h: se añadió el extracto nuclear para el cual transcurrió el tiempo respectivo después de la estimulación con IFN-\alpha (1000 U/ml). + frío: se añadieron 50 ng de sonda ISRE2 no marcada. + frío sin relacionar: se añadieron 50 ng de secuencia adp no marcada.

La Figura 8 es un electroforetograma que muestra el resultado de un experimento en el que los factores de transcripción que se unen al promotor HM1.24 se identificaron usando diversos anticuerpos, y es una fotografía en lugar de un dibujo. NE(-): no se añadió extracto nuclear. 0 h: se añadió el extracto nuclear sin estimulación de IFN-\alpha. 8 h: se añadió el extracto nuclear para el cual transcurrió el tiempo respectivo después de la estimulación con IFN-\alpha (1000 U/ml). + frío: se añadieron 50 ng de la sonda ISRE2 no marcada. + frío sin relacionar: se añadieron 50 ng de secuencia adp no marcada. Se añadieron dos \mug de cada uno de los anticuerpos.

La Figura 9 es un gráfico que muestra el resultado de un experimento en el que el plásmido indicador promotor HM1.24 y el plásmido de expresión de IRF-2 se introdujeron en las células U266, y se determinó la actividad indicadora.

Realización para llevar a cabo la invención Interferón-\alpha e interferón-\gamma

El interferón-\alpha y el interferón-\gamma para uso en la presente invención pueden ser mutantes siempre y cuando tengan la actividad de aumentar la cantidad expresada de antígeno HM1.24. Con el fin de determinar la cantidad de expresada de antígeno HM1.24, como se describe en los Ejemplos, las células de mieloma se cosechan a partir de una línea celular de mieloma o de un paciente con mieloma y luego se someten a citometría de flujo para detección. Como mutantes, pueden ser interferón-\alpha e interferón-\gamma en donde uno o varios, o una pluralidad, de residuos de aminoácidos han sido eliminados, sustituidos o insertados, o añadidos.

Como métodos para introducir la deleción, sustitución o inserción, se puede usar mutagénesis dirigida al sitio que altera el correspondiente gen (Hashimoto-Gotoh, Gene (1005) 152, 271-275, Zoller, Methods Enzymol. (1983) 100, 468-500, Kramer, Nucleic Acids Res. (1984) 12, 9441-8456, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 489-492, "New Cell. Engineering Experimental Protocol" editado por el Dept. of Oncology, Inst. of Medical Science, Univ. of Tokyo (1993) pág. 241-248).

También es posible usar el "Sistema de Mutagénesis Dirigida al Sitio" (GIBCO-BRL) y el "Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuickChange" (Stratagene) empleando PCR disponible en el mercado. Las mutaciones de aminoácidos en proteínas pueden a veces tener lugar en la naturaleza. Dicha proteína, en la que se ha introducido la mutación, tiene una actividad equivalente a la proteína original que se muestra en Mark, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666.

En la sustitución de residuos de aminoácidos, se prefiere sustituir entre aminoácidos cuyas propiedades se conservan. Por ejemplo, se prefiere la sustitución entre aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (G, A, V, L, I, P), aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen grupos hidroxilo (S, T, Y), aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre (C, M), aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen ácido carboxílico y amida (D, N, E, Q), aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen bases (R, K, H) y aminoácidos que tienen cadenas laterales que tienen grupos aromáticos (H, F, Y, W).

Además, como mutantes, se pueden usar fragmentos peptídicos de interferón-\alpha o interferón-\gamma. En particular, fragmentos peptídicos que tienen sitios de unión con receptores de interferón-\alpha o interferón-\gamma. Preferiblemente, son péptidos comprendidos por 100 o más, más preferiblemente 130 o más, incluso más preferiblemente 150, y lo más preferiblemente 160 o más residuos de aminoácidos contiguos.

Proteína de IRF-2

Los factores reguladores de interferón (IRF)-1 y -2 se identificaron como un factor regulador de transcripción del gen IFN-\beta. Se sabe que el IRF-1 y el -2 se unen a la misma secuencia reguladora de genes: IRF-1 e IRF-2 actúan en un modo antagonista en el sentido que el IRF-1 actúa como un factor de activación de la transcripción, mientras que el IRF-2 actúa como un factor de supresión de la transcripción. Se ha demostrado que las células NIH3T3 en las que el IRF-2 se expresa altamente exhiben densidad de saturación celular potenciada, formación de colonias en el gel de metilcelulosa y una propiedad oncógena en ratones atímicos, y el IRF-2 actúa como oncogén.

Por otra parte, los últimos avances en la investigación han indicado que el IRF-2 es necesario para la expresión de la histona H4 que actúa para el control del ciclo celular. También se muestra que el IRF-2 aumenta la expresión de la molécula 1 de adhesión de células vasculares (VCAM-1) en las células musculares, y está cada vez más claro que la región ácida (182 a 218) está implicada en la activación de VCAM-1. En base a esto, se sabe que el IRF-2 no solo actúa como factor regulador de la transcripción pero como factor de activación de la transcripción.

Hibridoma

El hibridoma producido por el anticuerpo para uso en la presente invención puede construirse básicamente usando la tecnología conocida descrita a continuación. Por lo tanto, se puede usar la proteína del antígeno HM1.24 o una célula IL-6 que exprese el antígeno HM1.24 como antígeno sensibilizante y se inmuniza por el método convencional de inmunización. Las células inmunitarias así obtenidas se condensan con células madre conocidas en el proceso de fusión celular convencional, y luego las células productoras de anticuerpos monoclonales son detectadas por el método de detección convencional para construir el hibridoma deseado.

Específicamente, el anticuerpo monoclonal puede obtenerse de la siguiente manera. Por ejemplo, como la célula que expresa el antígeno HM1.24 que es el antígeno sensibilizante para obtener el anticuerpo, se puede usar una línea celular de mieloma múltiple humana KPMM2 (Publicación de patente japonesa sin examinar (Kokai) No. 7-236475) y KPC-32 (Goto, T. et al., Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400). Como el antígeno sensibilizante, es también posible usar una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 o un péptido o un polipéptido que contiene un epítopo reconocido por un anticuerpo anti-HM1.24.

El ADNc de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 1 usado como el antígeno sensibilizante se inserta en el sitio de escisión XbaI del vector pUC19 para preparar un plásmido pRS38-pUC19. La E. coli que tiene el plásmido pRS38-pUC19 se ha depositado internacionalmente bajo las disposiciones del Tratado de Budapest como Escherichia coli DH5\alpha (pRS38-pUC19) el 5 de octubre de 1993 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki Pref., Japón, como FERM BP-4434 (publicación de patente japonesa sin examinar (Kokai) No. 7-196694). Usando el fragmento de ADNc contenido en este plásmido pRS38-pUC19, se puede construir un péptido o polipéptido que contiene un epítopo reconocido por el anticuerpo anti-HM1.24 mediante genotecnología.

Los mamíferos que se inmunizarán con el antígeno sensibilizante no están específicamente limitados, y preferiblemente se seleccionan considerando su compatibilidad con la célula madre para uso en la fusión celular. En general incluyen roedores tales como ratones, ratas y hámsters.

La inmunización de animales con un antígeno sensibilizante se lleva a cabo usando un método conocido. Un método general, por ejemplo, implica la administración intraperitoneal o subcutánea de un antígeno sensibilizante al mamífero.

Específicamente, un antígeno sensibilizante que se ha diluido y suspendido en una cantidad apropiada de solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina fisiológica, etc. se mezcla, según se desee, con una cantidad apropiada de un adyuvante común, por ejemplo adyuvante completo de Freund. Después de emulsionarse, preferiblemente se administra al mamífero varias veces cada 4 a 21 días. Alternativamente, se puede usar un vehículo adecuado al momento de inmunización del antígeno sensibilizante.

Después de inmunizar en este modo y confirmar el aumento de los niveles deseados de anticuerpo en el suero, se recogen las células inmunitarias del mamífero y se someten a fusión celular.

Las células de mieloma de mamíferos, al igual que las otras células madre que se someten a la fusión celular con las células inmunitarias anteriormente mencionadas, preferiblemente incluyen diversas líneas celulares conocidas tales como P3X63Ag8.653 (J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G. y Milstein, C, Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276: 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al. J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277: 131-133) y similares.

La fusión celular entre las células inmunitarias y las células de mieloma puede llevarse a cabo esencialmente de acuerdo con un método conocido tal como se describe en Milstein et al. (Kohler, G. y Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73: 3-4 6) y similares.

Más específicamente, la fusión celular antes mencionada se lleva a cabo en el caldo nutriente convencional en presencia de, por ejemplo, un acelerador de la fusión celular. Como el acelerador de la fusión celular, se puede usar, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), virus Sendai (HVJ) y similares, y además se puede añadir un adyuvante tal como sulfóxido de dimetilo, etc. según se desee para potenciar la eficacia de la fusión.

La relación preferida de las células inmunitarias y las células de mieloma que se ha de utilizar es, por ejemplo, 1 a 10 veces más células inmunitarias que las células de mieloma. Los ejemplos de medios de cultivo que se han de utilizar para la fusión celular anterior incluyen el medio RPMI1640 y el medio de cultivo MEM adecuados para la proliferación de las líneas celulares de mieloma anteriormente mencionadas, y el medio de cultivo convencional utilizado para este tipo de cultivo celular. Se puede añadir un complemento de suero tal como suero de ternero fetal (FCS).

En la fusión celular, se mezclan cantidades predeterminadas de las células inmunitarias anteriormente mencionadas y las células de mieloma se mezclan bien en el líquido de cultivo de arriba, al cual se le añade una solución de PEG previamente calentada hasta aproximadamente 37ºC, por ejemplo, una solución de PEG con un peso molecular promedio de aproximadamente 1000 a 6000, a una concentración de 30 a 60% (p/v), y se mezcla hasta obtener las células de fusión deseadas (hibridomas). Luego, repitiendo la adición secuencial y la centrifugación de un líquido de cultivo adecuado para eliminar el sobrenadante, se pueden eliminar los agentes de fusión celular, etc. que no son deseables para el crecimiento del hibridoma.

Dicho hibridoma se selecciona cultivando en un medio de selección convencional, por ejemplo, el medio de cultivo HAT (un líquido de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en dicho medio de cultivo HAT continúa en general por un período de tiempo suficiente para efectuar la destrucción de las células (células sin fusión) que no son el hibridoma deseado, en general durante varios días o varias semanas. Luego, se lleva a cabo el método de dilución limitante convencional en el que se detectan y clonan los hibridomas que producen el anticuerpo deseado.

Además de obtener el hibridoma anterior inmunizando un animal que no sea un ser humano con un antígeno, es también posible sensibilizar los linfocitos humanos in vitro con antígeno HM1.24 o células que expresan antígeno HM1.24, y permitir que los linfocitos sensibilizados resultantes se fusionen con una célula de mieloma derivada de ser humano, por ejemplo U266, y obtener de este modo el anticuerpo humano deseado que tiene la actividad de unirse al antígeno HM1.24 o a células que expresan el antígeno HM1.24 (véase la publicación de patente japonesa examinada (Kokoku) No. 1-59878). Además, un animal transgénico que tiene un repertorio de genes de anticuerpo humano se inmuniza con antígeno HM1.24 o células que expresan antígeno HM1.24 para obtener el anticuerpo deseado de acuerdo con el método anteriormente mencionado (véanse las solicitudes de patentes internacionales WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735).

Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales así construidos se pueden subcultivar en el líquido de cultivo convencional, o se pueden conservar durante un período de tiempo prolongado en nitrógeno líquido.

Con el fin de obtener anticuerpos monoclonales de dicho hibridoma, se puede emplear un método en el que dicho hibridoma se cultiva en el método convencional, y los anticuerpos se obtienen como el sobrenadante de cultivo, o un método en el que el hibridoma se administra a y crece en un mamífero compatible con dicho hibridoma y los anticuerpos se obtienen como la ascitis, u otros métodos. El método anterior es adecuado para obtener anticuerpos de alta pureza, mientras que esto último es adecuado para una producción de anticuerpos a gran escala.

Anticuerpo monoclonal

Específicamente, el hibridoma que produce el anticuerpo anti-HM1.24 se puede construir usando el método de Goto, T. et al. (Blood (1994) 84: 1922-1930). Se puede llevar a cabo por: un método en el que el hibridoma que produce el anticuerpo anti-HM1.24 que se depositó internacionalmente según las disposiciones del Tratado de Budapest como FERM BP-5233 el 27 de abril de 1995 ante el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki Pref., Japón, se inyecta por vía intraperitoneal a ratones BALB/c desarrollados por CLEA Japan) para obtener la ascitis, de los cuales se purifica el anticuerpo anti-HM1.24, o: un método en el que dicho hibridoma se cultiva en un medio de cultivo adecuado tal como el medio RPMI1640 que contiene suero fetal de bovino al 10% y BM-Condimed Hl al 5% (fabricado por Boehringer Mannheim), el medio SFM de hibridoma (fabricado por GIBCO-BRL), el medio PFHM-II (fabricado por GIBCO-BRL) y similares, y el anticuerpo anti-HM1.24 se pueden purificar a partir del sobrenadante.

Anticuerpo recombinante

Un anticuerpo recombinante que se produjo por la tecnología de genes recombinantes en donde un gen de anticuerpo se clonó a partir del hibridoma y se integró a un vector adecuado que se introdujo luego a un hospedante se puede usar en la presente invención como anticuerpo monoclonal (véase, por ejemplo, Carl, A. K., Borrebaeck, y James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).

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Específicamente el ARNm que codifica la región variable (V) del anticuerpo deseado se aísla del hibridoma produciendo el anticuerpo. El aislamiento de ARNm se realiza preparando ARN total usando, por ejemplo, un método conocido tal como el método ultracentrífugo de guanidina (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), el método AGPC (Chmczynski, P. et al., (1987) 162, 156-159), y luego el ARNm se purifica a partir del ARN total usando el Kit de Purificación de ARNm (fabricado por Pharmacia) y similares. Alternativamente, el ARNm puede prepararse directamente usando el Kit de Purificación de ARNm QuickPrep (fabricado por Pharmacia).

El ADNc de la región V del anticuerpo se puede sintetizar a partir del ARNm así obtenido, usando una transcriptasa inversa. El ADNc se puede sintetizar usando el Kit de Síntesis de ADNc de Primera Cadena de Transcriptasa Inversa AMV y similares. Alternativamente, para la síntesis y ampliación de ADNc, se pueden usar el Kit 5'-Ampli FINDER RACE (fabricado por Clontech) y el método 5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) que emplea PCR. El fragmento de ADN deseado se purifica a partir del producto PCR obtenido y se puede ligar al ADN vector. Además, se construye un vector recombinante a partir de allí y luego se introduce en E. coli etc., desde donde se selecciona para preparar el vector recombinante deseado. La secuencia base del ADN deseado se puede confirmar por un método conocido tal como el método didesoxi.

Una vez que se ha obtenido el ADN que codifica la región V del anticuerpo deseado, se puede ligar al ADN que codifica la región constante (región C) del anticuerpo deseado, que luego se integra a un vector de expresión. Alternativamente, el ADN que codifica la región V del anticuerpo puede integrarse a un vector de expresión que ya contiene ADN que codifica la región C del anticuerpo.

Con el fin de producir el anticuerpo para uso en la presente invención, el gen del anticuerpo se integra como se describe a continuación en un vector de expresión como para expresarse bajo el control de la región reguladora de expresión, por ejemplo, un potenciador y/o un promotor. Posteriormente, el vector de expresión se puede transformar en una célula hospedante y el anticuerpo puede luego expresarse allí.

Anticuerpo alterado

De acuerdo con la presente invención, se puede usar anticuerpo recombinante artificialmente alterado tal como anticuerpo quimérico y anticuerpo humanizado para el propósito de reducir la antigenicidad heteróloga contra la humana. Este anticuerpo alterado se puede producir usando métodos conocidos.

El anticuerpo quimérico se puede obtener ligando el ADN así obtenido, que codifica la región V del anticuerpo al ADN que codifica la región C del anticuerpo humano, que luego se integra en un vector de expresión y se introduce en un hospedante para producir allí el anticuerpo (véanse la solicitud de patente europea EP 125023 y la solicitud de patente internacional WO 96/02576). Usando este método conocido puede obtenerse el anticuerpo quimérico útil para la presente invención.

Por ejemplo, se ha depositado E. coli que tiene el plásmido que contiene la cadena L y la cadena H de anticuerpo anti-HM1.24 quimérico según las disposiciones del Tratado de Budapest como Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-1.24L-g\kappa) y Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-1.24H-g\gammal), respectivamente, el 29 de agosto de 1996 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki Pref., Japón, como FERM BP-5646 y FERM BP-5644, respectivamente (véase la solicitud de patente japonesa No. 8-264756).

Se ha creado el anticuerpo humanizado también llamado anticuerpo humano reformado transplantando la región determinante de complimentaridad (CDR) de anticuerpo de un mamífero que no sea un ser humano, por ejemplo anticuerpo de ratón, a la CDR de anticuerpo humano. También se conoce la tecnología de ADN recombinante general para preparación de dichos anticuerpos (véase la solicitud de patente europea EP 125023 y la solicitud de patente internacional WO 96/02576).

Específicamente, una secuencia de ADN que se diseñó para ligar el CDR de anticuerpo de ratón con la región marco (FR) del anticuerpo humano se sintetiza por el método PCR de varios oligonucleótidos divididos que tienen secciones superpuestas entre sí en sus extremos. El ADN así obtenido se liga al ADN que codifica la región C del anticuerpo humano y luego se integra a un vector de expresión, que se introduce a un hospedante para producción de anticuerpos (véase la solicitud de patente europea EP 239400 y la solicitud de patente internacional WO
96/02576).

Para la FR del anticuerpo humano ligado a través de CDR, se selecciona la región determinante de complimentaridad que forma un sitio de unión al antígeno favorable. Si se desea, los aminoácidos en la región marco de la región variable del anticuerpo se pueden sustituir de modo que la región determinante complementaria del anticuerpo humano reformado puede formar un sitio de unión al antígeno apropiado (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53/851-856).

Por ejemplo, la E. coli que tiene el plásmido que contiene la cadena L y la cadena H de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado se ha depositado internacionalmente según las disposiciones del Tratado de Budapest como Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVLa-AHM-g\kappa) y Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHr-AHM-gYl), respectivamente, el 29 de agosto de 1996 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki Pref., Japón, como FERM BP-5645 y FERM BP-5643, respectivamente (Solicitud de patente internacional WO 98-14580).

Para el anticuerpo quimérico o el anticuerpo humanizado, se usa la región C del anticuerpo humano, y como la región C del anticuerpo humano que exhibe actividad citotóxica, se puede usar C\gamma humano, por ejemplo C\gamma1, C\gamma2, C\gamma3 y C\gamma4. Entre ellos, el anticuerpo que tiene C\gamma1 y C\gamma3 en particular tiene actividad citotóxica potente, es decir, actividad ADCC y actividad CDC, y se usa preferiblemente en la presente invención.

El anticuerpo quimérico consiste en la región variable del anticuerpo derivado de un mamífero que no sea un ser humano, y en la región C derivada de anticuerpo humano, mientras que el anticuerpo humanizado consiste en la región determinante complementaria de anticuerpo derivada de un mamífero que no sea un ser humano y la región marco (FR) y la región C del anticuerpo derivado de anticuerpo humano. Por consiguiente, su antigenicidad en el cuerpo humano se ha reducido de modo que son útiles como el principio activo de los agentes terapéuticos de la presente invención.

Una realización preferida del anticuerpo humanizado para uso en la presente invención incluye el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado (véase la solicitud de patente japonesa No. 8-264756).

Expresión y producción

Los genes de anticuerpos construidos en el modo descrito precedentemente se pueden expresar y obtener en un método conocido. En el caso de células mamíferas, la expresión se puede lograr usando un vector de expresión que contiene un promotor útil comúnmente utilizado, el gen de anticuerpos que se ha de expresar y el ADN en el que la señal poli A ha sido operativamente unida a su 3' o un vector que contiene dicho ADN. Los ejemplos del promotor/potenciador incluyen el promotor/potenciador temprano inmediato al citomegalovirus humano.

Además, como promotor/potenciador que se puede utilizar para la expresión de anticuerpos para uso en la presente invención, se pueden usar promotores/potenciadores víricos tales como retrovirus, polioma virus, adenovirus y virus símico 40 (SV40), y promotores/potenciadores derivados de células mamíferas tales como el factor de elongación humano la (HEFl\alpha).

Por ejemplo, la expresión se puede lograr fácilmente por el método de Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108) cuando se usa el promotor/potenciador SV40, o por el método de Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) cuando se usa el promotor/potenciador HEFl\alpha.

En el caso de E. coli, la expresión se puede llevar a cabo uniendo operativamente un promotor útil comúnmente empleado, una secuencia de señal para secreción de anticuerpos y el gen de anticuerpos que se ha de expresar, seguido de su expresión. Como el promotor, por ejemplo, se pueden mencionar el promotor lacZ y el promotor araB. Se puede usar el método de Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) cuando se usa el promotor lacZ, y se puede usar el método de Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043) cuando se usa el promotor araB.

Como una secuencia de señales para la secreción de anticuerpos, cuando se produce en el periplasma de E. coli, se puede usar la secuencia de señales pelB (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Después de separar el anticuerpo producido en el periplasma, la estructura del anticuerpo se repliega adecuadamente antes del uso (véase, por ejemplo, el documento WO 96/30394).

Como origen de replicación, se pueden utilizar aquellos derivados de SV40, polioma virus, adenovirus, papilomavirus bovino (BPV) y similares. Además, para la ampliación del número de copias de genes en el sistema de la célula hospedante, los vectores de expresión pueden incluir, como marcadores seleccionables, el gen de aminoglucósido transferasa (APH), el gen de timidina cinasa (TK), el gen de E. coli xantina guaninafosforribosiltransfersa (Ecogpt), el gen de dihidrofolato transferasa (dhfr) y similares.

Para la producción del anticuerpo para uso en la presente invención, se puede usar cualquier sistema de producción. El sistema de producción de preparación del anticuerpo comprende el sistema de producción in vitro e in vivo. Como el sistema de producción in vitro, se puede mencionar un sistema de producción que emplea células eucarióticas y el sistema de producción que emplea células procarióticas.

Cuando se usan las células eucarióticas, están los sistemas de producción que emplean células animales, células vegetales y células fúngicas. Las células animales conocidas incluyen (1) células mamíferas tales como células CHO, células COS, células de mieloma, células de riñón de criatura de hámster (BHK), células HeLa y células Vero, (2) células anfibias tales como Xenopus oocytes, o (3) células de insectos tales como sf9, sf21 y Tn5. Las células vegetales conocidas incluyen, por ejemplo, aquellas derivadas del género Nicotiana, más específicamente células derivadas de Nicotiana tabacum, que se someten a un cultivo de callo. Las células fúngicas conocidas incluyen levaduras tales como el género Saccharomyces, más específicamente Saccharomyces cereviceae, u hongos filamentosos tales como el género Aspergillus, más específicamente Aspergillus niger.

Cuando se usan células procarióticas, están los sistemas de producción que emplean células bacterianas. Las células bacterianas conocidas incluyen Escherichia coli (E. coli) y Bacillus subtilis.

Al introducir, por transformación, el gen del anticuerpo deseado en estas células y cultivar la células transformadas in vitro, se puede obtener el anticuerpo. El cultivo se lleva a cabo por métodos conocidos. Por ejemplo, como el cultivo líquido, se pueden usar DMEM, MEM, RPMI1640 e IMDM, y se pueden combinar con complementos de suero como el suero de ternero fetal (FCS). Además, los anticuerpos se pueden producir in vivo implantando células en las que se ha introducido el gen del anticuerpo a la cavidad abdominal de un animal y similares.

Como otros sistemas de producción in vivo, se pueden mencionar aquellos que emplean animales y aquellos que emplean plantas. Cuando se usan animales, están los sistemas de producción que emplean mamíferos e insectos.

Como mamíferos, se pueden usar cabras, cerdos, ovejas, ratones y ganado (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). También como insectos, se pueden usar el gusano de seda.

Cuando se utilizan plantas, se puede usar tabaco, por ejemplo.

Los genes de anticuerpo se introducen en estos animales o plantas, y los anticuerpos se producen en dichos animales o plantas, y se recuperan a partir de allí. Por ejemplo, un gen de anticuerpo se inserta en el medio del gen que codifica la proteína en la que se produce inherentemente en la leche tal como caseína \beta de cabra para preparar genes de fusión. Los fragmentos de ADN que contienen el gen de fusión al cual se le ha insertado el gen de anticuerpo se inyectan en un embrión de cabra, y el embrión se introduce en una cabra hembra. El anticuerpo deseado se obtiene a partir de la leche producida por la cabra transgénica transmitida a la cabra que recibió el embrión o sus crías. Con el fin de aumentar la cantidad de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, se pueden administrar hormonas a la cabra transgénica según sea apropiado. (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Cuando se utilizan gusanos de seda, el baculovirus al cual se le ha insertado el gen del anticuerpo deseado se infecta con el gusano de seda, y el anticuerpo deseado se puede obtener a partir del fluido corporal del gusano de seda (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594). Asimismo, cuando se usa tabaco, el gen del anticuerpo deseado se inserta en un vector de expresión para plantas, por ejemplo pMON 530, y luego el vector se introduce en una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens. La bacteria se infecta luego a tabaco tal como Nicotiana tabacum para obtener el anticuerpo deseado de las hojas del tabaco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Cuando se produce un anticuerpo en los sistemas de producción in vitro o in vivo, según se describió anteriormente, el ADN que codifica la cadena pesada (cadena H) o la cadena liviana (cadena L) del anticuerpo se puede integrar separadamente a un vector de expresión y los hospedantes se transforman simultáneamente, o el ADN que codifica la cadena H y la cadena L se puede integrar a un vector de expresión simple y al hospedante transformado con esto (véase la solicitud de patente internacional WO 94-11523).

El anticuerpo producido como se describió anteriormente se puede unir a diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG) para uso como un anticuerpo modificado. "Anticuerpo", como se emplea en esta memoria, incluye estos anticuerpos modificados. Con el fin de obtener estos anticuerpos modificados, el anticuerpo obtenido se puede modificar químicamente. Estos métodos ya se han consolidado en el campo de la técnica.

Separación y purificación de anticuerpos

Los anticuerpos producidos y expresados como se describió anteriormente se pueden separar desde el interior o exterior de la célula o desde el hospedante, y luego pueden purificarse hasta homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo para uso en la presente invención se pueden lograr por cromatografía de afinidad. Como la columna utilizada para dicha cromatografía de afinidad, se puede mencionar la columna de Proteína A y la columna de Proteína G. Los ejemplos de la columna que emplea la Proteína A son Hyper D, POROS, Sepharose F.F. y
similares.

Alternativamente, se pueden usar métodos de separación y purificación convencionalmente empleados para proteínas sin ninguna limitación. La separación y purificación del anticuerpo para uso en la presente invención se pueden lograr combinando, según sea apropiado, cromatografía que no sea la cromatografía de afinidad anteriormente mencionada, filtración, ultrafiltración, salificación, diálisis y similares. La cromatografía incluye, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel y similares.

Determinación de la concentración de anticuerpos

La concentración del anticuerpo obtenido en el método mencionado se puede determinar por la medición de absorbancia o por ELISA y similares. Por lo tanto, cuando se emplea la medición de absorbancia, el anticuerpo para uso en la presente invención o una muestra que contiene el anticuerpo se diluye adecuadamente con PBS(-) y luego se mide la absorbancia a 280 nm, seguida de cálculo usando el coeficiente de absorción de 1,35 OD a jmTRQQ SBZVC1 mg/ml. Cuando se usa el método ELISA, la medición se realiza como se explica a continuación. Por lo tanto, se añaden 100 \mul de IgG anti-humana de cabra (fabricada por BIO SOURCE) diluidos hasta 1 \mug/ml en tampón de bicarbonato 0,1 M, pH 9,6, a una placa de 96 pocillos (fabricada por Nunc), y se incuban durante una noche a 4ºC para inmovilizar el anticuerpo.

Después de bloquear, se añaden 100 ml de cada anticuerpo adecuadamente diluido de la presente invención o una muestra que contiene el anticuerpo, o 100 ml de IgG humana (fabricada por CAPPEL) como el estándar, y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, se añaden 100 \mul de anticuerpo de IgG antihumana (fabricado por BIO SOURCE) marcado con fosfatasa alcalina diluida 5000 veces, y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, se añade solución de sustrato y se incuba, y luego se mide la absorbancia a 405 nm usando la LECTORA DE MICROPLACAS Modelo 3550 (fabricada por Bio-Rad) para calcular la concentración del anticuerpo deseado.

Análisis FCM

La reactividad del anticuerpo de la presente invención con linfocitos se puede examinar por análisis de citometría de flujo (FCM). Como las células, se pueden usar líneas celulares consolidadas o células recién aisladas. Como las líneas celulares consolidadas, se pueden usar RPMI822 6 derivada de mieloma (ATCC CCL 155), U266 derivada de mieloma (ATCC TIB 196), KPMM2 derivada de mieloma, KPC-32 derivada de mieloma y ARH-77 derivada de plasmacitoma (ATCC CRL 1621) y similares.

Después de lavar las células anteriormente mencionadas en PBS(-), se añaden 100 \mul de anticuerpo o control diluidos hasta 25 \mug/ml en el tampón FACS (PBS(-) que contiene suero bovino fetal al 2% y azida de sodio al 0,05%), que luego se incuban en hielo durante 30 minutos. Después de lavar con tampón FACS, se añaden 100 \mul de 25 \mug/ml de anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con FITC (GAM, fabricado por Becton Dickinson), que luego se incuban en hielo durante 30 minutos. Después de lavar con tampón FACS, las células se suspenden en 600 \mul o 1 ml del tampón FACS, y se puede medir la intensidad de fluorescencia de cada pocillo usando FACScan (fabricado por Becton Dickinson).

Método de detección

Con el fin de detectar el potenciador de expresión del antígeno HM1.24, por ejemplo, se determinan las células que no han sido estimuladas y que no están expresando el antígeno HM1.24 o las células que están expresando por lo menos el antígeno usando análisis FCM. Por ejemplo, las células descritas en los Ejemplos y en una sustancia de ensayo se incuban durante 1-2 días, y luego se tiñen con anticuerpo HM1.24 antihumano de ratón como el anticuerpo primario. Las células se lavan y se tiñen adicionalmente con anticuerpo de IgG anti-ratón marcado con FITC como el anticuerpo secundario. Finalmente, después de lavar las células, se mide la intensidad de fluorescencia de FITC por citometría de flujo.

A su vez, en lugar de la tinción indirecta anteriormente mencionada se puede usar el análisis FCM por tinción directa en donde las células se tratan con una alta concentración de inmunoglobulina, luego se tiñen, después de bloquear los receptores Fc, con anticuerpo HM1.24 antihumano marcado con FITC.

También es posible detectar los potenciadores de expresión del antígeno HM1.24 usando un ensayo de gen indicador y usando la secuencia del promotor HM1.24. Como el gen indicador, se puede emplear la luciferasa. Se construye un plásmido que contiene la secuencia del promotor HM1.24 en dirección 5' del gen indicador, después de lo cual se transforma en las células, y las células obtenidas se cultivan con una sustancia de ensayo durante 1-2 días, y las células recuperadas se someten al ensayo de luciferasa para detectar los fármacos que potencian la expresión del antígeno HM1.24.

Actividad citotóxica Medición de actividad ADCC

El anticuerpo para uso en la presente invención es uno que tiene, por ejemplo, una actividad ADCC como la actividad citotóxica.

Según la presente invención, la actividad ADCC en las células de mieloma se puede medir de la siguiente manera: primero, se aíslan células mononucleares como las células efectoras de sangre periférica humana o médula ósea por el método centrífugo de gravedad.

Como las células diana (célula diana: T), se marcan RPMI8226 (ATCC CCL 155), U266 (ATCC TIB 196), KPMM2, KPC-32, ARH-77 (ATCC CRL 1621) o similar con ^{51}Cr para prepararse como las células diana. Posteriormente, a las células diana marcadas se les añade el anticuerpo que se ha de medir para la actividad ADCC, y se incuba. Las células efectoras, en una relación adecuada a las células diana, se añaden luego y se incuban.

Después de la incubación, se elimina el sobrenadante y se mide la radiactividad usando un contador gamma, en donde se puede usar NP-40 al 1% para medir la radiactividad libre máxima. La actividad citotóxica (%) se puede calcular como (A-C)/(B-C) X 100, en donde A es la radiactividad (cpm) liberada en presencia del anticuerpo, B es la radiactividad (cpm) liberada por NP-4 0 y C es la radiactividad (cpm) liberada por el medio solo que no contiene anticuerpo.

Potenciación de actividad citotóxica

Con el fin de exhibir actividad citotóxica tal como una actividad ADCC, se prefiere usar C\gamma, en particular C\gamma1 y C\gamma3 como la región constante (región C) de anticuerpo en seres humanos. Asimismo, se puede inducir una actividad ADCC o actividad CDC más potente añadiendo, alterando o modificando parte de los aminoácidos en la región C del anticuerpo.

A modo de ejemplo, se puede mencionar la construcción de un polímero de tipo IgM de IgG por sustitución de aminoácidos (Smith, R.I.F. & Morrison, S.L. BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683-688), la construcción de un polímero de tipo IgM de IgG por adición de aminoácidos (Smith, R.I.F. et al., J. Immunology (1995) 154, 2226-2236), la expresión de un gen ligado en tándem codificado de cadena l (Shuford, W. et al., Science (1991) 252, 724-727), la dimerización de IgG por sustitución de aminoácidos (Caron, P.C. et al., J. Exp. Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B., J. Immunology (1992) 148, 2918-2922), la dimerización de IgG por modificación química (Wolff, E. A. et al., Cancer Res. (1993) 53, 2560-2565) y la introducción de la función efectora alterando un aminoácido(s) en la región bisagra del anticuerpo (Norderhaug, L. et al., Eur. J. Immunol. (1991) 21, 2379-2384) y similares.

Esto se puede lograr mediante mutagénesis específica del sitio oligomérico, usando un cebador, la adición de una secuencia base usando un sitio de escisión de enzimas de restricción, y el uso de un modificador químico que crea un enlace covalente.

Tratamiento

Una realización de la presente invención se refiere al uso de interferón-\alpha o interferón-\gamma y un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2 y tiene actividad citotóxica en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece mieloma, en donde el medicamento potencia la expresión del antígeno HM1.24 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2 en células de mieloma.

El interferón y el anticuerpo anti-HM1.24 se pueden administrar juntos o por separado. En el último caso, preferiblemente se administra primero el interferón, seguido de la administración de anticuerpo anti-HM1.24 al cabo de 96horas. El intervalo entre la administración del interferón y la administración del anticuerpo anti-HM1.24 no está limitada siempre que la cantidad expresada de antígeno HM1.24 esté siendo potenciada por la administración de interferón, pero es preferiblemente al cabo de 96horas, más preferiblemente 72 horas, incluso más preferiblemente 48 horas. La administración alternada de interferón y anticuerpo anti-HM1.24 una pluralidad de veces dependiendo de la respuesta clínica del paciente está dentro del alcance de la presente invención. La ruta de administración es preferiblemente directamente en la circulación de la sangre, y se puede usar goteo intravenoso.

El medicamento puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable que ha sido utilizado para preparaciones de interferón y anticuerpo, como solución salina fisiológica o dextrano al 5%, junto con un estabilizador o excipiente común.

Ejemplos

Ejemplo 1

Potenciación de la cantidad expresada de antígeno HM1.24 en células de mieloma por interferón-\alpha

Una línea celular de mieloma humano U266 (ATCC TIB 196) y células de mieloma derivadas de médula ósea de un paciente con mieloma múltiple se cultivaron en un medio RPMI1640 (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.) que contenía suero bovino fetal al 10% (Whittaker Bioproducts, Inc., Walkersville, MD, EE. UU.) en una incubadora con dióxido de carbono al 5% a 37ºC. El hibridoma que produce anticuerpo anti-HM1.24 de ratón se ha depositado internacionalmente como FERM BP-5233 (fecha de depósito: 27 de abril de 1995) en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki Pref.

Se cultivaron células de mieloma (1 X 10^{5}/ml) en presencia o ausencia de 1000 U/ml del interferón-\alpha natural (Otsuka Pharmaceutical, Tokyo) durante 48 horas, y se determinaron los cambios en el antígeno HM1.24 (la secuencia base que codifica esto se muestra en la SEC ID Nº: 1) por citometría de flujo. Después de lavar las células con tampón fosfato (Gibco BRL, Grand Island, NY, EE. UU.) enriquecido con albúmina de suero bovino al 0,1% (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.) y azida de sodio al 0,02%, se suspendieron en PBS (100 \mul) enriquecido con inmunoglobulina humana (3 mg/ml, Green Cross, Osaka), y se dejaron reaccionar a 4ºC durante 15 minutos.

De allí en más, se añadieron 2 \mul de FITC-IgGl humano (1 mg/ml) o FITC-anticuerpo anti-HM1.24 (1 mg/ml) para teñir a 4ºC durante 60 minutos. Cuando se usaron células de mieloma del paciente, se añadieron 20 \mul de PE-anti-CD38 (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE. UU.) para doble tinción a fin de identificar la célula de mieloma. Después de teñir, las células se lavaron dos veces con PBS, y se conservaron en PBS que contenía paraformaldehído al 1% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka). Después, la expresión de antígeno HM1.24 se analizó usando un citómetro de flujo (EPICS XL, Coulter, Hialeah, FL, EE. UU.).

Como consecuencia, una línea celular de mieloma U266 (Figura 1) y las células de mieloma del paciente (Figura 2) expresaban antígeno HM1.24 en condiciones sin estimulación, y la estimulación con interferón-\alpha aumentó además la cantidad expresada de antígeno HM1.24.

El interferón-\alpha potenció además la expresión del antígeno HM1.24 en la célula de mieloma, y aumentó el número de anticuerpos anti-HM1.24 que se unen a las células de mieloma. Dado que el efecto antitumoral terapéutico del anticuerpo anti-HM1.24 es proporcional al número de anticuerpos de unión, se espera que el tratamiento con anticuerpo anti-HM1.24 después de la ampliación del interferón-\alpha se convierta en una terapia que potencie el efecto terapéutico del anticuerpo y potencie además la eficacia.

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Ejemplo 2

Análisis de la función de expresión del antígeno HM1.24 mediante el análisis del gen indicador

Con el fin de investigar si la inducción de expresión del antígeno es regulada por la región promotora HM1.24, se analizó el gen indicador en la región promotora.

El gen (SEC ID Nº: 3) de la región promotora HM1.24 se obtuvo por clonación PCR. Se preparó ADN genómico a partir de células mononucleares de sangre periférica humana usando el reactivo DNAzol (GIBCO). Con el ADN genómico obtenido como el molde, usando el cebador HM2k (aaaggtaccagctgtctttctgtctgtcc) (SEC ID Nº: 4) y BST2B (atagtcatacgaagtagatgccatccag) (SEC ID Nº: 5), se llevó a cabo la PCR (94ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min, 72ºC durante 1 min, 30 ciclos) usando TaKaRa Taq (Takara Shuzo, Ohtsu) en un Ciclador Térmico 480 (Perkin-Elmer, CA, EE. UU).

Se trató un fragmento de aproximadamente 2 kb obtenido con las enzimas de restricción KpnI y BglII (Takara Shuzo), y se clonó al sitio KpnI-BglII de un plásmido de gen indicador pGL3-basic (Promega, WI, EE. UU.) usando el kit de ligadura de ADN ver. II (Takara Shuzo) para transformar en E. coli JM109 (Nippongene) competente. La E. coli transformada se cultivó a 37ºC en el medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, y el plásmido se preparó usando el maxi kit de plásmido QIAGEN (QIAGEN, Hilden, Alemania).

El plásmido HM-2k/GL3 obtenido se trató con las enzimas de restricción KpnI y XhoI, a partir de las cuales se construyó un clon de deleción usando el kit de deleción (Takara Shuzo) para una secuencia de quilo a fin de obtener un plásmido HM-493/GL3 que contenía desde el punto de iniciación de la transcripción hasta 493 bp en dirección 5'. Además, se trató HM-2k/GL3 con las enzimas de restricción KpnI y AflII, a partir de las cuales se construyó un clon de deleción como el anteriormente descrito, y HM-151/GL3 y HM-77/GL3 que contenían desde el punto de iniciación de la transcripción hasta -151 bp o -77 bp en dirección 5'.

Para la introducción del plásmido a la célula, se usó el Kit polyethyleneimine-Transferrinfection (Tf PEI-Kit) (Bender MedSystems, Viena, Austria), y para el ensayo de lucifersa se usó el Sistema De Ensayo Indicador de Luciferasa Dual (Promega). La línea celular se cultivó durante la noche en medio RPMI-1640 que contenía 50 \muM de Desferrioxamina y FBS al 10%. Con el fin de formar un complejo del plásmido que se ha de introducir con Tf-PEI, se preparó una mezcla del plásmido de gen indicador a una concentración final de 20 \mug/ml, 0,4 \mug/ml de pRL-SV40 y 1 \mug/ml de reactivo Tf-PEI, y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron 5 X 10^{5} células/ml de células en tres volúmenes de la mezcla Tf-PEI/plásmido, y se incubó a 37ºC durante cuatro horas, se lavó el medio y se cultivaron 100 \mul por pocillo a una concentración de 2 X 10^{5} células/ml en una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se añadió IFN-\alpha a una concentración final de 0, 10, 100 ó 1000 U/ml, que se cultivó a 37ºC durante dos días. Después de lavar las células en PBS(-), se disolvieron en 20 \mul de Tampón de Lisis Pasiva, de los cuales se aplicaron 6 Ul a la placa C96 blanca Polysorp Fluoronunc (Nunc). Usando Luminoskan (Labsystems), se midió la intensidad de luminiscencia para Luciérnaga y Renilla a 30 \mul de la solución de sustrato y un tiempo de medición de 10 segundos. Los valores medidos fueron corregidos por Luciérnaga/Renilla, y se determinó la actividad relativa con el control (medio) como uno.

Como consecuencia, la actividad de la luciferasa del indicador se aumentó en un modo dependiente de la concentración de IFN-\alpha tanto para 2 kbp y 493 bp en dirección 5', confirmando que la actividad de transcripción potenciada de la actividad de transcripción de la región promotora causa la inducción de expresión del antígeno (Figura
3).

Asimismo, en el resultado de un experimento en el que se usaron el plásmido indicador 151 bp y 77 bp en dirección 5' del punto de iniciación de la transcripción, se observó una actividad potenciada de la luciferasa por estimulación de IFN-\alpha para el plásmido indicador de 151 bp en dirección 5'. Por otra parte, no se observaron cambios en la actividad por la estimulación de IFN-\alpha en el plásmido indicador de 77 bp en dirección 5' (Figura 4). En la región de 77-151 bp, estuvo presente una secuencia que tenía una alta homología con el elemento GAS e ISRE, y, como es un factor regulador de transcripción activado en respuesta a la estimulación de IFN-\alpha, se demostró que el factor regulador de la transcripción de la familia IRF estaba implicado en la actividad.

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Ejemplo 3

Potenciación de la cantidad expresada del antígeno HM1.24 en células de mieloma por el interferón-\gamma

De acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1, se usaron 1000 U/ml del interferón-\gamma de tipo natural (R&D System) para el análisis. Como resultado, se observaron incrementos en la cantidad expresada de antígeno HM1.24 tanto en la línea celular de mieloma U266 (Figura 5) como en las células de mieloma del paciente (Figura 6) como para el interferón-\alpha.

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Ejemplo 4

Unión de IRF-2 a la región promotora HM1.24

Con el fin de identificar el factor de transcripción que se une a la región promotora HM1.24, se realizó el Ensayo de Cambio de Movilidad Electroforética (EMSA) con la región promotora HM1.24 como la sonda de la siguiente manera, para identificar IRF-2 como el factor de unión.

(1) Preparación de extracto nuclear

Se cultivaron células de mieloma U266-B1 (ATCC-TIB196) en el medio RPMI-1640 (GIBCO-BRL) que contenía FBS al 10% (HyClone) a 37ºC en una incubadora de CO_{2} al 5%. Con el fin de estimular las células con el interferón-\alpha (IFN-\alpha) (Pepro Tech EC), se añadió IFN-a al medio hasta una concentración final de 1000 U/ml, y las células se recuperaron 30 minutos, dos horas, cuatro horas y ochos horas después de la adición. Las células se suspendieron en PBS frío (-), se centrifugaron a 1.000 rpm para desechar el sobrenadante y se suspendieron en una solución de Tris 10 mM, NaCl 10 mM y MgCl_{2} 6 mM.

Después de dejar reposar en hielo durante cinco minutos, se repitió la centrifugación, y el sobrenadante se desechó. Las células se suspendieron en Tris 10 mM, NaCl 10 mM, MgCl_{2} 6 mM, DTT 1 mM, PMSF 0,4 mM y Na_{3}VO_{4} 1 mM. Las células se homogeneizaron en hielo, usando un homogeneizador de vidrio, se centrifugaron a 6000 g durante tres minutos, y se desechó el sobrenadante. Las células se suspendieron en el tampón de extracción (glicerol al 20%, HEPES 20 mM, NaCl 420 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, PMSF 0,2 mM, DTT 1 mM, Na_{3}VO_{4} 0,1 mM, 2 mg/ml aprotinina y 5 mg/ml leupeptina), y luego se dejaron reposar en hielo durante 20 minutos. Se centrifugó a 12000 g durante 10 minutos, y el sobrenadante se recuperó.

(2) Preparación de la sonda marcada

Como la sonda, se construyó ISRE2 que contiene una secuencia (ttcccagaaa (SEC ID Nº: 10)) que tiene una homología con GAS (sitio de activación de IFN-\gamma: la secuencia de consenso GAS es ttncnnnaa (SEC ID Nº: 8)) e ISRE (factor de respuesta de estimulación de IFN-\alpha: la secuencia de consenso ISRE es ngaaanngaaact (SEC ID Nº: 9)), y ggaaactgaaact (SEC ID Nº: 11) en la región promotora HM1.24. Por lo tanto, se mezclaron oligo ADN ISRE-F2 (aatttctgggaaactgaaactgaaaacct (SEC ID Nº: 12)) e ISRE-R2 (aattaggttttcagtttcagtttcccaga (SEC ID Nº: 13)) y se anelaron para formar una sonda de ADN bicatenario ISRE2.

Además, se mezclaron oligo ADN adp-1 (catggcatctacttcgtatgactattgcagagtgcc (SEC ID Nº: 14)) y adp-2 (catggg
cactctgcaatagtcatacgaagtagatgc (SEC ID Nº: 15)) y se anelaron para formar una sonda no relacionada adp. Las sondas se marcaron usando el Kit Band Shift (Amersham Pharmacia Biotech) de acuerdo con el protocolo estándar. En consecuencia, se sometieron 50 ng de ADN bicatenario construido como anteriormente a la reacción de la polimerasa del fragmento Klenow en una solución de reacción que contenía [\alpha-^{32}P]dATP (20 \muCi) (Amersham Pharmacia Biotech) a 37ºC durante una hora. La solución que completó la reacción se diluyó dos veces y luego se cargó la Columna Nick Spin (Amersham Pharmacia Biotech) y, después de la centrifugación a 1600 rpm durante cuatro minutos, la solución se recuperó para preparar una sonda marcada.

(3) Cambios con el tiempo en el factor de unión producidos por estimulación de IFN-\alpha

Según el protocolo estándar del Kit Band Shift (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, EE. UU.), se realizó el siguiente procedimiento. A 5 \mug de los extractos temporalmente preparados en (1) ya mencionado, se le añadieron 2 \mul del tampón de unión 10 X (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, DTT 5 mM), 4 \mul de glicerol al 50%, 1 \mul de NP-40 al 1% y 1 \mul de poli (dI-dC)/poli (dI-dC), y se añadieron 2 \mul de la sonda ISRE-2 marcada con ^{32}P en (2) ya mencionado, a los que se les añadió agua hasta un volumen total de 20 \mul, y esta mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir la unión de los posibles factores de unión que pueden estar presentes en el extracto anterior y dicha sonda ISRE-2 marcada con ^{32}P.

A 18 \mul de la mezcla de reacción se le añadieron 2 \mul de la solución de tinción 1,0 X (unida al kit), que se sometió a la electroforesis en tampón Tris-glicina 1 X (Tris 25 mM, glicina 190 mM, EDTA 1 mM, pH 8,1) en un gel de acrilamida al 7,5%, y luego, después de la electroforesis, se unió el gel al papel de filtro para transferir la proteína al papel de filtro. El papel de filtro secado con un secador de gel se expuso a una película de rayos X para detectar señales.

Para fines comparativos, se prepararon una solución de reacción [(NEC-)] a la que no se le añadió ningún extracto, una solución de reacción [0 h] a la que se le añadió un extracto del cultivo celular que se cultivó sin estimulación por interferón-\alpha, una solución de reacción [8 h (+fría)] a la que se añadieron 50 ng de sonda ISRE2 no marcada en lugar de la sonda marcada al extracto de cultivo de 8 horas, y una solución de reacción [8 h (+fría no relacionada)] a la que se añadieron 50 ng de sonda adp no relacionada al extracto de cultivo de 8 horas, y se procesaron según lo anteriormente descrito para representar señales.

El resultado se muestra en la Figura 7. Como se puede observar a partir de esta figura, una sustancia que se une a un ADN bicatenario correspondiente a parte del promotor HM1.24 aumentó con el tiempo en las células U266-B1 cultivadas bajo la estimulación con interferón.

(4) Identificación de un factor de transcripción por reacción con diversos anticuerpos

En un modo similar al descrito en (1), se cultivaron células de mieloma U266-B1 (ATCC-TIB196) durante ocho horas en presencia de 1000 U/ml de interferón-\alpha para preparar un extracto. El siguiente procedimiento se realizó de acuerdo con el protocolo estándar del Kit Band Shift (Amersham Pharmacia Biotech). Por ende, se añadieron 2 \mug de anticuerpo a 5 \mug del extracto, y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos para obtener una solución de reacción extracto/anticuerpo. A 2 \mul del tampón de unión 10 X adjunto al kit, 4 \mul de glicerol al 50%, 1 \mul de NP-40 al 1% y 1 \mul de Poly(dI-dC)/Poly (dI-dC) se le añadieron 2 \mul de la solución de reacción extracto/anticuerpo recientemente mencionada y 2 \mul de la sonda marcada preparada anteriormente en (2), a la que se añadió agua para componer el volumen total de 20 \mul, y la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.

La mezcla de reacción se sometió a electroforesis como se describió anteriormente en (3) para detectar señales.

Como el anticuerpo previamente descrito, se emplearon los siguientes anticuerpos (todos de Santa Cruz Biotechnology):

STAT1 p84/p91 antihumano (E-23): (descripción) anticuerpo policlonal de conejo (SC-34 6X)

STAT2 antihumano (C-20): anticuerpo policlonal de conejo (SC-476X)

STAT3 antirratón (K-15): anticuerpo policlonal de conejo (SC-483X)

ISGF-3\gamma p48 antihumano (C-20): anticuerpo policlonal de conejo (SC-496X)

IRF-1 antihumano (C-20): anticuerpo policlonal de conejo (SC-497X)

IRF-2 antihumano (C-19): anticuerpo policlonal de conejo (SC-498X)

ICSAT antihumano (M-17): anticuerpo policlonal de conejo SC-6059X)

Como control, se prepararon una solución de reacción que usa un extracto de las células cultivadas sin estimulación de interferón [0 h]; una solución de reacción a la que se añadió un extracto de las células cultivadas durante ocho horas bajo la estimulación de 1000 U/ml interferón-\alpha, y ningún anticuerpo [8 h]; una solución de reacción a la que a 50 ng de la sonda ISRE2 no marcada se le añadió la sonda ISRE2 marcada [8 h (+fría)]; una solución de reacción a la que a 50 ng de sonda dp no marcada se le añadió la sonda ISRE2 marcada [8 h (+fría)], y se procesaron como se describió anteriormente.

El resultado se muestra en la Figura 8. Como se puede observar a partir de esta figura, se demostró que el componente que se une a la sonda ISRE2 marcada en el extracto de las células cultivadas bajo la estimulación de interferón-\alpha se une solamente al anticuerpo anti-IRF-2, y el factor que se une y activa así el promotor HM1.24 es un factor de transcripción IRF-2.

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Ejemplo 5

Confirmación de la activación del promotor HM1.24 con IRF-2

El efecto sobre la actividad del promotor HM1.24 por la co-expresión de IRF-2 se determinó por el ensayo de gen indicador usando las células U266, y se reveló que el IRF-2 realmente tiene la actividad de activación de la transcripción del promotor HM1.24. En el siguiente experimento, se usó una línea celular de mieloma U266-B1 (ATCC TIB196). Las células se cultivaron en el medio RPMI-1640 (GIBCO) (al que se hace referencia a continuación en este documento como el medio) que contenía FBS al 10% (GIBCO BRL) en un incubador de CO_{2} al 5%.

(1) Construcción de un plásmido que contiene la región promotora HM1.24

El gen de la región promotora HM1.24 se obtuvo por clonación PCR. A partir de células mononucleares de sangre periférica humana, se preparó ADN genómico usando el reactivo DNAzol (GIBCO). Con el ADN genómico obtenido como molde, usando el cebador HM2k (aaaggtaccagctgtctttctgtctgtcc) (SEC ID Nº: 16) y BST2B (atagtcatacgaagta
gatgccatccag) (SEC ID Nº: 17), se llevó a cabo PCR (94ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min, 72ºC durante 1 min, 30 ciclos) usando TaKaRa Taq (Takara Shuzo, Ohtsu) en el Ciclador Térmico 480 (Perkin-Elmer, CA, EE. UU.).

Se trató un fragmento de aproximadamente 2 kb obtenido con las enzimas KpnI y BglII (Takara Shuzo), y se clonó en el sitio KpnI-BglII de un plásmido de gen indicador pGL3-basic (Promega, WI, EE. UU.) usando el kit de ligadura de ADN ver. II (Takara Shuzo) para transformar E. coli JM109 competente (Nippongene). La E. coli transformada se cultivó a 37ºC en el medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, y se preparó un plásmido usando el maxi kit del plásmido QIAGEN (QIAGEN, Hilden, Alemania).

El plásmido HM-2k/GL3 obtenido se trató con las enzimas de restricción KpnI y XhoI, a partir de las cuales se construyó un clon de deleción usando el kit de deleción para secuenciación de quilo (Takara Shuzo) para obtener un plásmido HM-491/GL3 que contiene hasta -491 bp en dirección 5' del punto de iniciación de la transcripción. Además, se trató HM-2k/GL3 con las enzimas de restricción KpnI y AflII, a partir de las cuales se construyó un clon de deleción como se describió anteriormente, y HM-151/GL3 que contiene -151 bp en dirección 5' del punto de iniciación de la transcripción.

Además, con HM-2k/GL3 como molde, usando el cebador 10S (tttcggtacctaattaatcctctgcctg) (SEC ID Nº: 18) y el cebador GL 2 (ctttatgtttttggcgtcttcca) (SEC ID Nº: 19), se realizó PCR (94ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min, 72ºC durante 1 min, 30 ciclos) usando TaKaRa Taq (Takara Shuzo, Ohtsu) en un Ciclador Térmico 480 (Perkin-Elmer, CA, EE. UU). El fragmento obtenido se trató con las enzimas de restricción KpnI y BglI (Takara Shuzo), y se clonó en el sitio KpnI-BglI de un plásmido de gen indicador pGL3-basic (Promega, WI, EE. UU.) usando el kit de ligadura (Toyobo) para transformar E. coli JM109 (Nippongene) competente.

La E. coli transformada se cultivó a 37ºC en el medio LB que contenía 100 \mug/ml ampicilina, y se preparó un plásmido usando el maxi kit de plásmido QIAGEN (QIAGEN, Hilden, Alemania). Se obtuvo así un plásmido HM-125/GL3 que contiene hasta 125 bp en dirección 5' del punto de iniciación de la transcripción. Asimismo, con HM-2k/GL3 como molde, usando el cebador HMP700 (aaaggtaccagagtttacctggtatcctgg) (SEC ID Nº: 20) y el cebador GL 2, se realizó PCR en un procedimiento similar e, introduciendo el fragmento al sitio KphI-BglII de pGL3-basic, se obtuvo HM-700/GL3 que contenía hasta aproximadamente 700 bp en dirección 5' del punto de iniciación de la transcripción.

Además, con HM-2k/GL3 como molde, usando el cebador HMP700 y 11A' (cagaggattaattaggtaccgaaagagaggtggg
ctttt) (SEC ID Nº: 21), se llevó a cabo PCR (98ºC durante 15 segundos, 65ºC durante 2 segundos, 74ºC durante 30 segundos, 25 ciclos) usando la polimerasa KOD (Toyobo) en un Ciclador Térmico 480 (Perkin-Elmer, CA, EE. UU.). El fragmento obtenido se insertó en el vector pCR4 Blunt-TOPO usando el kit de clonación zero Blunt TOPO PCR para secuenciación ver. B (Invitrogen). El plásmido obtenido se trató con una enzima de restricción KpnI, y se recuperó un fragmento de aproximadamente 550 bp, que se introdujo al sitio KpnI de HM-125/GL3 usando el ki "Ligation High". Por lo tanto, se obtuvo dISRE/GL3 que carece de -25 a -145 en dirección 5' del punto de iniciación de la transcripción.

(2) Construcción del plásmido de expresión de IRF-2

El plásmido de expresión de IRF-2 se construyó de la siguiente manera. A partir de células U266, después de que habían transcurrido ocho horas desde la estimulación con interferón-\alpha (1000 U/ml), se extrajo ARN total usando el reactivo TRIzol (GIBCO BRL). Con ARN obtenido usando el kit de Síntesis de ADNc monocatenario (Pharmacia) como el molde, y usando NotI-d(T)_{18} como el cebador, se realizó una reacción de transcripción inversa a 37ºC durante una hora. Con el ADNc obtenido como molde, usando IRF2-F2 (ttgtattggtagcgtgaaaaaagc) (SEC ID Nº: 22) e IRF2-R2 (cagctagttcacattatctcgtcc) (SEC ID Nº: 23) como cebadores, se llevó a cabo PCR (94ºC durante 45 segundos, 60ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 60 segundos, 40 ciclos) usando LA-Taq (Takara Shuzo).

Con la reacción PCR como molde, usando IRF2-F1 (agagggtaccatgccggtggaaaggatgcg) (SEC ID Nº: 24) e IRF2-R1 (agtcggtaccttaactgctcttgacgcggg) (SEC ID Nº: 25) como cebadores, se llevó a cabo PCR (94ºC durante 45 segundos, 60ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 60 segundos, 30 ciclos) usando la polimerasa KOD (Toyobo). El fragmento obtenido se trató con una enzima de restricción KpnI, y luego se introdujo en el sitio KpnI de un plásmido de expresión pTracer-CMV (Invitrogen) usando el kit Ligation High (Toyobo) para obtener un plásmido de expresión de IRF-2 pIRF-2/Tracer.

(3) Medición de la actividad del gen indicador

Para la introducción del plásmido a las células, se usó el Kit polyethyleneimine-Transferrinfection (Tf PEI-Kit) (Bender MedSystems, Viena, Austria), y para el ensayo de la luciferasa se usó el Sistema De Ensayo Indicador de Luciferasa Dual (Promega). La línea celular se cultivó durante una noche en RPMI-164 0 que contenía 50 \mum de Desferrioxamina y FBS al 10%. Con el fin de formar un complejo del plásmido al que se le introduciría Tf-PEI, se preparó una mezcla del plásmido de gen indicador a una concentración final de 20 \mug/ml, 20 \mug/ml de pIRF-2/Tracer o pTracer-CMV, 0,4 \mug/ml de pRL-SV40 y 1 \mug/ml de reactivo Tf-PEI, y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Se añadieron 5 X 10^{5} células/ml de células a tres volúmenes de la mezcla de Tf-PEI/plásmido, y se incubó a 37ºC durante cuatro horas, se lavó con el medio, y se cultivaron 100 \mul por pocillo a una concentración de 2 X 10^{5} células/ml en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Se añadió IFN-\alpha hasta una concentración final de 0 ó 1000 U/ml, que se cultivó a 37ºC durante dos días. Después de lavar las células en PBS(-), se disolvió en 20 \mul del Tampón de Lisis Pasiva, de los cuales seis \mul se aplicaron a la placa C96 White Polysorp Fluoronunc (Nunc). Usando Luminoskan (Labsystems), se midió la intensidad de luminiscencia para Luciérnaga y Renilla a 30 \mul del sustrato en un tiempo de medición de 10 segundos. Los valores medidos se corrigieron por Luciérnaga/Renilla para obtener la actividad relativa correcta.

(4) Resultado

El plásmido indicador promotor HM1.24 y el plásmido de expresión de IRF-2 se introdujeron a las células U266, y se determinó la actividad del indicador (Figura 9). Como consecuencia, se aumentó la actividad de la luciferasa en -700 y -151 que contenía la secuencia del motivo ISRE que es un sitio de unión a IRF-2 por co-expresión de IRF-2. Por otra parte, no se observaron cambios de actividad en dISRE/GL3 que carece de la secuencia ISRE por co-expresión de IRF-2. Este resultado indicó que el IRF-2 se une a la región ISRE del promotor HM1.24 y potencia su actividad de transcripción.

(5) Confirmación de expresión potenciada de antígeno HM1.24 por expresión forzada de IRF-2

Para confirmar el cambio en una cantidad de expresión de HM1.24, por IRF2, se introduce el plásmido de expresión de IRF-2 (pIRF-2/Tracer) o el plásmido control (pTracer/CMV) en las células U266 por el método anteriormente descrito, y luego se cultiva durante 1-2 días, desde donde se recuperan las células, y luego se tiñen con anticuerpo HM1.24 antihumano de ratón como un anticuerpo primario. Las células se lavan, y se tiñen adicionalmente con anticuerpo IgG antirratón marcado con FITC como anticuerpo secundario. Después de lavar las células, la intensidad de fluorescencia FITC de las células se mide por citometría de flujo. Se confirma que, en las células en las que se introdujo el plásmido de expresión de IRF-2, hay más células que tiene una alta intensidad de FITC en comparación con las células en las que se introdujo el plásmido control.

Referencia al microorganismo deposito según el Patent Cooperation Treaty (Tratado de Cooperación de Patentes), Norma 13-2, y nombre del órgano de depósito

Órgano de depósito

Nombre: National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial)

Domicilio: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki Pref., Japón

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Organismo (1)

Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pRS38-pUC19)

Número de acceso: FERM BP-4434

Fecha de depósito: 5 de octubre de 1993

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Organismo (2)

Nombre: Hibridoma HM1.24 ratón-ratón

Número de acceso: FERM BP-5233

Fecha de depósito: 27 de abril de 1995

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Organismo (3)

Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHr-AHM-g\gammal)

Número de acceso: FERM BP-5643

Fecha de depósito: 29 de agosto de 1996

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Organismo (4)

Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-1.24H-g\gammal)

Número de acceso: FERM BP-5644

Fecha de depósito: 29 de agosto de 1996

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Organismo (5)

Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVLa-AHN-gK)

Número de acceso: FERM BP-5645

Fecha de depósito: 29 de agosto de 1996

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Organismo (6)

Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-1.24L-gK)

Número de acceso: FERM BP-5646

Fecha de depósito: 29 de agosto de 1996

<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA

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<120> Agente para potenciar la expresión de HM1.24 que comprende como componente activo interferón-\alpha

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<130> H757

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<160> 5

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<210> 1

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<211> 1073

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de la proteína HM1.24

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<400> 1

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1

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2

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<210> 2

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<211> 180

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<223> Secuencia de aminoácidos del antígeno de la proteína HM1.24

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<400> 2

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3

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4

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<210> 3

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<211> 2016

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<223> Secuencia de nucleótidos de la región promotora del gen que codifica el antígeno de la proteína HM1.24

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<400> 3

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5

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6

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<210> 4

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221>

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<222>

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<223> Cebador HM2K

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<400> 4

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\hskip0,8cm

7

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<210> 5

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<211> 78

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221>

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<222>

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<223> Cebador BST2B

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<400> 5

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\hskip0,8cm

8

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<210> 6

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<211> 2144

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína IRF-2

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<400> 6

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9

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10

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<210> 7

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<211> 349

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<223> Secuencia de aminoácidos de la proteína IRF-2

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<400> 7

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11

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12

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13

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de consenso siile activado de IFN-gamma (GAS)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de consenso del elemento de respuesta estimulada por IFN-alfa (ISRE)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda ISRE-F2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda ISRE-F2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sonda adp-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sonda adp-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador HM2k

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> BST2B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador 10S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GL Cebador 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador HMP700

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador 11A'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador IRF2-F2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador IRF2-R2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador IRF2-F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador IRF2-R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

31

Claims (11)

1. Uso de interferón-\alpha o interferón-\gamma y un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2 y tiene actividad citotóxica en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece mieloma, en donde el medicamento potencia la expresión del antígeno HM1.24 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2 en células de mieloma.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho mieloma es el mieloma múltiple.

3. El uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

5. El uso según la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado es anticuerpo anti-HM1.24 quimérico o anticuerpo anti-HM1.24 humanizado.

6. Uso de IRF-2 y un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2 y actividad citotóxica en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece mieloma, en el que dicho medicamento potencia la expresión del antígeno HM1.24 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2 en células de mieloma.

7. El uso según la reivindicación 6, en el que dicho mieloma es el mieloma múltiple.

8. El uso según la reivindicación 6 ó 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

10. El uso según la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado es el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico o el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado.

11. Uso de IRF-2 para potenciar la actividad transcripcional del promotor HM1.24 in vitro.