TW201540728A - 多重特異性抗體 - Google Patents

多重特異性抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW201540728A
TW201540728A TW104110751A TW104110751A TW201540728A TW 201540728 A TW201540728 A TW 201540728A TW 104110751 A TW104110751 A TW 104110751A TW 104110751 A TW104110751 A TW 104110751A TW 201540728 A TW201540728 A TW 201540728A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
amino acid
domain
heavy chain
acid
Prior art date
Application number
TW104110751A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI576353B (zh
Inventor
Wolfgang Schaefer
Christian Klein
Sabine Imhof-Jung
Stefan Klostermann
Michael Molhoj
Joerg Thomas Regula
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53724278&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TW201540728(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of TW201540728A publication Critical patent/TW201540728A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI576353B publication Critical patent/TWI576353B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

本發明係關於多重特異性抗體、其製造及用途。

Description

多重特異性抗體
本發明係關於新穎多重特異性抗體、其製造及用途。
經改造蛋白質、例如能結合兩種或更多種抗原之二重特異性或多重特異性抗體為業內已知。該等多重特異性結合蛋白可使用細胞融合、化學偶聯或重組DNA技術生成。
最近已研發眾多種重組多重特異性抗體形式，例如藉由融合例如IgG抗體形式及單鏈結構域生成之四價雙特異性抗體(例如，參見Coloma,M.J.等人，Nature Biotech.15(1997)159-163；WO 2001/077342；及Morrison,S.L.,Nature Biotech.25(2007)1233-1234)。
亦已研發若干種其他新形式，其中不再保持抗體核心結構(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)，例如雙價、三價或四價抗體、微小抗體、若干種單鏈形式(scFv、雙-scFv)，其能結合兩種或更多種抗原(Holliger,P.等人，Nature Biotech.23(2005)1126-1136；Fischer,N.及Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；Shen,J.等人，J.Immunol.Methods 318(2007)65-74；Wu,C.等人，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。
所有該等形式皆使用連接體以將抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合至另一結合蛋白(例如scFv)或融合(例如)兩個Fab片段或scFv(Fischer,N.及Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14)。儘管連接 體顯然具有改造雙重特異性抗體之優點，但其亦在治療環境中引起問題。實際上，該等外源肽可引發針對連接體自身之免疫反應或蛋白質與連接體之間之接合。此外，該等肽之撓性使其更易於發生蛋白分解裂解，從而可能導致較差抗體穩定性、聚集及提高之免疫原性。另外，可能期望保持效應物功能，例如補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，其係藉由維持與天然抗體之高相似度經由Fc部分來介導。
因此，理想地，目標應在於研發一般結構與天然抗體(如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)極為相似且與人類序列偏差極小之雙重特異性抗體。
在一種方法中，已使用四源雜交瘤技術(參見Milstein,C.及Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540)產生與天然抗體極為相似之雙重特異性抗體，該四源雜交瘤技術係基於兩種不同雜交瘤細胞系的體細胞融合，該兩種雜交瘤細胞系表現具有雙重特異性抗體之期望特異性之小鼠單株抗體。由於所得雜交-雜交瘤(或四源雜交瘤)細胞系內兩種不同抗體重鏈及輕鏈之隨機配對，生成多達10種不同抗體物質，其中僅一種係期望的功能性雙重特異性抗體。由於存在配對錯誤之副產物且產率顯著降低，故需要精密純化程序(例如，參見Morrison,S.L.,Nature Biotech.25(2007)1233-1234)。一般而言，若使用重組表現技術，則保留配對錯誤之副產物之相同問題。
一種避免配對錯誤之副產物的問題之方法稱為「杵臼結構(knobs-into-holes)」，其旨在藉由將突變引入CH3結構域中以修飾接觸界面來迫使兩種不同抗體重鏈配對。在一條鏈上，藉由具有短側鏈之胺基酸置換巨大胺基酸以產生「臼形空穴」。相反，將具有大側鏈之胺基酸引入另一CH3結構域中以產生「杵形隆凸」。藉由共表現該兩條重鏈(及兩條相同輕鏈，其必須適合於兩條重鏈)，觀察到異二聚體 形成(「隆凸-空穴」)相對同二聚體形成(「空穴-空穴」或「隆凸-隆凸」)之高產率(Ridgway,J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617-621；及WO 96/027011)。異二聚體百分比可藉由使用噬菌體展示方法對兩個CH3結構域之相互作用表面重建模及引入二硫橋以穩定異二聚體來進一步增加(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)。用於杵臼結構技術之新方法闡述於(例如)EP 1 870 459 A1中。儘管此形式似乎極有吸引力，但當前未獲得闡述面向診療所之進展之資料。此策略之一個重要限制在於，兩個親代抗體之輕鏈必須相同以防止配對錯誤及形成無活性分子。因此，此技術不適合作為自兩種針對第一及第二抗原之抗體開始容易地研發針對三種或四種抗原之重組三重特異性或四重特異性抗體之基礎，此乃因必須首先最佳化該等抗體之重鏈及/或相同輕鏈，之後必須添加針對第三及第四抗原之其他抗原結合肽。
WO 2006/093794係關於異二聚蛋白質結合組合物。WO 99/37791闡述多用途抗體衍生物。Morrison,S.L.等人，J.Immunol.160(1998)2802-2808提及可變區結構域交換對IgG功能性性質之影響。
WO 2013/02362係關於異二聚體多肽。WO 2013/12733係關於包含異二聚Fc區之多肽。WO 2012/131555係關於經改造異二聚免疫球蛋白。EP 2647707係關於經改造異二聚免疫球蛋白。
WO 2013/026835係關於具有結構域交叉之雙重特異性無Fc抗體。WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254及Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191係關於具有結構域交叉之二價雙重特異性IgG抗體。
闡述於WO2009/080252中(亦參見Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191)之在一個結合臂中具有VH/VL置換/交換以防止輕鏈配對錯誤(CrossMabVH-VL)之多重特異性抗體顯著減少因針對第一抗 原之輕鏈與針對第二抗原之錯誤重鏈之失配產生之副產物(與不使用該結構域交換之方法相比)。然而，其製備並非完全不含副產物。主要副產物係基於Bence-Jones型相互作用--亦參見Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191(附錄中之圖S1I)。
因此，業內仍需要進一步減少該等副產物以改良(例如)該等雙重特異性抗體之產率。
本發明係關於多重特異性抗體，其包含：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，且其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或ii)b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
本發明之另一實施例係製備本發明多重特異性抗體之方法，其包含以下步驟：
A)用包含編碼以下之核酸分子之載體轉化宿主細胞：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或ii)b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
B)在容許合成該抗體分子之條件下培養該宿主細胞，及
C)自該培養物回收該抗體分子。
本發明之另一實施例係編碼本發明多重特異性抗體之胺基酸序列之核酸。
本發明之另一實施例係表現載體，其含有能在宿主細胞中表現該核酸之本發明核酸。
本發明之另一實施例係宿主細胞，其包含本發明之載體。
本發明之另一實施例係本發明抗體之組合物，例如醫藥組合物或診斷組合物。
本發明之另一實施例係醫藥組合物，其包含本發明抗體及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
本發明之另一實施例係治療需要療法之患者之方法，其特徵在於向該患者投與治療有效量之本發明抗體。
根據本發明，期望多重特異性抗體與不期望主要Bence Jones型副產物之比率可藉由在CH1及CL結構域中之特定胺基酸位置引入相反電荷對帶電荷胺基酸之取代加以改良。
圖1 在一個抗體結合臂中具有VH/VL結構域置換且在一個CH1/CL結構域界面中具有特定突變之本發明多重特異性抗體之一些實例：至少CL結構域之位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且至少CH1結構域之位置147之胺基酸或CH1結構域之位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
圖1A：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及另一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變。
圖1B：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及同一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變。
圖1C：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及另一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變，及CH3/CH3結構域界面之促進重鏈異二聚化之修飾(如例如杵臼結構技術或交替異二聚化技術，如例如用其各別相反電荷取代帶電荷胺基酸)。
圖2A在一個抗體結合臂中具有VH/VL結構域置換且在一個CH1/CL結構域界面中無突變之多重特異性抗體(左側)及此多重特異性 抗體之主要副產物(由於VL-VL Bence Jones型結構域相互作用而產生)之實例--直接藉由質譜或在胞漿素或LysC消化後藉由質譜分析其Fab片段皆未檢測到作為潛在副產物之其他可能變體。
圖2B在一個抗體結合臂中具有VH/VL結構域置換且在一個CH1/CL結構域界面中無突變之多重特異性抗體之主要副產物之來源(由於VL-VL Bence Jones型結構域相互作用而產生)。
圖3 圖3A：CH1結構域中之野生型(wt)胺基酸序列(顯示兩個IgG同型)，且加下劃線並加強顯示胺基酸位置147及213(根據Kabat EU索引編號)。
圖3B：κ同型CL結構域中之野生型(wt)胺基酸序列，且加下劃線並加強顯示胺基酸位置124及123(根據Kabat編號)。
圖3C：λ同型之CL結構域中之野生型(wt)胺基酸序列，且加下劃線並加強顯示胺基酸位置124及123(根據Kabat編號)。
圖4 圖4A：藉由CH1/CL界面中本發明之單一帶電荷胺基酸取代來減少主要Bence-Jones型副產物。
具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )之本發明抗Ang2-VEGF多重特異性抗體之實例。
野生型(wt)及單一帶電荷胺基酸取代之不同組合之比較
1)野生型(wt)抗Ang2-VEGF CrossMAb Vh-VL 多重特異性抗體，在CH1/CL界面中無特定胺基酸取代，2)本發明抗Ang2-VEGF多重特異性抗體，i)在CL結構域之位置124及在CH1結構域之位置147具有取代(根據Kabat EU索引編號)，或ii)在CL結構域之位置124及在CH1結構域之位置213具有取代(根據Kabat EU索引編號)，3)其他抗Ang2-VEGF CrossMAb Vh-VL 多重特異性抗體，在不同位置具有取代。
圖4B：多重特異性抗體之序列(SEQ ID NO)，其結果顯示於圖4A中。
圖5 圖5A：藉由CH1/CL界面中之不同帶電荷胺基酸取代來減少主要Bence-Jones型副產物。
具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )之本發明抗Ang2-VEGF多重特異性抗體之實例。
野生型(wt)及帶電荷胺基酸取代之不同組合之比較。
圖5B：多重特異性抗體之序列(SEQ ID NO)，其結果顯示於圖5A中。
圖6 圖6A：藉由CH1/CL界面中之不同帶電荷胺基酸取代來減少主要Bence-Jones型副產物。
具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )之本發明抗IL-17/TWEAK多重特異性抗體之實例。
野生型(wt)及帶電荷胺基酸取代之不同組合之比較。
圖6B：多重特異性抗體之序列(SEQ ID NO)，其結果顯示於圖6A中。
圖7 在一個抗體結合臂中具有VH/VL結構域置換且在一個CH1/CL結構域界面中具有特定突變之本發明二價多重特異性抗體之一些實例，其中多重特異性抗體全無Fc片段(Fab-CrossFabVH-VL形式及CrossFabVH-VL-Fab)：
至少CL結構域之位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且
至少CH1結構域之位置147之胺基酸或CH1結構域之位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
圖7A：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及另一抗體結合 臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變。
圖7B：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及同一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變。
圖7C：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及同一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變；及另一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之其他特定突變。
圖7D：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及另一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變。
圖8 在一個抗體結合臂中具有VH/VL結構域置換且在一個CH1/CL結構域界面中具有特定突變之本發明三價多重特異性抗體之一些實例，其中多重特異性抗體全無Fc片段(Fab-Fab-CrossFabVH-VL形式)：
至少CL結構域之位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且
至少CH1結構域之位置147之胺基酸或CH1結構域之位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
圖8A、B、C：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及另一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變。
圖8D：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及同一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變。
圖8E：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及同一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變；及另一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之其他特定突變。
圖9 在一個抗體結合臂中具有VH/VL結構域置換且在一個CH1/CL結構域界面中具有特定突變之本發明四價多重特異性抗體之 一些實例，其中多重特異性抗體全無Fc片段(Fab-Fab-CrossFabVH-VL形式)：至少CL結構域之位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且至少CH1結構域之位置147之胺基酸或CH1結構域之位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
圖9A：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及另一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變。
圖9B：一個抗體結合臂中之VH/VL結構域置換及同一抗體結合臂之CH1/CL結構域界面中之特定突變。
在一個結合臂中具有結構域置換/交換(CrossMabVH-VL)之多重特異性抗體詳細闡述於WO2009/080252及Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191(其係以引用方式併入本文中)中。其顯著減少因針對第一抗原之輕鏈與針對第二抗原之錯誤重鏈之失配而產生之副產物(與不使用該結構域交換之方法相比)。然而，其製備並非完全不含副產物。主要副產物係基於Bence-Jones型相互作用--亦參見Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191(附錄中之圖S1I)。
因此，現已發現藉由在CH1及CL結構域中之特定胺基酸位置引入相反電荷對帶電荷胺基酸之取代進一步減少該等副產物以改良該等多重特異性抗體之產率之方法。
因此，本發明係關於多重特異性抗體，其包含：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈， 且其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸(根據Kabat編號)經帶正電荷胺基酸取代，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸(根據Kabat EU索引編號)經帶負電荷胺基酸取代；或ii)b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸(根據Kabat編號)經帶正電荷胺基酸取代，且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸(根據Kabat EU索引編號)經帶負電荷胺基酸取代。
因此，本發明係關於多重特異性抗體，其包含：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，且其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或ii)b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中b)項之第 二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
本發明進一步係關於多重特異性抗體，其包含：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，且其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸(根據Kabat編號)經帶正電荷胺基酸取代，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸(根據Kabat EU索引編號)經帶負電荷胺基酸取代。
本發明進一步係關於多重特異性抗體，其包含：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，且其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
因此，對於特異性結合至第二抗原之該第二抗體，以下適用： 在輕鏈內
輕鏈可變結構域VL經該抗體之重鏈可變結構域VH置換；且在重鏈內
重鏈可變結構域VH經該抗體之輕鏈可變結構域VL置換；且第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之恆定結構域CL及CH1不經彼此置換(保持未交換)。
因此，對於特異性結合至第一抗原之該抗體，以下適用：在源自該第一抗體之該第一輕鏈內，輕鏈結構域之連續排列(CL-VL)保持不變；且在源自該第一抗體之該第一重鏈內，重鏈結構域之連續排列(例如CH1-CL或CH3-CH2-CH1-CL)保持不變(因此，特異性結合至第一抗體之該抗體不包括結構域交換尤其不包括VH/VL之交換)。
如本文所用「抗體之輕鏈」係在N-末端至C-末端方向上包含抗體輕鏈可變結構域(VL)及抗體輕鏈恆定結構域(CL)(縮寫為VL-CL)之多肽。
如本文所用「抗體之重鏈」係在N-末端至C-末端方向上包含抗體重鏈可變結構域(VH)及抗體重鏈恆定結構域1(CH1)之多肽。
在本發明之一個實施例中，多重特異性抗體之重鏈在N-末端至C-末端方向上包括抗體重鏈可變結構域(VH)及抗體重鏈恆定結構域1(CH1)且全無重鏈恆定結構域CH2及CH3，因此縮寫為VH-CH1。在一個實施例中，本發明多重特異性抗體包含至少兩個Fab片段，其中第一Fab片段包含至少一個對第一抗原具有特異性之抗原結合位點；且第二Fab片段包含至少一個對第二抗原具有特異性之抗原結合位點，其中在第二Fab片段第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中多重特異性抗體全無Fc結構域；且其中i)在第一Fab片段之輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸 獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中在第一Fab片段之重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或 ii)在第二Fab片段之輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中在第二Fab片段之重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，本發明多重特異性抗體包含至少兩個Fab片段，其中第一Fab片段包含至少一個對第一抗原具有特異性之抗原結合位點；且第二Fab片段包含至少一個對第二抗原具有特異性之抗原結合位點，其中在第二Fab片段中，第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中多重特異性抗體全無Fc結構域；且其中i)在第一Fab片段之輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中在第一Fab片段之重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
如本文所用之「Fab片段」係指抗體片段，其包含含有輕鏈之可變VL結構域及恆定結構域(CL)之輕鏈片段，及重鏈之可變VH結構域及第一恆定結構域(CH1)。此實施例之多重特異性抗體包含至少兩個 Fab片段，其中第二Fab片段之重鏈及輕鏈之可變區經交換。由於可變區之交換，該第二Fab片段亦稱為「交叉-Fab片段」或「xFab片段」或「交叉Fab片段」。在其中Fab重鏈及輕鏈之可變區經交換之該第二Fab片段中，交叉Fab分子包含由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成之經修飾重鏈，及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成之經修飾輕鏈。此交叉Fab分子亦稱為CrossFabVHVL。
術語「Fc結構域」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分之C-末端區域。舉例而言，在天然抗體中，Fc結構域由兩個相同蛋白質片段組成，該等片段源自IgG、IgA及IgD同型中抗體兩條重鏈之第二及第三恆定結構域；IgM及IgE Fc結構域在每條多肽鏈中含有3條重鏈恆定結構域(CH結構域2-4)。如本文所用「全無Fc結構域」意指，本發明雙重特異性抗體不包含CH2、CH3及CH4結構域；即，恆定重鏈僅由一或多個CH1結構域組成。
在一個實施例中，第一及第二Fab片段係經由肽連接體連接。如本文所用術語「肽連接體」表示具有胺基酸序列之肽，其較佳具有合成來源。在一個實施例中，肽連接體用於將一個Fab片段連接至另一Fab片段之C-或N-末端以形成本發明多重特異性抗體。在一個較佳實施例中，該肽連接體係胺基酸序列之長度為至少5個胺基酸、在一個實施例中長度為5至100、在另一實施例中為10至50個胺基酸之肽。在一個實施例中，該肽連接體係(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，且(x=3，n=3、4、5或6，且m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5且m=0、1、2或3)，在一個實施例中，x=4且n=2或3，在另一實施例中，x=4且n=2。在一個實施例中，該肽連接體係(G4S)2。肽連接體用於連接第一及第二Fab片段。在一個實施例中，第一Fab片段連接至第二Fab片段之C-或N-末端。
在本發明之另一較佳實施例中，抗體重鏈在N-末端至C-末端方 向上包含抗體重鏈可變結構域(VH)、抗體重鏈恆定結構域1(CH1)、抗體重鏈恆定結構域2(CH2)及抗體重鏈恆定結構域3(CH3)(縮寫為VH-CH1-CH2-CH3)。
在多重特異性抗體在每一重鏈中包含結構域VH-CH1-CH2-CH3之情形中，本發明之另一態樣係進一步改良期望多重特異性抗體相比於不期望副產物之比率，此可藉由修飾該多重特異性抗體之第一及第二CH3結構域以促進含有該等第一及第二CH3結構域之兩條重鏈之異二聚化來實現。
已存在若干種修飾CH3以增強異二聚化之方法，其詳細闡述於(例如)以下文獻中：WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291。通常在所有該等方法中，第一CH3結構域及第二CH3結構域二者以互補方式經改造，使得每一CH3結構域(或包含其之重鏈)無法再與自身同二聚化，而被迫使與互補改造之其他CH3結構域異二聚化(使得第一及第二CH3結構域異二聚化且在兩個第一CH3結構域之間或在兩個第二CH3結構域之間不形成同二聚體)。涵蓋該等用於改良重鏈異二聚化之不同方法作為不同置換方案，其與本發明多重特異性抗體中減少輕鏈配對錯誤及Bence-Jones型副產物之重鏈-輕鏈修飾(一個結合臂中之VH及VL交換/置換及在CH1/CL界面中引入相反電荷對帶電荷胺基酸之取代)組合。
在本發明之一個實施例中(在多重特異性抗體在重鏈中包含CH3結構域之情形中)，本發明之該多重特異性抗體之CH3結構域藉由以下方式經改變以支持異二聚化：- 取代第一重鏈之CH3結構域之至少一個胺基酸，及- 取代第二重鏈之CH3結構域之至少一個胺基酸，其中在多重特 異性抗體之三級結構內，該胺基酸面向第一重鏈之CH3結構域之至少一個胺基酸，其中第一及第二重鏈之CH3結構域內之各別胺基酸分別
- 經取代，使得將相反側鏈電荷之胺基酸引入相對重鏈中，或- 經取代，使得將具有大及小側鏈體積之胺基酸引入相對重鏈中，藉此在一個CH3結構域中由具有大側鏈體積之胺基酸產生凸起，其可定位於位於另一CH3結構域內之凹洞中，其中該凹洞係由具有小側鏈體積之胺基酸產生。
在本發明之一個較佳實施例中(在多重特異性抗體在重鏈中包含CH3結構域之情形中)，本發明之該多重特異性抗體之CH3結構域藉由「杵臼結構」技術經改變，該技術以若干實例詳細闡述於(例如)以下文獻中：WO 96/027011；Ridgway,J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617-621；及Merchant,A.M.等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；及WO 98/050431。在此方法中，兩個CH3結構域之相互作用表面經改變以促進含有該兩個CH3結構域之兩條重鏈之異二聚化。(兩條重鏈之)兩個CH3結構域中之每一者可為「隆凸」，而另一者係「空穴」。引入二硫橋進一步穩定異二聚體(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)並提高產率。
因此，在本發明之一個實施例中，該多重特異性抗體(在每一重鏈中包含CH3結構域且)之特徵進一步在於
a)項之抗體第一重鏈之第一CH3結構域及b)項之抗體第二重鏈之第二CH3結構域各自在界面處相會，該界面包含抗體CH3結構域之間之初始界面，其中該界面經改變以促進形成多重特異性抗體，其中該改變之特徵在於： i)一條重鏈之CH3結構域經改變， 使得在與多重特異性抗體內另一條重鏈之CH3結構域之初始界面相會之一條重鏈之CH3結構域之初始界面內， 胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在一條重鏈之CH3結構域之界面內生成凸起，該凸起可定位於另一條重鏈之CH3結構域之界面內之凹洞中， 且 ii)另一條重鏈之CH3結構域經改變， 使得在與多重特異性抗體內一條重鏈之CH3結構域之初始界面相會之另一條重鏈之CH3結構域之初始界面內， 胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在另一條重鏈之CH3結構域之界面內生成凹洞，一條重鏈之CH3結構域之界面內之凸起可定位於該凹洞內。
在本發明之一個實施例中，該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基選自由以下組成之群：精胺酸(R)、***酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。
在本發明之一個實施例中，該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基選自由以下組成之群：丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。
在本發明之一個態樣中，兩個CH3結構域藉由以下方式進一步改變：引入半胱胺酸(C)作為每一CH3結構域之相應位置中之胺基酸，使得可在兩個CH3結構域之間形成二硫橋。因此，根據本發明之此態樣，一條重鏈之CH3結構域進一步經改變，使得在與多重特異性抗體內另一重鏈之CH3結構域之初始界面相會之一條重鏈之CH3結構域之初始界面內，胺基酸殘基經半胱胺酸(C)殘基置換，且另一重鏈之CH3結構域進一步經改變，使得在與多重特異性抗體內一條重鏈之 CH3結構域之初始界面相會之另一重鏈之CH3結構域之初始界面內，胺基酸殘基經半胱胺酸(C)殘基置換，使得可在兩個CH3結構域之間經由所引入半胱胺酸殘基形成二硫橋。
在一個較佳實施例中，該多重特異性抗體包含「隆凸鏈」之一個CH3結構域中之胺基酸T366W突變以及「空穴鏈」之另一CH3結構域中之胺基酸T366S、L368A、Y407V突變。亦可使用CH3結構域之間之另一鏈間二硫橋(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681)，例如藉由將胺基酸Y349C突變引入「空穴鏈」之CH3結構域中；及將胺基酸E356C突變或胺基酸S354C突變引入「隆凸鏈」之CH3結構域中。
在一個較佳實施例中，該多重特異性抗體(其在每一重鏈中包含CH3結構域)包含一個CH3結構域中之胺基酸S354C及T366W突變以及兩個CH3結構域中另一者之胺基酸Y349C、T366S、L368A及Y407V突變(其中一個CH3結構域中之另一胺基酸S354C突變及另一CH3結構域中之另一胺基酸Y349C突變形成鏈間二硫橋)(根據Kabat EU索引編號)。
涵蓋用於修飾CH3以促進異二聚化之其他技術作為本發明之替代方案且闡述於(例如)以下文獻中：WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954及WO 2013/096291。
在一個實施例中，替代地使用闡述於EP 1 870 459A1中之異二聚化方法。此方法係基於在兩條重鏈之間之CH3/CH3結構域界面中之特定胺基酸位置引入相反電荷對帶電荷胺基酸之取代/突變。該等多重特異性抗體之一個較佳實施例係多重特異性抗體之一條重鏈之CH3結構域中之胺基酸R409D及K370E突變以及另一重鏈之CH3結構域中之 胺基酸D399K及E357K突變(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，該多重特異性抗體包含「隆凸鏈」之CH3結構域中之胺基酸T366W突變以及「空穴鏈」之CH3結構域中之胺基酸T366S、L368A及Y407V突變，且另外包含「隆凸鏈」之CH3結構域中之胺基酸R409D及K370E突變以及「空穴鏈」之CH3結構域中之胺基酸D399K及E357K突變。
在另一實施例中，該多重特異性抗體包含一條重鏈之CH3結構域中之胺基酸S354C及T366W突變以及另一重鏈之CH3結構域中之胺基酸Y349C、T366S、L368A及Y407V突變；或該多重特異性抗體包含一條重鏈之CH3結構域中之胺基酸Y349C及T366W突變以及另一重鏈之CH3結構域中之胺基酸S354C、T366S、L368A及Y407V突變，且另外包含「隆凸鏈」之CH3結構域中之胺基酸R409D及K370E突變以及「空穴鏈」之CH3結構域中之胺基酸D399K及E357K突變。
在一個實施例中，替代地使用闡述於WO2013/157953中之異二聚化方法。在一個實施例中，一條重鏈之CH3結構域包含胺基酸T366K突變且另一重鏈之CH3結構域包含胺基酸L351D突變。在另一實施例中，一條重鏈之CH3結構域進一步包含胺基酸L351K突變。在另一實施例中，另一重鏈之CH3結構域進一步包含選自以下之胺基酸突變：Y349E、Y349D及L368E(在一個實施例中，L368E)。
在一個實施例中，替代地使用闡述於WO2012/058768中之異二聚化方法。在一個實施例中，一條重鏈之CH3結構域包含胺基酸L351Y及Y407A突變且另一重鏈之CH3結構域包含胺基酸T366A及K409F突變。在另一實施例中，另一重鏈之CH3結構域在位置T411、D399、S400、F405、N390或K392進一步包含胺基酸突變。在一個實施例中，該胺基酸突變選自由以下組成之群：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E及T411W， b)D399R、D399W、D399Y及D399K，c)S400E、S400D、S400R及S400K，d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V及F405W，e)N390R、N390K及N390D，f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F及K392E。
在另一實施例中，一條重鏈之CH3結構域包含胺基酸L351Y及Y407A突變且另一重鏈之CH3結構域包含胺基酸T366V及K409F突變。在另一實施例中，一條重鏈之CH3結構域包含胺基酸Y407A突變且另一重鏈之CH3結構域包含胺基酸T366A及K409F突變。在另一實施例中，另一重鏈之CH3結構域進一步包含胺基酸K392E、T411E、D399R及S400R突變。
在一個實施例中，替代地使用闡述於WO2011/143545中之異二聚化方法。在一個實施例中，在重鏈之CH3結構域中在選自由368及409組成之群之位置引入根據WO2011/143545之胺基酸修飾。
在一個實施例中，替代地使用闡述於WO2011/090762中之異二聚化方法，其亦使用上述杵臼結構技術。在一個實施例中，一條重鏈之CH3結構域包含胺基酸T366W突變且另一重鏈之CH3結構域包含胺基酸Y407A突變。在一個實施例中，一條重鏈之CH3結構域包含胺基酸T366Y突變且另一重鏈之CH3結構域包含胺基酸Y407T突變。
在一個實施例中，多重特異性抗體係IgG2同型且替代地使用闡述於WO2010/129304中之異二聚化方法。
在一個實施例中，替代地使用闡述於WO2009/089004中之異二聚化方法。在一個實施例中，一條重鏈之CH3結構域包含帶負電荷胺基酸(在一個實施例中，麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)；在另一實施例中，K392D或N392D突變)之K392或N392之胺基酸取代，且另一重鏈之CH3結構域包含帶正電荷胺基酸(在一個實施例中，離胺酸(K)或精胺 酸(R)，在另一實施例中，D399K、E356K、D356K或E357K取代；且在另一實施例中，D399K或E356K突變)之D399、E356、D356或E357之胺基酸取代。在另一實施例中，一條重鏈之CH3結構域進一步包含帶負電荷胺基酸(在一個實施例中，麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)；在另一實施例中，K409D或R409D突變)之K409或R409之胺基酸取代。在另一實施例中，一條重鏈之CH3結構域進一步或替代地包含帶負電荷胺基酸(在一個實施例中，麩胺酸(E)或天冬胺酸(D))之K439及/或K370之胺基酸取代。
在一個實施例中，替代地使用闡述於WO2007/147901中之異二聚化方法。在一個實施例中，一條重鏈之CH3結構域包含胺基酸K253E、D282K及K322D突變且另一重鏈之CH3結構域包含胺基酸D239K、E240K及K292D突變。
在一個實施例中，替代地使用闡述於WO2007/110205中之異二聚化方法。
如本文所用術語「結合位點」或「抗原-結合位點」表示抗體分子中配體(例如抗原或其抗原片段)實際上結合之區域且其源自抗體。抗原-結合位點包括抗體重鏈可變結構域(VH)及/或抗體輕鏈可變結構域(VL)或VH/VL對。
特異性結合至期望抗原之抗原-結合位點可源自a)針對該抗原之已知抗體或b)藉由重新免疫方法尤其使用抗原蛋白質或核酸或其片段或藉由噬菌體展示獲得之新抗體或抗體片段。
本發明抗體之抗原結合位點含有6個互補決定區(CDR)，其有助於改變結合位點對抗原之親和力程度。存在3個重鏈可變結構域CDR(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及3個輕鏈可變結構域CDR(CDRL1、CDRL2及CDRL3)。CDR及框架區(FR)之範圍係藉由與胺基酸序列之經編譯資料庫比較來確定，其中該等區域已根據序列之間之變異性來 界定。本發明範圍內亦包括包括較少CDR(即，其中結合特異性係由3、4或5個CDR確定)之功能性抗原結合位點。舉例而言，少於完整集合(6個CDR)對於結合即已足夠。在一些情形中，VH或VL結構域將足夠。
抗體特異性係指抗體對抗原之特定表位之選擇性識別。例如，天然抗體具有單特異性。如本文所用術語「單特異性」抗體表示具有一或多個結合位點之抗體，每一結合位點結合至相同抗原之相同表位。
多重特異性抗體係例如雙重特異性、三重特異性或四重特異性抗體。雙重特異性抗體係具有兩種不同抗原結合特異性之抗體。因此，三重特異性抗體係具有三種不同抗原結合特異性之抗體。四重特異性抗體係具有四種不同抗原結合特異性之抗體。在本發明之一個較佳實施例中，多重特異性抗體係雙重特異性抗體。
若抗體具有一種以上特異性，則所識別表位可與單一抗原或與一種以上抗原相關。
如當前申請案內所用術語「價」表示在抗體分子中存在指定數目之結合位點。例如，天然抗體具有兩個結合位點且為二價。因此，術語「三價」表示在抗體分子中存在3個結合位點。
在本發明之一個較佳實施例中，本發明抗體包含一或多個免疫球蛋白種類之免疫球蛋白恆定區。免疫球蛋白種類包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE同型且在IgG及IgA情形中包括其亞型。在一個較佳實施例中，本發明抗體具有IgG型抗體之恆定結構域結構。
如本文所用術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指單一胺基酸組成之抗體分子之製劑。
術語「嵌合抗體」係指包含來自一種來源或物種之可變區(即，結合區)及源自不同來源或物種之恆定區之至少一部分之抗體，其通 常係藉由重組DNA技術來製備。包含鼠類可變區及人類恆定區之嵌合抗體較佳。本發明涵蓋之「嵌合抗體」之其他較佳形式係如下之彼等：其中恆定區相對於初始抗體之恆定區已經修飾或改變，以生成本發明之尤其關於C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合之性質。該等嵌合抗體亦稱為「種類轉換抗體」。嵌合抗體係免疫球蛋白基因之表現產物，該等免疫球蛋白基因包含編碼免疫球蛋白可變區之DNA區段及編碼免疫球蛋白恆定區之DNA區段。產生嵌合抗體之方法涉及業內所熟知之習用重組DNA及基因轉染技術。例如，參見Morrison,S.L.等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855；US 5,202,238及US 5,204,244。
術語「人類化抗體」係指其中框架或「互補決定區」(CDR)已經修飾以包含與親代免疫球蛋白相比特異性不同之免疫球蛋白CDR之抗體。在較佳實施例中，將鼠類CDR移植至人類抗體之框架區中以製備「人類化抗體」。例如，參見Riechmann,L.等人，Nature 332(1988)323-327；及Neuberger,M.S.等人，Nature 314(1985)268-270。本發明涵蓋之「人類化抗體」之其他形式係如下之彼等：其中恆定區已相對於初始抗體經額外修飾或改變以生成本發明之尤其關於C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合之性質。
如本文所用術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。人類抗體為當前技術中所熟知(van Dijk,M.A.及van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人類抗體亦可在轉基因動物(例如小鼠)中產生，該等轉基因動物能在免疫後在不產生內源免疫球蛋白之情況下產生全譜或選擇之人類抗體。人類種系免疫球蛋白基因陣列在該等種系突變體小鼠中之轉移將導致在抗原激發後產生人類抗體(例如，參見Jakobovits,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits,A. 等人，Nature 362(1993)255-258；Bruggemann,M.等人，Year Immunol.7(1993)33-40)。人類抗體亦可在噬菌體展示文庫中產生(Hoogenboom,H.R.及Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；及Boerner,P.等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。如已針對本發明之嵌合及人類化抗體所提及，如本文所用術語「人類抗體」亦包含該等如下抗體：其在恆定區中藉由(例如)「種類轉換」(即Fc部分之改變或突變，例如自IgG1至IgG4及/或IgG1/IgG4突變)經修飾以生成本發明之尤其關於C1q結合及/或FcR結合之性質。
如本文所用術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，例如自諸如NS0或CHO細胞等宿主細胞或自人類免疫球蛋白基因之轉基因動物(例如小鼠)分離之抗體，或使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體。該等重組人類抗體具有呈重排形式之可變區及恆定區。本發明之重組人類抗體已經歷活體內體細胞超突變。因此，儘管重組抗體中VH及VL區之胺基酸序列源自人類種系VH及VL序列且與其相關，但其可能並非天然存在於活體內人類種系抗體譜中。
如本文所用「可變結構域」(輕鏈可變結構域(VL)、重鏈可變結構域(VH))表示直接參與抗體與抗原結合之輕鏈及重鏈對中之每一者。人類輕鏈及重鏈可變結構域具有相同之一般結構，且每一結構域包含4個框架區(FR)，其序列高度保守且藉由三個「超變區」(或互補決定區CDR)連接。框架區採用β-摺疊構象且CDR可形成連接β-摺疊結構之環。每一鏈中之CDR藉由框架區來保持其三維結構，並與另一條鏈中之CDR一起形成抗原結合位點。抗體重鏈及輕鏈CDR3區在本 發明抗體之結合特異性/親和力中具有尤其重要之作用，且因此提供本發明之另一目標。
術語「超變區」或「抗體之抗原結合部分」在本文中使用時係指抗體中負責結合抗原之胺基酸殘基。超變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「框架」或「FR」區係彼等除了如本文所定義之超變區殘基以外之可變結構域區域。因此，抗體之輕鏈及重鏈自N-末端至C-末端包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。每一鏈上之CDR藉由該等框架胺基酸隔開。重鏈之CDR3尤其係對抗原結合貢獻最大之區域。CDR及FR區係根據Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))之標準定義來確定。
如本文所用術語「結合」、「其特異性結合」及「特異性結合」係指在使用純化野生型抗原之活體外分析中、較佳在電漿共振分析(BIAcore®,GE-Healthcare Uppsala,Sweden)中抗體與抗原表位之結合。結合親和力定義為術語ka(來自抗體/抗原複合物之抗體結合之速率常數)、kD(解離常數)及KD(kD/ka)。在一個實施例中，「結合」或「其特異性結合至」意指結合親和力(KD)為10-8mol/l或更小，在一個實施例中，10-8M至10-13mol/l。因此，本發明多重特異性抗體以10-8mol/l或更小之結合親和力(KD)，在一個實施例中以10-8至10-13mol/l之結合親和力(KD)特異性結合至對其具有特異性之每一抗原。在一個實施例中，多重特異性抗體特異性結合至其抗原以10-9至10-13mol/l之結合親和力(KD)。
抗體與FcγRIII之結合可藉由BIAcore®分析(GE-Healthcare Uppsala,Sweden)來研究。結合親和力定義為術語ka(來自抗體/抗原複合物之抗體結合的速率常數)、kD(解離常數)及KD(kD/ka)。
術語「表位」包括能特異性結合至抗體之任一多肽決定子。在某些實施例中，表位決定子包括分子之化學活性表面基團(例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。表位係抗原中由抗體結合之區域。
在某些實施例中，當抗體在蛋白質及/或大分子之複合混合物中優先識別其靶抗原時，稱該抗體特異性結合抗原。
在另一實施例中，本發明多重特異性抗體之特徵在於，該抗體為人類IgG1亞類，或為具有突變L234A及L235A(根據Kabat EU索引編號)之人類IgG1亞類。
在另一實施例中，本發明多重特異性抗體之特徵在於，該抗體為人類IgG2亞類。
在另一實施例中，本發明多重特異性抗體之特徵在於，該抗體為人類IgG3亞類。
在另一實施例中，本發明多重特異性抗體之特徵在於，該抗體為人類IgG4亞類，或為具有另一突變S228P(根據Kabat EU索引編號)之人類IgG4亞類。
在另一實施例中，本發明多重特異性抗體之特徵在於，其為人類IgG1或人類IgG4亞類。
在另一實施例中，本發明多重特異性抗體之特徵在於係具有突變L234A及L235A(根據Kabat EU索引編號)之人類IgG1亞類。
在另一實施例中，本發明多重特異性抗體之特徵在於係具有突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat EU索引編號)之人類IgG1亞類。
在另一實施例中，本發明多重特異性抗體之特徵在於係具有突變S228P及L235E(根據Kabat EU索引編號)之人類IgG4亞類。
在另一實施例中，本發明多重特異性抗體之特徵在於係具有突 變S228P、L235E及P329G(根據Kabat EU索引編號)之人類IgG4亞類。
現已發現，本發明多重特異性抗體具有改良特徵，例如生物或藥理學活性、藥物動力學性質或毒性。其可用於(例如)治療諸如癌症等疾病。
如當前申請案內所用術語「恆定區」表示抗體中除可變區以外之結構域之總和。恆定區不直接參與與抗原之結合，但展現多種效應物功能。端視抗體重鏈恆定區之胺基酸序列而定，將抗體分為以下種類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可將其中若干種類進一步分為多個亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同抗體種類之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。可在所有五個抗體種類中發現之輕鏈恆定區(CL)稱為κ(卡帕)及λ(拉目達)。如本文所用「恆定結構域」來自人類來源，其來自亞類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之人類抗體之重鏈恆定區及/或輕鏈κ或λ恆定區。該等恆定結構域及區域為當前技術中所熟知且闡述於(例如)以下文獻中：Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。
如本文所用重鏈及輕鏈之所有恆定區及結構域之胺基酸位置係根據闡述於Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))中之Kabat編號系統來編號且在本文中稱作「根據Kabat編號」。特定而言，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)之Kabat編號系統(參見第647-660頁)用於κ及λ同型之輕鏈恆定結構域CL，且Kabat EU索引編號系統(參見第661-723頁)用於重鏈恆定結構域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3，在此情形中，其在本文中藉由稱作「根據Kabat EU索引編號」來進一步 闡明)。
IgG4亞類之抗體顯示降低之Fc受體(FcγRIIIa)結合性，而其他IgG亞類之抗體顯示強結合性。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(喪失Fc碳水化合物)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及His435(根據Kabat EU索引編號)等殘基若改變時則亦提供降低之Fc受體結合性(Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等人，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434)。
在一個實施例中，本發明抗體具有與IgG1抗體相比降低之FcR結合。因此，親代抗體係關於IgG4亞類或IgG1或IgG2亞類之FcR結合，該等亞類具有S228、L234、L235及/或D265之突變及/或含有PVA236突變(根據Kabat EU索引編號)。在一個實施例中，親代抗體中之突變係S228P、L234A、L235A、L235E及/或PVA236(根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，親代抗體中之突變在IgG4S228P且在IgG1L234A及L235A(根據Kabat EU索引編號)。
抗體恆定區直接參與ADCC(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)及CDC(補體依賴性細胞毒性)。補體活化(CDC)係藉由補體因子C1q與大多數IgG抗體亞類之恆定區結合來起始。C1q與抗體之結合係由在所謂結合位點之確定蛋白質-蛋白質相互作用來引發。該等恆定區結合位點為當前技術中已知且闡述於(例如)以下文獻中：Lukas,T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Bunkhouse,R.及Cobra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人，Nature 288(1980)338-344；Thomason,J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idiocies,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hearer,M.等人，JVirol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人， Immunology 86(1995)319-324；及EP 0 307 434。該等恆定區結合位點之特徵為(例如)胺基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329(根據Kabat EU索引編號)。
術語「抗體依賴性細胞毒性(ADCC)」係指本發明抗體在效應細胞存在下裂解人類靶細胞。ADCC較佳係藉由在效應細胞存在下用本發明抗體處理表現抗原之細胞製劑來量測，該等效應細胞例如來自血沉棕黃層之剛分離之PBMC或純化效應細胞，如單核球或天然殺傷(NK)細胞或永久生長之NK細胞系。
術語「補體依賴性細胞毒性(CDC)」表示藉由補體因子C1q與大多數IgG抗體亞類之Fc部分結合起始之過程。C1q與抗體之結合係藉由在所謂結合位點之確定蛋白質-蛋白質相互作用來引發。該等Fc部分結合位點為當前技術中已知(參見上文)。該等Fc部分結合位點之特徵為(例如)胺基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329(根據Kabat EU索引編號)。亞類IgG1、IgG2及IgG3抗體通常顯示包括C1q及C3結合之補體活化，而IgG4不活化補體系統且不結合C1q及/或C3。
單株抗體之細胞介導效應物功能可藉由改造其寡糖組份來增強，如Umana,P.等人，Nature Biotechnol.17(1999)176-180及US 6,602,684中所述。IgG1型抗體係最常用治療抗體，其係在每一CH2結構域中之Asn297具有保守N-連接糖基化位點之糖蛋白。附接至Asn297之兩個複雜二支鏈寡糖包埋於CH2結構域之間，與多肽骨架形成廣泛接觸，且其存在為抗體介導諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)等效應物功能所必需(Lifely,M.,R.等人，Glycobiology 5(1995)813-822；Jefferis,R.等人，Immunol.Rev.163(1998)59-76；Wright,A.及Morrison,S.L.,Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。Umana,P.等人，Nature Biotechnol.17(1999)176-180及WO 99/54342顯示，β(1,4)-N- 乙醯葡糖胺基轉移酶III(「GnTIII」)(催化形成二等分型寡糖之糖基轉移酶)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之過表現顯著提高抗體之活體外ADCC活性。Asn297碳水化合物之組成之改變或其消除亦影響與FcγR及C1q之結合(Umana,P.等人，Nature Biotechnol.17(1999)176-180；Davies,J.等人，Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294；Mimura,Y.等人，J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547；Radaev,S.等人，J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483；Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740；Simmons,L.C.等人，J.Immunol.Methods 263(2002)133-147)。
增強單株抗體之細胞介導之效應物功能之方法報導於(例如)以下文獻中：WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835、WO 2000/061739。
在本發明之一個較佳實施例中，多重特異性抗體在Asn297經糖鏈糖基化(若其包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類、較佳IgG1或IgG3亞類之Fc部分)，其中該糖鏈內岩藻糖之量為65%或更低(根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，該糖鏈內岩藻糖之量介於5%與65%之間，較佳介於20%與40%之間。本發明之「Asn297」意指位於Fc區中約位置297之胺基酸天冬醯胺。基於抗體之微小序列變異，Asn297亦可位於位置297上游或下游數個胺基酸(通常不超過±3個胺基酸)處，即介於位置294與300之間。在一個實施例中，本發明之糖基化抗體之IgG亞類係人類IgG1亞類，具有突變L234A及L235A之人類IgG1亞類，或IgG3亞類。在另一實施例中，在糖鏈內，N-羥乙醯基神經胺酸(NGNA)之量為1%或更低，及/或N-末端α-1,3-半乳糖之量為1%或 更低。糖鏈較佳展現附接至在CHO細胞中重組表現之抗體中Asn297之N-連接聚糖之特徵。
術語「糖鏈顯示附接至在CHO細胞中重組表現之抗體中Asn297之N-連接聚糖之特徵」表示，在本發明親代抗體中Asn297之糖鏈具有與在未經修飾之CHO細胞中表現之相同抗體(例如與彼等報導於WO 2006/103100中者)相同之結構及糖殘基序列(岩藻糖殘基除外)。
如本申請案內所用術語「NGNA」表示糖殘基N-羥乙醯基神經胺酸。
在Asn297處發生人類IgG1或IgG3之糖基化作為核心岩藻糖基化二支鏈複雜寡糖糖基化，其末端為最多2個Gal殘基。IgG1或IgG3亞類之人類重鏈恆定區詳細報導於以下文獻中：Kabat,E.,A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)及Brüggemann,M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；Love,T.,W.等人，Methods Enzymol.178(1989)515-527。該等結構端視末端Gal殘基之量命名為G0、G1(α-1,6-或α-1,3-)或G2聚糖殘基(Raju,T.,S.,Bioprocess Int.1(2003)44-53)。抗體Fc部分之CHO型糖基化闡述於(例如)Routier,F.H.,Glycoconjugate J.14(1997)201-207中。在未經糖基修飾之CHO宿主細胞中重組表現之抗體通常在Asn297處以至少85%之量經岩藻糖基化。抗體之經修飾寡糖可為雜合或複雜寡糖。較佳地，二等分型還原/非岩藻糖基化寡糖係雜合寡糖。在另一實施例中，二等分型還原/非岩藻糖基化寡糖係複雜寡糖。
根據本發明，「岩藻糖之量」意指在Asn297處糖鏈內之該糖相對於藉由MALDI-TOF質譜所量測附接至Asn297之所有糖基結構(例如複雜、雜合及高甘露糖結構)之和之量且計算為平均值。岩藻糖之相對量係含岩藻糖結構相對於藉由MALDI-TOF在在N-糖苷酶F處理樣品中 鑑別之所有糖基結構(分別例如複雜、雜合以及寡甘露糖及高甘露糖結構)之百分比。
本發明抗體可結合至多種抗原。在本發明之一個實施例中，第一抗原及第二抗原皆不為活化T細胞抗原。在本發明之一個實施例中，第一抗原及第二抗原皆不為CD3。在一個實施例中，抗體不特異性結合至活化T細胞抗原。在一個實施例中，抗體不特異性結合至CD3。
在本發明之一個實施例中，第一或第二抗原係人類TWEAK。在本發明之一個實施例中，第一或第二抗原係人類IL17。在本發明之一個實施例中，第一抗原係人類TWEAK且第二抗原係人類IL17。在本發明之一個實施例中，第一抗原係人類IL17且第二抗原係人類TWEAK。
人類TWEAK(UniProtKB O43508，細胞凋亡之TNF相關弱誘導物)係細胞表面相關II型跨膜蛋白。TWEAK闡述於以下文獻中：Chicheportiche,Y.等人，J.Biol.Chem.272(1997)32401-32410；Marsters,S.A.等人，Curr.Biol.8(1998)525-528；Lynch,C.N.等人，J.Biol.Chem.274(1999)8455-8459。TWEAK之活性形式係可溶同三聚物。人類及小鼠TWEAK在受體結合結構域中顯示93%序列一致性。TWEAK受體Fn14(纖維母細胞生長因子可誘導之14kDa蛋白質)係配體結合結構域中之129個aa之I型跨膜蛋白，其由一個單一富半胱胺酸結構域組成。TWEAK之信號傳導經由NF-KB路徑活化發生。TWEAK mRNA在多種組織中表現且發現於大多數重要器官(如心臟、腦、骨骼肌及胰臟)、免疫系統相關組織(如脾、淋巴結及胸腺)中。已在心臟、腦、肺、胎盤、血管EC及平滑肌細胞中檢測到Fn14mRNA。TWEAK-缺失及Fn14-缺失敲除小鼠有活力，健康且可孕，且具有更多天然殺傷細胞並展示增強之先天免疫反應。TWEAK參與細 胞凋亡、增殖、血管生成、缺血性半影、大腦水腫、多發性硬化。
人類IL-17(亦名為IL17-A；CTLA-8，Swiss Prot Q16552,IL17)係由輔助T細胞亞組(稱為Th17)產生之促發炎細胞介素，其參與MS之發病。IL-17A在誘導其他發炎細胞介素、趨化介素及黏著分子中發揮作用。用中和IL-17A之抗體治療動物降低自體免疫腦脊髓炎之疾病發病率及嚴重程度(Komiyama,Y.等人，J.Immunol.177(2006)566-573)。IL-17A在MS患者之腦脊髓液中過表現(Hellings,P.W.等人，Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.28(2003)42-50；Matusevicius,D.等人，Multiple Sclerosis 5(1999)101-104；WO 2005/051422)。另外，中和IL-17A之抗體降低膠原誘導關節炎之小鼠RA模型之嚴重程度及發病率，且可在RA患者之發炎關節之滑液中檢測到大量IL-17A(Ziolkowska,M.等人，J.Immunol.164(2000)2832-2838；Kotake,S.等人，J.Clin.Invest.103(1999)1345-1352；Hellings,P.W.等人，Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.28(2003)42-50)。
本發明抗體係藉由重組方式來產生。因此，本發明之一態樣係編碼本發明抗體之核酸且另一態樣係包含編碼本發明抗體之該核酸之細胞。重組產生方法在當前技術中眾所周知且包含在原核及真核細胞中表現蛋白質以及隨後分離抗體且通常將其純化至醫藥上可接受之純度。對於如上文所提及之抗體在宿主細胞中之表現，藉由標準方法將編碼各別經修飾輕鏈及重鏈之核酸***表現載體中。在適宜原核或真核宿主細胞(如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌(E.coli)細胞)中進行表現，且自該等細胞(裂解後上清液或細胞)回收抗體。重組產生抗體之一般方法為當前技術領域所熟知且闡述於(例如)以下綜述文章中：Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16 (2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。
宿主細胞產生之抗體可經歷重鏈C-末端之一或多個、尤其一或兩個胺基酸之翻譯後裂解。因此，宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子產生之抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈之經裂解變體(本文中亦稱作經裂解變體重鏈)。此可係重鏈之最後兩個C-末端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，根據Kabat EU索引編號)之情形。
因此，若無其他指示，則在本文中表示之包括CH3結構域之重鏈胺基酸序列無C-末端甘胺酸-離胺酸二肽。
在一個實施例中，如本文所指定之包含包括CH3結構域之重鏈之抗體包含另一C-末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat之EU索引編號)。在一個實施例中，如本文所指定之包含包括CH3結構域之重鏈之抗體包含另一C-末端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat之EU索引編號)。
本發明組合物(例如本文所述之醫藥組合物)包含本發明之抗體群。抗體群可包含具有全長重鏈之抗體及具有經裂解變體重鏈之抗體。抗體群可由具有全長重鏈之抗體與具有經裂解變體重鏈之抗體之混合物組成，其中至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之抗體具有經裂解變體重鏈。
在一個實施例中，包含本發明抗體群之組合物包含如本文所指定之包含包括CH3結構域之重鏈之抗體，其具有另一C-末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat之EU索引編號)。在一個實施例中，包含本發明抗體群之組合物包含如本文所指定之包含包括CH3結構域之重鏈之抗體，其具有另一C-末端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat之EU索引編號)。
在一個實施例中，此一組合物包含抗體群，該抗體群包括如本 文所指定之包含包括CH3結構域之重鏈之抗體；如本文所指定之包含包括CH3結構域之重鏈之抗體，其具有另一C-末端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat之EU索引編號)；及如本文所指定之包含包括CH3結構域之重鏈之抗體，其具有另一C-末端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat之EU索引編號)。
本發明多重特異性抗體係藉由習用免疫球蛋白純化程序以適宜方式自培養基分離，該等免疫球蛋白純化程序係(例如)蛋白質A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。編碼單株抗體之DNA及RNA可使用習用程序容易地分離並測序。雜交瘤細胞可用作該DNA及RNA之來源。分離後，可立即將DNA***表現載體中，然後將其轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞(例如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞)中，以在宿主細胞中獲得重組單株抗體之合成。
多重特異性抗體之胺基酸序列變體(或突變體)係藉由將適當核苷酸變化引入抗體DNA中或藉由核苷酸合成來製備。然而，該等修飾僅可在如(例如)上文所述之極有限範圍內實施。舉例而言，該等修飾不改變上文所提及之抗體特徵，例如IgG同型及抗原結合，但可改良重組產生之產率、蛋白質穩定性或有利於純化。在某些實施例中，提供具有一或多個保守胺基酸取代之抗體變體。
可根據常見側鏈性質將胺基酸分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
如本申請案中所用術語「宿主細胞」表示任何種類之細胞系統，其可經改造以生成本發明抗體。在一個實施例中，使用HEK293細胞及CHO細胞作為宿主細胞。如本文所用表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用，且所有該等名稱皆包括子代。因此，詞語「轉化體」及「轉化細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養物 而不考慮轉移次數。亦應理解，所有子代之DNA含量可能由於有意或無意突變而不精確相同。本發明包括在初始轉化細胞中篩選之具有相同功能或生物活性之變體子代。倘若意欲使用不同名稱，則其可自上下文明了。
在NS0細胞中之表現闡述於(例如)以下文獻中：Barnes,L.M.等人，Cytotechnology 32(2000)109-123；及Barnes,L.M.等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270。瞬時表現闡述於(例如)Durocher,Y.等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9中。可變結構域之選殖闡述於以下文獻中：Orlandi,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；及Norderhaug,L.等人，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87。較佳瞬時表現系統(HEK 293)闡述於以下文獻中：Schlaeger,E.-J.及Christensen,K.，Cytotechnology 30(1999)71-83及Schlaeger,E.-J.,J.Immunol.Methods 194(1996)191-199。
舉例而言，適用於原核生物之控制序列包括啟動子、視情況操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞可利用啟動子、增強子及多聚腺苷酸化信號。
在使核酸與另一核酸序列具有功能性關係時，該核酸經「可操作地連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該DNA可操作地連接至該多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子可操作地連接至該序列；或若核糖體結合位點經定位以促進翻譯，則該核糖體結合位點可操作地連接至編碼序列。通常，「可操作地連接」意指，所連接之DNA序列係鄰接序列，且在分泌前導序列之情形下係鄰接序列且位於讀碼框內。然而，增強子無需鄰接。連接係藉由在便捷限制位點處接合來完成。若不存在該等位點，則根據習用慣例使用合成寡核 苷酸銜接子或連接體。
藉由標準技術實施抗體之純化以消除細胞組份或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)，該等標準技術包括鹼/SDS處理、CsCl分帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及業內熟知之其他技術。參見Ausubel,F.等人編輯，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。不同方法已為業內所公認且廣泛用於蛋白質純化，例如利用微生物蛋白質之親和層析(例如蛋白質A或蛋白質G親和層析)、離子交換層析(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(胺基乙基樹脂)及混合模式交換)、嗜硫菌吸附(例如使用β-巰基乙醇及其他SH配體)、疏水性相互作用或芳香族吸附層析(例如使用苯基-sepharose、氮雜-親芳烴(arenophilic)樹脂或間-胺基苯基酸)、金屬螯合親和層析(例如使用Ni(II)-及Cu(II)-親和力物質)、粒徑篩析層析及電泳方法(例如凝膠電泳、毛細管電泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
本發明之一個態樣係包含本發明抗體之醫藥組合物。本發明之另一態樣係本發明抗體用於製造醫藥組合物之用途。本發明之另一態樣係製造包含本發明抗體之醫藥組合物之方法。在另一態樣中，本發明提供組合物(例如醫藥組合物)，其含有與醫藥載劑一起調配之本發明抗體。
本發明之一個實施例係用於治療癌症之本發明多重特異性抗體。
本發明之另一態樣係該醫藥組合物，其用於治療癌症。
本發明之另一態樣係本發明抗體用於製造用於治療癌症之藥劑之用途。
本發明之另一態樣係藉由將本發明抗體投與需要治療之患者來治療患有癌症之患者之方法。
本發明之一個實施例係本發明多重特異性抗體，其用於治療發炎性疾病、自體免疫疾病、類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、肌肉疾病(例如，肌肉營養不良症)、多發性硬化、慢性腎病、骨病(例如，多發性骨髓瘤中之骨退變)、全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎及血管損傷。
本發明之另一態樣係該醫藥組合物，其用於治療發炎性疾病、自體免疫疾病、類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、肌肉疾病(例如，肌肉營養不良症)、多發性硬化、慢性腎病、骨病(例如，多發性骨髓瘤中之骨退變)、全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎及血管損傷。
本發明之另一態樣係本發明抗體用於製造用於治療以下疾病之藥劑之用途：發炎性疾病、自體免疫疾病、類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、肌肉疾病(例如，肌肉營養不良症)、多發性硬化、慢性腎病、骨病(例如，多發性骨髓瘤中之骨退變)、全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎及血管損傷。
本發明之另一態樣係藉由將本發明抗體投與需要治療之患者來治療患有以下疾病之患者之方法：發炎性疾病、自體免疫疾病、類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、肌肉疾病(例如，肌肉營養不良症)、多發性硬化、慢性腎病、骨病(例如，多發性骨髓瘤中之骨退變)、全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎及血管損傷。
如本文所用「醫藥載劑」包括任何及所有生理上相容之溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑及諸如此類。較佳地，載劑適於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊柱或表皮投與(例如，藉由注射或輸注)。
本發明之組合物可藉由多種業內已知之方法來投與。如熟習此項技術者將瞭解，投與途徑及/或模式將端視期望結果而變。為藉由某些投與途徑來投與本發明化合物，可能需要用材料包覆該化合物或 將該化合物與該材料共投與以防止該化合物失活。舉例而言，可將化合物在適宜載劑(例如脂質體)或稀釋劑中投與個體。醫藥上可接受之稀釋劑包括生理鹽水及水性緩衝溶液。醫藥載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。用於醫藥活性物質之該等介質及藥劑之使用為業內已知。
如本文所用片語「非經腸投與」及「以非經腸方式投與」意指除經腸及局部投與以外之投與方式，通常係藉由注射且包括(不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、莢膜內、眶內、心內、真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、角質層下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
如本文所用術語「癌症」係指增殖性疾病，例如淋巴瘤、淋巴細胞性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、表皮或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、***癌、***癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、***癌、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽管癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性神經膠母細胞瘤、星細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦脊髓膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤恩氏肉瘤(Ewings sarcoma)，包括上述癌症中任一者之難治性形式或上述癌症中一或多者之組合。
該等組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。可藉由滅菌程序(見上文)及藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如，對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸如此類)二者來確 保防止微生物存在。亦可期望在組合物中包括等滲劑，例如糖、氯化鈉及諸如此類。另外，可藉由包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現可注射醫藥形式之延長吸收。
無論選擇何種投與途徑，可以適宜水合形式使用之本發明化合物及/或本發明醫藥組合物係藉由彼等熟習此項技術者已知之習用方法調配成醫藥上可接受之劑型。
本發明醫藥組合物中之活性成份之實際劑量可變，以獲得在對患者無毒之情況下對於具體患者、組合物及投與模式有效達成期望治療反應之活性成份之量。所選劑量將取決於多種藥物動力學因素，包括本發明所用具體組合物之活性、投與途徑、投與時間、所用具體化合物之***速率、治療持續時間、與所用具體組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、一般健康狀況及先前病史以及醫學領域熟知的類似因素。
組合物必須無菌且流動性程度使得可藉由注射器遞送該組合物。除水以外，載劑較佳係等滲緩衝鹽水溶液。
可藉由(例如)以下方式來維持適當流動性：使用諸如卵磷酯等包衣，在分散液情形中維持所需粒徑，及使用表面活性劑。在多種情形中，較佳在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)及氯化鈉。
如本文所用術語「轉化」係指將載體/核酸轉移至宿主細胞中之過程。若使用無堅固細胞壁阻擋之細胞作為宿主細胞，則藉由(例如)磷酸鈣沈澱法來實施轉染，如Graham及Van der Eh,Virology 52(1978)546ff中所述。然而，亦可使用(例如)藉由核注射或藉由原生質體融合將DNA引入細胞中之其他方法。若使用原核細胞或含有實質細胞壁構築之細胞，則例如一種轉染方法係使用氯化鈣進行鈣處理，如Cohen,F.N等人，PNAS 69(1972)7110(參照下文)中所述。
如本文所用「表現」係指將核酸轉錄為mRNA之過程及/或隨後將經轉錄mRNA(亦稱為轉錄物)翻譯為肽、多肽或蛋白質之過程。轉錄物及所編碼多肽統稱為基因產物。若多核苷酸源自基因體DNA，則真核細胞中之表現可包括mRNA之剪接。
「載體」係核酸分子，尤其自我複製核酸分子，其將***核酸分子轉移至宿主細胞中及/或在宿主細胞之間轉移該***核酸分子。 該術語包括主要用於將DNA或RNA***細胞中(例如，染色體整合)之載體，主要用於複製DNA或RNA之複製載體，及用於轉錄及/或翻譯DNA或RNA之表現載體。亦包括提供一種以上如上所述之功能之載體。
「表現載體」係在引入適當宿主細胞中時可轉錄並翻譯為多肽之多核苷酸。「表現系統」通常係指包括可用於產生期望表現產物之表現載體之適宜宿主細胞。
在本發明之以下特定實施例中列示：1.多重特異性抗體，其包含：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，且其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或 ii)b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
2.根據實施例1之多重特異性抗體，其中a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
3.根據實施例1之多重特異性抗體，其中a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
4.根據實施例3之多重特異性抗體，其中a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)；且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
5.根據實施例1之多重特異性抗體， 其中a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
6.根據實施例1之多重特異性抗體， 其中b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)；且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
7.根據實施例1之多重特異性抗體， 其中b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)(根據Kabat編號)，且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
8.根據實施例7之多重特異性抗體， 其中b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
9.根據實施例1之多重特異性抗體， 其中b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
10.根據實施例4之多重特異性抗體，其中a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
11.根據實施例8之多重特異性抗體，其中b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
12.根據前述實施例中任一實施例之多重特異性抗體，其中a)項之第一輕鏈及b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL係κ同型。
13.根據實施例1至11中任一實施例之多重特異性抗體，其中a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL係λ同型且b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL係κ同型。
14.根據實施例1至11中任一實施例之多重特異性抗體，其中a)項之第一輕鏈及b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL係λ同型。
15.根據前述實施例中任一實施例之多重特異性抗體，其中a) 項之第一輕鏈或b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，其中位置124之胺基酸不獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代且其係κ同型，位置124之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(在一個較佳實施例中，經麩胺酸(E)取代(根據Kabat編號))。
16.根據前述實施例中任一實施例之抗體，其特徵在於
a)項之抗體之第一重鏈之第一CH3結構域及b)項之抗體之第二重鏈之第二CH3結構域各自在界面處相會，該界面包含抗體CH3結構域之間之初始界面，其中該界面經改變以促進形成多重特異性抗體，其中該改變之特徵在於：i)一條重鏈之CH3結構域經改變，使得在與多重特異性抗體內另一條重鏈之CH3結構域之初始界面相會之一條重鏈之CH3結構域之初始界面內，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在一條重鏈之CH3結構域之界面內生成凸起，該凸起可定位於另一條重鏈之CH3結構域之界面內之凹洞中，且ii)另一條重鏈之CH3結構域經改變，使得在與多重特異性抗體內一條重鏈之CH3結構域之初始界面相會之另一條重鏈之CH3結構域之初始界面內，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在另一條重鏈之CH3結構域之界面內生成凹洞，一條重鏈之CH3結構域之界面內之凸起可定位於該凹洞中。
17.根據實施例16之抗體，其特徵在於
該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基選自由以下組成之群：精胺酸(R)、***酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)，且該具有較小側鏈體 積之胺基酸殘基選自由以下組成之群：丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。
18.根據實施例16或17之抗體，其特徵在於
兩個CH3結構域皆藉由以下方式進一步改變：引入半胱胺酸(C)作為每一CH3結構域之相應位置中之胺基酸，使得可在兩個CH3結構域之間形成二硫橋。
19.根據前述實施例中任一實施例之多重特異性抗體，其中該抗體具有雙重特異性。
20.根據前述實施例中任一實施例之多重特異性抗體，其特異性結合至人類TWEAK且特異性結合至人類IL17，其中
A)該多重特異性抗體包含
SEQ ID NO：24之重鏈可變結構域(VH)及SEQ ID NO：25之輕鏈可變結構域(VL)；且
B)該多重特異性抗體包含
SEQ ID NO：26之重鏈可變結構域(VH)及SEQ ID NO：27之輕鏈可變結構域(VL)。
21.一種雙重特異性抗體，其包含
a)特異性結合至人類TWEAK之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈，該第一抗體包含SEQ ID NO：24之重鏈可變結構域(VH)及SEQ ID NO：25之輕鏈可變結構域(VL)；及b)特異性結合至人類IL-17之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，該第二抗體包含SEQ ID NO：26之重鏈可變結構域(VH)及SEQ ID NO：27之輕鏈可變結構域(VL)；其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換，且其中i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地 經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
22.根據實施例21之雙重特異性抗體，其中 a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)；且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
23.根據實施例20至22中任一實施例之抗體，其用於治療癌症，或發炎性疾病、自體免疫疾病、類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、肌肉疾病(例如，肌肉營養不良症)、多發性硬化、慢性腎病、骨病(例如，多發性骨髓瘤中之骨退變)、全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎及血管損傷。
24.一種根據實施例20至22中任一實施例之抗體之用途，其用於製造用於治療以下疾病之藥劑：癌症，或發炎性疾病、自體免疫疾病、類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、肌肉疾病(例如，肌肉營養不良症)、多發性硬化、慢性腎病、骨病(例如，多發性骨髓瘤中之骨退變)、全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎及血管損傷。
25.根據實施例1至22中任一實施例之多重特異性抗體，其特徵在於其為人類IgG1或人類IgG4亞類。
26.根據實施例1至22及25中任一實施例之多重特異性抗體，其特徵在於係人類IgG1亞類且具有突變L234A及L235A(根據Kabat EU索引編號)。
27.根據實施例1至22及25至26中任一實施例之多重特異性抗體，其特徵在於係人類IgG1亞類且具有突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat EU索引編號)。
28.根據前述實施例1至22及25中任一實施例之多重特異性抗體，其特徵在於係人類IgG4亞類且具有突變S228P及L235E(根據Kabat EU索引編號)。
29.根據實施例1至22、25及28中任一實施例之多重特異性抗體，其特徵在於係人類IgG4亞類且具有突變S228P、L235E及P329G(根據Kabat EU索引編號)。
30.一種製備根據實施例1至22及25至29中任一實施例之多重特異性抗體之方法，其包含以下步驟：A)用包含編碼以下之核酸分子之載體轉化宿主細胞：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，且其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或ii)b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較 佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；B)在容許合成該抗體分子之條件下培養該宿主細胞，及C)自該培養物回收該抗體分子。
31.一種核酸，其編碼根據實施例1至22及25至29中任一實施例之多重特異性抗體之胺基酸序列。
32.一種含有根據實施例31之核酸之表現載體，其能在宿主細胞中表現該核酸。
33.一種宿主細胞，其包含根據實施例32之載體。
34.一種組合物，其包含根據實施例1至22及25至29中任一實施例之抗體。
35.一種醫藥組合物，其包含根據實施例1至22及25至29中任一實施例之抗體及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
36.一種治療需要療法之患者之方法，其特徵為向該患者投與治療有效量之根據實施例1至22及25至29中任一實施例之抗體。
37.一種減少多重特異性抗體之副產物之方法，其包含以下步驟：A)用包含編碼以下之核酸分子之載體轉化宿主細胞：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，且其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中包括以下取代用於減少該多重特異性抗體之該等副產物：i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地 經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或ii)b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；B)在容許合成該抗體分子之條件下培養該宿主細胞，及C)自該培養物回收該抗體分子。
38.一種減少多重特異性抗體之副產物之方法，其包含以下步驟：A)用包含編碼以下之核酸分子之載體轉化宿主細胞：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，且其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中包括以下取代，i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)取代)，且其中a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或ii)b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地 經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)取代)，且其中b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，B)在容許合成該抗體分子之條件下培養該宿主細胞，及C)自該培養物回收具有減小副產物譜之該抗體分子。
39.一種以下取代之用途，其用於減少多重特異性抗體之副產物之形成(或用於減小副產物譜)：i)a)項之第一輕鏈之恆定結構域CL中，獨立地藉由離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代位置124之胺基酸(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地藉由離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且a)項之第一重鏈之恆定結構域CH1中，獨立地藉由麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代位置147之胺基酸或位置213之胺基酸(根據Kabat EU索引編號)；或ii)b)項之第二輕鏈之恆定結構域CL中，獨立地藉由離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代位置124之胺基酸(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地藉由離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且b)項之第二重鏈之恆定結構域CH1中，獨立地藉由麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代位置147之胺基酸或位置213之胺基酸(根據Kabat EU索引編號)；其中該多重特異性抗體包含
a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，且其中第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換。
40.根據實施例1至15及19至22中任一實施例之多重特異性抗體，其中該抗體包含至少兩個Fab片段，其中第一Fab片段包含至少一 個對第一抗原具有特異性之抗原結合位點；且第二Fab片段包含至少一個對第二抗原具有特異性之抗原結合位點，其中在該第二Fab片段中，第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中該多重特異性抗體全無Fc結構域。
41.根據實施例40之多重特異性抗體，其中該抗體包含2至4個Fab片段。
42.根據實施例40或41之多重特異性抗體，其中該抗體特異性結合至人類Ang-2及VEGF。
提供以下實例、序列表及圖式以幫助理解本發明，本發明之實際範疇陳述於隨附申請專利範圍中。應理解，可在不背離本發明精神之情況下修改所述程序。
胺基酸序列之說明
SEQ ID NO：1 輕鏈(LC)<Ang-2>野生型(wt)
SEQ ID NO：2 重鏈(HC)<Ang-2>野生型(wt)
SEQ ID NO：3 重鏈(HC)<VEGF>，具有VH-VL交換野生型(wt)
SEQ ID NO：4 輕鏈(LC)<VEGF>，具有VH-VL交換野生型(wt)
SEQ ID NO：5 輕鏈(LC)<Ang-2>，具有Q124K取代
SEQ ID NO：6 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代
SEQ ID NO：7 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K213E取代
SEQ ID NO：8 輕鏈(LC)<Ang-2>，具有E123K取代
SEQ ID NO：9 輕鏈(LC)<Ang-2>，具有Q124K取代及E123K取代
SEQ ID NO：10 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代及K213E取代
SEQ ID NO：11 輕鏈(LC)<Ang-2>，具有Q124R取代及E123K取代
SEQ ID NO：12 輕鏈(LC)<VEGF>，具有Q124E取代
SEQ ID NO：13 輕鏈(LC)<Ang-2>，具有E124K取代及E123K取代
SEQ ID NO：14 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代及K213D取代
SEQ ID NO：15 輕鏈(LC)<IL-17>野生型(wt)
SEQ ID NO：16 重鏈(HC)<IL-17>野生型(wt)
SEQ ID NO：17 重鏈(HC)<TWEAK>，具有VH-VL交換野生型(wt)
SEQ ID NO：18 輕鏈(LC)<TWEAK>，具有VH-VL交換野生型(wt)
SEQ ID NO：19 輕鏈(LC)<IL-17>，具有Q124K取代及E123R取代
SEQ ID NO：20 重鏈(HC)<IL-17>，具有K147E取代及K213E取代
SEQ ID NO：21 輕鏈(LC)<TWEAK>，具有Q124E取代
SEQ ID NO：22 重鏈(HC)<IL-17>，具有K147E取代及K213D取代
SEQ ID NO：23 輕鏈(LC)<IL-17>，具有Q124K取代及E123K取代
SEQ ID NO：24 重鏈可變結構域VH<TWEAK>305-HC4
SEQ ID NO：25 輕鏈可變結構域VL<TWEAK>305-LC2
SEQ ID NO：26 重鏈可變結構域VH<IL-17>HC136
SEQ ID NO：27 輕鏈可變結構域VL<IL-17>LC136
SEQ ID NO：28 重鏈(HC)<TWEAK>，具有VH-VL交換野生型(wt)(包含末端GK二肽)
SEQ ID NO：29 重鏈(HC)<IL-17>，具有K147E取代及K213E取代(包含末端GK二肽)
SEQ ID NO：30 重鏈(HC)<IL-17>，具有K147E取代及K213D取代(包含末端GK二肽)
SEQ ID NO：31 重鏈(HC)<Ang-2>野生型(wt)(包含末端GK二肽)
SEQ ID NO：32 重鏈(HC)<VEGF>，具有VH-VL交換野生型(wt)(包含末端GK二肽)
SEQ ID NO：33 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代(包含末端GK二肽)
SEQ ID NO：34 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K2 13E取代(包含末端GK二肽)
SEQ ID NO：35 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代及K213E取代(包含末端GK二肽)
SEQ ID NO：36 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代及K213D取代(包含末端GK二肽)
SEQ ID NO：37 重鏈(HC)<IL-17>野生型(wt)(包含末端GK二肽)
SEQ ID NO：38 Fab2-CrossFab重鏈(HC)，其包括兩條重鏈(HC)<Ang-2>野生型(wt)，該等重鏈經由甘胺酸-絲胺酸-連接體偶合至一條具有VH-VL交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>
SEQ ID NO：39 Fab2-CrossFab重鏈(HC)，其包括兩條具有K147E及K2 13E取代之重鏈(HC)<Ang-2>，該等重鏈經由甘胺酸-絲胺酸-連接體偶合至一條具有VH-VL交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>
SEQ ID NO：40 CrossFab-Fab重鏈(HC)，其包括一條具有VH-VL交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>，該重鏈經由甘胺酸-絲胺酸-連接體偶合至一條具有K147E及K213E取代之重鏈(HC)<Ang-2>
SEQ ID NO：41 CrossFab-Fab重鏈(HC)，其包括一條具有VH-VL 交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>，該重鏈經由甘胺酸-絲胺酸-連接體偶合至一條具有K147E及K213E取代之重鏈(HC)<Ang-2>
SEQ ID NO：42 CrossFab2-Fab重鏈(HC)，其包括兩條具有VH-VL交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>，該等重鏈經由甘胺酸-絲胺酸-連接體偶合至一條重鏈(HC)<Ang-2>野生型(wt)
SEQ ID NO：43 CrossFab2-Fab重鏈(HC)，其包括兩條具有VH-VL交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>，該等重鏈經由甘胺酸-絲胺酸-連接體偶合至一條具有K147E及K231E取代之重鏈(HC)<Ang-2>
SEQ ID NO：44 重鏈(HC)<VEGF>，具有VH-VL交換以及K147E取代
SEQ ID NO：45 輕鏈(LC)<VEGF>，具有VH-VL交換以及Q124K取代
SEQ ID NO：46 重鏈(HC)<VEGF>，具有VH-VL交換以及K147E及K213E取代
SEQ ID NO：47 輕鏈(LC)<VEGF>，具有VH-VL交換以及E123K及Q124K取代
實例 材料及一般方法
關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊參見以下文獻：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。抗體鏈之胺基酸係根據如上文所定義之Kabat之編號系統編號並提及(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。
重組DNA技術
使用標準方法來操作DNA，如以下文獻中所述：Sambrook,J.等人，Molecular Cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989。根據製造商說明書使用分子生物學試劑。
基因合成
期望基因區段係自藉由化學合成製得之寡核苷酸製備。側接有單一限制內核酸酶裂解位點之長600-1800bp之基因區段係藉由退火並接合寡核苷酸(包括PCR擴增)來裝配，且隨後經由所指示限制位點(例如KpnI/SacI或AscI/PacI)選殖至基於pPCRScript(Stratagene)之pGA4選殖載體中。藉由DNA測序來證實亞選殖基因片段之DNA序列。基因合成片段係根據Geneart(Regensburg,Germany)之所給規範來訂購。
DNA序列測定
DNA序列係藉由在MediGenomix GmbH(Martinsried,Germany)或SequiServe GmbH(Vaterstetten,Germany)實施之雙鏈測序來測定。
DNA及蛋白質序列分析及序列資料管理
使用GCG(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)之軟體包10.2版及Infomax's Vector NT1 Advance套件8.0版進行序列創建、定位、分析、注釋及闡釋。
表現載體
對於所述抗體之表現，施加用於瞬時表現之表現質體之變體(例如在HEK293 EBNA或HEK293-F細胞中)，其係基於具有或不具有CMV-內含子A啟動子之cDNA組織或基於具有CMV啟動子之基因體組織。
除了抗體表現盒以外，載體含有：- 複製起點，其容許在大腸桿菌中複製此質體，及 - β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中產生胺苄青黴素(ampicillin)抗性。
抗體基因之轉錄單元由以下元件組成：- 在5’端之獨特限制位點，- 來自人類巨細胞病毒之立即早期增強子及啟動子，- 在cDNA組織情形中，之後之內含子A序列，- 人類抗體基因之5’-非翻譯區，- 免疫球蛋白重鏈信號序列，- 人類抗體鏈(野生型或具有結構域交換)，其呈具有免疫球蛋白外顯子-內含子組織之cDNA或基因體組織，- 具有多聚腺苷酸化信號序列之3’非翻譯區，及- 在3’端之獨特限制位點。
如下文所述包含抗體鏈之融合基因係藉由PCR及/或基因合成來生成，且藉由已知重組方法及技術藉由使用(例如)各別載體中之獨特限制位點連接相應核酸區段來裝配。亞選殖核酸序列係藉由DNA測序來驗證。對於瞬時轉染，藉由質體製備自經轉化大腸桿菌培養物(Nucleobond AX,Macherey-Nagel)製備較大量之質體。
細胞培養技術
使用標準細胞培養技術，如以下文獻中所述：Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S，、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott-Schwartz,J.及Yamada,K.M.(編輯),John Wiley & Sons,Inc.。
多重特異性抗體係藉由各別表現質體在黏附生長之HEK293-EBNA中或在懸浮生長之HEK29-F細胞中之瞬時共轉染來表現，如下文所述。
在HEK293-EBNA系統中之瞬時轉染
多重特異性抗體係藉由各別表現質體(例如編碼重鏈及經修飾重鏈，以及相應輕鏈及經修飾輕鏈)在黏附生長之HEK293-EBNA細胞(表現艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr-Virus)核抗原之人類胚腎細胞系293；美國典型培養物保存號ATCC編號CRL-10852，批號959 218)中之瞬時共轉染來表現，該等細胞係在補充有10% Ultra Low IgG FCS(胎牛血清，Gibco®)、2mM L-麩醯胺酸(Gibco®)及250μg/ml建那黴素(Geneticin)(Gibco®)之DMEM(達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)，Gibco®)中培養。對於轉染，以FuGENETM試劑(μl)對DNA(μg)為4：1(介於3：1至6：1範圍內)之比率使用FuGENETM 6轉染劑(Roche Molecular Biochemicals)。使用(經修飾及野生型)輕鏈及重鏈編碼質體分別為1：1(等莫耳)(介於1：2至2：1範圍內)之莫耳比自各別質體表現蛋白質。在第3天用L-麩醯胺酸及4mM葡萄糖[Sigma]及NAA[Gibco®]飼餵細胞。在轉染後第5天至第11天藉由離心收穫含有多重特異性抗體之細胞培養上清液並將其儲存於-20℃下。關於在(例如)HEK293細胞中重組表現人類免疫球蛋白之一般資訊參見：Meissner,P.等人，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203。
在HEK293-F系統中之瞬時轉染
多重特異性抗體係藉由根據製造商之說明書使用HEK293-F系統(Invitrogen)用各別質體(例如編碼重鏈及經修飾重鏈以及相應輕鏈及經修飾輕鏈)瞬時轉染來生成。簡言之，用4種表現質體與293fectinTM或fectin(Invitrogen)之混合物轉染在搖瓶中或在攪拌式發酵罐中在無血清FreeStyleTM 293表現培養基(Invitrogen)中懸浮生長之HEK293-F細胞(Invitrogen)。對於2L搖瓶(Corning)，HEK293-F細胞係以1.0E*6個細胞/mL之密度以600mL接種，且在120rpm、8% CO2下培育。在後一天，以約1.5E*6個細胞/mL之細胞密度用約42mL以下之混合物 轉染細胞：A)20mL Opti-MEM(Invitrogen)，含有600μg分別以等莫耳比率編碼重鏈或經修飾重鏈以及相應輕鏈之總質體DNA(1μg/mL)，及B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293 fectin或fectin(2μl/mL)。根據葡萄糖消耗在發酵過程期間添加葡萄糖溶液。在5-10天後收穫含有所分泌抗體之上清液，並直接自上清液純化抗體或冷凍並儲存上清液。
蛋白質測定
純化抗體及衍生物之蛋白質濃度係藉由根據Pace等人，Protein Science,1995,4,2411-1423，使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數，在280nm下測定光學密度(OD)來測定。
上清液中之抗體濃度測定
抗體及衍生物在細胞培養上清液中之濃度係藉由用蛋白質A瓊脂糖珠粒(Roche)進行免疫沈澱來估計。將60μL蛋白質A瓊脂糖珠粒在TBS-NP40(50mM Tris,pH 7.5,150mM NaCl,1% Nonidet-P40)中洗滌三次。隨後，將1-15mL細胞培養上清液施加至在TBS-NP40中預平衡之蛋白質A瓊脂糖珠粒。在室溫下培育1小時後，將珠粒在Ultrafree-MC過濾管柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗滌一次，用0.5mL 2×磷酸鹽緩衝鹽水(2×PBS,Roche)洗滌兩次，並用0.5mL 100mM檸檬酸Na(pH 5.0)短暫洗滌4次。藉由添加35μl NuPAGE® LDS樣品緩衝液(Invitrogen)來溶析結合抗體。分別將一半樣品與NuPAGE®樣品還原劑組合或保持未還原，且在70℃下加熱10min。因此，將5-30μl施加至4-12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(對於非還原SDS-PAGE，使用MOPS緩衝液；且對於還原SDS-PAGE，使用含有NuPAGE®抗氧化劑運行緩衝液添加劑(Invitrogen)之MES緩衝液)並用考馬斯藍(Coomassie Blue)染色。
抗體及衍生物在細胞培養上清液中之濃度係藉由親和HPLC層析 定量量測。簡言之，將含有結合至蛋白質A之抗體及衍生物之細胞培養上清液施加至Agilent HPLC 1100系統上之Applied Biosystems Poros A/20管柱之200mM KH2PO4、100mM檸檬酸鈉(pH 7.4)中，並用200mM NaCl、100mM檸檬酸(pH 2.5)自基質溶析。經溶析蛋白質係藉由UV吸光度及峰面積積分來定量。純化標準IgG1抗體用作標準品。
或者，抗體及衍生物在細胞培養上清液中之濃度係藉由Sandwich-IgG-ELISA來量測。簡言之，用100μL/孔之0.1μg/mL生物素化抗人類IgG捕獲分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)塗佈StreptaWell高結合鏈黴抗生物素蛋白A-96孔微量滴定板(Roche)並在室溫下保持1小時或另一選擇為在4℃下保持過夜，隨後用200μL/孔PBS、0.05% Tween(PBST,Sigma)洗滌3次。將100μL/孔之含有各別抗體之細胞培養上清液於PBS(Sigma)中之連續稀釋液添加至孔中並在微量滴定板振盪器上在室溫下培育1-2小時。用200μL/孔PBST將孔洗滌3次，並在微量滴定板振盪器上在室溫下用100μl 0.1μg/mL之F(ab')2<hFcγ>POD(Dianova)作為檢測抗體檢測結合抗體1-2小時。用200μL/孔PBST將未結合檢測抗體洗除3次，且藉由添加100μL ABTS/孔檢測結合之檢測抗體。吸光度之測定係在Tecan Fluor光譜儀上在405nm之量測波長下(參照波長492nm)實施。
蛋白質純化
參照標準方案自經過濾細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，將抗體施加至蛋白質A Sepharose管柱(GE healthcare)並用PBS洗滌。 抗體之溶析係在pH 2.8達成，之後立即中和樣品。在PBS中或在20mM組胺酸、150mM NaCl(pH 6.0)中藉由粒徑篩析層析(Superdex 200,GE Healthcare)將聚集蛋白質與單體抗體分離。彙集單體抗體部分，使用(例如)MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)離心濃縮器濃縮(若需要)，冷凍並儲存於-20℃或-80℃下。提供部分樣品用於隨後 藉由(例如)SDS-PAGE、粒徑篩析層析(SEC)或質譜進行蛋白質分析及分析型表徵。
SDS-PAGE
根據製造商說明書使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)。具體而言，使用10%或4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast凝膠(pH 6.4)及NuPAGE® MES(還原凝膠，含有NuPAGE®抗氧化劑運行緩衝液添加劑)或MOPS(非還原凝膠)運行緩衝液。
分析型粒徑篩析層析
用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之粒徑篩析層析(SEC)係藉由HPLC層析來實施。簡言之，將蛋白質A純化抗體施加至Agilent HPLC 1100系統上之Tosoh TSKgel G3000SW管柱之300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4(pH 7.5)中，或施加至Dionex HPLC系統上之Superdex 200管柱(GE Healthcare)之2×PBS中。經溶析蛋白質係藉由UV吸光度及峰面積積分來定量。BioRad凝膠過濾標準品151-1901用作標準品。
質譜
此章節闡述對具有VH/VL交換(VH/VL CrossMab)之多重特異性抗體之表徵，且重點在於其正確裝配。藉由去糖基化完整CrossMab及去糖基化/胞漿素消化之CrossMab或另一選擇為去糖基化/受限LysC消化之CrossMab之電噴霧離子化質譜(ESI-MS)分析預期一級結構。
VH/VL CrossMab係在1mg/ml之蛋白質濃度下用N-糖苷酶F在磷酸鹽或Tris緩衝液中在37℃下去糖基化最長17h。胞漿素或受限LysC(Roche)消化分別係用100μg去糖基化VH/VL CrossMab在Tris緩衝液(pH 8)中在室溫下實施120小時且在37℃下實施40min。在質譜之前，經由HPLC在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上使樣品去鹽。經由 ESI-MS在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上測定總質量。
使用表面電漿共振(SPR)(BIACORE)對多重特異性抗體與各別抗原之結合及結合親和力之測定
藉由表面電漿共振使用BIACORE儀器(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)研究所生成抗體對各別抗原(例如ANG2及VEGF)之結合。簡言之，對於親和力量測，經由胺偶合將山羊抗人類IgG(JIR 109-005-098抗體)固定在CM5晶片上以供呈現針對各別抗原之抗體。結合係在HBS緩衝液(HBS-P(10mM HEPES,150mM NaCl,0.005% Tween 20,ph 7.4))中在25℃下(或另一選擇為在37℃下)量測。 以各種濃度在溶液中添加抗原(R&D Systems或內部純化)。結合係藉由80秒至3分鐘之抗原注射來量測；解離係藉由用HBS緩衝液將晶片表面洗滌3-10分鐘來量測，且KD值係使用1：1 Langmuir結合模型來估計。自樣品曲線減去陰性對照資料(例如緩衝液曲線)以校正系統固有基線漂移及減少雜訊。使用各別Biacore評估軟體來分析感測圖並計算親和力資料。
使用表面電漿共振(SPR)(BIACORE)對同時結合之檢測
多重特異性抗體對(例如)Ang-2及VEGF或對IL17-TWEAK之同時結合。
比較多重特異性抗體形式之結合與「野生型」IgG之結合，結合模組及雙重特異性抗體源自該等「野生型」IgG。該等分析係藉由施加如上文所述之表面電漿共振(Biacore)來實施。為顯示同時結合，藉由表面電漿共振(SPR)技術使用Biacore儀器(Biacore AB,Uppsala)分析結合性質。
使用胺偶合化學法將捕獲抗人類IgG抗體固定在CM5生物感測晶片表面上。用0.1M N-羥基琥珀醯亞胺與0.1M 3-(N,N-二甲基胺基)丙 基-N-乙基碳二亞胺之1：1混合物以(例如)5μl/min之流速活化流動槽。抗人類IgG抗體係以10μg/ml於乙酸鈉(pH 5.0)中注射，此產生約12000RU之表面密度。以相同方式但僅用媒劑緩衝液代替捕獲抗體處理參照對照流動槽。藉由注射1M乙醇胺/HCl(pH 8.5)來封阻表面。將多重特異性抗體稀釋於HBS-P中並以5μl/min之流速注射。濃度介於1nM與50nM之間之抗體之接觸時間(結合期)為1min。人類Ang-2或人類VEGF蛋白質；或人類IL17或TWEAK蛋白質係以遞增濃度注射。所有相互作用皆係在25℃下(標準溫度，或另一選擇為在37℃下)進行。在每一結合循環後，將3M氯化鎂之再生溶液以5μl/min流速注射60秒，以去除任何未共價結合之蛋白質。以每秒一個信號之速率檢測信號。以遞增濃度注射樣品。
實例1A
結合至血管生成素-2(ANG2)及VEGF之多重特異性抗體之產生及表現，其在一個結合臂中具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )並在CH1/CL界面中具有單一帶電荷胺基酸取代
在第一實例中，結合至人類血管生成素-2(ANG2)及人類VEGF之多重特異性抗體係如一般方法章節中所述藉由古典分子生物學技術來生成，且如上文所述在HEK293細胞中瞬時表現。該等各別多重特異性抗體之一般示意圖提供於圖1A至C中。亦製備在CH1/CL界面中無取代之野生型(wt)VH/VL結構域交換/置換抗體用於比較。亦使用在緊鄰CH1CL界面處之其他替代性取代(例如EP 2647707中所提及)用於比較。多重特異性抗體係使用含有編碼表2a中所繪示胺基酸序列之核酸之表現質體來表現。
表2a：抗Ang2-VEGF多重特異性抗體Ang2VEGF-0273、Ang2VEGF-0396、Ang2VEGF-0397、Ang2VEGF-0394、Ang2VEGF-0395之輕鏈(LC)及重鏈(HC)之胺基酸序列，其具有VH/VL結構域交
對於所有構築體，使用隆凸至空穴中異二聚化技術，在第一CH3結構域中具有典型隆凸(T366W)取代且在第二CH3結構域中具有相應空穴取代(T366S、L368A及Y407V)(以及所引入之兩個額外半胱胺酸殘基S354C/Y349’C)(含於上文描繪之各別相應重鏈(HC)序列中)
實例1B
結合至血管生成素-2(ANG2)及VEGF之多重特異性抗體之純化及表徵，其在一個結合臂中具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )且在CH1/CL界面中具有單一帶電荷胺基酸取代
上文表現之多重特異性抗體係藉由蛋白質A親和層析與粒徑篩析層析之組合自上清液純化。所有多重特異性抗體皆可以良好產率產生且穩定。
表徵所獲得產物之一致性(藉由質譜)及諸如純度等分析型性質(藉由SDS-PAGE)、單體含量及穩定性
質譜
藉由去糖基化完整CrossMab及去糖基化/胞漿素消化之CrossMab 或另一選擇為去糖基化/受限LysC消化之CrossMab之電噴霧離子化質譜(ESI-MS)分析預期一級結構。
VH/VL CrossMab係在1mg/ml之蛋白質濃度下用N-糖苷酶F在磷酸鹽或Tris緩衝液中在37℃下去糖基化最長17h。胞漿素或受限LysC(Roche)消化分別係用100μg去糖基化VH/VL CrossMab在Tris緩衝液(pH 8)中在室溫下實施120小時且在37℃下實施40min。在質譜之前，經由HPLC在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上使樣品去鹽。經由ESI-MS在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上測定總質量。
結果顯示於表2b及圖4a中。
表2b及圖4a中之結果顯示，在根據本發明/如本發明所述在CH1及CL結構域中用相反電荷取代單一帶電荷胺基酸時(CL：Q124K及 CH1：K147E對；或CL：Q124K及CH1：K213E對)，主要副產物(Bence-Jones型配對錯誤)與不具有該等取代之野生型多重特異性抗體相比顯著減少(減少約17%)。在緊鄰處之其他取代下(CL：Q123K及CH1：K147E對；或CL：Q123K及CH1：K213E對)，主要副產物與不具有該等取代之野生型多重特異性抗體相比僅略有減少(減少約5%)。
實例2A
結合至血管生成素-2(ANG2)及VEGF之多重特異性抗體之產生及表現，其在一個結合臂中具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )且在CH1/CL界面中具有不同帶電荷胺基酸取代
在第一實例中，結合至人類血管生成素-2(ANG2)及人類VEGF之多重特異性抗體係如一般方法章節中所述藉由古典分子生物學技術來生成，且如上文所述在HEK293細胞中瞬時表現。該等各別多重特異性抗體之一般示意圖提供於圖1A至C中。亦製備在CH1/CL界面中無取代之野生型(wt)VH/VL結構域交換/置換抗體用於比較。多重特異性抗體係使用含有編碼表3a中所繪示胺基酸序列之核酸之表現質體來表現。
對於所有構築體，使用隆凸至空穴中異二聚化技術，在第一CH3結構域中具有典型隆凸(T366W)取代且在第二CH3結構域中具有相應空穴取代(T366S、L368A及Y407V)(以及所引入之兩個額外半胱胺酸殘基S354C/Y349’C)(含於上文描繪之各別相應重鏈(HC)序列中)。
實例2B
結合至血管生成素-2(ANG2)及VEGF之多重特異性抗體之純化及表徵，其在一個結合臂中具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )且在CH1/CL界面中具有不同帶電荷胺基酸取代
上文表現之多重特異性抗體係藉由蛋白質A親和層析與粒徑篩析層析之組合自上清液純化。所有多重特異性抗體皆可以良好產率產生且穩定。
表徵所獲得產物之一致性(藉由質譜)及諸如純度等分析型性質(藉由SDS-PAGE)、單體含量及穩定性
質譜
藉由去糖基化完整CrossMab及去糖基化/胞漿素消化之CrossMab或另一選擇為去糖基化/受限LysC消化之CrossMab之電噴霧離子化質譜(ESI-MS)分析預期一級結構。
VH/VL CrossMab係在1mg/ml之蛋白質濃度下用N-糖苷酶F在磷酸鹽或Tris緩衝液中在37℃下去糖基化最長17h。胞漿素或受限LysC(Roche)消化分別係用100μg去糖基化VH/VL CrossMab在Tris緩衝液(pH 8)中在室溫下實施120小時且在37℃下實施40min。在質譜之前， 經由HPLC在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上使樣品去鹽。經由ESI-MS在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上測定總質量。
結果顯示於表3b及圖5a中。
表3b及圖5a中之結果顯示，在根據本發明/如本發明所述在CH1及CL結構域中用相反電荷雙重取代帶電荷胺基酸時 (CL：Q124K/E123K及CH1：K147E/K213E；CL：Q124R/E123K及CH1：K147E/K213E；CL：Q124R/E123K及CH1：K147E/K213D)，主要副產物(Bence-Jones型配對錯誤)在與不具有該等取代之野生型多重特異性抗體相比時完全去除。此與另一結合臂之CL結構域中之另一單一取代Q124E無關，其既不影響表現亦不影響副產物譜。
實例2C
結合至血管生成素-2(ANG2)及VEGF之多重特異性抗體之抗原結合性質，其在一個結合臂中具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )且在CH1/CL界面中具有不同帶電荷胺基酸取代
多重特異性抗體對其各別靶抗原(即ANG2及VEGF)之結合係如一般方法章節中所指示藉由Biacore®使用如表3b中所指示之Ang2VEGF-0274抗體來評價。作為比較實例，平行評價特異性結合至Ang2及VEGF之參照抗體及具有VH/VL結構域交換/置換且無帶電荷胺基酸取代之相應多重特異性抗體(表3b之Ang2VEGF-0273抗體)。
結果指示於表3c及3d中。
如自結果可見，所測試之所有抗體皆特異性結合至兩個靶Ang2及VEGF。
實例3A
結合至IL-17及TWEAK之多重特異性抗體之產生及表現，其在一個結合臂中具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )且在CH1/CL界面中具有不同帶電荷胺基酸取代
在第一實例中，結合至人類IL-17及人類TWEAK之多重特異性抗體係如一般方法章節中所述藉由古典分子生物學技術來生成，且如上文所述在HEK293細胞中瞬時表現。該等各別多重特異性抗體之一般示意圖提供於圖1A至C中。亦製備在CH1/CL界面中無取代之野生型(wt)VH/VL結構域交換/置換抗體用於比較。多重特異性抗體係使用含有編碼表4a中所繪示胺基酸序列之核酸之表現質體來表現。
對於所有構築體，使用隆凸至空穴中異二聚化技術，在第一CH3結構域中具有典型隆凸(T366W)取代且在第二CH3結構域中具有相應空穴取代(T366S、L368A及Y4()7V)(以及所引入之兩個額外半胱胺酸 殘基S354C/Y349’C)(含於上文描繪之各別相應重鏈(HC)序列中)。
實例3B
結合至IL-17及TWEAK之多重特異性抗體之純化及表徵，其在一個結合臂中具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )且在CH1/CL界面中具有不同帶電荷胺基酸取代
上文表現之多重特異性抗體係藉由蛋白質A親和層析與粒徑篩析層析之組合自上清液純化。所有多重特異性抗體皆可以良好產率產生且穩定。
表徵所獲得產物之一致性(藉由質譜)及諸如純度等分析型性質(藉由SDS-PAGE)、單體含量及穩定性
質譜
藉由去糖基化完整CrossMab及去糖基化/胞漿素消化之CrossMab或另一選擇為去糖基化/受限LysC消化之CrossMab之電噴霧離子化質譜(ESI-MS)分析預期一級結構。
VH/VL CrossMab係在1mg/ml之蛋白質濃度下用N-糖苷酶F在磷酸鹽或Tris緩衝液中在37℃下去糖基化最長17h。胞漿素或受限LysC(Roche)消化分別係用100μg去糖基化VH/VL CrossMab在Tris緩衝液(pH 8)中在室溫下實施120小時且在37℃下實施40min。在質譜之前，經由HPLC在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上使樣品去鹽。經由ESI-MS在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上測定總質量。
結果顯示於表4b及圖6a中。
表2b及圖6a中之結果顯示，在根據本發明/如本發明所述在CH1及CL結構域中用相反電荷雙重取代帶電荷胺基酸時(CL：Q124K/E123R及CH1：K147E/K213E；CL：Q124K/E123R及CH1：K147E/K213D；CL：Q124K/E123K及CH1：K147E/K213E)，主要副產物(Bence-Jones型配對錯誤)在與不具有該等取代之野生型多重特異性抗體相比時完全去除。此與另一結合臂之CL結構域中之另一單一取代Q124E無關，其既不影響表現亦不影響副產物譜。
實例4A
結合至Ang2及VEGF之二價及三價多重特異性抗體之產生及表 現，其中該等抗體全無Fc片段且在一個結合臂中包括VH/VL結構域交換/置換且在CH1/CL界面中包括一或多個帶電荷胺基酸取代
在另一實例中，結合至人類Ang2及人類VEGF之多重特異性抗體係如一般方法章節中所述藉由古典分子生物學方法來生成，且如上文所述在HEK293細胞中瞬時表現。所生成抗體在特異性結合至VEGF之結合臂中包括具有VH/VL結構域交換之Fab片段，且在特異性結合至Ang2之另一結合臂中包括無結構域交換之Fab片段，同時多重特異性抗體全無Fc片段。因此，第一輕鏈源自特異性結合至人類Ang2之抗體且自N-末端至C-末端方向包含結構域VL-CL。第一(抗Ang2)及第二(抗VEGF)抗體之重鏈係經由甘胺酸-絲胺酸肽連接體連接。在特異性結合至VEGF之抗體之重鏈中，初始可變結構域VH經源自抗VEGF抗體之可變結構域VL置換。因此，包含抗Ang2抗體及抗VEGF抗體之重鏈之多肽自N-末端至C-末端方向包含結構域VH(Ang2)-CH1(Ang2)-連接體-VL(VEGF)-CH1(VEGF)。在特異性結合至人類VEGF之輕鏈中，初始可變結構域VL經源自抗VEGF抗體之可變結構域VH置換。因此，抗VEGF抗體之經修飾輕鏈自N-末端至C-末端方向包含結構域VH-CL。CH1/CL界面中不同胺基酸之取代指示於表5b中。
在此實例中，生成三種一般結構之多重特異性抗體：i)(Fab)2-CrossFabVH-VL形式之三價多重特異性Ang2-VEGF雙重特異性抗體(一般結構指示於圖8D中)；ii)CrossFabVH-VL-(Fab)形式之二價多重特異性Ang2-VEGF雙重特異性抗體(一般結構指示於圖7D中)；iii)(CrossFabVH-VL)2-Fab形式之三價多重特異性Ang2-VEGF雙重特異性抗體(一般結構指示於圖8C(neu)中)
亦製備在CH1/CL界面中無取代之野生型(wt)VH/VL結構域交換/置換抗體用於比較。多重特異性抗體係使用含有編碼表5a中所繪示胺 基酸序列之核酸之表現質體來表現。
實例4B：
結合至ANG2及VEGF之二價及三價多重特異性抗體之產生及表現，其中該等抗體全無Fc片段且在一個結合臂中包括VH/VL結構域交換/置換，且在CH1/CL界面中包括不同帶電荷胺基酸取代
所分泌蛋白質係藉由標準程序使用位於重鏈N-末端之六組胺酸標籤之親和純化來純化。
質譜：藉由去糖基化完整抗體及去糖基化/胞漿素消化之抗體或另一選擇為去糖基化/受限LysC消化之抗體之電噴霧離子化質譜(ESI-MS)分析預期一級結構。
VH/VL Fab-CrossFab構築體係在1mg/ml之蛋白質濃度下用N-糖苷酶F在磷酸鹽或Tris緩衝液中在37℃去糖基化最長17h。胞漿素或受 限LysC(Roche)消化分別係用100μg去糖基化VH/VL Fab-CrossFabs在Tris緩衝液(pH 8)中在室溫下實施120小時且在37℃下實施40min。在質譜之前，經由HPLC在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上使樣品去鹽。經由ESI-MS在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上測定總質量。
實例5A：
結合至血管生成素-2(ANG2)及VEGF之多重特異性抗體之產生及表現，其在VEGF-結合臂中具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )且在VEGF-結合臂之CH1/CL界面中具有不同帶電荷胺基酸取代
在另一實例中，結合至人類血管生成素-2(ANG2)及人類VEGF之多重特異性抗體係如一般方法章節中所述藉由古典分子生物學技術來生成，且如上文所述在HEK293細胞中瞬時表現。該等各別多重特異性抗體之一般示意圖提供於圖1B中，指示在包含VH/VL結構域交換/置換之結合臂之CH1/CL界面內存在不同帶電荷胺基酸之取代。亦製備在CH1/CL界面中無取代之野生型(wt)VH/VL結構域交換/置換抗體用於比較。多重特異性抗體係使用含有編碼表6a中所繪示胺基酸序列之核酸之表現質體來表現。
對於所有構築體，使用隆凸至空穴中異二聚化技術，在第一CH3結構域中具有典型隆凸(T366W)取代且在第二CH3結構域中具有相應空穴取代(T366S、L368A及Y407V)(以及所引入之兩個額外半胱胺酸殘基S354C/Y349C)(含於上文描繪之各別相應重鏈(HC)序列中)。
實例5B
結合至血管生成素-2(ANG2)及VEGF之多重特異性抗體之純化及表徵，其在一個結合臂中具有VH/VL結構域交換/置換(CrossMAb Vh-VL )且在CH1/CL界面中具有不同帶電荷胺基酸取代
上文表現之多重特異性抗體係藉由蛋白質A親和層析與粒徑篩析層析之組合自上清液純化。所有多重特異性抗體皆可以良好產率產生且穩定。
表徵所獲得產物之一致性(藉由質譜)及諸如純度等分析型性質(藉由SDS-PAGE)、單體含量及穩定性
質譜
藉由去糖基化完整CrossMab及去糖基化/胞漿素消化之CrossMab 或另一選擇為去糖基化/受限LysC消化之CrossMab之電噴霧離子化質譜(ESI-MS)分析預期一級結構。
VH/VL CrossMab係在1mg/ml之蛋白質濃度下用N-糖苷酶F在磷酸鹽或Tris緩衝液中在37℃下去糖基化最長17h。胞漿素或受限LysC(Roche)消化分別係用100μg去糖基化VH/VL CrossMab在Tris緩衝液(pH 8)中在室溫下實施120小時且在37℃下實施40min。在質譜之前，經由HPLC在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上使樣品去鹽。經由ESI-MS在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上測定總質量。
結果顯示於表6b中。
表6b中之結果顯示，在Ang2VEGF-雙重特異性抗體中未能改良副產物譜(包括Bence-Jones型配對錯誤)，該等抗體在位於包含VH/VL結構域交換/置換之結合臂內之CH1/CL界面中具有胺基酸取代。
<110> 瑞±商赫孚孟拉羅股份公司
<120> 多重特異性抗體
<130> P32061-WO
<150> EP 14163165.5
<151> 2014-04-02
<150> EP 14179034.5
<151> 2014-07-30
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<Ang-2>野生型(wt)
<400> 1
<210> 2
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈(HC)<Ang-2>野生型(wt)
<400> 2
<210> 3
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈(HC)<VEGF>，具有VH-VL交換野生型(wt)
<400> 3
<210> 4
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<VEGF>，具有VH-VL交換野生型(wt)
<400> 4
<210> 5
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<Ang-2>，具有Q124K取代
<400> 5
<210> 6
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代
<400> 6
<210> 7
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K213E取代
<400> 7
<210> 8
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<Ang-2>，具有E123K取代
<400> 8
<210> 9
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<Ang-2>，具有Q124K取代及E123K取代
<400> 9
<210> 10
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代及K213E取代
<400> 10
<210> 11
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<Ang-2>，具有Q124R取代及E123K取代
<400> 11
<210> 12
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<VEGF>，具有Q124E取代
<400> 12
<210> 13
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<Ang-2>，具有E124K取代及E123K取代
<400> 13
<210> 14
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代及K213D取代
<400> 14
<210> 15
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<IL-17>野生型(wt)
<400> 15
<210> 16
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈(HC)<IL-17>野生型(wt)
<400> 16
<210> 17
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈(HC)<TWEAK>，具有VH-VL交換野生型(wt)
<400> 17
<210> 18
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<TWEAK>，具有VH-VL交換野生型(wt)
<400> 18
<210> 19
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<IL-17>，具有Q124K取代及E123R取代
<400> 19
<210> 20
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈(HC)<IL-17>，具有K147E取代及K213E取代
<400> 20
<210> 21
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<TWEAK>，具有Q124E取代
<400> 21
<210> 22
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈(HC)<IL-17>，具有K147E取代及K213D取代
<400> 22
<210> 23
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈(LC)<IL-17>，具有Q124K取代及E123K取代
<400> 23
<210> 24
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈可變結構域VH<TWEAK>305-HC4
<400> 24
<210> 25
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈可變結構域VL<TWEAK>305-LC2
<400> 25
<210> 26
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 重鏈可變結構域VH<IL-17>HC136
<400> 26
<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈可變結構域VL<IL-17>LC136
<400> 27
<210> 28
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<TWEAK>，具有VH-VL交換野生型(wt)(包含末端GK二肽)
<400> 28
<210> 29
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<IL-17>，具有K147E取代及K213E取代(包含末端GK二肽)
<400> 29
<210> 30
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<IL-17>，具有K147E取代及K213D取代(包含末端GK二肽)
<400> 30
<210> 31
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<Ang-2>野生型(wt)(包含末端GK二肽)
<400> 31
<210> 32
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<VEGF>，具有VH-VL交換野生型(wt)(包含末端GK二肽)
<400> 32
<210> 33
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代(包含末端GK二肽)
<400> 33
<210> 34
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K213E取代(包含末端GK二肽)
<400> 34
<210> 35
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代及K213E取代(包含末端GK二肽)
<400> 35
<210> 36
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<Ang-2>，具有K147E取代及K213D取代(包含末端GK二肽)
<400> 36
<210> 37
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<IL-17>野生型(wt)(包含末端GK二肽)
<400> 37
<210> 38
<211> 688
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab2-CrossFab重鏈(HC)，其包括兩條重鏈(HC)<Ang-2>野生型(wt)，該等重鏈經由甘胺酸-絲胺酸連接體偶合至一條具有VL-VH結構域交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>
<400> 38
<210> 39
<211> 688
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab2-CrossFab重鏈(HC)，其包括兩條具有K147E及K213E取代之重鏈(HC)<Ang-2>，該等重鏈經由甘胺酸-絲胺酸連接體偶合至一條具有VL-VH結構域交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>
<400> 39
<210> 40
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossFab-Fab重鏈(HC)，其包括一條具有VL-VH結構域交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>，該重鏈經由甘胺酸-絲胺酸連接體偶合至一條重鏈(HC)<Ang-2>野生型(wt)
<400> 40
<210> 41
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossFab-Fab重鏈(HC)，其包括一條具有VL-VH結構域交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>，該重鏈經由甘胺酸-絲胺酸連接體偶合至一條具有K147E及K213E取代之重鏈(HC)<Ang-2>
<400> 41
<210> 42
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossFab2-Fab重鏈(HC)，其包括兩條具有VL-VH結構域交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>，該等重鏈經由甘胺酸-絲胺酸連接體偶合至一條重鏈(HC)<Ang-2>野生型(wt)
<400> 42
<210> 43
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossFab2-Fab重鏈(HC)，其包括兩條具有VL-VH結構域交換野生型(wt)之重鏈(HC)<VEGF>，該等重鏈經由甘胺酸-絲胺酸連接體偶合至一條具有K147E及K231E取代之重鏈(HC)<Ang-2>
<400> 43
<210> 44
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<VEGF>，具有VH-VL交換及K147E取代
<400> 44
<210> 45
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈(LC)<VEGF>，具有VH-VL交換及Q124K取代
<400> 45
<210> 46
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈(HC)<VEGF>，具有VH-VL交換以及K147E及K213E取代
<400> 46
<210> 47
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈(LC)<VEGF>，具有VH-VL交換以及E123K及Q124K取代
<400> 47

Claims (16)

  1. 一種多重特異性抗體，其包含：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，且其中該第二抗體之該第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中i)a)項之該第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且其中a)項之該第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  2. 如請求項1之多重特異性抗體，其中a)項之該第一輕鏈之該恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且其中a)項之該第一重鏈之該恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  3. 如請求項1之多重特異性抗體，其中a)項之該第一輕鏈之該恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且其中a)項之該第一重鏈之該恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  4. 如請求項1之多重特異性抗體，其中a)項之該第一輕鏈之該恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且位置123之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且其中a)項之該第一重鏈之該恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  5. 如請求項1至4中任一項之多重特異性抗體，其中b)項之該第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且其中b)項之該第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  6. 如請求項4之多重特異性抗體，其中a)項之該第一輕鏈之該恆定結構域CL中，位置124之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且其中a)項之該第一重鏈之該恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  7. 如請求項1至4中任一項之抗體，其中a)項之該抗體之該第一重鏈之第一CH3結構域及b)項之該抗體之該第二重鏈之第二CH3結構域各自在界面處相會，該界面包含 該等抗體CH3結構域之間之初始界面，其中該界面經改變以促進形成多重特異性抗體，其中該改變之特徵在於：i)一條重鏈之CH3結構域經改變，使得在與該多重特異性抗體內另一條重鏈之CH3結構域之初始界面相會之該一條重鏈之CH3結構域之初始界面內，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在該一條重鏈之該CH3結構域之該界面內生成凸起，該凸起可定位於該另一條重鏈之該CH3結構域之該界面內之凹洞中，且ii)該另一條重鏈之該CH3結構域經改變，使得在與該多重特異性抗體內該一條重鏈之該CH3結構域之該初始界面相會之該另一條重鏈之該CH3結構域之該初始界面內，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在該另一條重鏈之該CH3結構域之該界面內生成凹洞，可讓該一條重鏈之該CH3結構域之該界面內之凸起定位於該凹洞中。
  8. 如請求項7之抗體，其中該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基選自由以下組成之群：精胺酸(R)、***酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)；且該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基選自由以下組成之群：丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。
  9. 如請求項7之抗體，其中兩個CH3結構域皆藉由以下方式進一步改變：引入半胱胺酸(C)作為每一CH3結構域之相應位置中之胺基酸，使得可在兩個CH3結構域之間形成二硫橋。
  10. 如請求項8之抗體，其中 兩個CH3結構域皆藉由以下方式進一步改變：引入半胱胺酸(C)作為每一CH3結構域之相應位置中之胺基酸，使得可在兩個CH3結構域之間形成二硫橋。
  11. 如請求項1至4中任一項之多重特異性抗體，其特異性結合至人類TWEAK且特異性結合至人類IL17，其中A)該多重特異性抗體包含SEQ ID NO：24之重鏈可變結構域(VH)及SEQ ID NO：25之輕鏈可變結構域(VL)；且B)該多重特異性抗體包含SEQ ID NO：26之重鏈可變結構域(VH)及SEQ ID NO：27之輕鏈可變結構域(VL)。
  12. 一種製備如請求項1至11中任一項之多重特異性抗體之方法，其包含以下步驟：A)用包含編碼以下之核酸分子之載體轉化宿主細胞：a)特異性結合至第一抗原之第一抗體之第一輕鏈及第一重鏈；及b)特異性結合至第二抗原之第二抗體之第二輕鏈及第二重鏈，且其中該第二抗體之該第二輕鏈及第二重鏈中之可變結構域VL及VH經彼此置換；且其中i)a)項之該第一輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)取代)，且其中a)項之該第一重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或 ii)b)項之該第二輕鏈之恆定結構域CL中，位置124之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個較佳實施例中，獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)取代)，且其中b)項之該第二重鏈之恆定結構域CH1中，位置147之胺基酸或位置213之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；B)在容許合成該抗體分子之條件下培養該宿主細胞，及C)自該培養物回收該抗體分子。
  13. 一種核酸，其編碼如請求項1至11中任一項之多重特異性抗體之胺基酸序列。
  14. 一種表現載體，其含有如請求項13之核酸且能在宿主細胞中表現該核酸。
  15. 一種組合物，其包含如請求項1至11中任一項之抗體。
  16. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之抗體及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
TW104110751A 2014-04-02 2015-04-01 多重特異性抗體 TWI576353B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14163165 2014-04-02
EP14179034 2014-07-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201540728A true TW201540728A (zh) 2015-11-01
TWI576353B TWI576353B (zh) 2017-04-01

Family

ID=53724278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104110751A TWI576353B (zh) 2014-04-02 2015-04-01 多重特異性抗體

Country Status (30)

Country Link
US (2) US20150315296A1 (zh)
EP (2) EP3126395B1 (zh)
JP (1) JP6742245B2 (zh)
KR (1) KR102524165B1 (zh)
CN (1) CN106164095B (zh)
AU (2) AU2015239546A1 (zh)
BR (1) BR112016020112A2 (zh)
CA (1) CA2939852C (zh)
CL (1) CL2016002455A1 (zh)
CR (1) CR20160450A (zh)
DK (1) DK3126395T3 (zh)
EA (1) EA036292B1 (zh)
ES (1) ES2747749T3 (zh)
HR (1) HRP20191704T1 (zh)
HU (1) HUE045243T2 (zh)
IL (1) IL247273B (zh)
LT (1) LT3126395T (zh)
MX (1) MX369645B (zh)
MY (1) MY186351A (zh)
PE (1) PE20161390A1 (zh)
PH (1) PH12016501763A1 (zh)
PL (1) PL3126395T3 (zh)
PT (1) PT3126395T (zh)
RS (1) RS59311B1 (zh)
SG (1) SG11201608095YA (zh)
SI (1) SI3126395T1 (zh)
TW (1) TWI576353B (zh)
UA (1) UA117289C2 (zh)
WO (1) WO2015150447A1 (zh)
ZA (1) ZA201605660B (zh)

Families Citing this family (174)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
MY166429A (en) 2010-11-17 2018-06-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
EP2681239B8 (en) 2011-02-28 2015-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding proteins
EP2681240B1 (en) 2011-02-28 2017-08-16 F. Hoffmann-La Roche AG Monovalent antigen binding proteins
RU2605390C2 (ru) 2011-08-23 2016-12-20 Рош Гликарт Аг Биспецифические антитела, специфичные к антигенам, активирующим т-клетки, и опухолевому антигену, и способы их применения
BR112014024903A2 (pt) 2012-04-05 2017-07-11 Hoffmann La Roche anticorpos biespecíficos contra tweak humanao e il17 humana e seus usos
KR20150064068A (ko) 2012-10-08 2015-06-10 로슈 글리카트 아게 2개의 Fab 단편을 포함하는 FC-부재 항체 및 이용 방법
US9951145B2 (en) 2012-11-27 2018-04-24 Ajou University Industry—Academic Cooperation Foundation CH3 domain variant pair inducing formation of heterodimer of heavy chain constant region of antibody at high efficiency, method for preparing same, and use thereof
DK2961771T3 (da) 2013-02-26 2020-03-02 Roche Glycart Ag Bispecifikke, T-celle-aktiverende, antigenbindende molekyler, der er specifikke for CD3 og CEA
EP3444278A1 (en) 2013-02-26 2019-02-20 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2015052230A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
WO2016020309A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3204415B1 (en) * 2014-10-09 2020-06-17 EngMab Sàrl Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
BR112017009764A2 (pt) * 2014-11-10 2018-02-20 Hoffmann La Roche anticorpos biespecíficos e métodos de uso em oftalmologia
MY191428A (en) 2014-11-14 2022-06-27 Hoffmann La Roche Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
RS61134B1 (sr) 2014-11-20 2020-12-31 Hoffmann La Roche Kombinovana terapija bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju t ćelije za cd3 i folatni receptor 1 (folr1), i antagonistima vezivanja ose pd-1
CN114751989A (zh) 2015-03-31 2022-07-15 豪夫迈·罗氏有限公司 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子
ES2889906T3 (es) 2015-05-21 2022-01-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos
HRP20220304T1 (hr) 2015-06-24 2022-05-13 F. Hoffmann - La Roche Ag Anti-transferinska receptorska protutijela s prilagođenim afinitetom
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
WO2017055404A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
AR106189A1 (es) * 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
PE20181004A1 (es) 2015-10-02 2018-06-26 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos contra el cd20 humano y el receptor de transferrina humano y metodos de uso
JP7044700B2 (ja) 2015-10-02 2022-03-30 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ｃｅａｘｃｄ３ ｔ細胞活性化抗原結合分子
KR101851380B1 (ko) * 2015-10-12 2018-04-23 아주대학교산학협력단 효모접합을 이용한 항체 ch3 도메인 이종이중체 돌연변이쌍 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 ch3 돌연변이체 쌍
CN115920030A (zh) 2015-12-09 2023-04-07 豪夫迈·罗氏有限公司 Ii型抗cd20抗体用于降低抗药物抗体形成
WO2017117179A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Massachusetts Institute Of Technology Bispecific antibodies having constant region mutations and uses therefor
CA3006529A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
JP7082604B2 (ja) 2016-03-21 2022-06-08 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 多重特異性および多機能性分子ならびにその使用
PL3433280T3 (pl) 2016-03-22 2023-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Dwuswoiste cząsteczki limfocytów T aktywowane przez proteazy
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
WO2017201488A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
KR102365977B1 (ko) 2016-05-20 2022-02-22 하푼 테라퓨틱스, 인크. 단일 쇄 가변 단편 cd3 결합 단백질
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
CA3033475A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Heterodimeric fc-fused cytokine and pharmaceutical composition comprising the same
ES2897217T3 (es) 2016-09-30 2022-02-28 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecíficos frente a p95HER2
US20180118811A1 (en) * 2016-10-19 2018-05-03 Invenra Inc. Antibody constructs
CA3044659A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Harpoon Therapeutics, Inc. Prostate specific membrane antigen binding protein
BR112019010602A2 (pt) * 2016-11-23 2019-12-17 Harpoon Therapeutics Inc proteínas trispecíficas para psma e métodos de uso
CN110944651A (zh) 2017-02-08 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
CA3054079A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
US11685776B2 (en) 2017-03-02 2023-06-27 Novartis Ag Engineered heterodimeric proteins
WO2018177967A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved antigen binding receptor formats
WO2018184965A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates of il-2 with an anti-pd-1 and tim-3 bispecific antibody
KR102461885B1 (ko) 2017-04-03 2022-11-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-pd-1 항체와 돌연변이 il-2 또는 il-15의 면역접합체
CN110494452B (zh) 2017-04-03 2023-08-25 豪夫迈·罗氏有限公司 结合steap-1的抗体
KR102346336B1 (ko) 2017-04-05 2022-01-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 lag3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
MX2019011916A (es) 2017-04-05 2020-01-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-lag3.
JP7090347B2 (ja) 2017-05-12 2022-06-24 ハープーン セラピューティクス，インク． メソテリン結合タンパク質
CA3063362A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Harpoon Therapeutics, Inc. Msln targeting trispecific proteins and methods of use
EP3630836A1 (en) 2017-05-31 2020-04-08 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
MX2019014274A (es) 2017-06-02 2020-01-23 Hoffmann La Roche Metodo de tratamiento.
CN116041530A (zh) * 2017-06-25 2023-05-02 西雅图免疫公司 多特异性抗体及其制备和使用方法
JP7474193B2 (ja) * 2017-06-25 2024-04-24 システィミューン， インク． 多重特異性抗体とその作製及び使用方法
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
BR112020005834A2 (pt) 2017-09-29 2020-09-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha molécula multiespecífica de ligação ao antígeno tendo atividade de substituição de função de cofator do fator viii de coagulação sanguínea (fviii), e formulação farmacêutica contendo a referida molécula como ingrediente ativo
BR112020007196A2 (pt) 2017-10-13 2020-12-01 Harpoon Therapeutics, Inc. proteínas triespecíficas e métodos de uso
CR20200195A (es) 2017-10-13 2020-08-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión a antigenos de maduraciòn de celulas b
TWI805665B (zh) 2017-12-21 2023-06-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合hla-a2/wt1之抗體
CN111479588A (zh) 2017-12-29 2020-07-31 豪夫迈·罗氏有限公司 用于改善抗vegf抗体的vegf受体阻断选择性的方法
CA3084398A1 (en) * 2018-01-15 2019-07-18 I-Mab Biopharma Us Limited Modified c.kappa. and ch1 domains
US20200354457A1 (en) 2018-01-31 2020-11-12 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies comprising an antigen-binding site binding to lag3
WO2019149715A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Stabilized immunoglobulin domains
JP7475275B2 (ja) 2018-02-08 2024-04-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 二重特異性抗原結合分子及びその使用方法
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
WO2019178364A2 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CN117285641A (zh) * 2018-03-27 2023-12-26 西雅图免疫公司 制导和导航控制蛋白及其制备和使用方法
WO2019191552A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Genentech, Inc. Modulating lactogenic activity in mammalian cells
KR20200144114A (ko) 2018-04-13 2020-12-28 에프. 호프만-라 로슈 아게 4-1bbl을 포함하는 her-2 표적화 항원 결합 분자
AR115052A1 (es) 2018-04-18 2020-11-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos
EP3818083A2 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
CN112424228A (zh) * 2018-07-04 2021-02-26 豪夫迈·罗氏有限公司 新型双特异性激动性4-1bb抗原结合分子
JP2021530992A (ja) * 2018-07-11 2021-11-18 モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 改変されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体に関する組成物および方法
MX2021000287A (es) * 2018-07-11 2021-09-08 Momenta Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos relacionados con constructos de dominio de unión a antígeno-fc modificados genéticamente.
US10815311B2 (en) 2018-09-25 2020-10-27 Harpoon Therapeutics, Inc. DLL3 binding proteins and methods of use
PE20211279A1 (es) 2018-10-23 2021-07-19 Dragonfly Therapeutics Inc Proteinas heterodimericas fusionadas con fc
US20220041719A1 (en) * 2018-12-05 2022-02-10 Morphosys Ag Multispecific antigen-binding molecules
SG10202105788SA (en) 2018-12-21 2021-06-29 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3
AU2019410073A1 (en) 2018-12-21 2021-06-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor-targeted agonistic CD28 antigen binding molecules
MX2021007421A (es) 2018-12-21 2021-08-05 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a factor de crecimiento endotelial vascular (vegf) y a interleucina 1 beta (il-1beta) y metodos de uso.
BR112021012338A2 (pt) * 2018-12-24 2021-09-14 Sanofi Proteínas de ligação multiespecíficas com domínios fab mutantes
CN113412123A (zh) 2018-12-28 2021-09-17 豪夫迈·罗氏有限公司 用于免疫应答增强的患者的治疗性用途的肽-mhc-i-抗体融合蛋白
GB2597851A (en) 2019-02-21 2022-02-09 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
GB2599229B (en) 2019-02-21 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2020172571A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
GB2599227B (en) 2019-02-21 2024-05-01 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
WO2020172596A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and thereof
KR20220005568A (ko) 2019-05-09 2022-01-13 제넨테크, 인크. 항체의 제조 방법
JP7450647B2 (ja) 2019-06-26 2024-03-15 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｓｉｒｔ－１遺伝子ノックアウトを有する哺乳類細胞株
WO2020260329A1 (en) 2019-06-26 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Fusion of an antibody binding cea and 4-1bbl
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
KR20220038415A (ko) 2019-07-26 2022-03-28 벤더르빌트 유니버시티 엔테로바이러스 d68에 대한 인간 모노클로날 항체
BR112022001460A2 (pt) 2019-07-31 2022-03-22 Hoffmann La Roche Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, um ou mais polinucleotídeos isolados, célula hospedeira, método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica e para tratar uma doença em um indivíduo, composição farmacêutica, uso da molécula de ligação ao antígeno biespecífica e invenção
WO2021018925A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to gprc5d
MX2022003212A (es) 2019-09-18 2022-04-25 Genentech Inc Anticuerpos anti-klk7, anticuerpos anti-klk5, anticuerpos multiespecificos anti-klk5/klk7 y metodos de uso.
IL292480A (en) * 2019-10-25 2022-06-01 Sanofi Sa Methods for the analysis of chain mispairs in multispecific binding proteins
JP2023501394A (ja) 2019-11-15 2023-01-18 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー タンパク質水溶液中での可視粒子形成の防止
JP7296467B2 (ja) 2019-12-18 2023-06-22 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｌａ－ａ２／ｍａｇｅ－ａ４に結合する抗体
CN114867532A (zh) 2019-12-18 2022-08-05 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ccl2抗体
EP4081294A2 (en) 2019-12-23 2022-11-02 Genentech, Inc. Apolipoprotein l1-specific antibodies and methods of use
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
BR112022012969A2 (pt) 2020-01-09 2022-09-06 Hoffmann La Roche Moléculas de ligação, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, usos da molécula de ligação, métodos para produzir a molécula de ligação, tratar um indivíduo com câncer e suprarregular ou prolongar a atividade de células t citotóxicas em um indivíduo com câncer
EP4090666A1 (en) 2020-01-15 2022-11-23 F. Hoffmann-La Roche AG Methods to decrease impurities from recombinant protein manufacturing processes
EP4103602A1 (en) 2020-02-11 2022-12-21 Vanderbilt University Human monoclonal antibodies to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov- 2)
CN115768463A (zh) 2020-02-21 2023-03-07 哈普恩治疗公司 Flt3结合蛋白及使用方法
TW202200618A (zh) * 2020-03-17 2022-01-01 美商西雅圖免疫公司 微型導引和導航控制(miniGNC)類抗體蛋白及其製造和使用方法
LT4045533T (lt) 2020-03-26 2024-02-26 Vanderbilt University Žmogaus monokloniniai antikūnai prieš sunkaus ūminio respiracinio sindromo koronavirusą 2 (sars-cov-2)
KR20220159426A (ko) 2020-03-26 2022-12-02 제넨테크, 인크. 감소된 숙주 세포 단백질을 보유하는 변형된 포유동물 세포
WO2021195385A1 (en) 2020-03-26 2021-09-30 Vanderbilt University HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-GoV-2)
WO2021198034A1 (en) 2020-03-30 2021-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to vegf and pdgf-b and methods of use
EP4139363A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
JP2023520249A (ja) 2020-05-15 2023-05-16 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 非経口タンパク質溶液中の可視粒子形成の防止方法
CN115605185A (zh) 2020-05-19 2023-01-13 豪夫迈·罗氏有限公司（Ch） 螯合剂用于防止胃肠外蛋白质溶液中形成可见颗粒的用途
MX2022015206A (es) 2020-06-08 2023-01-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hbv y metodos de uso.
CN115916826A (zh) 2020-06-19 2023-04-04 豪夫迈·罗氏有限公司 与CD3和FolR1结合的抗体
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
CN115698084A (zh) 2020-06-19 2023-02-03 豪夫迈·罗氏有限公司 与cd3结合的抗体
CN115916825A (zh) 2020-06-19 2023-04-04 豪夫迈·罗氏有限公司 与cd3和cd19结合的抗体
JP2023530760A (ja) 2020-06-23 2023-07-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｅｒ２を標的とするアゴニストＣＤ２８抗原結合分子
EP4172192A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
JP2023531067A (ja) 2020-06-25 2023-07-20 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ３／抗ｃｄ２８二重特異性抗原結合分子
CN116133689A (zh) 2020-07-07 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 作为治疗性蛋白质制剂的稳定剂的替代表面活性剂
IL298921A (en) 2020-07-10 2023-02-01 Hoffmann La Roche Antibodies that bind to cancer cells and direct radionuclides to said cells
JP2023534458A (ja) 2020-07-17 2023-08-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗Ｎｏｔｃｈ２抗体及び使用方法
WO2022046920A2 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
GB2616128A (en) 2020-08-26 2023-08-30 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
KR20230056766A (ko) 2020-08-28 2023-04-27 제넨테크, 인크. 숙주 세포 단백질의 CRISPR/Cas9 다중 녹아웃
KR20230061458A (ko) 2020-09-04 2023-05-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 Vegf-a 및 ang2에 결합하는 항체 및 사용 방법
JP2023542079A (ja) 2020-09-21 2023-10-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体の精製
IL301366A (en) 2020-09-24 2023-05-01 Hoffmann La Roche Mammalian cell lines with genetic knockout
AR123855A1 (es) 2020-10-20 2023-01-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-mertk conjugados con peg y métodos de uso
IL303656A (en) 2020-12-17 2023-08-01 Hoffmann La Roche ANTI-HLA-G antibodies and their use
JP2024501662A (ja) 2020-12-22 2024-01-15 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｘｂｐ１を標的とするオリゴヌクレオチド
AU2022206061A1 (en) 2021-01-06 2023-07-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy employing a pd1-lag3 bispecific antibody and a cd20 t cell bispecific antibody
MX2023008084A (es) 2021-01-12 2023-07-13 Hoffmann La Roche Anticuerpos split que se unen a celulas cancerosas y dirigen radionuclidos a dichas celulas.
AU2022207624A1 (en) 2021-01-13 2023-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy
EP4288458A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
GB202102823D0 (en) 2021-02-26 2021-04-14 Tochikunda Ltd Diagnostic method
EP4304724A1 (en) 2021-03-09 2024-01-17 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugate and anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2022192647A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Genentech, Inc. Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
AU2022255506A1 (en) 2021-04-08 2023-11-09 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof
JP2024513474A (ja) 2021-04-09 2024-03-25 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 異種ポリペプチドを発現する細胞クローンを選択するための方法
CA3215965A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Amy Shen Modified mammalian cells
KR20240010469A (ko) 2021-05-21 2024-01-23 제넨테크, 인크. 관심 재조합 생성물의 생성을 위한 변형된 세포
AR126009A1 (es) 2021-06-02 2023-08-30 Hoffmann La Roche Moléculas agonistas de unión al antígeno cd28 que se dirigen a epcam
KR20240021859A (ko) 2021-06-18 2024-02-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ccl2 항체
CA3223534A1 (en) 2021-07-02 2023-01-05 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating cancer
US20230197278A1 (en) 2021-07-13 2023-06-22 Genentech, Inc. Multi-variate model for predicting cytokine release syndrome
KR20240036570A (ko) 2021-07-22 2024-03-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 이종이량체 Fc 도메인 항체
KR20240038008A (ko) 2021-07-28 2024-03-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 암 치료 방법 및 조성물
WO2023012147A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies and methods of use
WO2023094569A1 (en) 2021-11-26 2023-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies and tyrp1-specific antibodies
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
WO2023117325A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the determination of hydrolytic activity
US20230322958A1 (en) 2022-01-19 2023-10-12 Genentech, Inc. Anti-Notch2 Antibodies and Conjugates and Methods of Use
US20230295348A1 (en) 2022-01-24 2023-09-21 Novimmune Sa Composition and methods for the selective activation of cytokine signaling pathways
GB202204813D0 (en) 2022-04-01 2022-05-18 Bradcode Ltd Human monoclonal antibodies and methods of use thereof
WO2023202967A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved production cells
WO2023217933A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to vegf-a and il6 and methods of use
WO2023232961A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved production cells
WO2024020564A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024023271A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Ablynx Nv Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor
WO2024079009A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and proteasome inhibitors
WO2024079015A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and imids
WO2024079010A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and cd38 antibodies
WO2024079069A1 (en) 2022-10-12 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for classifying cells

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
AU751659B2 (en) 1997-05-02 2002-08-22 Genentech Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
ES2234241T3 (es) 1998-01-23 2005-06-16 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Derivados de anticuerpo de multiples fines.
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
NZ521540A (en) 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
EP1443961B1 (en) 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
NZ541503A (en) 2003-01-22 2008-09-26 Glycart Biotechnology Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased Fc receptor binding affinity and effector function
EP1648511A1 (en) 2003-07-29 2006-04-26 Morphotek, Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
WO2005027966A2 (en) 2003-09-05 2005-03-31 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
EP1983000B1 (en) 2003-11-21 2015-09-02 UCB Biopharma SPRL Method for the treatment of multiple sclerosis by inhibiting IL-17 activity
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
AU2006218876A1 (en) 2005-02-28 2006-09-08 Centocor, Inc. Heterodimeric protein binding compositions
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
TW200720289A (en) 2005-04-01 2007-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against CCR5 and uses thereof
JP5315489B2 (ja) 2005-04-26 2013-10-16 アール クレア アンド カンパニー エフェクター機能が増強されたヒトＩｇＧ抗体を作製する方法
US8008443B2 (en) 2005-04-26 2011-08-30 Medimmune, Llc Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
EP1999154B1 (en) 2006-03-24 2012-10-24 Merck Patent GmbH Engineered heterodimeric protein domains
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US8242247B2 (en) * 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
WO2009089004A1 (en) 2008-01-07 2009-07-16 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
BR112013013311A2 (pt) 2010-11-30 2017-09-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd agente terapêutico de indução de citotoxicidade
EA201791693A1 (ru) 2011-03-25 2018-05-31 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Гетеродимерные иммуноглобулины
TWI687441B (zh) 2011-06-30 2020-03-11 中外製藥股份有限公司 異源二聚化多胜肽
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
AR087601A1 (es) 2011-08-23 2014-04-03 Roche Glycart Ag Anticuerpos sin fc que comprenden dos fragmentos fab y metodos de utilizacion
US11851476B2 (en) * 2011-10-31 2023-12-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
PT2794905T (pt) 2011-12-20 2020-06-30 Medimmune Llc Polipéptidos modificados para estrutura de anticorpos bispecíficos
BR112014024903A2 (pt) * 2012-04-05 2017-07-11 Hoffmann La Roche anticorpos biespecíficos contra tweak humanao e il17 humana e seus usos
NZ630551A (en) 2012-04-20 2017-11-24 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
CA2869529A1 (en) * 2012-05-24 2013-11-28 Raffaella CASTOLDI Multispecific antibodies
UY35148A (es) * 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
KR102264570B1 (ko) * 2012-11-28 2021-06-14 자임워크스 인코포레이티드 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
PL3126395T3 (pl) 2019-12-31
AU2020273356A1 (en) 2020-12-17
EA201691991A1 (ru) 2017-04-28
CA2939852C (en) 2023-01-17
ES2747749T3 (es) 2020-03-11
SI3126395T1 (sl) 2019-10-30
TWI576353B (zh) 2017-04-01
KR20160138103A (ko) 2016-12-02
IL247273A0 (en) 2016-09-29
BR112016020112A2 (pt) 2018-01-16
EA036292B1 (ru) 2020-10-22
KR102524165B1 (ko) 2023-04-20
WO2015150447A1 (en) 2015-10-08
SG11201608095YA (en) 2016-10-28
JP6742245B2 (ja) 2020-08-19
JP2017511139A (ja) 2017-04-20
EP3126395A1 (en) 2017-02-08
MY186351A (en) 2021-07-15
PT3126395T (pt) 2019-09-30
EP3126395B1 (en) 2019-07-24
ZA201605660B (en) 2022-05-25
US20150315296A1 (en) 2015-11-05
MX2016012371A (es) 2016-12-02
CN106164095A (zh) 2016-11-23
MX369645B (es) 2019-11-15
EP3590968A1 (en) 2020-01-08
AU2015239546A1 (en) 2016-09-01
CN106164095B (zh) 2021-07-27
CR20160450A (es) 2016-12-19
PH12016501763A1 (en) 2017-02-06
HUE045243T2 (hu) 2019-12-30
DK3126395T3 (da) 2019-09-30
UA117289C2 (uk) 2018-07-10
US20210309730A1 (en) 2021-10-07
PE20161390A1 (es) 2016-12-28
RS59311B1 (sr) 2019-10-31
IL247273B (en) 2021-02-28
LT3126395T (lt) 2019-10-10
CL2016002455A1 (es) 2017-08-11
CA2939852A1 (en) 2015-10-08
HRP20191704T1 (hr) 2019-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210309730A1 (en) Multispecific antibodies
US8796424B2 (en) Tri- or tetraspecific antibodies
JP5689118B2 (ja) 二重特異性四価抗原結合タンパク質
JP5689463B2 (ja) 二重特異性抗原結合タンパク質
WO2013164325A1 (en) Multispecific antigen binding proteins