EA036292B1 - Способ получения мультиспецифического антитела, экспрессионный вектор и фармацевтическая композиция, содержащая это антитело - Google Patents

Способ получения мультиспецифического антитела, экспрессионный вектор и фармацевтическая композиция, содержащая это антитело Download PDF

Info

Publication number
EA036292B1
EA036292B1 EA201691991A EA201691991A EA036292B1 EA 036292 B1 EA036292 B1 EA 036292B1 EA 201691991 A EA201691991 A EA 201691991A EA 201691991 A EA201691991 A EA 201691991A EA 036292 B1 EA036292 B1 EA 036292B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
antibody
heavy chain
domain
antibodies
Prior art date
Application number
EA201691991A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201691991A1 (ru
Inventor
Вольфганг Шефер
Кристиан Клайн
Забине Имхоф-Юнг
Штефан Клостерманн
Михаэль Мольхой
Йёрг Томас Регула
Original Assignee
Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53724278&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA036292(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of EA201691991A1 publication Critical patent/EA201691991A1/ru
Publication of EA036292B1 publication Critical patent/EA036292B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

В изобретении описаны способ получения мультиспецифического антитела, экспрессионный вектор, содержащий молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей этого антитела, и фармацевтическая композиция, содержащая это антитело.

Description

Настоящее изобретение относится к способу получения мультиспецифического антитела.
Предпосылки создания изобретения
В данной области известны сконструированные белки, такие как би- или мультиспецифические антитела, которые могут связываться с двумя или большим количеством антигенов. Указанные мультиспецифические связывающие белки можно создавать с использованием методов клеточного слияния, химической конъюгации или рекомбинантной ДНК.
В последние годы создано широкое разнообразие форматов рекомбинантных мультиспецифических антител, например четырехвалентные биспецифические антитела, полученные путем слияния, например, антитела IgG-формата и одноцепочечных доменов (см., например, Coloma M.J. et al., Nature Biotech 15, 1997, p. 159-163; WO 01/077342 и Morrison S.L., Nature Biotech 25, 2007, p. 1233-1234).
Разработано также несколько других новых форматов, в которых уже не сохранялась основная структура антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), таких как димерные (диабоди), тримерные (триабоди) или тетрамерные (тетрабоди) антитела, мини-антитела, несколько одноцепочечных форматов (scFv, бисscFv), которые могут связываться с двумя или большим количеством антигенов (Holliger Р. et al., Nature Biotech. 23, 2005, p. 1126-1136; Fischer N., Leger O., Pathobiology, 74, 2007, p. 3-14; Shen J et al., Journal of Immunological Methods 318, 2007, p. 65-74; Wu С. et al., Nature Biotech. 25, 2007, p. 1290-1297).
Во всех указанных форматах используют линкеры либо для слияния основной структуры антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) с дополнительным связывающим белком (например, scFv), либо для слияния, например, двух Fab-фрагментов или scFv (Fischer N., Leger O., Pathobiology, 74, 2007, p. 3-14). Хотя очевидно, что линкеры дают преимущества при создании биспецифических антител, с ними могут быть связаны также проблемы терапевтического плана. Фактически эти чужеродные пептиды могут вызывать иммунный ответ против самого линкера или области стыка между белком и линкером. Кроме того, гибкая природа этих пептидов делает их более чувствительными к протеолитическому расщеплению, что может приводить к неудовлетворительной стабильности, агрегации и повышенной иммуногенности антитела. Кроме того, может существовать необходимость в поддержании эффекторных функций, таких, например, как комплементзависимая цитотоксичность (CDC) или антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), которые опосредуются Fc-областью, путем сохранения высокой степени сходства с встречающимися в естественных условиях антителами.
Таким образом, в идеальном варианте необходимо создавать биспецифические антитела, структура которых очень сходна с общей структурой встречающихся в естественных условиях антител (типа IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) и имеет минимальное отклонение от человеческих последовательностей.
В соответствии с одним из подходов биспецифические антитела с высокой степенью сходства со встречающимися в естественных условиях антителами создавали с помощью технологии квадром (квадрогибридом) (см. Milstein С. и Cuello А.С., Nature, 305, 1983, p. 537-540) на основе соматического слияния двух различных клеточных линий гибридом, которые экспрессируют мышиные моноклональные антитела с требуемыми для биспецифического антитела специфичностями. В результате случайного спаривания тяжелых и легких цепей двух различных антител в образующейся линии клеток гибридагибридомы (или квадромы) получают вплоть до 10 различных видов антител, из которых только одно представляет собой требуемое функциональное биспецифическое антитело. Из-за присутствия полученных в результате ошибочного спаривания побочных продуктов и в значительной степени сниженного выхода продукта требуются более сложные процедуры очистки (см., например, Morrison S.L., Nature Biotech 25, 2007, p. 1233-1234). В целом, эта же проблема, связанная с ошибочно спаренными побочными продуктами, сохраняется и при применении методов рекомбинантной экспрессии.
Подход, с помощью которого можно обойти проблему, связанную с полученными в результате ошибочных спариваний побочными продуктами, известный под названием технология knobs-into-holes (взаимодействие по типу выступ-впадина), направлен на усиление спаривания тяжелых цепей двух различных антител путем интродукции мутаций в CH3 -домены для модификации поверхности раздела в области контакта. На одной цепи имеющие большие размеры аминокислоты заменяли на аминокислоты с короткими боковыми цепями для создания впадины. И, наоборот, аминокислоты с более крупными боковыми цепями интродуцировали в другой ОИ3-домен, создавая выступ. Путем совместной экспрессии этих двух тяжелых цепей (и двух идентичных легких цепей, которые должны соответствовать обеим тяжелым цепям) достигали высоких выходов гетеродимерной конструкции (выступ-впадина) относительно гомодимерной конструкции (впадина-впадина или выступ-выступ) (Ridgway J. В. et al., Protein Eng. 9, 1996, p. 617-621; и WO 1996/027011). Процентное содержание гетеродимера можно дополнительно повышать путем ремоделирования поверхностей раздела двух CH3-доменов с помощью технологии фагового дисплея и интродукции дисульфидного мостика с целью стабилизации гетеродимеров (Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16, 1998, p. 677-681; Atwell S., Ridgway J.B., Wells J.A., Carter P., J. Mol. Biol. 270, 1997, p. 26-35). Новые подходы к технологии knobs-into-holes описаны, например, в ЕР 1870459 А1. Хотя указанный формат, по-видимому, является очень привлекательным, в настоящее время отсутствуют данные о его усовершенствовании в направлении клинического применения. Одним из важных ограничений этой стратегии является то, что легкие цепи двух родительских антител должны быть идентичными для предупреждения ошибочного спаривания и формирования неактивных молекул.
- 1 036292
Таким образом, эта технология не пригодна в качестве основы для более легкого создания рекомбинантных три- или тетраспецифических антител к трем или четырем антигенам с использованием в качестве исходных двух антител к первому и второму антигену, поскольку сначала должны быть оптимизированы или тяжелые цепи этих антител, и/или идентичные легкие цепи, а затем добавлены дополнительные антигенсвязывающие пептиды против третьего и четвертого антигена.
В WO 2006/093794 описаны композиции гетеродимерных связывающих белков. В WO 99/37791 описаны многоцелевые производные антител. У Morrison et al., J. Immunolog, 160, 1998, p. 2802-2808 описано влияние замены вариабельных областей на функциональные свойства IgG.
В WO 2013/02362 описаны гетеродимеризованные полипептиды. В WO 2013/12733 описаны полипептиды, которые содержат гетеродимерные Fc-области. В WO 2012/131555 описаны сконструированные гетеродимерные иммуноглобулины. В EP 2647707 описаны сконструированные гетеродимерные иммуноглобулины.
В WO 2013/026835 описаны биспецифические не содержащие Fc-области антитела с кроссовером доменов. В WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 и у Schaefer W. et al., PNAS, 108, 2011, p. 11187-1191 описаны биспецифические антитела IgG-типа с кроссовером доменов.
Установлено, что для мультиспецифических антител с заменой/обменом VH/VL в одной связывающей области для предупреждения ошибочного спаривания легких цепей (CrossMabVII-VI'). которые описаны в WO 2009/080252 (см. также Schaefer W. et al., PNAS, 108, 2011, p. 11187-1191), характерно выраженное снижение содержания побочных продуктов, полученных в результате ошибочного спаривания легких цепей антитела к первому антигену с неправильной тяжелой цепью антитела ко второму антигену (по сравнению с подходами, в которых не использовали указанный обмен доменов). Однако их получение не полностью исключает образование побочных продуктов. Основной побочный продукт является результатом взаимодействия бенс-джонсовского типа - см. также Schaefer W. et al., PNAS, 108, 2011, p. 11187-1191; на фиг. S1I дополнения).
Таким образом, все еще существует потребность в дополнительном снижении указанных побочных продуктов с целью повышения, например, выхода указанных биспецифических антител.
Краткое изложение сущности изобретения
Изобретение относится к способу получения мультиспецифического антитела, заключающемуся в том, что осуществляют стадии, на которых:
А) трансформируют клетку-хозяина векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие:
а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь первого антитела, которое специфически связывается с первым антигеном; и
б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь второго антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, в котором вариабельные домены VL и VH во второй легкой цепи и второй тяжелой цепи второго антитела заменены друг на друга; и в котором:
I) в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) (в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения независимо на лизин (K) или аргинин (R)) и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота); или
II) в константном домене CL второй легкой цепи, указанной в подпункте б), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) (в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения независимо на лизин (K) или аргинин (R)) и в котором в константном домене CH1 второй тяжелой цепи, указанной в подпункте б), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота);
Б) культивируют клетку-хозяина в условиях, обеспечивающих синтез указанной молекулы антитела; и
В) выделяют указанную молекулу антитела из указанной культуры.
Другим вариантом осуществления изобретения является способ, в котором у указанной молекулы антитела в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K) или аргинин (R) (нумерация согласно Кэботу) и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в (а), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Другим вариантом осуществления изобретения является способ, в котором у указанной молекулы антитела в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в (а), аминокислота в поло- 2 036292 жении 147 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Другим вариантом осуществления изобретения является способ, в котором у указанной молекулы антитела в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) (в одном предпочтительном варианте независимо на лизин (K) или аргинин (R)), и дополнительно аминокислота в положении 123 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в (а), аминокислота в положении 147 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота) и аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Другим вариантом осуществления изобретения является способ, в котором у указанной молекулы антитела в константном домене CL второй легкой цепи, указанной в подпункте б), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) (в одном предпочтительном варианте независимо на лизин (K) или аргинин (R)) и в котором в константном домене CH1 второй тяжелой цепи, указанной в б), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Другим вариантом осуществления изобретения является способ, в котором в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена на лизин (K) (нумерация согласно Кэботу), и дополнительно аминокислота в положении 123 заменена на лизин (K) (нумерация согласно Кэботу) и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в (а), аминокислота в положении 147 заменена на глутаминовую кислоту (E) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота), и аминокислота в положении 213 заменена на глутаминовую кислоту (E) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Другим вариантом осуществления изобретения является способ, отличающийся тем, что первый CH3 домен первой тяжелой цепи антитела, указанной в (а), и второй CH3 домен второй тяжелой цепи антитела, указанной в (b), каждый соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая включает исходную поверхность раздела между CH3 доменами антитела, где указанная поверхность раздела изменена для стимулирования формирования мультиспецифического антитела, где изменение отличается тем, что:
I) CH3-домен одной тяжелой цепи изменен так, что на исходной поверхности раздела CH3-домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела CH3-домена другой тяжелой цепи в мультиспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, с образованием в результате этого выпуклости на поверхности раздела CH3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость в поверхности раздела CH3-домена другой тяжелой цепи, и
II) CH3-домен другой тяжелой цепи изменен так, что на исходной поверхности раздела CH3-домена другой тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела CH3-домена одной тяжелой цепи в мультиспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, с образованием в результате этого полости в поверхности раздела CH3-домена другой тяжелой цепи, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела CH3-домена одной тяжелой цепи.
Другим вариантом осуществления изобретения является способ, отличающийся тем, что указанный аминокислотный остаток, имеющий большую по объему боковую цепь, выбран из группы, включающей аргинин (R), фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W); и указанный аминокислотный остаток, имеющий меньшую по объему боковую цепь, выбран из группы, состоящей из аланина (А), серина (S), треонина (T) и валина (V).
Другим вариантом осуществления изобретения является способ, отличающийся тем, что оба CH3домена дополнительно изменены путем интродукции цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующие положения каждого CH3-домена таким образом, чтобы мог образоваться дисульфидный мостик между обоими CH3-доменами.
Следующим объектом данного изобретения является экспрессионный вектор, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей мультиспецифичного антитела.
Следующим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит антитело, полученное с помощью предложенного способа, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
- 3 036292
Описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - некоторые примеры мультиспецифических антител, предлагаемых в изобретении, с обменом VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфическими мутациями в одной поверхности раздела CH1/CL-доменов:
по меньшей мере аминокислота в положении 124 CL-домена заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) и по меньшей мере аминокислота в положении 147 СШ-домена или аминокислота в положении 213 СШ-домена заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота);
на фиг. 1А - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела СШ/Ск-доменов в другом связывающем плече антитела;
на фиг. 1Б - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела СШ/СЬ-доменов в этом же связывающем плече антитела;
на фиг. 1В - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела СН1/СЬ-доменов в другом связывающем плече антитела и модификации поверхности раздела СНЗ/СНЗ-доменов для усиления гетеродимеризации тяжелых цепей (например, с применением технологии типа knobs-into-holes или в альтернативном варианте технологий гетеродимеризации типа, например замены заряженных аминокислот на соответствующие аминокислоты с противоположным зарядом);
на фиг. 2А - пример мультиспецифического антитела с обменом VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и без специфических мутаций ни в одной из поверхностей раздела CH1/CLдоменов (слева) и основного побочного продукта указанного мультиспецифического антитела (образовавшегося в результате взаимодействия бенс-джонсовского типа доменов VL-VL) - других возможных вариантов в качестве побочных продуктов не выявлено ни непосредственно с помощью массспектрометрии, ни с помощью масс-спектрометрии после расщепления плазмином или LysC путем анализа их Fab-фрагментов;
на фиг. 2Б - отличительная структура основного побочного продукта мультиспецифического антитела с заменой VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и без специфических мутаций ни в одной из поверхностей раздела СШ/СЕ-доменов (образовавшегося в результате взаимодействия бенс-джонсовского типа доменов VL-VL);
на фиг. ЗА - аминокислотные последовательности дикого типа (wt) СН1-домена (приведены два изотипа IgG), в которых подчеркнуты и выделены аминокислотные положения 147 и 213 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота);
на фиг. ЗБ - аминокислотные последовательности дикого типа (wt) СГ-домена каппа-изотипа, в которых подчеркнуты и выделены аминокислотные положения 124 и 123 (нумерация согласно Кэботу);
на фиг. ЗВ - аминокислотные последовательности дикого типа (wt) CL-домена лямбда-изотипа, в которых подчеркнуты и выделены аминокислотные положения 124 и 123 (нумерация согласно Кэботу);
на фиг. 4А - данные о снижении содержания основного побочного продукта, образовавшегося в результате взаимодействия бенс-джонсовского типа, с помощью единичных замен заряженных аминокислот, предлагаемых в изобретении, в поверхности раздела ΟΗ1/^.
Примеры мультиспецифических антител к Ang2-VEGF, предлагаемых в изобретении, с заменой/обменом VH/VL-доменов (OOssMAbV^VL).
Сравнение дикого типа (wt) и различных комбинаций единичных замен заряженных аминокислот;
1) мультиспецифическое антитело дикого типа (wt) к Ang2-VEGF типа CrossMAbVH-VL без специфических аминокислотных замен в поверхности раздела CH1/CL,
2) мультиспецифические антитела к Ang2-VEGF, предлагаемые в изобретении, I) с заменами в положении 124 CL-домена и в положении 147 СН1-домена (нумерация согласно EU-индексу Кэбота) или II) с заменами в положении 124 CL-домена и в положении 213 СН1-домена (нумерация согласно EU-индексу Кэбота),
3) другие мультиспецифические антитела к Ang2-VEGF типа CrossMAbVH-VL с заменами в различных положениях;
на фиг. 4Б - последовательности (SEQ ID NO:) мультиспецифических антител, результаты для которых представлены на фиг. 4А;
На фиг. 5А - данные о снижении содержания основного побочного продукта, образовавшегося в результате взаимодействия бенс-джонсовского типа, с помощью различных замен заряженных аминокислот, предлагаемых в изобретении, в поверхности раздела ^1/^.
Примеры мультиспецифических антител к Ang2-VEGF, предлагаемых в изобретении, с заменой/обменом VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL).
Сравнение дикого типа (wt) и различных комбинаций замен заряженных аминокислот:
на фиг. 5Б - последовательности (SEQ ID NO:) мультиспецифических антител, результаты для которых представлены на фиг. 5А;
- 4 036292 на фиг. 6А - данные о снижении содержания основного побочного продукта, образовавшегося в результате взаимодействия бенс-джонсовского типа, с помощью различных замен заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
Примеры мультиспецифических антител к IL-17/TWEAK, предлагаемых в изобретении, с заменой/обменом VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL).
Сравнение дикого типа (wt) и различных комбинаций замен заряженных аминокислот;
на фиг. 6Б - последовательности (SEQ ID NO:) мультиспецифических антител, результаты для которых представлены на фиг. 6А;
на фиг. 7 - некоторые примеры двухвалентных мультиспецифических антител, предлагаемых в изобретении, с обменом VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфическими мутациями в одной поверхности раздела CH1/CL-доменов, в приведенных в качестве примера мультиспецифических антителах отсутствует Fc-фрагмент (формат Fab-CrossFabVH-VL и CrossFabVH-VL-Fab):
по меньшей мере одна аминокислота в положении 124 CL-домена заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) и по меньшей мере аминокислота в положении 147 CH1-домена или аминокислота в положении 213 CH1-домена заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота);
на фиг. 7А - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела CH1/CL-доменов в другом связывающем плече антитела;
на фиг. 7Б - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела CH1/CL-доменов в этом же связывающем плече антитела;
на фиг. 7В - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела CH1/CL-доменов в этом же связывающем плече антитела; и дополнительные специфические мутации в поверхности раздела CH 1/ОЕ-доменов в другом связывающем плече антитела;
на фиг. 7Г - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела CH1/CL-доменов в другом связывающем плече антитела;
на фиг. 8 - некоторые примеры трехвалентных мультиспецифических антител, предлагаемых в изобретении, с обменом VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфическими мутациями в одной поверхности раздела CH1/CL-доменов, в приведенных в качестве примера мультиспецифических антителах отсутствует Fc-фрагмент (формат Fab-Fab-CrossFabVH-VL):
по меньшей мере аминокислота в положении 124 CL-домена заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) и по меньшей мере аминокислота в положении 147 CH1-домена или аминокислота в положении 213 CH1-домена заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота);
на фиг. 8А-8В - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела CH1/CL-доменов в других связывающих плечах антитела;
на фиг. 8Г - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела CH1/CL-доменов в этом же связывающем плече антитела;
на фиг. 8Д - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела CH1/CL-доменов в этом же связывающем плече антитела; и дополнительные специфические мутации в поверхности раздела CH1/CL-доменов в других связывающих плечах антитела;
на фиг. 9 - некоторые примеры четырехвалентных мультиспецифических антител, предлагаемых в изобретении, с обменом VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфическими мутациями в одной поверхности раздела CH1/CL-доменов, в приведенных в качестве примера мультиспецифических антителах отсутствует Fc-фрагмент (формат (Fab-Fab-CrossFabVH-VL):
по меньшей мере аминокислота в положении 124 CL-домена заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) и по меньшей мере аминокислота в положении 147 CH1-домена или аминокислота в положении 213 CH1-домена заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота);
на фиг. 9А - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела CH1/CL-доменов в других связывающих плечах антитела;
на фиг. 9Б - обмен VH/VL-доменов в одном из связывающих плечей антитела и специфические мутации в поверхности раздела CH1/CL-доменов в этом же связывающем плече антитела.
- 5 036292
Подробное описание изобретения
Мультиспецифические антитела с обменом/заменой доменов в одном связывающем плече (CrossMabVH-VL) подробно описаны в WO 2009/080252 и у Schaefer W. et al., PNAS, 108, 2011, p. 11187-1191 (которые включены в настоящее описание в качестве ссылки). Для них четко установлено снижение содержания побочных продуктов, полученных в результате ошибочного спаривания легких цепей антитела к первому антигену с неправильной тяжелой цепью антитела ко второму антигену (по сравнению с подходами, в которых не использовали указанный обмен доменов). Однако их получение не полностью исключает образование побочных продуктов. Основной побочный продукт является результатом взаимодействия бенс-джонсовского типа - см. также Schaefer W. et al., PNAS, 108, 2011, p. 11187-1191; на фиг. S1I дополнения).
Таким образом, при создании изобретения разработан новый способ для дополнительного снижения содержания указанных побочных продуктов для повышения выхода указанных мультиспецифических антител (т.е. мультиспецифических антител, которые содержат обмен/замену VH/VL-доменов только в связывающем (их) плече(ах) одной антигенной специфичности, в то время как связывающее(ие) плечо(и) другой антигенной специфичности не содержат обмен/замену VH/VL-доменов, но обычно имеют соответствующее дикому типу строение доменов, указанное на фиг. 1, в результате интродукции замен заряженных аминокислот на аминокислоты с противоположным зарядом в специфические аминокислотные положения в CH1- и CL-доменах.
Таким образом, изобретение относится к способу получения мультиспецифического антитела, которое содержит:
а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь первого антитела, которое специфически связывается с первым антигеном; и
б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь второго антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, и в котором вариабельные домены VL и VH во второй легкой цепи и второй тяжелой цепи второго антитела замены друг на друга; и в котором:
I) в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 (нумерация согласно Кэботу) заменена на положительно заряженную аминокислоту и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота) заменена на отрицательно заряженную аминокислоту; или
II) в константном домене CL второй легкой цепи, указанной в подпункте б), аминокислота в положении 124 (нумерация согласно Кэботу) заменена на положительно заряженную аминокислоту и в котором в константном домене CH1 второй тяжелой цепи, указанной в подпункте б), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота) заменена на отрицательно заряженную аминокислоту.
Согласно концепции изобретения способ получения антитела, предлагаемый в изобретении, включает только одну из модификаций антитела, указанных в подпунктах I) и II) выше и ниже. Таким образом, способ получения мультиспецифического антитела, предлагаемый в изобретении, позволяет получить антитело, у которого либо
I) в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), замену аминокислоты в положении 124 (нумерация согласно Кэботу) на положительно заряженную аминокислоту и в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в подпункте а), замену аминокислоты в положении 147 или аминокислоты в положении 213 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота) на отрицательно заряженную аминокислоту; либо
II) в константном домене CL второй легкой цепи, указанной в подпункте б), замену аминокислоты в положении 124 (нумерация согласно Кэботу) на положительно заряженную аминокислоту и в константном домене CH1 второй тяжелой цепи, указанной в подпункте б), замену аминокислоты в положении 147 или аминокислоты в положении 213 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота) на отрицательно заряженную аминокислоту, при условии, что мультиспецифическое антитело не содержит обе модификации, указанные в подпунктах I) и II).
Таким образом, изобретение относится к способу получения мультиспецифического антитела, содержащего:
а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь первого антитела, которое специфически связывается с первым антигеном; и
б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь второго антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном и в котором вариабельные домены VL и VH во второй легкой цепи и второй тяжелой цепи второго антитела заменены друг на друга; и в котором:
I) в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) (в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения независимо на лизин (K) или арги-
- 6 036292 нин (R)) и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота); или
II) в константном домене CL второй легкой цепи, указанной в подпункте б), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) (в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения независимо на лизин (K) или аргинин (R)) и в котором в константном домене CH1 второй тяжелой цепи, указанной в подпункте б), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Кроме того, предложенным способом возможно получение мультиспецифического антитела, содержащего:
а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь первого антитела, которое специфически связывается с первым антигеном; и
б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь второго антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном и в котором вариабельные домены VL и VH во второй легкой цепи и второй тяжелой цепи второго антитела заменены друг на друга; и в котором:
I) в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 (нумерация согласно Кэботу) заменена на положительно заряженную аминокислоту и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота) заменена на отрицательно заряженную аминокислоту.
В альтернативном варианте осуществления изобретения относится к способу получения мультиспецифического антитела, содержащего:
а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь первого антитела, которое специфически связывается с первым антигеном; и
б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь второго антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, и в котором вариабельные домены VL и VH во второй легкой цепи и второй тяжелой цепи второго антитела заменены друг на друга; и в котором:
I) в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) (в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения независимо на лизин (K) или аргинин (R)) и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Таким образом, указанное второе антитело, специфически связывающееся со вторым антигеном, которое входит в состав мультиспецифического антитела, получаемого предложенным способом, удовлетворяет следующим условиям:
в легкой цепи вариабельный домен легкой цепи VL заменен на вариабельный домен тяжелой цепи VH указанного антитела, и в тяжелой цепи вариабельный домен тяжелой цепи VH заменен на вариабельный домен легкой цепи VL указанного антитела, и константные домены CL и CH1 во второй легкой цепи и второй тяжелой цепи второго антитела не заменены друг на друга (остаются не обменёнными).
А антитело, специфически связывающееся с первым антигеном, которое входит в состав мультиспецифического антитела, получаемого описанным способом, удовлетворяет следующим условиям:
в указанной первой легкой цепи, происходящей из указанного первого антитела, последовательное расположение доменов легкой цепи (CL-VL) остается неизмененным и в указанной первой тяжелой цепи, происходящей из указанного первого антитела, последовательное расположение доменов тяжелой цепи (например, CH1-VH или CH3-CH2-CH1-VH) остается неизмененным (таким образом, указанное антитело, которое специфически связывается с первым антителом, не включает обмен доменов, прежде всего обмен VH/VL).
Другими словами, указанное антитело, специфически связывающееся с первым антигеном, которое входит в состав мультиспецифического антитела, может содержать:
первую легкую цепь, происходящую из указанного первого антитела, которая содержит последовательное расположение доменов легкой цепи VL-CL (в направлении от N-конца к С-концу); и первую тяжелую цепь, происходящую из указанного первого антитела, которая содержит последовательное расположение доменов тяжелой цепи CH1-VH (в направлении от N-конца к С-концу) (а также первая тяжелая цепь может содержать последовательное расположение доменов тяжелой цепи CH3-CH2CH1-VH в направлении от N-конца к С-концу.
- 7 036292
В контексте настоящего описания легкая цепь антитела означает полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (CL) антитела, сокращенно VL-CL.
В контексте настоящего описания тяжелая цепь антитела означает полипептид, содержащий в направлении от N-конца к С-концу вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела и константный домен 1 тяжелой цепи (CH1) антитела.
Мультиспецифическое антитело, тяжелая цепь может также включать в направлении от N-конца к С-концу вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела и константный домен 1 тяжелой цепи (CH1) антитела и в нем отсутствуют константные домены СН2 и CH3, поэтому его сокращенно обозначают как VH-CH1. Кроме того, мультиспецифическое антитело, может содержать по меньшей мере два Fabфрагмента, при этом первый Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфический для первого антигена, а второй Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфический для второго антигена, в котором во втором Fab-фрагменте вариабельные домены VL и VH во второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга; и у мультиспецического антитела отсутствует Fc-домен: и в котором:
I) в константном домене CL легкой цепи первого Fab-фрагмента аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) или независимо на лизин (K) или аргинин (R)) и в котором в константном домене CH1 тяжелой цепи первого Fabфрагмента аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота); или
II) в константном домене CL легкой цепи второго Fab-фрагмента аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) (в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения независимо на лизин (K) или аргинин (R)) и в котором в константном домене CH1 тяжелой цепи второго Fab-фрагмента аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Мультиспецифическое антитело может также содержать по меньшей мере два Fab-фрагмента, при этом первый Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, специфический для первого антигена, а второй Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, специфический для второго антигена, в котором во втором Fab-фрагменте вариабельные домены VL и VH во второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга; и где у мультиспецического антитела отсутствует Fc-домен; и в котором:
I) в константном домене CL легкой цепи первого Fab-фрагмента аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу или независимо на лизин (K) или аргинин (R)) и в котором в константном домене CH1 тяжелой цепи первого Fabфрагмента аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 может быть заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В контексте настоящего описания понятие Fab-фрагмент относится к фрагменту антитела, который содержит фрагмент легкой цепи, содержащий вариабельный VL-домен и константный домен легкой цепи (CL), и вариабельный VH-домен и первый константный домен тяжелой цепи (CH1). Кроме того, мультиспецифические антитела могут содержать по меньшей мере два Fab-фрагмента, при этом вариабельные области тяжелой и легкой цепей второго Fab-фрагмента обменены. Из-за обмена вариабельных областей указанный второй Fab-фрагмент обозначают также как Кросс-Fab-фрαгмент или xFabфрагмент или КроссоВер-Fab-фрагмент. В указанном втором Fab-фрагменте, в котором вариабельные области тяжелой и легкой цепей Fab обменены, молекула кроссовер-Fab содержит модифицированную тяжелую цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области тяжелой цепи (CH1), и модифицированную легкую цепь, состоящую из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области легкой цепи (CL). Указанную молекулу кроссовер-Fab обозначают также как CrossFabVH/VL
В контексте настоящего описания понятие Fc-домен применяют для определения С-концевой области тяжелой цепи антитела, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Например, во встречающихся в естественных условиях антителах Fc-домен состоит из двух идентичных белковых фрагментов, происходящих из второго и третьего константных доменов двух тяжелых цепей антитела изотипов IgG, IgA и IgD; Fc-домены IgM и IgE содержат три константных домена тяжелой цепи (СНдомены 2-4) в каждой полипептидной цепи. В контексте настоящего описания отсутствует Fc-домен означает, что биспецифические антитела могут не содержать СН2-, CH3- и СН4-домены; т.е. константная тяжелая цепь состоит только из одного или нескольких СН1-доменов.
Первый и второй Fab-фрагменты соединены через пептидный линкер. В контексте настоящего описания пептидный линкер обозначает пептид с аминокислотными последовательностями, которые предпочтительно имеют синтетическое происхождение. Пептидный линкер можно применять для соединения
- 8 036292 одного из Fab-фрагментов с С- или N-концом другого Fab-фрагмента для получения мультиспецифического антитела. Причем указанный пептидный линкер может представлять собой пептид с аминокислотной последовательностью, состоящей по меньшей мере из 5 аминокислот или из 5-100, еще в одном варианте осуществления изобретения из 10-50 аминокислот. Указанный пептидный линкер может представлять собой (GxS)n или (GxS)nGm, где G обозначает глицин, S обозначает серин и x=3, n=3, 4, 5 или 6 и m=0, 1, 2 или 3, или х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3, или x=4 и n=2 или 3, или x=4 и n=2. Указанный пептидный линкер представляет собой (G4S)2. Пептидный линкер применяют для соединения первого и второго Fab-фрагментов. Первый Fab-фрагмент можно соединить с С- или N-концом второго Fabфрагмента.
Тяжелая цепь антитела может содержать в направлении от N-конца к С-концу вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела, константный домен 1 тяжелой цепи (CH1) антитела, константный домен 2 тяжелой цепи (СН2) и константный домен 3 тяжелой цепи (CH3), сокращенно VH-CH1-CH2-CH3.
В случае мультиспецифического антитела, которое содержит домены VH-CH1-CH2-CH3 в каждой тяжелой цепи, дополнительно можно повышать соотношение между требуемым мультиспецифическим антителом и нежелательными побочными продуктами путем модификаций первого и второго CH3доменов указанного мультиспецифического антитела для усиления гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих указанные первые и второй CH3-домены.
Известно несколько подходов для ОИ3-модификаций, направленных на усиление гетеродимеризации, которые описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291. Как правило, при осуществлении всех указанных подходов первый ОИ3-домен и второй ОИ3-домен, оба, конструируют комплементарным образом так, чтобы каждый ОИ3-домен (или содержащая его тяжелая цепь) не обладал большей способностью к самогомодимеризации, но обладал усиленной способностью к гетеродимеризации с комплементарным сконструированным другим ОИ3-доменом (в результате чего происходит гетеродимеризация первого и второго CH3-доменов и не образуются гомодимеры между двумя первыми или двумя вторыми CH3доменами). Указанные различные подходы повышения гетеродимеризации тяжелых цепей рассматриваются в качестве различных альтернатив в комбинации с модификациями тяжелых-легких цепей (обмен/замена VH и VL в одном связывающем плече и интродукция замен заряженных аминокислот на аминокислоты с противоположными зарядами в поверхность раздела CH1/CL) в мультиспецифических антителах, которые снижают ошибочное спаривание легких цепей и содержание побочных продуктов, образовавшихся в результате взаимодействия бенс-джонсовского типа.
Мультиспецифическое антитело, которое содержит CH3-домены в тяжелых цепях, указанные CH3можно изменять для поддержания гетеродимеризации путем замены по меньшей мере одной аминокислоты ОИ3-домена первой тяжелой цепи и замены по меньшей мере одной аминокислоты ОИ3-домена второй тяжелой цепи, где указанная аминокислота контактирует по меньшей мере с одной аминокислотой ОИ3-домена первой тяжелой цепи в третичной структуре мультиспецифического антитела, при этом соответствующие аминокислоты в CH3 -доменах первой и второй тяжелой цепей соответственно либо заменяют таким образом, что аминокислоты с противоположными зарядами боковых цепей интродуцируют в противоположные тяжелые цепи, либо заменяют таким образом, что аминокислоты с большими или малыми объемами боковых цепей интродуцируют в противоположные тяжелые цепи, создавая тем самым выпуклость с помощью аминокислоты с большим объемом боковой цепи в одном ОИ3-домене, которая может помещаться в полость, образованную в другом ОИ3-домене, при этом полость создают с помощью аминокислоты с малым объемом боковой цепи.
Мультиспецифическое антитело, содержащее CH3-домены в тяжелых цепях мультиспецифического антитела, можно изменять с помощью технологии knob-into-hole, которая подробно описана на некоторых примерах, например, в WO 96/027011, у Ridgway J.B. et al., Protein Eng. 9, 1996, p. 617-621 и у Merchant A.M. et al., Nat Biotechnol. 16, 1998, p. 677-681 и в WO 98/050431. При использовании этого метода взаимодействующие поверхности двух CH3-доменов изменяют с целью повышения уровня гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих эти два ОИ3-домена. Каждый из двух CH3-доменов (двух тяжелых цепей) может представлять собой выступ, а другой представлять собой впадину. Введение дисульфидного мостика дополнительно стабилизирует гетеродимеры (Merchant A.M., et al., Nature Biotech .16, 1998, p. 677-681; Atwell S. et al., J. Mol. Biol. 270, 1997, p. 26-35) и повышает выход продукта.
Таким образом, мультиспецифическое антитело, которое содержит ОИ3-домен в каждой тяжелой цепи и дополнительно отличается тем, что первый CH3 -домен первой тяжелой цепи антитела, указанной в подпункте а), и второй ОИ3-домен в одной тяжелой цепи антитела, указанной в подпункте б), каждый соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между ОИ3-доменами антитела, при этом указанная поверхность раздела изменена для стимулирования формирования мультиспецифического антитела, где изменение отличается тем, что:
- 9 036292
I) СНЗ-домен одной тяжелой цепи изменен так, что на исходной поверхности раздела СНЗ-домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела CH3-домена другой тяжелой цепи в мультиспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, с образованием в результате этого выпуклости на поверхности раздела CH3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость в поверхности раздела CH3-домена другой тяжелой цепи; и
II) CH3-домен другой тяжелой цепи изменен так, что на исходной поверхности раздела CH3-домена другой тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела CH3-домена одной тяжелой цепи в мультиспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, с образованием в результате этого полости в поверхности раздела CH3-домена другой тяжелой цепи, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела CH3-домена одной тяжелой цепи.
Мультиспецифическое антитело, аминокислотный остаток которого имеет большую по объему боковую цепь, выбирают из группы, включающей аргинин (R), фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W).
Аминокислотный остаток мультиспецифического антитела должен иметь меньшую по объему боковую цепь, выбирают из группы, включающей аланин (A), серин (S), треонин (T) и валин (V).
Оба CH3-домена дополнительно можно изменять путем интродукции цистеина (C) в качестве аминокислоты в соответствующие положения каждого CH3-домена таким образом, чтобы мог образоваться дисульфидный мостик между обоими CH3-доменами. Таким образом, CH3-домен одной тяжелой цепи дополнительно можно изменять так, чтобы в исходной поверхности раздела CH3 -домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела CH3-домена другой тяжелой цепи в мультиспецифическом антителе, аминокислотный остаток был заменен на остаток цистеина (С), а CH3-домен другой тяжелой цепи дополнительно изменяют так, чтобы в исходной поверхности раздела CH3-домена другой тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела СНЗ-домена одной тяжелой цепи в мультиспецифическом антителе, аминокислотный остаток был заменен на остаток цистеина (С) таким образом, чтобы в результате интродукции остатков цистеина мог образоваться дисульфидный мостик между обоими СНЗ-доменами.
Мультиспецифическое антитело может содержать аминокислотную мутацию T366W в СНЗ-домене, имеющим выступ цепи, и аминокислотные мутации T366S, L368A, Y407V в ОИЗ-домене, имеющим впадину цепи. Можно применять также дополнительный связывающий цепи дисульфидный мостик между СНЗ-доменами (Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16, 1998, p. 677-681), например, путем интродукции аминокислотной мутации Y349C в СНЗ-домен, имеющий впадину цепи, и аминокислотной мутации Е356С или аминокислотной мутации S354C в СНЗ-домене, имеющим выступы цепи.
Мультиспецифическое антитело (которое содержит СНЗ-домен в каждой тяжелой цепи) также может содержать аминокислотные мутации S354C и T366W в одном СНЗ-домене и аминокислотные мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V в другом из двух СНЗ-доменов (с дополнительной аминокислотной мутацией S354C в одном СНЗ-домене и дополнительной аминокислотной мутацией Y349C в другом СНЗ-домене, что приводит к образованию дисульфидного мостика между цепями) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
СНЗ-модификации, предназначенные для усиления гетеродимеризации описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/0504З1, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129З04, WO 2011/90754, WO 2011/14З545, WO 2012/058768, WO 201З/157954 и WO 201З/096291.
Подход к гетеродимеризации, описанный в EP 1870459A1, также можно использовать. Этот подход базируется на интродукции замен/мутаций заряженных аминокислот на аминокислоты с противоположным зарядом в конкретные аминокислотные положения в поверхности раздела СНЗ/СНЗ-доменов между двумя тяжелыми цепями. В мультиспецифических антителах могут присутствовать аминокислотные мутации R409D и КЗ70Е в СНЗ-домене одной тяжелой цепи и аминокислотные мутации D399K и ЕЗ57К в СНЗ-домене другой тяжелой цепи (нумерации согласно EU-индексу Кэботу).
Мультиспецифическое антитело может содержать аминокислотную мутацию T366W в СНЗ-домене цепи с выступами и аминокислотные мутации T366S, L368A, Y407V в СНЗ-домене цепи с впадиной и дополнительно содержать аминокислотные мутации R409D и КЗ70Е в СНЗ-домене цепи с выступами и аминокислотные мутации D399K и ЕЗ57К в СНЗ-домене цепи с впадиной.
Мультиспецифическое антитело также может содержать аминокислотные мутации S354C и T366W в СНЗ-домене одной тяжелой цепи и аминокислотные мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V в СНЗдомене другой тяжелой цепи или указанное мультиспецифическое антитело может содержать мутации Y349C и T366W в СНЗ-домене одной тяжелой цепи и аминокислотные мутации S354C, T366S, L368A и Y407V в СНЗ-домене другой тяжелой цепи и дополнительно содержит аминокислотные мутации R409D и КЗ70Е в СНЗ-домене цепи с выступами и аминокислотные мутации D399K и ЕЗ57К в СНЗ-домене цепи с впадиной.
- 10 036292
Кроме того, можно использовать подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2013/157953. CH3домен одной тяжелой цепи может содержать аминокислотную мутацию Т366К, а CH3-домен другой тяжелой цепи содержит аминокислотную мутацию L351D. CH3-домен одной тяжелой цепи может содержать дополнительную аминокислотную мутацию L351K, а CH3-домен второй тяжелой цепи может содержать дополнительную аминокислотную мутацию, выбранную из Y349E, Y349D и L368E.
Также можно использовать подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2012/058768. CH3-домен одной тяжелой цепи может содержать аминокислотные мутации L351Y и Y407A, а CH3-домен другой тяжелой цепи может содержать аминокислотные мутации Т366А и K409F. CH3-домен другой тяжелой цепи может содержать дополнительную аминокислотную мутацию в положении Т411, D399, S400, F405, N390 или K392. Указанную аминокислотную мутацию можно выбрать из группы, состоящей из:
а) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, Т411Е и T411W,
б) D399R, D399W, D399Y и D399K,
в) S400E, S400D, S400R и S400K,
г) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V и F405W,
д) N390R, N390K и N390D,
e) K392V, К392М, K392R, K392L, K392F и К392Е.
CH3-домен одной тяжелой цепи может содержать аминокислотные мутации L351Y и Y407A, а CH3-домен другой тяжелой цепи содержит аминокислотные мутации T366V и K409F. CH3-домен одной тяжелой цепи может содержать аминокислотную мутацию Y407A, а CH3-домен другой тяжелой цепи содержит аминокислотные мутации Т366А и K409F. CH3-домен другой тяжелой цепи может дополнительно содержать аминокислотные мутации К392Е, Т411Е, D399R и S400R.
Также можно использовать подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2011/143545, или аминокислотную модификацию, описанную в WO 2011/143545, можно интродуцировать в CH3-домен тяжелой цепи в положение, выбранное из группы, состоящей из 368 и 409.
Кроме того, можно использовать также подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2011/090762, в котором применяют описанную выше технологию knob-into-hole. При этом CH3-домен одной тяжелой цепи может содержать аминокислотную мутацию T366W, а CH3-домен другой тяжелой цепи может содержать аминокислотную мутацию Y407A. CH3-домен одной тяжелой цепи может содержать аминокислотную мутацию T366Y, а CH3-домен другой тяжелой цепи может содержать аминокислотную мутацию Y407T.
Мультиспецифическое антитело может иметь IgG2-изотип, и в качестве альтернативы можно использовать подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2010/129304.
Также можно использовать подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2009/089004. CH3-домен одной тяжелой цепи может содержать аминокислотную замену K392 или N392 на отрицательно заряженную аминокислоту (глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D), в другом случае мутацию K392D или N392D), а CH3-домен другой тяжелой цепи может содержать аминокислотную замену D399, Е356, D356 или Е357 на положительно заряженную аминокислоту (лизин (K) или аргинин (R), в другом случае замену D399K, Е356К, D356K или Е357К, а также мутацию D399K или Е356К). CH3-домен одной тяжелой цепи может содержать также аминокислотную замену K409 или R409 на отрицательно заряженную аминокислоту (глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D), в другом случае мутацию K409D или R409D). CH3-домен одной тяжелой цепи в дополнительном или альтернативном варианте может содержать аминокислотную замену K439 и/или K370 на отрицательно заряженную аминокислоту (глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D)).
Можно также использовать подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2007/147901, CH3-домен одной тяжелой цепи может содержать аминокислотные мутации К253Е, D282K и K322D, а CH3-домен другой тяжелой цепи содержит аминокислотные мутации D239K, E240K и K292D.
Кроме того, можно использовать подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2007/110205.
В контексте настоящего описания понятия сайт связывания или антигенсвязывающий центр обозначают область(и) молекулы антитела, с которой(ыми) фактически связывается лиганд (например, антиген или фрагмент антигена) и который происходит из антитела. Антигенсвязывающий центр включает вариабельные домены тяжелой цепи антитела (VH) и/или вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) или пары VH/VL.
Антигенсвязывающие центры, обладающие способностью специфически связываться с требуемым антигеном, можно получать из а) известных антител к антигену или б) новых антител или фрагментов антител, полученных de novo с помощью методов иммунизации с использованием, среди прочего, либо антигенного белка, либо нуклеиновой кислоты или их фрагментов или с помощью метода фагового дисплея.
Антигенсвязывающий центр антитела может содержать шесть гипервариабельных участков (CDR), которые вносят различный вклад в аффинность сайта связывания с антигеном. Они представляют собой три вариабельных домена (CDR-участки) тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и три вариабельных домена (CDR-участки) легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3). Размер CDR и каркасных участков (FR) определяют путем сравнения с компилированной базой данных аминокислотных последовательностей, в
- 11 036292 которых такие участки были определены на основе вариабельности последовательностей. Функциональные антигенсвязывающие центры могут включать меньшее количество CDR (т.е. когда специфичность связывания определяется тремя, четырьмя или пятью CDR). Например, для связывания может быть достаточно меньшего количества CDR, чем полный набор из 6 CDR. В некоторых случаях может быть достаточно VH- или VL-домена.
Специфичность антитела характеризует избирательное распознавание антителом конкретного эпитопа антигена. Например, встречающиеся в естественных условиях антитела являются моноспецифическими. В контексте настоящего описания понятие моноспецифическое антитело обозначает антитело, которое имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.
Мультиспецифические антитела представляют собой биспецифические, три- или тетраспецифические антитела. Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые имеют две различные антигенсвязывающие специфичности. Соответственно триспецифические антитела представляют собой антитела, которые имеют три различные антигенсвязывающие специфичности. Тетраспецифические антитела представляют собой антитела, которые имеют четыре различные антигенсвязывающие специфичности. Если антитело имеет более одной специфичности, то распознаваемые эпитопы могут быть ассоциированы с одним антигеном или с несколькими антигенами.
В контексте настоящего описания понятие валентность означает наличие определенного количества сайтов связывания в молекуле антитела. Например, встречающееся в естественных условиях антитело имеет два сайта связывания и является двухвалентным. Соответственно понятие трехвалентный означает наличие трех сайтов связывания в молекуле антитела.
Антитела могут содержать константные области иммуноглобулина из одного или нескольких классов иммуноглобулинов. Классы иммуноглобулинов включают изотипы IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, а в случае IgG и IgA также их подтипы. Антитело может иметь структуру константного домена, которая соответствует структуре антитела IgG-типа.
В контексте настоящего описания понятия моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела относятся к препарату молекул антитела одинакового аминокислотного состава.
Понятие химерное антитело относится к антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, полученную из одного и того же источника или вида, и по меньшей мере часть константной области, полученную из другого источника или вида, и его, как правило, получают с использованием методов рекомбинантной ДНК. Предпочтительными являются химерные антитела, которые содержат мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Другими предпочтительными формами химерных антител, подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, константная область которых модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом с целью получения свойств прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания Fcрецептора (FcR). Такие химерные антитела обозначают так же, как антитела переключенного класса. Химерные антитела являются продуктом экспрессии генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, которые кодируют вариабельные области иммуноглобулинов, и сегменты ДНК, которые кодируют константные области иммуноглобулинов. Методы получения химерных антител включают обычные методы рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, которые хорошо известны в данной области (см., например, Morrison S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, p. 6851-6855; US 5202238 и US 5204244).
Понятие гуманизированное антитело относится к антителам, в которых каркасные или гипервариабельные участки (CDR) модифицированы так, что они содержат CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению со специфичностью родительского иммуноглобулина. Для получения гуманизированного антитела мышиный CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела (см., например, Riechmann L. et al., Nature, 332, 1988, p. 323-327; и Neuberger M.S. et al., Nature 314, 1985, p. 268-270). Другими формами гуманизированных антител вляются антитела, константная область которых дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом с целью получения свойств, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания Fc-рецептора (FcR).
Понятие человеческое антитело в контексте настоящего описания относится к антителам, вариабельные и константные области которых получены из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышей линии. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk M.A. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, p. 368-374). Человеческие антитела можно получать также в трансгенных животных (например, мышах), которые в результате иммунизации могут продуцировать полный спектр или определенную часть человеческих антител при отсутствии производства эндогенного иммуноглобулина. Перенос набора генов иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии в такую мутантную мышиную зародышевую линию должен приводить к производству человеческих антител после антигенной стимуляции (см., например, Jakobovits А., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, p. 2551-2555; Jakobovits А. et al., Nature 362, 1993, p. 255-258; Bruggemann M. et al., Year Immunol. 7, 1993, p. 33-40). Человеческие антитела можно получать также с помощью фаговых дисплейных библиотек (Hoogenboom H.R. и Winter G., J. Mol. Biol. 227, 1992, p. 381-388; Marks J.D. et al., J. Mol. Biol. 222,
- 12 036292
1991, p. 581-597). Для получения человеческих моноклональных антител можно использовать также методы, разработанные Cole с соавторами и Boerner с соавторами (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, под ред. Alan R. Liss, 1985, p. 77; и Boerner P. et al., J. Immunol. 147, 1991, p. 86-95). Как уже было отмечено для химерных и гуманизированных антител, понятие человеческое антитело включает также такие антитела, константная область которых модифицирована с целью получения нужных свойств, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания FcR, например, путем переключения класса, т.е. замены или мутации Fc-областей (например, IgG1 на IgG4 и/или IgG1/IgG4-мутация).
Понятие рекомбинантное человеческое антитело в контексте настоящего описания относится ко всем человеческим антителам, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью методов рекомбинации, например к антителам, выделенным из клетки-хозяина, такой как NS0- или CHO-клетка, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным из-за присутствия человеческих генов иммуноглобулинов или антител, экспрессируемых с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектирована клетка-хозяин. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области, которые находятся в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, можно подвергать соматической гипермутации in vivo. Таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии и родственных им линий, могут не существовать в естественных условиях в спектре зародышевой линии человеческих антител in vivo.
Понятие вариабельный домен (вариабельный домен легкой цепи (VL), вариабельный домен тяжелой цепи (VH)) в контексте настоящего описания относится к областям каждой из пары легких и тяжелых цепей, которые участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельных человеческих легких и тяжелых цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются весьма консервативными, связанных тремя гипервариабельными участками (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки адоптированы к β-складчатой конформации, a CDR могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи сохраняют их трехмерную структуру с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из других цепей антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелых и легких цепей антитела играют особенно важную роль в специфичности связывания/аффинности антители поэтому являются дополнительным объектом изобретения.
Понятия гипервариабельный участок или антигенсвязывающий центр антитела в контексте настоящего описания относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывания антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из определяющих комплементарность участков или CDR. Каркасные или FR''-участки представляют собой участки вариабельной области, отличные от указанных в настоящем описании остатков гипервариабельного участка. Таким образом, легкие и тяжелые цепи антитела содержат в направлении от N- к С-концу участки FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR каждой цепи разделены аминокислотами указанного каркасного участка. В частности, CDR3 тяжелой цепи представляют собой участок, который вносит наибольший вклад в связывание с антигеном. CDR- и FR-участки определяют с помощью стандартной номенклатуры Кэбота (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-изд., изд-во Public Health
Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
В контексте настоящего описания понятия связывание, который специфически связывается с или специфическое связывание относятся к связыванию антитела с эпитопом антигена, что определяют путем анализа in vitro, предпочтительно с помощью анализа резонанса поверхностного плазмона (BIAcore®, фирма GE-Healthcare, Уппсала, Швеция) с использованием очищенного антигена дикого типа. Аффинность связывания характеризуют с помощью понятий ka (константа скорости ассоциации антитела при формировании комплекса антитело/антиген), kD (константа диссоциации) и KD (kD/ka). Наличие связывания или специфического связывания с означает, что аффинность связывания (KD) составляет 10-8 моль/л или менее или от 10-8 М до 10-13 моль/л. Так, мультиспецифическое антитело специфически связывается с каждым антигеном, в отношении которого оно обладает специфичностью, что характеризуется аффинностью связывания (KD), составляющей 10-8 моль/л или менее, в другом случае характеризуется аффинностью связывания (KD), составляющей от 10-8 до 10-13 моль/л. Мультиспецифическое антитело специфически связывается с его антигеном, что характеризуется аффинностью связывания (KD), составляющей от 10-9 до 10-13 моль/л.
Связывание антитела с FcyRIII можно оценивать с помощью BIAcore®-анализа (фирма GE-Healthcare, Уппсала, Швеция). Аффинность связывания определяют с помощью понятий ka (константа скорости ассоциации антитела при формировании комплекса антитело/антиген), kD (константа диссоциации) и KD (kD/ka).
Понятие эпитоп включает любую полипептидную детерминанту, обладающую способностью специфически связываться с антителом. Эпитопная детерминанта может включать химически активные
- 13 036292 поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорил или сульфонил, и они могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, с которой связывается антитело.
Антитело специфически связывается с антигеном, когда оно преимущественно распознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул.
Мультиспецифическое антитело отличается тем, что указанное антитело может относиться к подклассу человеческого IgG1 или подклассу человеческого IgG1 с мутациями L234A и L235A (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Мультиспецифическое антитело отличается тем, что указанное антитело может относиться к подклассу человеческого IgG2.
Мультиспецифическое антитело отличается тем, что указанное антитело может относиться к подклассу человеческого IgG3.
Мультиспецифическое антитело отличается тем, что указанное антитело может относиться к подклассу человеческого IgG4 или подклассу человеческого IgG4 с дополнительной мутацией S228P (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Мультиспецифическое антитело отличается тем, что оно может относиться к подклассу человеческого IgG1 или человеческому подклассу IgG4.
Мультиспецифическое антитело отличается тем, что оно может относиться к подклассу человеческого IgG1 с мутациями L234A и L235A (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Мультиспецифическое антитело отличается тем, что оно может относиться к подклассу человеческого IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Мультиспецифическое антитело может отличаться тем, что оно может относиться к подклассу человеческого IgG4 с мутациями S228P и L235E (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Мультиспецифическое антитело отличается тем, что оно может относиться к подклассу человеческого IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
При создании настоящего изобретения было установлено, что мультиспецифические антитела, полученные с помощью заявленного способа получения, обладают улучшенными характеристиками, такими как биологическая или фармакологическая активность, фармакокинетические свойства или токсичность. Их можно применять, например, для лечения заболеваний, таких как рак.
В контексте настоящего описания понятие константная область обозначает совокупность доменов антитела, отличных от вариабельной области. Константная область не принимает непосредственного участия в связывании с антигеном, но она обладает различными эффекторными функциями. Антитела подразделяют в зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, a некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы, такие как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgAl и IgA2. Константные области тяжелой цепи, соответствующие различным классам антител, обозначают символами α, β, ε, γ и μ соответственно. Константные области легкой цепи (CL), которые могут присутствовать во всех пяти классах антител, обозначают символами к (каппа) и λ (лямбда). В контексте настоящего описания понятие константная область, полученная из человеческого источника, обозначает константную область тяжелой цепи человеческого антитела подкласса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и/или константную область легкой каппа- или лямбда-цепи. Такие константные области хорошо известны в данной области, и они описаны, например, у Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
В контексте настоящего описания аминокислотные положения всех константных областей и доменов тяжелой и легкой цепей нумеруют согласно системе нумерации по Кэботу, описанной у Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, и обозначают в контексте настоящего описания как нумерация согласно Кэботу. В частности систему нумерации по Кэботу (см. p. 647-660), которая описана у Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, применяют для константного домена легкой цепи CL каппа- и лямбдаизотипа и систему нумерации на основе EU-индекса Кэбота (см. p. 661-723) применяют для константных доменов тяжелой цепи (CH1, шарнир, СН2 и CH3, которую в контексте настоящего описания для большей ясности обозначают в этом случае как нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В то время как антитела подкласса IgG4 обладают небольшой способностью к связыванию с Fc-рецептором (FcYRIIIa), антитела других подклассов IgG характеризуются выраженной способностью к связыванию. Однако изменение таких остатков, как Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (утрата углевода Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота), также приводит к снижению способности к связыванию с Fc-рецептором (Shields R.L. et al., J. Biol. Chem. 276, 2001, p. 6591-6604; Lund J. et al., FASEB J. 9, 1995, p. 115-119; Morgan А. et al., Immunology 86, 1995, p. 319-324; EP 0307434).
Антитело может обладать более низкой способностью к связыванию с FcR по сравнению с антите- 14 036292 лом подкласса IgG1. Таким образом, родительское антитело с точки зрения связывания с FcR относится к подклассу IgG4 или подклассу IgG1 или IgG2, имеющему мутацию в S228, L234, L235 и/или D265 и/или содержащему мутацию PVA236 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). Мутации в родительском антителе могут представлять собой S228P, L234A, L235A, L235E и/или PVA236 (нумерация согласно EUиндексу Кэбота). Мутации в родительском антителе могут представлять собой S228P в случае IgG4 и L234A и L235A в случае IgG1 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Константная область антитела принимает непосредственное участие в ADCC (антителообусловленная клеточно-зависимая цитотоксичность) и CDC (комплементзависимая цитотоксичность). Активация комплемента (CDC) инициируется в результате связывания фактора C1q системы комплемента с константной областью антител большинства из подклассов IgG. Связывание C1q с антителом происходит в результате определенных белок-белковых взаимодействий в так называемом сайте связывания. Такие сайты связывания константных областей известны в данной области, и они описаны, например, у Lukas T.J. et al., J. Immunol. 127, 1981, p. 2555-2560; Bunkhouse R. и Cobra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, p. 907-917; Burton D.R. et al., Nature 288, 1980, p. 338-344; Thomason J.E. et al., Mol. Immunol. 37, 2000, p. 995-1004; Idiocies E.E. et al., J. Immunol. 164, 2000, p. 4178-4184; Hearer M. et al., J. Virol. 75, 2001, p. 12161-12168; Morgan А. et al., Immunology 86, 1995, p. 319-324; и в EP 0307434. Такими сайтами связывания константной области являются, например, сайты, в которых присутствуют аминокислоты L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и Р329 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Понятие антитело-обусловленная клеточно-зависимая цитотоксичность (ADCC) относится к лизису человеческих клеток-мишеней, опосредованному антигенсвязывающим белком в присутствии эффекторных клеток. Уровень ADCC оценивают предпочтительно путем обработки препарата экспрессирующих антиген клеток антигенсвязывающим белком в присутствии эффекторных клеток, таких как свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или очищенные эффекторные клетки из лейкоцитарных пленок, типа моноцитов или естественных клеток-киллеров (NK) или постоянно выращиваемой линии NK-клеток.
Понятие комплементзависимая цитотоксичность (CDC) обозначает процесс, инициируемый связыванием фактора C1q системы комплемента с Fc-фрагментом большинства подклассов антител IgG-изотипа. Связывание C1q с антителом происходит в результате определенных белок-белковых взаимодействий в так называемом сайте связывания. Такие сайты связывания Fc-фрагмента известны в данной области (см. выше). Такие сайты связывания Fc-фрагмента представляют собой сайты, в которых присутствуют аминокислоты L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и Р329 (нумерация EU-индексу Кэбота). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3, как правило, обладают способностью к активации комплемента, включая связывание с C1q и C3, в то время как IgG4 не активирует систему комплемента и не связывается с C1q и/или C3.
Клеточно-опосредованные эффекторные функции моноклональных антител можно усиливать путем конструирования его олигосахаридного компонента, как это описано у Umana Р. et al., Nature Biotechnol. 17, 1999, p. 176-180 и в US 6602684. Антитела IgG1-типа, которые являются наиболее широко применяемыми терапевтическими антителами, представляют собой гликопротеины, которые имеют консервативный N-сцепленный сайт гликозилирования на Asn297 в каждом из доменов СН2. Два сложных биантенных олигосахарида, присоединенные к Asn297, расположены между СН2-доменами, формируя протяженные области контакта с полипептидным каркасом, и их присутствие является важным для опосредуемых антителом эффекторных функций, таких как антитело-обусловленная клеточно-зависимая цитотоксичность (ADCC) (Lifely M. R. et al., Glycobiology 5, 1995, p. 813-822; Jefferis R. et al., Immunol. Rev. 163, 1998, p. 59-76; Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15, 1997, p. 26-32). В статье Umana P. et al., Nature Biotechnol. 17, 1999, p. 176-180 и в WO 99/54342 продемонстрировано, что сверхэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) в(1,4)-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), которая представляет собой гликозилтрансферазу, катализирующую образование разветвленных олигосахаридов, существенно повышает ADCC-активность антител in vitro. Изменения состава присоединенного к Asn297 углевода или его элиминация оказывают влияние также на связывание с FcyR и C1q (Umana P. et al., Nature Biotechnol. 17, 1999, p. 176-180; Davies J. et al., Biotechnol. Bioeng. 74, 2001, p. 288294; Mimura Y. et al., J. Biol. Chem. 276, 2001, p. 45539-45547; Radaev S. et al., J. Biol. Chem. 276, 2001, p. 16478-16483; Shields R.L. et al., J. Biol. Chem. 276, 2001, p. 6591-6604; Shields R.L. et al., J. Biol. Chem. 277, 2002, p. 26733-26740; Simmons L.C. et al., J. Immunol. Methods 263, 2002, p. 133-147).
Методы усиления клеточно-опосредуемых эффекторных функций моноклональных антител описаны, например, в WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739.
Мультиспецифическое антитело может быть гликозилированным (если оно содержит Fc-фрагмент антитела подкласса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно подкласса IgG1 или IgG3) с сахарной цепью на Asn297, при этом количество фукозных остатков в указанной сахарной цепи составляет 65% или менее (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). Количество фукозных остатков в указанной сахар
- 15 036292 ной цепи составляет от 5 до 65%, предпочтительно от 20 до 40%. В контексте настоящего описания Asn297 обозначает аминокислоту аспарагин, присутствующую примерно в положении 297 в Fc-фрагменте. Вследствие минорных вариаций последовательности антител Asn297 может располагаться также на несколько аминокислот (как правило, не более чем на ±3 аминокислоты) дальше или ближе в направлении к С-концу по отношению к положению 297, т.е. между положениями 294 и 300. Гликозилированное антитело подкласса IgG может представлять собой человеческое антитело подкласса IgG1, человеческое антитело подкласса IgG1, имеющее мутации L234A и L235A, или антитело подкласса IgG3. Количество в указанной сахарной цепи остатков N-гликолилнейраминовой кислоты (NGNA) может составлять 1% или менее и/или количество остатков N-концевой альфа-1,3-галактозы составлять 1% или менее. Предпочтительно сахарная цепь обладает характеристиками N-сцепленных гликанов, присоединенных к Asn297 антитела, которое рекомбинантно экспрессируется в СНО-клетке.
Выражение сахарная цепь обладает характеристиками N-сцепленных гликанов, присоединенных к Asn297 антитела, которое рекомбинантно экспрессируется в СНО-клетке означает, что сахарная цепь на Asn297 родительского антитела имеет такую же структуру и последовательность сахарных остатков, за исключением фукозного остатка, что и антитело, экспрессируемое в немодифицированных СНО-клетках, например, как описано в WO 2006/103100.
В контексте настоящего описания понятие NGNA обозначает сахарный остаток N-гликолилнейраминовой кислоты.
Гликозилирование человеческого IgG1 или IgG3 имеет место на Asn297 в виде гликозилирования, осуществляемого с помощью сложного биантенного олигосахарида с коровым фукозилированием, на концах которого располагаются вплоть до 2 остатков Gal. Константные области человеческих тяжелых цепей подклассов IgG1 или IgG3 подробно описаны у Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 и у Bruggemann M. et al., J. Exp. Med. 166, 1987, p. 1351-1361; Love T.W. et al., Methods Enzymol. 178, 1989, p. 515-527. Эти структуры обозначают как гликановые остатки GO, G1 (α1,6 или α1,3) или G2 в зависимости от количества концевых остатков Gal (Raju T.S., BioProcess Int. 1, 2003, p. 44-53). СНО-тип гликозилирования Fc-фрагментов антитела описан, например, у Routier F.H., Glycoconjugate J. 14, 1997, p. 201-207. Антитела, которые рекомбинантно экспрессируются в СНО-клетках-хозяевах с немодифицированной схемой гликозилирования, как правило, являются фукозилированными на Asn297 по меньшей мере на 85%. Модифицированные олигосахариды в антителе могут быть гибридными или комплексными. Предпочтительно разветвленные восстановленные/нефукозилированные олигосахариды являются гибридными. Разветвленные восстановленные/нефукозилированные олигосахариды могут быть комплексными.
В контексте изобретения понятие количество фукозы означает количество указанного сахара в сахарной цепи на Asn297 по отношению к сумме всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), которое измеряют с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии и рассчитывают в виде среднего значения. Относительное количество фукозы выражают в виде процента содержащих фукозу структур относительно всех гликоструктур, идентифицированных с помощью MALDI-TOF в обработанном N-гликозидазой F образце (например, комплексных, гибридных структур, олиго-структур и структур с высоким содержанием маннозы соответственно).
Антитела могут связываться с различными антигенами. Ни первый антиген, ни второй антиген не представляют собой активирующий Т-клетку антиген, а также ни первый антиген, ни второй антиген могут не представлять собой CD3. Антитело может также не связываться специфически с активирующим Т-клетку антигеном или с CD3.
Первый или второй антиген может представлять собой человеческий TWEAK. Первый или второй антиген может представлять собой человеческий IL-17. Первый антиген может представлять собой человеческий TWEAK, a второй антиген представлять собой человеческий IL-17. В другом случае первый антиген может представлять собой человеческий IL-17, а второй антиген представлять собой человеческий TWEAK.
Человеческий TWEAK (UniProtKB 043508, TNF-подобный слабый индуктор апоптоза) представляет собой ассоциированный с клеточной поверхностью трансмембранный белок типа II. TWEAK описан у Chicheportiche Y. et al., J. Biol. Chem. 272, 1997, p. 32401-32410; Marsters S.A. et al., Curr. Biol. 8, 1998, p. 525-528; Lynch C.N. et al., J. Biol. Chem. 274, 1999, p. 8455-8459. Активная форма TWEAK представляет собой растворимый гомотример. Установлено, что последовательности связывающихся с рецептором доменов человеческого и мышиного TWEAK идентичны на 93%. TWEAK-рецептор Fn14 (индуцируемый фактором роста фибробластов белок, 14 кДа) представляет собой состоящий из 129 аминокислот (ак) трансмембранный белок типа I, лигандсвязывающий домен которого состоит из одного индивидуального богатого цистеином домена. Передача сигналов TWEAK происходит посредством активации пути NF-KB. мРНК TWEAK экспрессируется в различных тканях, и она обнаружена в большинстве основных органов типа сердца, головного мозга, скелетной мышцы и поджелудочной железы, в тканях,
- 16 036292 связанных с иммунной системой, типа селезенки, лимфатических узлов и тимуса. мРНК Fn14 обнаружена в сердце, головном мозге, легком, плаценте, эпителиальных клетках (ЭК) сосудов и гладкомышечных клетках. Мыши, у которых выключен TWEAK (TWEAK-нуль) и Fn14 (FnM-нуль), являются жизнеспособными, здоровыми и фертильными, у них выше содержание естественных клеток-киллеров и для них характерен повышенный врожденный воспалительный ответ. TWEAK принимает участие в апоптозе, пролиферации, ангиогенезе, он присутствует в области ишемической полутени, обнаружен при церебральном отеке, рассеянном склерозе.
Человеческий IL-17 (другое название IL-17A; CTLA-8, Swiss Prot Q16552, IL-17) представляет собой провоспалительный цитокин, который продуцируется субпопуляцией Т-клеток-хелперов (которые обозначают как Th17), участвующий в патогенезе рассеянного склероза (PC). IL-17A играет роль в индукции других провоспалительных цитокинов, хемокинов и молекул адгезии. Обработка животных нейтрализующими IL-17A антителами снижала коэффициент заболеваемости и серьезность аутоиммунного энцефаломиелита (Komiyama Y. et al., J. Immunol. 177, 2006, p. 566-573). Обнаружена сверхэкспрессия IL-17A в спинномозговой жидкости страдающих PC пациентов (Hellings P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28, 2003, p. 42-50; Matusevicius D. et al., Multiple Sclerosis 5, 1999, p. 101-104; WO 2005/051422). Кроме того, нейтрализующие IL-17A антитела снижают серьезность и коэффициент заболеваемости ревматоидным артритом (РА) на мышиной модели индуцированного коллагеном артрита, а высокие уровни IL-17A можно обнаружить в синовиальной жидкости воспаленных суставов у страдающих РА пациентов (Ziolkowska M et al., J. Immunol. 164, 2000, p. 2832-2838; Kotake S. et al., J. Clin. Invest. 103, 1999, p. 13451352; Hellings P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28, 2003, p. 42-50).
Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирует антитело. Методы рекомбинантного получения хорошо известны в данной области, и они включают осуществление экспрессии белка в прокариотических и эукариотических клетках и последующее выделение антитела и, как правило, очистку до достижения фармацевтически приемлемой степени чистоты. Для осуществления экспрессии указанных выше антител в клетке-хозяине нуклеиновые кислоты, кодирующие соответствующие модифицированные легкие и тяжелые цепи, встраивают в экспрессионные векторы с помощью стандартных методов. Экспрессию осуществляют в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, таких как СНО-клетки, №0-клетки, SP2/0-клетки, HEK293-клетки, COS-клетки, PER.C6-клетκи, клетки дрожжей или клетки E.coli, и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или клеток после лизиса). Общие методы рекомбинантного получения антител хорошо известны из существующего уровня техники, и они описаны, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, p. 183-202; Geisse S. et al., Protein Expr. Purif. 8, 1996, p. 271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, p. 151-161; Werner R.G., Drug Res. 48, 1998, p. 870-880.
Антитела, продуцируемые клетками-хозяевами, можно подвергать посттрансляционному отщеплению одной или нескольких, прежде всего одной или двух аминокислот от С-конца тяжелой цепи. Таким образом, антитело, продуцируемое клеткой-хозяином путем экспрессии молекулы специфической нуклеиновой кислоты, которая кодирует полноразмерную тяжелую цепь, может включать полноразмерную тяжелую цепь, или оно может включать расщепленный вариант полноразмерной тяжелой цепи (который обозначают также как расщепленный вариант тяжелой цепи). Это может иметь место в случае, когда две последние С-концевые аминокислоты тяжелой цепи представляют собой глицин (G446) и лизин (K447, нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Таким образом, в контексте настоящего изобретения подразумевается, что аминокислотные последовательности тяжелых цепей, включающих ОИЗ-домены, не имеют С-концевого дипептида глицинлизин, если не указано иное.
Антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую ОИЗ-домен, указанный в настоящем описании, содержит дополнительный С-концевой дипептид глицин-лизин (G446 и K447, нумерация согласно EU-индексу Кэбота). Антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую ОИЗ-домен, указанный в настоящем описании, может содержать дополнительный С-концевой остаток глицина (G446, нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Фармацевтические композиции могут содержать популяцию антител. Популяция антител может содержать антитела, имеющие полноразмерную тяжелую цепь, и антитела, имеющие расщепленный вариант тяжелой цепи. Популяция антител может состоять из смеси антител, которые имеют полноразмерную тяжелую цепь, и антител, которые имеют расщепленный вариант тяжелой цепи, в которой по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% приходится на долю антител, имеющих расщепленный вариант тяжелой цепи.
Фармацевтическая композиция может содержать антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую ОИ3-домен, указанный в настоящем описании, с дополнительным С-концевым дипептидом глицин-лизин (G446 и K447, нумерация согласно EU-индексу Кэбота). Фармацевтическая композиция может содержать антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую CH3-домен, указанный в настоящем описании, с дополнительным С-концевым остатком глицина (G446, нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Фармацевтическая композиция может содержать популяцию антител, которая содержит антитела,
- 17 036292 содержащие тяжелую цепь, которая включает СНЗ-домен, указанный в настоящем описании; антитела, содержащие тяжелую цепь, которая включает ОН3-домен, указанный в настоящем описании, с дополнительным С-концевым остатком глицина (G446, нумерация согласно EU-индексу Кэбота); и антитела, содержащие тяжелую цепь, которая включает CH3-домен, указанный в настоящем описании, с дополнительным С-концевым дипептидом глицин-лизин (G446 и K447, нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Мультиспецифические антитела можно отделять от культуральной среды с помощью общепринятых методов очисти иммуноглобулинов, таких, например, как, хроматография на белок А-сефарозе, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. ДНК и РНК, которые кодируют моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых методов. Клетки гибридом могут служить источником таких ДНК и РНК. После выделения ДНК можно встраивать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как ΗΕΚ293-κ^τκ^ СНО-клетки или клетки миеломы, которые в ином случае не могут продуцировать белок иммуноглобулина, для обеспечения синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.
Варианты (или мутанты) аминокислотной последовательности мультиспецифического антитела создают путем внесения соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК антитела или с помощью нуклеотидного синтеза. Однако такие модификации можно осуществлять лишь в очень ограниченном масштабе, например, как указано выше. Например, модификации не должны приводить к изменению указанных выше характеристик антитела, таких как изотип IgG и способность связываться с антигеном, но они могут повышать выход рекомбинантного продукта, стабильность белка или облегчать процесс очистки. Антитела могут иметь одну или несколько консервативных аминокислотных замен.
Аминокислоты можно группировать на основе общих свойств боковых цепей следующим образом:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Таблица 1. Специфические свойства аминокислот____________________________________
Аминокислота 3-буквенный код 1-буквенный код Полярность боковой цепи Заряд боковой цепи (pH 7,4)
аланин Ala A неполярная нейтральный
аргинин Arg R основная полярная положительный
аспарагин Asn N полярная нейтральный
аспарагиновая кислота Asp D кислотная полярная отрицательный
цистеин Cys C неполярная нейтральный
глутаминовая кислота Glu E кислотная полярная отрицательный
глутамин Gin Q полярная нейтральный
глицин Gly G неполярная нейтральный
гистидин His H основная полярная положительный (10%) нейтральный (90%)
изолейцин Ile I неполярная нейтральный
лейцин Leu L неполярная нейтральный
лизин Lys К основная полярная положительный
метионин Met M неполярная нейтральный
фенилаланин Phe F неполярная нейтральный
пролин Pro P неполярная нейтральный
серин Ser s полярная нейтральный
треонин Thr T полярная нейтральный
триптофан Trp w неполярная нейтральный
тирозин Tyr Y полярная нейтральный
валин Val V неполярная нейтральный
В контексте настоящего описания понятие клетка-хозяин относится к клеточной системе любого типа, которую можно сконструировать так, чтобы она продуцировала антитела. В качестве клеток-хозяев можно применять НЕК293-клстки и СНО-клетки. В контексте настоящего описания понятия клетка, клеточная линия и клеточная культура используются взаимозаменяемо, и все определения, в которые входят эти понятия, включают потомство. Так, выражения трансформанты и трансформированные клетки включают прежде всего первичные рассматриваемые клетки, а также культуры, происходящие из них, независимо от количества переносов. Следует также иметь в виду, что все потомство может не быть строго идентичным касательно содержания ДНК вследствие случайных или неумышленных мутаций. Эти понятия включают варианты потомства, которые обладают такой же функцией или биологической активностью, что и отобранная путем скрининга исходная трансформированная клетка. Если употребляются другие обозначения, то они должны быть ясны из контекста.
- 18 036292
Экспрессия в NSO-клетках описана, например, у Barnes L.M. et al., Cytotechnology 32, 2000, p. 109123; Barnes L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73, 2001, p. 261-270. Кратковременная экспрессия описана, например, у Durocher Y. et al., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, p. Е9. Клонирование вариабельных доменов описано у Orlandi R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, p. 3833-3837; Carter P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, p. 4285-4289; и Norderhaug L. et al., J. Immunol. Methods 204, 1997, p. 77-87. Предпочтительная система для кратковременной экспрессии (HEK293) описана Schlaeger E.-J. и Christensen K. в Cytotechnology 30, 1999, p. 71-83 и у Schlaeger E.-J., J. Immunol. Methods 194, 1996, p. 191-199.
Контролирующие последовательности, которые можно применять для прокариотических организмов, представляют собой, например, промоторную последовательность, необязательно операторную последовательность и сайт связывания рибосом. Известно, что для эукариотических клеток применяют промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.
Нуклеиновая кислота функционально связана, когда она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или лидерной секреторной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если при ее экспрессии образуется предбелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что облегчает трансляцию. Как правило, понятие функционально связаны означает, что последовательности ДНК, будучи связаны, являются смежными, а в случае лидерной секреторной последовательности являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако для энхансеров не является необходимым, чтобы они были смежными. Связывание осуществляют путем лигирования в соответствующих сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, то в соответствии с принятой практикой применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.
Очистку антител для удаления других клеточных компонентов или других примесей, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков, осуществляют с помощью стандартных методов, включая обработку щелочью/ДСН, CsC1-бэндинг, хроматографию на колонках, электрофорез в агарозном геле и другие методы, хорошо известные в данной области (см. в Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel F. et al., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987). Для очистки белков разработаны и нашли широкое распространение различные методы, такие как аффинная хроматография с использованием белков микроорганизмов (например, аффинная хроматография на белке А или белке G), ионообменная хроматография (например, катионообменная (с использованием карбоксиметиловых смол), анионообменная (с использованием аминоэтиловых смол) хроматография и хроматография со смешанной формой разделения), тиофильная адсорбция (например, с использованием бета-меркаптоэтанола и других SH-лигандов), хроматография на основе гидрофобного взаимодействия или адсорбционная хроматография ароматических соединений (например, с использованием фенилсефарозы, аза-аренофильных смол или мета-аминофенилбороновой кислоты), металлхелатирующая аффинная хроматография (например, с использованием материала, обладающего аффинностью к Ni(II) и Cu(II)), гель-фильтрация и электрофоретические методы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998, p. 93-102).
Антитело может быть включено в состав препаративной формы в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
Мультиспецифическое антитело может быть предназначено для лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, мышечных болезней, например мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, болезней костной ткани, например дегенерации кости при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистых повреждений.
В контексте настоящего описания понятие фармацевтический носитель включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, придающие изотоничность и замедляющие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель можно применять для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии).
Фармацевтическую композицию можно вводить с помощью различных методов, известных в данной области. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, путь и/или форму введения можно варьировать в зависимости от требуемых результатов. Для реализации назначения соединения можно наносить на соединение покрытие из материала, препятствующего его инактивации, или осуществлять введение соединения совместно с таким материалом. Например, соединение можно вводить индивидууму в соответствующем носителе, например в липосомах или в разбавителе. К фармацевтически приемлемым разбавителям относятся физиологический раствор и водные забуферивающие растворы. К фармацевтическим носителям относятся стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий непосредственно перед введением. Применение таких сред и агентов для обладающих фармацевтической активностью субстан
- 19 036292 ций известно в данной области.
В контексте настоящего описания понятия парентеральное введение и введение парентеральным путем означают пути введения, отличные от энтерального введения и местного применения, как правило, они относятся к введению путем инъекции и включают (но не ограничиваясь только ими) внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, внутриоболочечную, внутрикапсульную, внутриглазную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию.
В контексте настоящего описания понятие рак относится к пролиферативным заболеваниям, таким как лимфомы, лимфолейкозы, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), альвеолярноклеточный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожная или внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, гастральный рак, рак ободочной кишки, рак молочной железы, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркома мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечно-клеточная карцинома, карцинома почечной лоханки, мезотелиома, печеночно-клеточный рак, билиарный рак, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоли позвоночника, глиома ствола головного мозга, мультиформная глиобластома, астроцитомы, шванномы, эпендимоны, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденома гипофиза и саркома Юинга, включая рефрактерные варианты любого из указанных выше видов рака и комбинации одного или нескольких видов рака.
Композиции могут содержать также адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Отсутствие микроорганизмов можно обеспечивать как с помощью процедур стерилизации (см. выше), так и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств, таких, например, как парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота и т.п. Может оказаться целесообразным включать в композиции агенты для придания изотоничности, такие как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, можно пролонгировать абсорбцию инъекционной фармацевтической формы путем включения веществ, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Вне зависимости от выбранного пути введения соединения можно применять в пригодной гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции приготавливают в виде фармацевтически приемлемых форм лекарственного средства с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области.
Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях можно варьировать для получения количества действующего вещества, которое является эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента при использовании конкретной композиции и пути введения, но не является токсичным для пациента. Выбранный уровень доз должен зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композиций, путь введения, время введения, скорость экскреции конкретного применяемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, которые используют в сочетании с конкретными применяемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и предшествующая история болезни пациента, подлежащего лечению, и другие подобные факторы, хорошо известные в области медицины.
Композиция должна быть стерильной и текучей в той степени, чтобы ее можно было вводить с помощью шприца. Помимо воды предпочтительным носителем является изотонический забуференный физиологический раствор.
Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию агенты для придания изотоничности, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит или сорбит, и хлорид натрия.
В контексте настоящего описания понятие трансформация относится к процессу переноса векторов/нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Если в качестве клеток-хозяев применяют клетки, оболочки которых не представляют собой труднопреодолимые барьеры, то трансфекцию осуществляют, например, методом, основанным на осаждении фосфатом кальция, который описан у Graham и Van der Eh, Virology, 52, 1978, p. 546 и далее. Однако можно применять также и другие методы интродукции ДНК в клетки, такие как инъекция в ядра или слияние протопластов. Если используют прокариотические клетки или клетки, имеющие значительные клеточные оболочки, то в качестве метода трансфекции можно применять обработку кальцием с использованием хлорида кальция, описанную у Cohen F.N. et al., PNAS 69, 1972, p. 7110 и далее.
- 20 036292
В контексте настоящего описания понятие экспрессия относится к процессу, посредством которого осуществляется транскрипция нуклеиновой кислоты в мРНК, и/или к процессу, посредством которого транскрибированная мРНК (которую называют также транскриптом) впоследствии транслируется с образованием пептидов, полипептидов или белков. Транскрипты и кодируемые полипептиды в целом называют генным продуктом. Если полинуклеотид происходит из геномной ДНК, то экспрессия в эукариотической клетке может включать сплайсинг мРНК.
Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, в частности самореплицирующуюся, которая переносит встроенную молекулу нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева и/или между клеткамихозяевами. Понятие включает векторы, функция которых состоит прежде всего во встраивании ДНК или РНК в клетку (например, хромосомная интеграция), в репликационные векторы, функция которых прежде всего состоит в репликации ДНК или РНК, и экспрессионные векторы, функция которых состоит прежде всего в транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Под понятие подпадают также векторы, которые обладают несколькими указанными функциями.
Экспрессионный вектор представляет собой полинуклеотид, который при интродукции в соответствующую клетку-хозяина может транскрибироваться и транслироваться в полипептид. Понятие экспрессионная система относится, как правило, к приемлемой клетке-хозяину, содержащей экспрессионный вектор, функцией которой может быть выход требуемого продукта экспрессии.
Следующие примеры, перечень последовательностей и чертежи даны с целью лучшего понимания настоящего изобретения, полный объем которого представлен в приведенной ниже формуле изобретения. Очевидно, что могут быть сделаны модификации в изложенных процедурах без отклонения от сути изобретения.
Описание аминокислотных последовательностей
SEQ ID NO: 1 - легкая цепь (LC) <Ang-2> дикого типа (wt),
SEQ ID NO: 2 - тяжелая цепь (НС) <Ang-2> дикого типа (wt),
SEQ ID NO: 3 - тяжелая цепь (НС) <VEGF> с VH-VL-обменом дикого типа (wt),
SEQ ID NO: 4 - легкая цепь (LC) <VEGF> с VH-VL-обменом дикого типа (wt),
SEQ ID NO: 5 - легкая цепь (LC) <Ang-2> с заменой Q124K,
SEQ ID NO: 6 - тяжелая цепь (НС) <Ang-2> с заменой К147Е,
SEQ ID NO: 7 - тяжелая цепь (НС) <Ang-2> с заменой К213Е,
SEQ ID NO: 8 - легкая цепь (LC) <Ang-2> с заменой Е123К,
SEQ ID NO: 9 - легкая цепь (LC) <Ang-2> с заменой Q124K и заменой Е123К,
SEQ ID NO: 10 - тяжелая цепь (НС) <Ang-2> с заменой К147Е и заменой К213Е,
SEQ ID NO: 11 - легкая цепь (LC) <Ang-2> с заменой Q124R и заменой Е123К,
SEQ ID NO: 12 - легкая цепь (LC) <VEGF> с заменой Q124E,
SEQ ID NO: 13 - легкая цепь (LC) <Ang-2> с заменой Е124К и заменой Е123К,
SEQ ID NO: 14 - тяжелая цепь (НС) <Ang-2> с заменой К147Е и заменой K213D,
SEQ ID NO: 15 - легкая цепь (LC) <IL-17> дикого типа (wt),
SEQ ID NO: 16 - тяжелая цепь (НС) <IL-17> дикого типа (wt),
SEQ ID NO: 17 - тяжелая цепь (НС) <TWEAK> с VH-VL-обменом дикого типа (wt),
SEQ ID NO: 18 - легкая цепь (LC) <TWEAK> с VH-VL-обменом дикого типа (wt), SEQ ID NO: 19 - легкая цепь (LC) <IL-17> с заменой Q124K и заменой E123R, SEQ ID NO: 20 - тяжелая цепь (НС) <IL-17> с заменой К147Е и заменой К213Е, SEQ ID NO: 21 - легкая цепь (LC) <TWEAK> с заменой Q124E, SEQ ID NO: 22 - тяжелая цепь (НС) <IL-17> с заменой К147Е и заменой K213D, SEQ ID NO: 23 - легкая цепь (LC) <IL-17> с заменой Q124K и заменой Е123К SEQ ID NO: 24 - вариабельный домен тяжелой цепи VH <TWEAK > 305-НС4, SEQ ID NO: 25 - вариабельный домен легкой цепи VL <TWEAK>305-LC2, SEQ ID NO: 26 - вариабельный домен тяжелой цепи VH <IL-17> НС136, SEQ ID NO: 27 - вариабельный домен легкой цепи VL <IL-17> LC136,
SEQ ID NO: 28 - тяжелая цепь (НС) <TWEAK> с VH-VL-обменом дикого типа (wt) (содержащая концевой дипептид GK),
SEQ ID NO: 29 - тяжелая цепь (НС) <IL-17> с заменой К147Е и заменой К213Е (содержащая концевой дипептид GK),
SEQ ID NO: 30 - тяжелая цепь (НС) <IL-17> с заменой К147Е и заменой K213D (содержащая концевой дипептид GK),
SEQ ID NO: 31 - тяжелая цепь (НС) <Ang-2> дикого типа (wt) (содержащая концевой дипептид GK),
SEQ ID NO: 32 - тяжелая цепь (НС) <VEGF> с VH-VL-обменом дикого типа (wt) (содержащая концевой дипептид GK),
SEQ ID NO: 33 - тяжелая цепь (НС) <Ang-2> с заменой К147Е (содержащая концевой дипептид GK),
SEQ ID NO: 34 - тяжелая цепь (НС) <Ang-2> с заменой К213Е (содержащая концевой дипептид GK),
- 21 036292
SEQ ID NO: 35 - тяжелая цепь (НС) <Ang-2> с заменой К147Е и заменой К213Е (содержащая концевой дипептид GK),
SEQ ID NO: 36 - тяжелая цепь (НС) <Ang-2> с заменой К147Е и заменой K213D (содержащая концевой дипептид GK),
SEQ ID NO: 37 - тяжелая цепь (НС) <IL-17> дикого типа (wt) (содержащая концевой дипептид GK),
SEQ ID NO: 38 - тяжелая цепь (НС) Fab2-CrossFab, включающая две тяжелые цепи (НС) <Ang-2> дикого типа (wt), сцепленные с одной тяжелой цепью (НС) <VEGF> с VH-VL-обменом дикого типа (wt) через глицин-сериновые линкеры,
SEQ ID NO: 39 - тяжелая цепь (НС) Fab2-CrossFab, включающая две тяжелые цепи (НС) <Ang-2> с заменами К147Е и К213Е-, сцепленные с одной тяжелой цепью (НС) <VEGF> с VH-VL-обменом дикого типа (wt) через глицин-сериновые линкеры,
SEQ ID NO: 40 - тяжелая цепь (НС) CrossFab-Fab, включающая одну тяжелую цепь (НС) <VEGF> с VH-VL-обменом дикого типа (wt), сцепленную с одной тяжелой цепью (НС) <Ang-2> с заменами К147Е и К213Е через глицин-сериновые линкеры,
SEQ ID NO: 41 - тяжелая цепь (НС) CrossFab-Fab, включающая одну тяжелую цепь (НС) <VEGF> с VH-VL-обменом дикого типа (wt), сцепленную с одной тяжелой цепью (НС) <Ang-2> с заменами К147Е и К213Е через глицин-сериновые линкеры,
SEQ ID NO: 42 - тяжелая цепь (НС) CrossFab2-Fab, включающая две тяжелые цепи (НС) <VEGF> с VH-VL-обменом дикого типа (wt), сцепленные с одной тяжелой цепью (НС) <Ang-2> дикого типа (wt) через глицин-сериновые линкеры,
SEQ ID NO: 43 - тяжелая цепь (НС) CrossFab2-Fab, включающая две тяжелые цепи (НС) <VEGF> с VH-VL-обменом дикого типа (wt), сцепленные с одной тяжелой цепью (НС) <Ang-2> с заменами К147Е и K231Е через глицин-сериновые линкеры,
SEQ ID NO: 44 - тяжелая цепь (НС) <VEGF> с VH-VL-обменом с заменой К147Е,
SEQ ID NO: 45 - легкая цепь (LC) <VEGF> с VH-VL-обменом с заменой Q124K,
SEQ ID NO: 46 - тяжелая цепь (НС) <VEGF> с VH-VL-обменом с заменами К147Е и К213Е,
SEQ ID NO: 47 - легкая цепь (LC) <VEGF> с VH-VL-обменом с Е123К и заменой Q124K.
Примеры
Материалы и общие методы.
Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческого иммуноглобулина, представлена у Kabat Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Аминокислоты цепей антител пронумерованы и на них сделаны ссылки согласно системам нумерации, предложенным Кэботом (Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991), описанным выше.
Методы рекомбинантной ДНК.
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.
Синтез генов.
Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной 600-1800 пар оснований, которые фланкированы единичными сайтами, распознаваемыми рестриктазами, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦРамплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции, например KpnI/SacI или AscI/PacI в клонирующем векторе pGA4, основой которого является плазмида pPCRScript (фирма Stratagene). Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК. Синтез генных фрагментов заказывали в соответствии с настоящей спецификацией на фирме Geneart (Регенсбург, Германия).
Определение последовательностей ДНК.
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования двух цепей на фирме MediGenomix GmbH (Мартинсрид, Германия) или фирме Sequiserve GmbH (Фатерштеттен, Германия).
Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях.
Применяли пакет программ фирмы GCG (Genetics Computer Group, Мэдисон, шт. Висконсин), версия 10.2 и Infomax's Vector NT1 Advance suite, версия 8.0 для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.
Экспрессионные векторы.
Для экспрессии описанных антител применяли варианты экспрессионных плазмид, предназначенных для кратковременной экспрессии (например, в клетках HEK293 EBNA или HEK293-F), основанные либо на кДНК-организации промотора CMV с интроном А или без него, либо на геномной организации с промотором CMV.
- 22 036292
Помимо кассеты экспрессии антитела векторы включали:
сайт инициации репликации, который обеспечивает репликацию этого вектора в E.coli, ген β-лактамазы, который придает устойчивость Е. coli к ампициллину.
Транскрипционная единица гена антитела состояла из следующих элементов: уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на 5'-конце, немедленно-ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса, расположенная за ней последовательность интрона А в случае конструкции на основе кДНК, 5'-нетранслируемая область гена человеческого антитела, сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина, цепь человеческого антитела (дикого типа или с обменом доменов) либо в виде кДНК, либо в виде геномной организации с иммуноглобулиновой экзон-интронной организацией,
3'-нетранслируемая область с сигнальной последовательностью полиаденилирования и уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на 3'-конце.
Слияния генов, содержащих описанные цепи антитела, как указано ниже, осуществляли с помощью ПЦР и/или синтеза генов и сборки с использованием известных методов и процедур рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот, например с использованием уникальных сайтов рестрикции, в соответствующих векторах. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК. Для осуществления кратковременных трансфекций плазмиды создавали в больших количествах посредством получения плазмид из трансформированных культур F.coli (набор Nucleobond AX, фирма Macherey-Nagel).
Методики культивирования клеток.
Применяли стандартные методики культивирования клеток, описанные в Current Protocols in Cell Biology, под ред. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. и Yamada K.M., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 2000.
Мультиспецифические антитела экспрессировали путем кратковременной котрансфекции соответствующими экспрессионными плазмидами выращенных в виде прикрепленных культур клеток HEK293-EBNA или выращенных в виде суспензионных культур клеток HEK29-F, что будет описано ниже.
Кратковременные трансфекции в системе HEK293-EBNA.
Мультиспецифические антитела экспрессировали путем кратковременной котрансфекции соответствующими экспрессионными плазмидами (например, кодирующими тяжелую и модифицированную тяжелую цепь, а также соответствующую легкую цепь и модифицированную легкую цепь) выращенных в виде прикрепленных культур клеток HEK293-EBNA (линия клеток почки человеческого эмбриона 293, экспрессирующая ядерный антиген вируса Эпштейна-Барра; депонирована в Американской коллекции типовых культур под номером АТСС CRL-10852, партия 959218), которые культивировали в среде DMEM (модифицированная по методу Дульбекко среда Игла, Gibco®), дополненной 10% FCS (фетальная телячья сыворотка, Gibco®) с ультранизким содержанием IgG (Ultra Low IgG FCS), 2м М L-глутамином (Gibco®) и 250 мкг/мл генетицина (Gibco®). Для трансфекции применяли реагент для трансфекции типа FuGENE™ 6 (фирма Roche Molecular Biochemicals), используя соотношение реагента FuGENE™ (мкл) и ДНК (мкг) 4:1 (диапазон от 3:1 до 6:1). Белки экспрессировали, применяя соответствующие плазмиды, с использованием плазмид, кодирующих (модифицированные и дикого типа) легкую цепь и тяжелую цепь, в молярном соотношении 1:1 (эквимолярное соотношение), диапазон от 1:2 до 2:1 соответственно. Клетки подпитывали в день 3 L-глутамином до концентрации 4 мМ, глюкозой (фирма Sigma) и NAA (амид никотиновой кислоты) (Gibco®). В дни с 5 по 11 после трансфекции собирали путем центрифугирования супернатанты клеточных культур, содержащие мультиспецифическое антитело, и хранили при -20°С. Общую информацию, касающуюся рекомбинантной экспрессии человеческих иммуноглобулинов, например, в HEK293-клетках, см. у Meissner P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75, 2001, p. 197-203.
Кратковременные трансфекции в системе HEK293-F.
Мультиспецифические антитела получали путем кратковременной трансфекции соответствующими плазмидами (например, кодирующими тяжелую и модифицированную тяжелую цепь, а также соответствующую легкую цепь и модифицированную легкую цепь), используя систему HEK293-F (фирма Invitrogen) согласно инструкции производителя. В целом, метод состоял в следующем: HEK293-F-клетки (фирма Invitrogen), выращенные в виде суспензионной культуры либо во встряхиваемой колбе, либо в ферментере с мешалкой в бессывороточной среде для экспрессии типа FreeStyle™ 293 (фирма Invitrogen), трансфектировали смесью четырех экспрессионных плазмид и 293-фектином™ или фектином (фирма Invitrogen). В 2-литровую встряхиваемую колбу (фирма Corning) высевали клетки HEK293-F с плотностью 1,0х106 клеток/мл в 600 мл и инкубировали при 120 об/мин, 8% СО2. Через 1 день клетки трансфектировали при плотности клеток примерно 1,5х106 клеток/мл с помощью примерно 42 мл смеси А), содержащей 20 мл среды Opti-MEM (фирма Invitrogen), с 600 мкг общей плазмидной ДНК (1 мкг/мл), которая кодирует соответственно тяжелую или модифицированную тяжелую цепь и
- 23 036292 соответствующую легкую цепь, в эквимолярном соотношении, и смеси Б), содержащей 20 мл
Opti-MEM + 1,2 мл 293-фектина или фектина (2 мкл/мл). В зависимости от поглощения глюкозы в процессе ферментации добавляли раствор глюкозы. Через 5-10 дней собирали супернатант, содержащий секретированное антитело, и либо очищали антитела непосредственно из супернатанта, либо супернатант замораживали и помещали на хранение.
Определение белка.
Концентрацию белков очищенных антител и их производных определяли на основе оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности согласно методу, который описан у Расе et al., Protein Science, 4, 1995, p. 2411-1423.
Определение концентрации антител в супернатантах.
Концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур определяли путем иммунопреципитации с белок А-агарозными гранулами (фирма Roche). 60 мкл белок А-агарозных гранул промывали трижды в TBS-NP40 (50 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1% Nonidet-P40). Затем 1-15 мл супернатанта клеточной культуры наносили на белок А-агарозные гранулы, предварительно уравновешенные в TBS-NP40. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре гранулы промывали на фильтрующей колонке типа Ultrafree-MC (фирма Amicon), используя однократно 0,5 мл TBS-NP40, дважды 0,5 мл двукратного (2х) забуференного фосфатом физиологического раствора (2хЗФР, фирма Roche) и быстро четыре раза, используя 0,5 мл 100 мМ Na-цитратного буфера, рН 5,0. Связанное антитело элюировали, добавляя 35 мкл буфера для образцов NuPAGE® LDS (фирма Invitrogen). Половину образца объединяли с восстановителем для образцов NuPAGE® или оставляли в невосстановленной форме соответственно и выдерживали в течение 10 мин при 70°С. Затем по 5-30 мкл применяли для осуществления ДСН-ПААГ с использованием 4-12% бис-Трис-гелей NuPAGE® (фирма Invitrogen) (применяя буфер MOPS для осуществлении ДСН-ПААГ в невосстанавливающихся условиях и буфер MES в виде подвижного буфера с антиоксидантной добавкой NuPAGE® (фирма Invitrogen) для осуществлении ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях) и окрашивали кумасси бриллиантовым голубым.
Концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур оценивали количественно с помощью аффинной ЖХВР-хроматографии. В целом, метод состоял в следующем: супернатанты клеточных культур, содержащие антитела и их производные, которые связывались с белком А, вносили на колонку Applied Biosystems Poros А/20 в 200 мМ KH2PO4, 100 мМ цитрате натрия, pH 7,4 и элюировали из матрикса с помощью 200 мМ NaCl, 100 мМ лимонной кислоты, pH 2,5 с использованием системы Agilent HPLC 1100. Элюированный белок оценивали количественно с помощью измерения УФ-абсорбции и интегрирования площадей пиков. Очищенное стандартное антитело в виде IgG1 служило в качестве стандарта.
В альтернативном варианте концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур оценивали с помощью сэндвич''-IgG-ELISA. В целом, метод состоял в следующем: 96-луночные титрационные микропланшеты, обладающие высокой способностью связывать стрептавидин А (планшеты типа StreptaWell High Bind Strepatavidin А (фирма Roche)), сенсибилизировали из расчета 100 мкл/лунку биотинилированным античеловеческим IgG F(ab')2<h-FcY>BI (фирма Dianova), применяемым в качестве иммобилизованной молекулы, в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре или в другом варианте в течение ночи при 4°С и затем промывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФР, 0,05% Твин (ЗФРТ, фирма Sigma). Добавляли в лунки по 100 мкл/лунку серийных разведений в ЗФР (фирма Sigma) супернатантов клеточных культур, содержащих соответствующее антитело, и инкубировали в течение 1-2 ч на шейкере для титрационных микропланшетов при комнатной температуре. Лунки промывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФРТ, и выявляли связанное антитело с помощью 100 мкл F(ab')2<hFcY>POD (фирма Dianova) в концентрации 0,1 мкг/мл в качестве идентифицирующего антитела в течение 1-2 ч на шейкере для титрационных микропланшетов при комнатной температуре. Несвязанное идентифицирующее антитело отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФРТ, а связанное идентифицирующее антитело выявляли, добавляя 100 мкл ABTS/лунку. Определение абсорбции осуществляли на спектрометре типа Tecan Fluor при длине волны 405 нм (длина референсволны 492 нм).
Очистка белков.
Белки очищали из профильтрованных супернатанов клеточных культур согласно стандартным протоколам. В целом, метод состоял в следующем: антитела вносили на колонку, заполненную белок А-сефарозой (фирма GE Healthcare), и промывали ЗФР. Элюцию антител осуществляли при pH 2,8 с последующей немедленной нейтрализацией образца. Агрегированный белок отделяли от мономерных антител гель-фильтрацией (Супердекс 200, фирма GE Healthcare) в ЗФР или в 20 мМ гистидине, 150 мМ NaCl, pH 6,0. Фракции мономерных антител объединяли, (при необходимости) концентрировали, используя, например, центрифужный концентратор типа MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO (молекулярно весовой предел), замораживали и хранили при -20 или -80°С. Часть образцов оставляли для последующего аналитического изучения белка и его аналитической характеризации, например, с помощью
- 24 036292
ДСН-ПААГ, гель-фильтрации (ГФ) или масс-спектрометрии.
ДСН-ПААГ.
Применяли гелевую систему NuPAGE® Pre-Cast (фирма Invitrogen) согласно инструкции производителя. В частности, использовали 10% или 4-12% бис-Трис Pre-Cast-гели NuPAGE®, Novex® (pH 6,4) и подвижные буферы, такие как NuPAGE® MES (гели, применяемые в восстанавливающих условиях, подвижный буфер с антиоксидантной добавкой NuPAGE®) или MOPS (гели, применяемые в невосстанавливающихся условиях).
Аналитическая гель-фильтрация.
В качестве гель-фильтрации (ГФ), предназначенной для определения агрегированного и олигомерного состояния антител, применяли ЖХВР-хроматографию. В целом, метод состоял в следующем: очищенные на белке А антитела вносили на колонку типа Tosoh TSKgel G3000SW в 300 мМ NaCl, 50 мМ KH2PO4/K2HPO4, pH 7,5 в системе Agilent HPLC 1100, или на колонку Супердекс 200 (фирма GE Healthcare) в 2хЗФР в ЖХВР-системе Dionex. Количество элюированного белка определяли на основе УФабсорбции и интегрирования площадей пиков. В качестве стандарта применяли стандарт для гельфильтрации фирмы BioRad (Gel Filtration Standard 151-1901).
Масс-спектрометрия.
В этом разделе описана характеризация мультиспецифических антител с VH/VL-обменом (VH/VL-CrossMab), особое значение при осуществлении которой придавали их правильной сборке. Ожидаемые первичные структуры анализировали с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем (ESI-MC) дегликозилированных интактных CrossMab и дегликозилированных/расщепленных плазмином или в другом варианте дегликозилированных/ограниченно расщепленных LysC CrossMab.
VH/VL-CrossMab дегликозилировали с помощью N-гликозидазы F в фосфатном или Трис-буфере при 37°С в течение вплоть до 17 ч при концентрации белка 1 мг/мл. Расщепление плазмином или ограниченное расщепление LysC (фирма Roche) осуществляли, используя 100 мкг дегликозилированных VH/VL-CrossMab в Трис-буфере, pH 8 при комнатной температуре в течение 120 ч и при 37°С в течение 40 мин соответственно. Перед осуществлением масс-спектрометрии образцы обессоливали с помощью ЖХВР на колонке Сефадекс G25 (фирма GE Healthcare). Общую массу определяли с помощью ESI-MC с использованием МС-системы maXis 4G UHR-QTOF, снабженной источником NanoMate TriVersa (фирма Advion).
Определение связывания или аффинности связывания мультиспецифических антител с соответствующими антигенами с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (BIAcore).
Связывание созданных антител с соответствующими антигенами (например, ANG2 и VEGF) изучали с помощью поверхностного плазмонного резонанса, применяя устройство BIAcore (фирма GE Healthcare Biosciences AB, Уппсала, Швеция). В целом, метод состоял в следующем: для оценки аффинности козьи античеловеческие антитела IgG-типа JIR 109-005-098 иммобилизовали на СМ5-чипе посредством аминного сочетания для презентации антител к соответствующему антигену. Связывание измеряли в HBS-буфере (HBS-P (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,005% Твин 20, pH 7,4) при 25°С (или в альтернативном варианте при 37°С). Добавляли антиген (фирма R&D Systems или очищенный в лаборатории заявителей) в различных концентрациях в растворе. Для измерения ассоциации инъекцию антигена осуществляли в течение промежутка времени, составляющего от 80 с до 3 мин; диссоциацию измеряли путем промывки поверхности чипа HBS-буфером в течение 3-10 мин и величину KD определяли, используя модель связывания Ленгмюра при соотношении 1:1. Данные, полученные для отрицательного контроля (например, кривые, полученные для буфера), вычитали из кривых для образца для коррекции присущей системе сдвигу и для снижения шумового сигнала. Соответствующую программу Biacore Evaluation применяли для анализа сенсограмм и для расчета данных об аффинности.
Пример 1А.
Производство и экспрессия мультиспецифических антител, которые связываются с ангиопоэтином2 (ANG2) и VEGF, с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с единичными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
В качестве первого примера создавали мультиспецифические антитела, которые связываются с человеческим ангиопоэтином-2 (ANG2) и человеческим VEGF, с помощью описанных в разделе Общие методы классических методик молекулярной биологии и кратковременно экспрессировали в HEK293клетках согласно описанному выше методу. Общая схема указанных соответствующих мультиспецифических антител представлена на фиг. 1А, 1В. Для сравнения получали также антитела дикого типа (wt) с обменом/заменой VH/VL-доменов, но без замены в поверхности раздела CH1/CL. Кроме того, для сравнения использовали также другие альтернативные замены в непосредственной близости к поверхности раздела CH1/CL (упомянутые, например, в EP 2647707). Мультиспецифические антитела экспрессировали, используя экспрессионные плазмиды, содержащие нуклеиновые кислоты, которые кодируют аминокислотные последовательности, представленные в табл. 2а.
- 25 036292
Таблица 2а. Аминокислотные последовательности легких цепей (LC) и тяжелых цепей (НС) мультиспецифических антител к Ang2-VEGF Ang2VEGF-0273, Ang2VEGF-0396, Ang2VEGF-0397,
Ang2VEGF-0394, Ang2VEGF-0395 с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL): дикого типа (wt) и с различными комбинациями единичных замен заряженных аминокислот______
Антитело LC ANG-2 HC ANG-2 HC VEGF LC VEGF
Ang2VEGF-0273 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
Ang2VEGF-0396 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
Ang2VEGF-0397 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
Ang2VEGF-0394 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
Ang2VEGF-0395 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
Для всех конструкций применяли технологию гетеродимеризации knobs into holes с типичной заменой, приводящей к образованию выступа (T366W) в первом CH3-домене, и соответствующими заменами, приводящими к образованию впадины (T366S, L368A и Y407V) во втором CH3-домене (а также интродукцию двух дополнительных остатков цистеина S354C/Y349'C) (которые содержались в соответствующих последовательностях тяжелых цепей (НС), указанных выше).
Пример 1Б.
Очистка и характеризация мультиспецифических антител, которые связываются с ангиопоэтином-2 (ANG2) и VEGF, с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с единичными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
Мультиспецифические антитела, экспрессия которых описана выше, очищали из супернатанта путем комбинации аффинной хроматографии на белке А и гель-фильтрации. Все мультиспецифические антитела можно получать с высокими выходами, и они являлись стабильными.
Полученные продукты характеризовали в отношении их идентичности с помощью массспектрометрии и определяли их аналитические свойства, такие как чистота, которую оценивали с помощью ДСН-ПААГ, содержание мономеров и стабильность.
Масс-спектрометрия.
Ожидаемые первичные структуры анализировали с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем (ESI-MC) дегликозилированных интактных CrossMab и дегликозилированных/расщепленных плазмином или в другом варианте дегликозилированных/ограниченно расщепленных LysC CrossMab.
VH/VL-CrossMab дегликозилировали с помощью N-гликозидазы F в фосфатном или Трис-буфере при 37°С в течение вплоть до 17 ч при концентрации белка 1 мг/мл. Расщепление плазмином или ограниченное расщепление LysC (фирма Roche) осуществляли, используя 100 мкг дегликозилированных VH/VL-CrossMab в Трис-буфере, pH 8 при комнатной температуре в течение 120 ч и при 37°С в течение 40 мин соответственно. Перед осуществлением масс-спектрометрии образцы обессоливали с помощью ЖХВР на колонке Сефадекс G25 (фирма GE Healthcare). Общую массу определяли с помощью ESI-MC с использованием МС-системы maXis 4G UHR-QTOF, снабженной источником NanoMate TriVersa (фирма Advion).
Результаты представлены в табл. 2б и на фиг. 4А.
Таблица 2б. Снижение содержания основного побочного продукта, полученного в результате бенс-джонсовского взаимодействия, путем единичных замен заряженных аминокислот, предлагаемых в изобретении, в поверхности раздела CH1/CL
CL ANG-2 (положение 124) CL ANG-2 (положение 123) CHI ANG-2 (положение 147) CHI ANG-2 (положение 213) CHI VEGF CL VEGF Основной побочный продукт (ошибочное спаривание бенсджонсовского типа) % с помощью МС
Ang2VEGF0273 wt: Q124 wt: E123 wt: K147 wt: K213 wt Wt ~20
Ang2VEGF0396 Q124K Wt K147E wt wt Wt _3
Ang2VEGF0397 Q124K Wt wt K213E wt Wt _3
Ang2VEGF0394 wt E123K K147E wt wt Wt Л5
Ang2VEGF0395 wt E123K wt K213E wt Wt Л5
Результаты, представленные в табл. 2б и на фиг. 4А, свидетельствуют о том, что с помощью замен единичных заряженных аминокислот на аминокислоты с противоположным зарядом в CH1- и CL-доменах, предлагаемых в изобретении/указанных в настоящем описании (пара CL:Q124K и CH1:K147E или пара CL:Q124K и CH1:K213E), содержание основного побочного продукта (полученного в результате ошибочного спаривания бенс-джонсовского типа) значительно снижалось по сравнению с мультиспецифическим антителом дикого типа без указанных замен (снижение на ~ 17%). При использо- 26 036292 вании других замен, находящихся в тесной близости от указанных (пара CL:Q123K и CH1:K147E или пара CL:Q123K CH1:K213E), обнаружено лишь небольшое снижение количества основного побочного продукта по сравнению с мультиспецифическим антителом дикого типа без указанных замен (снижение на ~5%).
Пример 1В.
Антигенсвязывающие свойства мультиспецифических антител, которые связываются с ангиопоэтином-2 (ANG2) и VEGF, с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с единичными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL
Связывание мультиспецифических антител, описанных выше в примерах 1А и 1Б, с соответствующими антигенами-мишеням, т.е. ANG2 и VEGF, оценивали с помощью BIAcore®.
Связывание с VEGF оценивали согласно следующей процедуре.
Связывание указанных антител с человеческим VEGFA-121 изучали с помощью поверхностного плазмонного резонанса, используя устройство BIAcore® T200 (фирма GE Healthcare). Примерно 10000 (RU) антитела к His (1 мкг/мл антитела к His; код заказа: 28995056; фирма GE Healthcare Bio-Sciences АВ, Швеция) сшивали с СМ5-чипом серий S (фирма GE Healthcare, BR-1005-30) при pH 5,0, применяя набор для аминного сочетания, поставляемый фирмой GE Healthcare. Буфер HBS-N (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4, фирма GE Healthcare) применяли в качестве подвижного буфера при осуществлении процедуры иммобилизации. При последующей характеризации кинетики буфер для образца и подвижный буфер представлял собой ЗФР-Т (10 мМ забуференный фосфатом физиологический раствор, включающий 0,05% Твин 20), pH 7,4. Температуру проточной ячейки устанавливали на 25°С, а температуру блока для образца устанавливали на 12°С и примировали дважды, используя подвижный буфер, перед осуществлением характеризации кинетики.
VEFGA-121-His захватывали путем инъекции раствора с концентрацией 0,5 мкг/мл в течение 30 с при скорости потока 5 мкл/мин. Ассоциацию измеряли путем инъекции указанных антител в различных концентрациях в растворе в течение 180 с при скорости потока 30 мкл/мин, начиная с 1000 нМ, осуществляя серийные разведения 1:3. Мониторинг фазы диссоциации осуществляли в течение промежутка времени, составляющего вплоть до 600 с, и ее запускали путем замены раствора для образца на подвижный буфер. Поверхность регенерировали путем 60-секундной промывки с помощью раствора глицина, pH 1,5 при скорости потока 30 мкл/мин. Все различия в коэффициентах преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного от поверхности, покрытой антителом к His. Вычитали также данные, полученные при осуществлении контрольных пустых инъекций (двойной контроль). Для расчета величины KD и других кинетических параметров применяли модель 1: 1 Лэнгмюра.
Связывание Ang-2 оценивали согласно следующей процедуре.
Связывание указанных антител с человеческим Ang-2-RBD-Fc изучали с помощью поверхностного плазмонного резонанса, используя устройство BIAcore® T200 (фирма GE Healthcare). Примерно 8000 (RU) козьего античеловеческого F(ab')2 (10 мкг/мл античеловеческого F(ab)'2; код заказа: 28958325; фирма GE Healthcare Bio-Sciences AB, Швеция) сшивали с СМ5-чипом серий S (фирма GE Healthcare, BR-1005-30) при pH 5,0, применяя набор для аминного сочетания, поставляемый фирмой GE Healthcare. Буфер HBS-N (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4, фирма GE Healthcare) применяли в качестве подвижного буфера при осуществлении процедуры иммобилизации. При последующей характеризации кинетики буфер для образца и подвижный буфер представлял собой ЗФР-Т (10 мМ забуференный фосфатом физиологический раствор, включающий 0,05% Твин 20), pH 7,4. Температуру проточной ячейки устанавливали на 25°С, а температуру блока для образца устанавливали на 12°С и примировали дважды, используя подвижный буфер, перед осуществлением характеризации кинетики.
Биспецифическое антитело захватывали путем инъекции раствора с концентрацией 5 нМ в течение 25 с при скорости потока 5 мкл/мин. Ассоциацию измеряли путем инъекции человеческого Ang2-RBD-Fc в различных концентрациях в растворе в течение 120 с при скорости потока 30 мкл/мин, начиная с 100 нМ, осуществляя серийные разведения 1:3. Мониторинг фазы диссоциации осуществляли в течение промежутка времени, составляющего вплоть до 180 с, и ее запускали путем замены раствора для образца на подвижный буфер. Поверхность регенерировали путем 60-секундной промывки с помощью раствора глицина, pH 2,1 при скорости потока 30 мкл/мин. Все различия в коэффициентах преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного от поверхности, покрытой козьим античеловеческим F(ab')2. Вычитали также данные, полученные при осуществлении контрольных пустых инъекций (двойной контроль). Для расчета кажущейся величины KD и других кинетических параметров применяли модель 1: 1 Лэнгмюра.
В качестве применяемого для сравнения примера параллельно изучали контрольное антитело, специфически связывающееся с Ang2 и VEGF, которое содержало обмен/замену VH/VL-доменов, но в котором отсутствовали замены заряженных аминокислот (антитело Ang2VEGF-0273 в табл. 2б).
Результаты представлены в табл. 2в и 2г.
- 27 036292
Таблица 2в. Аффинность к VEGF указанных антител
Образец KD (hM)
Ang2VEGF-0273 6
Ang2VEGF-0396 3
Ang2VEGF-0397 4
Ang2VEGF-0394 3
Ang2VEGF-0395 4
Таблица 2г. Аффинность к Ang2 указанных антител
Образец KD (hM)
Ang2VEGF-0273 15
Ang2VEGF-0396 17
Ang2VEGF-0397 14
Ang2VEGF-0394 12
Ang2VEGF-0395 15
Все протестированные антитела специфически связывались с обеими мишенями, т.е. Ang2 и VEGF, и величина их аффинности к антигену находилась в наномолярном диапазоне.
Пример 1Г.
Стабильность мультиспецифических антител, которые связываются с ангиопоэтином-2 (ANG2) и VEGF, с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с единичными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
Для оценки стабильности конструкций антител оценивали термостабильность, а также температуры начала агрегации согласно следующей процедуре.
Образцы указанных антител приготавливали в концентрации 1 мг/мл в 20 мМ гистидине/хлориде гистидина, 140 мМ NaCl, pH 6,0, переносили в набор 10-микролитровых кювет и фиксировали данные о статическом рассеянии света, а также данные о флуоресценции после возбуждения лазером при длине волны 266 нм с помощью устройства Optim1000 (фирма Avacta Inc.), при этом температуру образцов повышали со скоростью 0,1°С/мин с 25 до 90°С.
Температуру начал агрегации (Tagg) определяли как температуру, при которой начинает возрастать интенсивность рассеяния света. Температуру плавления (Tm) определяли как точку излома на графике зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны.
Результаты представлены в табл. 2д.
Таблица 2д. Температура начала агрегации (Tagg) и температура .плавления (Tm) указанных антител
Образец TaKK (°C) Tm (°C)
Ang2VEGF-0273 56,0 61,3
Ang2VEGF-0396 56,9 62,0
Ang2VEGF-0397 56,0 61,7
Ang2VEGF-0394 56,9 62,2
Ang2VEGF-0395 56,8 62,1
Пример 1Д.
Выход производства мультиспецифических антител, которые связываются с ангиопоэтином-2 (ANG2) и VEGF, с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с единичными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
Выходы производства указанных мультиспецифических антител оценивали после очистки на белке A (ProtA). Результаты представлены в табл. 2е.
Таблица 2е. Выходы производства [мг/л супернатанта] указанных антител
Образец ProtA
Ang2VEGF-0273 65
Ang2VEGF-0396 80,8
Ang2VEGF-0397 68,4
Ang2VEGF-0394 79,2
Ang2VEGF-0395 93,6
Пример 2А.
Производство и экспрессия мультиспецифических антител, которые связываются с ангиопоэтином2 (ANG2) и VEGF, с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с различными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
В качестве первого примера создавали мультиспецифические антитела, которые связываются с человеческим ангиопоэтином-2 (ANG2) и человеческим VEGF, согласно классическим методикам молекулярной биологии, описанным в разделе Общие методы, и кратковременно экспрессировали в HEK293клетках согласно описанному выше методу. Общая схема указанных соответствующих мультиспецифических антител представлена на фиг. 1А, 1В. Для сравнения получали также антитела дикого типа (wt) с обменом/заменой VH/VL-доменов, но без замены в поверхности раздела CH1/CL. Мультиспецифические антитела экспрессировали, используя экспрессионные плазмиды, содержащие нуклеиновые кислоты, которые кодируют аминокислотные последовательности, представленные в табл. 3а.
- 28 036292
Таблица 3а. Аминокислотные последовательности легких цепей (LC) и тяжелых цепей (НС) мультиспецифических антител к Ang2-VEGF Ang2VEGF-0273, Ang2VEGF-0274, Ang2VEGF-0282,
Ang2VEGF-0283, Ang2VEGF-0284, Ang2VEGF-0285, Ang2VEGF-0286 с обменом/заменой VH/VLдоменов (CrossMAbVH-VL): дикого типа (wt) и с различными комбинациями замен заряженных аминокислот
Антитело LC ANG-2 HC ANG-2 HC VEGF LC VEGF
Ang2VEGF-0273 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
Ang2VEGF-0274 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
Ang2VEGF-0282 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 12
Ang2VEGF-0283 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
Ang2VEGF-0284 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
Ang2VEGF-0285 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 12
Ang2VEGF-0286 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 12
Для всех конструкций применяли технологию гетеродимеризации knobs into holes с типичной заменой, приводящей к образованию выступа (T366W) в первом CH3-домене и соответствующими заменами, приводящими к образованию впадины (T366S, L368A и Y407V) во втором CH3-домене (а также интродукцию двух дополнительных остатков цистеина S354C/Y349'C) (которые содержались в соответствующих последовательностях тяжелых цепей (НС), указанных выше).
Пример 2Б.
Очистка и характеризация мультиспецифических антител, которые связываются с ангиопоэтином-2 (ANG2) и VEGF, с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с различными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
Мультиспецифические антитела, экспрессия которых описана выше, очищали из супернатанта путем комбинации аффинной хроматографии на белке А и гель-фильтрации. Все мультиспецифические антитела можно получать с высокими выходами, и они являлись стабильными.
Полученные продукты характеризовали в отношении их идентичности с помощью массспектрометрии и определяли их аналитические свойства, такие как чистота, которую оценивали с помощью ДСН-ПААГ, содержание мономеров и стабильность.
Масс-спектрометрия.
Ожидаемые первичные структуры анализировали с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем (ESI-MC) дегликозилированных интактных CrossMab и дегликозилированных/расщепленных плазмином или в другом варианте дегликозилированных/ограниченно расщепленных LysC CrossMab.
VH/VL-CrossMab дегликозилировали с помощью N-гликозидазы F в фосфатном или Трис-буфере при 37°С в течение вплоть до 17 ч при концентрации белка 1 мг/мл. Расщепление плазмином или ограниченное расщепление LysC (фирма Roche) осуществляли, используя 100 мкг дегликозилированных VH/VL-CrossMab в Трис-буфере, pH 8 при комнатной температуре в течение 120 ч и при 37°С в течение 40 мин соответственно. Перед осуществлением масс-спектрометрии образцы обессоливали с помощью ЖХВР на колонке Сефадекс G25 (фирма GE Healthcare). Общую массу определяли с помощью ESI-MC с использованием МС-системы maXis 4G UHR-QTOF, снабженной источником NanoMate TriVersa (фирма Advion).
Результаты представлены в табл. 3б и на фиг. 5А.
- 29 036292
Таблица 3б. Снижение содержания основного побочного продукта, полученного в результате бенсджонсовского взаимодействия, путем единичных замен заряженных аминокислот, предлагаемых в изобретении, в поверхности раздела CH1/CL________________________________________________
CL ANG-2 CL ANG2 CHI ANG2 CHI ANG2 CHI VEGF CL VEGF Основной побочный продукт (ошибочное спаривание бенсджонсовского типа) % с помощью МС
Ang2VEGF0273 wt: Q124 (каппа) wt: E123 wt: K147 wt: K213 wt wt: Q124 -20%
Ang2VEGF0274 Q124K E123K K147E K213E wt Wt 0
Ang2VEGF0282 Q124R E123K K147E K213E wt Q124E 0
Ang2VEGF0283 E124K (лямбда) E123K K147E K213E wt wt: 0
Ang2VEGF0284 Q124R E123K K147E K213D wt Wt 0
Ang2VEGF0285 Q124R E123K K147E K213D wt Q124E 0
Ang2VEGF0286 Q124K E123K K147E K213E wt Q124E 0
Результаты, представленные в табл. 3б и на фиг. 5А, свидетельствуют о том, что с помощью двойных замен заряженных аминокислот на аминокислоты с противоположным зарядом в CH1- и CL-доменах, предлагаемых в изобретении/указанных в настоящем описании (CL:Q124K/E123K и CH1:K147E/K213E; CL:Q124R/E123K и CH1:K147E/K213E; CL:Q124R/E123K и CH1:K147E/K213D), основной побочный продукт (полученный в результате ошибочного спаривания бенс-джонсовского типа) полностью отсутствовал при сравнении с мультиспецифическим антителом дикого типа без указанных замен. Это не зависело от дополнительной единичной замены Q124E в CL-домене другого связывающего плеча, которая не влияла ни на экспрессию, ни на профиль побочных продуктов.
Пример 2В.
Антигенсвязывающие свойства мультиспецифических антител, которые связываются с ангиопоэтином-2 (ANG2) и VEGF, с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с различными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
Связывание мультиспецифических антител, описанных выше в примерах 2А и 2Б, с соответствующими антигенами-мишенями, т.е. ANG2 и VEGF, оценивали с помощью BIAcore® согласно методу, изложенному в примере 1В.
В качестве применяемого для сравнения примера параллельно изучали контрольное антитело, специфически связывающееся с Ang2 и VEGF, которое содержало обмен/замену VH/VL-доменов, но в котором отсутствовали замены заряженных аминокислот (антитело Ang2VEGF-0273 в табл. 2б).
Результаты представлены в табл. Зв и Зг.
Таблица Зв. Аффиность к VEGF указанных антител
Образец KD (нМ)
Ang2VEGF-0273 6
Ang2VEGF-0274 3
Ang2VEGF-0282 4
Ang2VEGF-0283 4
Ang2VEGF-0284 4
Ang2VEGF-0285 4
Ang2VEGF-0286 4
Таблица Зг. Аффинность к Ang2 указанных антител
Образец KD (нМ)
Ang2VEGF-0273 15
Ang2VEGF-0274 17
Ang2VEGF-0282 14
Ang2VEGF-0283 15
Ang2VEGF-0284 13
Ang2VEGF-0285 14
Ang2VEGF-0286 12
Все протестированные антитела специфически связывались с обеими мишенями, т.е. Ang2 и VEGF, и величина их аффинности к антигену находилась в наномолярном диапазоне.
Пример 2Г.
Стабильность мультиспецифических антител, которые связываются с ангиопоэтином-2 (ANG2) и VEGF, с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с единичными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
- 30 036292
Для оценки стабильности конструкций антител оценивали термостабильность, а также температуры начала агрегации согласно процедуре, изложенной в примере 1Г.
Результаты представлены в табл. 3д.
Таблица 3д. Температура начала агрегации (Tagg) и температура плавления (Tm) указанных антител
Образец TaKK (°C) Tm (°C)
Ang2VEGF-0273 56,0 61,3
Ang2VEGF-0274 53,5 58,9
Ang2VEGF-0282 56,9 61,4
Ang2VEGF-0283 56,3 61,0
Ang2VEGF-0284 56,3 61,1
Ang2VEGF-0285 56,3 61,1
Ang2VEGF-0286 56,3 61,6
Пример 3А.
Производство и экспрессия мультиспецифических антител, которые связываются с IL-17 и TWEAK, с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с различными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
В качестве первого примера создавали мультиспецифические антитела, которые связываются с человеческим IL-17 и человеческим TWEAK, согласно классическим методикам молекулярной биологии, описанным в разделе Общие методы, и кратковременно экспрессировали в HEK293-клетках согласно описанному выше методу. Общая схема указанных соответствующих мультиспецифических антител представлена на фиг. 1А, 1В. Для сравнения получали также антитела дикого типа (wt) с обменом/заменой VH/VL-доменов, но без замены в поверхности раздела CH1/CL. Мультиспецифические антитела экспрессировали, используя экспрессионные плазмиды, содержащие нуклеиновые кислоты, которые кодируют аминокислотные последовательности, представленные в табл. 4а.
Таблица 4а. Аминокислотные последовательности легких цепей (ХС) и тяжелых цепей (НС) мультиспецифических антител к TWEAK-IL-17, TweakIL-17-0096, TweakIL-17-0097, TweakIL-17-0098, TweakIL-17-0099, TweakIL 17-0100, TweakIL-17-0101 с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL): дикого типа (wt) и с различными комбинациями замен заряженных аминокислот
Антитело LC IL17 HC IL17 HC TWEAK LC TWEAK
TweakIL 17-0096 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
TweakIL 17-0097 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 21
TweakIL17-0098 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
TweakIL17-0099 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 21
TweakIL17-0100 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 21
TweakIL 17-0101 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
Для всех конструкций применяли технологию гетеродимеризации knobs into holes с типичной заменой, приводящей к образованию выступа (T366W) в первом CH3-домене и соответствующими заменами, приводящими к образованию впадины (T366S, L368A и Y407V) во втором Cffi-домене (а также интродукцию двух дополнительных остатков цистеина S354C/Y349'C) (которые содержались в соответствующих последовательностях тяжелых цепей (НС), указанных выше).
Пример 3Б.
Очистка и характеризация мультиспецифических антител, которые связываются с IL-17 и TWEAK, с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с различными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
Мультиспецифические антитела, экспрессия которых описана выше, очищали из супернатанта путем комбинации аффинной хроматографии на белке А и гель-фильтрации. Все мультиспецифические антитела можно получать с высокими выходами, и они являлись стабильными.
Полученные продукты характеризовали в отношении их идентичности с помощью массспектрометрии и определяли их аналитические свойства, такие как чистота, которую оценивали с помощью ДСН-ПААГ, содержание мономеров и стабильность.
Масс-спектрометрия.
Ожидаемые первичные структуры анализировали с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем (ESI-MC) дегликозилированных интактных CrossMab и дегликозилированных/расщепленных плазмином или в другом варианте дегликозилированных/ограниченно расщепленных LysC CrossMab.
VH/VL-CrossMab дегликозилировали с помощью N-гликозидазы F в фосфатном или Трис-буфере при 37°С в течение вплоть до 17 ч при концентрации белка 1 мг/мл. Расщепление плазмином или ограниченное расщепление LysC (фирма Roche) осуществляли, используя 100 мкг дегликозилированных VH/VL-CrossMab в Трис-буфере, pH 8 при комнатной температуре в течение 120 ч и при 37°С в течение 40 мин соответственно. Перед осуществлением масс-спектрометрии образцы обессоливали с помощью ЖХВР на колонке Сефадекс G25 (фирма GE Healthcare). Общую массу определяли с помощью ESI-MC с использованием МС-системы maXis 4G UHR-QTOF, снабженной источником NanoMate TriVersa (фирма
- 31 036292
Advion).
Результаты представлены в табл. 4б и на фиг. 6А.
Таблица 4б. Снижение содержания основного побочного продукта, полученного в результате бенсджонсовского взаимодействия, путем единичных замен заряженных аминокислот, предлагаемых в изобретении, в поверхности раздела CH1/CL____________________________________________________
CL IL17 (положение 124) CL IL17 (положение 123) CHI IL17 (положение 147) CHI IL17 (положение 213) CHI TWEAK CL TWEAK (положение 124) Основной побочный продукт (ошибочное спаривание бенсджонсовского типа) % с помощью МС
TweakIL170096 wt: Q124 wt: E123 wt: K147 wt: K213 wt wt: Q124 -20%
TweakIL170097 Q124K E123R K147E K213E wt Q124E 0
TweakIL170098 Q124K E123R K147E K213D wt wt 0
TweakIL170099 Q124K E123R K147E K213D wt Q124E 0
TweakIL170100 Q124K E123K K147E K213E wt Q124E 0
TweakIL170101 Q124K E123K K147E K213E wt wt не определяли
Результаты, представленные в табл. 4б и на фиг. 6А, свидетельствуют о том, что с помощью двойных замен заряженных аминокислот на аминокислоты с противоположным зарядом в CH1- и CL-доменах, предлагаемых в изобретении/указанных в настоящем описании (CL:Q124K/E123R и CH1:K147E/K213E; CL:Q124K/E123R и CH1:K147E/K213D; CL:Q124K/E123K и CH1:K147E/K213E), основной побочный продукт (полученный в результате ошибочного спаривания бенс-джонсовского типа) полностью отсутствовал при сравнении с мультиспецифическим антителом дикого типа без указанных замен. Это не зависело от дополнительной единичной замены Q124E в CL-домене другого связывающего плеча, которая не влияла ни на экспрессию, ни на профиль побочных продуктов.
Пример 4А.
Производство и экспрессия двухвалентных и трехвалентных мультиспецифических антител, которые связываются с Ang2 и VEGF, где антитела лишены Fc-фрагментов и включают обмен/замену VH/VL-доменов в одном связывающем плече и одну или несколько замен заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
В качестве дополнительного примера создавали мультиспецифические антитела, которые связываются с человеческим ANG2 и человеческим VEGF, с помощью описанных в разделе Общие методы классических методик молекулярной биологии и кратковременно экспрессировали в HEK293-клетках согласно описанному выше методу. Созданные антитела имели в связывающем плече, специфично связывающемся с VEGF, Fab-фрагмент с обменом VH/VL-доменов и в другом связывающем плече, специфично связывающемся с Ang2, Fab-фрагмент без обмена доменов, при этом в мультиспецифическом антителе отсутствовал Fc-фрагмент. Таким образом, первую легкую цепь получали из антитела, которое специфически связывается с человеческим Ang2 и содержит в направлении от N-конца к С-концу домены VL-CL. Тяжелые цепи первого (анти-Ang2) и второго (анти-VEGF) антител связывали с помощью глицин-серинового пептидного линкера. В тяжелой цепи антитела, специфически связывающегося с VEGF, исходный вариабельный домен VH заменяли на вариабельный домен VL, полученный из антитела к VEGF. Таким образом, полипептид, содержащий тяжелые цепи антител к Ang2 и к VEGF, содержал в направлении от N-конца к С-концу домены VH(Ang2)-CH1(Ang2)-линкер-VL(VEGF)-CH1(VEGF). В легкой цепи, специфически связывающейся с человеческим VEGF, исходный вариабельный домен VL заменяли на вариабельный домен VH, полученный из антитела к VEGF. Таким образом, модифицированная легкая цепь антитела к EGF содержал в направлении от N-конца к С-концу домены VH-CL. Замены конкретных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL представлены в табл. 5б.
В этом примере создавали мультиспецифические антитела, имеющие три основные структуры:
I) двухвалентное мультиспецифическое (биспецифическое) антитело к Ang2-VEGF формата CrossFabVH-VL-(Fab) (общая структура представлена на фиг. 7Г);
II) трехвалентное мультиспецифическое (биспецифическое) антитело к Ang2-VEGF формата (CrossFabVH-VL)2-Fab (общая структура представлена на фиг. 8В (neu));
III) трехвалентное мультиспецифическое (биспецифическое) антитело к Ang2-VEGF формата (Fab)2-CrossFabVH-VL (общая структура представлена на фиг. 8Г).
Для сравнения получали также антитела дикого типа (wt) с обменом/заменой VH/VL-доменов, но без замены в поверхности раздела CH1/CL. Мультиспецифические антитела экспрессировали, используя экспрессионные плазмиды, содержащие нуклеиновые кислоты, которые кодируют аминокислотные последовательности, представленные в табл. 5а.
- 32 036292
Таблица 5а. Аминокислотные последовательности легких цепей (LC) и тяжелых цепей (НС) мультиспецифических антител к Ang2-VEGF с обменом/заменой VH/VL-доменов: дикого типа (незаряженные) и с различными комбинациями замен заряженных аминокислот (заряженные)
Антитело LC Ang2 HC LC VEGF
xFab-Fab<ANG2-VEGF>-HC3apn7KCHHOC (Ang2 VEGF-0452) SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 4
xFab-Fab<ANG2-VEGF>-3apa;KeHHoe (Ang2 VEGF-0447) SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 4
xFab2-Fab<ANG2-VEGF>-HC3apH7i<CHH0C (Ang2VEGF-0453) SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 4
xFab2-Fab<ANG2-VEGF>-3apH:®eHHoe (Ang2 VEGF-0448) SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 4
РаЬ2-хРаЬ<АМС2-УЕСЕ>-незаряженное SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 4
Fab2-xFab<ANG2-VEGF>-3apna<eHHoe SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 4
Таблица 5б. Аминокислотные замены в поверхности раздела CH1/CL в антителах, предлагаемых в изобретении, которые указаны в табл. 5а__________________________________________________
Ang2 VEGF
CL (положение 124) CL (положение 123) CHI (положение 147) CHI (положение 213) CHI CL (положение 124)
xFab-Fab<ANG2УЕСР>-незаряженное (Ang2VEGF-0452) wt: Q124 wt: E123 wt: K147 wt: K213 wt wt: Q124
xFab-Fab<ANG2УЕСР>-заряженное (Ang2VEGF-0447) Q124R E123K K147E K123E wt Wt
xFab2-Fab<ANG2УЕОР>-незаряженное (Ang2VEGF-0453) wt: Q124 wt: E123 wt: K147 wt: K213 wt wt: Q124
xFab2-Fab<ANG2УЕСР>-заряженное (Ang2VEGF-0448) Q124R E123K K147E K123E wt Wt
Fab2-xFab<ANG2УЕСР>-незаряженное wt: Q124 wt: E123 wt: K147 wt: K213 wt wt: Q124
Fab2-xFab<ANG2УЕСР>-заряженное Q124R E123K K147E K123E wt Wt
Пример 4Б.
Производство и экспрессия двухвалентных и трехвалентных мультиспецифических антител, которые связываются с Ang2 и VEGF, где антитела лишены Fc-фрагментов и включают обмен/замену VH/VL-доменов в одном связывающем плече и различные замены заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
Секретируемый белок очищали стандартными методами аффинной очистки.
Выходы производства после аффинной очистки и фракция молекулы антитела, определенная с помощью аналитической гель-фильтрации, представлены в табл. 5в.
Таблица 5в. Выход производства и фракция требуемого антитела после аффинной очистки
Антитело Выход [мг/л] Фракция [%] антитела, определенная с помощью аналитической ГФ
Ang2VEGF0452 37,8 64,1
Ang2VEGF0447 26,7 88,5
Ang2VEGF0453 4,2 88,5
Ang2VEGF0448 9,7 92,4
Масс-спектрометрия.
Ожидаемые первичные структуры анализировали с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем (ESI-MC) дегликозилированных интактных CrossMab и дегликозилированных/расщепленных плазмином или в другом варианте дегликозилированных/ограниченно расщепленных LysC CrossMab.
Конструкции VH/VL Fab-CrossFab дегликозилировали с помощью N-гликозидазы F в фосфатном или Трис-буфере при 37°С в течение вплоть до 17 ч при концентрации белка 1 мг/мл. Расщепление плазмином или ограниченное расщепление LysC (фирма Roche) осуществляли, используя 100 мкг дегликозилированных VH/VL-CrossMab в Трис-буфере, pH 8 при комнатной температуре в течение 120 ч и при 37°С в течение 40 мин соответственно. Перед осуществлением масс-спектрометрии образцы обессоливали с помощью ЖХВР на колонке Сефадекс G25 (фирма GE Healthcare). Общую массу определяли с по- 33 036292 мощью ESI-MC с использованием МС-системы maXis 4G UHR-QTOF, снабженной источником
NanoMate TriVersa (фирма Advion).
Из-за перекрывания диапазона масс представленного продукта и масс, полученных при создании методами МС, образцы оценивали с помощью двух различных методов для обнаружения потенциальных побочных продуктов в более высоком диапазоне масс. При работе в более высоком диапазоне масс (1000-4000 m/z) метод включал CID (светоизлучающий диод)-напряжение (в данном случае с CID 90), при измерении в более низком диапазоне масс (600-2000) не применяли CID. При применении CID повышался шанс получения фрагментов, которые появлялись в источнике фрагментации в массспектрометре.
Результаты представлены в табл. 5г.
Таблица 5г. Результаты количественной оценки побочных продуктов указанных антител по данным МС-анализа относительно требуемой основной молекулы_________________________________
Антитело Фракция побочных продуктов [%] по данным МС Побочный продукт
Ang2VEGF0452 6% ошибочно спаренный побочный продукт с двумя легкими цепями VL-CL антитела к Ang2
Ang2VEGF0447 0 не обнаружен
Ang2VEGF0453 4,4%; 35,7% ошибочно спаренный побочный продукт с тремя легкими цепями VL-CL антитела к Ang; ошибочно спаренный побочный продукт с двумя легкими цепями VL-CL антитела к Ang и одной цепью VH-CL антитела к VEGF
Ang2VEGF0448 0 не обнаружен
Пример 4В.
Антигенсвязывающие свойства двухвалентных и трехвалентных мультиспецифических антител, которые связываются с ANG2 и VEGF, где антитела лишены Fc-фрагментов и включают обмен/замену VH/VL-доменов в одном связывающем плече и различные замены заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
Связывание мультиспецифических антител, описанных выше в примерах 4А и 4Б, с соответствующими антигенами-мишенями, т.е. ANG2 и VEGF, оценивали с помощью BIAcore®.
Связывание с VEGF оценивали согласно следующей процедуре.
Связывание указанных антител с человеческим VEGFA-121 изучали с помощью поверхностного плазмонного резонанса, используя устройство BIAcore® T200 (фирма GE Healthcare). Для этой цели 50 RU VEFGA-121-His сшивали с С1-чипом серии S (фирма GE Healthcare BR-1005-35) при pH 5,0, применяя набор для аминного сочетания, поставляемый фирмой GE Healthcare. Буфер HBS-N (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4, фирма GE Healthcare) применяли в качестве подвижного буфера при осуществлении процедуры иммобилизации. При последующей характеризации кинетики буфер для образца и подвижный буфер представлял собой ЗФР-Т (10 мМ забуференный фосфатом физиологический раствор, включающий 0,05% Твин 20), pH 7,4. Температуру проточной ячейки устанавливали на 25°С, а температуру блока для образца устанавливали на 12°С и примировали дважды, используя подвижный буфер, перед осуществлением характеризации кинетики.
Ассоциацию измеряли путем инъекции указанных антител в различных концентрациях в растворе в течение 180 с при скорости потока 30 мкл/мин, начиная с 100 нМ, осуществляя серийные разведения 1:3. Мониторинг фазы диссоциации осуществляли в течение промежутка времени, составляющего вплоть до 300 с, и ее запускали путем замены раствора образца на подвижный буфер. Поверхность регенерировали путем 60-секундной промывки с помощью 0,85% раствора Н3РО4 (фосфорная кислота) при скорости потока 30 мкл/мин. Все различия в коэффициентах преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного от поверхности, покрытой антителом к His. Вычитали также данные, полученные при осуществлении контрольных пустых инъекций (двойной контроль). Для расчета величины KD и других кинетических параметров применяли модель 1: 1 Лэнгмюра.
Связывание Ang-2 оценивали согласно следующей процедуре.
Связывание указанных антител с человеческим Ang-2-RBD-Fc изучали с помощью поверхностного плазмонного резонанса, используя устройство BIAcore® T200 (фирма GE Healthcare). Примерно 8000 (RU) козьего античеловеческого F(ab')2 (10 мкг/мл античеловеческого F(ab)'2; код заказа: 28958325; фирма GE Healthcare Bio-Sciences AB, Швеция) сшивали с СМ5-чипом серий S (фирма GE Healthcare, BR-1005-30) при pH 5,0, применяя набор для аминного сочетания, поставляемый фирмой GE Healthcare. Буфер HBS-N (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4, фирма GE Healthcare) применяли в качестве подвижного буфера при осуществлении процедуры иммобилизации. При последующей характеризации кинетики буфер для образца и подвижный буфер представлял собой ЗФР-Т (10 мМ забуференный фосфатом физиологический раствор, включающий 0,05% Твин 20), pH 7,4. Температуру проточной ячейки уста- 34 036292 навливали на 25°С, а температуру блока для образца устанавливали на 12°С и примировали дважды, используя подвижный буфер перед осуществлением характеризации кинетики.
Биспецифическое антитело захватывали путем инъекции раствора с концентрацией 5 нМ в течение 25 с при скорости потока 5 мкл/мин. Ассоциацию измеряли путем инъекции человеческого Ang2-RBD-Fc в различных концентрациях в растворе в течение 120 с при скорости потока 30 мкл/мин, начиная с 100 нМ, осуществляя серийные разведения 1:3. Мониторинг фазы диссоциации осуществляли в течение промежутка времени, составляющего вплоть до 180 с, и ее запускали путем замены раствора образца на подвижный буфер. Поверхность регенерировали путем 60-секундной промывки с помощью раствора глицина, pH 2,1 при скорости потока 30 мкл/мин. Все различия в коэффициентах преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного от поверхности, покрытой козьим античеловеческим F(ab')2. Вычитали также данные, полученные при осуществлении контрольных пустых инъекций (двойной контроль). Для расчета кажущейся величины KD и других кинетических параметров применяли модель 1: 1 Лэнгмюра.
Результаты представлены в табл. 5д и 5е.
Таблица 5д. Аффинность к VEGF указанных антител
Антитело KD (нМ)
Ang2VEGF-0452 0,35
Ang2VEGF-0447 0,36
Ang2VEGF-0453 0,22
Ang2VEGF-0448 0,18
Таблица 5е. Аффинность к Ang2 указанных антител
Антитело KD (нМ)
Ang2VEGF-0452 3
Ang2VEGF-0447 3
Ang2VEGF-0453 5
Ang2VEGF-0448 4
Связывание с антигеном не нарушалось мутациями, интродуцированными в поверхность раздела CH1/CL антител, у которых отсутствует Fc.
Пример 5А.
Производство и экспрессия мультиспецифических антител, которые связываются с ангиопоэтином2 (ANG2) и VEGF с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в VEGF-связывающем плече и с различными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL в VEGF-связывающем плече.
В качестве дополнительного примера создавали мультиспецифические антитела, которые связываются с человеческим ангиопоэтином-2 (ANG2) и человеческим VEGF, с помощью описанных в разделе Общие методы классических методик молекулярной биологии и кратковременно экспрессировали в HEK293-клетках согласно описанному выше методу. Общая схема указанных соответствующих мультиспецифических антител представлена на фиг. 1Б, на которой продемонстрировано, что замена различных заряженных аминокислот присутствует в поверхности раздела CH1/CL связывающего плеча, которое содержит обмен/замену VH/VL-доменов. Для сравнения получали также антитела дикого типа (wt) с обменом/заменой VH/VL-доменов, но без замены в поверхности раздела CH1/CL. Мультиспецифические антитела экспрессировали, используя экспрессионные плазмиды, содержащие нуклеиновые кислоты, которые кодируют аминокислотные последовательности, представленные в табл. 6а.
Таблица 6а. Аминокислотные последовательности легких цепей (LC) и тяжелых цепей (НС) мультиспецифических антител к Ang2-VEGF Ang2VEGF-0273, Ang2VEGF-0425 и Ang2VEGF-0424 с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL): дикого типа (wt) и с различными комбинациями замен заряженных аминокислот
Антитело LC ANG-2 HC ANG-2 HC VEGF LC VEGF
Ang2VEGF-0273 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
Ang2VEGF-0425 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45
Ang2VEGF-0424 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47
Для всех конструкций применяли технологию гетеродимеризации knobs into holes с типичной заменой, приводящей к образованию выступа (T366W) в первом CH3-домене и соответствующими заменами, приводящими к образованию впадины (T366S, L368A и Y407V) во втором CH3-домене (а также интродукцию двух дополнительных остатков цистеина S354C/Y349'C) (которые содержались в соответствующих последовательностях тяжелых цепей (НС), указанных выше).
Пример 5Б.
Очистка и характеризация мультиспецифических антител, которые связываются с ангиопоэтином-2 (ANG2) и VEGF с обменом/заменой VH/VL-доменов (CrossMAbVH-VL) в одном связывающем плече и с различными заменами заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL.
Мультиспецифические антитела, экспрессия которых описана выше, очищали из супернатанта путем комбинации аффинной хроматографии на белке А и гель-фильтрации. Все мультиспецифические
- 35 036292 антитела можно получать с высокими выходами, и они являлись стабильными.
Полученные продукты характеризовали в отношении их идентичности с помощью массспектрометрии и определяли их аналитические свойства, такие как чистота, которую оценивали с помощью ДСН-ПААГ, содержание мономеров и стабильность.
Масс-спектрометрия.
Ожидаемые первичные структуры анализировали с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем (ESI-MC) дегликозилированных интактных CrossMab и дегликозилированных/расщепленных плазмином или в другом варианте дегликозилированных/ограниченно расщепленных LysC CrossMab.
VH/VL-CrossMab дегликозилировали с помощью N-гликозидазы F в фосфатном или Трис-буфере при 37°С в течение вплоть до 17 ч при концентрации белка 1 мг/мл. Расщепление плазмином или ограниченное расщепление LysC (фирма Roche) осуществляли, используя 100 мкг дегликозилированных VH/VL-CrossMab в Трис-буфере, pH 8 при комнатной температуре в течение 120 ч и при 37°С в течение 40 мин соответственно. Перед осуществлением масс-спектрометрии образцы обессоливали с помощью ЖХВР на колонке Сефадекс G25 (фирма GE Healthcare). Общую массу определяли с помощью ESI-MC с использованием МС-системы maXis 4G UHR-QTOF, снабженной источником NanoMate TriVersa (фирма Advion).
Результаты представлены в табл. 6б.
Таблица 6б. Профиль побочного продукта, полученного (в результате бенс-джонсовского взаимодействия) путем единичных замен заряженных аминокислот в поверхности раздела CH1/CL в связывающем плече, которое содержит обмен/замену VH/VL-доменов_______________________________
CL ANG-2 CHI ANG2 CHI VEGF CL VEGF Требуемая молекула Основной побочный продукт (ошибочное спаривание бенсджонсовского типа) % с помощью МС
Ang2VEGF0273 wt (каппа) wt wt K147 K213 wt E123 Q124 n.d. -20%
Ang2VEGF0425 wt wt K147E Q124K 72% 22%
Ang2VEGF0424 wt wt K147E K213E E123K Q124K 64% 26%
Результаты, представленные в табл. 6б, продемонстрировали, что профиль побочного продукта (включая продукт, полученный в результате ошибочного спаривания бенс-джонсовского типа) не удалось улучшить для биспецифических антител к Ang2-VEGF с аминокислотными заменами в поверхности раздела CH1/CL, локализованными в связывающем плече, которое содержит обмен/замену VH/VL-доменов.

Claims (12)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения мультиспецифического антитела, включающий стадии, на которых:
    A) трансформируют клетку-хозяина векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют:
    а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь первого антитела, которое специфически связывается с первым антигеном; и
    б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь второго антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном и в котором вариабельные домены VL и VH во второй легкой цепи и второй тяжелой цепи второго антитела заменены друг на друга; и в котором:
    I) в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота); или
    II) в константном домене CL второй легкой цепи, указанной в подпункте б), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) и в котором в константном домене CH1 второй тяжелой цепи, указанной в подпункте б), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота);
    Б) культивируют клетку-хозяина в условиях, обеспечивающих синтез указанной молекулы антитела; и
    B) выделяют указанную молекулу антитела из указанной культуральной среды.
  2. 2. Способ по п.1, где в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), ами-
    - 36 036292 нокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K) или аргинин (R).
  3. 3. Способ по п.1, где в константном домене CL второй легкой цепи, указанной в подпункте б), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K) или аргинин (R).
  4. 4. Способ по п.1, в котором у указанной молекулы антитела в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K) или аргинин (R) (нумерация согласно Кэботу),и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в (а), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
  5. 5. Способ по п.1 или 4, в котором у указанной молекулы антитела в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в (а), аминокислота в положении 147 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
  6. 6. Способ по п.4, в котором у указанной молекулы антитела в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) (в одном предпочтительном варианте независимо на лизин (K) или аргинин (R)) и дополнительно аминокислота в положении 123 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в (а), аминокислота в положении 147 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота) и аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
  7. 7. Способ по п.1, в котором у указанной молекулы антитела в константном домене CL второй легкой цепи, указанной в подпункте б), аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H) (нумерация согласно Кэботу) (в одном предпочтительном варианте независимо на лизин (K) или аргинин (R)) и в котором в константном домене CH1 второй тяжелой цепи, указанной в (б), аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (E) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
  8. 8. Способ по п.4, в котором в константном домене CL первой легкой цепи, указанной в подпункте а), аминокислота в положении 124 заменена на лизин (K) (нумерация согласно Кэботу) и дополнительно аминокислота в положении 123 заменена на лизин (K) (нумерация согласно Кэботу) и в котором в константном домене CH1 первой тяжелой цепи, указанной в (а), аминокислота в положении 147 заменена на глутаминовую кислоту (E) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота) и аминокислота в положении 213 заменена на глутаминовую кислоту (E) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
  9. 9. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что для стимулирования формирования мультиспецифического антитела в CH3 домене одной тяжелой цепи, который соприкасается в процессе формирования антитела с CH3 доменом другой тяжелой цепи, аминокислотный остаток, имеющий меньшую по объему боковую цепь, выбранный из группы, состоящей из аланина (А), серина (S), треонина (T) и валина (V), заменяют на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, выбранный из группы, включающей аргинин (R), фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W), с образованием выпуклости на поверхности CH3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость на поверхности CH3 домена другой тяжелой цепи, а в CH3 домене другой тяжелой цепи, который соприкасается в процессе формирования антитела с CH3 доменом одной указанной выше тяжелой цепи, аминокислотный остаток, имеющий большую по объему боковую цепь, выбранный из группы, включающей аргинин (R), фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W), заменяют на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, выбранный из группы, состоящей из аланина (А), серина (S), треонина (T) и валина (V), с образованием полости на поверхности раздела CH3-домена другой тяжелой цепи, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела СНЗ-одной тяжелой цепи.
  10. 10. Способ по п.8, отличающийся тем, что оба CH3-домена дополнительно изменены путем интродукции цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующие положения каждого ОИЗ-домена таким образом, чтобы мог образоваться дисульфидный мостик между обоими ОИЗ-доменами.
  11. 11. Экспрессионный вектор, содержащий молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей мультиспецифичного антитела, охарактеризованного в пп.1-10, который обладает способностью экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в клетке-хозяине.
  12. 12. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело, полученное способом по одному из пп.110, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
EA201691991A 2014-04-02 2015-04-01 Способ получения мультиспецифического антитела, экспрессионный вектор и фармацевтическая композиция, содержащая это антитело EA036292B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14163165 2014-04-02
EP14179034 2014-07-30
PCT/EP2015/057165 WO2015150447A1 (en) 2014-04-02 2015-04-01 Multispecific antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201691991A1 EA201691991A1 (ru) 2017-04-28
EA036292B1 true EA036292B1 (ru) 2020-10-22

Family

ID=53724278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691991A EA036292B1 (ru) 2014-04-02 2015-04-01 Способ получения мультиспецифического антитела, экспрессионный вектор и фармацевтическая композиция, содержащая это антитело

Country Status (30)

Country Link
US (2) US20150315296A1 (ru)
EP (2) EP3126395B1 (ru)
JP (1) JP6742245B2 (ru)
KR (1) KR102524165B1 (ru)
CN (1) CN106164095B (ru)
AU (2) AU2015239546A1 (ru)
BR (1) BR112016020112A2 (ru)
CA (1) CA2939852C (ru)
CL (1) CL2016002455A1 (ru)
CR (1) CR20160450A (ru)
DK (1) DK3126395T3 (ru)
EA (1) EA036292B1 (ru)
ES (1) ES2747749T3 (ru)
HR (1) HRP20191704T1 (ru)
HU (1) HUE045243T2 (ru)
IL (1) IL247273B (ru)
LT (1) LT3126395T (ru)
MX (1) MX369645B (ru)
MY (1) MY186351A (ru)
PE (1) PE20161390A1 (ru)
PH (1) PH12016501763A1 (ru)
PL (1) PL3126395T3 (ru)
PT (1) PT3126395T (ru)
RS (1) RS59311B1 (ru)
SG (1) SG11201608095YA (ru)
SI (1) SI3126395T1 (ru)
TW (1) TWI576353B (ru)
UA (1) UA117289C2 (ru)
WO (1) WO2015150447A1 (ru)
ZA (1) ZA201605660B (ru)

Families Citing this family (174)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
TR201802772T4 (tr) 2010-11-17 2018-03-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Kan pıhtılaşma faktörü VIII in işlevi için alternatif işleve sahip multi-spesifik antijen bağlayıcı molekül.
ES2549638T3 (es) 2011-02-28 2015-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteínas de unión a antígeno
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
KR101870555B1 (ko) 2011-08-23 2018-06-22 로슈 글리카트 아게 T 세포 활성화 항원 및 종양 항원에 대해 특이적인 이중특이적 항체 및 이의 사용 방법
SG11201406238UA (en) 2012-04-05 2014-10-30 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies against human tweak and human il17 and uses thereof
WO2014056783A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
EA032681B1 (ru) 2012-11-27 2019-07-31 Аджоу Юниверсити Индастри-Академик Кооперейшн Фаундейшн ГЕТЕРОДИМЕР Fc ИММУНОГЛОБУЛИНА, СОДЕРЖАЩИЙ ВАРИАНТ ДОМЕНА CH3 ДЛЯ ОБРАЗОВАНИЯ АНТИТЕЛА ИЛИ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ГЕТЕРОМЕРНЫМ Fc С ВЫСОКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ, СПОСОБ ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
MY192312A (en) 2013-02-26 2022-08-17 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
RU2015140915A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
MX2016003593A (es) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
PE20170263A1 (es) * 2014-08-04 2017-03-30 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
ES2850325T3 (es) * 2014-10-09 2021-08-27 Engmab Sarl Anticuerpos biespecíficos contra CD3epsilon y ROR1
BR112017009764A2 (pt) * 2014-11-10 2018-02-20 Hoffmann La Roche anticorpos biespecíficos e métodos de uso em oftalmologia
EP3224275B1 (en) 2014-11-14 2020-03-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
BR112017010324A2 (pt) 2014-11-20 2018-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag método para tratar ou retardar a progressão de um câncer em um indivíduo, moléculas, métodos para aumentar a função imune em um indivíduo e para selecionar um paciente para tratamento, kits, composição farmacêutica e usos de uma combinação de uma molécula
WO2016156291A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
IL293719B2 (en) 2015-05-21 2023-07-01 Harpoon Therapeutics Inc Trispecific binding proteins and methods of use
DK3313879T3 (da) 2015-06-24 2022-03-14 Hoffmann La Roche Anti-transferrinreceptor-antistoffer med tilpasset affinitet
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AR106189A1 (es) * 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
CN114014936A (zh) 2015-10-02 2022-02-08 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
CN107849137B (zh) 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ceaxcd3 t细胞活化性抗原结合分子
KR102146319B1 (ko) 2015-10-02 2020-08-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 tim3에 특이적인 이중특이성 항체
KR101851380B1 (ko) * 2015-10-12 2018-04-23 아주대학교산학협력단 효모접합을 이용한 항체 ch3 도메인 이종이중체 돌연변이쌍 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 ch3 돌연변이체 쌍
JP7325186B2 (ja) 2015-12-09 2023-08-14 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗薬物抗体の形成を減少させるためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体
WO2017117179A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Massachusetts Institute Of Technology Bispecific antibodies having constant region mutations and uses therefor
MX2018008347A (es) 2016-01-08 2018-12-06 Hoffmann La Roche Metodos de tratamiento de canceres positivos para ace utilizando antagonistas de union a eje pd-1 y anticuerpos biespecificos anti-ace/anti-cd3.
CN109153728A (zh) 2016-03-21 2019-01-04 埃尔斯塔治疗公司 多特异性和多功能分子及其用途
FI3433280T3 (fi) 2016-03-22 2023-06-06 Hoffmann La Roche Proteaasin aktivoimia t-solubispesifisiä molekyylejä
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
AU2017267793B2 (en) 2016-05-20 2024-01-25 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
TW201902512A (zh) 2016-06-02 2019-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療方法
US10696722B2 (en) * 2016-08-10 2020-06-30 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Heterodimeric Fc-fused cytokine and pharmaceutical composition comprising the same
EP3519437B1 (en) 2016-09-30 2021-09-08 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies against p95her2
KR102617264B1 (ko) * 2016-10-19 2023-12-29 인벤라 인코포레이티드 항체 구조물
MX2019006043A (es) 2016-11-23 2019-09-26 Harpoon Therapeutics Inc Proteína de unión de antígeno prostático específico de membrana.
BR112019010602A2 (pt) * 2016-11-23 2019-12-17 Harpoon Therapeutics Inc proteínas trispecíficas para psma e métodos de uso
EP3579848A4 (en) 2017-02-08 2021-03-03 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR ACTIVATING NATURAL KILLER CELLS AND THEIR THERAPEUTIC USES FOR TREATING CANCER
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
AU2018220736A1 (en) 2017-02-20 2019-09-05 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding HER2, NKG2D and CD16
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
WO2018158719A1 (en) * 2017-03-02 2018-09-07 Novartis Ag Engineered heterodimeric proteins
SG11201908784TA (en) 2017-03-27 2019-10-30 Hoffmann La Roche Improved antigen binding receptor formats
BR112019018767A2 (pt) 2017-04-03 2020-05-05 Hoffmann La Roche anticorpos, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, usos, método para tratar uma doença em um indivíduo e invenção
LT3606946T (lt) 2017-04-03 2022-10-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-pd-1 antikūno imunokonjugatai su mutantiniu il-2 arba su il-15
WO2018184965A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates of il-2 with an anti-pd-1 and tim-3 bispecific antibody
KR102346336B1 (ko) 2017-04-05 2022-01-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 lag3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
MX2019011916A (es) 2017-04-05 2020-01-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-lag3.
JP7209936B2 (ja) 2017-05-12 2023-01-23 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｍｓｌｎ標的三重特異性タンパク質及びその使用方法
KR102376863B1 (ko) 2017-05-12 2022-03-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. 메소텔린 결합 단백질
WO2018222901A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
CN116199785A (zh) * 2017-06-25 2023-06-02 西雅图免疫公司 多特异性抗体及其制备和使用方法
CN110799540B (zh) * 2017-06-25 2024-02-13 西雅图免疫公司 多特异性抗体及其制备和使用方法
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
MX2020002710A (es) * 2017-09-29 2020-07-20 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno multiespecifica que tiene actividad de sustitucion de la funcion de cofactor del factor viii de coagulacion de sangre (fviii) y formulacion farmaceutica que contiene tal molecula como ingrediente activo.
CR20200195A (es) 2017-10-13 2020-08-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión a antigenos de maduraciòn de celulas b
KR102569133B1 (ko) 2017-10-13 2023-08-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. 삼중특이적 단백질 및 사용 방법
MX2020006119A (es) 2017-12-21 2020-08-24 Hoffmann La Roche Anticuerpos de union a hla-a2/wt1.
CN111479588A (zh) 2017-12-29 2020-07-31 豪夫迈·罗氏有限公司 用于改善抗vegf抗体的vegf受体阻断选择性的方法
EA202091053A1 (ru) * 2018-01-15 2020-12-03 Ай-Маб Биофарма Юэс Лимитед Модифицированные c- и ch1-домены
WO2019149716A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising an antigen-binding site binding to lag3
CN111630063A (zh) 2018-01-31 2020-09-04 豪夫迈·罗氏有限公司 稳定化的免疫球蛋白结构域
AU2019218959A1 (en) 2018-02-08 2020-09-03 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
CN112368012A (zh) 2018-02-08 2021-02-12 蜻蜓疗法股份有限公司 靶向nkg2d受体的抗体可变结构域
TWI829667B (zh) * 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
EP3765517A1 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
US20210009711A1 (en) 2018-03-14 2021-01-14 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
CN111566127A (zh) * 2018-03-27 2020-08-21 西雅图免疫公司 制导和导航控制蛋白及其制备和使用方法
AU2019245243A1 (en) 2018-03-29 2020-09-03 Genentech, Inc Modulating lactogenic activity in mammalian cells
AR114284A1 (es) 2018-04-13 2020-08-12 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno dirigidas a her2 que comprenden 4-1bbl
AR115052A1 (es) 2018-04-18 2020-11-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
EP3818082A1 (en) * 2018-07-04 2021-05-12 F. Hoffmann-La Roche AG Novel bispecific agonistic 4-1bb antigen binding molecules
MX2021000280A (es) * 2018-07-11 2021-11-12 Momenta Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos relacionados con constructos de dominio de unión a antígeno-fc modificados genéticamente.
CN113164591A (zh) * 2018-07-11 2021-07-23 动量制药公司 与工程化Fc-抗原结合结构域构建体有关的组合物和方法
JP7425049B2 (ja) 2018-09-25 2024-01-30 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｄｌｌ３結合タンパク質および使用方法
BR112021007175A2 (pt) 2018-10-23 2021-08-10 Dragonfly Therapeutics, Inc. proteínas fundidas a fc heterodimérico
EP3891186A1 (en) * 2018-12-05 2021-10-13 MorphoSys AG Multispecific antigen-binding molecules
AU2019406712A1 (en) 2018-12-21 2021-06-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to VEGF and IL-1beta and methods of use
MY198034A (en) 2018-12-21 2023-07-27 Hoffmann La Roche Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
TWI829831B (zh) 2018-12-21 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合cd3之抗體
EP3902823A1 (en) * 2018-12-24 2021-11-03 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
CN113412123A (zh) 2018-12-28 2021-09-17 豪夫迈·罗氏有限公司 用于免疫应答增强的患者的治疗性用途的肽-mhc-i-抗体融合蛋白
SG11202109056TA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2020172571A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
SG11202109033XA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
AU2020226904A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
CN114127111A (zh) 2019-02-21 2022-03-01 马伦戈治疗公司 与nkp30结合的抗体分子及其用途
KR20220005568A (ko) 2019-05-09 2022-01-13 제넨테크, 인크. 항체의 제조 방법
KR20220016957A (ko) 2019-06-26 2022-02-10 에프. 호프만-라 로슈 아게 Sirt-1 유전자 녹아웃을 갖는 포유류 세포주
TW202115124A (zh) 2019-06-26 2021-04-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合至cea之新穎抗原結合分子
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
JP2022541652A (ja) 2019-07-26 2022-09-26 ヴァンダービルト ユニバーシティ エンテロウイルスｄ６８に対するヒトモノクローナル抗体
JP2022543551A (ja) 2019-07-31 2022-10-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｇｐｒｃ５ｄに結合する抗体
JP2022543553A (ja) 2019-07-31 2022-10-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｇｐｒｃ５ｄに結合する抗体
US20210130492A1 (en) 2019-09-18 2021-05-06 Genentech, Inc. Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
JP2022553716A (ja) * 2019-10-25 2022-12-26 サノフイ 多特異性結合タンパク質において鎖誤対合を分析する方法
MX2022005317A (es) 2019-11-15 2022-05-26 Hoffmann La Roche Prevencion de formacion de particulas visibles en soluciones acuosas de proteina.
CA3164818A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-ccl2 antibodies
PE20221282A1 (es) 2019-12-18 2022-09-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a hla-a2/mage-a4
KR20220118527A (ko) 2019-12-23 2022-08-25 제넨테크, 인크. 아포지질단백질 l1-특이적 항체 및 이용 방법
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
CA3162009A1 (en) 2020-01-09 2021-07-15 F. Hoffmann-La Roche Ag New 4-1bbl trimer-containing antigen binding molecules
AU2021208515A1 (en) 2020-01-15 2022-08-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods to decrease impurities from recombinant protein manufacturing processes
IL295310A (en) 2020-02-11 2022-10-01 Univ Vanderbilt Human monoclonal antibodies to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2)
AU2021224851A1 (en) 2020-02-21 2022-09-15 Harpoon Therapeutics, Inc. FLT3 binding proteins and methods of use
TW202200618A (zh) * 2020-03-17 2022-01-01 美商西雅圖免疫公司 微型導引和導航控制(miniGNC)類抗體蛋白及其製造和使用方法
WO2021195385A1 (en) 2020-03-26 2021-09-30 Vanderbilt University HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-GoV-2)
JP2023518841A (ja) 2020-03-26 2023-05-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 宿主細胞タンパク質が減少した修飾哺乳動物細胞
PL4045533T3 (pl) 2020-03-26 2024-04-15 Vanderbilt University Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko ciężkiemu ostremu zespołowi oddechowemu wywołanemu koronawirusem 2 (sars-cov-2)
CN115397850A (zh) 2020-03-30 2022-11-25 豪夫迈·罗氏有限公司 与vegf和pdgf-b结合的抗体及其使用方法
JP2023523011A (ja) 2020-04-24 2023-06-01 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ｔ細胞関連のがん細胞に結合する多機能性分子およびその使用
JP2023520249A (ja) 2020-05-15 2023-05-16 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 非経口タンパク質溶液中の可視粒子形成の防止方法
JP2023525898A (ja) 2020-05-19 2023-06-19 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 非経口タンパク質溶液における可視粒子の形成を防止するためのキレート剤の使用
US20230340081A1 (en) 2020-06-08 2023-10-26 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-hbv antibodies and methods of use
AU2021291011A1 (en) 2020-06-19 2023-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3 and CD19
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
WO2021255143A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and folr1
AU2021291407A1 (en) 2020-06-19 2022-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3
US20220017637A1 (en) 2020-06-23 2022-01-20 Hoffmann-La Roche Inc. Agonistic cd28 antigen binding molecules targeting her2
WO2021262783A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
CN115916830A (zh) 2020-06-25 2023-04-04 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd3/抗cd28双特异性抗原结合分子
WO2022008468A1 (en) 2020-07-07 2022-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Alternative surfactants as stabilizers for therapeutic protein formulations
CR20230076A (es) 2020-07-10 2023-03-13 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a células cancerosas y dirigen radionucleótidos a dichas células
AU2021308653A1 (en) 2020-07-17 2023-02-16 Genentech, Inc. Anti-Notch2 antibodies and methods of use
CN116249718A (zh) 2020-08-26 2023-06-09 马伦戈治疗公司 结合至钙网蛋白的多功能性分子及其用途
GB2616128A (en) 2020-08-26 2023-08-30 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
KR20230056766A (ko) 2020-08-28 2023-04-27 제넨테크, 인크. 숙주 세포 단백질의 CRISPR/Cas9 다중 녹아웃
KR20230061458A (ko) 2020-09-04 2023-05-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 Vegf-a 및 ang2에 결합하는 항체 및 사용 방법
AU2021342566A1 (en) 2020-09-21 2023-03-02 Genentech, Inc. Purification of multispecific antibodies
AU2021347580A1 (en) 2020-09-24 2023-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Mammalian cell lines with gene knockout
TW202233671A (zh) 2020-10-20 2022-09-01 美商建南德克公司 Ｐｅｇ結合抗ｍｅｒｔｋ抗體及其使用方法
KR20230120665A (ko) 2020-12-17 2023-08-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-hla-g 항체 및 이의 용도
EP4267734A1 (en) 2020-12-22 2023-11-01 F. Hoffmann-La Roche AG Oligonucleotides targeting xbp1
MX2023007846A (es) 2021-01-06 2023-07-07 F Hoffmann La Roche Ag Tratamiento conjunto que usa un anticuerpo biespecifico contra pd1-lag3 y un anticuerpo biespecifico de linfocitos t cd20.
AU2022207615A1 (en) 2021-01-12 2023-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Split antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
EP4277668A1 (en) 2021-01-13 2023-11-22 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy
JP2024509695A (ja) 2021-02-03 2024-03-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性結合タンパク質分解プラットフォームおよび使用方法
GB202102823D0 (en) 2021-02-26 2021-04-14 Tochikunda Ltd Diagnostic method
WO2022189380A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugate and anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies
AR125074A1 (es) 2021-03-12 2023-06-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-klk7, anticuerpos anti-klk5, anticuerpos multiespecíficos anti-klk5 / klk7 y métodos de uso
BR112023020832A2 (pt) 2021-04-08 2023-12-19 Marengo Therapeutics Inc Moléculas multifuncionais ligadas a tcr e seus usos
EP4320444A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 F. Hoffmann-La Roche AG Process for selecting cell clones expressing a heterologous polypeptide
TW202305122A (zh) 2021-04-19 2023-02-01 美商建南德克公司 經修飾之哺乳動物細胞
KR20240010469A (ko) 2021-05-21 2024-01-23 제넨테크, 인크. 관심 재조합 생성물의 생성을 위한 변형된 세포
AR126009A1 (es) 2021-06-02 2023-08-30 Hoffmann La Roche Moléculas agonistas de unión al antígeno cd28 que se dirigen a epcam
CA3221735A1 (en) 2021-06-18 2022-12-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-ccl2 antibodies
BR112023026966A2 (pt) 2021-07-02 2024-03-12 Hoffmann La Roche Métodos para tratar um indivíduo com melanoma, para alcançar uma resposta clínica, para tratar um indivíduo com linfoma não hodgkin, para tratar uma população de indivíduos com linfoma não hodgkin e para tratar um indivíduo com câncer colorretal metastático
WO2023287663A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 Genentech, Inc. Multi-variate model for predicting cytokine release syndrome
WO2023001884A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
AU2022317820A1 (en) 2021-07-28 2023-12-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for treating cancer
WO2023012147A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies and methods of use
WO2023094569A1 (en) 2021-11-26 2023-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies and tyrp1-specific antibodies
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
WO2023117325A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the determination of hydrolytic activity
US20230322958A1 (en) 2022-01-19 2023-10-12 Genentech, Inc. Anti-Notch2 Antibodies and Conjugates and Methods of Use
US20230295348A1 (en) 2022-01-24 2023-09-21 Novimmune Sa Composition and methods for the selective activation of cytokine signaling pathways
GB202204813D0 (en) 2022-04-01 2022-05-18 Bradcode Ltd Human monoclonal antibodies and methods of use thereof
WO2023202967A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved production cells
WO2023217933A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to vegf-a and il6 and methods of use
WO2023232961A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved production cells
WO2024020564A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024023271A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Ablynx Nv Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor
WO2024079009A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and proteasome inhibitors
WO2024079015A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and imids
WO2024079010A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and cd38 antibodies
WO2024079069A1 (en) 2022-10-12 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for classifying cells

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013150043A1 (en) * 2012-04-05 2013-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against human tweak and human il17 and uses thereof
WO2013174873A1 (en) * 2012-05-24 2013-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
WO2014081955A1 (en) * 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc. Heterodimeric immunoglobulins

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
EP1049787B1 (en) 1998-01-23 2004-11-24 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie Multipurpose antibody derivatives
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
ES2574993T3 (es) 2003-01-22 2016-06-23 Roche Glycart Ag Construcciones de fusión y uso de las mismas para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y función efectora
CA2534077A1 (en) 2003-07-29 2005-02-10 Morphotek Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
AU2004273791A1 (en) 2003-09-05 2005-03-31 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
JP4833850B2 (ja) 2003-11-21 2011-12-07 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム Ｉｌ−１７活性阻害による多発性硬化症を治療するための方法
US7632497B2 (en) 2004-11-10 2009-12-15 Macrogenics, Inc. Engineering Fc Antibody regions to confer effector function
EP1863844A1 (en) 2005-02-28 2007-12-12 Centocor, Inc. Heterodimeric protein binding compositions
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
TW200720289A (en) 2005-04-01 2007-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against CCR5 and uses thereof
CA2606102C (en) 2005-04-26 2014-09-30 Medimmune, Inc. Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
US20090215639A1 (en) 2005-04-26 2009-08-27 Bioren, Inc. Method of Producing Human IgG Antibodies with Enhanced Effector Functions
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
AR084053A1 (es) 2010-11-30 2013-04-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapeutico que induce citotoxicidad
EA028804B1 (ru) 2011-03-25 2018-01-31 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Гетеродимерные иммуноглобулины
BR112013032630B1 (pt) 2011-06-30 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polipeptídeo heterodimerizado compreendendo região fc de igg
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
RU2617970C2 (ru) 2011-08-23 2017-04-28 Рош Гликарт Аг Антитела, не содержащие fc-фрагмента, включающие два fab-фрагмента, и способы их применения
CN109134658B (zh) * 2011-10-31 2022-10-14 中外制药株式会社 控制了重链与轻链的缔合的抗原结合分子
CA2859667C (en) 2011-12-20 2022-05-24 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
WO2014082179A1 (en) * 2012-11-28 2014-06-05 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013150043A1 (en) * 2012-04-05 2013-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against human tweak and human il17 and uses thereof
WO2013174873A1 (en) * 2012-05-24 2013-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
WO2014081955A1 (en) * 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc. Heterodimeric immunoglobulins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTIAN KLEIN, SUSTMANN CLAUDIO, THOMAS MARKUS, STUBENRAUCH KAY, CROASDALE REBECCA, SCHANZER J�RGEN, BRINKMANN ULRICH, KETTENBER: "Progress in overcoming the chain association issue in bispecific heterodimeric IgG antibodies", MABS, vol. 4, no. 6, 1 November 2012 (2012-11-01), pages 653 - 663, XP055106060, ISSN: 19420862, DOI: 10.4161/mabs.21379 *
SEBASTIAN FENN, SCHILLER CHRISTIAN, GRIESE JULIA, DUERR HARALD, IMHOF JUNG SABINE, GASSNER CHRISTIAN, MOELLEKEN JOERG, REGULA JOER: "Crystal Structure of an Anti-Ang2 CrossFab Demonstrates Complete Structural and Functional Integrity of the Variable Domain", PLOS ONE, PUBLIC LIBRARY OF SCIENCE, vol. 8, no. 4, 1 April 2013 (2013-04-01), pages e61953, XP055106055, ISSN: 19326203, DOI: 10.1371/journal.pone.0061953 *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201605660B (en) 2022-05-25
CA2939852A1 (en) 2015-10-08
KR102524165B1 (ko) 2023-04-20
MY186351A (en) 2021-07-15
HUE045243T2 (hu) 2019-12-30
DK3126395T3 (da) 2019-09-30
CL2016002455A1 (es) 2017-08-11
CN106164095B (zh) 2021-07-27
UA117289C2 (uk) 2018-07-10
SI3126395T1 (sl) 2019-10-30
IL247273B (en) 2021-02-28
ES2747749T3 (es) 2020-03-11
KR20160138103A (ko) 2016-12-02
RS59311B1 (sr) 2019-10-31
US20150315296A1 (en) 2015-11-05
EP3126395A1 (en) 2017-02-08
JP6742245B2 (ja) 2020-08-19
AU2015239546A1 (en) 2016-09-01
CA2939852C (en) 2023-01-17
SG11201608095YA (en) 2016-10-28
TWI576353B (zh) 2017-04-01
PL3126395T3 (pl) 2019-12-31
PT3126395T (pt) 2019-09-30
EA201691991A1 (ru) 2017-04-28
HRP20191704T1 (hr) 2019-12-13
IL247273A0 (en) 2016-09-29
PE20161390A1 (es) 2016-12-28
WO2015150447A1 (en) 2015-10-08
US20210309730A1 (en) 2021-10-07
JP2017511139A (ja) 2017-04-20
EP3590968A1 (en) 2020-01-08
MX369645B (es) 2019-11-15
MX2016012371A (es) 2016-12-02
PH12016501763A1 (en) 2017-02-06
LT3126395T (lt) 2019-10-10
EP3126395B1 (en) 2019-07-24
AU2020273356A1 (en) 2020-12-17
TW201540728A (zh) 2015-11-01
CR20160450A (es) 2016-12-19
BR112016020112A2 (pt) 2018-01-16
CN106164095A (zh) 2016-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210309730A1 (en) Multispecific antibodies
US20220363771A1 (en) Multispecific antibodies
RU2604189C2 (ru) Биспецифические четырехвалентные антигенсвязывающие белки
RU2570633C2 (ru) Три- или тетраспецифические антитела
RU2573914C2 (ru) Биспецифические антигенсвязывающие белки

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM