ES2234241T3 - Derivados de anticuerpo de multiples fines. - Google Patents

Abstract

Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines, que comprende dominios CL y Vl que interactúan con dominios CH1 y VH, en el que dicho dominio CH1 no está unido a una región bisagra, comprendiendo además dos o más de otras moléculas, que tiene al menos un fin adicional acoplado a dos o más de dichos dominios, y en el que la heterodimerización está conducida por la interacción heterotípica entre los dominios (combinación VH-)CH1 y (combinación de inmunoglobulina VL-)CL.

Description

Derivados de anticuerpo de múltiples fines.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una clase de moléculas especificadas como derivados de anticuerpo de múltiples fines novedosos. La invención se refiere además, en particular, a tales derivados de anticuerpo que tienen dos o más partes de unión a antígeno, a derivados que tienen al menos dos partes de unión a antígeno, combinado con al menos otra función, tal como una toxina, una enzima, una citocina, una hormona o una molécula de señalización, y a derivados que tienen una parte de unión a antígeno combinado con al menos otras dos funciones.

Antecedentes de la invención

Debido a su versatilidad, los derivados de anticuerpo de múltiples fines (mpAbs), tales como anticuerpos biespecíficos (BsAb), inmunotoxinas y anticuerpos bifuncionales, son herramientas prometedoras en el tratamiento de diversas enfermedades (humanas). La primera rama permite normalmente reconocer específicamente una célula diana (por ejemplo, una célula cancerígena) por medio de una función de unión a antígeno, mientras que otro determinante puede dirigirse a través de otra función de unión a antígeno hacia un segundo tipo celular (por ejemplo, una célula T citotóxica) o puede ser una toxina, una enzima (por ejemplo, para escindir localmente y activar un profármaco), una citocina, una hormona o una molécula de señalización.

La dificultad para producir BsAb funcional en cantidad y pureza suficiente está obstaculizando todavía el uso más general de BsAb en aplicaciones clínicas. Cuando se utiliza la tecnología del cuadroma sólo el 10% del conjunto de inmunoglobulinas es el anticuerpo biespecífico correcto. Por tanto, son inevitables procesos de purificación que conllevan mucho tiempo y son costosos.

La reasociación química de fragmentos de anticuerpo experimenta pérdida de afinidad por la desnaturalización de proteínas o la formación de puentes disulfuro no ortodoxos, así como el uso de un reticulador químico, que genera estructuras inactivas, químicamente modificadas.

Ambos métodos clásicos de producción de BsAb dan lugar a rendimiento bastante bajos. La metodología del ADN recombinante y la ingeniería genética de anticuerpos han facilitado enormemente la producción de derivados de anticuerpo en sistemas de expresión heteróloga. Mediante la fusión genética de diversos fragmentos de anticuerpos para generar BsAb, se reduce la estructura normal tetramérica de un anticuerpo (H + L)_{2}. Cuando se incluye la porción Fc total, la autoasociación de los puentes disulfuro en la región bisagra reduce considerablemente el rendimiento de BsAb heterodimérico. Por tanto, todavía se requiere purificación para separarlo de los subproductos homodiméricos, bivalentes. Con el fin de mejorar el nivel del producto heterodimérico, biespecífico, se ha desarrollado un principio "Knobs into holes" ("botones en agujeros") para producir mediante ingeniería genética los dominios CH3 en la cola Fc para la heterodimerización preferente. La molécula propuesta por Ridgway et al. (1996) comprende una porción Fc completa, que aumenta el peso molecular de la proteína final más allá del tamaño óptimo para la biodistribución. Además, la porción Fc puede interactuar con una multitud de receptores de FC presentes en las diversas células del organismo, lo que puede desviar la unión de esta molécula a dianas no específicas.

Los derivados de anticuerpo pequeños (tales como sFv, bssFv, diacuerpo tienen la ventaja de su fácil penetración en tumores sólidos; además, en parte debido a la ausencia de regiones bisagra que contengan alto contenido de disulfuro, pueden producirse en grandes cantidades, en sistemas de expresión heteróloga. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, estas moléculas se eliminan generalmente demasiado rápidamente de la circulación como para permitir una acumulación eficaz en el sitio tumoral, mientras que las moléculas de tamaño intermedio tienen estabilidad en suero mejorada y mantienen una penetración en el tejido satisfactoria.

Con el fin de conseguir heterodímeros de tamaño medio, se han unido sFv incorporando un péptido adicional, cremalleras de leucina, hélices anfipáticas o estreptavidina. Sin embargo, estas extensiones de heterodimerización podrían ser inmunógenas.

Se han encontrado problemas similares en la preparación de inmunotoxinas y derivados de anticuerpo que tienen una función enzimática. Los fragmentos Fv de cadena sencilla monovalente (sFv) o fragmentos Fv estabilizados con disulfuro (dsFv) se utilizan predominantemente para construir fusiones de toxinas. Esto da como resultado una unión más débil y mala internalización debido a la unión monovalent6e y el rápido aclaramiento sanguíneo debido al pequeño tamaño de la molécula.

Fell et al. (1991) describen derivados de anticuerpo heterodiméricos de múltiples fines que consisten en una estructura V_{L}-C_{L}-V_{H}-C_{H1}, que carece de la región bisagra y en los que la heterodimerización está dirigida por la interacción heterotípica entre los dominios pesados y ligeros de las inmunoglobulinas. La estructura se une además a una molécula de interleucina.

Descripción de la invención

En vista de los anterior, es el objeto de la presente invención proporcionar una clase de moléculas, especificadas como derivados de anticuerpo de múltiples fines novedosos que puede prepararse eficazmente sin muchos subproductos, que tienen un tamaño intermedio y que combinan dos o más sitios de unión antigénica, o un sitio de unión antigénica con dos o más de otras funciones en una molécula.

Esto se consigue según la invención mediante un derivado de anticuerpo de múltiples fines, que comprende los dominios CL y VL de un primer anticuerpo con una especificidad de unión del primer antígeno deseada, interaccionando los dominios CH1 y VH de dicho primer anticuerpo con los dominios CL y VL, y teniendo una o más de otras moléculas al menos un fin adicional acoplado a uno o más de los dominios del primer anticuerpo.

La invención se basa en el potencial de la interacción específica VL-CL:VH-CH1 (denominada "L:Fd") para dirigir la heterodimerización estabilizada con disulfuro de las proteínas de fusión derivadas de anticuerpos recombinantes. El uso de la interacción L:Fd, que puede ser tanto natural como quimérica, para dirigir la heterodimerización tiene varias ventajas. En primer lugar, su interacción heterodimérica natural evita la necesidad de modificar la proteína mediante ingeniería genética para conseguir complementariedad. Además, la interacción es muy fuerte, al contrario que los homodímeros L:L que sólo se forman escasamente o los homodímeros Fd:Fd, que nunca se han detectado en los sistemas de expresión eucariotas. Además, en los sistemas de expresión bacterianos, la cadena Fd sola se pliega de manera aberrante (Ward, 1992). Finalmente, un único puente disulfuro natural estabiliza el heterodímero L:Fd.

Cada uno de los dos dominios de la cadena ligera y pesada puede extenderse con otra molécula (por ejemplo, una región VL o VH, un sFv, una toxina, una enzima tal como una enzima de escisión de profármaco, una citocina, una hormona, una molécula de señalización, etc.).

Por tanto, la invención se refiere a una clase de moléculas especificadas en el presente documento como "derivados de anticuerpo de múltiples fines" novedosos. Esta clase de moléculas se produce mediante heterodimerización de los dos componentes constituyentes. La heterodimerización se obtiene mediante la interacción heterotípica específica de una combinación CH1-VH elegida de dominios de inmunoglobulina, con una combinación CL-VL elegida de dominios de inmunoglobulina. Se propone la interacción VHCH1-VLCL como una estructura de heterodimerización muy eficaz, que podría producirse de manera eficaz. Eligiendo los dominios VH y VL apropiados en el contexto de VHCH1 y VLCL, puede constituirse una especificidad de unión mediante la propia estructura de heterodimerización. Por tanto, puede extenderse una o ambas de las cadenas que comprenden VHCH1 y VLCL en el extremo N-terminal o C-terminal, o ambos, con otras moléculas, tales como una toxina, una enzima, una citocina, una hormona o una molécula de señalización y derivados que tienen una parte de unión a antígeno para el fin de combinar estas moléculas las unas con las otras.

La construcción de la parte Fab del anticuerpo, fijada a moléculas relativamente simples tales como fosfatasa alcalina bacteriana, o una forma mutante truncada de la exotoxina de Pseudomonas, se ha descrito anteriormente (Ducancel et al., 1993, Choe et al., 1994). Sin embargo, se ha encontrado de forma imprevista según la invención que la interacción L:Fd puede aún dirigir la heterodimerización cuando una de las cadenas del Fab se fusiona a una molécula compleja como un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. Incluso de manera más imprevista, se ha encontrado que también ambas cadenas del Fab pueden fusionarse a otras moléculas, sin afectar a la capacidad de las moléculas para formar preferentemente heterodímeros.

Las moléculas scFv consisten en dominios (VL y VH) de la misma naturaleza que los que pueden encontrarse en las cadenas Fd y L, así que podrían esperarse fácilmente derivados no funcionales, formados erróneamente. Sin embargo, los hallazgos tal como se ilustran en los ejemplos muestran de manera imprevista que tales moléculas pueden producirse de manera eficaz y demuestran ser funcionales para todos sus componentes.

De manera sorprendente, esto podría conseguirse con secuencias de unión ("linkers") peptídicas tan cortas como unos cuantos aminoácidos. Excluyendo la región bisagra, se omite la dimerización de la fusión Fab-scFv. La homodimerización de algunas especificidades podría inducir la actividad o inhibición no deseadas de funciones con células efectoras. Con el fin de evitar esto, puede evitarse la homodimerización a través de, por ejemplo, la región bisagra, excluyendo esta región en la molécula Fab-scFv.

Puede(n) fusionarse otra(s) molécula(s) o bien al extremo C-terminal de CH1, el extremo N-terminal de VH, el extremo C-terminal de CL y/o el extremo N-terminal de VL. En total, la invención ofrece 15 tipos de variantes diferentes de combinaciones de otras moléculas con el constructo L + Fd como estructura. Los tipos de variantes se resumen en la tabla 1. cada tipo de variante puede, a su vez, proporcionarse con distintas clases de otras moléculas.

TABLA 1

1

El L:Fd actúa como un "vehículo" para la otra molécula. En el caso de un sFv como la otra molécula, el tamaño total de sFv aumenta debido a la presencia del vehículo. Como consecuencia, no tendrá la desventaja de los sFv o bssFv conocidos que se eliminan demasiado rápidamente de la circulación. Las cadenas L y Fd puede constituir, si se desea, una especificidad de unión propia. En este caso, las cadenas L y Fd contribuyen a una función propia, aparte de servir como una señal de heterodimerización.

Cuando una molécula de la invención combina dos funciones (diferentes o iguales), se denomina bifuncional. De manera similar, cuando una molécula de la invención combina tres o más de tres funciones diferentes o iguales, se denomina trifuncional, multifuncional, respectivamente. Cuando una molécula de la invención está combinando dos, tres o más partes de anticuerpo que tienen una especificidad diferente, se denomina, bi, tri o multiespecífica, respectivamente. Cuando una molécula de la invención está combinando dos, tres o más partes de anticuerpo que tienen la misma especificidad, se denomina, bi, tri o multivalente, respectivamente, para la especificidad de
unión.

En una primera realización preferida, la invención proporciona un mpAB recombinante novedoso, que es un anticuerpo bifuncional, biespecífico (BsAb) cuando las especificidades son diferentes o un anticuerpo bifuncional, bivalente (BvAb) cuando las especificidades son las mismas. Se basan en la fusión de un Fab y un sFv, que se fusiona al extremo C-terminal de CH1 o CL. Esta molécula tendrá un tamaño intermedio de aproximadamente 80 kDa, satisface los criterios mencionados anteriormente e incorpora heterodimerización preferente a través de sus dominios L:Fd.

Según una segunda realización preferida, se proporciona un anticuerpo similar que también se basa en la fusión de un Fab y un sFv, pero en este caso, este último se fusiona al extremo N-terminal de VH o el extremo N-terminal de VL. En una tercera realización preferida, la invención proporciona un mpAB novedoso, recombinante biespecífico, trifuncional o bivalente, trifuncional, que es una inmunotoxina basada en la fusión de un BsAb o un BvAb según la primera realización y una toxina, que se fusiona al extremo C-terminal de la cadena pesada del Fab que no porta el sFv.

Según una cuarta realización preferida, la invención proporciona un mpAB novedoso, recombinante biespecífico, trifuncional o bivalente, trifuncional que se denomina un anticuerpo catalítico (cAb) basado en la fusión de un BsAb o un BvAb con una enzima, que se fusiona al extremo C-terminal de la cadena pesada del Fab que no porta el sFv.

Según una quinta realización preferida, la invención proporciona un mpAB novedoso, recombinante biespecífico, trifuncional o bivalente, trifuncional que se combina con una hormona, una citocina o una función de señalización, mediante la fusión de una molécula con dicha actividad a un BsAb o BvAb según la primera realización.

Según una sexta realización preferida, tanto el extremo C-terminal de CH1 como el extremo C-terminal de CL se fusionan a un sFv, dando como resultado una molécula con tres partes de unión a antígeno. Esta molécula es trifuncional y puede ser trivalente monoespecífica, bivalente biespecífica o monovalente triespecífica.

Por tanto, esta invención ofrece, entre otros, la posibilidad de producir inmunotoxinas bivalentes trifuncionales (es decir, moléculas que se destinan a dos fines, concretamente toxicidad y unión a antígeno bivalente) o anticuerpos triespecíficos (es decir, tres especificidades antigénicas). En este último caso, se extiende con un sFv no sólo CH1, sino también CL.

La otra molécula puede unirse a la(s) parte(s) de anticuerpo L o Fd directamente o través de una secuencia de unión. La presencia de una secuencia de unión de al menos 1, preferiblemente más de 3, aminoácidos puede utilizarse para evitar el impedimento estérico entre dos o más sitios de unión a antígeno y entre el (los) sitio(s) de unión a antígeno y el centro activo de la otra molécula. También pueden utilizarse moléculas de unión distintas a las cadenas de aminoácidos.

Según una realización específicamente preferida de la invención, se fusionaron diversos fragmentos anti-CD3_{\varepsilon} murino de cadena sencilla (sFv) al extremo C-terminal de CH1 de un fragmento Fd específico para la fosfatasa alcalina de placenta humana (hPLAP). Este derivado de anticuerpo biespecífico Fab-sFv (de la fórmula general Fab-secuencia de unión-sFv, en la que la secuencia de unión es por ejemplo, EPSG, pero puede ser de secuencia y longitud variables) puede utilizarse para unir células citotóxicas a células tumorales.

El producto de fusión se mejoró adicionalmente para alcanzar antígenos bastante separados, proporcionando una secuencia espaciadora suficientemente larga (de la fórmula general Fab-secuencia de unión- sFv, en la que la secuencia de unión es por ejemplo, EPSGP(G_{4}S)_{3}M, pero puede ser de secuencia y longitud variables). Tras la secreción eucariota, se produce la heterodimerización específica entre la correspondiente cadena ligera anti-hPLAP y el fragmento Fd, en la que este último porta un sFv funcional. Con la expresión en las células de mamífero, más del 90% del material de inmunoglobulina en el medio era el heterodímero específico, sólo con una contaminación minoritaria de la cadena ligera derivada de homodímeros y monómeros, que no muestran capacidad de unión a hPLAP. Nunca se observaron los homodímeros procedentes de VH-CH1 derivado de cadena pesada fusionado al sFv anti-CD3_{\varepsilon}.

La proteína de fusión Fab-sFv entre el sFv anti-CD3_{\varepsilon} murino y el Fab anti-hPLAP descritos en el presente documento es un ejemplo de la producción eficaz de heterodímeros específicos, estabilizados con disulfuro, que pueden utilizarse para preparar anticuerpos específicos. La invención no se limita a este ejemplo particular. Pueden utilizarse otras especificidades de unión a antígeno y, para el otro fin o función, existe también una variedad de opciones. La invención radica en principio en el hallazgo de que la interacción L:Fd es sumamente específica y puede utilizarse como una estructura heterodimérica para construir un nuevo tipo de mpAb. Los dominios VL y CL en la cadena L, así como los dominios VH y CH1 en la cadena Fd, no tienen necesariamente que derivarse del mismo anticuerpo.

Los derivados de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de tumores, en el tratamiento de diversas células infectadas, en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o trombosis. Además, los derivados de la invención pueden utilizarse para dirigir un virus hacia células efectoras inmunológicas, para inducir o disolver un coágulo sanguíneo, para eliminar tipos celulares específicos in vitro o in vivo, establecer o mejorar transfecciones, o en diagnóstico.

La invención también se refiere a constructos de ADN que codifican para los dominios de cadena pesada de un derivado de anticuerpo de la invención, que comprende secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción adecuadas, unidas de manera factible a secuencias que codifican para los dominios VH y CH1 del primer anticuerpo y, opcionalmente, una secuencia codificante para la otra molécula unida de manera factible a la misma.

En tal constructo de ADN, la secuencia codificante para la otra molécula puede consistir en secuencias de ADN que codifican para los dominios VL y VH de un segundo anticuerpo, secuencias de ADN que están unidas de manera factible entre sí, en una cualquiera de las secuencias 5'-VL2-VH2-3' o 5'-VH2-VL2-3'.

En el constructo de ADN, puede incorporarse una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de una secuencia de unión, entre una o más de las secuencias codificantes de VH, CH1, VL2 y/o VH2, y/o la secuencia codificante para la otra molécula. La secuencia de unión ayuda a evitar el impedimento estérico entre los diversos dominios.

Un constructo de ADN particularmente preferido, designado como pCA2C11sFvE6Hf, puede obtenerse a partir de células DH5\alpha de E. coli depositadas el 15 de octubre de 1997 en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos y al que se le dio el número de registro de depósito LMBP3715. Otro constructo de ADN preferido se designa como pCAE6HfGS2C11sFv (también identificado como pCAE6H2sc2C11H) y que puede obtenerse a partir de células MC1061 de E. coli depositadas el 15 de octubre de 1997 en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos y al que se le dio el número de registro de depósito LMBP3716.

Además, la invención se refiere a un constructo de ADN que codifica para los dominios de cadena ligera de un derivado de anticuerpo de la invención, que comprende secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción adecuadas, unidas de manera factible a secuencias que codifican para los dominios VL y CL del primer anticuerpo y, opcionalmente, una secuencia codificante para la otra molécula unida de manera factible a la misma. La secuencia codificante para la otra molécula puede consistir en secuencias de ADN que codifican para los dominios VL y VH de un segundo anticuerpo, secuencias de ADN que están unidas de manera factible entre sí, en una cualquiera de las secuencias 5'-VL2-VH2-3' o 5'-VH2-VL2-3'.

Además, en este constructo de ADN, puede incorporarse una secuencia de unión, entre una o más de las secuencias codificantes de VL, CL, VL2 y/o VH2, y/o la secuencia codificantes para la otra molécula.

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a un conjunto de constructos de ADN para la producción de derivados de anticuerpo de múltiples fines de la invención, que comprenden uno cualquiera de los constructos descritos anteriormente junto con un constructo que codifica para al menos los dominios ligeros VL y CL del primer anticuerpo o junto con un constructo que codifica para al menos los dominios pesados VH y CH del primer anticuerpo, dependiendo de si el otro constructo codifica para los dominios pesados o ligeros del primer anticuerpo.

En una primera realización, el conjunto consiste en un vector pCAE6H2sc2C11H y un vector pCAG6SE6L. En una realización alternativa, el conjunto consiste en un vector pCA2C11sFvHE6Hf y un vector pCAG6SE6L. Esos conjuntos pueden utilizarse para producir derivados de anticuerpo de múltiples fines de la invención, en células huésped de expresión heteróloga. La invención también se refiere a un método para la producción de derivados de anticuerpo de múltiples fines, que comprende la expresión de un conjunto tal en células huésped de expresión heteróloga. Las células huésped pueden ser células de E. coli, otras células bacterianas, tales como de Bacillus spp., Lactobacillus spp. o Lactococcus spp.; actinomicetos; levaduras; hongos filamentosos; células de mamíferos, tales como células COS-1, células HEK, células de insectos, animales o plantas transgénicos.

Otro aspecto de la invención se refiere a una preparación médica, que comprende derivados de anticuerpo de múltiples fines.

Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de los derivados de anticuerpo de múltiples fines en diagnóstico.

Según un aspecto final, la invención se refiere al uso de derivados de anticuerpo de múltiples fines para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, infecciones, parásitos, enfermedades autoinmunitarias, trombosis.

El término "fin" se utiliza en el presente documento para indicar una cierta actividad u otra función, preferiblemente especificidad de unión a antígeno, toxicidad, actividad de señalización o enzimática.

El término "derivado" se utiliza en el presente documento para referirse a moléculas distintas a los anticuerpos clásicos, que consisten en dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, cadenas pesadas que, a su vez, comprenden múltiples dominios constantes. Los derivados comprenden al menos un dominio VL, un dominio CL, dominio VH y un dominio CH.

Por tanto, los derivados de la presente invención pueden prepararse mediante ingeniería genética utilizando métodos bien conocidos en la técnica. En los ejemplos que siguen, se describe cómo mediante ingeniería genética, se diseñó un nuevo tipo de anticuerpo biespecífico con uso potencial en inmunoterapia mediante citotoxicidad celular redirigida. El diseño del anticuerpo se basó en la heterodimerización muy eficaz y selectiva de las dos cadenas de anticuerpo, L y Fd. Ambas cadenas, la Fd y la L, pueden extenderse con nuevos determinantes, denominados en el presente documento "otras moléculas" (péptidos, dominios), o bien en su extremo N-terminal o C-terminal, o ambos. Como un ejemplo, se describe la molécula Fab (L + Fd) extendida en su extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del fragmento Fd con una fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (sFv). Este último, Fab-(G_{4}S)_{3}-sFv, se caracterizó en detalle. (G_{4}S)_{3} es corto para EPSGPGGGGSGGGGSGGGGSM. La especie biespecífica fue el producto predominante en un sistema de expresión heteróloga. Tenía un peso molecular intermedio que es beneficioso para la estabilidad en suero, biodistribución y penetración en el tejido sólido.

Los siguientes ejemplos proporcionan la enseñanza que parte de qué variantes pueden prepararse. Los ejemplos, por tanto, no pretenden de ninguna manera ser limitantes para la invención. En los ejemplos, "VH", "CH1", "CL" y "VL" se utilizan para los dominios derivados del primer anticuerpo,. "VH2" y "VL2" se utilizan para los dominios derivados del segundo anticuerpo. "VH3" y "VL3" se utilizan para los dominios derivados del tercer anticuer-
po.

Breve descripción de las figuras

En los ejemplos, se hace referencia a las siguientes figuras.

Figura 1: Diagrama de los insertos de vector de expresión pSV51 (Huylebroeck et al., 1988), PCAGGS (Niwa et al., 1991) y pCDNA3.1zeo^{-} (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) utilizados para la transfección. E6 = anticuerpo anti-hPLAP parental, 2C11 = derivado del anticuerpo anti-CD3 parental 145-2C11, B1 = anticuerpo anti-BCL1 parental, 3D5 = anticuerpo anti-(His)_{5-6} parental, VL y CL = dominio variable y dominio constante de la cadena ligera, VH y CH1 = dominio variable y primer dominio constante de la cadena pesada, Bla = \beta-lactamasa de E. coli, mIL2 = interleucina 2 murina. Todos los dominios de cadena ligera de E6 están en negro, todos los dominios de cadena pesada de E6 en blanco. Los dominios 2C11scFv y 3D5scFv están sombreados, Bla y mIL2 están en gris.

Figura 2: La heterodimerización de moléculas que contienen CL y CH1 en células eucariotas puede depender del emparejamiento de dominios VL y VH apropiados.

Figura 3: Expresión de proteínas de fusión Fab-scFv en el extremo C-terminal

Figura 4: Las proteínas de fusión Fab-scFv en el extremo C-terminal son funcionales como anticuerpos biespecíficos.

Figura 5: Pueden utilizarse moléculas de cadenas L-Fd quiméricas para heterodimerizar anticuerpos biespecíficos Fab-scFv.

Figura 6: Expresión, purificación de la funcionalidad y estabilidad en suero de moléculas de Fab-scFv biespecíficas con cadenas Fab.

Figura 7: Fd:L puede heterodimerizar eficazmente dos moléculas de sFv diferentes.

Figura 8: Funcionalidad de los derivados de anticuerpo triespecíficos.

Figura 9: Expresión de derivados de anticuerpo multivalentes.

Figura 10: Expresión de derivados de anticuerpo multifuncionales.

Ejemplos Materiales y métodos Preparación de constructos Cepas bacterianas y líneas celulares

Se utilizaron MC1061 (F^{-} araD139 \Delta(ara-leu)7696 galE15 galK16 \Delta(lac)X74 rpsL (Str^{r}) hsdR2 (r_{k}^{-}m_{k}^{+}) mcrA mcrBI) y DH5\alpha (endA1 hsdR17(r_{k}^{-}m_{k}^{+})supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nal^{r}) relA1 \Delta(lacIZYA-argF)U169 deoR
(\Phi80dlac\Delta(lacZ) M15)) de E. coli para las transformaciones y aislamientos de ADN. Se hicieron crecer las bacterias en medio LB, complementado con Triacillin 100 \mug/ml. La línea celular COS-1, derivada de células de riñón CV-1 de mono, se utilizó para la expresión eucariota. HEK293T, una línea celular de riñón embrionario humano transfectada con antígeno T grande de SV40 (SV40T tsA1609) (DuBridge et al., 1987) se utilizó para la expresión eucariota. Las células TE_{2} son células "T cooperadoras" tipo 1, positivas para CD3, murinas (Grooten et al., 1989) y se cultivaron en medio RPMI1640 (GibcoBRL life technologies, Paisly, RU) complementado con IL2 recombinante murino 30 U/ml, \betaME 0,06 mM, 10% de FCS, 0,03% de L-glutamina, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/l y piruvato de sodio 0,4 mM. Se cultivaron células MO_{4} derivadas de fibrosarcoma de ratón en medio REGA-3 (GibcoBRL) complementado con un 10% de FCS, 0,03% de L-glutamina, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml y piruvato de sodio 0,4 mM. Las células MO_{4}I_{4} (hPLAP+) son células MO_{4} transfectadas con el gen hPLAP (Smans et al., 1995; Hendrix et al., 1991). Se cultivaron células BCL1^{vitro} (donadas por el Dr. Thielemans) como células TE_{2} pero con IL2.

Ensamblaje de genes y plásmidos

Se adquirieron enzimas de restricción de GibcoRBL life technologies (Paisly, RU), ADN polimerasa Vent procedía de New England Biolabs (Beverly, MA; EE.UU.), la ADN ligasa de T4, la enzima Klenow y la ADN polimerasa de T4 procedían de Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania). Todas las enzimas se utilizaron tal como recomiendan los fabricantes.

Todos los cebadores para amplificación por PCR se adquirieron a GibcoRBL. La amplificación de ADN se realizó en un bloque térmico de Biometra utilizando una etapa previa de desnaturalización de 10 min. a 94ºC, seguido por 30 ciclos, que contenía una etapa de desnaturalización (94ºC), una etapa de hibridación (55ºC) y una etapa de extensión (72ºC), cada una durante 30 seg.

Todos los módulos de expresión se representan esquemáticamente en la figura 1.

La clonación de la cadena ligera (L) y el fragmento truncado de la cadena pesada (Fd) del mAb anti-hPLAP murino parental E6 (IgG2b, \kappa) en los vectores pSV51E6 (LMBP2142) y pSV51E6Hf1 (LMBP2143), respectivamente, se describió anteriormente (De Sutter, et al., 1992a).

pSVE6sFvE6CL

Se clonó un fragmento de cadena sencilla de VH y VL anti-hPLAP en el vector pSV51E6sFv (LMBP3609, no publicado y proporcionado por S. Dincq y K. De Sutter, VIB-RUG, Gent) y se utilizó para sustituir VL en pSV51E6L (De Sutter, et al., 1992a) mediante intercambio del fragmento BanII-AvaI. El vector resultante pSVE6sFvE6CL codifica para E6scFv-CL.

pSV2C11sFvE6CH1E

El vector pC/DNA/AMP que contiene scFv anti-CD3 en laconfiguración VL-L-VH fue proporcionado amablemente por el Dr. D. Segal (Bethesda, MD, EE.UU.). A través de mutagénesis dirigida al sitio con la secuencia de unión 5' CCGTCTCCTCAGAGCTC-CAAAAACCC 3' se creó un sitio SacI (subrayado) inmediatamente después de scFv. En el vector pSV51-2C11sFvMG2fEtag, el 2C11scFv flanqueado por BamHI-SacI se fusionó delante de la porción Fc de IgG2b de ratón con cola E. En este vector, se sustituye el fragmento de cadena pesada de ratón por el dominio CH1 amplificado mediante PCR, digerido con SacI y NotI. El dominio CH1 se amplificó a partir del vector pSV51E6Hf1 con el cebador directo 5' CACTGCCGAGCTCCCAAAAC 3'(sitio SacI subrayado) y el cebador inverso 5' TCATGTCGCGGCCGCGCTCTA 3' (sitio NotI subrayado). Como resultado, el vector pSV2C11sFvE6CH1 codificaba para 2C11scFv-CH1. Finalmente, el dominio CH1 se intercambió por el dominio CH1 con cola E del vector pCAsc2C11E6Hf (véase más adelante) mediante un digesto de restricción BaII-SaII. Esto dio como resultado el vector pSV2C11sFvE6CH1E.

pSVBlaE6CH1E

El vector pSV71 que contiene el inserto BlaLIHi (De Sutler et al., 1992b) fue la fuente del inserto EcoRV-SacI que sustituyó a 2C11scFv con EcoRV-SacI escindido de pSV2C11sFvE6CH1E. De esta manera, se preparó pSVBlaE6CH1E, que codifica para Bla-CH1. Los 14 aminoácidos de la secuencia de unión 1 (VNHKPSNTKVDKRV = úl-
timos aminoácidos de CH1 de IgG2b de ratón y parte superior de bisagra) y los aminoácidos del sitio SacI (EL) están uniendo ambos subunidades, sumando en total una secuencia de unión de 16 aminoácidos que conecta CH1 y Bla.

pCAGGSE6L

El vector de expresión eucariota pCAGGS fue una donación del Dr. J. Miyazaki (Universidad de Tokio, Japón) (Niwa et al., 1991) y contiene un gen de resistencia a ampicilina, el promotor híbrido \beta-actina/\beta-globulina, fuerte y constitutivo, y parte del exón 3, 3' UTR y señal poliA del gen \beta-globina de conejo. Se preparó pCAGGSE6L (LMBP3547-IDA97-33, no publicado y proporcionado amablemente por el Dr. J. Demolder, VIB-RUG, Gent) ligando el fragmento XbaI (sustituido con Klenow de ADN polimerasa) de pSV51E6L que contiene la secuencia E6L, a un fragmento de vector abierto en MscI de pCAGGS.

pCA2C11sFvE6Hf

Se obtuvo el ensamblaje génico 2C11scFv-Fd en el vector pCA2C11sFvE6Hf (LMBP3715-IDA97-34) que contiene los siguientes fragmentos (en el sentido de las agujas del reloj): vector abierto en MSC1 de pCAGGS (Niwa et al., 1991); fragmento SspI-BamHI de pSV51 (Huylebroeck et al., 1988), fragmento que codifica para 2C11scFv de pcDNA/AMP/2C11 (Jost et al., 1994) cortado en el sitio BamHI e introducido en el EcI136II; fragmento que codifica para Fd de pSV23SE6Hm (Dr. W. Lammermant, RUG, tesis doctoral, 1994) flanqueado por KpnI (T4 de extremos romos) y los 2 nucleótidos del sitio BanII; fragmento NotI (Klenow de extremos romos)-BsmI (T4 de extremos romos) de pCANTAB5E (Pharmacia LBK Biotechnology, Uppsala, Suecia) que codifica para la cola E; fragmento SaII (de extremos romos)-XbaI (de extremos romos) de pSV51.

pSVE6H1sc2C11M

Se preparó el gen de fusión Fd-H1-2C11scFv en pSVE6H1sc2C11M ligando el fragmento NdeI (Klenow de extremos romos)-AvaI de pcDNA/AMP/2C11 (Jost et al., 1994) en fragmento de vector ApaI (T4 de extremos romos)-SaII de pSV51E6H (De Sutter et al., 1992a), que codifica para la cadena pesada de E6 que se truncó después del tercer aminoácido de la región bisagra (Fd, sin cisteínas incluidas). La secuencia de conexión (que codifica para la EPSG adicional) entre E6Fd y 2C11scFv se confirmó mediante análisis de la secuencia de ADN. Este scFv anti-CD3 estaba en la configuración VL-secuencia de unión-VH y portaba una cola c-myc.

pCAE6H1sc2C11H

Se preparó también el gen de fusión Fd-H1-2C11scFv en pCAE6H1sc2C11H ligando un fragmento que codifica para 2C11scFv, amplificado por PCR, al extremo C-terminal de E6Fd. El fragmento de PCR que codifica para el 2C11scFv en la configuración VH-VL con una cola de (His)_{6} y se amplificó a partir de pQE-bssFvB1-2C11 (De Jonge et al., 1995, proporcionado amablemente por el Dr. K. Thielemans, VUB, Bélgica) con el cebador directo 5' GGC
CCATGGAGGTCAAGCTGGTGGAGTC 3' y el cebador inverso 5' ATAGGATCCTTATCCGGACCTTTTATTTCC
AGCTTGGTGGCCAG 3' (sitio BamHI subrayado). Este fragmento de PCR se cortó en el sitio BamHI y se trató con cinasa. Posteriormente, se clonó en el vector pCAGGS abierto en MscI-BgIII (Niwa et al., 1991), el fragmento HindIII (de extremos romos) ApaI de pSV23sE6Hm (Dr. W. Lammermant, RUG, tesis doctoral, 1994), que codifica para el fragmento Fd, y el fragmento de PCR que codifica para 2C11scFv.

pCAE6H2sc2C11H

Se obtuvo el ensamblaje génico Fd-H2-2C11scFv en el vector en pCAE6H2sc2C11H (LMBP3716-IDA97-35), que contenía los siguientes fragmentos: vector pCAGGS abierto en MscI-BstXI (Niwa et al., 1991), el fragmento HindIII (de extremos romos)-ApaI de pSV23sE6Hm (Dr. W. Lammermant, RUG, tesis doctoral, 1994), que codifica para el fragmento Fd; fragmento de PCR amplificado a partir de pQE-bssFvB1-2C11 (De Jonge et al., 1995) con el cebador directo 5' GCTGAAAGGGCCCGGTGGAGG 3' (sitio ApaI, subrayado) y con el cebador inverso 5' GGTCCCAGGGCACTGGCCTCACTCTAGAG 3' (sitio BstXI, subrayado). Este fragmento de PCR codifica para una secuencia de unión (G_{4}S)_{3}, un scFv anti-CD3\varepsilon murino en la configuración VH-VL y una cola (His)_{6}.

pCAE6L2sc2C11

Se realizó el ensamblaje génico E6L-L2-2CIIscFv en el vector en pCAE6L2sc2C11, que contenía los siguientes fragmentos: vector pCAGGSE6L abierto en HpaI-BstXI; fragmento de PCR (que codifica para CL) amplificado a partir de pCAGGSE6L con el cebador directo 5' CAGTGAGCAGTTAACATCTGG 3' (sitio HpaI, subrayado) y con el cebador inverso 5' CCTTTCGGGGCCCACACTCATTCC 3' (sitio ApaI, subrayado); fragmento de PCR amplificado a partir de pQE-bssFvB1-2C11 (De Jonge et al., 1995) con el cebador directo 5' GCTGAAAGGGCCCGGTGGAGG 3' (sitio ApaI, subrayado) y con el cebador inverso 5' GTGCCAGGGCACTGGTTAAGATCTGGATCC 3' (sitio BstXI, subrayado). Este fragmento de PCR codifica para una secuencia de unión (G_{4}S)_{3}, un scFv anti-CD3\varepsilon murino en la configuración VH-secuencia de unión-VL y un codón de terminación.

pCAB1E6H2sc2C11H

Se ensambló la cadena Fd quimérica con secuencias variables derivadas del mAb B1 anti-BCL1 y la secuencia constante del mAB E6 anti-hPLAP: VH(BI)-CH1(E6) acoplada al 2C11scFv anti-CD3 murino en el vector pCAB1E6H2sc2C11H tal como sigue: el dominio B1VH, junto con su secuencia señal natural, se amplificó por PCR a partir del vector pEFBOS-bssFvB1-2C11 (proporcionado amablemente por el Dr. K. Thielemans, VUB, Bélgica) con
el cebador directo 5' CCTCACCTCGAGTGATCAGCACTG 3' sitio XhoI subrayado) y el cebador inverso 5' CCACC
TGAGGAGACAGTGACC 3' (sitio Bsu36I subrayado). Posteriormente, el E6CH1 en pCAE6H2sc2C11H se flanqueó con un sitio Bsu36I mediante amplificación por PCR, utilizando el cebador directo 5'CTGCCTCCTCAGGCAAAACA
ACACCC 3' (sitio Bsu36I subrayado), el cebador inverso 5' GGACCCAGTGCATGCCATAGCC 3' (sitio SphI subrayado). Estos dos fragmentos de PCR se ligaron en el vector pCAE6H2sc2C11H abierto en XhoI-SphI.

pCAB1E6L

Se ensambló la cadena ligera quimérica VL(B1)-CL(E6) sustituyendo la secuencia de ADN del gen VL(E6) maduro en pCAGGSE6L por la del VL(B1) maduro. El vector resultante pCAB1E6Lcontiene los siguientes fragmentos (en el sentido de las agujas del reloj): fragmento XbaI-Tsp45I de pCAGGSE6L que codifica para la secuencia señal de E6H; la secuencia de VL(B1) amplificada a partir de pEFBOS-bssFvB1-2C11 con el cebador directo 5' GGATGTGACTTGTGATGACC 3' (sitio Tsp45I subrayado) y el cebador inverso 5' GATCCTTTGAGCTCCAGC 3' (sitio SacI subrayado), la secuencia de CL(E6) amplificada a partir de pCAGGSE6L con el cebador directo 5' GTTGGAGCTCAAACGGGCTG 3' (sitio SacI subrayado) y el cebador inverso 5' GGAGCTGGTGGTGGCGTCTC
AGGACC 3' (sitio BsmBI subrayado); vector pCAGGSE6L abierto en XbaI-BsmbI.

pCDE6L4scB1 y pCDE6L4E6

La estrategia de construcción de este plásmido supuso la construcción de pCAGGSE6Lm2. El constructo se preparó mediante amplificación por PCR del gen E6L de pCAGGSE6L (Dr. J. Demolder, VIB-RUG) con el cebador directo 5' ATACCGCTCGAGACACAGACATGAGTGTGCCCACTC 3' (sitio XhoI subrayado) y el cebador inverso 5' CGCGGATCCTTACCCGGGGACGTCACACTCATTCCTG-TTGAAGCTCTTGAC 3' (sitio BamHI subrayado), con el fin de crear sitios de clonación adicionales en los extremos N y C-terminal del gen E6L.

Para la construcción de pCDE6L4scB1, se amplificó B1scFv a partir del vector pFE12-BI (proporcionado amablemente por el Dr. K. Thielemans) con el cebador directo 5' TCCCCCGGGGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTG 3' (sitio SmaI subrayado) y el cebador inverso: 5' ATAGGATCCTTATCCGGATTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGC 3' (sitio BamHI subrayado). Este fragmento de PCR se digirió con BamHI y se fosforiló. Posteriormente, el fragmento de PCR se ligó con el fragmento de vector SmaI-BsaI de pCAGGS y el fragmento BsaI-BamHI de pCDNA3.1 zeo^{-} (Invitrogen). De esta manera, se creó un marco de vector híbrido, designado como pCD, cuya región promotora se deriva del vector pCAGGS y cuya región 3' no traducida, gen con resistencia a Zeocin y sitio de clonación múltiple se derivan del vector pCDNA3.1 zeo^{-}.

pCDE6L4scE6 se construyó exactamente de la misma manera, sólo que el gen E6scFv se amplificó a partir de pSV51E6sFv (S. Dincq, VIB-RUG) con el cebador directo 5' TCCCCCGGGCAGGTTC-AGCTGCAGCAGTCT
GGAG 3' y el cebador inverso 5' ATAGGATCCTTATCCGGA-CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCC 3'.

pCDE6L5scB1 y pCDE6L5scE6

Estos dos constructos se derivan inmediatamente de los vectores pCDE6L4scB1 y pCDE6L4scE6 insertando dos oligonucleótidos adaptadores complementarios en los sitios AatI y XmaI entre los genes E6L y scFv. Se permitió que hibridaran los oligonucleótidos 5' CGACGGTGGTTCTAGAGGTGATGGGC 3' y 5' CCGGGCCCATCACCT
CTAGAACCACCGTCGACGT 3', dando como resultado los extremos cohesivos AatI y XmaI y entonces se clonó el adaptador.

pCDE6L6scE6

Este vector contiene los siguientes fragmentos (en el sentido de las agujas del reloj): fragmento XhoI-Bsp120I (de extremos romos) de pCAE6L2sc2C11 que codifica para E6L, fragmento AatII (de extremos romos)-XhoI de pCDE6L4scE6 que codifica para E6scFv.

pCDE6H6scE6

Este vector contiene los siguientes fragmentos (en el sentido de las agujas del reloj): fragmento XhoI-Bsp120I (de extremos romos) de pCAE6H2sc2C11H que codifica para E6Fd, fragmento AatII (de extremos romos)-XhoI de pCDE6L4scE6 que codifica para E6scFv.

pCDE6L7scE6

Este vector contiene los siguientes fragmentos (en el sentido de las agujas del reloj): fragmento XhoI-Bsp120I (de extremos romos) de pCAE6L2sc2C11, que codifica para E6L, dos oligonucleótidos complementarios:

5' GGCCTCAACCACAACCTCAGCCGCAACCTCAACCTGGGC 3'

y

5' CCGGGCCCAGGTTGAGGTTGCGGCTGAGGTTGTGGTTGA 3'

que forman extremos cohesivos Bsp120I y XmaI, vector XmaI-XhoI fragmento de pCAE6L6scE6.

pCDE6H7scE6

Este vector contiene los siguientes fragmentos (en el sentido de las agujas del reloj): fragmento XhoI-Bsp120I de pCAE6H6scE6, que codifica para E6Fd, dos oligonuleótidos complementarios 5' GGCCTCAACCACAACCT
CAGCCGCAACCTCAACCTGGGC 3' y 5' CCGGGCCCAGGTTGAGGTTGCGGCTGAGGTTGTGGTTGA 3', que forman extremos cohesivos Bsp120I y XmaI, fragmento de vector XmaI-XhoI de pCDE6L6scE6.

Constructos con 3D5scFv

El plásmido pAK100His2 (Knappick et al., 1994) que codifica para scFv anti-His de 3D5, fue una amable donación del Dr. A. Plückthun (Zurich, Suiza). scFv de 3D5 se amplificó a partir de pAK100His2 con el cebador directo 5' TCCCCCG-GGGACATTTTGATGACCCAAACTCCAC 3' (sitio SmaI subrayado) y el cebador inverso 5' ATAGGATCCTTATCCGGATTCGGCCCCCGAGGCCGCAGAGA-CAG 3' (sitio BspEI subrayado) y se fusionó a una secuencia que codifica para la cola E (TCCGGAGCGCCGGTGCCGTATCCAGATCCGCT-GGAACCACGTGG
CGCCTAAGGATC C, sitio BspEI y sitio BamHI subrayados) en el vector pCD. Se utilizó el fragmento SmaI-SpeI de este constructo, que codifica para scFv con cola E de 3D5 (abreviado 3D5E) para ensamblar los siguientes
vectores:

pCDE6L4sc3D5E: fragmento 3D5E ligado al fragmento SpeI-SmaI de pCDE6L4scB1

pCDE6L5sc3D5E: fragmento 3D5E ligado al fragmento SpeI-SmaI de pCDE6L5scB1

pCDE6L6sc3D5E: fragmento 3D5E ligado al fragmento SpeI-SmaI de pCDE6L6scE6

pCDE6L7sc3D5E: fragmento 3D5E ligado al fragmento SpeI-SmaI de pCDE6L7scE6

pCAE6L8sc3D5E: fragmento 3D5E ligado al fragmento SpeI-SmaI de pCAE6Lm2.

\newpage

pCAE6L61mIL2

Se ensambló el gen de fusión E6L-mIL2 ligando los siguientes fragmentos: fragmento XhoI-Bsp120I (de extremos romos) de pCDE6L6scE6, que codifica para E6L, fragmento NdeI (de extremos romos)-BamHI de pLT10mIL2ST (Mertens et al., 1995) que codifica para mIL2, y el fragmento de vector XhoI-BamHI de pCDE6L4sc3D5E.

pCDE6H61mIL2 y pCDE6H62mIL2

Estos vectores se ensamblaron ligando los siguientes fragmentos: fragmento de vector XhoI-BamHI de pCDE6L4
sc3D5E, fragmento NdeI (de extremos romos)-BamHI de pLT10mIL2ST, que codifica para mIL2 y un fragmento de pCDE6H6scE6 que codifica para E6Fd, escindido con XhoI-Bsp120I (de extremos romos) para la secuencia de unión H61 o cortado con XhoI-XmaI para la secuencia de unión H62.

Plásmidos para electroporación de células SP2/0

En el vector pCAB1E6L, se insertó un gen resistente a Zeocin sustituyendo el fragmento BgIII-ScaI del vector pCAGGS por el fragmento BamHI-ScaI del vector pCDNA3.1zeo^{-} (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Este nuevo plásmido se denominó pCDB1E6Lzeo. De manera análoga, se insertó un gen de resistencia a neomicina en pCAB1E6H2sc2C11H sustituyendo el fragmento HindIII-ScaI del vector, por el fragmento HindIII-ScaI de pCDNA3 (Invitrogen). Esto dio como resultado el vector pCDB1E6H2sc2C11Hneo.

Protocolos de transferencia

A menos que se establezca lo contrario, todos los cultivos se hicieron crecer a 37ºC con un 5% de CO_{2} en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM, GibcoRBL life technologies, Paisly, RU)complementado con un 10% de FCS, 0,03% de L-glutamina, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/l y piruvato de sodio 0,4 mM.

La transfección de células COS-1 se realizó tal como se describe en De Sutter et al. (1992). Se transfectaron células HEK293T (DuBridge et al., 1987) mediante un método con Ca_{3}(PO_{4})_{2}. Veinte h antes de la transfección, se trataron monocapas subconfluentes con tripsina y se volvieron a sembrar a 2,25 x 10^{6} células/75 cm^{2}. Dos h antes de la transfección, se añadieron 35 ml de medio nuevo a las células. Se redisolvieron 14 \mug de ADN estéril, precipitado con etanol, de cada plásmido de expresión (purificado en una columna de purificación de ADN Qiagen, Qiagen Inc., CA, USA) en 1400 \mul de tampón 0,1 x TE (1 x TE: Tris.HCl 10 mM, EDTA 1 mM) pH 7,5 y se mezcló con 350 \mul de CaCl_{2} 1,25 mM, Hepes-NaOH 125 mM, pH 7,5. Esta disolución de ADN se añadió lentamente a 1 x Hepes/2x BS (Hepes-NaOH 25 mM, pH 7,5; NaCl 16 g/l; KCl 0,74 g/l; Na_{2}HPO_{4}.12H_{2}O 0,50 g/l; dextrosa 2 g/l) con agitación continua. Tras 1 min. de agitación adicional, la mezcla se transfirió al medio que cubre las células y se incubó durante 24 h a 37ºC.

Posteriormente, se extrajo la mezcla de las células y se sustituyó por 35 ml de DMEM complementado con un 0,03% de L-glutamina, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/l, piruvato de sodio 0,4 mM, insulina bovina 5 mg/l, transferrina 5 mg/l y selenio 5 \mug/l. El medio se recogió tras 24 ó 72 h. Se retiraron las células muertas por centrifugación a 1100 rpm durante 5 min. y el sobrenadante del cultivo se concentró sobre una membrana con un valor de corte de 10 KDa (microconcentrador Centricon-10® o una membrana de concentrador Centriprep-10®, Amicon Inc., Beverly, MA, EE.UU.).

Con el fin de cambiar el tampón, se diluyó el sobrenadante concentrado que contenía el anticuerpo biespecífico (35 ml a 2,5 en Centriprep-10) con 12,5 ml de PBS (A) (= NaCl 171,1 mM, KCl 3,4 mM, Na_{2}HPO_{4}.12H_{2}O 10 mM, K_{2}HPO_{4} 1,8 mM) complementado con un 0,05% de albúmina de suero bovino (BSA) y un 0,02% de azida, y se concentró de nuevo hasta 1,5 ml. Las células se lisaron con un 10% de NP-40 (Nonidet P40), que contenía un 10% de apoproteína, Tris.HCl 100 mM, pH 8,0, y EDTA 10 mM.

Producción con HEK293T de BsAb Fab-scFv

Para la producción con HEK293T de 1 mg de B1Fab-scFv biespecífico, se sembraron 4 x 10^{7} células HEK293T en 10 matraces de cultivo de 175 cm^{2} y, tras 24 h, estas células se cotransfectaron con pCAB1E6L y pCAB1E6H2sc2C11H (140 \mug de cada plásmido) utilizando el método habitual de transfección con Ca_{3}(PO_{4})_{2} descrito. Después de 24 h, se eliminó el precipitado y las células se permitieron crecer en medio ITS complementado. Cada 48 h, este medio se recogió y cambió. Esto se repitió seis veces, dando como resultado medio 1.751 que se filtró con un filtro superior de botella (Nalgene).

Electroporación de Fab-scFv en células 8P2/0

Se recogieron células SP2/0-Ag14, con crecimiento en fase logarítmica, y se resuspendieron a 4 x 10^{6} células en 400 \mul de medio de crecimiento (RPMI 1640, complementado con un 10% de suero bovino fetal, 0,03% de L-glutamina, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/l, 5 x 10^{-5} \betaME y piruvato de sodio 0,4 mM) y se mantuvo en hielo. Se linealizaron 15 \mug de cada plásmido (pCDB1E6Lzeo y pCDB1E6H2sc2C11Hneo) mediante un digesto con ScaI. Los plásmidos se ligaron y la mezcla se purificó mediante una extracción con fenol-éter, se precipitó y se resuspendió en 20 ml de agua bidestilada. Un min. antes de la electroporación, el ADN se mezcló con 4 x 10^{6} células en la cubeta de electroporación (espacio de 0,4 cm) y se mantuvo en hielo. Se generó el pulso eléctrico (900 \muF, 250 V) mediante un EASYJECT Plus (Molecular Technologies Inc., San Luis, NO, EE.UU.). Inmediatamente después del pulso, se añadió 1 ml de medio nuevo a las células y éstas se transfirieron a una placa de cultivo de 12 cm^{2}. Cuarenta y ocho h después, las células sometidas a electroporación se incubaron con medio de crecimiento que contenía Zeocin 0,6 mg/ml y neomicina 0,6 mg/ml. Después de 30 días, las células supervivientes se transfirieron a matraces de cultivo más grandes o se diluyeron para la subclonación, y se analizó el medio de cultivo.

Caracterización de las proteínas expresadas

Se diluyeron fracciones en medio concentrado de células transfectadas correspondientes a 500 \mul de sobrenadante, con tampón 3 x muestra no reductora (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.), se mantuvo en ebullición durante 5 min. y se sometió a SDS-PAGE al 10% (Laemmli, 1970). Tras la electroforesis en gel, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (BA85; 0,45 \mum; Schleicher & schuell, Dassel, Alemania) utilizando el sistema Multiphor II NovaBlot semianhidro (1 mA/cm^{2}; 1,5 h; Pharmacia LBK Biotechnology, Upssala, Suecia).

Se realizó la posterior detección de las proteínas en la inmunotransferencia tal como sigue: tras el bloqueo de la membrana en la disolución de bloqueo (5% p/v) reconstituida, leche desnatada en polvo en Tris.HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 80 mM, NaN_{3} 3 mM y 0,2% de NP-40), se incubó la inmunotransferencia durante 1,5 h con los sueros de detección anti \gamma y \kappa murinas, cada uno diluido 1:1000 con disolución de bloqueo (suero de cabra anti-Ig murina y suero de cabra anti-\kappa murina, ambos 1 mg/ml, Sera-Lab LTD, Crawley Down, RU). Posteriormente, la inmunotransferencia se lavó tres veces con la disolución de bloqueo y se incubaron durante otras 1,5 h con suero de conejo anti-IgG de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma Immuno Chemicals, San Luis, MO, EE.UU.) diluido 1:7500 con disolución de bloqueo. Finalmente, la membrana se lavó exhaustivamente con tampón sustrato (Tris.HCl 0,1 M, pH 9,5, NaCl 0,1 M y MgCl_{2} 50 mM) y se reveló mediante incubación con azul de nitrotetrazolio y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (Promega, Leiden, los Países Bajos) en tampón sustrato. La reacción de tinción se detuvo aclarando la inmunotransferencia con agua.

Se analizó la capacidad de unión a antígeno tras la inmunotransferencia mediante incubación del filtro bloqueado con hPLAP soluble (Sigma Chemical, San Luis, MO, EE.UU., concentración final de 0,1 u/ml en disolución de bloqueo), seguido por la reacción de tinción enzimática específica, tal como se describió anteriormente.

Para mediciones densitométricas, se sometió a exploración la inmunotransferencia que contiene señales inmunorreactivas con un dispositivo de exploración de sobremesa y se analizaron mediante el software Whole Band Analyses ("análisis de bandas completo") (Bio Image, Ann Arbor, MI, EE.UU.). Se calculó la intensidad integrada para cada carril en términos de porcentaje.

Se logró la inmunodetección anti-cola E con un anticuerpo anti-cola E murino (1:1000, Pharmacia LBK Biotechnology, Uppsala, Suecia). Se logró la inmunodetección anti-cola de His con un anticuerpo anti-cola de His (Qiagen Inc, Valencia, CA, EE.UU.).

Ambas etapas de incubación estuvieron seguidas por un suero anti-IgG murina conjugado con fosfatasa alcalina (Pharmigen, San Diego, CA, EE.UU.). Se realizó la posterior tinción enzimática tal como se describió anteriormente.

La molécula IgM de BCL1 purificada y biotinilada fue una amable donación del Dr. K. Thielemans (VUB, Bélgica). Se utilizó en una concentración final de 1 \mug/ml para incubar la inmunotransferencia que contienen la molécula B1Fab-scFv o B1scFv. Posteriormente, la inmunotransferencia se trató con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Life Technologies, Paisley, RU) y se tiñó con la misma reacción enzimática descrita anteriormente.

Purificación mediante IMAC de Fab-scFv biespecífico Preparación de la columna

Para una purificación a gran escala, se utilizó una columna quelante Hi-Trap (Pharmacia). Las perlas de agarosa de la columna se enjuagaron meticulosamente con agua bidestilada, se cargaron con 1 volumen de columna de NiSO_{4} 0,1 M e inmediatamente se enjuagaron con 5 volúmenes de columna de agua bidestilada.

Preparación de la muestra

Se concentró el sobrenadante con HEK293T, se dializó hasta 150 ml de PBS(A), complementado con imidazol hasta una concentración final de 10 mM y posteriormente se ajustó hasta pH 7,5.

Purificación

La columna se equilibró con 10 volúmenes de tampón inicial (PBS(A) que contenía imidazol 50 mM, 10% de glicerol, pH 8,5) y se cargó con la muestra utilizando una jeringa con cierre Luer. Se recogió el flujo a su través. Se utilizaron diez volúmenes de tampón inicial para lavar la columna y se eluyó el Fab-sFb biespecífico con PBS(A) que contenía imidazol 400 mM, pH 8,5.

Concentración, diálisis y análisis funcional de B1Fab-scFv purificado

Las fracciones eluidas se concentraron mediante ultrafiltración (sistema Centricon, Amicon) se diluyeron en PBS(A)y se concentraron de nuevo hasta un volumen final de 300 \mul. Se midió la concentración de proteínas con un ensayo de proteínas Biorad DC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) y se determinó que era de 4 mg/ml. La cantidad final de B1Fab-scFv purificado fue de 1,3 mg. El B1Fab-scFv purificado se utilizó en un ensayo de proliferación de células T tal como se describe más adelante y se encontró que era funcional. Un \mug de BsAb purificado dio lugar a una respuesta proliferativa comparable a la de 1 \mug de proteína no purificada (datos no mostrados).

Citometría de flujo

Se utilizaron células TE2, CD3^{+} Th-1 (Grooten et al., 1989), células MO4 de fibrosarcoma de ratón, células MO4I4, transfectadas con el gen hPLAP (Hendrix et al., 1991; proporcionado amablemente por el Dr. M. De Broe, Universidad de Amberes, Bélgica) y células BCL1^{vitro} (obtenidas del Dr. K. Thielemans) para experimentos de citometría de flujo.

El anticuerpo E6 anti-hPLAP monoclonal, murino, purificado (De Waale et al., 1988; Flamez et al., 1995) se utilizó para verificar la expresión de hPLAP en las células MO_{4}I_{4}. Se utilizó una fracción purificada del anticuerpo monoclonal anti-CD3\varepsilon murino parental 145-2C11 (Leo et al., 1987, proporcionado amablemente por el Prof. J. Plum, RUG, Gent) para verificar la expresión de CD3 en las células TE_{2} (datos no mostrados).

Para la tinción mediante inmunofluorescencia indirecta, se lavaron células TE_{2} (CD3^{+}) con medio RPMI 1640 y se resuspendieron (25 x 10^{4} células por muestra) en 500 \mul del BsAb, dializado y concentrado, (\alphahPLAP x \alphaCD3) (4 \mug) y, posteriormente, se incubaron en hielo durante 60 min. De la misma manera, las células MO_{4}I_{4} (hPLAP^{+}) se lavaron con medio RPMI 1640 y se incubaron 25 x 10^{4} células con BsAb (\alphahPLAP x \alphaCD3). Tras tres etapas de lavado con tampón de incubación (PBS(A) complementado con un 0,5% de BSA y 0,02% de NaN_{3}), las células se cargaron con BsAb y se incubaron durante 60 min. en hielo con una dilución 1:1000 del fragmento de cabra (Fab')_{2} conjugado con fluoresceína contra IgG de ratón (Fab')_{2} (Cappel, West Chester, RU). Tras un procedimiento final de lavado, todas las células se resuspendieron en 300 \mul de tampón de incubación e inmediatamente se analizaron mediante citometría de flujo (FACScalibur; Becton Dickinson, Sunnyvale, CA).

Se midió la intensidad de fluorescencia verde para la población de células vivas, que se mantuvo de manera constante a 4ºC. Se trataron las presentaciones de los histogramas resultantes con el software WinMDI (interrelación de múltiples documentos y aplicaciones de citometría de flujo, versión 2.1.3, TSRI, http://facs.sripps.edu/software.html.

El análisis por citometría de flujo del carácter biespecífico de BsAb (\alphahPLAP x \alphaCD3) se realizó esencialmente en un procedimiento similar, pero en el presente documento se utilizaron diferentes células tumorales y sistemas de detección. Para la tinción de inmunofluorescencia de las células TE2 (CD3^{+}) pretratadas con BsAb (\alphaBCL1 x \alphaCD3) (15 \mug/ml), se utilizó el anticuerpo biotinilado IgM de BCL1 (donado por el Dr. K. Thielemans) seguido por estreptavidina conjugada con FITC (Sera-Lab LTD, Crawley Down, RU). Se utilizaron células BCL1^{vitro} (BCL1^{+}) para analizar la capacidad de unión de la subunidad quimérica Fab del anticuerpo biespecífico. Las células se cargaron con BsAb (\alphaBCL1 x \alphaCD3) y posteriormente se tiñeron con los siguientes anticuerpos de detección: anticuerpo anti-cola de His (Qiagen Inc, Valencia, CA, EE.UU.), anti IgG1 de ratón (Sigma), anti-Ig de cabra conjugado con FITC (Sigma), Finalmente, las células con fluorescencia verde se contaron con un citómetro FACSCaliber.

El análisis por citometría de flujo de la molécula triespecífica (\alphahPLAP x \alphaBCL1 x \alphaCD3) y Fab-(scFv)_{2} se realizó esencialmente tal como se describió anteriormente, pero se utilizaron anticuerpos de detección diferentes: anti-\gamma/\kappa de IgG de ratón (dilución 1:200) y suero de pollo anti-IgG de cabra (H+L)-FITC (dilución 1:200, Chemicon, Tenecula, CA, EE.UU.).

Ensayo de proliferación de células T

Para el modelo de tumor con hPLAP, se utilizaron células tumorales MO4I4 y células T esplénicas de C3H/
HeOUico singénicos, para las células de linfoma BCL1 se utilizaron células T de ratones BALB/c singénicos. Todos los ratones se adquirieron del grupo de Charles River (Sulzfeld, Alemania) y se almacenó y trató según las directrices dadas por la comisión ética local para los experimentos con animales.

Las células MO4I4 y BCL1^{vitro} se pretrataron con mitomicina C50 \mug/ml a 37ºC en la oscuridad durante 12 h y 1,5 h, respectivamente. Tras la retirada de la mitomicina C, se cultivaron conjuntamente 5 x 10^{4} células con las correspondientes 1 x 10^{5} células T esplénicas en un pocillo de fondo redondo en presencia de la concentración indicada del BsAb (\alphahPLAP x \alphaCD3) (\alphaBCL1 x \alphaCD3) o la molécula triespecífica (\alphahPLAP x \alphaCD3 x \alphaBCL1). Tras 48 h, las células se pulsaron con 0,5 \muCi de tritio-timidina ([^{3}H]TdR, 1 mCi/ml, Amersham). Dieciocho h después, las células se lisaron por congelación, se recogió el ADN con un colector automático de células y se midió la radioactividad incorporada mediante recuento por centelleo, utilizando un aparato Top-count (Packard, Meriden, CO,
EE.UU.).

Ensayo de liberación de ^{51}Cr

Se generaron respuestas CTL alorreactivas primarias y se investigaron con un ensayo habitual de liberación de ^{51}Cr. Brevemente, se mezclaron 4 x 10^{6} células esplénicas singénicas que responden (C3H/HeOUico para el modelo tumoral con hPLAP, BALB/c para el modelo tumoral con BCL1) con 4 x 10^{6} células esplénicas alogénicas estimuladoras (C57B1/6) que se trataron con mitomicina C 50 \mug/ml durante 60 min., a 37ºC en la oscuridad. La población de células mezcladas se cultivó conjuntamente en cultivos de 2 ml de medio completo (RPMI 1640, con 10% de suero bovino fetal, 0,03% de L-glutamina, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml, piruvato de sodio 0,4 mM y \betaME 5 x 10^{-5}) en presencia de mIL2 30 U/ml. Estos cultivos de incubaron a 37ºC en un 5-7% de CO_{2} en aire humidificado durante 5 días.

Se incubaron las células tumorales (MO4I4 o BCL1^{vitro}) con 150 \muCi de Na^{51}CrO_{4} (Amersham, Ghent, Bélgica) durante 90 min. a 37ºC y se lavaron cuidadosamente (para minimizar la liberación espontánea). Se recogieron las células efectoras del cultivo de linfocitos mezclados, se lavaron y se cultivaron en placa 25 x 10^{4} células por triplicado en placas de 96 pocillos con fondo en U (Falcon, Becton Dickinson, Mountain View, CA, EE.UU.) que contenían 5 x 10^{3} células tumorales y anticuerpo biespecífico (1 \mug/ml). La razón de efector/diana es de 50/1 en un volumen total de 200 \mul. Tras 4 h de incubación a 37ºC, se transfirieron 30 \mul del sobrenadante del cultivo a una placa Luma-plate (Packard, Meriden, CO, EE.UU.) se secó al aire y se midió con un aparato Top-count. Se calculó el porcentaje de lisis específica como 100 x [(liberación experimental) - (liberación espontánea)/(liberación máxima) - (liberación espontánea)]. La liberación máxima fue el valor obtenido a partir de células diana incubadas con un 2% de SDS. La liberación espontánea nunca superó el 14% de la liberación máxima.

Estabilidad del suero in vitro Preparación del suero e incubación de la muestra

Se trataron ratones BALB/c con un anestésico (3,75 mg de avertina) y se les sacó sangre mediante punción cardiaca. La sangre se incubó a 37ºC durante 60 min., luego se almacenó a 4ºC durante 60 min. y posteriormente se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 min. El suero se esterilizó por filtración y se añadió la muestra de Fab-scFv hasta una concentración final de 4 \mug/ml. Esto se dividió en tres lotes (cada uno de 150 \mul) y se incubaron a 37ºC en condiciones estériles. Tras varios periodos de tiempo (2 h, 12 h y 24 h), uno de los lotes se congeló hasta su posterior análisis.

Análisis de la actividad restante del BsAb Fab-scFv tras la incubación con suero

Se investigó la estabilidad en suero del BsAb Fab-scFv novedoso utilizando un ensayo habitual de proliferación de células T. Se argumentó que la actividad funcional restante en las muestras incubadas con suero se correlaciona con la estabilidad en suero de la proteína biespecífica. Las muestras de suero congeladas se sometieron por triplicado a un ensayo de proliferación de células T, tal como se describió anteriormente.

Ejemplo 1 La heterodimerización por interacción CL-CH1 en células eucariotas puede depender del emparejamiento VL-VH apropiado

En un primer intento, se construyeron minicuerpos utilizando los dominios CL y CH1 por sí mismos para promover la heterodimerización de dos moléculas de scFv diferentes. Sin embargo, tras la cotransfección de plásmidos de expresión para las proteínas de fusión VH-VL-CL (scFv-CL) y la VL2-VH2-CH1 (scFV-CH2), en su mayoría todas las inmunoglobulinas secretadas, detectadas mediante un suero anti-\gamma/\kappa de IgG de ratón, estaban en formato de monómero. La inclusión de una cola E en el extremo C-terminal del dominio CH1 permitió la fácil discriminación entre scFv-CL y scFv-CH1 con cola E mediante inmunodetección con un anticuerpo anti-cola E. Esto mostró claramente que los monómeros no eran scFv-CH1 y que la pequeña cantidad de dímeros formados no contenía la molécula de fusión scFv-CH1, y por tanto, consistía en moléculas de scFv-CL solas (datos no mostrados). Para evitar el posible impedimento estérico producido por la fusión de las moléculas de scFv a los dominios CL y CH1, se preparó un derivado con una secuencia de unión flexible más larga (16 aminoácidos: VNHKPSNTKVDKRVEL) separando el componente de fusión de CH1. Para simplificar el análisis del constructo, se utilizó una molécula de \beta-lactamasa como componente de fusión, que permite la detección de heterodímeros simplemente basándose en el peso molecular. Cuando se coexpresa la fusión bla-CH1 con la fusión scFv-CL, sólo pudieron encontrarse en el medio productos que contienen CL con la inmunodetección con anti-\gamma/\kappa de IgG de ratón. Esto es especialmente notable puesto que esto también fue cierto cuando la fusión bla-CH1 se coexpresó con una cadena L nativa. Los derivados de cadena L o cadenas L pueden expresarse por sí mismos y aparecen como monómeros y como homodímeros, de modo que puede secretarse sin asociación a cualquier otro componente. La fusión bla-CH1 no se espera que impida la asociación de CH1-CL, así que se esperaba que se formaría un dímero L:bla-CH1 por la interacción de CL y CH1. No puede observarse ningún producto con el peso molecular esperado del heterodímero pretendido (figura 2A). Además, la inmunodetección con el anticuerpo anti-cola E sumamente sensible fracasó en revelar alguna traza del heterodímero L:bla-CH1 (datos no mostrados).

Sin embargo, en la situación inversa, cuando se coexpresó una fusión scFv-CL con una cadena Fd nativa (VH1-CH1), pudo formarse un heterodímero scFv-CL:scFd (figura 2B, molécula A3), incluso cuando la cadena Fd se extendía en el extremo N-terminal con otra scFv (scFv-CL:scFv-Fd) (figura 2B, molécula C1). Sin embargo, se observó una heterodimerización más eficaz cuando se coexpresó la fusión scFv-Fd con la cadena L nativa. Esto dio como resultado un anticuerpo biespecífico mediante fusión genética de un fragmento scFv al extremo N-terminal de la cadena Fd de un fragmento Fab (figura 2B, molécula C2), que es un formato novedoso para anticuerpos biespecíficos. Debido al hecho de que no se incluye la región bisagra, ambas especificidades de unión siguen siendo monovalentes.

Ambos homodímeros VL-CL:VL-CL (L:L) y VH-CH1:VH-CH1 (Fd:Fd) podrían formarse en teoría. Especialmente, se ha descrito ya el dímero de cadena L. El dímero de cadena Fd no se ha observado nunca, tal como se muestra también en la figura 2C: pueden expresarse el fragmento Fab completo y el dímero de cadena L, mientras que la expresión de Fd no es detectable en el medio ni en la fracción celular. Esto es debido posiblemente a la asociación descrita de chaperonas endoplásmicas, tales como BiP con una cadena Fd no apareada. Cuando se pospone la asociación de la cadena L, la cadena Fd podría degradarse en su lugar.

BiP es una chaperona endoplásmica (retenida en el RE por una secuencia KDEL) de la familia HSP70 que generalmente se une a parches hidrófobos expuestos. La asociación de BiP con cadenas Fd o a dominios CH1 sola podría ser responsable del fracaso de todas las moléculas de fusión scFv-CH1 o BLA-CH1 para emparejarse con una cadena L o una proteína de fusión scFv-CL. En estas moléculas, el dominio CH1 no está precedido por un dominio VH que podría entonces emparejarse con un dominio VL apropiado. Esto podría explicarse si BiP se uniera principalmente al dominio CH1, y el desplazamiento sólo podría producirse de manera eficaz cuando también la interacción VH-VL contribuya también a la energía de unión. Si las energías de interacción de CH1 con BiP o con CL están al menos en el mismo intervalo, el desplazamiento de la chaperona sería ineficaz a menos que una energía libre adicional de unión, contribuida por la interacción de VH con VL, favorezca el desplazamiento. La asociación improductiva prolongada de BiP con moléculas de fusión que contienen CH1 podría conducir entonces a la fijación de las moléculas como diana para su degradación.

La figura 2 muestra que la heterodimerización de moléculas que contienen CL y CH1 en células eucariotas puede depender del emparejamiento de dominios VL y VH apropiados. Se resumen las moléculas esperadas tras la coexpresión de proteínas de fusión que contienen CL y CH1. Los dominios derivados de cadena ligera están en negro, los dominios derivados de cadena pesada están en blanco, los dominios derivados de 2CL están sombreados. Se muestra una inmunotransferencia, revelada con suero anti-\gamma/\kappa de IgG de ratón, de un SDS-PAGE al 10% no reductora cargado con fracciones de sobrenadante de células COS-1. Junto a los dibujos de los geles, se muestra la posición de los marcadores de peso molecular (kDa), así como la configuración y posición de las moléculas observadas sobre el gel.

En la figura, los símbolos rellenos representan todos los dominios procedentes de moléculas que contienen CL; los símbolos vacíos representan dominios procedentes de moléculas que contienen CH1.

A]

Coexpresión de 2c11scFv-CH1 con E6scFv-Cl (molécula A1) o con la cadena E6L natural (molécula A2), y de una fusión bla-CH1 (separado por una secuencia de secuencia de unión alargada) con E6scFv-CL (molécula B1) o con la cadena E6L natural (molécula B2). En el carril L1, se carga E6scFv-CL y en el carril L2, la cadena E6L sola. Por lo demás, la molécula esperada se muestra en la parte superior de cada carril. En todos los casos, sólo son visibles los derivados de cadena ligera o de cadena ligera monoméricos y diméricos. Esto se confirmó revelando las mismas muestras con un anticuerpo sumamente sensible contra CH1-cola E fusionada.

B]

El carril L1 muestra la expresión de E6scFv-CL solo. La coexpresión de E6scFv con una cadena Fd extendida en el extremo N-terminal (C1) en lugar de una molécula de CH1 extendida en el extremo N-terminal (compárese A1 y B1) dio como resultado la formación de un heterodímero esperado, aunque la eficacia de la heterodimerización es baja. La eficacia de la heterodimerización se aumentó hasta más del 90% mediante la coexpresión de la fusión scFv-Fd con la cadena L natural (C2).

C]

La expresión de la cadena Fab (Fab) y de la cadena L sola (L) es detectable, pero la expresión de la cadena Fd solo no puede detectarse en el medio (med) ni en la fracción celular(cel).

Ejemplo 2 Heterodímeros Fab-scFv como un sistema modelo para anticuerpos biespecíficos

Una de las desventajas de utilizar moléculas de BsAb recombinantes más pequeñas, tales como moléculas de (scFv)_{2} o moléculas de scFv dimerizadas, es el corto alcance relativo hasta antígenos alejados. Esto es especialmente importante si se pretende que las moléculas unan dos células diferentes. Cuando las cadenas Fab se utilizan como motivo de la heterodimerización, pueden constituir una especificidad de unión por sí mismas. Para mejorar aun más el intervalo de interacción, se fusionó la segunda especificidad al otro lado (extremo C-terminal) de la posición de la especificidad de unión del fragmento Fab. Puesto que una molécula de scFV confiere la segunda especificidad de unión, el peso molecular será todavía lo suficientemente bajo como para permitir una rápida penetración tisular, aunque siendo lo suficientemente alto como para evitar el rápido aclaramiento del organismo.

La secuencia de unión de péptido artificial utilizada para conectar la cadena Fd o la L no debe contener una región bisagra funcional, puesto que este motivo puede ser responsable de una homodimerización de dos BsAb, haciéndolos divalentes para cada especificidad de unión. Esto puede ser una desventaja para algunas aplicaciones, puesto que algunos receptores pueden activarse por reticulación, conduciendo a la activación o inactivación prematura de la célula efectora. Las especificidades de unión monovalentes son, por ejemplo, de gran importancia cuando se utiliza la molécula para redirigir células T hasta un sitio tumoral. Una unión anti-CD3 bivalente podría conducir a una reticulación de CD3 sistémico, conduciendo a una activación temporal de las células T y una energía de las células T sostenida. Además, para algunos marcadores de membrana, una unión bivalente podría conducir a la internalización y eliminación de la molécula de la superficie celular. Por tanto, es importante utilizar el fragmento Fab como una unidad de dimerización y no el Fab'. Si se incluye una región bisagra funcional, actuará como un motivo de homodimerización por sí misma, doblando las especificidades de unión en una parte sustancial de las moléculas expresadas, incluso si se expresan juntas dos moléculas diferentes.

Se ha explorado la posibilidad de crear moléculas de BsAbmonovalentes fusionando una molécula de scFv a través de una secuencia de unión en el extremo C-terminal de o bien la cadena Fd o bien la L (figura 3A). Utilizando esto como un sistema modelo para la creación de BsAb, se puede obtener una heterodimerización muy específica las moléculas de L con las de Fd-scFv. Hasta más del 90% de las proteínas de inmunoglobulina secretadas estaba en el formato biespecífico deseado (figura 3A). Además, el formato L:Fd-scFv permite la producción eficaz del BsAb a partir del medio de cultivo de las células transfectadas. Sin amplificación, pudieron obtenerse hasta 10 \mug de BsAb/ml de medio de cultivo.

Aparentemente, la longitud y composición de la secuencia de unión peptídica que conecta las moléculas de L con las de scFv puede variarse sin ninguna disminución significativa en la expresión del heterodímero L-scFv:Fd (figura 38). La proteína de fusión Fab-scFV se expresó como el principal producto derivado de inmunoglobulina tal como se demuestra mediante inmunodetección con anticuerpos anti-\gamma/\kappa de IgG y anti-cola E. La revelación de las proteínas sometidas a inmunotransferencia con hPLAP mostró la funcionalidad del fragmento Fab. Una secuencia de unión más larga podría permitir un mayor intervalo de alcance para el antígeno, o una secuencia de aminoácidos diferente podría estabilizar el producto de fusión. Esto podría ser importante cuando la secuencia de unión flexible deba ser vulnerable para las proteasas presentes en el entorno en el que se espera que funcione el BsAb.

Como modelo de un BsAb monovalente, se caracterizó adicionalmente el (\alphahPLAP)Fab-(\alphaCD3)scFV con la secuencia de unión peptídica (G_{4}S)_{3} (H2) para la unión funcional a células que expresan hPLAP (células de fibrosarcoma M_{4}OI_{4}) o CD3 (células T TE2) en su membrana. El BsAb Fab-scFv (\alphahPLAP x \alphaCD3) se demostró que se unía de manera eficaz a ambas células, probando la funcionalidad de ambos lados de unión de este nuevo modelo para BsAb (figura 4A). Esta unión no se observó con células que no expresaron los marcadores hPLAP o CD3 (datos no mostrados). Para excluir la posibilidad de que fracciones de BsAb unan sólo un antígeno al mismo tiempo, se ensayó la funcionalidad de los BsAb para unir dos células al mismo tiempo. Esto se realizó utilizando un ensayo de proliferación de células T y un ensayo de citotoxicidad de células T (figura 4B). Estos ensayos mostraron claramente que, de hecho, el BsAb podía unir dos células diferentes al mismo tiempo. Pudo observarse una reacción de células T claramente dependiente de la dosis, sólo cuando se utilizaron BsAb con las especificidades apropiadas (\alphahPLAP x \alphaCD3) y células que expresan hPLAP. Esto demuestra claramente que el nuevo modelo de Fab-scFv es funcional como derivado de anticuerpo biespecífico y puede redirigir la actividad CTL hacia células tumorales.

La parte Fab de la molécula puede ser también una molécula híbrida, en la que los diferentes dominios se derivan de diferentes anticuerpos. Tal Fab quimérico puede constituirse a partir de un VH y un VL con una especificidad definida, fusionados a dominios constantes derivados de un anticuerpo diferente. En la figura 5A, se muestra que puede producirse satisfactoriamente la expresión de un BsAb que contiene un fragmento Fab híbrido con dominios VH y VL derivados del anticuerpo B1 anti-BCL1 y dominios constantes procedentes del anticuerpo E6 anti-hPLAP. De nuevo, la heterodimerización de la molécula biespecífica deseada fue muy selectiva. La funcionalidad de las especificidades de unión se demostró mediante citometría de flujo y mediante la funcionalidad en un ensayo de proliferación de células T y un ensayo de lisis de células T dirigida por anticuerpo (figura 5B).

Fusionar una segunda funcionalidad a la cadena Fd tiene la ventaja adicional de que la purificación por afinidad dirigida hacia la fusión Fd-scFv (por ejemplo, mediante inclusión de una cola de His en la molécula) elimina las cadenas L no funcionales restantes. Tal como se mencionó, nunca se producen homodímeros Fd:Fd, así que cada cadena Fd o proteína de fusión que contiene Fd se empareja sólo con una cadena L o derivado de cadena L y, por tanto, están en el formato biespecífico. Debido a la eficaz heterodimerización de la cadena Fd y la L, el principal producto heterólogo formado mediante líneas celulares transformadas, estables o transitorias, es el producto deseado. La figura 6A muestra que el BsAb puede expresarse eficazmente en una línea celular HEK293T transformada transitoria (1 \mug/ml en medio de cultivo) y una línea celular mieloide defectuosa SP2/0 transformada estable (hasta 10 \mug/ml en medio de cultivo). Tras una purificación por afinidad de una etapa, pudo obtenerse una preparación de BsAb pura en un 70 - 90%, dependiendo de si el medio contenía FCS o no. El BsAb purificado era todavía activo en un ensayo de proliferación de células T (datos no mostrados). La incubación durante hasta 24 h en suero nuevo derivado de ratón no dio como resultado una pérdida significativa de actividad (< 30%), de nuevo medido mediante un ensayo de proliferación de células T (figura 6B).

La figura 3 muestra la expresión de proteínas de fusión Fab-scFv en el extremo C-terminal. El modelo de BsAb pretendido mediante coexpresión de dos cadenas se representa esquemáticamente. Los rectángulos rellenos representan dominios derivados de cadenas ligeras, los rectángulos vacíos representan dominios derivados de cadenas pesadas. Los dominios derivados de 145-2C11 están sombreados, los BsAb se produjeron fusionando el fragmento Fab (\alphahPLAP) de E6 o bien a las moléculas de scFV de 2c11 (\alphaCD3) o 3D5 (\alphaHIS). Se utilizaron diferentes secuencias de unión para fusionar scFv al extremo C-terminal de o bien la cadena L (L2, 4, 5, 6, 7 y 8) o bien la cadena Fd (H1 y 2), oscilando desde 4 hasta 20 aminoácidos de largo. La composición de aminoácidos se representa con un código de una sola letra. Los dibujos son de inmunotransferencias proteicas tras SDS-PAGE al 10% no reductora del sobrenadante de HEK 293T (recogido 24 h después de la transfección). La posición de los marcadores de peso molecular se indica junto al gel (M).

A]

La cotransformación de los vectores de expresión de L y Fd-scFv dio como resultado un alto grado de homodímeros L:L y relativamente poco heterodímero Fab-scFv (D1). Sin embargo, la inversión de la orientación de scFv (VHVL en lugar de VLVH) dio como resultado más del 90% de heterodimerización específica, con pocos contaminantes de cadenas L no apareadas u homodimerizadas (D2), mientras se mantiene la secuencia de unión que conecta. Esencialmente, se obtuvieron los mismos resultados cuando se alargó la secuencia de unión que interconecta hasta 20 aminoácidos (D3) o cuando scFV se fusionó al extremo C-terminal de la cadena L. Se investigaron las inmunotransferencias con suero de cabra anti-\gamma/\kappa de IgG de ratón y se reveló con un suero anti-cabra conjugado con fosfatasa alcalina y NBT/BCIP (azul de nitrotetrazolio / fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo).

B]

Expresión de BsAb formado mediante el acoplamiento de un scFv anti-His, también en formato VLVH, a la molécula de cadena L E6, utilizando cinco tipos diferentes de secuencias de unión. La inmunodetección de las proteínas sometidas a inmunotransferencia mediante anti-\gamma/\kappa de IgG de ratón y anti-cola E muestra que todas las moléculas de inmunoglobulina detectables están en el formato de heterodímero esperado. La primera inmunotransferencia se reveló con hPLAP, mostrando la funcionalidad de la parte Fab de E6 de la molécula.

En la figura 4, se muestra que las proteínas de fusión Fab-scFv en el extremo C-terminal son funcionales como anticuerpos biespecíficos.

A]

Se demostró la unión celular funcional del BsAb Fab-H2-scFv (\alphahPLAP x \alphaCD3) mediante citometría de flujo en células de fibrosarcoma que expresan hPLAP (MO4I4) y en células T que expresan CD3 (TE2). Las células se incubaron con el anticuerpo de detección secundario anti-(Fab')_{2}-FITC de ratón (curvas vacías) o se pretrataron con E6Fab-scFv biespecífico y posteriormente se incubaron con el anticuerpo de detección (curvas rellenas). Fab-scFv biespecífico mostró unión tanto a las células CD3^{+} como a las células hPLAP^{+} con una afinidad satisfactoria.

B]

Se demostró un ligado célula-célula funcional a través de Fab-scFv, mediante la activación de células T con la reticulación de CD3. El primer ensayo mide la proliferación de células T como una respuesta a la formación de puentes entre células tumorales y células esplénicas mediada por la proteína de BsAb Fab-scFv (\alphahPLAP x \alphaCD3). Para el modelo de tumor con hPLAP, se cultivaron conjuntamente células MO4I4 tratadas con mitomicina con células esplénicas C3H (razón diana/célula que responde: 1/20). La proteína de BsAb Fab-scFv (\alphaBCL1 x \alphaCD3) que no se une a hPLAP se utilizó como control. Se midió la proliferación de células T mediante la incorporación de tritio y depende de la concentración del Fab-scFv biespecífico.

El segundo ensayo mide la destrucción de las células diana MO4I4 por células T citotóxicas redirigidas por BsAb. Se muestra un diagrama de la respuesta citotóxica de células esplénicas C3H singénicas, alorreactivas tras su incubación con células MO4I4 marcadas con ^{51}Cr y en presencia del Fab-scFV biespecífico apropiado. El BsAb Fab-scFv (\alphahPLAP x \alphaCD3) puede formar un puente entre las células efectoras y las células diana (razón celular 50/1) mientras que el control BsAb Fab-scFv (\alphaBCL1 x \alphaCD3) no puede. Se calculó la lisis específica dividiendo la lisis medida menos la lisis espontánea entre la diferencia entre la lisis máxima y la lisis espontánea. La lisis no específica no fue superior al 10% de la lisis máxima.

En ambos ensayos, pudo observarse una activación específica de células T que dependía de la presencia del antígeno tumoral hPLAP (datos no mostrados) y de la presencia y concentración del BsAb Fab-scFv (\alphahPLAP x \alphaCD3).

La figura 5 demuestra que las moléculas de Fab quiméricas pueden utilizarse para construir anticuerpos biespecíficos Fab-scFv.

A]

representación esquemática de una molécula de BsAb Fab-scFv que contiene cadenas Fab quiméricas. En este ejemplo, los dominios VH1 y VL1 se derivan del moAb B1, con una especificidad anti-linfoma BCL1. La molécula de fusión híbrida pudo expresarse eficazmente en células HEK293T, tal como puede verse en la inmunotransferencia de una SDS-PAGE al 10% no reductora cargada con sobrenadante que contiene las moléculas de BsAb Fab-scFv (\alphaBCL1 x \alphaCD3) (carril 1) o la molécula control bssFv (De Jonge et al; 1995). El sistema de detección utilizado es el mencionado debajo de cada panel. Se indican los productos detectados y los marcadores de peso molecular (kDa).

El BsAb quimérico Fab-scFV (\alphaBCL1 x \alphaCD3) mantuvo su especificidad de unión tal como se demuestra mediante citometría de flujo. Se muestran histogramas del análisis por citometríade flujo de células BCL1^{vitro} y células T CD3^{+} TE2, incubadas con el BsAb Fab-scFv (\alphaBCL1 x \alphaCD3) e incubadas posteriormente con el anticuerpo de detección (curvas rellenas) o incubadas con los anticuerpos de detección solos (curvas vacías). La unión de las células de linfoma de células B BCL1 se detectaron mediante un anticuerpo anti-HIS (Qiagen, DE), seguido por incubación con suero de cabra anti-IgG1 de ratón y con suero anti-cabra acoplado con FITC. Se demostró la unión a células T TE2 mediante incubación con el moAb de IgM de BCL1 ideotípico biotinilado seguido por incubación con estreptavidina acoplada con FITC. El BsAb Fab-scFv (\alphaBCL1 x \alphaCD3) mostró unión a ambas células CD3^{+} y BCL1^{+} con afinidad satisfactoria.

B]

Se demostró que el BsAb quimérico Fab-scFv (\alphaBCL1 x \alphaCD3) era activo como BsAb mediante la activación dependiente de célula diana y anticuerpo de células T, medido mediante ensayos de proliferación y citotoxicidad específica. Las curvas muestran proliferación de células T como una respuesta a la formación de puentes entre las células de linfoma y las células esplénicas mediada por la proteína de BsAb Fab-scFv (\alphaBCL1 x \alphaCD3). Se cultivaron conjuntamente células BCL1 tratadas con mitomicina con células esplénicas de Balb/c en una razón de diana/célula que responde de 1/2. Se midió la proliferación de células T mediante la incorporación de tritio y disminuye con la dilución del Fab-scFv biespecífico. El diagrama muestra la respuesta citotóxica de células esplénicas de Balb/c, singénicas y alorreactivas con la incubación con células BCL1^{vitro} marcadas con ^{51}Cr, en presencia del Fab-scFv biespecífico apropiado. El Fab-scFv, BCL1 x \alphaCD3, puede formar un puente entre las células efectoras y las células diana (razón de efector/diana de 50/1), mientras que no puede el BsAb control con idéntica estructura pero una especificidad diferente (\alphahPLAP x \alphaCD3).

La figura 6 ilustra la expresión, purificación y estabilidad en suero de moléculas de Fab-scFv biespecífico (\alphaBCL1 x \alphaCD3).

A]

Cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados de BsAb Fab-scFv (\alphaBCL1 x \alphaCD3) biespecífico. El medio de cultivo de células transfectadas transitoriamente (HEK293T) o estables (SP2/0) se cargó en una columna quelante de NTA-Ni^{2+}, se eluyó con imidazol y se analizó sobre un gel de SDS-PAGE al 10% no reductora y se tiñó con azul brillante de Coomassie (CBB). Las fracciones de Fab-scFv purificadas se cargaron en grandes cantidades (10 y 50 \mug) para permitir la detección de pequeñas bandas contaminantes. Como referencia, también se cargó globulina plasmática patrón (Sigma) en las mismas cantidades. Se indica la posición del BsAb Fab-scFv y su peso molecular. Los marcadores de peso molecular se indican en el lado del gel.

B)

Estabilidad en suero de un Fab-scFv (\alphaBCL1 x \alphaCD3). Las fracciones de Fab-scFv purificadas se incubaron durante hasta 24 h en suero de ratón recién aislado. Tras la incubación, se compararon las fracciones para determinar su actividad biológica en un ensayo de proliferación de células T. Se cultivaron conjuntamente células esplénicas de Balb/c con células BCL1^{vitro} tratadas con mitomicina en presencia del B1Fab-scFv biespecífico incubado en suero durante 2, durante 12 h o 24 h. El suero sin B1Fab-scFv biespecífico no dio respuesta. No hubo una pérdida significativa de actividad del Fab-scFv biespecífico tras 24 h de incubación en suero.

Ejemplo 3 Heterodimerización mediada por Fd:L de dos moléculas de scFv diferentes expresión eficaz de anticuerpos triespecíficos

Puesto que la fusión de scFv en el extremo C-terminal a la cadena Fd o la L pudo expresarse satisfactoriamente y dio como resultado moléculas funcionales, se investigó si la molécula de Fab podía todavía formarse si ambas cadenas se alargaban. Cuando se utiliza la señal de heterodimerización L:Fd para unir dos moléculas de scFv, puede crearse una molécula triespecífica utilizando también la especificidad de la molécula de Fab producida por la heterodimerización L:Fd. Esto se realizó mediante la cotransfección de un vector que expresa la proteína de fusión VL-CL-VH2-VL2 (L-scFv) con uno de VH-CH1-VH3-VL3 (Fd-scFv) (figura 7A). Especialmente cuando se fusionan dos moléculas de scFv en el mismo lado de la molécula, es importante monitorizar si la funcionalidad de unión no está afectada por la configuración del TsAb. Los dominios Fv tienen su lado de reconocimiento de antígeno más orientado hacia el lado N-terminal, mientras que éste es también el lado en el que se produce la fusión de las cadenas Fab. Puesto que puede esperarse que las moléculas de scFV dirijan su unión más hacia el fragmento Fab, existe la posibilidad de que mediante la "agrupación" tanto por Fab como por el segundo scFv, la unión a un antígeno del primer scFv esté impedida. A partir de los estudios sobre las secuencias de unión utilizadas en las moléculas de scFv, se sabe que son necesarios 15 aminoácidos para abarcar el diámetro de un domino Fv. Por tanto, se supone que tal secuencia de unión permitiría a la molécula de scFv girar su lado de unión lejos de Fab. Además, dos moléculas de cadena sencilla podrían impedir la interacción normal entre el par L:Fd y, por tanto, inhibir la heterodimerización del TsAb. Por tanto, se construye una serie de moléculas con secuencias de unión peptídicas variables que conectan el Fab con las moléculas de scFv en dos modelos de TsAb diferentes (figuras 7A y 7B). De manera sorprendente, incluso las secuencias de unión más cortas (4 aminoácidos) permitieron la heterodimerización eficaz y no inhibieron la función de las moléculas de scFV unidas (figuras 7 y 8). El TsAb (\alphahPLAP x \alphaBCL1 x \alphaCD3) con una secuencia de unión de seis aminoácidos que conecta el scFv \alphaBCL1 con el Fab \alphahPLAP y con una secuencia de unión de 20 aminoácidos que conecta el scFv \alphaCD3 con el Fab se caracterizó adicionalmente. Pudieron demostrarse todas las especificidades de unión por separado para las células que expresan el marcador apropiado (figura 8A), así como la unión simultánea de una especificidad a un soporte (sólido), mientras se detectaba a través de un segundo grupo funcional (figura 8B). Con el fin de demostrar que el diseño molecular del TsAb podía permitir que las moléculas reticulasen dos antígenos que estaban fijos cada uno sobre las membranas de una célula diferente, se midió la activación de células T con un ensayo de proliferación de células T. Puesto que el TsAb contiene un sitio de unión para dos marcadores tumorales diferentes (hPLAP y BCL1) combinados con una especificidad \alphaCD3, el TsAb debe poder funcionar en un ensayo de proliferación con células que expresan hPLAP y también en un ensayo de proliferación que utiliza células que expresan BCL1. La figura 8 muestra que, de hecho, este es el caso: el TsAb (\alphahPLAP x \alphaBCL1 x \alphaCD3) combina la actividad de dos BsAb distintos (\alphahPLAP x \alphaCD3) y (\alphaBCL1 x \alphaCD3), lo que demuestra una actividad simultánea de las partes moleculares a lo largo de dos ejes cruciales. Claramente, no hubo problema de agrupación intramolecular que inhibiera el scFv \alphaBCL1 para unir incluso una célula de linfoma, mientras se une también a una célula T a través del segundo scFv.

Este diseño molecular permite la libre elección de la posición de los sitios de unión y la valencia del producto final. Una molécula útil con tres grupos funcionales podría ser un anticuerpo específico que tiene como diana dos antígenos tumorales diferentes en lugar de uno (figuras 7 y 8). Una unión bivalente al receptor de la célula diana podría ser útil si el receptor sólo se activa mediante la formación de agregados más grandes y es insensible a la dimerización de unidades monoméricas. En este caso, la unión bivalente acelerará la formación de agregados en el sitio diana (figura 9A). Por lo demás, las moléculas con unión bivalente o multivalente a la célula diana mientras mantienen una unión monovalente al receptor de activación en la célula efectora, podrían ser útiles para mejorar la biodistribución del derivado de anticuerpo (figura 9B). Para mejorar la avidez de la unión, es posible crear derivados de anticuerpo de unión multivalente con sólo una especificidad (figura 9C). Este diseño podría ser de importancia con el fin de mejorar la avidez de las moléculas que se van a utilizar, por ejemplo, en la detección y el diagnóstico, in vitro, así como in vivo.

Las cadenas Fd y L también pueden extenderse en el extremo C-terminal con otras moléculas distintas a las de scFv. La fijación como diana de ciertas moléculas de señalización para un tipocelular predeterminado puede ser útil en la práctica terapéutica y de diagnóstico. Se muestra que es posible utilizar la heterodimerización L:Fd para asociar dos moléculas de IL2, una fusionada a la cadena L y la otra fusionada a la cadena Fd, o crear una molécula trifuncional mediante la fusión de un scFV a una cadena y una molécula de señalización, tal como IL2, a la otra (figura 10).

La figura 7 muestra que Fd:L puede heterodimerizar de manera eficaz dos moléculas de scFv diferentes.

A]

Expresión de anticuerpos triespecíficos que pueden fijar como diana dos antígenos tumorales diferentes. Las cadenas Fab de E6 se extendieron ambas en su extremo C-terminal con una molécula de scFv. Se fusionó un marcador tumoral anti-BCL1 a la cadena E6L utilizando dos secuencias de unión diferentes: L4 y L5 de 6 y 12 aminoácidos de longitud, respectivamente. Estos genes de fusión se expresaron conjuntamente con una fusión Fd de E6 - scFv de 2c11 (scFV anti-CD3) con una secuencia de unión que interconecta de 20 aminoácidos (secuencia de unión H2). Los geles muestran el medio de células que expresan el L-scFv solo o en combinación con una cadena Fd no extendida o con una fusión Fd-scFv. Las flechas indican la posición del monómero y dímero de fusión L-scFv y del heterodímero scFv-L:Fd y scFv-L:Fd-scFv. Todos los productos de inmunoglobulina de ratón se visualizaron introduciendo una sonda en la inmunotransferencia con suero de cabra anti-\gamma/\kappa de IgG de ratón. La inmunotransferencia revelada con hPLAP muestra moléculas de unión a hPLAP funcionales (sólo las asociaciones L:Fd de E6 unen hPLAP). La posición de los marcadores de peso molecular se indica en el lado del gel. Ambas moléculas de TsAb se produjeron de manera eficaz.

B]

Influencia de la composición y longitud de la secuencia de unión sobre la producción de derivados de anticuerpo triespecíficos. Se acopló un scFv anti-(His)_{6} que portaba una cola E a la cadena L de E6 utilizando cinco secuencias de unión diferentes, indicadas como L4, L5, L6, L7 y L8. Esta fusión scFv-L (\alphaHIS) con cola E se combinó con Fd-scFv (\alphaCD3) con cola de HIS y casi se produjeron exclusivamente heterodímeros scFv-L:scFv tal como se muestra con la revelación de las proteínas sometidas a inmunotransferencia mediante hPLAP, anti-\gamma/\kappa de IgG, anti-cola E y anti-cola de HIS. La posición del TsAb y de los marcadores de peso molecular se muestra en el lado del gel. Todas las combinaciones de secuencia de unión dieron niveles de expresión iguales del TsAb.

C]

De manera análoga, pudo heterodimerizarse la cadena L con TL8, L4, L5, L6 y L7 unidos a \alphaHISscFv, con la cadena Fd con un H1 unido acoplado a \alphaCB3scFv. Es especialmente importante la expresión eficaz del L-(L8)-scFv con el Fd-(H1)-scFv, ya que ambas secuencias de unión son relativamente cortas.

La figura 8 demuestra la funcionalidad de los derivados de anticuerpo trifuncionales.

Se produjo el TsAb (\alphahPLAP x \alphaBCL1 x \alphaCD3) con la secuencia de unión L4 para monitorizar sus especificidades de unión y funcionalidad.

A]

Las tres especificidades de unión codificadas son funcionales. Se demostró que el TsAb se unía en (1) células de linfoma de células B BCL1 (BCL1^{+}), (2) células de fibrosarcoma MO4I4 (hPLAP^{+}) y (3) a la línea de células T TE2 (CD3^{+}). Se detectó la unión mediante suero de cabra anti-\gamma/\kappa de ratón seguido por una incubación con suero anti-cabra acoplado con FITC.

B]

El derivado de anticuerpo triespecífico puede unir dos moléculas diferentes al mismo tiempo. Mientras que un antígeno se fijó sobre un soporte (una membrana celular o plástico), se utilizó una segunda especificidad para detectar la unión. El TsAb estaba unido a (1) células MO_{4}I_{4} (hPLAP^{+}) o (2) células T TE2 y, posteriormente se incubó con anticuerpo IgM de BCL1 biotinilado (BCL1 es un antígeno idiopático) y estreptavidina acoplada a FITC. En una tercera situación, se recubrió IgM de BCL1 sobre placas para ELISA MaxiSorb (Nunc) y se detectó revelando el hPLAP unido (3). Se utilizó un anticuerpo (\alphahPLAP x \alphahPLAP x \alphaCD3) de la misma configuración pero que carecía de la especificidad \alphaBCL1 como control negativo. Se obtuvieron los valores del blanco mediante incubación con los anticuerpos de detección solos (ambos con análisis mediante FACScan y con experimentos ELISA).

C]

Los derivados de anticuerpo triespecíficos puede reticular diferentes marcadores celulares. El TsAb (\alphahPLAP x \alphaBCL1 x \alphaCD3) pudo actuar tan eficazmente como un BsAb en unensayo de proliferación de células T con células MO4I4 (hPLAP^{+}) y en un ensayo con células de linfoma BCL1 como diana. Esto demuestra que la molécula actúa como un anticuerpo biespecífico en ambos ejes (\alphahPLAP x CD3) y (BCL1 x \alphaCD3). En este ensayo, se compararon el TsAb con las secuencias de unión L4 y L5 que conectan el scFv \alphaBCL1 a la cadena L.

(1)

Proliferación de células T de células esplénicas de Balb/c con el cultivo conjunto de células BCL1^{vitro} tratadas con mitomicina en presencia del anticuerpo triespecífico con la secuencia de unión 4 (TsAb (L4)) o con TsAb con la secuencia de unión 5 (L5). La longitud de la secuencia de unión entre el scFv \alphaBCL1 y \alphaCD3 y el Fab no tiene ninguna influencia sobre la capacidad de formación de puentes del anticuerpo triespecífico.

(2)

Proliferación de células T de células esplénicas CH3 con el cultivo conjunto de células MO4I4 tratadas con mitomicina en presencia del anticuerpo triespecífico con la secuencia de unión 4 (TsAb (L4)) o con TsAb con la secuencia de unión 5 (L5). La molécula biespecífica B1Fab-sFb control no induce proliferación de células T. La longitud de la secuencia de unión entre el scFv \alphaBCL1 y el Fab no tiene ninguna influencia sobre la capacidad de formación de puentes de las otras dos especificidades en el anticuerpo triespecífico.

La figura 9 ilustra la expresión de derivados de anticuerpo multivalentes. Utilizar el modelo de extender una o más de las cadenas Fd o L de una cadena Fab en su extremo C-terminal con moléculas de scFv puede conducir a:

A]

expresión de derivados de anticuerpo biespecíficos de unión a células T bivalentes;

B]

expresión de derivados de anticuerpo biespecíficos de unión a células tumorales bivalentes; y

C]

expresión de derivados de anticuerpo monoespecíficos de unión a células tumorales trivalentes. Se sometieron a inmunotransferencia en geles de SDS al 10% no reductora y se revelaron con suero de cabra anti-\gamma/\kappa de IgG de ratón seguido por anti-cabra acoplado a fosfatasa alcalina y tinción con NBT/BICP, excepto donde se indica que se realizó una tinción con hPLAP. Se realizó el análisis mediante FACScan con los mismos anticuerpos, excepto que el último anticuerpo de detección fue un suero anti-cabra acoplado a FITC. La posición de las diversas formas de anticuerpo producidas y de los marcadores de peso molecular se muestra en el lado de los geles. Todos los derivados se produjeron en células HEK293T mediante cotransformación transitoria de vectores que expresan la cadena L o las proteínas de fusión de cadena Fd indicadas. Las secuencias de unión utilizaron para fusionar el scFv a la cadena L o Fd se indican como L2, L4, L5, L6, L7, H2, H6 y H7 con secuencias de aminoácidos de código único. Las cadenas para cuya expresión se cotransfectaron los vectores se dibujan en la parte superior de los carriles.

En la figura 10, se muestra la expresión de derivados de anticuerpo multifuncionales. La interacción L:Fd puede utilizarse para heterodimerizar moléculas de diferentes clases. En el presente documento, se expresaron satisfactoriamente las moléculas de fusión de IL2 con la cadena L o la Fd. Esto pudo conseguirse incluso cuando se utilizó una secuencia de unión de 3 aminoácidos para fusionarse a la cadena L (L61), combinado con una secuencia de unión de 6 aminoácidos para fusionarse a la cadena Fd (H61). La posición de los productos de fusión tras SDS-PAGE al 10% no reductora se reveló tras inmunotransferencia proteica e inmunodetección y se indica junto al gel, así como la posición de los marcadores de peso molecular que se hacen correr sobre el gel.

Las diferentes combinaciones de cadenas L y Fd nativas se coexpresaron con cadenas complementarias que se extendieron en su extremo C-terminal con moléculas de IL2 murina o con una molécula de scFv. Las cadenas L:Fd nativas se combinaron (carril 1), así como L:Fd-(H61)-mIL2 (carril 2), L:Fd-(H62)-mIL2 (carril 3), L-(L61)-mIL2:Fd-(H61)-mIL2 (carril 4), L-(62)-mIL2:Fd-(H62)-mIL2 (carril 5) y L-(L4)-\alphaBCL1scFv:Fd-(L62)-mIL2 (carril 6). El primer gel se reveló con hPLAP, los geles 2 y 3 se revelaron con suero de cabra anti-\gamma/\kappa de IgG de ratón seguido por anti-cabra acoplado a fosfatasa alcalina y tinción con NBT/BICP.

Este ejemplo muestra que también pueden dimerizarse moléculas de señalización (que pueden ser diferentes o iguales) mediante la interacción L:Fd, sin pérdida de la actividad de unión del fragmento Fab reconstituido. También pueden heterodimerizarse moléculas que pertenecen a diferentes clases moleculares, tales como moléculas de señalización y moléculas de scFv, mediante la interacción L:Fd.

En resumen, la presente invención se refiere a una clase de moléculas especificadas como derivados de anticuerpo de múltiples fines novedosos. Esta clase de moléculas se crea mediante heterodimerización de dos componentes constituyentes. Se obtiene la heterodimerización mediante la interacción heterotípica específica de una combinación de VH-CH1 escogida de dominios de inmunoglobulina, una combinación de VL-CL escogida de dominios de inmunoglobulina. La interacción VHCH1-VLCL se propone como una estructura para heterodimerización muy eficaz que pudo producirse eficazmente. Eligiendo los dominios VH y VL apropiados en el contexto de VHCH1 y VLCL, puede constituirse una especificidad de unión mediante la propia estructura para la heterodimerización. Una o ambas de las cadenas que comprenden VHCH1 y VLCL pueden extenderse, por tanto, en su extremo N o C-terminal, o ambos, con otras moléculas con el fin de combinar estas moléculas entre sí.

Las otras moléculas que se acoplan genéticamente a la estructura para heterodimerización con las secuencias de unión peptídicas de elección, pueden ser un polipéptido de toxina, una enzima, una hormona, una citocina, una molécula de señalización o una cadena sencilla unida a un fragmento Fab con la misma o deferente especificidad. De esta manera, combinando tres o más especificidades diferentes mediante la combinación de una molécula de Fab, con una cierta especificidad, con dos o más moléculas de scFv, con dos o más especificidades diferentes, puede conducir a derivados de anticuerpos triespecíficos o multiespecíficos, mientras se mantiene un peso molecular menor.

Además, el método descrito permite la producción de anticuerpos biespecíficos con una unión bivalente de sólo una especificidad, mientras se mantiene una unión monovalente de la otra especificidad. En su forma mínima, los métodos permiten la creación de anticuerpos biespecíficos con unión monovalente a cada antígeno, combinando una especificidad codificada por las cadenas Fab con una única fusión de scFv, sin la inclusión de una secuencia de unión derivada de una región bisagra de inmunoglobulina.

Este formato difiere de los formatos de anticuerpo producidos mediante ingeniería genética descritos anteriormente por el uso del comportamiento intrínseco de los fragmentos de cadena Fab para heterodimerizar. Puede realizarse una o más extensiones en el lado N o C-terminal, pero nunca incluyendo una región bisagra, que por sí misma es un motivo de homodimerización. Sin incluir la región bisagra, es mucho más sencillo obtener especificidades de unión monovalente en la molécula.

Datos de depósito

Se realizaron los siguientes depósitos de conformidad con la norma 28 EPC (Convención Europea de Patentes):

1.

pCAGGSE6L (presente en células MC1061\lambda de E. coli depositadas el 15 de octubre de 1997 en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos y se le dio el número de registro LMBP3714)

2.

pCA2C11sFvE6Hf (presente en células DH5\alpha de E. coli depositadas el 15 de octubre de 1997 en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos y se le dio el número de registro LMBP3715)

3.

pCAE6HfGS2C11sFv (también identificado como pCAE6H2sc2C11H) (presente en células MC1061 de E. coli depositadas el 15 de octubre de 1997 en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos y se le dio el número de registro LMBP3716)

Abreviaturas

Ab:

anticuerpo

\betaME:

\beta-mercaptoetanol

BsAc:

anticuerpo biespecífico

BssFv:

fragmento Fv de cadena sencilla biespecífico

BSA:

albúmina de suero bovino

BvAb:

anticuerpo bivalente

C:

extremo C-terminal

ºC:

grados Celsius

2C11:

procedente de anticuerpo anti-CD3 de hámster 145-2C11

CD3(\varepsilon)

grupo de diferenciación 3 (cadena \varepsilon)

CH1,CH3:

primer y tercer dominios constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina

CL:

dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina

COS-1:

células CV-1 con origen de replicación SV40 Defectuoso

ADN:

ácido desoxirribonucleico

DMEM:

medio esencial mínimo de Dulbecco

EDTA:

ácido etilendiaminotetraacético

E6:

anticuerpo monoclonal murino contra hPLAP

E. coli:

Escherichia coli

f:

fragmento

Fab:

fragmento de unión a antígeno que incluye VL, CL, VH y CH1

Fab':

fragmento Fab con región bisagra

FACS:

citometría de flujo activada por fluorescencia

Fc:

fragmento con dominios del extremo C-terminal de la cadena pesada de inmunoglobulina

FCS:

suero bovino fetal

Fd:

fragmento de cadena pesada VH-CH1, truncado después de CH1

FITC:

isotiocianato de fluoresceína

\gamma:

cadena pesada de Ig

h:

horas

H:

cadena pesada de Ig

HEK:

células de riñón de embrión humano

hPLAP:

fosfatasa alcalina de placenta humana

Ig:

inmunoglobulina

IL2:

interleucina 2

IMAC:

cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados

kDa:

kilodalton

\kappa:

cadena ligera de Ig

l:

secuencia de unión

L:

cadena ligera

LB:

Luria-Bertami

LMBP:

Laboratorio de Colección de Plásmidos de Biología Molecular

M:

molar

min.:

minutos

mpAb:

anticuerpo de múltiples fines

N:

extremo N-terminal

NP-40:

Nonidet-P40

PAGE:

electroforesis en gel de poliacrilamida

PBS:

solución salina tamponada con fosfato

PCR:

reacción en cadena de la polimerasa

rpm:

revolución(ones) por minuto

SDS:

dodecilsulfato de sodio

seg.:

segundos

sFv:

fragmento Fv unido a cadena sencilla

SV40:

virus 40 de simio

TE:

tampón Tris-EDTA

U:

unidad

UTR:

región no traducida

VH, VL:

dominios variables de las cadenas pesada y ligera de Ig

3D5:

procedente de scFv-3D5 específico para (His)_{6}

mIL2:

interleucina 2 de ratón

Bla:

beta-lactamasa de Escherichia coli

H1-7:

péptido secuencia de unión en los productos de fusión derivados de cadena pesada

LI-8:

péptido secuencia de unión en los productos de fusión derivados de cadena ligera

B1:

mAb de ratón contra idiotipo BCL1

IDA:

Autoridad Depositaria Internacional, Colección de Plásmidos LMBP/BCCM, K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent

CTL:

linfocitos T citotóxicos

(Fab')_{2}

fragmentos Fab' dimerizados

^{3}H:

tritio

^{51}Cr:

cromo radiactivo

\alpha:

anti

CBB:

azul brillante de Coomassie

VH2:

dominio VH derivado del segundo anticuerpo

VL2:

dominio VL derivado del segundo anticuerpo

VH3:

dominio VH derivado del tercer anticuerpo

VL3:

dominio VL derivado del tercer anticuerpo

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Claims (24)

1. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines, que comprende dominios CL y Vl que interactúan con dominios CH1 y VH, en el que dicho dominio CH1 no está unido a una región bisagra, comprendiendo además dos o más de otras moléculas, que tiene al menos un fin adicional acoplado a dos o más de dichos dominios, y en el que la heterodimerización está conducida por la interacción heterotípica entre los dominios (combinación VH-)CH1 y (combinación de inmunoglobulina VL-)CL.

2. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines según la reivindicación 1, en el que al menos una primera de las dos o más de las otras moléculas está acoplada a la cadena VH-CH1 y al menos una segunda de las dos o más de las otras moléculas está acoplada a la cadena VL-CL.

3. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines según la reivindicación 1 ó 2, en el que las dos o más de las otras moléculas se seleccionan de moléculas de scFv, toxinas, enzimas, hormonas, citocinas y moléculas de señalización.

4. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el acoplamiento de dos o más de dichos dominios a la(s) otra(s)molécula(s) tiene lugar a través de una secuencia de unión.

5. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines según la reivindicación 4, en el que la secuencia de unión es una cadena de aminoácidos de al menos 1 aminoácido.

6. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende dos o más de las otras moléculas que tienen al menos un fin adicional y en el que dichas otras moléculas están acopladas a dos o más de las siguientes regiones: el extremo N-terminal del dominio VH, el extremo C-terminal del dominio CH1, el extremo N-terminal del dominio VL, el extremo C-terminal del dominio CL.

7. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que una primera otra molécula está acoplada al lado C-terminal del dominio CH1 y una segunda otra molécula está acoplada al lado C-terminal del dominio CL.

8. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines según la reivindicación 7, en el que una molécula de sFv está acoplada a cada uno de dichos dominios CH1 y CL.

9. Anticuerpo de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de cáncer, infecciones, enfermedades autoinmunitarias o trombosis.

10. Anticuerpo de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en diagnóstico.

11. Constructos de ADN para producir derivados de anticuerpo heterodiméricos de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprenden uno de los siguientes conjuntos de constructos:

a)

-

un primer constructo que codifica para las cadenas que contienen el dominio pesado de un anticuerpo o para el dominio VH de un anticuerpo y el dominio CH1 de otro anticuerpo, que comprende secuencias adecuadas reguladoras de la transcripción y la traducción unidas de manera factible a las secuencias que codifican para los dominios VH y CH1, y que comprende además una secuencia codificante para una o más de otra(s) molécula(s) unida(s) de manera factible a las mismas, y

-

un segundo constructo que codifica para las cadenas que contienen el dominio ligero de un anticuerpo o para el dominio VL de un anticuerpo y el dominio CL de otro anticuerpo, que comprende secuencias adecuadas reguladoras de la transcripción y la traducción unidas de manera factible a las secuencias que codifican para los dominios VL y CL, y que comprende además una secuencia codificante para una o más de otra(s) molécula(s) unida(s) de manera factible a las mismas;

b)

-

un primer constructo que codifica para las cadenas que contienen el dominio pesado de un anticuerpo o para el dominio VH de un anticuerpo y el dominio CH1 de otro anticuerpo, que comprende secuencias adecuadas reguladoras de la transcripción y la traducción unidas de manera factible a las secuencias que codifican para los dominios VH y CH1, y

-

un segundo constructo que codifica para las cadenas que contienen el dominio ligero de un anticuerpo o para el dominio VL de un anticuerpo y el dominio CL de otro anticuerpo, que comprende secuencias adecuadas reguladoras de la transcripción y la traducción unidas de manera factible a las secuencias que codifican para los dominios VL y CL, que comprende además una secuencia codificante para dos o más de otra(s) molécula(s) unida(s) de manera factible a las mismas; o

c)

-

un primer constructo que codifica para las cadenas que contienen el dominio pesado de un anticuerpo o para el dominio VH de un anticuerpo y el dominio CH1 de otro anticuerpo, que comprende secuencias adecuadas reguladoras de la transcripción y la traducción unidas de manera factible a las secuencias que codifican para los dominios VH y CH1, y que comprende además una secuencia codificante para dos o más de otra(s) molécula(s) unida(s) de manera factible a las mismas, y

-

un segundo constructo que codifica para las cadenas que contienen el dominio ligero de un anticuerpo o para el dominio VL de un anticuerpo y el dominio CL de otro anticuerpo, que comprende secuencias adecuadas reguladoras de la transcripción y la traducción unidas de manera factible a las secuencias que codifican para los dominios VL y CL.

12. Constructos de ADN según la reivindicación 11, en los que la(s) secuencia(s) codificante(s) para una o más de otra(s) molécula(s) en el primer y/o segundo constructo consiste(n) en secuencias de ADN que codifican para los dominios VL y VH de un segundo anticuerpo, secuencias de ADN que están unidas de manera factible entre sí en una de las secuencias 5'-VL2-VH2-3' o 5'-VH2-VL2-3'.

13. Constructos de ADN según la reivindicación 11 ó 12, en los que se incorpora una secuencia de unión entre una o más de las secuencias codificantes para VH, CH1, VL o VH y la secuencia codificante para la otra molécula.

14. Constructos de ADN según la reivindicación 11, en los que se designa un primer constructo como pCA2C11s
FvE6Hf y que puede obtenerse a partir de células DH5\alpha de E. coli, depositadas el 15 de octubre de 1997 en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos y que se le dio el número de registro de depósito LMBP3715 y se designa un segundo constructo como pCAE6HfGSC11sFv (también identificado como pCAE6H2sc2C11H) y que puede obtenerse a partir de células DH5\alpha de E. coli depositadas el 15 de octubre de 1997 en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos y al que se le dio el número de registro de depósito LMBP3716.

15. Constructos de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, para su uso en la producción de derivados de anticuerpo heterodiméricos de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en células huésped de expresión heteróloga.

16. Método de producción de derivados de anticuerpo heterodiméricos de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende la expresión de constructos de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en células huésped de expresión heteróloga.

17. Método según la reivindicación 16, en el que las células huésped se eligen del grupo que consiste en células bacterianas, actinomicetos, levaduras, hongos filamentosos, células de insectos, células de mamíferos, animales o plantas transgénicos.

18. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un anticuerpo multivalente.

19. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un anticuerpo biespecífico.

20. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un anticuerpo triespecífico.

21. Derivado de anticuerpo heterodimérico de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un anticuerpo multiespecífico.

22. Uso de derivados de anticuerpo heterodiméricos de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 18 a 21, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, infecciones, enfermedades autoinmunitarias, trombosis, o para una preparación de diagnóstico.

23. Preparación médica que comprende anticuerpos heterodiméricos de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 18 a 21.

24. Preparación de diagnóstico que comprende anticuerpos heterodiméricos de múltiples fines según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 18 a 21.