CN112424228A - 新型双特异性激动性4-1bb抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4‑1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4‑1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中所述Fab片段(a)和(b)彼此融合；并且提供了生产这些分子的方法和使用所述分子的方法。

Description

新型双特异性激动性4-1BB抗原结合分子
技术领域
本发明涉及一种新型双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中Fab片段(a)和(b)彼此融合。本发明进一步涉及生产这些分子的方法和使用它们的方法。
背景技术
4-1BB(CD137)是TNF受体超家族的成员之一，其最初被鉴定为通过T细胞活化诱导表达的分子(Kwon Y.H.和Weissman S.M.(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1963-1967)。后续研究证明了4-1BB在T淋巴细胞和B淋巴细胞(Snell L.M.等人(2011)Immunol.修订版，244，197-217；或Zhang X.等人(2010)，J.Immunol.184，787-795)、NK细胞(Lin W.等人(2008)，Blood 112，699-707)、NKT细胞(Kim D.H.等人(2008)，J.Immunol.180，2062-2068)、单核细胞(Kienzle G.和von Kempis J.(2000)，Int.Immunol.12，73-82；或SchwarzH.等人(1995)，Blood 85，1043-1052)、中性粒细胞(Heinisch I.V.等人(2000)，Eur.J.Immunol.30，3441-3446)、肥大细胞(Nishimoto H.等人(2005)，Blood 106，4241-4248)和树突细胞以及非造血来源的细胞诸如内皮细胞和平滑肌细胞(Broll K.等人(2001)，Am.J.Clin.Pathol.115，543-549；或Olofsson P.S.等人(2008)，Circulation117，1292-1301)中的表达。4-1BB在不同细胞类型中的表达大多数是可诱导的，并且受各种刺激信号诸如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发以及通过共刺激分子或促炎细胞因子的受体诱导的信号传导的驱动(Diehl L.等人(2002)，J.Immunol.168，3755-3762；von KempisJ.等人(1997)，Osteoarthritis Cartilage 5，394-406；Zhang X.等人(2010)，J.Immunol.184，787-795)。
已知CD137信号传导刺激NK细胞的IFNγ分泌和增殖(Buechele C.等人(2012),Eur.J.Immunol.42，737-748；Lin W.等人(2008)，Blood 112，699-707；Melero I.等人(1998)，Cell Immunol.190，167-172)，并且促进DC活化(其表现为存活率增加以及分泌细胞因子和上调共刺激分子的能力的提高)(Choi B.K.等人(2009),J.Immunol.182，4107-4115；Futagawa T.等人(2002)，Int.Immunol.14，275-286；Wilcox R.A.等人(2002)，J.Immunol.168，4262-4267)。但是，CD137最大的特征在于作为一种共刺激分子，其调节T细胞的CD4+和CD8+亚群中TCR诱导的活化。与TCR触发相结合，激动性4-1BB特异性抗体增强T细胞增殖、刺激淋巴因子分泌并且降低T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(SnellL.M.等人(2011)Immunol.修订版，244，197-217)。与4-1BB抗体在体外对T细胞的这些共刺激作用一致，在许多实验性肿瘤模型中，将它们施用于荷瘤小鼠产生有效的抗肿瘤作用(Melero I.等人.(1997)，Nat.Med.3，682-685；Narazaki H.等人(2010)，Blood 115，1941-1948)。体内耗竭实验表明，CD8+ T细胞在4-1BB特异性抗体的抗肿瘤作用中发挥至关重要的作用。但是，根据肿瘤模型或包括抗4-1BB在内的联合疗法不同，已经报道了其他类型的细胞诸如DC、NK细胞或CD4+ T细胞的贡献(Murillo O.等人(2009)，Eur.J.Immunol.39，2424-2436；Stagg J.等人(2011)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108，7142-7147)。
看来4-1BB激动性抗体在体内的免疫调节特性要求抗体分子上存在野生型Fc部分，由此暗示Fc受体结合是此类试剂的药理活性所需的重要事件，其已被描述为对TNFR超家族的其他细胞凋亡诱导或免疫调节成员具有特异性的激动性抗体(Li F.和RavetchJ.V.(2011)，Science 333，1030-1034；Teng M.W.等人(2009)，J.Immunol.183，1911-1920)。但是，全身施用具有功能活性Fc结构域的4-1BB特异性激动性抗体还在小鼠体内不存在功能性Fc受体的情况下诱导CD8+ T细胞扩增，其与肝毒性减弱或明显改善相关联(Dubrot J.等人(2010)，Cancer Immunol.Immunother.59，1223-1233)。
Urelumab(BMS-666513，克隆10C7)是一种完整的人激动性非配体阻断单克隆IgG4抗体，其与4-1BB细胞外结构域结合。在美国专利号7,288,638中，将其公开为20H4.9-IgG4。在人体临床试验(ClinicalTrials.gov，NCT00309023和NCT00612664)中，每三周给予一次Urelumab治疗并且持续12周，可诱导黑素瘤、卵巢癌或肾细胞癌患者的疾病稳定。但是，由于发生抗体引起的4级肝炎所导致的两例肝毒性相关的死亡，因此这些试验终止(SimeoneE.和Ascierto P.A.(2012)，J.Immunotoxicology 9，241-247)。随后对临床安全性数据进行的详细分析表明，重度转氨酶升高的发生主要是由给定的Urelumab剂量引起。还观察到2+级中性粒细胞减少、白细胞减少和血小板减少症。随后对临床安全性数据进行的详细分析表明，重度转氨酶升高的发生主要是由给定的Urelumab剂量引起。2012年，Urelumab再次进入临床开发阶段，但条件是采用<1mg/kg的剂量并且每三周给药一次。目前的推荐剂量为每三周给予0.1mg/kg(N.Segal等人(2016)，Results From an Integrated Safety Analysisof Urelumab,an Agonist Anti-CD137 Monoclonal Antibody，Clin.Cancer Res.，在线发表于2016年12月1日)。考虑到剂量限制性毒性，需要改善的对4-1BB具有特异性的抗原结合分子，这些抗原结合分子应仅作用于肿瘤特异性部位，以免不可控制的副作用。本发明的双特异性抗原结合分子将能够与肿瘤特异性或肿瘤相关抗原(靶细胞抗原)优先结合的Fab片段与能够与4-1BB激动性结合的两个Fab片段相结合。本发明的双特异性抗原结合分子以其特定的形式可能不仅能够有效地触发4-1BB，而且能够在所需位点以非常高的选择性触发4-1BB，从而减少在常规的单特异性抗体诸如Urelumab中观察到的不良副作用。
发明内容
本发明涉及一种新型双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中Fab片段(a)和(b)彼此融合；并且提供了生产这些分子的方法和使用它们的方法。这些双特异性抗原结合分子是有利的，因为它们以其对靶细胞抗原的结合能力而优选地在表达靶细胞抗原的位点活化4-1BB，并且减少在体内其他位点的活化，从而避免仅对4-1BB具有特异性的抗体的副作用。它们的特征还在于其特异性结构特征，诸如能够特异性结合到4-1BB和靶细胞抗原的两个Fab片段的邻近性，分别与4-1BB的二价结合和与靶细胞抗原的单价结合使这些双特异性抗原结合分子非常有效。
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；
(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；
(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及
(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成；其中第二Fab片段(b)在Fab重链的C末端融合至第一Fab片段(a)的Fab重链的N末端，其继而在其C末端融合至第一Fc结构域亚基的N末端，并且第三Fab片段(c)在Fab重链的C末端融合至第二Fc结构域亚基的N末端，并且其中在能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，(i)Fab轻链和Fab重链的可变区VL和VH彼此替换，或(ii)Fab轻链和Fab重链的恒定区CL和CH1彼此替换。
在一个特定方面，提供了一种如本文所述的双特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子提供与4-1BB的二价结合和与靶细胞抗原的单价结合。
在进一步方面，提供了一种如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域为IgG Fc结构域，具体地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。在一个方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生凸起，其可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中；并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，该第一亚基的CH3结构域内的凸起可定位在该空腔内。因此，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中根据突起进入孔方法，Fc结构域的第一亚基包含突起并且Fc结构域的第二亚基包含孔。在一个特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU索引编号)，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在另一方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低与Fc受体的结合和/或效应子功能。在一个方面，所述一个或多个氨基酸取代位于选自由L234、L235和P329(Kabat EU索引编号)组成的组的一个或多个位置处。在一个方面，Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，具体地为氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。具体地，Fc受体为Fcγ受体并且/或者效应子功能为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在一个方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到4-1BB(a)和(c)的第一Fab片段和第三Fab片段相同。在一个特定方面，本发明提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段，其各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。更具体地，能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中第二Fab片段(b)在Fab重链的C末端融合至第一Fab片段(a)的Fab重链的N末端，其继而在其C末端融合至第一Fc结构域亚基的N末端，并且第三Fab片段(c)在Fab重链的C末端融合至第二Fc结构域亚基的N末端，其中在能够特异性结合到靶细胞抗原的第三Fab片段中，(i)可变结构域VL和VH彼此替换，或(ii)恒定结构域CL和CH1彼此替换，并且其中在能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat EU索引编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)或赖氨酸(K)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且其中在能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中在能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，Fab轻链和Fab重链的可变区VL和VH彼此替换。
在进一步方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中第二Fab片段能够特异性结合到选自由以下项组成的组中的靶细胞抗原：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD33和PD-L1。在一个方面，靶细胞抗原选自由以下项组成的组：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20和CD33。在一个特定方面，靶细胞抗原选自成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)和CD19。更具体地，靶细胞抗原选自FAP和CEA。在另一方面，靶细胞抗原为PD-L1。
在一个方面，能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段为能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段。因此，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中第二Fab片段能够特异性结合到FAP并且包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的tklosterdhe氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在进一步方面，能够特异性结合到FAP的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ IDNO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ IDNO:24的氨基酸序列的至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
具体地，能够特异性结合到FAP的Fab片段包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQID NO:21的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或者重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。更具体地，能够特异性结合到FAP的Fab片段包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列。
此外，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或者重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段为能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段。
因此，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的第二Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或者
(e)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQID NO:120的氨基酸序列；或者
(f)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:129或SEQID NO:130或SEQ ID NO:131的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列。
在一个方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中第二Fab片段能够特异性结合到CEA并且包含：
(a)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在另一方面，能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ IDNO:32的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ IDNO:40的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ IDNO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列的至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQID NO:56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ IDNO:56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(e)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQID NO:122的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(f)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:133的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQID NO:143的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(g)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:137的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQID NO:143的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
更具体地，能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或者重链可变区(VHCEA)，其包含SEQID NO:47的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。此外，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列。
在一个方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中第二Fab片段能够特异性结合到CEA并且包含：重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
具体地，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含SEQID NO:133的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列；或者重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列；或者重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列；或者重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列；或者重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列；或者重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列；或者重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列。
此外，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到CEA的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列；以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或者重链可变区VH，其VH包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
另外，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且(ii)能够特异性结合到CEA的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列。
在进一步方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到CEA的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:133的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列；或者重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列；或者重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列；或者重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列；或者重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列；或者重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQID NO:142的氨基酸序列；或者重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且(ii)能够特异性结合到CEA的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。更具体地，能够特异性结合到CEA的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ IDNO:122的氨基酸序列。
在另一个特定方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且(ii)能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在另一个特定方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且(ii)能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段为能够特异性结合到CD19的Fab片段。
具体地，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到CD19的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCD19)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCD19)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列。
具体地，能够特异性结合到CD19的Fab片段包含：重链可变区(VHCD19)，其包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCD19)，其包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。更具体地，能够特异性结合到CD19的Fab片段包含：重链可变区(VHCD19)，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCD19)，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到CD19的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:63的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
再一方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段为能够特异性结合到PD-L1的Fab片段。
具体地，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到PD-L1的Fab片段包含：(a)重链可变区(VHPD-L1)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ IDNO:147的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列。
具体地，能够特异性结合到PD-L1的Fab片段包含：重链可变区(VHPD-L1)，其包含与SEQ ID NO:152的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含与SEQ ID NO:153的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。更具体地，能够特异性结合到PD-L1的Fab片段包含：重链可变区(VHPD-L1)，其包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到PD-L1的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:152的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面，提供了一种如上文所述的编码双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸。本发明进一步提供了一种载体，特别是表达载体，其包含本发明的分离的多核苷酸；并且提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸或载体。在一些方面，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。
在另一方面，提供了一种生产如上文所述的双特异性抗原结合分子的方法，其包括以下步骤：(i)在适于表达抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞，以及(ii)回收该抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法生产的双特异性抗原结合分子。
本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含如上文所述的双特异性抗原结合分子以及至少一种药学上可接受的赋形剂。在一个方面，药物组合物用于治疗癌症。
另外，本发明涵盖如上文所述的双特异性抗原结合分子或包含其的药物组合物，用作药物。
在一个方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物，用于
(i)刺激T细胞应答，
(ii)支持活化T细胞的存活，
(iii)治疗癌症，
(iv)延迟癌症进展，或
(v)延长癌症患者的存活期。
在一个方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物，用于治疗癌症。在另一方面，本发明提供了如上文所述的用于治疗癌症的双特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子与化学治疗剂、放疗和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用。
在进一步方面，本发明提供了一种抑制个体中肿瘤细胞生长的方法，其包括向个体施用有效量的如上文所述的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物，以抑制肿瘤细胞的生长。
另外，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子在制备用于治疗有此需要的个体的疾病的药物中的用途，特别是在制造用于治疗癌症或感染性疾病的药物中的用途，以及一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的包含本发明的双特异性抗原结合分子的组合物，该组合物呈药学上可接受的形式。在一个具体方面，疾病为癌症。在上述方面中的任何方面，个体为哺乳动物，特别是人。
附图说明
图1A示出本发明的双特异性抗原结合分子的一个实例。双特异性抗原结合分子为huIgG1 P329GLALA形式，其包含两个抗4-1BB Fab片段(二价结合到4-1BB)和一个抗FAP交叉Fab片段(Fab片段，其中VH和VL区域被交换)，该抗FAP交叉Fab片段在其重链的C末端与4-1BB Fab片段之一的重链的N末端融合。这种形式在本文中称为头对头(H2H)2+1形式。大黑点表示突起进入孔突变，而CH1/CL结构域中的小黑点表示氨基酸突变，其改善重链与抗4-1BB轻链的正确配对。
图1B示出huIgG1 P329GLALA形式的另一种双特异性抗原结合分子，其包含两个抗4-1BB Fab片段(二价结合到4-1BB)以及能够特异性结合到FAP的VH和VL结构域，该FAP分别在重链的C末端融合。这种形式在本文中称为2+1 VH/VL形式，并且在本文中用作对照分子。图1C示出huIgG1 P329GLALA形式的双特异性抗原结合分子，其包含两个抗4-1BB Fab片段(二价结合到4-1BB)以及种系对照DP47(非靶向对照)的VH和VL结构域。图1D示出huIgG1P329GLALA形式的标准抗体，其包含两个抗4-1BB Fab片段(二价结合到4-1BB)。
图1E示出本发明的双特异性抗原结合分子的另一个实例。双特异性抗原结合分子为huIgG1 P329GLALA形式，其包含两个抗4-1BB Fab片段(二价结合到4-1BB)和一个抗人PD-L1(称为抗PD-L1)交叉Fab片段(Fab片段，其中VH和VL区域被交换)，其在其重链的C末端与4-1BB Fab片段之一的重链的N末端融合。这种形式在本文中称为头对头(H2H)2+1形式。大黑点表示突起进入孔突变，而CH1/CL结构域中的小黑点表示氨基酸突变，其改善重链与抗4-1BB轻链的正确配对。图1F示出huIgG1 P329GLALA形式的双特异性抗原结合分子，其包含一个抗4-1BB Fab片段(单价结合到4-1BB)和一个抗人PD-L1(称为抗PD-L1)交叉Fab片段(Fab片段，其中VH和VL区域被交换)。这种形式在本文中称为1+1形式。大黑点表示突起进入孔突变，而CH1/CL结构域中的小黑点表示氨基酸突变，其改善重链与抗4-1BB轻链的正确配对。
图2A和2B涉及双特异性2+1 H2H抗4-1BB x抗FAP huIgG1 P329GLALA抗原结合分子与4-1BB和FAP的同时结合。图2A为测定设置的象形图。图2B示出双特异性H2H抗4-1BB x抗FAP抗原结合分子(分析物1)与固定化的人4-1BB和人FAP(分析物2)的同时结合。
图3示出用于评估2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)抗原结合分子的二价结合的基于FRET的竞争测定。通过加入无标记的2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)huIgG1 PGLALA构建体(针对4-1BB的Fab之一无游离N末端，实心正方形)或加入无标记的2+1 VH/VL(C末端)4-1BB(20H4.9)x FAP(4B9)双特异性构建体(针对4-1BB的两个“游离Fab”，空心正方形)，在转染Hek细胞上表达的Tb标记的hu4-1BB-SNAP与d2标记的4-1BB(克隆20H4.9)IgG之间的相互作用竞争。竞争导致TR-FRET信号下降。
图4示出与表达人FAP的NIH/3T3-huFAP克隆19细胞的结合。将2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)抗原结合分子(黑色实心圆形和线条)或其对照分子的浓度相对于PE缀合的二级检测抗体的荧光强度(gMFI)的几何平均值作图。通过扣除空白对照(例如，无一级检测抗体，仅包含二级检测抗体)的基线值，对所有值进行基线校正。仅包含FAP抗原结合结构域的构建体(如抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)2+1 H2H huIgG1 P329GLALA(黑色实心圆形和线条)和抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)2+1 VH/VL huIgG1 P329GLALA(灰色实心正方形和线条))与表达FAP的细胞高效结合。可以看出，抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)2+1H2H huIgG1 P329GLALA的N末端融合的抗FAP交叉Fab片段(黑色实心圆形和线条)相比于抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)VH/VL 2+1huIgG1 P329GLALA的C末端融合的VH/VL抗FAP抗原结合结构域(灰色实心正方形和线条)表现出更高的gMFI和更低的EC50。
图5示出与表达人4-1BB(CD137)的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2的结合。将2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)抗原结合分子(黑色实心圆形和线条)或其对照的浓度相对于PE缀合的二级检测抗体的荧光强度(gMFI)的几何平均值作图。通过扣除空白对照(例如，无一级检测抗体，仅包含二级检测抗体)的基线值，对所有值进行基线校正。抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)2+1 H2H huIgG1 P329GLALA(黑色实心圆形和线条)与4-1BB的结合类似于其对照抗4-1BB(20H4.9)huIgG1 P329GLALA(灰色星形和线条)。
图6A至6C示出在表达4-1BB的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NFκB介导的荧光素酶表达活性。为测试2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)抗原结合分子(黑色实心圆形和线条)相比于2+1VH/VL抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)抗原结合分子(灰色实心正方形和线条)和对照的功能性，用报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2在不存在或存在表达人FAP的细胞系按1:5的比率的情况下，将分子孵育5h。将2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)抗原结合分子或其对照的浓度相对于在孵育和加入荧光素酶检测溶液后5h测得的发出的光的单位(RLU)作图。通过扣除空白对照(例如，未添加抗体)的基线值，对所有值进行基线校正。图6A示出与FAP靶点无关的4-1BB活化，由此4-1BB结合诱导由NFκB控制的荧光素酶在不存在任何FAP介导的交联的报告细胞系中的表达。在图6B中，加入表达FAP的人黑素瘤细胞系WM-266-4人黑素瘤细胞系(中间FAP表面表达)。表达FAP的WM-266-4细胞导致双特异性4-1BB(20H4.9)x FAP(4B9)抗原结合分子的交联。双特异性FAP靶向2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)抗原结合分子(黑色实心圆形和线条)表现出更出色的活化(更低的EC50值)，这可能反映出对FAP的亲和力更高。从图6C中可以更好地看出这一结果，该图中显示了在存在高FAP表达细胞系NIH/3T3-huFAP克隆19(人FAP转基因小鼠成纤维细胞系)的情况下NFκB诱导的荧光素酶活化。
图7示出与亲代鼠A5B7抗体的结合相比，人源化A5B7 huIgG1 P329G LALA变体与MKN-45的结合。用荧光标记的二抗检测抗体，并且通过流式细胞术测量荧光。
图8A和8B示出人源化MFE23抗体变体的VH氨基酸序列(图8A)和VL氨基酸序列(图8B)的比对图。
图9A、9B和9C示出与亲代鼠MFE23抗体的结合相比，人源化MFE23 huIgG1 P329GLALA变体与MKN-45的结合。用荧光标记的二抗检测抗体，并且通过流式细胞术测量荧光。三幅图分别显示了与亲代MFE23克隆的低结合、中等结合和类似的结合。
图10A至10D涉及CEA靶向的三聚体***的4-1BBL分子与hu4-1BB和huN(A2-B2)A或hu(NA1)BA的同时结合。图10A示出测定设置。图10B示出2+1 H2H抗人4-1BB(20H4.9)x CEA(A5B7)huIgG1P329GLALA(分析物1)与固定化的人N(A2-B2)A和人4-1BB(分析物2)的同时结合。图10C示出2+1 H2H 4-1BB(20H4.9)x CEA(A5H1EL1D)huIgG1 P329GLALA(分析物1)与固定化的人N(A2-B2)A和人4-1BB(分析物2)的同时结合。图10D示出2+1 H2H 4-1BB(20H4.9)xCEA(MFE23)huIgG1 P329GLALA(分析物1)与固定化的人(NA1)BA和人4-1BB(分析物2)的同时结合。显示了重复测定结果。
用于结合测定的表达CEACAM5的不同克隆的细胞表面CEACAM5表达水平如图11所示。用食蟹猴CEACAM5(CHO-k1-cynoCEACAM5克隆8)或人CEACAM5(CHO-k1-huCEACAM5克隆11、克隆12和克隆13)转染中国仓鼠卵巢细胞系CHO-k1(ATCC CRL-9618)。利用流式细胞术，通过滴定的APC标记的抗CD66特异性检测抗体(克隆CD66AB.1.1)测定表达水平。显示了荧光强度中位数相对于检测抗体的浓度，由此荧光强度的中位数与结合的检测抗体的含量正相关，因此与细胞表面CEACAM5分子的表达水平正相关。CHO-k1-cynoCEACAM5克隆8和CHO-k1-huCEACAM5克隆11表现出类似的细胞表面CEACAM5表达，而CHO-k1-huCEACAM5克隆12和13表现出高细胞表面CEACAM5表达水平。
图12A至12D示出与表达食蟹猴CEACAM5或人CEACAM5的CHO-k1细胞的结合。将2+1H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗CEA(4B9)抗原结合分子或对照分子的浓度相对于PE缀合的二级检测抗体的荧光强度中位数作图。通过扣除空白对照(例如，无一级检测抗体，仅包含二级检测抗体)的基线值，对所有值进行基线校正。仅包含CEACAM5抗原结合结构域的构建体，例如抗4-1BB(20H4.9)x CEA(MFE23)huIgG1 P329GLALA2+1 H2H(黑色实心圆形，虚线)，抗4-1BB(20H4.9)x CEA(A5B7)huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H(黑色实心菱形，黑色线条)和4-1BB(20H4.9)x(A5H1EL1D)huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H(灰色向下三角形，灰色线条)，高效结合到表达人CEACAM5的细胞(图12B、12C和12D)。相比之下，仅检测到4-1BB(20H4.9)x CEA(A5B7)huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H(黑色实心菱形，黑色线条)与食蟹猴CEACAM5的结合，4-1BB(20H4.9)x(A5H1EL1D)huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H(灰色向下三角形，灰色线条)仅表现出与食蟹猴CEACAM5非常弱的结合，并且4-1BB(20H4.9)x CEA(MFE23)huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H(黑色实心圆形，虚线)显示无结合，因为MFE23无人/食蟹猴交叉反应性(图12A)。
图13A至13D示出在表达4-1BB的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NFκB介导的荧光素酶表达活性。为测试2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗CEA抗原结合分子相比于对照的功能性，用报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2在不存在或存在表达食蟹猴或人CEACAM5的CHO-k1细胞系按1:5的比率的情况下，将分子孵育5h。将2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗CEA抗原结合分子或其对照的浓度相对于在孵育和加入荧光素酶检测溶液后5h测得的发出的光的单位(RLU)作图。通过扣除空白对照(例如，未添加抗体)的基线值，对所有值进行基线校正。与表达CEACAM5的CHO-k1细胞的结合测定相关的所有包含CEACAM5抗原结合结构域的构建体，例如抗4-1BB(20H4.9)x CEA(MFE23)huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H(黑色实心圆形，虚线)、抗4-1BB(20H4.9)x CEA(A5B7)huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H(黑色实心菱形，黑色线条)和抗4-1BB(20H4.9)x(A5H1EL1D)huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H(灰色向下三角形，灰色线条)，在存在人CEACAM5表达CHO-k1细胞系的情况下诱导Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系的活化增强(图13C和图13D)。而在存在食蟹猴CEACAM5的情况下，仅抗4-1BB(20H4.9)x CEA(A5B7)huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H(黑色实心菱形，黑色线条)和抗4-1BB(20H4.9)x(A5H1EL1D)huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H(灰色向下三角形，灰色线条)诱导Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系活化，但抗4-1BB(20H4.9)x CEA(MFE23)huIgG1P329GLALA 2+1 H2H(黑色实心圆形，虚线)无此诱导作用，因为MFE23无人/食蟹猴交叉反应性(图13B)。在不存在表达CEACAM5的细胞的情况下，未发生4-1BB(20H4.9)x CEA2+1 H2H的交联，并且未活化Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系。
图14A示出用于评估PD-L1靶向4-1BB激动剂构建体与hu4-1BB和huPD-L1-Fc的同时结合的设置。图14B示出2+1 H2H 4-1BB(20H4.9)/PD-L1人IgG1 PGLALA与huPD-L1-Fc和hu4-1BB-Fc(kih)的同时结合。图14C示出1+1 H2H 4-1BB(20H4.9)/PD-L1人IgG1 PGLALA与huPD-L1-Fc和hu4-1BB-Fc(kih)的同时结合。显示了三次重复测定结果。
图15A和15B示出与MKN45和PD-L1转染的MKN45(MKN45-huPD-L1)细胞的结合。将2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗人PD-L1抗原结合分子、1+1抗4-1BB(20H4.9)x抗人PD-L1抗原结合分子或对照分子相对于PE缀合的二级检测抗体的荧光强度的几何平均值作图。通过扣除空白对照(例如，无一级检测抗体，仅包含二级检测抗体)的基线值，对所有值进行基线校正。仅包含PD-L1抗原结合结构域的构建体，例如4-1BB(20H4.9)x PD-L1 huIgG1P329GLALA 2+1 H2H(黑色三角形和黑色线条)和抗4-1BB(20H4.9)x PD-L1 huIgG1P329GLALA 1+1(灰色向下三角形和线条)，高效结合到表达人PD-L1的MKN45-huPD-L1细胞(图15B)，而不与亲代细胞系MKN45结合(图15A)。
图16A和16B示出在表达4-1BB的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NFκB介导的荧光素酶表达活性。为测试2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x PD-L1和1+1抗4-1BB(20H4.9)x PD-L1抗原结合分子相比于对照的功能性，用报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2在不存在或存在表达人PD-L1的MKN45细胞系按1:5的比率的情况下，将分子孵育5h。将2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x PD-L1和1+1anti4-1BB(20H4.9)x PD-L1抗原结合分子或其对照的浓度相对于在孵育和加入荧光素酶检测溶液后5h测得的发出的光的单位(RLU)作图。通过扣除空白对照(例如，未添加抗体)的基线值，对所有值进行基线校正。如1+1anti4-1BB(20H4.9)x PD-L1 huIgG1 P329GLALA所示，与4-1BB的单价结合导致EC50值略有下降。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的示例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
如本文所用，术语“能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域”或“能够特异性结合到靶细胞抗原的部分”是指特异性结合到抗原决定簇的多肽分子。在一个方面，抗原结合结构域能够通过其靶细胞抗原活化信号传导。在一个特定方面，抗原结合结构域能够将与其附接的实体(例如4-1BB激动剂)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的抗体及其片段。另外，能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的支架抗原结合蛋白，例如基于设计的重复序列蛋白或设计的重复序列结构域的结合结构域(参见例如WO 2002/020565)。
关于抗体或其片段，术语“能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域”是指分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并且与之互补的区域。可通过例如一种或多种抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供能够特异性抗原结合的抗原结合结构域。具体地，能够特异性抗原结合的抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
在一个特定方面，“能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域”为Fab片段或交叉Fab片段。
本文的术语“抗体”以最广义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合到至少两种独特的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。
本申请中所用的术语“价态”表示在对一种独特抗原决定簇具有特异性的抗原结合分子中存在特定数量的对一种独特抗原决定簇具有特异性的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在对特定抗原决定簇具有特异性的两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在本发明的特定方面，根据本发明的双特异性抗原结合分子对特定抗原决定簇可以是单价的，意味着它们对所述抗原决定簇仅具有一个结合位点，或者对特定抗原决定簇可以是二价或四价的，意味着它们对所述抗原决定簇分别具有两个结合位点或四个结合位点。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用地指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，后接三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，后接轻链恒定结构域(CL)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以分配为五种类型中的一种，所述五种类型被称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体、三体抗体、四体抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun在The harmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)中所述；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和No.5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”或“Fab分子”是指这样的抗体片段，其包含含有VL结构域和轻链恒定结构域(CL)的轻链片段，以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。根据本发明，术语“Fab片段”还包括如下文所定义的“交叉Fab片段”或“交换型Fab片段”。
术语“交叉Fab片段”或“交叉Fab分子”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交叉Fab分子的两种不同链的组合物是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：在一个方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即交换型Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(VLVH)。在另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换型Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N-末端至C-末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是至少30个氨基酸，优选是32个至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab分子可以通过经由***半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
“交换型单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，并且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。此外，这些x-scFab分子可以通过经由***半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，通过10至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)中。另外，抗体片段包含单链多肽，所述单链多肽的特征在于具有VH结构域，即能够与VL结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
“支架抗原结合蛋白”是本领域已知的，例如纤连蛋白和设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)已被用作抗原结合结构域的替代支架，参见例如Gebauer和Skerra，Engineeredprotein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin ChemBiol 13:245-255(2009)和Stumpp等人，Darpins:A new generation of proteintherapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面中，支架抗原结合蛋白选自由以下项组成的组：CTLA-4(Evibody)、脂质运载蛋白(Anticalin)、蛋白A衍生的分子(诸如蛋白A的Z结构域(亲和体))、A结构域(Avimer/巨型抗体)、血清转铁蛋白(反式体)；设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)、抗体轻链或重链的可变结构域(单结构域抗体，sdAb)、抗体重链的可变结构域(纳米抗体，aVH)、VNAR片段、纤连蛋白(AdNectin)、C型凝集素结构域(四连接素)；新抗原受体β-内酰胺酶的可变结构域(VNAR片段)、人γ-晶体蛋白或泛素蛋白(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、微型体(诸如来自knottin家族的蛋白质)、肽适体和纤连蛋白(adnectin)。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+ T细胞上表达的CD28家族受体。其细胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。对应于抗体CDR的环可以用异源序列取代，以赋予不同的结合性质。经工程化改造以具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称为Evibody(例如US7166697B1)。Evibody与抗体(例如结构域抗体)的分离的可变区大小大致相同。关于进一步的细节，参见Journal ofImmunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白是细胞外蛋白质家族，其运输小的疏水性分子，诸如类固醇、胆素、类维生素A和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端处具有许多环，可以工程化改造成与不同的靶抗原结合。Anticalin的大小介于160-180个氨基酸之间，并且来源于脂质运载蛋白。关于进一步的细节，参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。亲和体是来源于金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架，其可以被工程化改造以结合抗原。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化形成了文库。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.2004,17,455-462和EP1641818A1。Avimer是来源于A结构域支架家族的多结构域蛋白质。约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键键合结构。多样性是通过重组A结构域家族表现出的自然变异而形成的。关于进一步的细节，参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6),909-917(2007年6月)。转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中***肽序列来工程化改造转铁蛋白，以结合不同的靶抗原。工程化改造的转铁蛋白支架的示例包括反式体。关于进一步的细节，参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)来源于锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞支架的附接的蛋白质家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33残基基序。它们可通过随机化每个重复序列中的第一α-螺旋和β-转角中的残基，而工程化改造成结合不同的靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数量来增加(亲和力成熟方法)。关于进一步的细节，参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003)、PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。单结构域抗体是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。第一单结构域来源于骆驼科动物的抗体重链的可变结构域(纳米抗体或VHH片段)。此外，术语单结构域抗体包含自体人重链可变结构域(aVH)或来源于鲨鱼的VNAR片段。纤连蛋白可以经工程化改造以结合抗原的支架。Adnectin由III型人纤连蛋白(FN3)的15个重复单元的第10结构域的天然氨基酸序列的主链组成。β-夹层的一个端部处的三个环可以经工程化改造，以使Adnectin能够特异性识别感兴趣的治疗靶标。关于进一步细节，参见ProteinEng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。肽适体是组合的识别分子，该组合的识别分子由恒定的支架蛋白，通常是硫氧还蛋白(TrxA)组成，所述恒定的支架蛋白含有在活性位点处***的受约束的可变肽环。关于进一步细节，参见Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。微型体来源于含有3-4个半胱氨酸桥、长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，所述微蛋白的示例包括KalataBI和芋螺毒素以及knottin。微蛋白具有环，其可以经工程化改造为包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠。关于工程化改造的knottin结构域的进一步细节，参见WO2008098796。
作为参考分子的“结合相同表位的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中所述抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合被阻断50％或更多。
术语“抗原结合结构域”或“抗原结合位点”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原很大的情况下，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，其称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个具体实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，例如如通过SPR所测得的，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于所述抗原结合分子与抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用的“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示，解离常数(Kd)是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。
如本文所用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。在某些实施例中，靶细胞抗原为肿瘤特异性或肿瘤相关抗原(TAA)。在一个实施例中，TAA为肿瘤细胞表面的抗原。在一个实施例中，TAA在肿瘤基质的细胞上。在另一方面，靶细胞抗原为T细胞或B细胞上与抗原。在一个实施例中，靶细胞抗原选自由以下项组成的组：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、CD19、CD20、CD33和PD-L1。在一个特定方面，靶细胞抗原为成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)或CD19。更具体地，靶细胞抗原为成纤维细胞活化蛋白(FAP)或CEA。在另一方面，靶细胞抗原为PD-L1。
术语“成纤维细胞活化蛋白(FAP)”也称为脯氨酰内肽酶FAP或Seprase(EC3.4.21)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工FAP，以及通过细胞中加工产生的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个实施例中，本发明的抗原结合分子能够特异性结合到人、小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(149版，SEQ ID NO:86)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中。人FAP的细胞外结构域(ECD)从26位的氨基酸延伸至760位的氨基酸。His标记的人FAP ECD的氨基酸序列示出于SEQ ID NO 87中。小鼠FAP的氨基酸序列示出于UniProt登录号P97321(126版，SEQ ID NO:88)或NCBI RefSeqNP_032012.1中。小鼠FAP的细胞外结构域(ECD)从26位的氨基酸延伸至761位的氨基酸。SEQID NO:89示出His标记的小鼠FAP ECD的氨基酸序列。SEQ ID NO:90示出His标记的食蟹猴FAP ECD的氨基酸序列。优选地，本发明的抗FAP结合分子结合到FAP的细胞外结构域。
术语“癌胚抗原(CEA)”也称为癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CEA，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人CEA的氨基酸序列示出于UniProt登录号P06731(151版，SEQ ID NO:91)中。长期以来，CEA被鉴定为一种肿瘤相关的抗原(Gold和Freedman，J Exp Med.，121:439-462，1965；Berinstein N.L.，J Clin Oncol.，20:2197-2207，2002)。CEA最初被归类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现已在多种正常成人组织中鉴定出来。这些组织主要来源于上皮，包括胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的细胞以及结肠、子宫颈、汗腺和***的细胞(Nap等人，Tumour Biol.，9(2-3):145-53，1988；Nap等人，Cancer Res.，52(8):2329-23339，1992)。上皮来源的肿瘤及其转移均包含CEA作为肿瘤相关抗原。CEA本身的存在并不表示已转化为癌细胞，但CEA的分布具有指示性。在正常组织中，CEA通常在细胞顶面上表达(
Figure BDA0002868662390000341
S.,Semin Cancer Biol.9(2):67-81(1999))，使其无法被血流中的抗体吸收。与正常组织相比，CEA倾向于在癌细胞的整个表面表达(
Figure BDA0002868662390000342
S.,SeminCancer Biol.9(2):67-81(1999))。表达模式的这一变化使CEA易于与癌细胞中的抗体结合。此外，CEA在癌细胞中的表达增加。此外，CEA表达的增加促进细胞间粘附的增加，其可能导致转移(Marshall J.,Semin Oncol.,30(a Suppl.8):30-6,2003)。CEA在各种肿瘤实体中的表达普遍非常高。根据已发表的数据，自己在组织样本中实施的分析证实了CEA的高发性，其中在大肠癌(CRC)中的发生率为约95％，在胰腺癌中的发生率为90％，在胃癌中的发生率为80％，在非小细胞肺癌(NSCLC，与HER3共表达)中的发生率为60％，在乳腺癌中的发生率为40％；并且发现在小细胞肺癌和胶质母细胞瘤中的表达水平低。
CEA易于从细胞表面裂解，并且直接或通过***从肿瘤中流入血流中。由于这种特性，血清CEA水平已被用作诊断癌症和筛查癌症(尤其是结直肠癌)复发的临床指标(Goldenberg D M.，The International Journal of Biological Markers，7:183-188，1992；Chau I.等人，J Clin Oncol.，22:1420-1429，2004；Flamini等人，Clin Cancer Res；12(23):6985-6988，2006)。
术语“黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)”也称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然MCSP，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人MCSP的氨基酸序列示出于UniProt登录号Q6UVK1(103版，SEQ IDNO:92)中。术语“表皮生长因子受体(EGFR)”也称为原癌基因c-ErbB-1或受体酪氨酸蛋白激酶erbB-1，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然EGFR，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人EGFR的氨基酸序列示出于UniProt登录号P00533(211版，SEQ IDNO:93)中。术语“CD19”是指B淋巴细胞抗原CD19，也称为B淋巴细胞表面抗原B4或T细胞表面抗原Leu-12，并且除非另有说明，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD19，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人CD19的氨基酸序列示出于UniProt登录号P15391(160版，SEQ ID NO:94)中。“CD20”指B淋巴细胞抗原CD20，也称为跨膜4结构域亚家族A成员1(MS4A1)、B淋巴细胞表面抗原B1或白细胞表面抗原Leu-16，并且除非另有说明，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD20，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人CD20的氨基酸序列示出于UniProt登录号P11836(149版，SEQ ID NO:95)中。“CD33”是指髓样细胞表面抗原CD33，也称为SIGLEC3或gp67，并且除非另有说明，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD33，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人CD33的氨基酸序列示出于UniProt登录号P20138(157版，SEQ ID NO:96)中。
术语“PD-L1”也称为CD274或B7-H1，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然PD-L1，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，特别是指“人PD-L1”。完整人PD-L1的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q9NZQ7(SEQ ID NO:106)中。术语“抗PD-L1抗体”或“与人PD-L1结合的抗体”或“与人PD-L1特异性结合的抗体”或“拮抗性抗PD-L1”是指与人PD-L1抗原特异性结合的抗体，其结合亲和力KD值为1.0×10-8mol/L或更低，并且在一个方面，KD值为1.0×10-9mol/L或更低。使用标准结合测定(诸如表面等离子体共振技术(
Figure BDA0002868662390000351
GE-Healthcare Uppsala，瑞典))来确定结合亲和力。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。
通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名***来确定CDR名称。Kabat等人定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号***。本领域普通技术人员可以明确地将该“Kabat编号”***分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”或“Kabat EU索引”是指是指由Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)提出的编号***。除非另有说明，否则提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat EU索引编号***。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历进行过人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是这样的抗体，相对于原始抗体，所述抗体中的恒定区已经经过了另外修饰或改变，以产生根据本发明的性质，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的性质。
“人”抗体是这样的抗体，其具有的氨基酸序列与由人或人细胞产生的或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本文中的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链C-末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2结构域和IgGCH3结构域。人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从大致231位的氨基酸残基延伸至大致340位的氨基酸残基。在一个实施例中，碳水化合物链附接至CH2结构域。本文的CH2结构域可以是天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C末端的一段残基(即，从IgG的约341位的氨基酸残基到约447位的氨基酸残基)。本文的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如在一条链中具有引入的“凸起”(“突起”)而在另一条链中具有相应的引入的“空腔”(“孔”)的CH3结构域；参见以引用方式明确并入本文的美国专利号5,821,333)。此类变体CH3结构域可用于促进如本文所述的两条不相同的抗体重链的异源二聚化。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的C末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的切割变体。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(K447)或C末端甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含Fc区的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，该重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，EU编号***也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
“突起进入孔(knob-into-hole)”技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“突起”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“孔”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在一个具体实施例中，突起修饰包含Fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代T366W，而孔修饰包含Fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另一个具体实施例中，包含突起修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代S354C，而包含孔修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”旨在包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)的能力的修改的变体。例如，可以使一个或多个氨基酸从免疫球蛋白的Fc区的N末端或C末端缺失，而基本上不丧失生物学功能。可以根据本领域中已知的一般规则来选择此类变体，以便对活性具有最小的影响(参见例如Bowie,J.U.等人，Science 247:1306-10(1990))。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的示例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
Fc受体结合依赖性效应子功能可通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR)的相互作用来介导，Fc受体是造血细胞上的特异性细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已被证明可通过吞噬免疫复合物来介导去除抗体包被的病原体，并且通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来裂解涂有相应抗体的红细胞及其他各种细胞靶点(例如，肿瘤细胞)(参见例如Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.，J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcRs由其对免疫球蛋白同种型的特异性来限定：IgG抗体的Fc受体称为FcγR。Fc受体结合描述于例如：Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.，Annu.修订版，Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等人，Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等人，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；以及Gessner,J.E.等人，Ann.Hematol.76(1998)231-248。
IgG抗体(FcγR)Fc区受体的交联触发多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞细胞毒性、炎症介质的释放以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。已在人体中鉴定出三类FcγR，其中包括：
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG，并且在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。Fc区IgG中在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329(根据Kabat的EU索引编号)的修饰，降低与FcγRI的结合。在233-236位的IgG2残基被IgG1和IgG4取代，使得与FcγRI的结合力降低103倍，并且消除了人单核细胞对抗体敏化红细胞的应答(Armour,K.L.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。
-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力结合复合IgG，并得到广泛表达。该受体可分为两种亚型，即FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA存在于许多参与杀伤的细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)中，并且似乎能够活化杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用，并且存在于B细胞、巨噬细胞以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞中。在B细胞上，它似乎起到抑制免疫球蛋白进一步产生以及同种型转换为例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB用于抑制由FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B型可能通过IgE与其单独受体的结合而有助于抑制这些细胞的活化。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIA的结合力降低。
-FcγRIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG，并且包括两种类型。FcγRIIIA存在于NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和T细胞上，并且介导ADCC。FcγRIIIB在中性粒细胞上的表达水平高。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIIA的结合力降低。
Shields,R.L.等人(J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)描述了人IgG1上与Fc受体的结合位点的定位、上述突变位点以及测量与FcγRI和FcγRIIA结合的方法。
术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞毒性”是由Fc受体结合介导的功能，并且是指在效应子细胞存在下本文所报道的抗体对靶细胞的裂解。通过测量抗体与表达Fcγ受体的细胞(诸如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA或NK细胞(在本质上表达FcγRIIIA)的细胞)的结合来研究抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力。具体地，测量与NK细胞上与FcγR的结合。
“活化Fc受体”是这样的Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。活化Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。特定的活化Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
“肿瘤坏死因子受体超家族”或“TNF受体超家族”目前由27种受体组成。它是一组细胞因子受体，其特征在于能够通过细胞外富含半胱氨酸的结构域(CRD)结合肿瘤坏死因子(TNF)。这些伪重复由受体链内高度保守的半胱氨酸残基形成的链内二硫键限定。除神经生长因子(NGF)外，所有TNF与原型TNF-α同源。大多数TNF受体以其活性形式在血浆膜中形成三聚体复合物。因此，大多数TNF受体含有跨膜结构域(TMD)。这些受体中的多种受体还包含细胞内死亡结构域(DD)，这些结构域在配体结合后召集与胱天蛋白酶相互作用的蛋白质，从而起始胱天蛋白酶活化的外源途径。其他缺乏死亡结构域的TNF超家族受体与TNF受体相关因子结合并且活化细胞内信号传导通路，从而导致增殖或分化。这些受体也可起始细胞凋亡，但它们经由间接机制发挥作用。除调节细胞凋亡以外，多种TNF超家族受体还参与调节免疫细胞功能，诸如B细胞稳态和活化、自然杀伤细胞活化和T细胞协同刺激。多种其他调节特定细胞类型的应答，诸如毛囊发育和破骨细胞发育。TNF受体超家族的成员包括：肿瘤坏死因子受体1(1A)(TNFRSF1A,CD120a)、肿瘤坏死因子受体2(1B)(TNFRSF1B,CD120b)、淋巴毒素β受体(LTBR,CD18)、OX40(TNFRSF4,CD134)、CD40(Bp50)、Fas受体(Apo-1,CD95,FAS)、诱骗受体3(TR6,M68,TNFRSF6B)、CD27(S152,Tp55)、CD30(Ki-1,TNFRSF8)、4-1BB(CD137,TNFRSF9)、DR4(TRAILR1,Apo-2,CD261,TNFRSF10A)、DR5(TRAILR2,CD262,TNFRSF10B)、诱骗受体1(TRAILR3,CD263,TNFRSF10C)、诱骗受体2(TRAILR4,CD264,TNFRSF10D)、RANK(CD265,TNFRSF11A)、骨保护素(OCIF,TR1,TNFRSF11B)、TWEAK受体(Fn14,CD266,TNFRSF12A)、TACI(CD267,TNFRSF13B)、BAFF受体(CD268,TNFRSF13C)、疱疹病毒侵入介体(HVEM,TR2,CD270,TNFRSF14)、神经生长因子受体(p75NTR,CD271,NGFR)、B细胞成熟抗原(CD269,TNFRSF17)、糖皮质激素诱导的TNFR相关(GITR,AITR,CD357,TNFRSF18)、TROY(TNFRSF19)、DR6(CD358,TNFRSF21)、DR3(Apo-3,TRAMP,WS-1,TNFRSF25)以及外胚叶发育不全A2受体(XEDAR,EDA2R)。
经过初始T细胞活化后，肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的多个成员将维持T细胞应答。术语“共刺激TNF受体家族成员”或“共刺激TNF家族受体”是指TNF受体家族成员的一个亚组，其能够协同刺激T细胞的增殖和细胞因子产生。除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然TNF家族受体，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在本发明的具体实施例中，共刺激TNF受体家族成员选自由以下项组成的组：OX40(CD134)、4-1BB(CD137)、CD27、HVEM(CD270)、CD30和GITR，它们对T细胞均具有共刺激作用。更具体地，共刺激TNF受体家族成员为4-1BB。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“4-1BB”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然4-1BB，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工4-1BB，以及通过细胞中加工产生的任何形式的4-1BB。该术语还涵盖4-1BB的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人4-1BB的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:97(Uniprot登录号Q07011)中，示例性鼠4-1BB的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:98(Uniprot登录号P20334)中，并且示例性食蟹猴4-1BB(来自猕猴)的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:99(Uniprot登录号F6W5G6)中。
术语“抗4-1BB抗体”、“抗4-1BB”、“4-1BB抗体和“与4-1BB特异性结合的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合4-1BB，使得该抗体可用作靶向4-1BB的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中，例如通过放射免疫测定(RIA)或流式细胞术(FACS)所测得的，抗4-1BB抗体与不相关的非4-1BB蛋白的结合程度小于该抗体与4-1BB结合程度的约10％。在某些实施例中，与4-1BB结合的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-6M或更小，例如10-68M至10-13M，例如10-8M至10-10M)。具体地，抗4-1BB抗体为美国专利号7,288,638所公开的克隆20H4.9。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸，通常约2至20个氨基酸的肽。肽接头是本领域中已知的或在本文中描述的。合适的非免疫原性连接肽是例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为介于1与10之间、通常介于2与4之间的数字，特别地是2，即选自由以下项组成的组的肽：GGGGS(SEQ ID NO:100)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:101)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:102)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:103)，但也包括以下序列：GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:104)、(G4S)3(SEQ ID NO:105)、(G4S)4(SEQ ID NO:106)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:107)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:108)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:109)、GGSGSG(SEQ IDNO:110)、GGSG(SEQ ID NO:111)、GGSGNGSG(SEQ ID NO:112)、GGNGSGSG(SEQ ID NO:113)和GGNGSG(SEQ ID NO:114)。特别感兴趣的肽接头是(G4S)(SEQ ID NO:100)、(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:101)、(G4S)3(SEQ ID NO:105)和(G4S)4(SEQ ID NO:106)，并且更具体地是(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:101)。
如本申请中所用的术语“氨基酸”表示包括以下项的天然存在的羧基α-氨基酸的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、蛋氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)，以及缬氨酸(val，V)。
“融合”或“连接”意指组分(例如，抗体和Fab片段的重链)直接地或经由一个或多个肽接头而通过肽键连接。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列一致性百分比之后，并且出于比对的目的在不考虑将任何保守取代作为序列一致性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列一致性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。另选地，可使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成一致性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册，并且如WO 2001/007611所述。
在某些实施例中，考虑了本文所提供的含TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善含TNF配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其他生物学特性。含TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可以通过向编码分子的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。用于取代诱变的感兴趣的位点包括HVR和框架(FR)。保守取代在表A中表头“优选的取代”下提供，并在下文中参考氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可以将氨基酸取代引入感兴趣的分子中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。
表A
Figure BDA0002868662390000451
Figure BDA0002868662390000461
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性；正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
术语“氨基酸序列变体”包括实质性变体，其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸取代。通常，相对于亲本抗原结合分子，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施例中，取代、***或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的抗原结合能力即可。例如，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。另选地或另外地，利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列***包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的示例包括具有N末端甲硫氨酰残基的本发明的双特异性抗原结合分子。分子的其他***变体包括与增加双特异性抗原结合分子的血清半衰期的多肽的N末端或C末端的融合。
在某些实施例中，改变本文提供的双特异性抗原结合分子以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，从而便利地获得分子的糖基化变体。当含TNF配体三聚体的抗原结合分子包含Fc区时，附接于其上的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-连接附接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对含TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的变体。在一个方面，提供了本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的变体，其具有缺乏附接(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能，参见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。在另一方面，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体提供有两分型寡糖的变体，例如其中附接于Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能，参见例如WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了在附接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能并描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些方面，可期望产生本发明的双特异性抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体，例如“thioMAb”，其中分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定方面，取代的残基存在于分子的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分，诸如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物。在某些方面，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述形成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，在线发表于2017年6月12日，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
“分离的”多核苷酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置处。
“编码双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导所述基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞***。宿主细胞包括培养的细胞，举几个例子，例如培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用配制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药学上可接受的赋形剂”是指药物组合物中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。
如本文所用的术语“癌症”是指增生性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经***(CNS)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括以上癌症中的任一种的难治性型式，或一种或多种以上癌症的组合。
本发明的双特异性抗原结合分子
本发明涉及新型双特异性激动性4-1BB抗体，其具有特别有利的特性，诸如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、靶向效率和降低的毒性。它们的特征还在于其特异性结构特征，诸如能够分别特异性结合到4-1BB和靶细胞抗原的两个Fab片段的邻近性，与4-1BB的二价结合和与靶细胞抗原的单价结合使这些双特异性抗原结合分子非常有效并且不影响安全性。
示例性双特异性抗原结合分子
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；
(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；
(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及
(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成；其中第二Fab片段(b)在Fab重链的C末端融合至第一Fab片段(a)的Fab重链的N末端，其继而在其C末端融合至第一Fc结构域亚基的N末端，并且第三Fab片段(c)在Fab重链的C末端融合至第二Fc结构域亚基的N末端，并且其中在能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，(i)Fab轻链和Fab重链的可变区VL和VH彼此替换，或(ii)Fab轻链和Fab重链的恒定区CL和CH1彼此替换。
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；
(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；
(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及
(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成；其中第二Fab片段(b)在Fab重链的C末端融合至第一Fab片段(a)的Fab重链的N末端，其继而在其C末端融合至第一Fc结构域亚基的N末端，并且第三Fab片段(c)在Fab重链的C末端融合至第二Fc结构域亚基的N末端，并且其中在能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，Fab轻链和Fab重链的可变区VL和VH彼此替换。
具体地，能够特异性结合到4-1BB的Fab片段包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了一种如本文所述的双特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子提供与4-1BB的二价结合和与靶细胞抗原的单价结合。更具体地，双特异性抗原结合分子提供了与4-1BB的二价结合和与肿瘤相关的抗原(TAA)的单价结合。
Fab片段可以直接或通过肽接头与Fc结构域融合，该肽接头包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。适于连接第一Fab片段和第二Fab片段的Fab重链的一种示例性肽接头包含序列(D)-(G4S)2。另一种合适的此类接头包含序列(G4S)4。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
在一个方面，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到4-1BB(a)和(c)的第一Fab片段和第三Fab片段相同。在一个特定方面，本发明提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
因此，在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；
(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；
(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及
(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成；其中
第二Fab片段(b)在Fab重链的C末端融合至第一Fab片段(a)的Fab重链的N末端，其继而在其C末端融合至第一Fc结构域亚基的N末端，并且第三Fab片段(c)在Fab重链的C末端融合至第二Fc结构域亚基的N末端，并且其中在能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，(i)Fab轻链和Fab重链的可变区VL和VH彼此替换，或(ii)Fab轻链和Fab重链的恒定区CL和CH1彼此替换，并且其中第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段，其各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。更具体地，能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个方面，双特异性抗原结合分子包括含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的一种多肽(Fc孔重链)和含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的两种多肽(轻链)。
本发明的双特异性抗原结合分子的特征还在于能够特异性结合到靶细胞抗原的一种Fab片段。因此，双特异性抗原结合分子相比于能够特异性结合到4-1BB的常规抗体的优势在于，它们选择性地诱导靶细胞(通常是癌细胞)上的共刺激T细胞应答。在一个方面，靶细胞抗原选自由以下项组成的组：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD33和PD-L1。在一个方面，靶细胞抗原选自由以下项组成的组：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20和CD33。具体地，靶细胞抗原选自成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)和CD19。在一个特定方面，靶细胞抗原选自成纤维细胞活化蛋白(FAP)和癌胚抗原(CEA)。更具体地，靶细胞抗原为FAP。另选地，靶细胞抗原为CEA。在另一个特定方面，靶细胞抗原为CD19。在进一步方面，靶细胞抗原为PD-L1。
其中靶细胞抗原为FAP的双特异性抗原结合分子
在一个特定方面，靶细胞抗原为成纤维细胞活化蛋白(FAP)。FAP结合部分已描述于WO 2012/02006中，该专利全文以引用方式并入本文。特别感兴趣的FAP结合部分如下文所述。
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
具体地，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到FAP的Fab片段包含：重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在另一方面，能够特异性结合到FAP的Fab片段包含：重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
具体地，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ IDNO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ IDNO:24的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
具体地，能够特异性结合到FAP的Fab片段包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQID NO:21的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或者重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。更具体地，能够特异性结合到FAP的Fab片段包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在进一步方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:66的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:68的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:66的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:68的多肽序列。
其中靶细胞抗原为CEA的双特异性抗原结合分子
在一个特定方面，靶细胞抗原为癌胚抗原(CEA)。CEA结合部分已描述于例如WO92/01059、WO 2007/071422、WO 2016/075278A2或WO2007/071426，这些专利全文以引用方式并入本文。特别感兴趣的CEA结合部分如下文所述。
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或者
(e)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQID NO:120的氨基酸序列；或者
(f)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:129或SEQID NO:130或SEQ ID NO:131的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列。
具体地，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
具体地，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：(a)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：(a)重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列(抗体A5B7)。
在一个方面，能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：人源化重链可变区(VHCEA)，其基于包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的人受体框架IGHV3-23-02；和人源化轻链可变区(VLCEA)，其基于包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的人受体框架IGKV3-11。
在一个特定方面，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQID NO:119的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。
在一个方面，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。具体地，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列(抗体A5H1EL1D)。在另一方面，Fab片段可包含相比于A5H1EL1D对CEA具有更高的亲和力的抗体，其中A5H1EL1D包含相同的框架区但CDR区存在突变。因此，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:121的氨基酸序列的至少约95％相同；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:122的氨基酸序列的至少约95％相同。
在另一方面，能够特异性结合到FAP的Fab片段包含：重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一个方面，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列(抗体MFE23)。
具体地，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含人源化重链和轻链可变结构域。在一个方面，能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
在一个方面，能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列；或者
(e)重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列；或者
(f)重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列；或者
(g)重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列。
在进一步方面，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在一个方面，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。具体地，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列(抗体T84.66-LCHA)。
在进一步方面，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在一个方面，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。具体地，能够特异性结合到CEA的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列(抗体CH1A1A 98/99/2F1)。
在一个方面，能够特异性结合到CEA的抗原结合结构域包含：重链可变区VH，该重链可变区VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者能够特异性结合到FAP的抗原结合结构域包含：重链可变区VH，该重链可变区VH包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在另一方面，能够特异性结合到CEA的抗原结合结构域包含：重链可变区VH，该重链可变区VH包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者能够特异性结合到FAP的抗原结合结构域包含：重链可变区VH，该重链可变区VH包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在进一步方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在进一步方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:47的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:121的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列。
在进一步方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:133的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:137的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列。
再一方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:138的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:137的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:135的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列。
在又一方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到FAP的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:133的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列。
在一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:76的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:77的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:76的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:77的多肽序列。
在另一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:78的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:79的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:78的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:79的多肽序列。
在另一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:80的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:81的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:80的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:81的多肽序列。
在又一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:82的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:83的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:82的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:83的多肽序列。
在另一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:173的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:174的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ IDNO:173的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:174的多肽序列。
在另一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:179的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:180的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ IDNO:179的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:180的多肽序列。
在另一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:181的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:182的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ IDNO:181的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:182的多肽序列。
在另一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:183的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:184的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ IDNO:183的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:184的多肽序列。
在另一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:185的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:186的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ IDNO:185的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:186的多肽序列。
在另一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:187的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:188的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ IDNO:187的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:188的多肽序列。
在另一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:189的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:190的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ IDNO:189的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:190的多肽序列。
在另一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:191的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:192的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ IDNO:191的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:192的多肽序列。
其中靶细胞抗原为CD19的双特异性抗原结合分子
在一个特定方面，靶细胞抗原是CD19。CD19结合部分已描述于例如WO 2016/075278 A1中，该专利全文以引用方式并入本文。特别感兴趣的CD19结合部分如下文所述。
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到CD19的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCD19)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCD19)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列。
具体地，能够特异性结合到CD19的Fab片段包含：重链可变区(VHCD19)，其包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCD19)，其包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。更具体地，能够特异性结合到CD19的Fab片段包含：重链可变区(VHCD19)，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLCD19)，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到CD19的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:63的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
在一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:84的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:85的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:84的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:85的多肽序列。
其中靶细胞抗原为PD-L1的双特异性抗原结合分子
在一个特定方面，靶细胞抗原是PD-L1。CD19结合部分已描述于例如WO 2010/077634中，该专利全文以引用方式并入本文。特别感兴趣的PD-L1结合部分如下文所述。
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到PD-L1的Fab片段包含：
重链可变区(VHPD-L1)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQID NO:150的氨基酸序列。
具体地，能够特异性结合到PD-L1的Fab片段包含：重链可变区(VHPD-L1)，其包含与SEQ ID NO:152的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含与SEQ ID NO:153的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。更具体地，能够特异性结合到PD-L1的Fab片段包含：重链可变区(VHPD-L1)，其包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中
(i)能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；并且
(ii)能够特异性结合到CD19的第二Fab片段包含：重链可变区VH，其包含SEQ IDNO:152的氨基酸序列，以及轻链可变区VL，其包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列。
在一个特定方面，双特异性抗原结合分子包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:193的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的两种多肽；以及与SEQ ID NO:194的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ IDNO:193的多肽序列、SEQ ID NO:67的两种多肽序列和SEQ ID NO:194的多肽序列。
还公开了一种具有与4-1BB单价结合的抗原结合分子(1+1形式)。因此，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包括：与SEQ ID NO:65的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:195的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；与SEQ ID NO:67的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；以及与SEQ IDNO:194的序列的至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽。在又一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:195的多肽序列、SEQ ID NO:67的多肽序列和SEQ ID NO:194的多肽序列。
降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
本发明的双特异性抗原结合分子进一步包含由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域。
在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。
Fc结构域为本发明的双特异性抗体赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定实施例中，与天然IgG Fc结构域，具体地是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域相比，本发明的双特异性抗体的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。更具体地，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。
在一个此类方面，与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比，该Fc结构域(或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出对Fc受体的结合亲和力的小于50％、优选地少小20％、更优选地小于10％且最优选地小于5％；和/或与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比，该Fc结构域(或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出效应子功能的小于50％、优选地小于20％、更优选地小于10％且最优选地小于5％。在一个方面，Fc结构域(或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)不显著结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在一个特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，Fc受体是人Fc受体。在一个方面，Fc受体是活化的Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是活化的人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIB。在一个方面，效应子功能是CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌中的一个或多个。在一个特定方面，效应子功能是ADCC。在一个方面，与天然IgG1 Fc结构域相比，Fc结构域表现出对新生儿Fc受体(FcRn)基本上类似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％、具体地大于约80％、更具体地大于约90％时，实现了与FcRn基本上类似的结合。
在一个特定方面，Fc结构域经过工程化改造，以与非工程化改造的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个特定方面，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个方面，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在另一方面，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一个方面，与包含非工程化改造的Fc结构域的本发明的双特异性抗体相比，包含工程化改造的Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子表现出对Fc受体的结合亲和力的小于20％、具体地小于10％、更具体地小于5％。在一个特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在其他方面，Fc受体是人Fc受体。在一个方面，Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIB。在一些方面，Fc受体是活化的Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是活化的人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合力降低。在一些方面，对互补组分的结合亲和力，对C1q的特异性结合亲和力也降低。在一个方面，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力不降低。当Fc结构域(或包含Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出Fc结构域的非工程化改造形式(或包含Fc结构域的非工程化改造形式的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上类似的与FcRn的结合，即实现了Fc结构域对该受体的结合亲和力的保留。Fc结构域或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子可表现出这种亲和力的大于约80％或甚至大于约90％。在某些实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域被工程化改造，以相比于非工程化改造的Fc结构域具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在本发明的一个方面，Fc结构域在E233、L234、L235、N297、P331和P329位处包含氨基酸取代。在一些方面，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(“LALA”)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个方面，Fc结构域在P329位处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，氨基酸取代是P329A或P329G，特别地是P329G。在一个实施例中，Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代并且包含选自由E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S组成的组的另外的氨基酸取代。在更特定的实施例中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”)。氨基酸取代的“P329GLALA”组合几乎完全消除人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，如PCT专利申请号WO 2012/130831 A1中所述。所述文档还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和用于确定其特性(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。这种抗体是具有突变L234A和L235A或具有突变L234A、L235A和P329G的IgG1(根据Kabat等人的EU索引编号，Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991)。
在一个方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域是在S228位处(Kabat编号)包含氨基酸取代，具体地是氨基酸取代S228P的IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域是包含氨基酸取代L235E和S228P以及P329G的IgG4 Fc结构域。这种氨基酸取代减少IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，DrugMetabolism and Disposition 38，84-91(2010))。
具有延长的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合、负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593，以及Kim,J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434)的抗体描述于US2005/0014934中。那些抗体包含这样的Fc区，所述Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。关于Fc区变体的其他示例，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；以及WO 94/29351。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。另选地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。Fc结构域的效应子功能，或本发明的包含Fc结构域的双特异性抗原结合分子，可以通过本领域已知的方法来测量。本文描述了用于测量ADCC的合适的测定法。用于评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0002868662390000761
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
以下部分描述了包含降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰的本发明的双特异性抗原结合分子的优选方面。在一个方面，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低抗体与Fc受体的结合亲和力，特别是对Fcγ受体的结合亲和力。在另一方面，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低效应子功能。在另一方面，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中Fc结构域相比于天然IgG1Fc结构域表现出对Fc受体特别是Fcγ受体的降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能，特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在另一方面，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低与Fc受体的结合和/或效应子功能，具体地其中所述一个或多个氨基酸取代在选自由以下项组成的组中的一个或多个位置处：L234、L235和P329(Kabat EU索引编号)。在另一方面，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中Fc结构域中的每个亚基包含三个氨基酸取代，这三个氨基酸取代降低与活化Fc受体的结合和/或效应子功能，其中所述氨基酸取代在位置L234A、L235A和P329G处(Kabat EU索引编号)。在特定方面，Fc结构域属于人IgG1亚类，具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
本发明的双特异性抗原结合分子包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合位点，因此该Fc结构域的两个亚基可包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高本发明的双特异性抗原结合分子的产率和纯度，因此在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰将是有利的。
因此，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其包含：(a)至少一个抗原结合结构域，所述至少一个抗原结合结构域能够特异性结合到4-1BB，(b)至少一个能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域，以及(c)Fc结构域，该Fc结构域由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的结合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体方面，所述修饰是所谓的“突起进入孔”修饰，所述修饰包括Fc结构域的两个亚基中的一个中的“突起”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“孔”修饰。因此，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其中在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生凸起，该凸起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中；而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，该第一亚基的CH3结构域内的凸起可定位在该空腔内。因此，提供了一种双特异性抗原分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中根据突起进入孔方法，Fc结构域的第一亚基包含突起并且Fc结构域的第二亚基包含孔。具体地，具有较大侧链体积的所述氨基酸残基选自由以下项组成的组：精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)，并且所述具有较小侧链体积的所述氨基酸残基选自由以下项组成的组：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一个方面，在Fc结构域的第一亚基中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)取代；并且在Fc结构域的第二亚基中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)取代；并且任选地，另外在Fc结构域的第二亚基中，366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)取代，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)取代(均根据Kabat EU索引进行编号)。在一个特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU索引编号)，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
突起进入孔技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，ProtEng 9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“突起”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“孔”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个方面，在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，某一氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生凸起，所述凸起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中；而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，某一氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，该第一亚基的CH3结构域内的所述凸起可定位在该空腔内。凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在一个具体方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，366位处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)取代，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，407位处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)取代。在一个方面中，另外在Fc结构域的第二亚基中，366位处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)取代，并且368位处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)取代。
在另一个方面，另外在Fc结构域的第一亚基中，354位处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)取代，并且另外在Fc结构域的第二亚基中，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)取代。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定该二聚体(Carter(2001),J Immunol Methods 248,7-15)。在一个特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)而Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在另一方面，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。
如本文报道的双特异性抗体的重链的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。在本文报道的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含含有C末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个实施例中，如本文所指定的包含含有C末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。
CH1/CL结构域的修饰
为进一步改善正确配对，双特异性抗原结合分子可包含带有不同电荷的氨基酸取代(所谓“带电荷的残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉的CH1和CL结构域中。在一个特定方面，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其中在CL结构域中的至少一者中，123位(EU编号)的氨基酸已被精氨酸(R)取代并且124位(EU编号)的氨基酸已被赖氨酸(K)取代；并且其中在CH1结构域中的至少一者中，147位(EU编号)和213位(EU编号)的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。更具体地，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其中在结合到4-1BB的Fab结构域的CL结构域中，123位(EU编号)的氨基酸已被精氨酸(R)取代并且124位(EU编号)的氨基酸已被赖氨酸(K)取代；并且其中在结合到4-1BB的Fab结构域的CH1结构域中，147位(EU编号)和213位(EU编号)的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
在一个方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中第二Fab片段(b)在Fab重链的C末端融合至第一Fab片段(a)的Fab重链的N末端，其继而在其C末端融合至第一Fc结构域亚基的N末端，并且第三Fab片段(c)在Fab重链的C末端融合至第二Fc结构域亚基的N末端，其中在能够特异性结合到靶细胞抗原的第三Fab片段中，(i)可变结构域VL和VH彼此替换，或(ii)恒定结构域CL和CH1彼此替换，并且其中在能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat EU索引编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)或赖氨酸(K)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且其中在能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
Fab结构域中的修饰
本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中在能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，(i)Fab轻链和Fab重链的可变区VL和VH彼此替换,或(ii)Fab轻链和Fab重链的恒定区CL和CH1彼此替换。因此，根据Crossmab技术制备双特异性抗体。
WO2009/080252和Schaefer,W.等人(PNAS,108(2011)11187-1191)详细描述了在一个结合臂中具有结构域置换/交换的多特异性抗体(CrossMab VH-VL或CrossMab CH-CL)。它们明显减少了由抗第一抗原的轻链与抗第二抗原的错误重链的错配导致的副产物(与没有此类结构域交换的方法相比)。
在一个方面，本发明涉及一种双特异性抗原结合分子，其中在能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，(i)Fab轻链和Fab重链的可变区VL和VH彼此替换，或(ii)Fab轻链和Fab重链的恒定区CL和CH1彼此替换,其中在第二Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，使得CH1结构域成为轻链的一部分，并且CL结构域成为重链的一部分(CH-CLcrossmab)。在另一方面，在第二Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，使得VH结构域成为轻链的一部分，并且VL结构域成为重链的一部分(VH-VL crossmab)。更具体地，在能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，Fab轻链和Fab重链的可变区VL和VH彼此替换，使得VH结构域成为轻链的一部分，并且VL结构域成为重链的一部分。
多核苷酸
本发明还提供了编码如本文所述的双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸。
编码本发明的双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸可以表达为编码完整抗原结合分子的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他手段缔合以形成功能性抗原结合分子。例如，免疫球蛋白的轻链部分可以由来自免疫球蛋白的重链部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成免疫球蛋白。
在一些方面中，分离的多核苷酸编码如本文所述的包含在根据本发明的双特异性分子中的多肽。
在一个方面，本发明涉及一种编码双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸，所述双特异性抗原结合分子包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
本发明的双特异性抗原结合分子可通过例如重组生产获得。对于重组生产，提供了编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的一种或多种多核苷酸。将编码双特异性抗原结合分子的一种或多种多核苷酸分离并***至一种或多种载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在本发明的一个方面，提供了一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献所述的技术：Maniatis等人，MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，该异源编码区与编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。
本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔
Figure BDA0002868662390000841
珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒***的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌双特异性抗原结合分子或其多肽片段，可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明的本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。另选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
DNA编码可用于促进后续纯化的短蛋白质序列(例如组氨酸标签)或帮助标记融合蛋白的DNA可包含在编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。
在本发明的另一方面，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些方面，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含(例如，已转化或转染)载体，该载体包含编码本发明的双特异性抗原结合分子(的一部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化改造以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞***。适于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。
用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的示例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人***细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。用于在这些***中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含免疫球蛋白的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化改造，以便也表达另一条免疫球蛋白链，使得表达的产物为具有重链和轻链的免疫球蛋白。
在一个方面，提供了一种生产本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的方法，其中该方法包括在适于表达本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的条件下培养包含编码如本文所提供的本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段多核苷酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段。
如本文所述制备的本发明的双特异性分子可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为诸如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、尺寸排阻色谱等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱纯化，可以使用与双特异性抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明融合蛋白的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗原结合分子。双特异性抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种来确定，所述熟知的分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。例如，实例中所述的表达的双特异性抗原结合分子被显示为得到完整并且适当组装，如还原和非还原SDS-PAGE所示。
测定
本文所提供的双特异性抗原结合分子的物理/化学性质和/或生物学活性可通过本领域中已知的各种测定法进行鉴定、筛选或表征。
1.亲和力测定
本文提供的双特异性抗原结合分子、抗体和抗体片段对4-1BB和靶细胞抗原的亲和力可以使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)以及可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，根据实例中阐述的方法通过表面等离子体共振(SPR)来确定。双特异性抗原结合分子对靶细胞抗原的亲和力也可以使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)以及可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，通过表面等离子体共振(SPR)来确定。用于测量结合亲和力的特定说明性和示例性实施例描述于实例1.2中。根据一个方面，在25℃下使用
Figure BDA0002868662390000871
T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振来测量KD。
2.结合测定和其他测定
本文所提供的双特异性抗原结合分子与表达相应受体的细胞的结合可使用表达特定受体或靶抗原的细胞系通过流式细胞术(FACS)来评估。在一个方面，在结合测定中使用表达4-1BB的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2。在进一步方面，利用表达靶细胞抗原(例如FAP或CEA)的癌细胞系证明抗原结合分子与靶细胞抗原的结合。
在另一方面，可使用竞争测定法鉴定分别与特定抗体或抗原结合分子竞争与靶点或4-1BB结合的抗原结合分子。在某些实施例中，此类竞争抗原结合分子与由特定抗靶抗体或特定抗4-1BB抗体结合的同一表位(例如，线性或构象表位)结合。用于定位抗体与之结合的表位的详细示例性方法提供于：Morris(1996)，“Epitope Mapping Protocols”，出自Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)。
3.活性测定
在一个方面，提供了用于鉴定与特定靶细胞抗原和具有生物活性的4-1BB结合的双特异性抗原结合分子的测定方法。生物活性可包括例如通过4-1BB对表达靶细胞抗原的细胞的激动性信号转导。还提供了通过测定鉴定出的具有此类体外生物活性的双特异性抗原结合分子。
在某些方面，测试本发明的双特异性抗原结合分子的此类生物活性。此外，用于检测细胞裂解(例如，通过测量LDH释放)、诱导的细胞凋亡动力学(例如，通过测量胱天蛋白酶3/7活性)或细胞凋亡(例如，使用TUNEL测定)的方法是本领域中熟知的。另外，可通过评估此类复合物对各种淋巴细胞亚群诸如NK细胞、NKT细胞或γT细胞的存活、增殖和淋巴因子分泌的影响，或评估其调节抗原呈递细胞诸如树突细胞、单核细胞/巨噬细胞或B细胞的表型和功能的能力，对此类复合物的生物活性进行评估。
药物组合物、制剂和施用途径
在进一步方面，本发明提供了包含本文所提供的双特异性抗原结合分子中的一者或多者的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一者中。在一个实施例中，药物组合物包含本文所提供的双特异性抗原结合分子中的任何一者以及至少一种药学上可接受的赋形剂。在另一实施例中，药物组合物包含任一种本文提供的双特异性抗原结合分子以及如下文所述的至少一种附加治疗剂。
本发明的药物组合物包含溶于或分散于药学上可接受的赋形剂中的一种或多种双特异性抗原结合分子治疗有效量。术语“药学上或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。包含根据本发明所述的至少一种双特异性抗原结合分子和任选的附加活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company，1990)所例示，该文献以引用方式并入本文。具体地，组合物为冻干制剂或水溶液。如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂及它们的组合，如对本领域的普通技术人员所知。
肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。为了进行注射，可在水溶液中配制本发明的双特异性抗原结合分子，优选在生理相容性缓冲剂诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水进行配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另选地，双特异性抗原结合分子可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的抗原结合分子以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白、微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
本文的示例性药学上可接受的赋形剂还包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0002868662390000901
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
除了先前描述的组合物之外，抗原结合分子也可以配制成长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，融合蛋白可以用合适的聚合或疏水材料(例如配制成可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如配制成微溶盐)。
包含本发明的双特异性抗原结合分子的药物组合物可通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。合适的制剂取决于所选择的施用途径。
双特异性抗原结合分子可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保留游离酸或游离碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如用蛋白质性质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
本文的组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
治疗方法和组合物
本文提供的任何双特异性抗原结合分子可用于治疗方法中。为了用于治疗方法中，本发明的双特异性抗原结合分子可按照符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病况、病症的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，将本发明的双特异性抗原结合分子提供为用作药物。
在其他方面，提供了(i)用于刺激或增强T细胞应答、(ii)用于支持活化T细胞的存活、(iii)用于治疗癌症、(iv)用于延迟癌症进展或(v)用于延长癌症患者的存活期的本发明的双特异性抗原结合分子。在一个特定方面，提供了用于治疗疾病特别是用于治疗癌症的本发明的双特异性抗原结合分子。
在某些方面，提供了用于治疗方法中的本发明的双特异性抗原结合分子。在一个方面，本发明提供了如本文所述的双特异性抗原结合分子用于治疗有此需要的个体的疾病。在某些方面，本发明提供了用于治疗患有疾病的个体的方法中的双特异性抗原结合分子，该方法包括向个体施用治疗有效量的双特异性抗原结合分子。在某些方面，待治疗的疾病是癌症。需要治疗的受试者、患者或“个体”通常是哺乳动物，更特别地是人。
在一个方面，提供了一种(i)刺激或增强T细胞应答、(ii)支持活化T细胞的存活、(iii)治疗癌症、(iv)延迟癌症进展或(v)延长癌症患者的存活期的方法，其中该方法包括向有此需要的个体施用治疗有效量的本发明的双特异性抗原结合分子。
在进一步方面，本发明提供了本发明的双特异性抗原结合分子用于生产或制备用于治疗有此需要的个体的疾病的药物的用途。在一个方面，药物用于治疗疾病的方法中，该方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些方面中，待治疗的疾病是增殖性病症，特别是癌症。癌症的示例包括但不限于膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、***、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、***癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌以及肾癌。癌症的其他示例包括恶性肿瘤、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子或抗体治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、***、消化***、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经***(中枢和外周神经***)、淋巴***、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部以及泌尿生殖***。还包括癌前病症或病变和癌转移。在某些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。本领域的技术人员易于认识到，在许多情况下，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体可能无法治愈，但可能提供益处。在一些方面，具有某些益处的生理变化也被视为具有治疗益处。因此，在一些方面，提供生理变化的本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。
为了预防或治疗疾病，本发明的双特异性抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种附加治疗剂联合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、具体分子、疾病的严重程度和进程、本发明的双特异性抗原结合分子或抗体是出于预防还是治疗目的施用、先前或同时进行的治疗性干预、患者的临床病史和对融合蛋白的应答以及主治医师的酌处权。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
本发明的双特异性抗原结合分子适于在一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的双特异性抗原结合分子可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的一种示例性剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他示例中，剂量还可包括每次施用约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的示例中，可以基于上述数字施用约0.1mg/kg体重至约20mg/kg体重、约5μg/kg体重至约1mg/kg体重等的范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约2至约20或例如约6个剂量的融合蛋白)。在一个特定方面，双特异性抗原结合分子将每三周施用一次。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。该疗法的进展通过常规技术和测定而容易地监测。
本发明的双特异性抗原结合分子将通常以有效实现预期目的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的双特异性抗原结合分子或抗体或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，最初可以根据体外测定(诸如细胞培养测定)来估计治疗有效剂量。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
还可以使用本领域熟知的技术来根据体内数据(例如动物模型)估计初始剂量。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
剂量和间隔可以单独地调节，以提供足以维持疗效的本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.1至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄入的情况下，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域的技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的治疗有效剂量的本发明的双特异性抗原结合分子通常将提供治疗益处而不会引起显著的毒性。融合蛋白的毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的双特异性抗原结合分子是优选的。在一个方面，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括毒性很小或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在：ThePharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的双特异性抗体治疗的患者的主治医师将知道如何以及何时由于毒性、器官功能障碍等终止、中断或调节施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调节到更高水平。在感兴趣的病症的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
其他药剂和治疗
本发明的双特异性抗原结合分子可在治疗中单独施用或与一种或多种其他药剂联合施用。例如，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体可与至少一种附加治疗剂联合施用。术语“治疗剂”包括可以施用用于治疗需要此类治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，附加治疗剂为另一种抗癌剂或化学治疗剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、蒽环类药物、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂或抗血管生成剂。在某些方面，附加治疗剂为免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂或细胞抑制剂、细胞凋亡活化剂或增加细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的药剂。
在一个方面，本发明的双特异性抗原结合分子与化学治疗剂、放疗和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用。化学治疗剂为如上文所定义的抗癌剂。另选地，化学治疗剂选自由以下项组成的组：核苷酸类似物(例如，阿扎胞苷、卡培他滨、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲或甲氨蝶呤)、铂基药物(例如，卡铂、顺铂或奥沙利铂)、紫杉烷类(例如，紫杉醇、多西他赛、Abraxane或泰索帝)、烷基化剂(例如，环磷酰胺、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪或替莫唑胺)蒽环类药物(例如，多柔比星或伊达比星)、拓扑异构酶I抑制剂(例如，伊立替康或拓扑替康)、拓扑异构酶II(例如，依托泊苷或替尼泊苷)、激酶抑制剂(例如，埃洛替尼、伊马替尼、维莫非尼或维莫德吉)、类维生素A、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和长春花生物碱。用于癌症免疫疗法的其他药剂包括例如阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂，诸如PD1抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)或PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)。本发明的双特异性抗原结合分子也可与放疗联合使用。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用融合蛋白的量、病症或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。本发明的双特异性抗原结合分子或抗体通常以与本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。
上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或分开的组合物中)，以及分开施用，在分开施用的情况下，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的施用可以在施用附加治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。在一个方面，双特异性抗原结合分子的施用和附加治疗剂的施用彼此在约1个月内或在约1、2或3周内或在约1、2、3、4、5或6天内发生。
制品
在本发明的另一个方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。容器容纳组合物，该组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的组合物组合，并且容器可具有无菌入口(例如容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的双特异性抗原结合分子。
标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)第一容器，该第一容器中含有包含本发明的双特异性抗原结合分子的组合物；以及(b)第二容器，该第二容器中含有包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，该包装插页指示组合物可用于治疗特定病症。
另选地或另外地，制品还可包括第二(或第三)容器，该二(或第三)容器包括药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
表B(序列)：
Figure BDA0002868662390000971
Figure BDA0002868662390000981
Figure BDA0002868662390000991
Figure BDA0002868662390001001
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Figure BDA0002868662390001101
Figure BDA0002868662390001111
对于所有核苷酸序列，均未呈现相应的终止密码子序列。
本发明的方面
以下编号的段落描述了本发明的各方面：
1.一种双特异性抗原结合分子，包含：
(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；
(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；
(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及
(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中第二Fab片段(b)在Fab重链的所述C末端融合至第一Fab片段(a)的N末端，其继而在其C末端融合至第一Fc结构域亚基的N末端，并且第三Fab片段(c)在Fab重链的C末端融合至第二Fc结构域亚基的N末端，并且其中在能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，(i)可变结构域VL和VH彼此替换，或(ii)恒定结构域CL和CH1彼此替换。
2.根据段落1所述的双特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子提供与4-1BB的二价结合和与靶细胞抗原的单价结合。
3.根据段落1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域为IgG Fc结构域，具体地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。
4.根据段落1至3中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中根据突起进入孔方法，Fc结构域的第一亚基包含突起并且Fc结构域的第二亚基包含孔。
5.根据段落1至4中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，具体地为氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
6.根据段落1至5中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段相同。
7.根据段落1至6中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
8.根据段落1至7中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含与SEQ IDNO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列的至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
9.根据段落1至8中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中在能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat EU索引编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)或赖氨酸(K)取代(根据KabatEU索引编号)，并且其中在能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
10.根据段落1至9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中在能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代。
11.根据段落1至10中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中第二Fab片段能够特异性结合到选自由以下项组成的组中的靶细胞抗原：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20和CD33。
12.根据段落1至11中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段为能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段。
13.根据段落1至12中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的tklosterdhe氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
14.根据段落1至13中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ IDNO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ IDNO:24的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
15.根据段落1至11中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段为能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段。
16.根据段落1至11或段落15中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
17.根据段落1至11或段落15或16中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ IDNO:32的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ IDNO:40的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ IDNO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ IDNO:56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
18.根据段落1至11中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段为能够特异性结合到CD19的Fab片段。
19.根据段落1至11或段落18中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到CD19的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCD19)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCD19)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列。
20.根据段落1至11或段落18或19中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到CD19的Fab片段包含：重链可变区(VHCD19)，其包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCD19)，其包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
21.一种多核苷酸，其编码根据段落1至20中任一项所述的双特异性抗原结合分子。
22.一种宿主细胞，其包含根据段落21所述的多核苷酸。
23.一种生产根据段落1至20中任一项所述的双特异性抗原结合分子的方法，该方法包括在适于表达双特异性抗原结合分子的条件下培养根据段落22所述的宿主细胞。
24.一种药物组合物，其包含根据段落1至20中任一项所述的双特异性抗原结合分子以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
25.根据段落24所述的药物组合物，用于治疗癌症。
26.根据段落1至20中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物，用作药物。
27.根据段落1至20中任一项所述的双特异性抗原结合分子，用于
(i)刺激T细胞应答，
(ii)支持活化T细胞的存活，
(iii)治疗癌症，
(iv)延迟癌症进展，或
(v)延长癌症患者的存活期。
28.根据段落1至20中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物，用于治疗癌症。
29.根据段落1至20中任一项所述的用于治疗癌症的双特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子与化学治疗剂、放疗和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用。
30.根据段落1至20中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物在制造用于治疗癌症或感染性疾病的药物中的用途。
31.一种抑制个体中肿瘤细胞生长的方法，该方法包括向个体施用有效量的根据段落1至20中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物，以抑制所述肿瘤细胞的生长。
32.一种治疗癌症或感染性疾病的方法，该方法包括向个体施用治疗有效量的根据段落1至20中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物。
***
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第五版，NIH Publication No 91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。在确切的基因序列不可用的情况下，基于最接近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从来源于合适的组织的RNA中分离出基因。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。
蛋白质纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体施加至蛋白质A琼脂糖柱(GE healthcare)并用PBS洗涤。在pH 2.8下实现抗体的洗脱，之后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200，GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸、150mM NaCl(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体抗体分离。将单体抗体级分合并，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(若需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃下。提供样品的部分以例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱(SEC)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用
Figure BDA0002868662390001191
预制凝胶***(Invitrogen)。具体地，使用10％或4-12％
Figure BDA0002868662390001193
Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和
Figure BDA0002868662390001192
MES(还原凝胶，具有
Figure BDA0002868662390001194
抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或MOPS(非还原凝胶)电泳缓冲液。
分析型尺寸排阻色谱
用于测定抗体的聚集和低聚物状态的尺寸排阻色谱法(SEC)通过HPLC色谱法进行。简而言之，将蛋白A纯化的抗体施加至Agilent HPLC 1100***上的300mM NaCl、50mMKH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱，或施加至Dionex HPLC***上的2×PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白质。将BioRad凝胶过滤标准品151-1901用作标准品。
质谱
本节描述了对具有VH/VL或CH/CL交换(CrossMab)的多特异性抗体的表征，重点在于所述多特异性抗体的正确装配。通过对脱糖基化的完整CrossMab和脱糖基化/纤溶酶消化或者另选地脱糖基化/限制性LysC消化的CrossMab进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)，来分析预期的一级结构。
在37℃下以1mg/ml的蛋白质浓度将CrossMab用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F脱糖基化至多17h。纤溶酶消化或有限的LysC(Roche)消化用pH 8的Tris缓冲液中的100μg脱糖基化的VH/VL CrossMab分别在室温下执行120小时和在37℃下执行40min。在质谱分析之前，将样品经由HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在配备有TriVersaNanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS***(Bruker Daltonik)上经由ESI-MS来测定总质量。
实例1
具有与4-1BB的二价结合和与FAP的单价结合的双特异性抗体的制备、纯化和表征
1.1具有与4-1BB的二价结合和与FAP的单价结合的双特异性抗体的形成
具有与4-1BB二价结合和与FAP单价结合的双特异性激动性4-1BB抗体的制备方法如图1所示。该构建体也称为头对头(H2H)2+1形式或2+1 H2H 4-1BB(20H4.9)/FAP(4B9)P329GLALA IgG1或4-1BB(20H.9)x FAP 2+1 H2H。
构建体的第一重链HC1由以下组分组成：抗4-1BB结合剂(克隆20H4.9)的VHCH1，后接Fc孔。第二重链HC2由后接抗4-1BB(克隆20H4.9)的VHCH1和Fc突起的抗FAP结合剂(交叉Fab形式的克隆4B9)的VLCH1组成。FAP结合剂4B9的形成和制备描述于WO 2012/020006 A2中，该专利以引用方式并入本文。对于4-1BB结合剂，根据US 7,288,638 B2或US 7,659,384B2获得克隆20H4.9的VH和VL序列。两条重链结合形成异二聚体，其包括一个FAP结合交叉Fab和两个4-1BB结合Fab(图1)。
为改善正确配对，已在抗4-1BB Fab分子的CH-CL中引入了以下突变：CL中的E123R和Q124K以及CH1中的K147E和K213E。抗FAP结合剂(克隆4B9)的第二轻链LC2由VHCL(交叉Fab)组成。
应用突起进入孔技术，通过在第一重链HC1(Fc孔重链)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突变并且通过在第二重链HC2(Fc突起重链)中引入S354C/T366W突变以形成异二聚体。
根据国际专利申请公开号WO2012/130831A1中所述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入突起和孔重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
双特异性抗体4-1BB(20H4.9)/FAP(4B9)P329GLALA IgG1 2+1(H2H)的氨基酸序列可参见表1。
表1：双特异性二价抗4-1BB/单价抗FAP人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H4-1BB(20H4.9)/FAP(4B9)P329GLALA IgG1)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001211
Figure BDA0002868662390001221
1.2具有与4-1BB的二价结合和与FAP的单价结合的双特异性抗体的生产在HEK293EBNA或CHO EBNA细胞中产生IgG样蛋白质
通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞或CHO EBNA细胞，形成抗体和双特异性抗体。对细胞进行离心，然后用经过预热的CD CHO培养基(Thermo Fisher，目录号10743029)代替原培养基。将表达载体在CD CHO培养基中混合，加入PEI(聚乙烯亚胺，Polysciences，Inc，目录号23966-1)，将溶液涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，将细胞(2Mio/ml)与载体/PEI溶液混合，将其转移至烧瓶中，并且置于振荡培养箱中，在5％CO2的气氛下于37℃下孵育3小时。孵育后，加入含有补充剂(占总体积的80％)的Excell培养基(W.Zhou和A.Kantardjieff，Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing，DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。转染后1天，加入补充剂(饲料，占总体积的12％)。7天后，通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用如下所示的标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
在CHO K1细胞中产生IgG样蛋白质
另选地，本文所述的抗体和双特异性抗体由Evitria使用其专有的载体***通过常规的(基于非PCR)克隆技术并且使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
IgG样蛋白质的纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，利用Protein A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH 3.0)从细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0002868662390001231
ULTRA-15，目录号：UFC903096)浓缩蛋白质，然后利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
IgG样蛋白质的分析
通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)所述的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。利用HPLC色谱法在25℃下测定聚集体含量，该***使用分析型尺寸排阻色谱柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)，并且在运行缓冲液(分别为25mMK2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸盐酸盐(pH 6.7)或200mM KH2PO4、250mM KCl(pH6.2))中平衡。
表2-2+1 H2H抗4-1BB、抗FAP huIgG1 P329GLALA抗原结合分子的生化分析
Figure BDA0002868662390001241
抗原和筛选工具人4-1BB Fc(kih)的制备：
将编码人4-1BB胞外域的DNA序列(按照Q07011合成)亚克隆到包含突起上的人IgG1重链CH2和CH3结构域的框架中。在抗原胞外域和人IgG1的Fc之间引入AcTEV蛋白酶切割位点。在抗原Fc突起的C末端引入用于定向生物素化的Avi标签。包含S354C/T366W突变的抗原Fc突起链与包含Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc孔链结合，形成异二聚体，该异二聚体包含单个包含4-1BB胞外域链的单拷贝，从而形成单体形式的Fc连接抗原。表3示出抗原Fc融合构建体的氨基酸序列。
表3：单体抗原Fc(kih)融合分子(通过将一条Fc孔链与一条抗原Fc突起链组合来产生)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001242
Figure BDA0002868662390001251
1.3具有与4-1BB的二价结合和与FAP的单价结合的双特异性抗体(其中FAP的VH和VL融合至重链的C末端，用作对照)的制备
制备具有与4-1BB的二价结合和与FAP的单价结合的双特异性激动性4-1BB抗体，该抗体也称为4-1BB(20H4.9)/FAP(4B9)P329GLALA IgG1 2+1 VH/VL(C末端)，其中FAP(4B9)结合剂的VH和VL分别融合至每条重链的C末端。应用突起进入孔技术，通过在第一重链HC1(Fc突起重链)中引入S354C/T366W突变并且在第二重链HC2(Fc孔重链)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突变以形成异二聚体。
在本实例中，构建体的第一重链HC1由以下组分组成：后接Fc突起的抗4-1BB结合剂(克隆20H4.9)的VHCH1在其C末端与抗FAP结合剂的VL融合。第二重链HC2由后接Fc孔的抗4-1BB的VHCH1组成，在其C末端与抗FAP结合剂(克隆4B9)VH融合。两条重链结合形成异二聚体，其包括一个FAP结合部分和两个4-1BB结合Fab。
根据国际专利申请公开号WO2012/130831A1中所述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入突起和孔重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
2+1抗4-1BB(抗FAP构建体，其包含融合至Fc突起重链的a-FAP VH和融合至Fc孔重链的VL)的氨基酸序列可参见表4。
表4：双特异性二价抗4-1BB/单价抗FAP人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(构建体，包含融合至Fc孔链的a-FAP VH和融合至Fc突起链的VL，称为2+1 VH/VL)的序列
Figure BDA0002868662390001261
Figure BDA0002868662390001271
表5：具有与4-1BB的二价结合和与FAP的单价结合的双特异性抗原结合分子(2+1VH/VL 4-1BB/FAP人IgG1 P329GLALA)的生化分析
Figure BDA0002868662390001272
1.4具有与4-1BB的二价结合和非靶向VH和VL部分(DP47种系对照)的双特异性抗体的制备，其中DP47的VH和VL融合至重链的C末端(对照)
制备具有与4-1BB的二价结合和单价非靶向DP47种系对照的双特异性激动性4-1BB抗体，也称为4-1BB(20H4.9)/非靶向(DP47)P329GLALA IgG1 2+1 VH/VL(C末端)，其中非结合克隆(DP47)的VH和VL分别在每条重链的C末端融合。应用突起进入孔技术，通过在第一重链HC1(Fc突起重链)中引入S354C/T366W突变并且在第二重链HC2(Fc孔重链)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突变以形成异二聚体。
在本实例中，构建体的第一重链HC1由以下组分组成：后接Fc突起的抗4-1BB结合剂(克隆20H4.9)的VHCH1在其C末端与DP47的VL融合。第二重链HC2由后接Fc孔的抗4-1BB的VHCH1组成，在其C末端与DP47的VH融合。两条重链结合形成异二聚体，其包括DP47(代替FAP结合部分和两个4-1BB结合Fab)。
根据国际专利申请公开号WO2012/130831A1中所述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入突起和孔重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
2+1抗4-1BB(非靶向(DP47)构建体，其包含融合至Fc突起重链的a-DP47VH和融合至Fc孔重链的VL)的氨基酸序列可参见表6。
表6：双特异性二价抗4-1BB/非靶向(DP47)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(构建体，包含融合至Fc孔链的DP47 VH和融合至Fc突起链的DP47 VL，称为C末端)的序列
Figure BDA0002868662390001281
Figure BDA0002868662390001291
实例2
具有与4-1BB的二价结合和与CEA的单价结合的双特异性抗体的制备、纯化和表征
2.1具有与4-1BB的二价结合和与CEA的单价结合的双特异性抗体的形成和生产
还可通过将抗FAP交叉Fab取代为抗CEA交叉Fab，制备具有与4-1BB的二价结合和与CEA的单价结合的双特异性激动性4-1BB抗体。这种构建体也称为头对头(H2H)2+1形式。
该构建体的第一重链HC1由以下组分组成：抗4-1BB结合剂(克隆20H4.9)的VHCH1，后接Fc孔。第二重链HC2由后接抗4-1BB(克隆20H4.9)的VHCH1和Fc突起的抗CEA结合剂(呈交叉Fab形式)的VLCH1组成。亲代CEA结合剂A5B7描述于WO 92/01059中。CEA结合剂MFE23的序列描述于WO 2007/071422中。对于4-1BB结合剂，根据US 7,288,638 B2或US 7,659,384B2获得克隆20H4.9的VH和VL序列。两条重链结合形成异二聚体，其包括一个CEA结合交叉Fab和两个4-1BB结合Fab(图1)。
为改善正确配对，已在抗4-1BB Fab分子的CH-CL中引入了以下突变：CL中的E123R和Q124K以及CH1中的K147E和K213E。抗CEA结合剂的第二轻链LC2由VHCL(交叉Fab)组成。
应用突起进入孔技术，通过在第一重链HC1(Fc孔重链)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突变并且通过在第二重链HC2(Fc突起重链)中引入S354C/T366W突变以形成异二聚体。
根据国际专利申请公开号WO2012/130831A1中所述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入突起和孔重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
双特异性2+1 H2H抗4-1BB抗CEA huIgG1 P329GLALA抗体按照有关2+1抗4-1BB抗FAP huIgG1 P329GLALA抗体的实例1.2中所述进行生产。
双特异性4-1BB(20H4.9)/CEA(A5B7)P329GLALA IgG1 2+1(H2H)抗体的氨基酸序列可参见表7，而双特异性4-1BB(20H4.9)/CEA(MFE23)P329GLALA IgG1 2+1(H2H)抗体的氨基酸序列可参见表8。
按照实例1.2所述生产并且纯化蛋白质。
表7：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(A5B7)人IgG1 P329GLALA抗体(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001301
Figure BDA0002868662390001311
表8：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(MFE23)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001312
Figure BDA0002868662390001321
具有与4-1BB的二价结合和与CEA的单价结合的其他双特异性激动性4-1BB抗体可通过抗CEA结合剂克隆抗CEA(T84.66-LCHA)或克隆抗CEA(CH1A1A 98/99 SF1)制备。双特异性4-1BB(20H4.9)x CEA(T84.66-LCHA)P329GLALA IgG1 2+1(H2H)抗体的氨基酸序列可参见表9，而双特异性4-1BB(20H4.9)x CEA(CH1A1A 98/99 SF1)P329GLALA IgG1 2+1(H2H)抗体的氨基酸序列可参见表10。
表9：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(T84.66-LCHA)人IgG1 P329GLALA抗体(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001331
表10：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(CH1A1A 98/99 2F1)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001332
Figure BDA0002868662390001341
2.2抗CEA抗体A5B7的人源化变体的形成
2.2.1方法
抗CEA抗体A5B7由例如M.J.Banfield等人(Proteins 1997,29(2),161-171)公开，并且其结构可参见蛋白质结构数据库(PDB)中的PDB ID:1CLO(www.rcsb.org，H.M.Berman等人，The Protein Data Bank，Nucleic Acids Research，2000，28，235-242)。该条目包括重链和轻链可变结构域序列。为鉴定抗CEA结合剂A5B7的人源化过程中的合适的人受体框架，采用一种经典方法，即寻找具有高序列同源性的受体框架，在该框架上嫁接CDR，并且评估可以设想的回复突变。更明确地说，判断鉴定出的构架与亲代抗体的每个氨基酸差异对结合剂的结构完整性的影响，并且在适当时引入朝向亲代序列的回复突变。结构评估基于亲代抗体及其人源化版本的Fv区同源性模型，该模型通过内部抗体结构同源性建模工具创建得到，该工具使用Biovia Discovery Studio Environment 4.5版实现。
2.2.2受体框架的选择及其适应
受体框架的选择如下表11所示：
表11：受体框架
Figure BDA0002868662390001351
CDR3后框架区改编自用于重链的人J元件种系IGJH6，并且序列类似于用于轻链的kappa J元件IGKJ2。
基于结构上的考虑，在重链的93位和94位引入从人受体框架到亲代结合剂中的氨基酸的回复突变。
2.2.3所得人源化CEA抗体的VH和VL区
所得人源化CEA抗体的VH结构域可参见下表12，并且所得人源化CEA抗体的VL结构域可参见下表13。
表12：人源化CEA抗体的VH结构域的氨基酸序列(基于人受体框架IGHV3-23或IGHV3-15)
Figure BDA0002868662390001352
Figure BDA0002868662390001361
Figure BDA0002868662390001371
对于重链，发现初始变体3-23A5-1适用于结合测定(但表现出的结合能力略低于亲代鼠抗体)，并且被选作进一步修饰的起点。与人源化变体3-23A5-1相比，基于IGHV3-15的变体表现出更低的结合活性。
为恢复亲代嵌合抗体的全部结合活性，创建了变体3-23A5-1A、3-23A5-1C和3-23A5-1D。还测试了变体3-23A5-1，CDR-H2的长度能否适应人受体序列的，但该构建体完全丧失结合活性。由于CDR-H2(Asn53-Gly54)中存在假定的脱酰胺基热点，我们将该基序改为Asn53-Ala54。另一个可能的热点Asn73-Ser74回复突变为Lys73-Ser74。因此，创建了变体3-23A5-1E。
表13：人源化CEA抗体的VL结构域的氨基酸序列(基于人受体框架IGKV3-11)。
Figure BDA0002868662390001381
轻链基于人IGKV3-11受体框架发生人源化。在系列A5-L1至A5-L4中，了解到变体A5-L1表现出良好的结合活性(但略低于亲代抗体)。CDR-L1的部分人源化(变体A5-L2；Kabat位置30和31处)完全消除了结合。同样，CDR-H2的人源化(变体A5-L3；Kabat位置50至56处)也完全消除了结合。位置90(变体A5-L4)对结合特性具有显著贡献。该位置处的组氨酸对于结合很重要。因此，选择变体A5-L1进行进一步修饰。
系列A5-L1A至A5-L1D解决了恢复亲代嵌合抗体的全部结合潜能所需的回复突变的问题。变体A5-L1A显示，Kabat位置1、2、整个框架2以及Kabat位置71的回复突变未增加任何更多结合活性。变体A5-L1B和A5-L1C定位了那些位置的子集，并确认它们不改变结合特性。在Kabat位置46和47处发生回复突变的变体A5-L1D表现出最佳的结合活性。
2.2.4人源化A5B7抗体的选择
基于VH和VL的新型人源化变体，根据WO 2012/130831 A1中所述的方法，将新型CEA抗体表达为具有效应子沉默Fc(P329G；L234,L235A)的huIgG1抗体，以消除与Fcγ受体的结合；检测它们与MKN45细胞上表达的CEA的结合，并且与相应的亲代鼠A5B7抗体进行比较。
表14：表达为huIgG1_LALA_PG抗体的VH/VL组合
A5-L1A A5-L1B A5-L1C A5-L1D
3-23A5-1A P1AE2164 P1AE2165 P1AE2166 P1AE2167
3-23A5-1C - - P1AE2176 P1AE2177
3-23A5-1D P1AE2179 - P1AE2181 P1AE2182
MKN45(DSMZ ACC 409)是表达CEA的人胃腺癌细胞系。在高级RPMI+2％FCS+1％Glutamax中培养细胞。检查MKN-45细胞的活力，并且细胞重悬并调整至密度为1Mio细胞/ml。将100μl该细胞悬液(含0.1Mio细胞)接种到96孔圆底板中。在400xg下将孔板离心4min，并且除去上清液。然后将40μl稀释的抗体或FACS缓冲液加入细胞中，并且在4℃下孵育30分钟。孵育后，用FACS缓冲液(每孔150μl)洗涤细胞两次。然后将20μl稀释的二级PE抗人Fc特异性二抗(109-116-170,Jackson ImmunoResearch)加入细胞中。将细胞在4℃下再孵育30分钟。为去除未结合的抗体，用FACS缓冲液(每孔150μl)将细胞再洗涤两次。为固定细胞，将100μl FACS缓冲液(含1％PFA)加入孔中。测量前，将细胞重悬于150μl FACS缓冲液中。使用BD流式细胞仪测量荧光。
图7显示了人源化A5B7变体的结合曲线。所有测试的结合剂均能够与MKN45细胞结合，但与亲代A5B7抗体相比，结合能力略有下降。在所有测试的变体中，克隆P1AE2167具有最佳结合力，因此被选择用于进一步开发。
2.2.5使用表面等离子体共振(BIACORE)测定鼠CEA-抗体A5B7的人源化变体的Fab片段对人CEA的亲和力
使用BIACORE T200仪器，通过表面等离子体共振评估鼠CEA抗体A5B7的人源化变体的Fab片段对人CEA的亲和力。在CM5芯片上，通过标准胺偶联将人CEA(hu N(A2-B2)A-avi-His B)以40nM的浓度固定化到流通池2上，持续30s，达到约100RU。随后将鼠CEA抗体A5B7的人源化变体的Fab片段作为分析物(3倍稀释液，浓度范围为500-0.656nM)注入，接触时间为120s，解离时间为250s或1000s，并且流速为30μl/min。通过在60s内2次脉冲注入10mM甘氨酸/HCl(pH 2.0)，实现人CEA(hu N(A2-B2)A-avi-His B)水平的再生。数据针对未固定化的流通池1和零浓度分析物进行双重参考。将分析物的传感图拟合到简单的1:1Langmuir相互作用模型。人CEA(A2结构域)的亲和常数[KD]汇总于下表15中。
表15：代表鼠CEA抗体A5B7的不同人源化变体的Fab片段对人CEA(A2结构域)的亲和常数。
Figure BDA0002868662390001401
鼠CEA抗体A5B7的人源化变体的亲和力低于亲代鼠抗体。选择来源于P1AE2167的Fab片段P1AE4138(重链包含VH变体3-23A5-1A并且Ckappa轻链包含VL变体A5-L1D)作为最终的人源化变体。此外，为去除脱酰胺位点，在VH结构域引入在Kabat位置54(G54A)处的甘氨酸到丙氨酸的突变，从而得到VL变体3-23A5-1E。将最终的人源化抗体(重链包含VH变体3-23A5-1E并且Ckappa轻链包含VL变体A5-L1D)命名为A5H1EL1D或huA5B7。
2.2.6具有与4-1BB的二价结合和与CEA(A5H1EL1D)的单价结合的双特异性抗体的形成和生产
双特异性2+1 H2H抗4-1BB抗CEA huIgG1 P329GLALA抗体按照有关2+1抗4-1BB抗CEA(A5B7)huIgG1 P329GLALA抗体的实例2.1中所述进行生产。
双特异性4-1BB(20H4.9)/CEA(A5H1EL1D)P329GLALA IgG1 2+1(H2H)抗体的氨基酸序列可参见表16。按照实例1.2所述生产并且纯化蛋白质。
表16：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(A5H1EL1D)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001411
Figure BDA0002868662390001421
2.3抗CEA抗体MFE23的人源化变体的形成
2.3.1方法
抗CEA抗体MFE23由例如M.K.Boehm等人(Biochem.J.2000,346,519-528)公开，并且其结构可参见蛋白质结构数据库(PDB)中的PDB ID:11QOK(www.rcsb.org，H.M.Berman等人，The Protein Data Bank，Nucleic Acids Research，2000，28，235-242)。该条目包括重链和轻链可变结构域序列。为鉴定抗CEA结合剂MFE23的人源化过程中的合适的人受体框架，采用一种经典方法，即寻找具有高序列同源性的受体框架，在该框架上嫁接CDR，并且评估可以设想的回复突变。更明确地说，判断鉴定出的构架与亲代抗体的每个氨基酸差异对结合剂的结构完整性的影响，并且在适当时引入朝向亲代序列的回复突变。结构评估基于亲代抗体及其人源化版本的Fv区同源性模型，该模型通过内部抗体结构同源性建模工具创建得到，该工具使用Biovia Discovery Studio Environment 4.5版实现。
为提高回复突变选择的可信度，我们鉴定该抗体可能源自的最接近的鼠源同源序列。我们从中寻找在该抗体在鼠B细胞成熟过程中发生了广泛的体细胞高频突变的位置。这些突变对于渗入到人源化构建体中可能非常重要。
2.3.2受体框架的选择及其适应
受体框架的选择如下表17所示：
表17：受体框架
Figure BDA0002868662390001431
CDR3后框架区改编自用于重链的人J元件种系IGHJ4-01，并且序列类似于用于轻链的kappa J元件IGKJ4-01。基于结构上的考虑，在重链的Kabat 71位和93位引入从人受体框架到亲代结合剂中的氨基酸的回复突变。基于对鼠种系的构架突变(得到最终成熟的MFE23序列)的重要性的考虑，将VH的Kabat 94位残基改回鼠序列。
为评估MFE23序列的亲和力和/或稳定性的进一步改善，我们在轻链序列中渗入了以下突变：Phe26Leu、Ser30Pro或Tyr、Leu78Val，如C.P.Graff等人(Protein Engineering,Design&Selection 2004,17(4),293-304)所述。
2.3.3所得人源化CEA抗体的VH和VL结构域
所得人源化CEA抗体的VH结构域可参见下表18，并且所得人源化CEA抗体的VL结构域可参见下表19。
表18：人源化CEA抗体的VH结构域的氨基酸序列(基于人受体框架IGHV1-2-02)
Figure BDA0002868662390001441
表19：人源化CEA抗体的VL结构域的氨基酸序列(基于人受体框架IGKV1-39-01)
Figure BDA0002868662390001451
图8分别显示了表18和19所列的序列的比对。
用包含P239G、L234A和L235A突变以消除与Fcγ受体的结合的人IgG1的恒定重链或恒定轻链，将编码人源化CEA结合剂的6条重链和6条轻链DNA序列的可变区亚克隆到框架中(WO 2012/130831 A1)。按照以下所述生产抗体。测试所得36种变体(表20)在MKN45细胞上的结合；并且选择7种变体进行进一步开发。
表20：表达为huIgG1_LALA_PG抗体的VH/VL组合的命名
MFE-L24 MFE-L25 MFE-L26 MFE-L27 MFE-L28 MFE-L29
MFE-H24 P1AE3125 P1AE3119 P1AE3113 P1AE3107 P1AE3101 P1AE3095
MFE-H25 P1AE3124 P1AE3118 P1AE3112 P1AE3106 P1AE3100 P1AE3094
MFE-H26 P1AE3123 P1AE3117 P1AE3111 P1AE3105 P1AE3099 P1AE3093
MFE-H27 P1AE3122 P1AE3116 P1AE3110 P1AE3104 P1AE3098 P1AE3092
MFE-H28 P1AE3121 P1AE3115 P1AE3109 P1AE3103 P1AE3097 P1AE3091
MFE-H29 P1AE3120 P1AE3114 P1AE3108 P1AE3102 P1AE3096 P1AE3090
2.3.4人源化MFE23抗体的选择
将36种人源化MFE23 huIgG1 P329G LALA变体对MKN45细胞上表达的CEA的结合与相应的亲代鼠MFE23 huIgG1 P329G LALA抗体进行比较。17种克隆丧失与表达人CEACAM5的MKN45细胞的结合能力(图9A)。与亲代克隆MFE23相比，8种克隆的结合力降低(图9B)。与亲代克隆MFE23相比，11种克隆的结合力类似(图9C)。这些结合曲线的拟合EC50值以及曲线下面积(AUC)如表21所示。
表21：不同人源化MFE23 huIgG1 P329G LALA抗体的结合曲线的EC50和曲线下面积(AUC)显示在图8A、8B和8C中
Figure BDA0002868662390001461
Figure BDA0002868662390001471
2.3.5具有与4-1BB的二价结合和与人源化CEA(MFE23)结合剂的单价结合的双特异性抗体的形成和生产
双特异性2+1 H2H抗4-1BB抗CEA huIgG1 P329GLALA抗体按照有关2+1抗4-1BB抗CEA(MFE23)huIgG1 P329GLALA抗体的实例2.1中所述进行生产。
双特异性4-1BB(20H4.9)/CEA(huMFE23-L28-H24)P329GLALA IgG12+1(H2H)抗体的氨基酸序列可参见表22，并且4-1BB(20H4.9)/CEA(huMFE23-L28-H28)P329GLALA IgG1 2+1(H2H)抗体的氨基酸序列可参见表23。按照实例1.2所述生产并且纯化蛋白质。其他双特异性构建体显示在表24至28中。
表22：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(huMFE23-L28-H24)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001481
表23：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(huMFE23-L28-H28)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001491
表24：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(huMFE23-L28-H25)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001501
表25：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(huMFE23-L27-H29)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001511
表26：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(huMFE23-L27-H28)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001521
表27：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(huMFE23-L27-H26)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001522
Figure BDA0002868662390001531
表28：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CEA(huMFE23-L27-H24)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001532
Figure BDA0002868662390001541
按照实例1.2所述进行双特异性抗体的生产。获得的产物的示例性分析见下表29。
表29-2+1 H2H抗4-1BB、抗CEA huIgG1 PGLALA双特异性抗体的生化分析
Figure BDA0002868662390001542
实例3
具有与4-1BB的二价结合和与CD19的单价结合的双特异性抗体的制备、纯化和表征
2.1具有与4-1BB的二价结合和与CD19的单价结合的双特异性抗体的形成和生产
还可通过将抗FAP交叉Fab取代为抗CD19交叉Fab，制备具有与4-1BB的二价结合和与CEA的单价结合的双特异性激动性4-1BB抗体。这种构建体也称为头对头(H2H)2+1形式。
CD19结合剂克隆2B11的形成和制备描述于WO 2017/055328 A1中。2+1 H2H二价双特异性4-1BB(20H4.9)x CD19(2B11)P329GLALA IgG1 2+1(H2H)抗体huIgG1 PGLALA的氨基酸序列可参见下表30。
表30：双特异性二价抗4-1BB/单价抗CD19(2B11)人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001551
Figure BDA0002868662390001561
实例4
具有与FAP单价结合的2+1 H2H双特异性激动性4-1BB抗原结合分子的功能表征
4.1表面等离子体共振(同时结合)
利用表面等离子体共振(SPR)评估同时结合到人4-1BB Fc(kih)和人FAP的能力。所有SPR实验均采用Biacore T200，在25℃下使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。通过胺偶联将人4-1BB Fc(kih)直接偶联至流通池(CM5传感器芯片)。所用的固定化水平为710共振单位(RU)。
使2+1 H2H抗4-1BB/抗FAP huIgG1 PGLALA构建体以200nM的浓度在30μL/min的流速下在90秒内通过流通池，并且将解离设置为0秒。将人FAP作为第二分析物以500nM的浓度在30μL/min的流速在90秒内注入流通池(参见图2A中的测定设置)。监测解离120秒。通过扣除在蛋白质未固定化的参比流通池中获得的应答，校正本体折射率差异。
从图2B中可以看出，2+1 H2H 4-1BB(20H4.9)/FAP(4B9)P329GLALA IgG1抗体构建体可同时结合人4-1BB和人FAP。
4.2利用TagLite实施竞争测定以确认与hu4-1BB的二价结合
为确认双特异性2+1 H2H抗4-1BB，抗FAP huIgG1 P329GLALA抗体与hu 4-1BB的二价结合，使用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)(称为TagLite)进行竞争测定。
d2标记的4-1BB(克隆20H4.9)IgG1与转染的Hek细胞上表达的Tb标记的hu4-1BB-SNAP的结合产生TR-FRET信号。在竞争测定中，将结合的d2标记的4-1BB(克隆20H4.9)IgG1取代为未标记的2+1 H2H 4-1BB(20H4.9)/FAP(4B9)P329GLALA IgG1抗体(针对4-1BB的Fab之一无游离N末端)或未标记的2+1 VH/VL(C末端)4-1BB(20H4.9)/FAP(4B9)P329GLALAIgG1抗体(针对4-1BB的两个“游离Fab”)后，导致TR-FRET信号降低(表31)。
表31：竞争测定中所用的样品
Figure BDA0002868662390001571
简言之，将预标记的表达Tb hu4-1BB-SNAP的细胞解冻，洗涤，并且以每孔5000个细胞(10μL)的密度与5μL带有受体(d2)标记的4-1BB(克隆20H4.9)IgG1(浓度为0.6nM)和5μL未标记的竞争构建体(1:3稀释液，浓度范围为0.006-1000nM)混合；在384孔板中的最终体积为20μL。在RT下染色0h、2h和4h后，测量荧光供体(Tb)在620nm处的荧光信号并且测量荧光受体(d2)在665nm处的荧光信号(M1000 Pro,Tecan)。计算665/620×10000(R)的比率，并且减去参比(仅细胞)的比率，得出绘制的ΔR值。为确定IC50，在Graph Pad Prism6中使用单个位点-拟合log IC50对结果进行分析(表32)。重复测定两次。
表32：4h后的Ki值与95％置信区间
Figure BDA0002868662390001581
结果表明，两种4-1BB FAP双特异性构建体均可与4-1BB(克隆20H4.9)IgG相似地竞争结合hu4-1BB(IC50相似)。这表明双特异性2+1H2H抗4-1BB，抗FAP huIgG1 P329GLALA抗体的针对4-1BB的两个Fab臂均可结合到4-1BB。因此，2+1 H2H 4-1BB(20H4.9)/FAP(4B9)huIgG1 P329GLALA抗体可二价结合到4-1BB(图3)。
4.3与表达人FAP的细胞系的结合
为测试与细胞表面表达的人成纤维细胞活化蛋白(FAP)的结合，使用NIH/3T3-huFAP克隆19细胞。通过在CMV启动子存在下用编码人FAP的表达pETR4921质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)，形成NIH/3T3-huFAP克隆19。将细胞维持在补充有胎牛血清(FBS，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号16000-044，批号941273，经γ射线照射，无支原体，热灭活)、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(Gluta-MAX-I，由LifeTechnologies提供的GIBCO，目录号35050-038)和1.5μg/mL嘌呤霉素(InvivoGen，目录号ant-pr-5)的DMEM(由Life Technologies提供的GIBCO，目录号42340-025)中。在结合测定中，将2×105的NIH/3T3-huFAP克隆19细胞加入圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one，cellstar，目录号650185)的各个孔中。将细胞用200μL DPBS洗涤一次，然后将沉淀重悬于100μL/孔的4℃的冷DPBS缓冲液(包含1:5000稀释的可固定活性染料eFluor 450(eBioscience，目录号65 0863 18))中。将孔板在4℃下孵育30分钟，然后用200μL 4℃的冷DPBS缓冲液洗涤一次。然后，将细胞重悬于50μL/孔的4℃的冷FACS缓冲液中，其包含不同滴定浓度的具有与FAP单价结合的2+1 H2H双特异性激动性4-1BB(20H4.9)/FAP(4B9)P329GLALA抗体(也称为抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)2+1 H2H)或对照分子，然后在4℃下于暗处孵育1小时。用200μL DPBS/孔洗涤四次后，在4℃下用50μL/孔的4℃的冷FACS缓冲液将细胞染色30分钟，其包含2.5μg/mL PE-缀合AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)。将细胞用200μL 4℃的DPBS缓冲液洗涤两次，然后重悬于50μL/孔的含1％甲醛的DPBS中进行固定。将同一天或第二天的细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，并且使用MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotec)进行采集。
如图4所示，相比于非靶向FAP的hu IgG1 P293G LALA形式，FAP靶向分子与表达人FAP的NIH/3T3-huFAP克隆19细胞高效结合。因此，N末端融合抗FAP交叉Fab(黑色实心圆形和线条)与FAP的亲和力高于C末端融合抗FAP VH/VL结构域(灰色实心正方形和虚线)。这反映在2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)huIgG1 P329GLALA抗体的EC50较低，并且饱和时较高的gMFI导致更高的曲线下面积(AUC)值。拟合EC50值和曲线下面积值列于表33中，并且拟合AUC值列于表34中。
表33：与表达FAP的细胞系NIH/3T3-huFAP克隆19的结合的EC50值
Figure BDA0002868662390001591
表34：与表达FAP的细胞系NIH/3T3-huFAP克隆19的结合的曲线下面积(AUC)值
Figure BDA0002868662390001592
Figure BDA0002868662390001601
4.4与表达人4-1BB的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2的结合
为测定与细胞表面表达的人4-1BB(CD137)的结合，使用Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系(Promega,Germany)。将细胞作为悬浮细胞维持在RPMI 1640培养基(由Life Technologies提供的GIBCO，目录号42401-042)中，其补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号16000-044，批号941273，经γ射线照射，无支原体，热灭活)、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(Gluta-MAX-I，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号35050-038)、1mM丙酮酸钠(SIGMA-Aldrich，目录号S8636)和1％(v/v)MEM-非必需氨基酸溶液100x(SIGMA-Aldrich，目录号M7145)、600μg/ml G-418(Roche，目录号04727894001)、400μg/ml潮霉素B(Roche，目录号10843555001)和25mM HEPES(SigmaLife Sience，目录号H0887-100 mL)。在结合测定中，将2×105的Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2加入圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one，cellstar，目录号650185)的各个孔中。将细胞用200μL DPBS洗涤一次，然后将沉淀重悬于100μL/孔的4℃的冷DPBS缓冲液(包含1:5000稀释的可固定活性染料eFluor 450(eBioscience，目录号65 0863 18))中。将孔板在4℃下孵育30分钟，然后用200μL 4℃的冷DPBS缓冲液洗涤一次。然后，将细胞重悬于50μL/孔的4℃的冷FACS缓冲液中，其包含不同滴定浓度的2+1 H2H激动性抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)huIgG1 P329GLALA抗体或对照分子，然后在4℃下于暗处孵育1小时。用200μL DPBS/孔洗涤四次后，在4℃下用50μL/孔的4℃的冷FACS缓冲液将细胞染色30分钟，其包含2.5μg/mL PE-缀合AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊F(ab')2片段(JacksonImmunoResearch，目录号109-116-098)。将细胞用200μL 4℃的DPBS缓冲液洗涤两次，然后重悬于50μL/孔的含1％甲醛的DPBS中进行固定。将同一天或第二天的细胞重悬于100μLFACS缓冲液中，并且使用MACSQuant Analyzer X(Miltenyi Biotec)进行采集。
如图5所示，2+1 H2H激动性抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)huIgG1 P329GLALA抗体与4-1BB的结合类似于其对照抗4-1BB(20H4.9)huIgG1 P329G LALA。因此，抗FAP交叉Fab的N末端头对头融合不影响与4-1BB的结合。结合曲线的EC50值和AUC分别列于表35和表36中。
表35：图5所示的与细胞表达的人4-1BB的结合曲线的EC50值总结
Figure BDA0002868662390001611
表36：图5所示的与细胞表达的人4-1BB的结合曲线的AUC值总结
Figure BDA0002868662390001612
4.5在表达人4-1BB和NFκB-荧光素酶报告基因的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NF-κB活化
4-1BB(CD137)受体与其配体(4-1BBL)的激动性结合通过活化核因子kappa B(NFkB)诱导4-1BB下游信号传导，并且促进CD8 T细胞的存活和活性(Lee HW,Park SJ,ChoiBK,Kim HH,Nam KO,Kwon BS.4-1BB promotes the survival of CD8(+)T lymphocytesby increasing expression of Bcl-x(L)and Bfl-1.J Immunol 2002；169:4882-4888)。为监测由2+1 H2H抗4-1BB，抗FAP huIgG1 PGLALA双特异性抗体介导的NFκB活化，从Promega(Germany)购得Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系。细胞培养方法如上文所述(与表达人4-1BB的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2的结合)。在测定中，收获细胞并将其重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的测定培养基RPMI 1640培养基中。将10μL含有2×103Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2的报告细胞转移至带顶盖的无菌白色384孔平底组织培养板的各个孔中(Corning，目录号3826)。加入10μL测定培养基，其包含滴定浓度的具有与FAP单价结合的2+1 H2H双特异性激动性抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)huIgG1 P329GLALA抗体(也称为抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)2+1 H2H)或对照分子。最后，提供10μL单独的测定培养基或包含1×104表达FAP的细胞(人黑素瘤细胞系WM-266-4(ATCCCRL-1676)或NIH/3T3-huFAP克隆19(如上文所述)的培养基，并且将孔板置于细胞培养箱中在37℃和5％CO2下孵育6小时。向各个孔中加入6μl新鲜解冻的One-Glo荧光素酶测定检测溶液(Promega，目录号E6110)，并且使用Tecan酶标仪(积分时间为500ms，无滤光片，采集所有波长的信号)立即测量发光强度。
如图6所示，在不存在表达FAP的细胞的情况下，没有分子能够诱导Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系中强烈的人4-1BB受体活化，从而导致NFkB活化和荧光素酶表达。在存在表达FAP的细胞例如WM-266-4(人黑素瘤细胞系，中等FAP表达水平)或NIH/3T3-huFAP克隆19(人FAP转基因小鼠成纤维细胞系)的情况下，双特异性2+1抗4-1BB x抗FAPhuIgG1 PGLALA抗体(2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)抗体，黑色实心圆形和线条，或2+1 VH/VL抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)抗体，灰色实心正方形和虚线)的交联导致Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系中NFkB活化的荧光素酶活性大大增加，高于非靶向对照抗4-1BB(20H4.9)x非靶向(DP47)2+1 VH/VL(空心灰色正方形和小虚线)所介导的活化。因此，双特异性2+1 H2H抗4-1BB x抗FAP huIgG1 P329GLALA抗体(抗4-1BB(20H4.9)x抗FAP(4B9)2+1 H2H，黑色实心圆形和线条)显示活化程度略高(EC50值较低)，可能反映出对FAP具有更高的亲和力。活化曲线的EC50值和曲线下面积(AUC)列于表37和表38中。
表37：图6所示的活化曲线的EC50值
Figure BDA0002868662390001621
表38：图6所示的活化曲线的曲线下面积(AUC)值
Figure BDA0002868662390001631
实例5
具有与CEA单价结合的2+1 H2H双特异性激动性4-1BB抗原结合分子的功能表征
5.1表面等离子体共振(同时结合)
利用表面等离子体共振(SPR)评估同时结合以NABA构建体形式的人4-1BB Fc(kih)和人CEA的能力。所有SPR实验均采用Biacore T200，在25℃下使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。通过胺偶联将人N(A2B2)A或(NA1)BA蛋白直接偶联至CM5芯片的流通池。所用的固定水平为约600RU。
使CEA靶向4-1BB激动剂构建体以200nM的浓度在30μL/min的流速下在90秒内通过流通池，并且将解离设置为0秒。将人4-1BB Fc(kih)作为第二分析物以500nM的浓度在30μL/min的流速在90秒内注入流通池(图10A)。监测解离120秒。通过扣除在蛋白质未固定化的参比流通池中获得的应答，校正本体折射率差异。
从图10B和10C中可以看出，2+1 H2H 4-1BB(20H4.9)/CEA(A5B7)P329GLALA IgG1和2+1 H2H 4-1BB(20H4.9)/CEA(A5H1EL1D)huIgG1 P329GLALA可同时结合人CEA(呈N(A2B2)A构建体的形式)和人4-1BB。图10D示出同时结合人CEA(呈(NA1)BA构建体的形式)和人4-1BB的2+1 H2H 4-1BB(20H4.9)/CEA(MFE23)huIgG1 P329GLALA。
5.2与表达食蟹猴和人CEACAM5的细胞系的结合
形成表达食蟹猴CEACAM5或人CEACAM5的第一细胞系。将编码人和食蟹猴CEACAM5的全长cDNA亚克隆到哺乳动物表达载体中。使用Lipofectamine LTX试剂(Invitrogen,#15338100)，按照生产商的方案，将质粒转染到CHO-K1(ATCC CRL-9618)细胞中。将稳定转染的CEACAM5阳性CHO细胞维持在DMEM/F-12培养基(由Life Technologies提供的GIBCO，#11320033)中，其补充有10％胎牛血清(FBS，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号16000-044，批号941273，经γ射线照射，无支原体，热灭活)和2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(Gluta-MAX-I，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号35050-038)。转染后两天，加入嘌呤霉素(Invivogen；#ant-pr-1)，使其浓度达到6μg/mL，并且将细胞培养数代。经过初步筛选后，利用BD FACSAria II细胞分选仪(BD Biosciences)对具有人和食蟹猴CEACAM5的高细胞表面表达的细胞进行分选(检测抗体抗CD66克隆CD66AB.1.1)，并且培养以确定稳定的细胞克隆。通过流式细胞术分析确认4周内的表达水平和稳定性。在结合测定中，收获CHO-k1-cynoCEACAM5克隆8、CHO-k1-huCEACAM5克隆11、CHO-k1-huCEACAM5克隆12或CHO-k1-huCEACAM5克隆13，并且用DPBS(由Life Technologies提供的GIBCO，#14190-136)进行洗涤，在含有可固定活性染料eF450(eBioscience#65-0863-18)的DPBS中于4℃下染色30分钟。将细胞洗涤，并且以3×104细胞/孔的密度接种到384孔板(Corning#3830)中。对细胞进行离心(350xg,5min)，除去上清液，并且将细胞重悬于10μL/孔的FACS缓冲液(DPBS，补充有2％FBS、5nM EDTA、7.5mM叠氮化钠)，其包含滴定浓度为2+1 H2H双特异性激动性4-1BB(20H4.9)x CEA huIgG1 P329GLALA抗体或对照(起始浓度300nM)。将细胞在4℃下孵育30min，然后用80μL/孔DPBS洗涤两次。在4℃下，将细胞重悬于10μL/孔的FACS缓冲液中30分钟，其包含2.5μg/mL的PE-缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)。将细胞用80μL/孔的DPBS洗涤两次，然后在包含1％的甲醛的30μL/孔的DPBS中固定至少15分钟。将同一天或第二天的细胞重悬于50μL孔的FACS缓冲液中，并且使用MACSQuant Analyzer X(Miltenyi Biotec)进行采集。
如图12A至12D所示，2+1 H2H双特异性激动性4-1BB(20H4.9)x CEA huIgG1P329GLALA抗体相比于非CEA靶向huIgG1 P293G LALA形式，与表达人CEACAM5的CHO-k1克隆12和克隆13细胞高效结合。相比之下，仅2+1 H2H双特异性激动性4-1BB(20H4.9)x CEA(A5B7)huIgG1 P329GLALA抗体与表达食蟹猴CEACAM5的CHO-k1-cynoCEACAM5细胞系结合良好。2+1 H2H双特异性激动性4-1BB(20H4.9)x CEA(A5H1EL1D)huIgG1 P329GLALA抗体与表达食蟹猴CECAM5的CHO-k1-cynoCEACAM5的结合非常弱，而2+1 H2H双特异性激动性4-1BB(20H4.9)x CEA(MFE23)huIgG1 P329GLALA抗体不与CHO-k1-cynoCEACAM5结合，因为MFE23克隆无人/食蟹猴交叉反应性。拟合EC50值和曲线下面积值列于表39中，并且拟合AUC值列于表40中。
表39：图9所示的与表达CEACAM5的细胞系的结合的EC50值
Figure BDA0002868662390001651
表40：图9所示的与表达CEACAM5的细胞系的结合的曲线下面积(AUC)值
Figure BDA0002868662390001661
5.3在表达人4-1BB和NFκB-荧光素酶报告基因的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NFκB活化
4-1BB(CD137)受体与其配体(4-1BBL)的激动性结合通过活化核因子kappa B(NFκB)诱导4-1BB下游信号传导，并且促进CD8 T细胞的存活和活性(Lee HW,Park SJ,Choi BK,Kim HH,Nam KO,Kwon BS.4-1BB promotes the survival of CD8(+)T lymphocytes byincreasing expression of Bcl-x(L)and Bfl-1.J Immunol 2002；169:4882-4888)。为监测由2+1 H2H抗4-1BB，抗CEA huIgG1 PGLALA双特异性抗体介导的NFκB活化，从Promega(Germany)购得Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系。细胞培养方法如上文所述。在测定中，收获细胞并将其重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的测定培养基RPMI1640培养基中。将10μL含有2×103Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2的报告细胞转移至带顶盖的无菌白色384孔平底组织培养板的各个孔中(Corning，目录号3826)。加入10μL测定培养基，其包含滴定浓度为的具有与CEA单价结合的2+1 H2H双特异性激动性抗4-1BB(20H4.9)x抗CEA huIgG1 P329GLALA抗体(不同克隆，例如A5B7、A5H1EL1D或MFE23)或对照分子。最后，提供10μL单独测定培养基或包含1×104细胞的不同CHO-k1细胞(经食蟹猴或人CEACAM5转染)的培养基，并且将孔板置于细胞培养箱中在37℃和5％CO2下孵育6小时。向各个孔中加入6μl新鲜解冻的One-Glo荧光素酶测定检测溶液(Promega，目录号E6110)，并且使用Tecan酶标仪(积分时间为500ms，无滤光片，采集所有波长的信号)立即测量发光强度。
如图13A至13D所示，在不存在表达CEACAM5的细胞的情况下，没有分子能够诱导Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系中强烈的人4-1BB受体活化，从而导致NFkB活化和荧光素酶表达。在存在表达人CEACAM5的细胞(例如CHO-k1-人CEACAM5克隆11和CHO-k1-人CEACAM5克隆12)的情况下，双特异性2+1抗4-1BB，抗CEA huIgG1 PGLALA抗体(2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗CEA(MFE23)抗体，黑色实心圆形和虚线，或2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗CEA(A5B7)抗体，黑色实心菱形和线条，或2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗CEA(A5H1EL1D)抗体，灰色向下三角形)的交联导致Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系中NFkB活化的荧光素酶活性大大增加，高于非靶向对照抗4-1BB(20H4.9)huIgG1 P329GLALA(空心灰色正方形和虚线)所介导的活化。在存在CHO-k1-cynoCEACAM5克隆8的情况下，仅2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗CEA(A5B7)huIgG1 P329GLALA抗体(黑色实心菱形和线条)和2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗CEA(A5H1EL1D)huIgG1 P329GLALA抗体(灰色向下三角形)诱导Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系中NFkB活化的荧光素酶活性大大增加，但2+1 H2H抗4-1BB(20H4.9)x抗CEA(MFE23)huIgG1 P329GLALA抗体(黑色实心圆形和虚线)无此诱导作用，因为MFE23结合剂无人/食蟹猴交叉反应性。
活化曲线的EC50值和曲线下面积(AUC)列于表41和表42中。
表41：图10所示的活化曲线的EC50值
Figure BDA0002868662390001681
表42：图10所示的活化曲线的曲线下面积(AUC)值
Figure BDA0002868662390001682
实例6
具有与4-1BB的二价结合和与PD-L1的单价结合的双特异性抗体的制备、纯化和表征
2.1具有与4-1BB的二价结合和与PD-L1的单价结合的双特异性抗体的形成和生产
还可通过将抗FAP交叉Fab取代为抗PD-L1交叉Fab，制备具有与4-1BB的二价结合和与PD-L1的单价结合的双特异性激动性4-1BB抗体。这种构建体也称为头对头(H2H)2+1形式。
该构建体的第一重链HC1由以下组分组成：抗4-1BB结合剂(克隆20H4.9)的VHCH1，后接Fc孔。第二重链HC2由后接抗4-1BB(克隆20H4.9)的VHCH1和Fc突起的抗PD-L1结合剂(克隆YW243.55.S70，呈交叉Fab的形式)的VLCH1以及组成。PD-L1结合剂YW243.55.S70描述于WO 2010/077634中。对于4-1BB结合剂，根据US 7,288,638 B2或US 7,659,384 B2获得克隆20H4.9的VH和VL序列。两条重链结合形成异二聚体，其包括一个PD-L1结合交叉Fab和两个4-1BB结合Fab(图1E)。与4-1BB单价结合的另一种异二聚体由包含抗4-1BB结合剂(克隆20H4.9)的VHCH1的第一重链HC1(后接Fc孔)以及包含抗PD-L1结合剂(克隆YW243.55.S70，呈交叉Fab形式)的VLCH1的第二重链HC2(后接Fc突起)形成(图1F)。
为改善正确配对，在抗4-1BB Fab分子的CH-CL中引入以下突变：CL中的E123R和Q124K以及CH1中的K147E和K213E。抗PD-L1结合剂的第二轻链LC2由VHCL(交叉Fab)组成。应用突起进入孔技术，通过在第一重链HC1(Fc孔重链)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突变并且通过在第二重链HC2(Fc突起重链)中引入S354C/T366W突变以形成异二聚体。
此外，根据国际专利申请公开号WO2012/130831A1中所述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入突起和孔重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
双特异性2+1 H2H抗4-1BB抗PD-L1 huIgG1 P329GLALA抗体按照有关2+1抗4-1BB抗FAP huIgG1 P329GLALA抗体的实例1.2中所述进行生产。
双特异性4-1BB(20H4.9)/PD-L1 P329GLALA IgG1 2+1(H2H)抗体的氨基酸序列可参见表43，而双特异性4-1BB(20H4.9)/PD-L1 P329GLALA IgG1 1+1抗体的氨基酸序列可参见表44。
按照实例1.2所述生产并且纯化蛋白质。
表43：双特异性二价抗4-1BB/单价抗PD-L1人IgG1 P329GLALA抗体(2+1 H2H)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001701
Figure BDA0002868662390001711
表44：双特异性单价抗4-1BB/单价抗PD-L1人IgG1 P329GLALA抗原结合分子(1+1)的氨基酸序列
Figure BDA0002868662390001712
按照实例1.2所述进行双特异性抗体的生产。获得的产物的示例性分析见下表45。
表45-抗4-1BB、抗PD-L1 huIgG1 PGLALA的生化分析
Figure BDA0002868662390001713
Figure BDA0002868662390001721
实例7
具有与PD-L1的单价结合的2+1 H2H双特异性激动性4-1BB抗原结合分子的功能表征
7.1表面等离子体共振(同时结合)
利用表面等离子体共振(SPR)评估同时结合到人4-1BB Fc(kih)和人PD-L1的能力。所有SPR实验均采用Biacore T200，在25℃下使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPESpH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。通过胺偶联将人4-1BB-Fc(kih)蛋白直接偶联至CM5芯片的流通池。所用的固定水平为约900RU。
使PD-L1靶向4-1BB激动剂构建体以150nM的浓度在10μL/min的流速下在90秒内通过流通池，并且将解离设置为0秒。将人PD-L1-Fc(重组人PD-L1/B7-H1 Fc嵌合蛋白，156-B7-100：R&D Systems)作为第二分析物以200nM的浓度在30μL/min的流速在90秒内注入流通池(图14A)。监测解离240秒。通过扣除在蛋白质未固定化的参比流通池中获得的应答，校正本体折射率差异。
从图14B和14C中可以看出，2+1H2H和the 1+1 4-1BB(20H4.9)/PD-L1人IgG1PGLALA抗体可同时结合人PD-L1和人4-1BB抗体。
7.2与表达人PD-L1的细胞系的结合
形成表达人PD-L1的第一细胞系。将编码人PD-L1的全长cDNA亚克隆到哺乳动物表达载体中。使用Lipofectamine LTX试剂(Invitrogen,#15338100)，按照生产商的方案，将质粒转染到MKN45(DSMZ 409)细胞中。将稳定转染的PD-L1阳性PD-L1细胞维持在RPMI 1640培养基(由Life Technologies提供的GIBCO，目录号42401-042)中，其补充有10％胎牛血清(FBS，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号16000-044，批号941273，经γ射线照射，无支原体，热灭活)、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(Gluta-MAX-I，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号35050-038)以及可选的200μg/mL潮霉素B(Roche，目录号10843555001)和1.5μg/mL嘌呤霉素(由Life Technologies提供的GIBCO，目录号A11138-02)。在结合测定中，收获MKN45细胞和MKN45-huPD-L1，用DPBS(由Life Technologies提供的GIBCO，#14190-136)进行洗涤，在含有可固定活性染料eF450(eBioscience#65-0863-18)的DPBS中于4℃下染色30分钟。将细胞洗涤，并且以3×104细胞/孔的密度接种到384孔板(Corning#3830)中。对细胞进行离心(350xg,5min)，除去上清液，并且将细胞重悬于10μL/孔的FACS缓冲液(DPBS，补充有2％FBS、5nM EDTA、7.5mM叠氮化钠)，其包含滴定浓度的2+1H2H双特异性激动性4-1BB(20H4.9)x PD-L1 huIgG1P329GLALA、1+1双特异性激动性4-1BB(20H4.9)x PD-L1 huIgG1P329GLALA抗体或对照(起始浓度300nM)。将细胞在4℃下孵育30min，然后用80μL/孔DPBS洗涤两次。在4℃下，将细胞重悬于10μL/孔的FACS缓冲液中30分钟，其包含2.5μg/mL的PE-缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)。将细胞用80μL/孔的DPBS洗涤两次，然后在包含1％的甲醛的30μL/孔的DPBS中固定至少15分钟。将同一天或第二天的细胞重悬于50μL孔的FACS缓冲液中，并且使用MACSQuant Analyzer X(Miltenyi Biotec)进行采集。
如图15B所示，2+1 H2H双特异性激动性4-1BB(20H4.9)x PD-L1huIgG1 P329GLALA抗体(黑色三角形和线条)和1+1双特异性激动性4-1BB(20H4.9)x PD-L1(灰色三角形和线条)相比于非PD-L1靶向huIgG1 P293GLALA形式，与表达人PD-L1的MKN45-huPD-L1细胞高效结合，但不与亲代细胞系MKN45结合。拟合EC50值和曲线下面积值列于表46中，并且拟合AUC值列于表47中。
表46：图15B所示的与表达PD-L1的细胞系的结合的EC50值
Figure BDA0002868662390001731
Figure BDA0002868662390001741
表47：图15B所示的与表达PD-L1的细胞系的结合的曲线下面积(AUC)值
Figure BDA0002868662390001742
7.3在表达人4-1BB和NFκB-荧光素酶报告基因的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NF-κB活化
4-1BB(CD137)受体与其配体(4-1BBL)的激动性结合通过活化核因子kappa B(NFkB)诱导4-1BB下游信号传导，并且促进CD8 T细胞的存活和活性(Lee HW,Park SJ,ChoiBK,Kim HH,Nam KO,Kwon BS.4-1BB promotes the survival of CD8(+)T lymphocytesby increasing expression of Bcl-x(L)and Bfl-1.J Immunol 2002；169:4882-4888)。为监测由2+1 H2H抗4-1BB x抗PD-L1 huIgG1 PGLALA双特异性抗体介导的NFκB活化，从Promega(Germany)购得Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系。细胞培养方法如上文所述。在测定中，收获细胞并将其重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的测定培养基RPMI 1640培养基中。将10μL含有2×103Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2的报告细胞转移至带顶盖的无菌白色384孔平底组织培养板的各个孔中(Corning，目录号3826)。加入10μL测定培养基，其包含滴定浓度的2+1 H2H双特异性激动性抗4-1BB(20H4.9)x抗PD-L1huIgG1 P329GLALA抗体、1+1双特异性激动性抗4-1BB(20H4.9)x抗PD-L1 huIgG1P329GLALA抗体或对照分子。最后，提供10μL单独的测定培养基或包含1×104个细胞的亲代MKN45或MKN45细胞(经人PD-L1转染)的测定培养基，并且将孔板置于细胞培养箱中在37℃和5％CO2下孵育6小时。向各个孔中加入6μl新鲜解冻的One-Glo荧光素酶测定检测溶液(Promega，目录号E6110)，并且使用Tecan酶标仪(积分时间为500ms，无滤光片，采集所有波长的信号)立即测量发光强度。
如图16A至16C所示，在不存在表达PD-L1的细胞的情况下，没有分子能够诱导Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系中强烈的人4-1BB受体活化，从而导致NFkB活化和随后荧光素酶表达。在存在表达人PD-L1的MKN45细胞的情况下，双特异性2+1 H2H抗4-1BB，抗PD-L1 huIgG1 PGLALA抗体(黑色三角形和线条)或双特异性1+1抗4-1BB，抗PD-L1huIgG1 PGLALA抗体(灰色三角形和线条)的交联导致Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系中NFkB活化的荧光素酶活性大大增加，高于非靶向对照抗4-1BB(20H4.9)huIgG1P329GLALA(实心灰色圆形和线条)所介导的活化。活化曲线的EC50值和曲线下面积(AUC)列于表48和表49中。
表48：图16B所示的活化曲线的EC50值
Figure BDA0002868662390001751
表49：图16B所示的活化曲线的曲线下面积(AUC)值
Figure BDA0002868662390001752
***
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 新型双特异性激动性 4-1BB 抗原结合分子
<130> P34875-WO
<150> EP18181652.1
<151> 2018-07-04
<160> 196
<170> PatentIn 3.5 版
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-H1
<400> 1
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-H2
<400> 2
Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-H3
<400> 3
Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-L1
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-L2
<400> 5
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) CDR-L3
<400> 6
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ala Leu Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) VH
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB (20H4.9) VL
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H1
<400> 9
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H2
<400> 10
Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H3
<400> 11
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L1
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L2
<400> 13
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L3
<400> 14
Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H1
<400> 15
Ser His Ala Met Ser
1 5
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H2
<400> 16
Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H3
<400> 17
Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr
1 5
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L1
<400> 18
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L2
<400> 19
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L3
<400> 20
Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr
1 5
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VH
<400> 21
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VL
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VH
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VL
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5B7)- CDR-H1
<400> 25
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5B7)- CDR-H2
<400> 26
Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5B7)- CDR-H3
<400> 27
Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5B7)- CDR-L1
<400> 28
Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5B7)- CDR-L2
<400> 29
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5B7)- CDR-L3
<400> 30
Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
1 5
<210> 31
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5B7) VH （亲代）
<400> 31
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5B7) VL （亲代）
<400> 32
Gln Thr Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE23)- CDR-H1
<400> 33
Asp Ser Tyr Met His
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE23)- CDR-H2
<400> 34
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE23)- CDR-H3
<400> 35
Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE23)- CDR-L1
<400> 36
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE23)- CDR-L2
<400> 37
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE23)- CDR-L3
<400> 38
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE23) VH
<400> 39
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE23) VL
<400> 40
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H1
<400> 41
Asp Thr Tyr Met His
1 5
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H2
<400> 42
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H3
<400> 43
Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L1
<400> 44
Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His
1 5 10 15
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L2
<400> 45
Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L3
<400> 46
Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA) VH
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA) VL
<400> 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (CH1A1A 98/99)- CDR-H1
<400> 49
Glu Phe Gly Met Asn
1 5
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (CH1A1A 98/99)- CDR-H2
<400> 50
Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (CH1A1A 98/99)- CDR-H3
<400> 51
Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (CEA 2F1)- CDR-L1
<400> 52
Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (CEA 2F1)- CDR-L2
<400> 53
Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (CEA 2F1)- CDR-L3
<400> 54
His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr
1 5 10
<210> 55
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (CH1A1A 98/99) VH
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (CEA 2F1) VL
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H1
<400> 57
Asp Tyr Ile Met His
1 5
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H2
<400> 58
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H3
<400> 59
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-L1
<400> 60
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-L2
<400> 61
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-L3
<400> 62
Leu Gln Leu Leu Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 63
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) VH
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) VL
<400> 64
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 65
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCH1(EE) (20H4.9)-重链 HC1（Fc 孔）
<400> 65
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro
<210> 66
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (4B9) VHCH1(EE) (20H4.9) -重链 HC2（Fc 突起）
<400> 66
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
225 230 235 240
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
245 250 255
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
260 265 270
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
275 280 285
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
305 310 315 320
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
325 330 335
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
340 345 350
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
355 360 365
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
370 375 380
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
385 390 395 400
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
405 410 415
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
420 425 430
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
435 440 445
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
450 455 460
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
465 470 475 480
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
485 490 495
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
500 505 510
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
515 520 525
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
530 535 540
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
545 550 555 560
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
565 570 575
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
580 585 590
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
595 600 605
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
610 615 620
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
625 630 635 640
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
645 650 655
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
660 665 670
Pro
<210> 67
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCL(RK)-轻链 (20H4.9)
<400> 67
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 68
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCL-轻链 (4B9)
<400> 68
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 125
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
130 135 140
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
145 150 155 160
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
165 170 175
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
195 200 205
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 69
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc 孔链
<400> 69
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 70
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 4-1BB 抗原 Fc 突起链
<400> 70
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys
165 170 175
Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
180 185 190
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
195 200 205
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
210 215 220
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
225 230 235 240
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
245 250 255
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
260 265 270
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
275 280 285
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
290 295 300
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
305 310 315 320
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
325 330 335
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
340 345 350
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
355 360 365
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
370 375 380
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln
405 410 415
Lys Ile Glu Trp His Glu
420
<210> 71
<211> 587
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCH1 (20H4.9)- 重链 HC1（Fc 孔） -VH (4B9)
<400> 71
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
465 470 475 480
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
485 490 495
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
500 505 510
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr
515 520 525
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
530 535 540
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
545 550 555 560
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr
565 570 575
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585
<210> 72
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCH1 (20H4.9)-重链 HC2（Fc 突起） -VL (4B9)
<400> 72
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
465 470 475 480
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
485 490 495
Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly
515 520 525
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
530 535 540
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
545 550 555 560
Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
565 570 575
Ile Lys
<210> 73
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCL-轻链 (20H4.9)
<400> 73
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 74
<211> 575
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCH1 (20H4.9)- 重链 HC1（Fc 孔）-VH (DP47)
<400> 74
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
450 455 460
Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
465 470 475 480
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp
485 490 495
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser
500 505 510
Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
515 520 525
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
530 535 540
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Ser
545 550 555 560
Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
565 570 575
<210> 75
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCH1 (20H4.9)-重链 HC2（Fc 突起） -VL (DP47)
<400> 75
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
465 470 475 480
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
485 490 495
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
515 520 525
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
530 535 540
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
545 550 555 560
Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
565 570 575
Ile Lys
<210> 76
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (A5B7) VHCH1(EE) (20H4.9) -重链 HC2（Fc 突起）
<400> 76
Gln Thr Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
130 135 140
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
145 150 155 160
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
165 170 175
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
180 185 190
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
195 200 205
Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
210 215 220
Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp
245 250 255
Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu
260 265 270
Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser Arg
275 280 285
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
290 295 300
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
305 310 315 320
Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
325 330 335
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
340 345 350
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
355 360 365
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
370 375 380
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
385 390 395 400
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
405 410 415
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
420 425 430
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
435 440 445
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
450 455 460
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
465 470 475 480
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
485 490 495
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
500 505 510
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
515 520 525
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
530 535 540
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
545 550 555 560
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
565 570 575
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
580 585 590
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
595 600 605
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
610 615 620
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
625 630 635 640
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
645 650 655
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 77
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCL-轻链 (A5B7)
<400> 77
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser
115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
130 135 140
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
145 150 155 160
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
165 170 175
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
180 185 190
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
195 200 205
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
210 215 220
Arg Gly Glu Cys
225
<210> 78
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (MFE23) VHCH1(EE) (20H4.9) -重链 HC2（Fc 突起）
<400> 78
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
130 135 140
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
145 150 155 160
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
165 170 175
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
180 185 190
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
195 200 205
Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
210 215 220
Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp
245 250 255
Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu
260 265 270
Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser Arg
275 280 285
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
290 295 300
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
305 310 315 320
Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
325 330 335
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
340 345 350
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
355 360 365
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
370 375 380
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
385 390 395 400
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
405 410 415
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
420 425 430
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
435 440 445
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
450 455 460
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
465 470 475 480
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
485 490 495
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
500 505 510
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
515 520 525
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
530 535 540
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
545 550 555 560
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
565 570 575
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
580 585 590
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
595 600 605
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
610 615 620
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
625 630 635 640
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
645 650 655
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 79
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCL-轻链 (MFE23)
<400> 79
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
115 120 125
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
145 150 155 160
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
195 200 205
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
210 215 220
Gly Glu Cys
225
<210> 80
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (T84.66-LCHA) VHCH1(EE) (20H4.9) -重链 HC2（Fc 突起）
<400> 80
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180 185 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys
225 230 235 240
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe
245 250 255
Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
260 265 270
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro
275 280 285
Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
290 295 300
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
305 310 315 320
Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp
325 330 335
Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
340 345 350
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
355 360 365
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
370 375 380
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
385 390 395 400
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
405 410 415
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
420 425 430
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro
435 440 445
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
450 455 460
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
465 470 475 480
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
485 490 495
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
500 505 510
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
515 520 525
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
530 535 540
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
545 550 555 560
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
565 570 575
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
580 585 590
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
595 600 605
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
610 615 620
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
625 630 635 640
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
645 650 655
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
660 665 670
Ser Leu Ser Pro
675
<210> 81
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCL-轻链 (T84.66-LCHA)
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser
115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
130 135 140
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
145 150 155 160
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
165 170 175
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
180 185 190
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
195 200 205
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
210 215 220
Arg Gly Glu Cys
225
<210> 82
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (CEA 2F1) VHCH1(EE) (20H4.9) -重链 HC2（Fc 突起）
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
225 230 235 240
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
245 250 255
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
260 265 270
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
275 280 285
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
305 310 315 320
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
325 330 335
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
340 345 350
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
355 360 365
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
370 375 380
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
385 390 395 400
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
405 410 415
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
420 425 430
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
435 440 445
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
450 455 460
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
465 470 475 480
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
485 490 495
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
500 505 510
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
515 520 525
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
530 535 540
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
545 550 555 560
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
565 570 575
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
580 585 590
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
595 600 605
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
610 615 620
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
625 630 635 640
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
645 650 655
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
660 665 670
Pro
<210> 83
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCL-轻链 (CEA CH1A1A 98/99)
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser
115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
130 135 140
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
145 150 155 160
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
165 170 175
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
180 185 190
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
195 200 205
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
210 215 220
Arg Gly Glu Cys
225
<210> 84
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (2B11) VHCH1(EE) (20H4.9) -重链 HC2（Fc 突起）
<400> 84
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu
225 230 235 240
Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser
245 250 255
Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly
260 265 270
Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn
275 280 285
Pro Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn
290 295 300
Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
305 310 315 320
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe
325 330 335
Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
340 345 350
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
355 360 365
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu
370 375 380
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
385 390 395 400
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
405 410 415
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
420 425 430
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu
435 440 445
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
450 455 460
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
465 470 475 480
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
485 490 495
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
500 505 510
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
515 520 525
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
530 535 540
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
545 550 555 560
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
565 570 575
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
580 585 590
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
595 600 605
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
610 615 620
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
625 630 635 640
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
645 650 655
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
660 665 670
Leu Ser Leu Ser Pro
675
<210> 85
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCL-轻链 (2B11)
<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser
115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
130 135 140
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
145 150 155 160
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
165 170 175
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
180 185 190
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
195 200 205
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
210 215 220
Arg Gly Glu Cys
225
<210> 86
<211> 760
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His
20 25 30
Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln
325 330 335
Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu
500 505 510
Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu
725 730 735
Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu
740 745 750
Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
<210> 87
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu FAP 胞外域+poly-lys-标签+his6-标签
<400> 87
Arg Pro Ser Arg Val His Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe
20 25 30
Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn
35 40 45
Asn Ile Val Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Arg Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser
65 70 75 80
Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp
85 90 95
Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly
100 105 110
Glu Phe Val Arg Gly Asn Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys
115 120 125
Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile
130 135 140
Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn
145 150 155 160
Gly Arg Glu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu
165 170 175
Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly
180 185 190
Lys Phe Leu Ala Tyr Ala Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile
195 200 205
Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile
210 215 220
Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile
225 230 235 240
Ile Asp Thr Thr Tyr Pro Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val
245 250 255
Pro Ala Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp
260 265 270
Val Thr Asp Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn
275 280 285
Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp
290 295 300
Asp Cys Pro Lys Thr Gln Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp
305 310 315 320
Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile
325 330 335
Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His
340 345 350
Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys
355 360 365
Trp Glu Ala Ile Asn Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr
370 375 380
Ser Ser Asn Glu Phe Glu Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg
385 390 395 400
Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His
405 410 415
Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr
420 425 430
Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser
435 440 445
Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu
450 455 460
Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu
465 470 475 480
Glu Ile Lys Lys Leu Glu Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met
485 490 495
Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile
500 505 510
Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala
515 520 525
Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala
530 535 540
Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr
545 550 555 560
Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr
565 570 575
Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile
580 585 590
Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu
595 600 605
Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val
610 615 620
Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly
625 630 635 640
Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val
645 650 655
Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His
660 665 670
Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala
675 680 685
Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser
690 695 700
Asp Gln Asn His Gly Leu Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr
705 710 715 720
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Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
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<210> 88
<211> 761
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 88
Met Lys Thr Trp Leu Lys Thr Val Phe Gly Val Thr Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Val Val Ile Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr
20 25 30
Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
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Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu
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65 70 75 80
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Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
740 745
<210> 90
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴 FAP 胞外域+poly-lys-标签+his6-标签
<400> 90
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<213> 智人
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Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe
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675 680 685
Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile
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<210> 92
<211> 2322
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Met Gln Ser Gly Pro Arg Pro Pro Leu Pro Ala Pro Gly Leu Ala Leu
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Ala Leu Thr Leu Thr Met Leu Ala Arg Leu Ala Ser Ala Ala Ser Phe
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Gly Leu Phe Val Gly Gly Thr Gly Thr Leu Gly Leu Pro Tyr Leu Arg
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Gly Thr Ser Arg Pro Leu Arg Gly Cys Leu His Ala Ala Thr Leu Asn
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Gly Arg Ser Leu Leu Arg Pro Leu Thr Pro Asp Val His Glu Gly Cys
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195 200 205
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Phe Gln Ala Gly Gly Arg Arg Gly Asp Phe Ile Tyr Val Asp Ile Phe
245 250 255
Glu Gly His Leu Arg Ala Val Val Glu Lys Gly Gln Gly Thr Val Leu
260 265 270
Leu His Asn Ser Val Pro Val Ala Asp Gly Gln Pro His Glu Val Ser
275 280 285
Val His Ile Asn Ala His Arg Leu Glu Ile Ser Val Asp Gln Tyr Pro
290 295 300
Thr His Thr Ser Asn Arg Gly Val Leu Ser Tyr Leu Glu Pro Arg Gly
305 310 315 320
Ser Leu Leu Leu Gly Gly Leu Asp Ala Glu Ala Ser Arg His Leu Gln
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Gly Cys Met Glu Asp Leu Ser Val Asn Gly Gln Arg Arg Gly Leu Arg
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610 615 620
Ser Leu Val Tyr Val His Arg Gly Gly Pro Ala Gln Asp Leu Thr Phe
625 630 635 640
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645 650 655
Val Ala Ile Arg Pro Ala Ile Gln Ile His Arg Ser Thr Gly Leu Arg
660 665 670
Leu Ala Gln Gly Ser Ala Met Pro Ile Leu Pro Ala Asn Leu Ser Val
675 680 685
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690 695 700
Gly Ala Leu Gln Phe Gly Glu Leu Gln Lys Gln Gly Ala Gly Gly Val
705 710 715 720
Glu Gly Ala Glu Trp Trp Ala Thr Gln Ala Phe His Gln Arg Asp Val
725 730 735
Glu Gln Gly Arg Val Arg Tyr Leu Ser Thr Asp Pro Gln His His Ala
740 745 750
Tyr Asp Thr Val Glu Asn Leu Ala Leu Glu Val Gln Val Gly Gln Glu
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Asn Leu Gln Leu Gln Gly Thr Arg Leu Ser Asp Gly Gln Gly Phe Thr
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Pro Tyr Phe Ser Pro Leu Tyr Thr Phe Pro Ile His Ile Gly Gly Asp
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Pro Asp Ala Pro Val Leu Thr Asn Val Leu Leu Val Val Pro Glu Gly
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Gly Glu Gly Val Leu Ser Ala Asp His Leu Phe Val Lys Ser Leu Asn
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Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Glu Val Met Glu Arg Pro Arg His Gly Arg
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Leu Ala Trp Arg Gly Thr Gln Asp Lys Thr Thr Met Val Thr Ser Phe
945 950 955 960
Thr Asn Glu Asp Leu Leu Arg Gly Arg Leu Val Tyr Gln His Asp Asp
965 970 975
Ser Glu Thr Thr Glu Asp Asp Ile Pro Phe Val Ala Thr Arg Gln Gly
980 985 990
Glu Ser Ser Gly Asp Met Ala Trp Glu Glu Val Arg Gly Val Phe Arg
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Ser Arg Ile Phe His Val Ala Arg Gly Gly Arg Arg Leu Leu Thr
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Thr Asp Asp Val Ala Phe Ser Asp Ala Asp Ser Gly Phe Ala Asp
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<213> 智人
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<213> 智人
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225 230 235 240
Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly
245 250 255
Val Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala
260 265 270
Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys
275 280 285
Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly
290 295 300
Ser Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr
305 310 315 320
Glu Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu
325 330 335
Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys
340 345 350
Asp Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln
355 360
<210> 97
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 98
<211> 256
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 98
Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln
20 25 30
Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro
35 40 45
Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys
50 55 60
Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr
65 70 75 80
His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro
85 90 95
Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr
100 105 110
Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn
115 120 125
Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg
130 135 140
Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu
165 170 175
Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe
195 200 205
Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
245 250 255
<210> 99
<211> 254
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 99
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Phe Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Thr Val Val Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Val Leu Arg
195 200 205
Phe Ser Val Val Lys Arg Ser Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
210 215 220
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
225 230 235 240
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250
<210> 100
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 100
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 101
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 102
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 103
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 103
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 104
Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 105
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 106
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 106
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 107
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 108
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 109
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 110
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 110
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 111
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 111
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 112
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 113
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 114
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 114
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5H1EL1D)- CDR-H1
<400> 115
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 116
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5H1EL1D)- CDR-H2
<400> 116
Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5H1EL1D)- CDR-H3
<400> 117
Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5H1EL1D)- CDR-L1
<400> 118
Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5H1EL1D)- CDR-L2
<400> 119
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5H1EL1D)- CDR-L3
<400> 120
Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
1 5
<210> 121
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5H1EL1D) VH (3-23A5-1E)
<400> 121
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 122
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (A5H1EL1D) VL (A5-L1D)
<400> 122
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE-H24 至 H29)- CDR-H1
<400> 123
Asp Ser Tyr Met His
1 5
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE-H24, H25, H27, H28, H29)- CDR-H2
<400> 124
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE-H26)- CDR-H2
<400> 125
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 126
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE-H24 至 H29)- CDR-H3
<400> 126
Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE-L24, L25, L27, L28, L29)- CDR-L1
<400> 127
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE-H26)- CDR-L1
<400> 128
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Met
1 5 10
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE-L24, L25, L27, L28)- CDR-L2
<400> 129
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE-L26)- CDR-L2
<400> 130
Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE-L29)- CDR-L2
<400> 131
Ser Thr Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (MFE-L24, L25, L27, L26, L28, L29)- CDR-L3
<400> 132
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 133
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H24
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 134
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H25
<400> 134
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 135
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H26
<400> 135
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 136
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H27
<400> 136
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 137
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H28
<400> 137
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 138
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H29
<400> 138
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 139
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L24
<400> 139
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 140
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L25
<400> 140
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 141
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L26
<400> 141
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 142
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L27
<400> 142
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 143
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L28
<400> 143
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 144
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L29
<400> 144
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 CDR-H1
<400> 145
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 146
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 CDR-H2
<400> 146
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 CDR-H3
<400> 147
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 148
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 CDR-L1
<400> 148
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 149
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 CDR-L2
<400> 149
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 CDR-L3
<400> 150
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 151
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VH
<400> 151
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 152
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VL
<400> 152
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 153
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys
<210> 154
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr
100
<210> 155
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-23A5-1 VH
<400> 155
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 156
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-23A5-2
<400> 156
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Tyr Tyr Gly Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 157
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-23A5-3 VH
<400> 157
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 158
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-23A5-4 VH
<400> 158
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 159
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-23A5-1A（所有回复突变）VH
<400> 159
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 160
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-23A5-1C (A93T) VH
<400> 160
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 161
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-23A5-1D (K73) VH
<400> 161
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 162
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-15A5-1 VH
<400> 162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 163
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-15A5-2 VH
<400> 163
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 164
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-15A5-3 VH
<400> 164
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 165
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro
85 90 95
<210> 166
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5-L1 VL
<400> 166
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 167
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5-L2 VL
<400> 167
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 168
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5-L3 VL
<400> 168
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 169
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5-L4 VL
<400> 169
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 170
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5-L1A（所有回复突变）VL
<400> 170
Gln Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 171
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5-L1B (Q1T2) VL
<400> 171
Gln Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 172
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5-L1C (FR2) VL
<400> 172
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 173
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (CEA A5H1EL1D) VHCH1(EE) (20H4.9) -重链 HC2 (Fc 突起)
<400> 173
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
130 135 140
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
145 150 155 160
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
165 170 175
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
180 185 190
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
195 200 205
Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
210 215 220
Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp
245 250 255
Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu
260 265 270
Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser Arg
275 280 285
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
290 295 300
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
305 310 315 320
Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
325 330 335
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
340 345 350
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
355 360 365
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
370 375 380
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
385 390 395 400
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
405 410 415
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
420 425 430
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
435 440 445
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
450 455 460
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
465 470 475 480
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
485 490 495
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
565 570 575
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
580 585 590
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
595 600 605
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
610 615 620
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
625 630 635 640
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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<213> 人工序列
<220>
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Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
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65 70 75 80
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Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
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115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
130 135 140
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
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Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
165 170 175
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
180 185 190
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Arg Gly Glu Cys
225
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<213> 智人
<400> 175
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<213> 智人
<400> 176
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35 40 45
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Ala Arg
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<211> 98
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Ala Arg
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<211> 95
<212> PRT
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Gly Glu Cys
225
<210> 181
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (CEA huMFE23-L28-H28) VHCH1(EE) (20H4.9) -重链 HC2
（Fc 突起）
<400> 181
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
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<220>
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<400> 182
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225
<210> 183
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (CEA huMFE23-L28-H25) VHCH1(EE) (20H4.9) -重链 HC2
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<400> 183
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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485 490 495
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515 520 525
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565 570 575
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580 585 590
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
595 600 605
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
610 615 620
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
625 630 635 640
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
645 650 655
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 184
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCL-轻链 (CEA huMFE23-L28-H25)
<400> 184
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Ser
20 25 30
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50 55 60
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100 105 110
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225
<210> 193
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (PD-L1) VHCH1(EE) (20H4.9) -重链 HC2（Fc 突起）
<400> 193
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
210 215 220
Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr
225 230 235 240
Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
245 250 255
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
260 265 270
Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser
275 280 285
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
290 295 300
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
305 310 315 320
Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg
325 330 335
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
340 345 350
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
355 360 365
Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
370 375 380
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
385 390 395 400
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
405 410 415
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
420 425 430
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
435 440 445
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
450 455 460
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
465 470 475 480
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
485 490 495
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
500 505 510
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
515 520 525
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
530 535 540
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
545 550 555 560
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
565 570 575
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
580 585 590
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
595 600 605
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
610 615 620
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
625 630 635 640
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 194
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCL-轻链 (PD-L1)
<400> 194
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
130 135 140
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
145 150 155 160
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
165 170 175
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
180 185 190
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
195 200 205
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
210 215 220
Cys
225
<210> 195
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCH1 (PD-L1) -重链 HC2（Fc 突起）
<400> 195
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 196
<211> 290
<212> PRT
<213> 智人
<400> 196
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290

Claims (33)

1.一种双特异性抗原结合分子，包含：
(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；
(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；
(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及
(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成；
其中所述第二Fab片段(b)在所述Fab重链的C末端融合至所述第一Fab片段(a)的Fab重链的N末端，其继而在其C末端融合至所述第一Fc结构域亚基的所述N末端，并且所述第三Fab片段(c)在所述Fab重链的所述C末端融合至所述第二Fc结构域亚基的所述N末端，并且其中在所述能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，(i)可变结构域VL和VH彼此替换，或(ii)恒定结构域CL和CH1彼此替换。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子提供与4-1BB的二价结合和与所述靶细胞抗原的单价结合。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中所述由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域为IgG Fc结构域，具体地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中根据突起进入孔方法，所述Fc结构域的所述第一亚基包含突起并且所述Fc结构域的所述第二亚基包含孔。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低所述抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，具体地为氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(VH4-1BB)，其包含与SEQID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL4-1BB)，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中在所述能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段的所述恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat EU索引编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)或赖氨酸(K)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且其中在所述能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段的所述恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第二Fab片段能够特异性结合到选自由以下项组成的组中的靶细胞抗原：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD33和PD-L1。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段为能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段为能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段。
14.根据权利要求1至9或权利要求13中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或者
(e)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列；或者
(f)重链可变区(VHCEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQID NO:126的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ IDNO:127或SEQ ID NO:128的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至9或权利要求13或14中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(b)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(c)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(d)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(e)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ IDNO:122的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(f)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(g)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:133的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ IDNO:143的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者
(h)重链可变区(VHCEA)，其包含与SEQ ID NO:137的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含与SEQ IDNO:143的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
16.根据权利要求1至9或权利要求13或14中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：重链可变区(VHCEA)，其包含SEQID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCEA)，其包含SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
17.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段为能够特异性结合到CD19的Fab片段。
18.根据权利要求1至9或权利要求17中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到CD19的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHCD19)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCD19)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至9或权利要求17或18中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到CD19的Fab片段包含：重链可变区(VHCD19)，其包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLCD19)，其包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
20.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段为能够特异性结合到PD-L1的Fab片段。
21.根据权利要求1至9或权利要求20中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到PD-L1的Fab片段包含：
(a)重链可变区(VHPD-L1)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQID NO:150的氨基酸序列。
22.根据权利要求1至9或权利要求20或21中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到PD-L1的Fab片段包含：重链可变区(VHPD-L1)，其包含与SEQ IDNO:152的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLPD-L1)，其包含与SEQ ID NO:153的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
23.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至22中任一项所述的双特异性抗原结合分子。
24.一种载体，所述载体包含根据权利要求23所述的多核苷酸。
25.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求23所述的多核苷酸或根据权利要求24所述的载体。
26.一种生产根据权利要求1至22中任一项所述的双特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括在适于表达所述双特异性抗原结合分子的条件下培养根据权利要求25所述的宿主细胞。
27.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的双特异性抗原结合分子以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
28.根据权利要求1至22中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据权利要求27所述的药物组合物，用作药物。
29.根据权利要求1至22中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据权利要求27所述的药物组合物，用于治疗癌症。
30.根据权利要求1至22中任一项所述的双特异性抗原结合分子，用于治疗癌症，其中所述双特异性抗原结合分子与化学治疗剂、放疗和/或用于癌症免疫疗法的其他药剂联合施用。
31.根据权利要求1至22中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据权利要求27所述的药物组合物在制造用于治疗癌症或感染性疾病的药物中的用途。
32.一种抑制个体中肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至22中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据权利要求27所述的药物组合物，以抑制所述肿瘤细胞的生长。
33.一种治疗癌症或感染性疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1至22中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据权利要求27所述的药物组合物。
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