TW201039849A - Bispecific anti-ErbB-2/anti-C-met antibodies - Google Patents

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Ulrich Brinkmann
Christian Klein
Gerhard Niederfellner
Wolfgang Schaefer
Juergen Michael Schanzer
Claudio Sustmann
Pablo Umana
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Description

201039849 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於針對人類ErbB-2及人類C-met之雙特異性 抗體、其產生方法、含有該等抗體之醫藥組合物、及其用 途。 【先前技術】
ErbB家族蛋白
ErbB蛋白家族由4個成員組成：ErbB-Ι，亦稱作表皮生 Ο 長因子受體（EGFR) ; ErbB-2，在人類中亦稱作HER2且在 齧齒動物中亦稱作neu ; ErbB-3，亦稱作HER3 ;及ErbB-4， 亦稱作HER4。ErbB家族蛋白係受體酪胺酸激酶且代表細 胞生長、分化及存活之重要介體。
ErbB-2 及抗-ErbB-2 抗體
ErbB蛋白家族之第二成員ErbB-2(亦稱作ERBB2、 HER2 ; CD340、HER-2/neu、c-erb B2/neu蛋白、神經母細 胞瘤/膠質母細胞瘤源癌基因同系物| v-erb-b2禽成紅細胞白 〇 W 血病病毒癌基因同系物2 ; SEQ ID NO: 14)係自身不具有配 體結合結構域且因此不能結合生長因子之蛋白質。然而， 其與結合配體之其他EGF受體家族成員緊密結合而形成異 二聚體，從而穩定配體結合並增強下游信號傳導途徑之激 酶介導活化，例如彼等涉及促有絲***原活化之蛋白激酶 及磷脂醯肌醇-3激酶者。已報導在亞型a中胺基酸654及 655位（亞型b之624及625位）之等位基因變異，在此處顯示 最常見等位基因Ile654/Ile655。已在多種癌症中報導此基 146956.doc 201039849 因之擴增及/或過表現，包括乳腺腫瘤及卵巢腫瘤。選擇 性剪接產生若干種其他轉錄變異體，其中某些變異體編碼 不同亞型且其他變異體尚未完全表徵。ErB-2最初鑒定為 來自經化學處理大鼠之神經母細胞瘤的轉化基因之產物。 neu原癌基因之活化形式得自所編碼蛋白跨膜區中之點突 變（纈胺酸變為麩胺酸）（Semba，K.等人，PNAS 82 (1985) 6497-501 ; Coussens, L.等人，Science 230 (1985) 1132-9 ; Bargmann，C.I.等人，Nature 319 (1986) 226-30 ; Yamamoto, T. 等人，Nature 319 (1986) 230-4)。 在乳癌及卵巢癌中觀察到neu之人類同系物之擴增且與 預後不良有關（Slamon，D.J.等人，8以611。6 235 (1987) 177-182 ; Slamon，D.J.等人，Science 244 (1989) 707-712 ;及 US 4,968,603)。迄今為止，尚未報導人類腫瘤中存在與 neu原癌基因中之點突變類似之點突變。在其他癌症中亦 已觀察到HER2之過表現（通常但並非總是由基因擴增所 致），包括胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、 結腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌及膀胱癌。尤其參見King， C.R.等人，Science 229 (1985) 974-976 ; Yokota，J.等人， Lancet 1 (1986) 765-767 ; Fukushige，S.等人，Mol Cell Biol. 6 (1986) 955-958 ; Guerin, M.等人，Oncogene Res. 3 (1988) 21-31 ; Cohen，J.A.等人，Oncogene, 4 (1989) 81-88 ; Yonemura, Y.等人，€乱11。6犷1^3.51 (1991) 1034- 1038 ; Borst，M.P.等人，0丫加(：〇1.〇11〇〇1.38 (1990) 364-366 ; Weiner, D.B.等人，Cancer Res. 50 (1990) 421-425 ; 146956.doc 201039849
Kern, J.Α·等人，Cancer Res· 50 (1990) 5184-5187 ; Park, J.B.等人，Cancer Res. 49 (1989) 6605-6609 ; Zhau，H.E.等 人，Mol· Carcinog. 3 (1990) 254-257 ; Aasland, R·等人’ Br. J. Cancer 57 (1988) 358-363 ; Williams, T.M.等人’ Pathobiology 59 (1991) 46-52 ;及 McCann, A.等人’ Cancer 65 (1990) 88-92。在***癌中HER2可能過表現 (Gu，Κ·等人，Cancer Lett. 99 (1996) 185-189 ; Ross，J.S. 等人，Hum. Pathol. 28 (1997) 827-833 ; Ross, J.S.等人， Cancer 79 (1997) 2162-2170 ;及 Sadasivan，R.等人，】· Urol. 150 (1993) 126-131)。 已生成針對人類HER2蛋白產物之抗體，例如參見 Hudziak，R.M.等人，Mol· Cell. Biol. 9 (1989) 1165-1172， 其闡述一組抗-HER2抗體之生成，該等抗體係使用人類乳 腺腫瘤細胞系SK-BR-3來表徵。該組抗-HER2抗體尤其包 括2C4(帕妥珠單抗（pertuzumab))及4D5(曲妥珠單抗 (trastuzumab)，HerceptinTM)抗體，其係針對 HER2 細胞外 結構域之不同表位。藉由在72小時後對單層實施結晶紫染 色來測定SK-BR-3細胞在暴露於抗體後之相對細胞增殖。 使用此分析以稱作4D5(曲妥珠單抗，HerceptinTM)之抗體 獲得最大抑制，其將細胞增瘦抑制56% »在此分析中該組 中之其他抗體以較低程度降低細胞增殖。另外發現抗體 4D5可使HER2過表現乳腺腫瘤細胞系對TNF-α (US 5,677,171)之細胞毒性效應敏感。1111(12丨&1<:，11.]^.等人論述 之HER2抗體進一步表徵於（例如）Fendly，B.M.等人， 146956.doc 201039849
Cancer Research 50 (1990) 1550-1558 中。 c-Met及抗-c-Met抗體 MET(間質-上皮過渡因子）係編碼蛋白MET之原癌基因 (亦稱作c-Met ;肝細胞生長因子受體HGFR ; HGF受體；擴 散因子受體；SF受體；SEQ ID NO:13)(Dean, M.等人， Nature 3 18 (1985) 385-8 ; Chan, A_M.等人，Oncogene 1 (1987) 229-33 ; Bottaro，D.P.等人，Science 251 (1991) 802-4 ; Naldini，L.等人，EMBO J. 10 (1991) 2867-78 ; Maulik, G.等人，Cytokine Growth Factor Rev· 13 (2002) 41-59)。MET係胚胎發育及傷口癒合必需之膜受體。肝細 胞生長因子（HGF)係MET受體之唯一已知配體。MET通常 由上皮來源之細胞表現，而HGF之表現受限於間質來源之 細胞。在HGF刺激後，MET誘導若干種生物反應，其共同 引發稱作侵襲性生長之程序。癌症中之異常MET活化與預 後不良有關，其中活性異常的MET誘發腫瘤生長、形成向 腫瘤供應營養之新金管（血管發生）、及癌症向其他器官擴 散（轉移）。MET在多種類型之人類惡性腫瘤中解除調節， 包括腎癌、肝癌、胃癌、乳癌及腦癌。通常，僅幹細胞及 祖細胞表現MET，其使得該等細胞可侵襲性生長以在胚胎 中生成新組織或在成人中使受損組織再生。然而，人們認 為癌症幹細胞可劫持正常幹細胞表現MET之能力，且由此 使得癌症可持續存留並擴散至體内其他位點。 原癌基因MET之產物係肝細胞生長因子受體且編碼酪胺 酸-激酶活性。對原始單鏈前體蛋白實施轉譯後裂解以產 146956.doc 201039849 生α及β亞單元，使其以二硫鍵連接以形成成熟受體。MET 基因中之多種突變與乳突樣腎癌有關。
抗-c-Met抗體可參見（例如）US 5,686,292、US 7,476,724、 WO 2004/072117、WO 2004/108766、WO 2005/016382、WO 2005/063816、WO 2006/015371、WO 2006/104911、WO 2007/126799、或 WO 2009/007427。 C-Met結合肽可參見（例如）Matzke，A.等人，Cancer Res 65 (14) (2005) 6105-10及 Tam，Eric，M.等人，J. Mol. Biol. 385 (2009)79-90。 多特異性抗體 最近幾年已研發出眾多種重組抗體形式，例如融合（例 如）IgG抗體形式及單鏈結構域之四價雙特異性抗體（例 如，參見 Coloma，M.J·等人，Nature Biotech 15 (1997) 159-163 ; WO 2001/077342 ;及 Morrison，S.L·，Nature
Biotech 25 (2007) 1233-1234)。 亦已研發出若干種不再保留抗體核心結構（IgA、IgD、 IgE、IgG或IgM)之其他新形式，例如雙鏈抗體、三鏈抗體 或四鏈抗體、微小抗體、若干種單鏈形式（scFv、雙 scFv)，其能結合兩種或更多種抗原（Holliger，P.等人’ Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136 ； Fischer, N-, Leger, 0·，Pathobiology 74 (2007) 3-14 ; Shen, J.等人，Journal of
Immunological Methods 318 (2007) 65-74 *» Wu, C.等人’ Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297)。 所有該等形式皆使用連接體來融合抗體核心（bA、 146956.doc 201039849
IgD、IgE、IgG或IgM)與另一結合蛋白（例如scFv)或融合 (例如）兩個 Fab 片段或 scFv (Fischer, N.，LSger，O.， Pathobiology 74 (2007) 3-14)。必須牢記，可藉由維持與 天然抗體之高度相似性來保留經由Fc受體結合介導之效應 子功能（例如補體依賴性細胞毒性（CDC)或抗體依賴性細胞 毒性（ADCC))。 在WO 2007/024715中報導雙可變結構域免疫球蛋白，其 為經改造多價多特異性結合蛋白。製備生物活性抗體二聚 體之方法報導於US 6,897,044中。具有至少四個經由肽連 接體彼此連接之可變結構域的多價Fv抗體構成物報導於US 7，129,330中。二聚及多聚抗原結合結構報導於US 2005/0079170中。包含三個或四個藉由連接結構彼此共價 結合之Fab片段的三價或四價單特異性抗原結合蛋白報導 於US 6,5 1 1,663中，該蛋白並非天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報導四價雙特異性抗體，其可在原核及真 核細胞中有效表現且可用於治療性及診斷性方法。一種自 包含經由至少一個鏈間二硫鍵連接之二聚體與並非經由至 少一個鏈間二硫鍵連接之二聚體的混合物分離該兩種類型 之多肽二聚體或優先合成該經由至少一個鏈間二硫鍵連接 之二聚體的方法報導於US 2005/0163782中。雙特異性四 價受體報導於US 5,959,083中。具有三個或更多個功能性 抗原結合位點之經改造抗體報導於WO 2001/077342中。 多特異性及多價抗原結合多肽報導於W0 1997/001580 中。W0 1992/004053報導通常自結合相同抗原決定簇之 146956.doc 201039849
IgG類單株抗體製備之均偶合物，其係藉由合成***聯共 價連接。對抗原具有高親合力之寡聚單株抗體報導於WO 1991/06305中，其中分泌具有兩個或更多個免疫球蛋白單 體之寡聚物（通常為IgG類），該等單體結合在一起形成四 價或六價IgG分子。綿羊源抗體及經改造抗體構成物報導 於US 6,350,860中，其可用於治療具有致病性幹擾素γ活性 之疾病。在US 2〇05/0100543中報導可靶向構成物，其係 雙特異性抗體之多價載體，即可靶向構成物之每個分子皆 可用作兩個或更多個雙特異性抗體之載體。遺傳改造雙特 異性四價抗體報導於WO 1995/009917中。在WO 2007八〇9254 中報導經穩定結合分子，其由經穩定scFv組成或包含該經 穩定scFv。US 2007/0274985係關於包含單鏈Fab (scFab)片 段之抗體形式。 WO 2008/140493係關於抗-EGFR家族成員抗體及包含一 或多個抗-EGFR家族成員抗體之雙特異性抗體。US 2004/0071696係關於可結合EGFR蛋白家族成員之雙特異 性抗體分子。 WO 20091 1 1707(A1)係關於使用Met及HER拮抗劑之組 合療法。WO 200911 1691(A2A3)係關於使用Met及EGFR拮 抗劑之組合療法。 WO 20040721 17係關於誘導c-Met下調/内化之C-Met抗 體，及其尤其在以ErbB-2作為第二抗原之雙特異性抗體中 的潛在用途。 【發明内容】 146956.doc 201039849 本發明之第一態樣係特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-2之第 一抗原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合 位點，其特徵在於，當在1小時後於流式細胞計數分析中 針對OVCAR-8細胞進行測量時，與不存在抗體時c-Met之 内化相比，該雙特異性抗體顯示c-Met之内化不超過15%。 在本發明一實施例中，該抗體係特異性結合人類ErbB-2 及人類c-Met之二價或三價雙特異性抗體，其包含一個或 兩個特異性結合人類ErbB-2之抗原結合位點及一個特異性 結合人類c-Met之抗原結合位點。 在本發明一實施例中，該抗體係特異性結合人類ErbB-2 及人類c-Met之三價雙特異性抗體，其包含兩個特異性結 合人類ErbB-2之抗原結合位點及一個特異性結合人類c-Met之第三抗原結合位點。 在本發明一實施例中，該抗體係特異性結合人類ErbB-2 及人類c-Met之二價雙特異性抗體，其包含一個特異性結 合人類ErbB-2之抗原結合位點及一個特異性結合人類c-Met之抗原結合位點。 本發明之一態樣係特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met 之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-2之第一抗 原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位 點，其特徵在於 該第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 15 之 CDR3H區、SEQ ID NO: 16之 CDR2H區、及 146956.doc -10· 201039849 8丑(）10]^0:17之€011111區，且在輕鏈可變結構域中 包含 SEQ ID NO·· 18 之 CDR3L 區、SEQ ID N0.19 之 CDR2L 區、及 SEQIDNO:20之 CDR1L 區；且 該第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 21 之 CDR3H區、SEQ ID NO:22之 CDR2H區、及 SEQ ID NO: 23之CDR1H區，且在輕鏈可變結構域中 包含 SEQ ID NO: 24 之 CDR3L 區、SEQ ID NO:25 之 CDR2L區、及 SEQIDN0:262CDRlLg。 該雙特異性抗體之特徵較佳在於 該特異性結合ErbB-2之第一抗原結合位點包含序列SEQ ID ΝΟ:1作為重鏈可變結構域，且包含序列SEQ ID NO:2作為輕鏈可變結構域；且 該特異性結合c-Met之第二抗原結合位點包含序列 SEQ ID NO:3作為重鏈可變結構域，且包含序列SEQ ID NO:4作為輕鏈可變結構域。 本發明另一態樣係本發明雙特異性抗體，其特徵在於包含 IgGl或IgG3亞類之恆定區。 在一實施例中’本發明該雙特異性抗體之特徵在於’該抗 體在Asn297處經糖鍵糖基化’其中該糖鍵内岩藻糖之量 為65%或更低。 本發明另一態樣係編碼該雙特異性抗體鏈之核酸分子。 本發明之其他態樣係包含該雙特異性抗體之醫藥組合 物、該用於治療癌症之組合物，該雙特異性抗體用於製造 用於治療癌症之藥物之用途、藉由將該雙特異性抗體投與 146956.doc -11 · 201039849 需要治療之患者來治療患有癌症之患者之方法。 乳腺腫瘤經常表現較高含量之ErbB2且大部分ErbB2陽性 腫瘤亦為c-Met陽性。多個先前研究顯示，乳腺腫瘤中之c-Met表現與預後不良有關（Kang, J·，Y.等人，Cancer Res. 63 (2003) 1 101-1 105 ; Lengyel, E.等人，Int·. J. Cancer 113 (2005) 678-82)。因此本發明雙特異性<ErbB-2-c-Met>抗體 具有有價值之特性，例如抗腫瘤效能及癌細胞抑制性。 本發明抗體表現價值極高之特性，例如尤其可抑制表現 兩種受體ErbB2及c-Met之癌細胞之生長、對患有癌症之患 者有益之抗腫瘤效能。在表現兩種受體ErbB2及c-Met之癌 細胞上，本發明雙特異性體與其親代單 特異性二價<c-Met>抗體相比表現降低之c-Met受體之内 化。 【實施方式】 本發明之第一態樣係特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-2之第 一抗原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合 位點，其特徵在於，當在1小時後於流式細胞計數分析中 對OVCAR-8細胞進行測量時，與不存在該雙特異性抗體時 c-Met之内化相比，該雙特異性抗體顯示c-Met之内化不超 過 15%。 因此本發明係關於特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met 之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB_2之第一抗 原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位 146956.doc -12^ 201039849 點，其中該雙特異性抗體導致當在OVCAR-8細胞-抗體培 育1小時後藉由流式細胞計數分析測量時，與不存在抗體 時OVCAR-8細胞上c-Met之内化相比，OVCAR-8細胞上c-Met之内化提高不超過15%。 在一實施例中，該特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met 之雙特異性抗體包含特異性結合人類ErbB-2之第一抗原結 合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位點，其 特徵在於，當在1小時後於流式細胞計數分析中對OVCAR-8細胞進行測量時，與不存在該雙特異性抗體時c-Met之内 化相比，該雙特異性抗體顯示c-Met之内化不超過10%。 在一實施例中，該特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met 之雙特異性抗體包含特異性結合人類ErbB-2之第一抗原結 合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位點，其 特徵在於，當在1小時後於流式細胞計數分析中對OVCAR-8細胞進行測量時，與不存在該雙特異性抗體時c-Met之内 化相比，該雙特異性抗體顯示c-Met之内化不超過7%。 在一實施例中，該特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met 之雙特異性抗體包含特異性結合人類ErbB-2之第一抗原結 合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位點，其 特徵在於，當在1小時後於流式細胞計數分析中對OVCAR-8細胞進行測量時，與不存在該雙特異性抗體時c-Met之内 化相比，該雙特異性抗體顯示c-Met之内化不超過5%。 術語「c-Met之内化」係指相對於不存在抗體時c-Met之 内化，在OVCAR-8細胞（NCI細胞系名稱；購自NCI(國家 146956.doc -13- 201039849 癌症研究所）〇VCAR-8-NCI ; Schilder RJ 等人，Int J Cancer. 1990 年 3 月 15 日；45(3):416-22 ; Ikediobi ON 等 人，Mol Cancer Ther. 2006 ; 5 ; 2606-12 ; Lorenzi，P.L.等 人，Mol Cancer Ther 2009 ; 8(4):713-24)上由抗體誘導之 c-Met受體内化。該c-Met受體之内化係由本發明雙特異性 抗體誘導，且係在1小時後於流式細胞計數分析（FACS)中 測量，如實例11中所述。在抗體暴露1小時後，與不存在 抗體時c-Met之内化相比，本發明雙特異性抗體在OVCAR-8細胞上顯示c-Met之内化不超過1 5%。在一實施例中，該 抗體顯示c-Met之内化不超過10°/〇。在一實施例中，該抗體 顯示c-Met之内化不超過7%。在一實施例中，該抗體顯示 c-Met之内化不超過5%。 本發明另一態樣係特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met 之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-2之第一抗 原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位 點，其特徵在於，當在1小時後於流式細胞計數分析中對 OVCAR-8細胞進行測量時，與由（相應）單特異性二價親代 c-Met抗體誘導之c-Met之内化相比，該雙特異性抗體可使 c-Met之内化降低50%或更多（在一實施例中，降低60%或 更多；在另一實施例中，降低70%或更多；在一實施例 中，降低80%或更多）。如下所述計算c-Met之内化之降低 (使用在1小時後於流式細胞計數分#中對OVCAR-8細胞進 行測量之内化％值，而將低於0之内化％值設定為〇%内 化，例如對於BSAB02而言（-7%内化設定為0%内化））：100 146956.doc -14- 201039849 Χ(由單特異性二價親代C-Met抗體誘導之c-Met之内化°/〇 -由雙特異性ErbB-2/cMet抗體誘導之c-Met之内化％)/由單特 異性二價親代c-Met抗體誘導之c-Met之内化％。舉例而 言：雙特異性ErbB-2/cMet抗體BsAB02顯示c-Met之内化 為-7%，將其設定為0% ;且單特異性二價親代c-Met抗體 Mab 5D5顯示c-Met之内化為37%。因此，雙特異性ErbB-2/cMet抗體BsAB02顯示c-Met之内化降低為100 X (40-0)/40%=100%(參見實例11中在1小時後於流式細胞計數分 析中對OVCAR-8細胞進行測量之内化值）。 本文所用「抗體」係指包含抗原結合位點之結合蛋白。 本文所用術語「結合位點」或「抗原結合位點」表示抗體 分子中實際結合配體且源自抗體之區域。術語「抗原結合 位點」包括抗體重鏈可變結構域（VH)及/或抗體輕鏈可變 結構域（VL)、或VH/VL對，且可源自完整抗體或抗體片 段，例如單鏈Fv、VH結構域及/或VL結構域、Fab、或 (Fab)2。在本發明之一實施例中，抗原結合位點各自包含 抗體重鏈可變結構域（VH)及/或抗體輕鏈可變結構域 (VL)，且較佳係藉由由抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體重 鏈可變結構域（VH)組成之對來形成。 除源自抗體之抗原結合位點外，結合肽（例如，如 Matzke，A.等人，Cancer Res. 65 (14) (2005) 6105-10， 2005年7月15曰中所述）亦可特異性結合抗原（例如C-Met)。 因此本發明另一態樣係特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met之雙特異性結合分子，其包含特異性結合人類ErbB-2 146956.doc •15- 201039849 之抗原結合位點及特異性結合人類c-Met之結合肽。因此 本發明另一態樣係特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met之 雙特異性結合分子，其包含特異性結合人類c-Met之抗原 結合位點及特異性結合人類ErbB-2之結合肽。
ErbB-2(亦稱作 ERBB2、HER2 ; CD340、HER-2/neu、c-erb B2/neu蛋白、神經母細胞瘤/膠質母細胞瘤源癌基因同系 物；v-erb-b2禽成紅細胞白血病病毒癌基因同系物2 ; SEQ ID NO: 14)係自身不具有配體結合結構域且因此不能結合 生長因子之蛋白質。然而，其與結合配體之其他EGF受體 家族成員緊密結合而形成異二聚體，從而穩定配體結合並 增強下游信號傳導途徑之激酶介導活化，例如彼等涉及促 有絲***原活化之蛋白激酶及磷脂醯肌醇-3激酶者。已報 導在亞型a中胺基酸654及655位（亞型b之624及625位）之等 位基因變異，在此處顯示最常見等位基因Ile654/Ile655。 已在多種癌症中報導此基因之擴增及/或過表現，包括乳 癌及卵巢腫瘤。選擇性剪接產生若干種其他轉錄變異體， 其中某些變異體編碼不同亞型且其他變異體尚未完全表 徵。ErB-2最初鑒定為來自經化學處理大鼠之神經母細胞 瘤的轉化基因之產物。neu原癌基因之活化形式得自所編 碼蛋白跨膜區中之點突變（纈胺酸變為糙胺酸）（Semba, K. 等人，PNAS 82 (1985) 6497-501 ; Coussens, L.等人， Science 230 (1985) 1 132-9 ; Bargmann，C.I.等人，Nature 319 (1986) 226-30 ; Yamamoto, T.等人，Nature 319 (1986) 230-4)° 146956.doc -16- 201039849 特異性結合人類ErbB-2之抗原結合位點及尤其重鏈可變 結構域（VH)及/或抗體輕鏈可變結構域（VL)可源自a)已知 抗-ErbB-2抗體，例如2C4(帕妥珠單抗；帕妥珠單抗係鼠 類抗-HER2抗體2C4之重組人類化形式且與相應製備方法 一起闡述於 WO 01/00245 及 WO 2006/007398 中）及4D5(曲妥 珠單抗（鼠類抗-HER2抗體4D5之重組人類化形式， HerceptinTM ;曲妥珠單抗及其製備方法闡述於US 5,821，337 中）抗體（Hudziak，R_, M.等人，Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1 165-1 172 ; Fendly，Β·, Μ.等人，Cancer Research 50 (1990) 1550-1558);或b)藉由尤其使用人類ErbB-2蛋 白或其核酸或片段實施之重新免疫方法或藉由噬菌體展示 法獲得之新抗-ErbB-2抗體。 MET(間質-上皮過渡因子）係編碼蛋白MET之原癌基因 (亦稱作c-Met ;肝細胞生長因子受體HGFR ; HGF受體；擴 散因子受體；SF受體；SEQ ID NO:13)(Dean，M.等人， Nature 3 18 (1985) 385-8 ; Chan，A.Μ.等人，Oncogene 1 (1987) 229-33 ; Bottaro，D.P.等人，Science 251 (1991) 802-4 ; Naldini，L.等人，EMBO J. 10 (1991) 2867-78 ; Maulik，G.等人，Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2002) 41-59)。MET係胚胎發育及傷口癒合必需之膜受體。肝細 胞生長因子（HGF)係MET受體之唯一已知配體。MET通常 由上皮來源之細胞表現’而HGF之表現受限於間質來源之 細胞。在HGF刺激後，MET誘導若干種生物反應，其共同 引發稱作侵襲性生長之程序。癌症中之異常MET活化與預 146956.doc -17- 201039849 後不良有關，其中活性異常的MET誘發腫瘤生長、形成向 腫瘤供應營養之新血管（血管發生）、及癌症向其他器官擴 散（轉移）。MET在多種類型之人類惡性腫瘤中解除調節， 包括腎癌、肝癌、胃癌、乳癌及腦癌。通常，僅幹細胞及 祖細胞表現MET，其使得該等細胞可侵襲性生長以在胚胎 中生成新組織或在成人中使受損組織再生。然而，人們認 為癌症幹細胞可劫持正常幹細胞表現met之能力，且由此 使得癌症可持續存留並擴散至體内其他位點。 特異性結合人類c-Met之抗原結合位點及尤其重鏈可變 結構域（VH)及/或抗體輕鏈可變結構域（VL)可源自a)已知 抗-c-Met抗體（例如如 US 5,686,292、US 7,476,724、WO 2004/072117、WO 2004/108766、WO 2005/016382、WO 2005/063816、WO 2006/015371、WO 2006/10491 1、WO 2007/126799、或 WO 2009/007427 中所述）；b)藉由（例如） 尤其使用人類抗-c-Met蛋白或其核酸或片段實施之重新免 疫方法或藉由噬菌體展示法獲得之新抗-c-Met抗體。 本發明另一態樣係特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met之 雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-2之第一抗 原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位 點，其特徵在於 該特異性結合ErbB-2之第一抗原結合位點包含序列SEQ ID ΝΟ:1作為重鏈可變結構域，且包含序列SEQ ID ΝΟ··2 作為輕鏈可變結構域；且
該特異性結合c-Met之第二抗原結合位點包含序列SEQ 146956.doc -18- 201039849 IDN〇:3作為重鏈可變結構域，且包含序列seqidno:4 作為輕鏈可變結構域。 抗體特異性係指抗料抗原特定表位之選擇性識別。例 如’天然抗體具有單特異性。本發明「雙特異性抗體」係 具有兩種不同抗原結合特異性之抗體。倘若抗體具有不止 種特〖生，則所識別表位可能與單一抗原或不止一種抗 原相關。本發明抗體對兩種不同抗原具有特異性，即作為 D 第一抗原之ErbB-2及作為第二抗原之c_Met。 本文所用術語「單特異性」抗體表示具有一或多個結合 位點之抗體，該等結合位點各自結合相同抗原上之相同表 位。 本申印案所用術語「價」表示抗體分子中存在特定數量 之結合位點。因此，術語「二價」、「四價」、及「六 4貝」分別表示在抗體分子中存在兩個結合位點、四個結合 位點、及六個結合位點。本發明雙特異性抗體至少為「二 Q 價」且可為「三價」或「多價」（例如「四價」或「六 價」）。 本發明抗體之抗原結合位點可含有六個互補決定區 (CDR)，其不同程度地促進結合位點對抗原之親和力。存 在三個重鏈可變結構域CDR(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及 三個輕鏈可變結構域CDR(CDRL1、CDRL2及CDRL3)。 CDR及框架區（FR)之範圍取決於與胺基酸序列之經編譯數 據庫的比對，其中該等區域已根據各序列間之差異加以界 定。本發明範圍内亦包含包括較少CDR(即其中結合特異 146956.doc •19· 201039849 性取決於三個、四個或五個CDR)之功能性抗原結合位 點。舉例而言，不足全套6個CDR之CDR數對於結合即已 足夠。在某些情形下，VH或VL結構域即足夠。 在較佳實施例中，本發明抗體另外包含一或多個人源免 疫球蛋白種類之免疫球蛋白恆定區。免疫球蛋白種類包括 IgG、IgM、IgA、IgD、及IgE同種型，且在IgG及IgA情形 下包括其亞型。在一較佳實施例中，本發明抗體具有IgG 型抗體之恆定結構域結構，且具有四個抗原結合位點。此 係藉由（例如）以下方式來完成：連接一個（或兩個）特異性 結合c-Met之完整抗原結合位點（例如單鏈Fab片段或單鏈 Fv)與特異性結合ErbB-2之完整抗體之N或C端重鏈或輕 鏈，從而產生三價雙特異性抗體（或四價雙特異性抗體）。 或者可使用針對人類ErbB-2及人類C-met之IgG樣雙特異性 二價抗體，其包含免疫球蛋白恆定區，如（例如）以下文獻 中所述：EP 07024867.9、EP 07024864.6、EP 07024865.3 或 Ridgway, J.B., Proteih Eng. 9 (1996) 617-621 ; WO 96/02701 1 ; Merchant, A.M.等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell，S.等人，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35及 EP 1870459A1。 本文所用術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指 具有單一胺基酸組成之抗體分子製劑。 術語「嵌合抗體」係指包含來自一種來源或物種之可變 區（即結合區）及源自不同來源或物種之恆定區之至少一部 分的抗體，其通常係藉由重組DNA技術來製備。包含鼠類 146956.doc •20- 201039849 可變區及人類悝定區之嵌合抗體較佳。本發明所涵蓋之其 他較佳形式之「嵌合抗體」係彼等恆定區已相對於原始抗 體進行修飾或改變從而尤其在Clq結合及/或以受體（FcR) 結合方面獲得本發明特性者。該等嵌合抗體亦稱作「種類 轉換抗體」。嵌合抗體係免疫球蛋白基因之表現產物，該 等免疫球蛋白基因包含編碼免疫球蛋白可變區2DNA片段 及編碼免疫球蛋白恆定區之DNA片段。製備嵌合抗體之方 ^ 法涉及業内熟知之習用重組DNA及基因轉染技術。例如， 參見Morrison, S.L.等人 ’ proc· Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ; US 5,202,238及US 5,204,244。 術語「人類化抗體」係指框架區或「互補決定區」 (CDR)已經修飾而包含與親代免疫球蛋白CDR相比具有不 同特異性之免疫球蛋白CDR的抗體。在一較佳實施例中， 將鼠類CDR移植入人類抗體之框架區中以製備「人類化抗 體」。例如’參見Riechmann，l.等人，Nature 332 (1988) ◎ 323·327 ;及Neuberger，M.S.等人，Nature 314 (1985) 268- 270。尤佳CDR對應於嵌合抗體中彼等代表可識別上述抗 原之序列者。本發明所涵蓋之其他形式之「人類化抗體」 係彼等恆定區已相對於原始抗體進行額外修飾或改變從而 尤其在Clq結合及/或^受體（FcR)結合方面獲得本發明特 性者。 本文所用術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類種系 免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。人類抗體已為 Μ Θ 業内所熟知（van Dijk, M.A.及 van de Winkel JG , 146956.doc •21- 201039849
Curr. Opin. Chem· Biol· 5 (2001) 368-374)。亦可在轉基因 動物（例如小鼠）中產生人類抗體，該等轉基因動物在免疫 後能在不產生内源免疫球蛋白之情況下產生全譜系之人類 抗體或所選人類抗體。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉 移至s玄等種系之突變小鼠中使得可在抗原激發後產生人類 抗體（例如，參見Jakobovits, A·等人，Proc_ Natl. Acad.
Sci. USA 90 (1993) 2551-2555 ; Jakobovits，A.等人，
Nature 362 (1993) 255-258 ; Brueggemann，Μ·等人，Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。人類抗體亦可在噬菌體展示文 〇 庫中產生（Hoogenboom，H.R.及 Winter，G.J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ; Marks，J.D.等人，J. Mol· Biol. 222 (1991) 581-597)。亦可使用 Cole，S.P.C.等人及 Boerner，p 等人之技術來製備人類單株抗體（Cole, S.P.C.等人， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A L (1985) 77-96 ;及 Boerner，P.等人，J. Immun〇i 147 (1991) 86-95)。如已提及之本發明嵌合及人類化抗體，本文所用 術語「人類抗體」亦包含該等恆定區中經修飾從而尤其在❹ Clq結合及/或FcR結合方面獲得本發明特性之抗體，例如 藉由「種類轉換」來修飾，即，使Fc部分發生改變或突變 (例如自IgGl變為igG4及/或IgGl/IgG4突變）。 本文所用術語「重組人類抗體」意欲包括所有藉由重組 方式製備、表現、產生或分離之人類抗體，例如自諸如 NS0或CHO細胞等宿主細胞或自人類免疫球蛋白基因之轉 基因動物（例如小鼠）分離之抗體、或使用轉染至宿主細胞 146956.doc -22· 201039849 中之重組表現载體表現之抗體。該等重組人類抗體具有呈 重排形式之可變及’艮定區。本發明之重組人類抗體已發生 體内體細胞超突變。因此，重組抗體之慨凡區之胺基 酸序列雖然源自人類種系Vi^VL序列且與之相關，但並 非天然存在於活體内人類抗體種系譜中。 本文所用「可變結構域」（輕鏈可變結構域（vl)、重鏈 可變區（VH))表示直接參與抗體與抗原結合之輕鏈及重鍵 對申之每一者。人類輕鏈及重鏈可變結構域具有相同一般 結構，且每一結構域包含四個序列高度保守之框架區 (FR)，經由二個「超變區」（或互補決定區，cdr)連接。 框架區採用β-片構形，CDRs可形成連接p_片結構之環。各 鏈中之CDRs藉由框架區保持三維結構，並與另一鏈中之 CDRs —起形成抗原結合位點。抗體重鏈及輕鏈之cDR3區 在本發明抗體之結合特異性/親和性方面具有特別重要之 作用’由此提供本發明之另一目的。 本文所用術語「超變區」或「抗體之抗原結合部分或抗 原結合位點」係指抗體中負責與抗原結合之胺基酸殘基。 超變區包含「互補決定區」或「CDRs」之胺基酸殘基。 「框架」或「FR」區係本文所定義超變區殘基以外的可變 結構域區。因此’抗體之輕鏈及重鏈自N端至C端包含結 構域 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。各鏈 上之CDRs係藉由該等框架胺基酸間隔。重鏈之CDR3尤其 為對抗原結合貢獻最大之區域。CDR及FR區係根據Rabat 等人（Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 146956.doc -23- 201039849 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Be the sd a, MD (1991))之標準定義確定。 本文所用術語「結合」或「特異性結合」係指抗體在體 外分析中與抗原（人類ErbB-2或人類c-Met)表位之結合，較 佳在電漿共振分析（BIAcore，GE-Healthcare Uppsala, Sweden)中與純化野生型抗原之結合。結合親和力係以術 語ka(抗體/抗原複合物中抗體之結合速率常數）、kD(解離 常數）及KD (kD/ka)定義。結合或特異性結合意指結合親和 力（KD)為 10_8 moin或更低，較佳 10_9 Μ 至 10·13 molA。因 此，本發明雙特異性<ErbB2-c-Met>抗體以10_8 mol/1或更 低、較佳1(Τ9 Μ至10_13爪〇1八之親和力（KD)與各特異性抗原 特異性結合。 可藉由 BIAcore 分析（GE-Healthcare Uppsala, Sweden)來 研究抗體與FcyRIII之結合。結合親和力定義為術語ka(抗 體/抗原複合物中抗體結合之速率常數）、kD(解離常數）及 KD (kD/ka)。 術語「表位」包括能特異性結合抗體之任何多肽決定 簇。在某些實施例中，表位決定簇包括分子之化學活性表 面基團，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基、或磺醯基，且在 某些實施例中可具有特定的三維結構特徵及/或比電荷特 徵。表位係抗原中結合抗體之區域。 在某些實施例中，當抗體在蛋白質及/或高分子複合混 合物中優先識別其靶抗原時，認為該抗體可特異性結合該 抗原。 146956.doc -24- 201039849 本申请案中所用術語「恆定區」表示抗體中除可變區以 外之結構域的總和。恆定區並非直接參與抗原結合，而是 表現出各種效應子功能。端視抗體重鏈恆定區之胺基酸序 列’可將抗體分為以下幾類：IgA、IgD、IgE、igG及 IgM ’且其中若干種類可進一步分為多個亞類，例如 IgGl、IgG2、IgG3 及 IgG4、IgAl 及 IgA2。對應於不同抗 體種類之重鏈怪定區分別稱作α、§、ε、γ及μ。在所有五 種抗體種類中可發現之輕鏈恆定區稱作K (kappa)及λ (lambda)。恆定區較佳得自人類來源。 本申請案中所用術語「得自人類來源之恆定區」表示 IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類人類抗體之重鏈恆定區及/ 或輕鏈TC或λ恆定區^該等恆定區為當前業内所熟知且由 (例如）Kabat，Ε. Α.所闡述（例如，參見j〇hnson，G.及Wu， T.T. > Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 ； Kabat, E.A. 等人 ’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788)。 在一實施例中’本發明雙特異性抗體包含IgG丨或IgG3亞 類（較佳為IgGl亞類）之恆定區，其較佳得自人類來源。在 一實施例中’本發明雙特異性抗體包含IgG1或IgG3亞類 (較佳為IgGl亞類）之Fc部分，其較佳得自人類來源。
IgG4亞類之抗體顯示降低之Fc受體（FcyRIIIa)結合，同 時其他IgG亞類之抗體顯示較強結合。然而，Pr〇23 8、
Asp265、Asp270、Asn297(喪失Fc碳水化合物）、pr〇329、 Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、 Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、及His435係在改變後 146956.doc •25- 201039849 亦可提供降低之Fc受體結合之殘基（Shields，R.L.等人，J. Biol· Chem, 276 (2001) 6591-6604 ; Lund，J·等人，FASEB J. 9 (1995) 1 15-1 19 ; Morgan, A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ; EP 0 307 434)。 在一實施例中，本發明抗體相對於IgGl抗體及全長親代 抗體具有降低之FcR結合，其在FcR結合方面屬於IgG4亞 類或IgGl或IgG2亞類且在S228、L234、L23 5及/或D265處 具有突變，及/或含有PVA236突變。在一實施例中，全長 親代抗體中之突變係S228P、L234A、L235A、L235E及/或 PVA236。在另一實施例中，全長親代抗體中之突變係 IgG4 S228P及 IgGl L234A及 L235A ° 抗體恆定區直接參與ADCC(抗體依賴性細胞介導細胞毒 性）及CDC(補體依賴性細胞毒性）。補體活化（CDC)係藉由 使補體因子Clq與大多數IgG抗體亞類之怪定區結合來起 始。Clq與抗體之結合係藉由在所謂的結合位點實施所定 義之蛋白質間交互作用來引發。該等恆定區結合位點為當 前業内所知且闡述於（例如）以下文獻中：Lukas，T· J.，等 人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ’ Brunhouse，R.，及
Cebra, J. J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917 , Burton, D. R.，等人，Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen，J. E.，等 人，Mol· Immunol. 37 (2000) 995-1004，Idusogie，E. E.，等 人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 ; Hezareh，M·，等 人，J. Virol. 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan, A.，等人’
Immunology 86 (1995) 319-324 ;及邱 0 307 434。該等恆 146956.doc •26- 201039849 定區結合位點之特徵在於（例如）胺基酸L234、L235、 D270、N297、E318、K320、K322、P331 及 P329(根據 Kabat之EU索引來編號）。 術語「抗體依賴性細胞毒性（ADCC)」係指人類靶細胞 在效應子細胞存在下由本發明抗體溶解。較佳在效應子細 胞存在下藉由用本發明抗體處理ErB-Ι及c-Met表現細胞之 製劑來測量ADCC，該等效應子細胞例如剛分離之PBMC 或自血沉棕黃層純化之效應子細胞，例如單核細胞或天然 殺傷（NK)細胞或持久生長NK細胞系。 術語「補體依賴性細胞毒性（CDC)」表示藉由使補體因 子Clq與大多數IgG抗體亞類之fc部分結合來起始之過程。 C1 q與抗體之結合係藉由在所謂的結合位點實施所定義之 蛋白質間交互作用來引發。該等Fc部分結合位點為當前業 内已知（參見上文）。該等Fc部分結合位點之特徵在於（例 如）胺基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、 K322、P331、及P3 29(根據Kabat之EU索引來編號）。 IgGl、IgG2及IgG3亞類抗體通常顯示包括ciq及C3結合在 内之補體活化’而IgG4不活化補體系統且不結合ciq及/或 C3。 單株抗體之細胞介導效應子功能可藉由改造其寡糖組份 來增強’如Umana，P.等人，Nature Biotechnol· 17 (1999) 176-180 ;及US 6,602,684所述。IgG1型抗體係最常用治療 性抗體’其為在各CH2結構域中之Asn297處具有保守N—連 接糖基化位點之糖蛋白。與Asn297附接之兩種複雜二天線 146956.doc -27- 201039849 (biantennary)寡糖包埋於CH2結構域之間，與多肽骨架形 成廣泛接觸，且其存在為抗體介導諸如抗體依賴性細胞毒 性（ADCC)等效應子功能所必需（Lifely, M. R.等人’ Glycobioiogy 5 (1995) 813-822 ; Jefferis, R.等人， Immunol· Rev. 163 (1998) 59-76 ; Wright, A.及 Morrison, S. L,，Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32)。Umana, P·等 人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及 WO 99/54342 顯示，中國倉鼠卵巢（CHO)細胞中β(1,4)-Ν-乙醢葡糖胺基 轉移酶III (「GnTIII」）（一種催化形成二等分型（bisected) 募糖之糖基轉移酶）之過表現可顯著提高抗體之活體外 ADCC活性。Asn297碳水化合物組成中之改變或其消除亦 影響與FcYR及Clq之結合（Umana, P.等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ; Davies，J.等人， Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294 ; Mimura, Y.等人， J. Biol. Chem· 276 (2001) 45539-45547 ; Radaev, S.等人， J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483 ; Shields，R.L.等 人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ; Shields，R.L.等 人，J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740 ； Simmons, L.C·等人，J· Immunol. Methods 263 (2002) 133-147)。 藉由減少岩藻糖之量來增強單株抗體之細胞介導效應子 功能之方法闡述於（例如）以下文獻中：WO 2005/0185 72、 WO 2006/116260、WO 2006/1 14700、WO 2004/065540、 WO 2005/01 1735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、 US 2006/0134709 、 US 2005/0054048 、 US 2005/0152894 、 146956.doc -28- 201039849 WO 2003/035835、WO 2000/061739 ; Niwa，R.等人，J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa，T.等 人，J Biol Chem，278 (2003) 3466-3473 ; WO 03/055993 或 US 2005/0249722。 在本發明一實施例中，本發明雙特異性抗體在Asn297處 經糖鏈糖基化（IgGl或IgG3亞類），其中該糖鏈内岩藻糖之 量為65%或更低（根據Kabat進行編號）。在另一實施例中， 該糖鏈内岩藻糖之量介於5%與65%之間，較佳介於20%與 40%之間。本發明「Asn297」意指大致位於Fc區中297位 之胺基酸天冬醯胺。基於抗體間之較小序列差異，Asn297 亦可位於297位上游或下游之數個胺基酸（通常不超過士3個 胺基酸）處，即介於294位與300位之間。 人類IgGl或IgG3之糖基化發生在Asn297處，其為核心岩 藻糖化二天線複雜募糖糖基化形式，末端為最多2個Gal殘 基。人類IgGl或IgG3亞類之重鏈恆定區詳細報導於以下文 獻中：Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service， National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991);及 Brueggemann, Μ·等人，厂£乂？.1^^(1.166 (1987) 1351-1361 ; Love，T.W.等人，Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527。該等結構端視末端Gal殘基之量命名為GO、 Gl(a-1，6-或 α-1，3-)或 G2 聚糖殘基（Raju，T.S·，Bioprocess Int.l (2003) 44-53)。抗體Fc部分之CHO類糖基化闡述於 (例如）Routier，F.H·，Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207 146956.doc -29- 201039849 中。以重組方式在未經糖基修飾之CHO宿主細胞中表現之 抗體通常在Asn297處以至少85°/。之比例經岩藻糖化。全長 親代抗體之經修飾寡糖可為雜合寡糖或複雜寡糖。二等分 型、經還原/未岩藻糖化募糖較佳為雜合寡糖。在另一實 施例中，二等分型、經還原/未岩藻糖化寡糖為複雜募 糖。 本發明「岩藻糖之量」意指在Asn297處之糠鏈内，該糖 相對於附接至Asn297之所有糖結構（例如複雜結構、雜合 體結構及高甘露糖結構）之總和之量’其係藉由MALDI-TOF 質譜法來測量且計算為平均值。藉由MALDI-TOF，岩藻 糖之相對量係含岩藻糖結構相對於N-糖苷酶F處理樣品中 所有確定糖結構（分別例如複雜結構、雜合體結構及寡-及高-甘露糖結構）之百分比。（例如，參見W02008/077546(A1))。 一實施例係製備在Asn297處經糖鏈糖基化之IgGl或IgG3 亞類雙特異性抗體之方法，其中岩藻糖在該糖鏈内之量為 65%或更低，且使用以下文獻中所述之程序：WO 2005/044859 、WO 2004/065540 、W02007/031875 ；
Umana, P.等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ; WO 99/154342、WO 2005/018572、WO 2006/1 16260、WO 2006/1 14700、WO 2005/01 1735、WO 2005/027966、WO 97/028267、US 2006/0134709 ' US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835 或 WO 2000/061739。 一實施例係製備在Asn297處經糖鏈糖基化之IgG 1或IgG3 亞類雙特異性抗體之方法，其中岩藻糖在該糖鏈内之量為 146956.doc -30- 201039849 65%或更低，且使用以下文獻中所述之程序：Niwa, R.等 人，J· Immunol. Methods 306 (2005) 151-160 ； Shinkawa, T.等人，J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473 ; WO 03/055993或 US 2005/0249722 ° 雙特異性抗體形式 本發明抗體具有兩個或更多個結合位點且為多特異性且 較佳為雙特異性。亦即，抗體甚至在具有兩個以上結合位 點（即抗體為三價或多價）之情形下亦可為雙特異性。本發 明雙特異性抗體包括（例如）多價單鏈抗體、雙鏈抗體及三 鏈抗體、以及具有全長抗體恆定結構域結構之抗體，該結 構經由一或多個肽連接體連接其他抗原結合位點（例如單 鏈Fv、VH結構域及/或VL結構域、Fab、或（Fab)2)。抗體 可為來自單一物種之全長抗體，或為嵌合抗體或人類化抗 體。對於具有兩個以上抗原結合位點之抗體而言，某些結 合位點可相同，只要該蛋白具有針對兩個不同抗原之結合 位點即可。亦即，若第一結合位點對ErbB-2具有特異性， 則第二結合位點對c-Met具有特異性，且反之亦然。 在一較佳實施例中，特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met之本發明雙特異性抗體包含抗體（較佳為IgGl或IgG3亞 類）之Fc區。 二價雙特異性形式 可使用針對人類ErbB-2及人類C-met且包含免疫球蛋白 恆定區之雙特異性二價抗體，如（例如）以下文獻中所述： WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253 或 146956.doc -31- 201039849
Ridgway, J.B. » Protein Eng. 9 (1996) 617-621 ϊ WO 96/027011 ； Merchant, A.M.等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell，S.等人，J. Mol. Biol· 270 (1997) 26-35 及 EP 1870459A1。 因此，在本發明一實施例中，本發明雙特異性<ErbB-2-c-Met>抗體係二價雙特異性抗體，其包含： a) 全長抗體中特異性結合ErbB-2之輕鏈及重鏈；及 b) 全長抗體中特異性結合人類C-met之輕鏈及重鏈’ 其中恆定結構域CL及CH1、及/或可變結構域VL及VH可 彼此替代。 在本發明另一實施例中，本發明雙特異性<ErbB-2-c-Met> 抗體係二價雙特異性抗體，其包含： a) 全長抗體中特異性結合人類C-met之輕鏈及重鏈；及 b) 全長抗體中特異性結合ErbB-2之輕鏈及重鏈， 其中恆定結構域CL及CH1、及/或可變結構域VL及VH可 彼此替代。 下文所述「隆凸-孔洞結合（knob-into-hole)」技術之實 例性示意性結構參見圖2a-c。 為改良該等異二聚二價雙特異性抗-ErbB-2/抗-C-met抗 體之產率，可藉由「隆凸-孔洞結合」技術來改變該全長 抗體之CH3結構域，該技術以若干個實例詳細闡述於（例 如）以下文獻中：WO 96/02701 1 ; Ridgway，J.B.等人’ Protein Eng 9 (1996) 617-621 ;及 Merchant, A.M.等人’ Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681。在此方法中，兩個 CH3 146956.doc -32· 201039849 結構域之父互作用表面經改變以增強含有該兩個CH3結構 域之兩條重鏈之異二聚化作用。兩個CH3結構域（兩條重鏈 中）之每一者皆可為Γ隆凸」，而另一者為「孔洞」。引 入一硫橋可穩定異二聚體（Merchant, A，M.等人，Nature
Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell，S.等人，j. M〇1‘ Bi〇1 270 (1997) 26-35)並提高產率。 因此在本發明一態樣中，該二價雙特異性抗體之特徵另 外在於： 一條重鏈之CH3結構域及另一條重鏈之CH3結構域各自 在包含抗體CH3結構域間之初始介面之介面處相遇； 其中該介面經改變以促進二價雙特異性抗體之形成，其中 該改變之特徵在於： a) —條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使得在二價雙特異性抗體内，在遇到一條重鏈之Ch3 結構域之初始介面的另一條重鏈之CH3結構域的初始介面 内， 胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基替代，從而 在一條重鏈之CH3結構域之介面内生成突出物，其可定位 於另一條重鏈之CH3結構域之介面内的腔令， 及 b) 另一條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使得在二價雙特異性抗體内，在遇到第一 CH3結構域 之初始介面的第二CH3結構域之初始介面内， 胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基替代，由此 146956.doc 33- 201039849 在第二CH3結構域之介面内生成腔，其中可定位第一 CH3 結構域之介面内之突出物。 該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成 之群：精胺酸（R)、***酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸 (W)。 該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成 之群：丙胺酸（A)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（T)、纈胺酸（V)。 在本發明一態樣中，兩個CH3結構域進一步發生以下改 變：在各CH3結構域之相應位置引入半胱胺酸（C)作為胺基 酸，從而可在兩個CH3結構域之間形成二硫橋。
在一較佳實施例中，該二價雙特異性抗體在「隆凸鏈」 之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔洞鏈」之CH3結 構域中包含T366S、L368A、Y407V突變。亦可藉由（例如） 在「隆凸鏈」之CH3結構域中引入Y349C突變且在「孔洞 鏈」之CH3結構域中引入E356C突變或S354C突變來使用 CH3結構域之間之另一鏈間二硫橋（Merchant, A.M等人， Nature Biotech 16 (1998) 677-681)。因此在另一較佳實施 例中，該二價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中 包含Y349C、T3 66W突變且在兩個CH3結構域中之另一者 中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突變；或該二價雙 特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S354C、T366S、L368A、Y407V突變（一個 CH3結構域中之 額外Y349C突變與另一 CH3結構域中之額外E356C或S354C 146956.doc -34- 201039849 突變形成鏈間二硫橋）（始終根據Kabat2 EU索引來編號）。 但或者或另外，亦可使用其他隆凸-孔洞結合技術，如EP 1 870459A1所述。該二價雙特異性抗體之較佳實例係··在 「隆凸鏈」之CH3結構域中具有R409D ; K370E突變且在 「孔洞鏈」之CH3結構域中具有D399K ; E357K突變（始終 根據Kabat之EU索引來編號）。 在另一較佳實施例中，該二價雙特異性抗體在「隆凸 鏈」之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔洞鏈」之 CH3結構域中包含T366S、L368A、Y407V突變，且另外在 「隆凸鏈」之CH3結構域中包含R409D ; K370E突變並在 「孔洞鏈」之CH3結構域中包含D399K ; E357K突變。 在另一較佳實施例中，該二價雙特異性抗體在兩個CH3 結構域中之一者中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3 結構域中之另一者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V 突變；或該二價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者 中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一 者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突變，且另外在 「隆凸鏈」之CH3結構域中包含R409D ; K370E突變並在 「孔洞鏈」之CH3結構域中包含D399K ; E357K突變。 三價雙特異性形式 本發明之另一較佳態樣係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-2且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕 鏈組成之全長抗體；及 b) —個特異性結合人類c_Met之單鏈Fab片段， 146956.doc -35- 201039849 其中该b)中之單鏈Fab片段經由該勾中之全長抗體重鏈 或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 下文所述「隆凸-孔洞結合」技術之實例性示意性結構 參見圖5a。 本發明之另一較佳態樣係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB_2且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕 鏈組成之全長抗體；及 b) —個特異性結合人類c_Met之單鏈Fv片段， 其中該b)中之單鏈!^片段經由該a)中之全長抗體重鏈或 輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 下文所述「隆凸-孔洞結合」技術之實例性示意性結構 參見圖5b。 在一較佳實施例中’該結合人類c_Met之單鏈Fab或Fv片 段經由該全長抗體重鏈C端之肽連接物與該全長抗體融 合。 本發明之另一較佳態樣係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-2且由兩個抗體重鏈及兩個抗體 輕鏈組成之全長抗體； b) 由以下組成之多肽： ba) 抗體重鏈可變結構域（VH);或 bb) 抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域1 (CH1)， 其中該多肽以該VH結構域之N端經由肽連接物 與該全長抗體兩條重鏈中一條之C端融合； 146956.doc -36- 201039849 C)由以下組成之多肽： ca) 抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 cb) 抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構 域（CL); 其中該多肽以該VL結構域之N端經由肽連接物與該 全長抗體兩條重鏈中另一條之C端融合； 且其中該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及該幻 〇 中之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL)一起形成特異 性結合人類c-Met之抗原結合位點0 該等b)及c)中之肽連接物較佳相同且為具有至少乃個胺 基酸、較佳介於30與50個胺基酸之間之肽。 實例性示意性結構參見圖3a_c。 視需要藉由在以下位置之間引入二硫鍵經由鏈間二硫橋 來連接及穩定該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及 s亥c)中之多肽之抗體輕鍵可變結構域（vl): Q 〇重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域1〇〇位， ii) 重鏈可變結構域105位與輕鏈可變結構域43位，或 iii) 重鏈可變結構域101位與輕鏈可變結構域1〇〇位（始終根 據Kabat之EU索引來編號）。 引入非天然二硫橋來進行穩定之技術闡述於（例如）以下 文獻中：WO 94/029350、Rajagopal等人，Pr〇t Engin (1997) 1453-59 ; Kobayashi，Η·等人，Nuclear Medicine &
Biology 25 (1998) 387-393 ;或 Schmidt，M 等人， Oncogene 18 (1999) 171 1 -1721。在一實施例中，…及^中 146956.doc •37- 201039849 之多肽之可變結構域之間的可選二硫鍵介於重鏈可變结構 域44位與輕鏈可變結構域1〇〇位之間。在一實施例中，b) 及c)中之多肽之可變結構域之間的可選二硫鍵介於重鏈可 變結構域105位與輕鏈可變結構域43位之間（始終根據 Kabat之EU索引來編號）。在一實施例中，在單鏈Fab片段 之可變結構域VH與VL之間未經該可選二硫鍵穩定之三價 雙特異性抗體較佳。 藉由融合單鏈Fab、Fv片段與重鏈中之一者（圖5&或51)) 或藉由融合不同多肽與全長抗體之兩個重鏈（圖3a_c),獲 得異二聚三價雙特異性抗體。為改良該等異二聚三價雙特 異性抗-ErbB-2/抗-C-met抗體之產率，可藉由「隆凸_孔洞 結合」技術來改變該全長抗體之CH3結構域，該技術以若 干個實例詳細闡述於（例如）以下文獻中：WO 96/02701 1 ;
Ridgway，J，B.等人，Protein Eng 9 (1996) 617-621 ;及 Merchant, Α·Μ.等人，Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681。 在此方法中，兩個CH3結構域之交互作用表面經改變以增 強含有該兩個CH3結構域之兩條重鏈之異二聚化作用。兩 個CH3結構域（兩條重鏈中）之每一者皆可為「隆凸」，而 另一者為「孔洞」。引入二硫橋可穩定異二聚體 (Merchant, Α·Μ·等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell, S.等人，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)並提高產 率。 因此在本發明一態樣中，該三價雙特異性抗體之特徵另 外在於 146956.doc -38- 201039849 全長抗體中一條重鏈之CH3結構域及全長抗體中另一條重 鏈之CH3結構域各自在包含抗體CH3結構域之間之初始介 面的介面處相遇； 其中該介面經改變以促進二價雙特異性抗體之形成，其中 該改變之特徵在於： a) —條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使得在二價雙特異性抗體内，在遇到一條重鏈之Ch3 結構域之初始介面的另一條重鏈之CH3結構域的初始介面 〇内， 胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基替代，從而 在一條重鏈之CH3結構域之介面内生成突出物，其可定位 於另一條重鏈之CH3結構域之介面内的腔中， 及 b) 另一條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使得在三價雙特異性抗體内，在遇到第一 CH3結構域 Q 之初始介面的第二CH3結構域之初始介面内， 胺基酸殘基經具有較小侧鏈體積之胺基酸殘基替代，由此 在第二CH3結構域之介面内生成腔，其中可定位第一 CH3 結構域之介面内之突出物。 該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成 之群：精胺酸（R)、***酸（F)、酪胺酸（γ)、色胺酸 (W)。 該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成 之群：丙胺酸（A)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（T)、纈胺酸（V)。 146956.doc •39- 201039849 在本發明一態樣中，兩個CH3結構域進一步發生以下改 變：在各CH3結構域之相應位置引入半胱胺酸（C)作為胺基 酸，從而可在兩個CH3結構域之間形成二硫橋。 在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體在「隆凸鏈」 之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔洞鏈」之CH3結 構域中包含T366S、L368A、Y407V突變。亦可藉由（例如） 在「隆凸鏈」之CH3結構域中引入Y349C突變且在「孔洞 鏈」之CH3結構域中引入E356C突變或S354C突變來使用 CH3結構域之間之另一鏈間二硫橋（Merchant, A.M.等人， Nature Biotech 16 (1998) 677-681)。因此在另一較佳實施 例中，該三價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中 包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者 中包含E3 56C、T3 66S、L368A、Y407V突變；或該三價雙 特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S354C、T366S、L368A、Y407V突變（一個 CH3結構域中之 額外Y349C突變與另一 CH3結構域中之額外E356C或S354C 突變形成鏈間二硫橋）（始終根據Kabat之EU索引來編號）。 但或者或另外，亦可使用其他隆凸-孔洞結合技術，如EP 1 870459A1所述。該三價雙特異性抗體之較佳實例係：在 「隆凸鏈」之CH3結構域中具有R409D ; K370E突變且在 厂孔洞鏈」之CH3結構域中具有D399K ; E357K突變（始終 根據Kabat之EU索引來編號）。 在另一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體在「隆凸 146956.doc 40· 201039849 鏈」之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔洞鏈」之 CH3結構域中包含T366S、L368A、Y407V突變，且另外在 「隆凸鏈」之CH3結構域中包含R409D ; K370E突變並在 「孔洞鏈」之CH3結構域中包含D399K ; E357K突變。 在另一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體在兩個CH3 結構域中之一者中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3 結構域中之另一者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V 突變；或該三價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者 中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一 者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突變，且另外在 「隆凸鏈」之CH3結構域中包含R409D ; K370E突變並在 「孔洞鏈」之CH3結構域中包含D399K ; E357K突變。 本發明之另一實施例係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-2且由以下組成之全長抗體： aa) 兩個抗體重鏈，其在n端至C端方向上由以下組成： 抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域1 (CH1)、抗體鉸鏈區（hr)、抗體重鏈恆定結構域2 (CH2) 及抗體重鏈恆定結構域3 (CH3);及 ab) 兩個抗體輕鏈，其在n端至C端方向上由以下組成： 抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構域（CL) (VL-CL);及 b) —個特異性結合人類c_Met之單鏈Fab片段， 其中該單鏈Fab片段係由抗體重鏈可變結構域（VH)及抗 體恆定結構域1 (CH1)、抗體輕鏈可變結構域（VL)、抗 146956.doc -41 - 201039849 體輕鏈恆定結構域（CL)及連接體組成，且其中該等抗體 結構域及該連接體在N端至C端方向上具有以下順序中 之一種： ba) VH-CH1-連接體-VL-CL，或 bb) VL-CL-連接體-VH-CH1 ； 其中該連接體係具有至少30個胺基酸、較佳具有介於32 與50個之間之胺基酸的肽； 且其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體的重鏈 或輕鏈C或N端（較佳位於重鏈C端）之肽連接物與該全長抗 體融合； 其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸、較佳具有介於 10與50個之間之胺基酸之肽。 在此實施例中，三價雙特異性抗體較佳在兩個CH3結構 域中之一者中包含T366W突變且在兩個CH3結構域中之另 一者中包含T366S、L368A、Y407V突變，且該三價雙特 異性抗體更佳在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S354C(^ E356C) ' T366S ' L368A ' Y407V ^ ft。在該實 施例中，三價雙特異性抗體視需要在「隆凸鏈」之CH3結 構域中包含R409D ; K370E突變並在「孔洞鏈」之CH3結 構域中包含D399K ; E357K突變。 本發明之另一實施例係三價雙特異性抗體，其包含 a)特異性結合人類ErbB-2且由以下組成之全長抗體： aa)兩個抗體重鏈，其在N端至C端方向上由以下組成： 146956.doc -42- 201039849 抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域1 (CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結構域2 (CH2) 及抗體重鏈恆定結構域3 (CH3);及 ab)兩個抗體輕鏈，其在N端至C端方向上由以下組成： 抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構域（CL) (VL-CL);及 b) —個特異性結合人類c-Met之單鏈Fv片段， 其中該b)中之單鏈Fv片段經由該a)中之全長抗體的重鏈 或輕鏈C或N端（較佳位於重鏈C端）之肽連接物與該全長 抗體融合；且 其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸、較佳具有介於 10與50個之間之胺基酸之肽。 在此實施例中，三價雙特異性抗體較佳在兩個CH3結構 域中之一者中包含T366W突變且在兩個CH3結構域中之另 一者中包含T366S、L368A、Y407V突變，且該三價雙特 異性抗體更佳在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S3 54C(或 E3 56C)、T3 66S、L3 68A、Y407V突變。在該實 施例中，三價雙特異性抗體視需要在「隆凸鏈」之CH3結 構域中包含R409D ; K370E突變並在「孔洞鏈」之CH3結 構域中包含D399K ; E357K突變。 因此一較佳實施例係三價雙特異性抗體，其包含 a)特異性結合人類ErbB-2且由以下組成之全長抗體： aa)兩個抗體重鏈，其在N端至C端方向上由以下組成： 146956.doc •43- 201039849 抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域1 (CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結構域2 (CH2) 及抗體重鏈恆定結構域3 (CH3);及 ab)兩個抗體輕鏈，其在N端至c端方向上由以下組成： 抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構域（CL) (VL-CL);及 b) —個特異性結合人類c_Met之單鏈ρv片段， 其中該b)中之單鏈!^片段經由該a)中之全長抗體的重鏈 C端之肽連接物與該全長抗體融合（產生兩個抗體重鏈_ 單鏈Fv融合肽）；且 其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸之肽。 本發明之另一實施例係三價雙特異性抗體，其包含 a)特異性結合人類ErbB-2且由以下組成之全長抗體： M)兩個抗體重鏈，其在N端至c端方向上由以下組成： k體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域工 (CH1)、抗體鉸鏈區（hr)、抗體重鏈恆定結構域2 (CH2) 及抗體重鏈恆定結構域3 (CH3);及 ab)兩個抗體輕鏈，其在n端至C端方向上由以下組成： 抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構域 (CL);及 b)由以下組成之多肽： ba) 抗體重鏈可變結構域（VH);或 bb) 抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域1 (CH1)， 146956.doc -44- 201039849 其中該多肽以該VH結構域之N端經由肽連接物與該全長 抗體兩條重鏈中一條之C端融合（產生抗體重鏈-VH融 合肽），其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸、較佳具 有介於25與50個之間之胺基酸之肽； c)由以下組成之多肽： ca) 抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 cb) 抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構域 (CL);
其中該多肽以該VL結構域之N端經由肽連接物與該全長 抗體兩條重鏈中另一條之C端融合（產生抗體重鏈-VL融 合肽）； 其中該肽連接物與b)中之肽連接物相同； 且其中該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及該c) 中之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL)—起形成特異性結 合人類c-Met之抗原結合位點。 在此實施例中，三價雙特異性抗體較佳在兩個CH3結構 域中之一者中包含T366W突變且在兩個CH3結構域中之另 一者中包含T366S、L368A、Y407V突變，且該三價雙特 異性抗體更佳在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S3 54C(或 E3 56C)、T3 66S、L3 68A、Y407V突變。在該實 施例中，三價雙特異性抗體視需要在「隆凸鏈」之CH3結 構域中包含R409D ; K370E突變並在「孔洞鏈」之CH3結 構域中包含D399K ; E357K突變。 146956.doc • 45- 201039849 在本發明另一態樣中，本發明三價雙特異性抗體包含 a) 結合人類ErbB-2且由兩個抗體重鏈VH-CH1-HR-CH2-CH3及兩個抗體輕鏈VL-CL組成之全長抗體； (其中兩個CH3結構域中之一者較佳包含Y349C、 T366W突變且兩個CH3結構域中之另一者包含 S354C(或 E3 56C)、T366S、L368A、Y407V突變）； b) 由以下組成之多肽： ba) 抗體重鏈可變結構域（VH);或 bb) 抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域1 (CH1)， 其中該多肽以該VH結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中一條之C端融合； c) 由以下組成之多肽： ca) 抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 cb) 抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構域 (CL); 其中該多肽以該VL結構域之N端經由肽連接物與該全 長抗體兩條重鏈中另一條之C端融合； 且其中該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及該c) 中之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL)—起形成特異性 結合人類c-Met之抗原結合位點。 四價雙特異性形式 在一實施例中，本發明多特異性抗體係四價，其中特異 性結合人類c-Met之抗原結合位點可抑制c-Met二聚化（例 146956.doc •46· 201039849 如，如 WO 2009/007427 中所述）。 在本發明一實施例中，該抗體係特異性結合人類ErbB-2 及人類c-Met之四價雙特異性抗體，其包含兩個特異性結 合人類ErbB-2之抗原結合位點及兩個特異性結合人類c-Met之抗原結合位點，其中該等特異性結合人類c-Met之抗 原結合位點可抑制c-Met二聚化（例如，如WO 2009/007427 中所述）。 因此，本發明另一態樣係四價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類c-Met且由兩個抗體重鏈及兩個抗體 輕鏈組成之全長抗體；及 b) 兩個相同的特異性結合ErbB-2之單鏈Fab片段， 其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體的 重鏈或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 因此，本發明另一態樣係四價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-2且由兩個抗體重鏈及兩個抗 體輕鏈組成之全長抗體；及 b) 兩個相同的特異性結合人類c-Met之單鏈Fab片段， 其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體的 重鏈或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 實例性示意性結構參見圖6a。 因此，本發明另一態樣係四價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合ErbB-2且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕 鍵組成之全長抗體；及 b) 兩個相同的特異性結合人類c-Met之單鏈Fv片段， 146956.doc -47- 201039849 其中該b)中之單鏈以片段經由該a)中之全長抗體的重 鏈或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 口此本發明另一態樣係四價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類c_Met且由兩個抗體重鏈及兩個抗體 輕鏈組成之全長抗體；及 b) 兩個相同的特異性結合ErbB_2之單鏈Fv片段， 其中該b)中之單鏈!^片段經由該a)中之全長抗體的重 鏈或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 實例性示意性結構參見圖6b。 在較佳實施例中，該等結合人類c-Met或人類ErbB-2 之早鏈Fab或Fv片段經由該全長抗體重鏈c端之肽連接物與 該全長抗體融合。 本發明之另一實施例係四價雙特異性抗體，其包含 特異性結合人類ErbB-2且由以下組成之全長抗體： aa) 兩個相同抗體重鏈，其在N端至C端方向上由以 下组成：抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈 恆定結構域1 (CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重 鏈恆定結構域2 (CH2)及抗體重鏈恆定結構域3 (CH3);及 ab) 兩個相同抗體輕鏈，其在N端至C端方向上由以 下組成：抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕 鏈恆定結構域（CL) (VL-CL);及 b)兩個特異性結合人類c-Met之單鏈Fab片段， 其·中該等單鏈Fab片段係由抗體重鏈可變結構域（VH) 146956.doc • 48- 201039849 及抗體恆定結構域1 (CHI)、抗體輕鏈可變結構域 (VL)、抗體輕鏈恆定結構域（CL)及連接體組成，且 其中該等抗體結構域及該連接體在N端至c端方向上 具有以下順序中之一種： ba) VH-CH1-連接體-VL-CL，或 bb) VL-CL-連接體 _ VH-CH1 ； 其中該連接體係具有至少30個胺基酸、較佳具有介 於32與50個之間之胺基酸的肽； 且其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體 的重鏈或輕鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融 合； 其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸、較佳具有介 於10與50個之間之胺基酸之肽。 三價或四價形式中所用術語「全長抗體」表示由兩個 「全長抗體重鏈」及兩個「全長抗體輕鏈」組成之抗體 (參見圖1)。「全長抗體重鏈」係在N端至C端方向上由以 下組成之多肽：抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定 結構域1 (CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結構域2 (CH2)及抗體重鏈恆定結構域3 (Ch3)，縮寫為VH-CH1-HR-Cm-Cm ;且在抗體為IgE亞類之情形下視需要包括抗 體重鏈恆定結構域4 (CH4)。「全長抗體重鏈」較佳為在N 端至C端方向上由VH、CHI、HR、CH2及CH3組成之多 肽。「全長抗體輕鏈」係在N端至C端方向上由以下組成 之多肽：抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構 146956.doc •49- 201039849 域（CL)，縮寫為VL-CL·。抗體輕鏈恆定結構域（CL)可為κ (kappa)或λ (lambda)。兩個全長抗體鏈經由（^結構域與 CH1結構域之間及全長抗體重鏈鉸鏈區之間之多肽内二硫 鍵連接在一起。典型全長抗體之實例係天然抗體，例如 IgG(例如 IgGl 及 IgG2)、IgM、IgA、IgD、及 IgE。本發明 全長抗體可來自單一物種（例如人類），或其可為嵌合抗體 或人類化抗體。本發明全長抗體包含兩個各自由VH及VL 對形成之抗原結合位點，二者可特異性結合相同抗原。該 全長抗體重鏈或輕鏈之C端表示該重鏈或輕鏈c端之最後 一個胺基酸。该全長抗體重鏈或輕鏈之]^端表示該重鏈或 輕鏈N端之最後一個胺基酸。 本發明所用術語「肽連接物」表示胺基酸序列較佳具有 合成來源之肽。使用本發明該等肽連接物來融合單鏈Fab 片段與全長抗體之C或N端以形成本發明多特異性抗體。 較佳地’ b)中之該等肽連接物係胺基酸序列長度為至少5 個胺基酸、較佳長度為5至1〇〇個、更佳為1〇至5〇個胺基酸 之肽。在一實施例中’該肽連接物係（GxS)n或 (GxS)nGm ’其中G=甘胺酸，8=絲胺酸，且（χ=3，、 4、5 或 6，且 m=0、；！、2 或 3)或（χ=4，n=2、3、4 或 5 且 m=0、1、2或3)，較佳地x=4且n=2或3，更佳地x=4， n=2。較佳地’在VH或VH_cm多肽及VI^VL_C l多肽（圖 7a -c)經由兩個相同肽連接物與全長抗體c端融合之三價雙 特異性抗體中，該等肽連接物係具有至少25個胺基酸之 狀’較佳為具有30至50個胺基酸之肽，且該肽連接物更佳 146956.doc •50· 201039849 為（GxS)n或（GxS)nGm，其中g=甘胺酸，S=絲胺酸，且 (x=3，n=6、7 或 8，且 m=0、1、2 或 3)或（χ=4，η=5、ό 或 7 且m=0、1、2或 3)，較佳地χ=4且η=5、6、7。 「單鏈Fab片段」（參見圖2a)係由以下組成之多肽：抗體 重鏈可變結構域（VH)、抗體恆定結構域i (CHi)、抗體輕 鏈可變結構域（VL)、抗體輕鏈恆定結構域（CL)及連接體， 其中該等抗體結構域及該連接體在N端至C端方向上具有 以下順序中之一種·· a) VH-CH1-連接體-VL-CL，b) VL-CL-連接體-VH-CH1，c) VH-CL-連接體-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接體- VH-CL ;且其中該連接體係具有至少3〇個胺 基酸、較佳具有介於32與50個之間之胺基酸的多肽。經由 CL結構域與CH1結構域之間之天然二硫鍵來穩定該等單鏈
Fab 片段 a) VH-CH1-連接體-VL-CL、b) VL-CL-連接體-VH-CH1、c) VH-CL-連接體-VL-CH1 及 d) VL-CH1-連接體-VH-CL。術語「N端」表示N端之最後一個胺基酸。術語「c 端」表示C端之最後一個胺基酸。 術語「連接體」在本發明中係結合單鍵Fab片段來使 用’且表示胺基酸序列較佳具有合成來源之肽。使用本發 明該等肽來連接a) VH-CH1與VL-CL、b) VL-CL與VH-CH1、c) VH-CL 與 VL-CH1 或 d) VL-CH1 與 VH-CL，從而形 成以下本發明單鏈Fab片段：a) VH-CH1-連接體-VL-CL、 b) VL-CL-連接體-VH-CH1、c) VH-CL-連接體-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接體-VH-CL。單鏈Fab片段之内之該連接體 係胺基酸序列長度為至少30個胺基酸、長度較佳為32至50 146956.doc -51- 201039849 個胺基酸之肽。在一實施例中，該連接體係（GxS)n ’其中 G=甘胺酸，S =絲胺酸（X =3，n=8、9或10且m=〇、1、2或3) 或（x=4且n=6、7或8且m=0、1、2或3)，較佳地x=4，n=6或 7且m=0、1、2或3，更佳地x=4，n=7且m=2。在一實施例 中’該連接體係（G4S)6G2。 在一較佳實施例中，在該單鏈Fab片段中，該等抗體結 構域及e玄連接體在N端至C端方向上具有以下順序中之一 種： a) VH-CH1-連接體-VL-CL’ 或 b) VL-CL-連接體-VH-CH1，更佳為VL-CL-連接體_vh_CH1。 在另一較佳實施例中，在該單鏈Fab片段中，該等抗體 結構域及該連接體在N端至C端方向上具有以下順序中之 一種： a) VH-CL-連接體-VL-CH1 或 b) VL-CH1-連接體-VH-CL。 視需要，在該單鏈Fab片段中，除cl結構域與CH1結構 域之間之天然二硫鍵以外，抗體重鏈可變結構域（VH)及抗 體輕鏈可變結構域（VL)亦藉由在以下位置之間引入二硫鍵 而經二硫鍵穩定： 0 重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域1 〇〇位， u)重鏈可變結構域105位與輕鏈可變結構域43位，或 111)重鏈可變結構域101位與輕鏈可變結構域1〇〇位（始 終根據Kabat之EU索引來編號）。 該單鏈Fab片段之進一步二硫鍵穩定係藉由在單鏈Fab片 146956.doc -52- 201039849 段之可變結構域VH與VL之間引入二硫鍵來達成。引入非 天然二硫橋來穩定單鏈Fv之技術闡述於（例如）以下文獻 中·· WO 94/029350 ; Rajagopal, V.等人，卩1*〇1丑1^111· (1997) 1453-59 ; Kobayashi, H.等人，Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393 ;或 Schmidt，Μ·等人，
Oncogene 18 (1999) 171 1-1721。在一實施例中，本發明抗 體中所包括單鏈Fab片段可變結構域之間之可選二硫鍵介 於重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域1 〇〇位之間。在
D 一實施例中，本發明抗體中所包括單鏈Fab片段可變結構 域之間之可選二硫鍵介於重鏈可變結構域1〇5位與輕鏈可 變結構域43位之間（始終根據Kabat之EU索引來編號）。 在一實施例中，在單鏈Fab片段可變結構域VH與VL之間 未經該可選二硫鍵穩定之單鏈Fab片段較佳。 「單鏈Fv片段」（參見圖2b)係由以下組成之多肽：抗體 重鏈可變結構域（VH)、抗體輕鏈可變結構域（VL)、及單 Q 鏈-Fv_連接體，其中該等抗體結構域及該單鏈-Fv-連接體 在N端至C端方向上具有以下順序中之一種：a) VH_單鏈_ Fv-連接體_VL、b) VL_單鏈_Fv連接體_VH;較佳為甸v沁 早鏈-Fv-連接體_VL，且其中該單鏈·Fv_連接體係胺基酸序 列長度為至少15個胺基酸之多肽，在一實施例中長度為至 少20個胺基酸。術語「N端」表示N端之最後一個胺基 酸。術語「C端」表示C端之最後一個胺基酸。 術語「單鏈_Fv_連接體」在用於單鏈W段中時表示胺 基酉夂序列較佳具有合成來源之肽。該單鏈_Fv-連接體係胺 146956.doc •53· 201039849 基酸序列長度為至少1 5個胺基酸、在一實施例中長度為至 少20個胺基酸且長度較佳介於15與30個胺基酸之間之肽。 在一實施例中，該單鏈-連接體係（GxS)n，其中〇=甘胺 酸，S =絲胺酸’（x=3且n=4、5或6)或（x=4且n=3、4、5或 6)，較佳地x=4 ’ n=3、4或5，更佳地x=4，n=3或4。在一 實施例中’該單鏈Fv-連接體係（g4S)3或（G4S)4。 此外’該等單鏈Fv片段較佳經二硫鍵穩定。該單鏈抗體 之進一步二硫鍵穩定係藉由在單鏈抗體之可變結構域之間 引入二硫鍵來達成’且闡述於（例如）以下文獻中： 94/029350 ; Rajagopal，V.等人，prot, Engin. 10 (1997) 1453-59 ’ Kobayashi，Η.等人，Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393 ;或 Schmidt，M.等人，Oncogene 18 (1999) 171 1 -1721。 在經二硫鍵穩定之單鏈Fv片段之一實施例中，本發明抗 體中所包括單鏈Fv片段之可變結構域之間之二硫鍵對各單 鏈Fv片段而言獨立地選自： 1)重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域1 〇〇位， ii) 重鍵可變結構域105位與輕鏈可變結構域43位，或 iii) 重鏈可變結構域1 〇 1位與輕鏈可變結構域1 〇〇位。 在一實施例中，本發明抗體中所包括單鏈Fv片段之可變 結構域之間之二硫鍵介於重鏈可變結構域4 4位與輕鏈可變 結構域100位之間。 本發明抗體係藉由重組方式來產生。因此，本發明一態 樣係編碼本發明抗體之核酸，且另一態樣係包含該編碼本 146956.doc -54· 201039849 發明抗體之核酸之細胞。用於重組製造之方法廣泛為當前 業内所知且包含在原核及真核細胞中表現蛋白質及隨後分 離抗體以及通常將其純化至醫藥上可接受之純度。對於上 述抗體在宿主細胞中之表現，藉由標準方法將編碼各經修 飾輕鏈及重鏈的核酸***表現载體中。在適宜原核或真核 佰主細胞（例如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293 細胞、COS細胞、PER,C6細胞、酵母或大腸桿菌（Ec〇li) 細胞）中進行表現，且自該等細胞（上清液或溶解後細胞）回 收抗體。重組產生抗體之通用方法已為當前業内所熟知且 閣述於（例如）以下綜述文獻中：Makrides，S.C.，Protein Expr. Pudf. 17 (1999) 183_2〇2 ; Geisse，s 等人，Pr〇tein
Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ; Kaufman，R.J.，Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160 ; Werner，R.G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880 。 藉由習用免疫球蛋白純化程序以適當方式自培養基分離 q 雙特異性抗體，該等純化程序為（例如）蛋白質A-瓊脂糖 法、經基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法。 編碼單株抗體之DNA及RNA可使用習用程序容易地分離並 測序。可使用雜交瘤細胞作為該DNA及RNA之來源。分離 - 後，可將DNA立即***表現載體中，隨後將其轉染至原本 不產生免疫球蛋白之宿主細胞（例如HEK 293細胞、CHO細 胞、或骨髓瘤細胞）中以在宿主細胞中實現重組單株抗體 之合成。 藉由將適宜核苷酸變化引入抗體DNA或藉由核苷酸合成 146956.doc -55· 201039849 來製備雙特異性抗體之胺基酸序列變體（或突變體）。然 而’僅能在極有限之範圍内（例如上文所述）實施該等修 飾。舉例而言，該等修飾不改變諸如IgG同種型及抗原結 合等上述抗體特徵’但可提高重組產生之產率、增強蛋白 質穩定性或有利於純化。 本申請案中所用術語「宿主細胞」表示可經改造以生成 本發明抗體之任何種類的細胞系統Q在一實施例中，使用 HEK293細胞及CHO細胞作為宿主細胞。本文所用表述 「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用且所 有§亥荨名稱皆包括其子代。因此，詞語「轉化體」及「轉 化細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養物而不考慮轉 移次數。亦應瞭解，所有子代之DNA含量可能因特意或無 思的突變而不完全相同。本發明包括最初轉化細胞中經篩 選具有相同功能或生物活性之變體的子代。 在NS0細胞中之表現闡述於（例如）Barnes，l.M.等人，
Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ; Barnes, L.M.等人， Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 中。瞬時表現闡述於 (例如）Durocher，Y.等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 中。可變結構域之選殖闡述於以下文獻中：〇rlandi, r等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ；
Carter, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;及 Norderhaug，L_ 等人，J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87。較佳瞬時表現系統（HEK 293)闡述於
Schlaeger, E_-J.及 Christensen, K.，Cytotechnology 3〇 146956.doc -56- 201039849 (1999) 71-83 ;及 Schlaeger，E.-J·，J. Immunol· Methods 194 (1996) 191-199 中。 舉例而言，適用於原核生物之控制序列包括啟動子、 (視需要）操縱子序列、及核糖體結合位點^已知真核細胞 可利用啟動子、增強子及多聚腺苷酸化信號。 當一核酸與另一核酸序列具有功能性關係時，該核酸係 「可操作連接的」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列 之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該前序列或分泌 前導序列之DNA可操作連接至該多肽之DNA ;若啟動子或 增強子可影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子可操 作連接至該編碼序列；或若核糖體結合位點之定位有助於 轉譯，則該核糖體結合位點可操作連接至該編碼序列。一 般而言，「可操作連接」意指所連接]〇1^八序列係鄰接序列 且在分泌前導序列情況下係鄰接序列且處於閱讀框内。然 而增強子無需鄰接。藉由在便利的限制位點處接合可完 ◎ 成連接。若不存在該等位點，則根據習用慣例可使用合成 性寡核普酸銜接子或連接體。 藉由標準技術實施抗體純化以消除細胞組份或其他污染 物（例如其他細胞核酸或蛋白質），該等技術包括鹼/SDS處 理、CsCl區帶法、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳法、及其 他業内熟知方法。參見Ausubel，F等人編輯，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley lnterscience，New Y〇rk (1987卜已有多種不同方法 被人們所接受且廣泛用於蛋白質純化，例如使用微生物蛋 146956.doc -57- 201039849 白質貫施之親和層析（例如蛋白皙 ^ 曰貝八或蛋白質G親和層析）、 離子父換層析（例如陽離子交換（輪甲I & 乂供（殘甲基樹脂）、陰離子交換 (胺基乙基樹脂）及混合型交換）、 m)臂硫鹵吸附（例如使用β- 疏基乙醇及其他SH配體）、疏水作用或芳香族吸附層析（例 如使用苯基-填脂糖、氮雜·親芳煙樹脂、或 ’胺基苯基爛酸）、金屬螯合親和層析（例如使用叫叩_及
Cu(II)-親和性材料）、尺寸排除層析及電泳方法（例如凝膠 電泳、毛細HW(Vijayalakshmi，MA，Appi Bi〇chem
Biotech. 75 (1998) 93-102)。 本文所用表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」 可互換使用且所有該等名稱皆包括子代。因此，詞語「轉 化體」及「轉化細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養 物而不考慮轉移次數。亦應瞭解，所有子代之DNA含量可 能因特意或無意的突變而不完全相同。本發明包括最初轉 化細胞中經篩選具有相同功能或生物活性之變體的子代。 倘若意欲使用獨特名稱’則可根據上下文來確定。 本文所用術語「轉化」係指將載體/核酸轉移至宿主細 胞中之過程。若使用不具有牢固細胞壁障壁之細胞作為宿 主細胞’則可藉由例如磷酸鈣沉澱法來實施轉染，如
Graham, F.L.及 van der Eb，A.J., Virology 52 (1973) 456- 467中所述。然而’亦可使用將DNA引入細胞中之其他方 法’例如細胞核注射或原生質體融合。若使用原核細胞或 含有牢固細胞壁構造之細胞，則一種轉染方法係（例如）使 用氣化鈣進行鈣處理，如Cohen，S·, N·等人，PNAS. 69 146956.doc 201039849 (1972) 2110-2114所述。 本文所用「表現」係指將核酸轉錄為mRNA之過程及/或 隨後將經轉錄mRNA(亦稱作轉錄物）轉譯為肽、多肽或蛋 白質之過程。轉錄物及所編碼多肽共稱為基因產物。若多 核音酸源自基因組DNA ’則在真核細胞中之表現可包括 mRNA之剪接。 「載體」係核酸分子，具體而言為自主複製的核酸分 子，其將***核酸分子轉移至宿主細胞中及/或宿主細胞 之間。該術語包括主要用於將DNA或RNA***細胞（例如 染色體整合）之載體、主要用於複製DN A或RNA之複製載 體、及用於DNA或RNA轉錄及/或轉譯之表現載體。該術 語亦包括可提供不止一種上述功能之載體。 「表現載體」係在引入適宜宿主細胞時可轉錄並轉譯為 多肽之多核苷酸。「表現系統」通常係指包括可用於產生 期望表現產物之表現載體的適宜宿主細胞。 醫藥組合物 本發明之一態樣係包含本發明抗體之醫藥組合物。本發 明另一態樣係本發明抗體用於製造醫藥組合物之用途。本 發明另一態樣係製造包含本發明抗體之醫藥組合物之方 法。在另一態樣中，本發明提供組合物（例如醫藥組合 物），其含有與醫藥載劑調配在一起之本發明抗體。 本發明一實施例係本發明雙特異性抗體，其用於治療癌 症。 本發明另一態樣係該醫藥組合物，其用於治療癌症。 146956.doc -59- 201039849 本發明另-態樣係本發明抗體之用途 癌症之藥物。 Μ造治療 本發明另一態樣係藉由將本發明抗體投與需要治療之串、 者來治療癌症患者之方法。 ’ 本文所用「醫藥載劑」包括任何及所有溶劑、分散介 質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、及 生理上相容之類似劑。較佳地，载劑適合靜脈内、肌内、 卜、屋腸、經脊柱或經表皮投與（例如藉由注射或輸 注）。 一， 本發明組合物可藉由多種業内已知方法投與。熟習此項 技術者f瞭解’投與路徑及/或方式可隨期望效果而變 化。為藉由某些投與路徑投與本發明化合物，可能需要用 某種材料塗佈該化合物或該化合物與該^ ^ ^ 該化合物失活。舉例而言，該化合物可於適宜載劑例= 質體或稀釋劑中投與個體。醫藥上可接受之稀釋劑包括鹽 水及水性緩衝溶液。醫藥載劑包括滅菌水性溶液或分散液 及用於臨時製備滅菌可注射溶液或分散液之滅菌粉劑。該 等介質及試劑於醫藥活性物質中之應用為業内已知。 本文所用片语「非經賜投與」&「以非經腸方式投與」 意指經腸及局部投與以外的投與方式，通常藉由注射投 與，包括（但不限於）靜脈内、肌内、動脈内、鞘内、囊 内、眼，内、心内、皮内、腹膜内、經氣管、皮下、表皮 下、關節内、囊下'虫知蛛膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内 注射及輸注。 146956.doc -60- 201039849 本文所用術語「癌症」係指增殖性疾病，例如淋巴瘤、 淋巴細胞性白血病、肺癌、非小細胞肺（Nscl)癌、細支氣 官肺泡細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮 膚或眼内黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、 月癌（stomach cancer)、胃癌（gastric cancer)、結腸癌、乳 癌、子呂癌、輸卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、*** 癌***癌、霍奇金病（Hodgkin's Disease)、食道癌、小 0 腸癌、内分泌系統癌、曱狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺 癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、***癌、膀胱癌、 腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞 癌、膽管癌、中樞神經系統（CNS)贅瘤、脊椎腫瘤、腦幹 膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、許旺細胞瘤 (schwannoma)、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、扁平細 胞癌、垂體腺瘤及尤文肉瘤（Ewings sarcoma)，包括任一 上述癌症之難治性形式，或一或多種上述癌症之組合。 Q 本發明另一態樣係本發明雙特異性抗體或該醫藥組合 物’其用作抗血管生成劑。該抗血管生成劑可用於治療癌 症’尤其可用於治療實體腫瘤及其他血管疾病。 本發明一實施例係本發明雙特異性抗體，其用於治療血 管疾病。 本發明另一態樣係本發明抗體用於製造治療血管疾病之 藥物之用途。 本發明另一態樣係藉由向需要治療之患者投與本發明抗 體來治療患有血管疾病之患者的方法。 146956.doc -61 - 201039849 術語「血管疾病」包括癌症、炎症性疾病、動脈粥樣硬 化 '缺血、創傷、敗止病、C0PD、哮喘 '糖尿病、 AMD、視網膜病變、中風、肥胖症、急性肺損傷、出血、 血管滲漏（例如細胞因子誘導血管滲漏）、過敏症、格雷夫 氏病（Graves’ Disease)、橋本自身免疫性甲狀腺炎 (Hashimotos Autoimmune Thyroiditis)、自發性血小板缺 乏紫斑症、巨細胞動脈炎、類風濕性關節炎、全身性紅斑 狼瘡（SLE)、狼瘡性腎炎、克羅恩氏病（Cr〇hn，s、 多發性硬化症、潰瘍性結腸炎、尤其實體腫瘤、眼内新生 血管型症候群（例如增殖性視網膜病或老年性黃斑退化症 (AMD))、類風濕性關節炎、及銀屑病（F〇lkman，j等人，j
Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934 ; Klagsbmn，等人， Aiinu· Rev· Physiol. 53 (1991) 217-239 ;及 Garner，A.，
Vascular diseases > Pathobiology 〇f 〇cuiar disease, A dynamic approach，Garner，A.及 Klintworth，G. K.(編輯）， 第 2版，Marcel Dekker，New York (1994) 1625-1710)。 该等組合物亦可含有佐劑’例如防腐劑、潤濕劑、乳化 劑及分散劑。可藉由上述消毒程序及藉由引入各種抗細菌 及抗真菌劑來確保防止存在微生物，該等抗細菌及抗真菌 劑為（例如）對羥基苯曱酸酯、氯丁醇、笨酚、山梨酸及諸 如此類。亦可期望該等組合物包括等滲劑，例如糖、氣化 納及諸如此類。另外’可藉由引入延遲吸收之試劑（例如 單硬脂酸鋁及明膠）來實現可注射醫藥形式之長效吸收。 不管選擇何種投與路徑’可藉由熟習此項技術者已知之 146956.doc -62, 201039849 ^方法將可以適宜水合形式使用之本發明化合物及/或 本發明醫藥組合物調配為醫藥上可接受之劑型。 本發明醫藥組合物中活性成份之實際劑量程度可改變， 以獲得活^料^錢特以者、*合物及投與模式 達成ή &療反應且對患者無毒性之m劑量程度取 決於各種藥代動力學因素，包括本發明所用特定組合物之 活性、、投與路徑、投與時間、所用特定化合物之***速
❹ 率'治療持續時間、與所用特定化合物組合使用之其他藥 物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體 重身體狀況、一般健康狀況及先前病史、及醫學領域熟 知的類似因素。 ’' ”組合物之無菌及流動性程度應使其可藉由注射器來遞 送。除水以外，载劑較佳為等滲緩衝鹽水溶液。 例如’可藉由使用諸如卵磷脂等包衣、藉由在分散物情 开乂下、准持所需粒控及藉由使用表面活性劑來維持適當流動 性。在許多情形下，組合物中較佳包括等渗劑，例如糖、 多元醇（例如甘露醇或山梨醇）、及氯化鈉。 現在已發現，針對人類ErbB_2及人類c_Met之本發明雙 特異性抗體具有有價值的特徵，例如生物或醫藥活性。 提供以下實例、序列表及圖來幫助理解本發明，本發明 之只際範圍陳述於隨附申請專利範圍中。應瞭解，可對各 程序實施修改而不偏離本發明之精神。 胺基酸序列說明 SEQ ID ΝΟ:1重鏈可變結構*<ErbB-2>曲妥珠單抗 146956.doc -63· 201039849 SEQ ID NO:2 輕鏈可變結構域<ErbB-2>曲妥珠單抗 SEQ ID NO:3 重鏈可變結構域<c-Met> Mab 5D5 SEQ ID NO:4 輕鍵可變結構域<c-Met> Mab 5D5 SEQ ID NO:5 重鏈<c-Met> Mab 5D5 SEQ ID NO:6 輕鏈 <c-Met> Mab 5D5 SEQ ID NO:7 重鏈<c-Met> Fab 5D5 SEQ ID NO:8 輕鏈 <c-Met> Fab 5D5 SEQ ID NO:9 人類IgG 1之重鏈怪定區 SEQ ID NO:10 人類IgG3之重鍵怪定區 SEQ ID NO:ll 人類輕鏈1<：恒定區 SEQ ID NO:12 人類輕鏈λ值定區 SEQ ID NO:13 人類c-Met SEQ ID NO:14 人類ErbB-2 SEQ ID NO:15 重鏈CDR3H, <ErbB-2>曲妥珠單抗 SEQ ID NO:16 重鏈CDR2H, <ErbB-2>曲妥珠單抗 SEQ ID NO:17 重鏈CDR1H, <ErbB-2>曲妥珠單抗 SEQ ID NO:18 輕鏈CDR3L，<ErbB-2>曲妥珠單抗 SEQ ID NO:19 輕鏈CDR2L，<ErbB-2>曲妥珠單抗 SEQ ID NO:20 輕鏈CDR1L, <ErbB-2>曲妥珠單抗 SEQ ID NO:21 重鏈 CDR3H, <c-Met> Mab 5D5 SEQ ID NO:22 重鏈 CDR2H, <c-Met> Mab 5D5 SEQ ID NO:23 重鏈 CDR1H，<c-Met> Mab 5D5 SEQ ID NO:24 輕鏈 CDR3L, <c-Met> Mab 5D5 SEQ ID NO:25 輕鏈 CDR2L, <c-Met> Mab 5D5 146956.doc -64- 201039849 SEQ ID NO:26 輕鏈CDR1L，<c-Met> Mab 5D5 實驗程序 實例 材料及方法 重組DNA技術 使用標準方法來處理DNA，如以下文獻中所述： Sambrook, J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual ； Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。根據製造商說明書來使用分子生物學試劑。 DNA及蛋白質序列分析及序列資料管理 關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈核苷酸序列之一般資訊 闡述於以下文獻中·· Kabat，E.，A·等人，（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，NIH出版號 91-3242。根據EU編號法對抗體鏈之胺基酸進行編號 (Edelman，G.M.等人，PNAS 63 (1969) 78-85 ; Kabat，E.A. 等人，（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，NIH 出版號 91-3242)。使用 GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)之軟體包（10.2版） 及Infomax之Vector NTI Advance suite(8.0版）來對序列實 施創建、製圖、分析、注釋及說明。 DNA測序 藉由用 SequiServe (Vaterstetten，Germany)及 Geneart AG (Regensburg, Germany)實施雙鏈測序法來測定DNA之序 列。 146956.doc -65· 201039849 基因合成 藉由 Geneart AG (Regensburg, Germany)自藉由自動化基 因合成產生之合成性寡核苷酸及PCR產物來製備期望基因 片段。將兩側具有單數個限制性内切核酸酶裂解位點之基 因片段選殖至pGA18 (ampR)質粒中。質粒DNA係自經轉化 細菌純化且藉由UV光譜法來測定濃度。藉由DNA測序來 確認亞選殖基因片段之DNA序列。以類似方式藉由使用兩 側BamHI及Xbal限制性位點之基因合成來製備DNA序列’ 該DNA序列編碼經修飾「隆凸-孔洞結合」<ErbB-2>抗體 重鏈，該抗體重鏈在CH3結構域中具有S354C及T366W突 變且具有/不具有藉由肽連接物連接的（：端 scFab VH區；以及「隆凸-孔洞結合」<ErbB-2>抗體重 鏈，該重鏈具有Y349C、T366S、L368A及Y407V突變且具 有/不具有藉由肽連接物連接之(：端<〇]^^>505 scFab VL 區。最後，使用兩側BamHI及Xbal限制性位點來合成編碼 <ErbB-2>抗體及<c-Met>5D5抗體之未經修飾重鏈及輕鏈 的DNA序列。所有構成物皆經設計而具有編碼前導肽 (MGWSCIILFLVATATGVHS)之 5,端DNA序列，該前導肽 把向真核細胞中之分泌蛋白。 表現質粒之構建 使用Roche表現載體來構建編碼所有重鏈及輕鏈scFv融 合蛋白之表現質粒。該載體係由以下元件組成： -作為選擇標記之抗潮黴素基因， -愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus) (EBV)之複製 146956.doc -66 - 201039849 起點oriP， -來自載體pUC 18之複製起點，其容許此質粒在大腸桿 菌中複製， -在大腸桿菌中賦予氨苄西林抗性之β_内醯胺酶基因， -來自人類巨細胞病毒（HCMV)之立即早期增強子及啟 動子， -人類1-免疫球蛋白多聚腺苷酸化（「多聚Α」）信號序 列，及 -獨特的BamHI及Xbal限制性位點。 包含重鏈或輕鏈構成物以及具有C端VH及VL結構域之 「隆凸-孔洞結合」構成物的免疫球蛋白融合基因係藉由 基因合成來製備且將其選殖至所述pGA18 (ampR)質粒中。 用 BamHI及 Xbal 限制性酶（Roche Molecular Biochemicals) 來消化具有合成DNA片段及Roche表現載體之PG18 (ampR) 質粒且實施瓊脂糖凝膠電泳。然後將編碼重鏈及輕鏈之經 純化DNA片段接合至經分離Roche表現載體BamHI/Xbal片 段，從而產生最終表現載體。將最終表現載體轉化至大腸 桿菌細胞中，分離表現質粒DNA (Miniprep)且對其實施限 制性酶分析及DNA測序。使正確純系在150 ml LB-Amp培 養基中生長，再次分離質粒DNA (Maxiprep)並藉由DNA測 序來確認序列完整性。 免疫球蛋白變體在HEK293細胞中之瞬時表現 根據製造商說明書藉由使用FreeStyle™ 293表現系統 (Invitrogen，USA)瞬時轉染人類胚腎293-F細胞來表現重組 146956.doc -67- 201039849 免疫球蛋白變體。簡言之，在FreeStyle™ 293表現培養基 中在37°C/8% C02下培養懸浮Freestyle™ 293-F細胞，且在 轉染當天將細胞以1-2x106活細胞/ml之密度接種於新鮮培 養基中。在Opti-MEM® I培養基（Invitrogen，USA)中使用 325 μΐ 293fectinTM (Invitrogen，Germany)及 250 pg 重鏈及 輕鏈質粒DNA以1:1莫耳比及250 ml之最終轉染體積來製備 DNA-293fectinTM 複合物。在 Opti-MEM® I 培養基 (Invitrogen，USA)中使用 325 μΐ 293fectin™ (Invitrogen, Germany)及250 pg「隆凸-孔洞結合」重鏈1及2及輕鏈質 粒DNA以1 ·· 1 ·_2之莫耳比及250 ml之最終轉染體積來製備 厂隆凸-孔洞結合」DNA-293fectin複合物。在轉染後7天藉 由以14000 g離心30分鐘來收穫含有抗體之細胞培養上清 液且經由無菌濾器（0.22 μηι)過濾。在純化前將上清液儲存 在-20°C下。 雙特異性抗體及對照抗體之純化 藉由使用 Protein A-SepharoseTM (GE Healthcare，Sweden) 之親和層析及Superdex200尺寸排除層析自細胞培養上清 液純化三價雙特異性抗體及對照抗體。簡言之，將無菌過 濾細胞培養上清液施加至經PBS缓衝液（10 mM Na2HP04、 1 mM KH2P〇4、137 mM NaCl 及 2.7 mM KC1，pH 7.4)平衡 之HiTrap ProteinA HP (5 ml)管柱上。用平衡緩衝液洗去 未結合蛋白。用0.1 Μ檸檬酸鹽緩衝液（PH 2.8)洗脫抗體及 抗體變體，且用0.1 ml 1 M Tris (pH 8.5)來中和含有蛋白 質之流份。然後，彙集所洗脫蛋白質流份，用Amicon 146956.doc -68· 201039849
Ultra離心過濾裝置（MWCO: 30 K，Millipore)濃縮至3 ml體 積並裝載至經20 mM Histidin、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡 之 Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60凝膠過濾管柱（GE Healthcare, Sweden)上。彙集含有經純化雙特異性抗體及 對照抗體以及低於5%之高分子量凝集體之流份且以1.0 mg/ml之等份儲存於-80°C下。藉由用木瓜蛋白酶消化經純 化5D5單株抗體且隨後藉由蛋白A層析移除摻雜的Fc結構 域來產生 Fab 片段。在經 20 mM Histidin、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡之 Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60 凝膠過濾 管柱（GE Healthcare, Sweden)上進一步純化未結合Fab片 段，將其彙集且以1.0 mg/ml等份儲存於-80°C下。 純化蛋白質之分析 藉由在280 nm下測量光密度（OD)使用基於胺基酸序列計 算出之莫耳消光係數來確定經純化蛋白質樣品之蛋白質濃 度。藉由在存在及不存在還原劑（5 mM 1,4-二硫蘇糖醇）時 使用考馬斯亮藍（Coomassie brilliant blue)染色實施SDS-PAGE來分析雙特異性抗體及對照抗體之純度及分子量。 根據製造商說明書來使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統 (Invitrogen, USA)(4-20% Tris-甘胺酸凝膠）。在 200 mM KH2P〇4、250 mM KC1 (pH 7.0)運行緩衝液中於25°C下使 用Superdex 200分析型尺寸排除管柱（GE Healthcare, Sweden)藉由高效SEC來分析雙特異性抗體及對照抗體樣 品之凝集體含量。以0.5 ml/min之流速將25 pg蛋白質注入 管柱上且經50分鐘實施等度洗脫。對於穩定性分析’將1 146956.doc -69· 201039849 mg/ml濃度之純化蛋白質在4°C及40°C下培育7天且隨後藉 由高效SEC來評估。在藉由用肽-N-糖苷酶F (Roche Molecular Biochemicals)實施酶處理移除N-聚糖後，藉由 奈升電喷霧Q-TOF質譜來驗證經還原雙特異性抗體輕鏈及 重鏈之胺基酸骨架之完整性。 c-Met磷酸化分析 在實施HGF刺激前一天以5xlOe5/孔將A549細胞接種於6 孔板中之含有0.5% FCS(胎牛血清）之RPMI中。第二天，經 一小時用含有0.2% BSA(牛血清白蛋白）之RPMI替代生長 培養基。然後將5 pg/mL雙特異性抗體添加至培養基中且 將細胞培育10分鐘，之後再經1 〇分鐘以50 ng/mL之終濃度 添加HGF。用含有1 mM釩酸鈉之冰冷PBS將細胞洗滌一 次，之後將其置於冰上並在細胞培養板中用1〇〇 μί溶解緩 衝液（50 mM Tris-Cl pH 7.5、150 mM NaCl、1% ΝΡ40、 0.5°/。DOC、抑肽酶、0·5 mM PMSF、1 mM釩酸鈉）進行溶 解。將細胞溶解產物轉移至埃彭道夫（eppendorf)管中並在 冰上使溶解繼續進行30分鐘。使用BCA方法（Pierce)來測 定蛋白質濃度。在4-12°/。Bis-Tris NuPage 凝膠（Invitrogen) 上分離30-50 pg溶解產物且將凝膠上之蛋白質轉移至硝酸 纖維素膜上。用含有5% BSA之TBS-T將膜封閉1小時且根 據製造商說明書用針對Y1230、1234 ' 1235之磷酸化特異 性c-Met抗體（44-888, Biosource)進行顯影。用結合未磷酸 化c-Met之抗體（AF276, R&D)再次探測免疫印跡。 ErbB2/Her2磷酸化分析 146956.doc -70- 201039849 在添加抗體的前一天以5xl0e5/孔將Sk-Br3細胞接種於6 孔板中之含有10% FCS(胎牛血清）之RPMI中。第二天，將 5 pg/mL對照抗體或雙特異性抗體添加至培養基中且將細 胞再培育1小時。用含有1 mM釩酸鈉之冰冷PBS將細胞洗 滌一次，之後將其置於冰上並在細胞培養板中用1〇〇 pL溶 解緩衝液（50 mM Tris-Cl pH 7.5、150 mM NaCl、1% NP40、0.5% DOC、抑肽酶、0.5 mM PMSF、1 mM釩酸鈉） 進行溶解。將細胞溶解物轉移至埃彭道夫管中並在冰上使 溶解進行30分鐘。使用BCA方法（Pierce)來測定蛋白質濃 度。在4-12% Bis-Tris NuPage 凝膠（Invitrogen)上分離 30-50 Mg溶解產物且將凝膠上之蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上。 用含有5% BSA之TBS-T將膜封閉1小時且根據製造商說明 書用針對Y1221/22之磷酸化特異性Her2抗體（Cell Signaling, 2243)進行顯影。用結合未磷酸化Her2之抗體 (Cell Signaling, 2165)再次探測免疫印跡。 AKT磷酸化分析 在添加抗體的前一天以5x10e5/孔將A431細胞接種於6孔 板中之含有10% FCS(胎牛血清）之RPMI中。第二天，將5 pg/mL對照抗體或雙特異性抗體添加至培養基中且將細胞 再培育1小時。然後用25 ng/mL HGF (R&D, 294-HGN)將細 胞亞群再刺激15 min。用含有1 mM飢酸納之冰冷PBS將細 胞洗滌一次，之後將其置於冰上並在細胞培養板中用100 μί溶解缓衝液（50 mM Tris-Cl pH 7.5、150 mM NaC卜 1% NP40、0.5% DOC、抑肽酶、0.5 mM PMSF、1 mM釩酸鈉） 146956.doc -71 · 201039849 進行溶解。將細胞溶解物轉移至埃彭道夫管中並在冰上使 溶解進行30分鐘。使用BCA方法（Pierce)來測定蛋白質濃 度。在4-12%Bis-TrisNuPage 凝膠（Invitrogen)上分離 30-50 pg溶解產物且將凝膠上之蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上。 用含有5% BSA之TBS-T將膜封閉1小時且根據製造商說明 書用針對Thr308之磷酸化特異性AKT抗體（Cell Signaling, 9275)進行顯影。用結合肌動蛋白之抗體（Abeam，ab20272) 再次探測免疫印跡。 ERK1/2磷酸化分析 在添加抗體的前一天以5X10e5/孔將A43 1細胞接種於6孔 板中之含有10% FCS(胎牛血清）之RPMI中。第二天’將5 pg/mL對照抗體或雙特異性抗體添加至培養基中且將細胞 再培育1小時。然後用25 ng/mL HGF (R&D，294-HGN)將細 胞亞群再刺激15 min。用含有1 mM釩酸鈉之冰冷PBS將細 胞洗滌一次，之後將其置於冰上並在細胞培養板中用100 μί 溶解緩衝液（50 mM Tris-Cl ρΗ7·5、150 mM NaC 卜 1% NP40、0.5% DOC、抑肽酶、0.5 mM PMSF、1 mM釩酸鈉） 進行溶解。將細胞溶解物轉移至埃彭道夫管中並在冰上使 溶解進行30分鐘。使用BCA方法（Pierce)來測定蛋白質濃 度。在4-12%Bis-TrisNuPage 凝膠（Invitrogen)上分離 3〇_5〇
Mg溶解產物且將凝膠上之蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上。 用含有5% BSA之TBS-T將膜封閉1小時且根據製造商說明 書用針對Thr202/Tyr204之磷酸化特異性Erkl/2抗體 (匚6118丨§1^1丨叫，％.9106)進行顯影。用結合肌動蛋白之抗 146956.doc -72- 201039849 體（Abeam，ab20272)再次探測免疫印跡。 細胞-細胞擴散（擴散分析） 在化合物處理前一天以200 pL總體積將A549(4000細胞/ 孔）或A43 1(8000細胞/孔）接種於96孔E-板（Roche， 05232368001)中之含有〇·5% FCS之RPMI中。用實時細胞 分析機過夜監測細胞點附及細胞生長，每15 min掃描一次 以監測阻抗。第二天，將細胞與5 μΕ之各抗體稀釋液在 PBS中一起預培育，且每5分鐘掃描一次。在30分鐘後，添 加2.5 μί具有2〇 ng/mL終濃度之HGF溶液並使實驗繼續再 進行72小時。經1 80分鐘每分鐘掃描一次來監測即時變 化，之後在剩餘時間内每15分鐘掃描一次。 HUVEC增殖分析 將HUVEC細胞（Promocell，C-12200)接種於經膠原塗佈 之96孔板中之含有0.5% FCS之EBM-2培養基（Promocell, C-2221 1)中。第二天將對照抗體或雙特異性抗體之一系列稀 釋液添加至細胞中。在培育30 min後添加25 ng/mL HGF (R&D，294-HGN)並將細胞再培育72 h，之後根據製造商建 議藉由 cell titer glow 分析（Promega，G7571/2/3)以 ATP 含量 形式測定細胞增殖。
Sk-Br3增殖分析 a)對於增殖研究，以10000細胞/孔在96孔細胞培養板中 之低血清培養基（RPMI 1640+4% FCS)中接種細胞。第二天 添加親代Her2或c-Met抗體以及雙特異性抗體並將細胞再 培養48 h，之後藉由cell titer glow分析（Promega)測定作為 146956.doc •73· 201039849 細胞增殖指示劑之ATP。 b)對於增殖研究’在HGF存在下’以10000細胞/孔在96 孔細胞培養板中之低血清培養基（RPMI 1640 + 4°/。FCS)中接 種細胞。第二天添加親代Her2或c-Met抗體以及雙特異性 抗體以及25 ng/mL HGF (R&D，294-HGN)並將細胞再培養 48 h，之後藉由cell titer glow分析（Promega)測定作為細胞 增疫指示劑之ATP。 流式細胞計數分析（FACS) a)結合分析 分離並計數C-met及ErbB-2表現細胞。以1.5xl0e5/孔將 細胞接種於96孔錐形板中。使細胞旋轉沉降（1500 rpm， 4°C, 5 min)且在冰上及50 gL各雙特異性抗體存於含有2% FCS(胎牛血清）之PBS中之系歹ij稀釋液中培育30 min。再次 使細胞旋轉沉降並用200 μί含有2% FCS之PBS洗滌一次， 之後再次與在含有2% FCS的PBS中稀釋之針對人類Fc且偶 合藻紅蛋白之抗體（Jackson Immunoresearch, 109 1 16098)— 起培育30 min。使細胞旋轉沉降且用200 pL含有2% FCS之 PBS洗滌兩次’使其再懸浮於BD細胞固定溶液（BD Biosciences)中且在冰上培育至少10 min。藉由流式細胞計 數術（FACS Canto, BD)測定細胞之平均螢光強度（mfi)。藉 由至少兩次一式兩份的獨立染色來測定mfi。使用FlowJo 軟體（TreeStar)進一步處理流式細胞計數術譜圖。使用 XLFit 4_0 (IDBS)及劑量反應一點式模型205來測定半最大 結合。 146956.doc -74- 201039849 b)内化分析 分離並計數細胞。將5x1 0e5個細胞置於埃彭道夫管中之 50 μι完全培養基中且與5 pg/mL之各雙特異性抗體在37°C 下一起培育。在指定時間點後將細胞儲存在冰上，直至時 程結束。此後，將細胞轉移至FACS管中，旋轉沉降（1500 rpm, 4°C , 5 min) > 用 PBS + 2% FCS洗滌且與在含有 2% FCS 之PBS中稀釋之50 pL針對人類Fc且偶合藻紅蛋白之第二抗 體（Jackson Immunoresearch, 109116098) —起培育30 分鐘。 再次使細胞旋轉沉降，用PBS+2% FCS洗滌並藉由流式細 胞計數術（FACS Canto, BD)測定螢光強度。
Cell Titer Glow分析 使用cell titer glow分析（Promega)來量化細胞活力及增 殖。根據製造商說明書來實施分析。簡言之，在96孔板中 以100 μί之總體積將細胞培養期望時間段。對於增殖分 析，自培育器中移出細胞且將其於室温下置放30 min。添 加1 00 pL cell titer glow試劑且將多孔板置於定軌振盥器上 並保持2 min。在15 min後於微量板讀數器（Tecan)上量化 發光。
Wst-Ι分析 根據終點法分析來實施Wst-1活力及細胞增殖分析，從 而檢測代謝活性細胞數。簡言之，將20 pL Wst-Ι試劑 (Roche, 11644807001)添加至200 pL培養基中。將96孔板 再培育30 min至1 h直至染料顯著顯影。在微量板讀數器 (Tecan)上於450 nm波長下量化染色強度。 146956.doc， -75- 201039849 雙特異性<ErbB2-c-Met>抗體之設計 以下所表現及純化之所有雙特異性<ErbB2-c-Met>抗體 皆包含IgGl亞類之恆定區或至少Fc部分（SEQ ID NO: 9之 人類IgGl恆定區），其最後如下文所述經修飾。 在表1中：已經或可根據上述通用方法來表現並純化三 價雙特異性<ErbB2-c-Met>抗體’其係基於全長ErbB-2抗 體（曲妥珠單抗）及一個來自C-met抗體（cMet 5D5)之單鏈 Fab片段（基本結構示意圖參見圖5a) ’且具有表1中所示之 各特徵。曲妥珠單抗及cMet 5D5之相應VH及VL闡述於序 列表中。 表1 : 分子名稱 雙特異性抗體之scFab-Ab-命名 特徵: BsAB02 隆凸·孔洞結合突變 S354C:T366W/ Y349'C:T366'S: υ68Α:Υ407Ύ 全長抗體骨架，源自： 曲妥珠單抗 單鏈Fab片段，源自： cMet 5D5 (人類化） 附接至抗體之scFab之位置 C端隆凸重鏈 連接mScFab} (G4S)5GG 狀連接物 (G4S)2 ScFab 二硫鍵VH44/ VL100 穩定 - 實例1 : 雙特異性抗體與ErbB-2及c-Met之結合 (表面電漿共振） 使用標準結合分析在25°C下測定結合親和力，例如表面 電聚共振技術（BIAcore®，GE-Healthcare Uppsala, Sweden)。 對於親和力測量，在SPR儀器（Biacore T100)上藉由標準胺 146956.doc •76- 201039849 偶合及封阻化學方法使30 pg/ml抗FcY抗體（來自山羊， Jackson Immuno Research)偶合至CM-5感受器晶片表面。 在偶聯後，在25°C下以5 pL/min之流速注入單或雙特異性 ErbB2/cMet抗體且隨後以30 pL/min注入人類ErbB2或c-Met ECD之連續稀釋液（0 nM至1000 nM)。使用PBS/0.1% BSA作為結合實驗之運行缓衝液。然後用10 mM甘胺酸-HC1 (pH 2.0)溶液之60s脈衝使晶片再生。 表2 :如藉由表面電漿共振所測定之雙特異性抗體結合 ErbB2/cMet之結合特徵。 結合特異性 BsAB02 fMoll c-Met ka(l/Ms) 8,40E+03 kd (1/s) 6,60E-05 KD(M) 8,20E-09 - ErbB-2 ka(l/Ms) 9,50E+04 kd (1/s) <lE-06 KD(M) <1E-10 實例2 : 雙特異性HER2/c-Met抗體形式對HGF誘導c-Met受體磷酸 化之抑制 為確認雙特異性抗體中c-Met部分之功能性，實施c-Met 磷酸化分析。在此實驗中，用雙特異性抗體或對照抗體處 理A549肺癌細胞或HT29結直腸癌細胞，之後暴露於HGF 中。然後溶解細胞並檢驗c-Met受體之磷酸化。兩種細胞 系皆可經HGF刺激，此可藉由免疫印跡中填酸化-c-Met特 異性區帶之出現來觀察。親代抗體或雙特異性抗體之結合 可導致對受體磷酸化之抑制。或者，亦可使用具有自分泌 146956.doc -77- 201039849 HGF環之細胞（例如U87MG)且在存在或不存在親代抗體或 雙特異性抗體時評價c-Met受體磷酸化。 實例3 : 在用Her2/cMet雙特異性抗體處理後分析Her2受體磷酸化 為確認雙特異性Her2/cMet抗體中Her2結合部分之功能 性，將Sk-Br3與親代EGFR抗體或雙特異性Her2/cMet抗體 一起培育。親代抗體或雙特異性抗體而非無關IgG對照抗 體之結合可導致受體磷酸化之抑制。或者，亦可在存在或 不存在親代抗體或雙特異性抗體時使用經NRG刺激可誘導 ErbB2/Her2受體磷酸化之細胞。 實例4 : 在用Her2/cMet雙特異性抗體處理後分析PI3K信號傳導
Her2以及c-Met受體可經由PI3K途徑傳導信號，該途徑 傳遞促有絲***信號。為證實同時靶向Her2及c-Met受 體，可監測AKT磷酸化，其係PI3K途徑中之下游靶。出於 此目的，將未經刺激細胞、經NRG或HGF處理之細胞、或 經兩種細胞因子處理之細胞並行地與非特異性親代對照抗 體或雙特異性抗體一起培育。或者，亦可評價過表現 ErbB2/Her2及/或具有自分泌HGF環之細胞，該HGF環可活 化c-Met信號傳導。AKT係PI3K途徑中之主要下游信號傳 導組份，且此蛋白質之磷酸化係經由此途徑傳導信號之關 鍵指示。 實例5 : 在用Her2/cMet雙特異性抗體處理後分析MAPK信號傳導 146956.doc •78- 201039849 c-Met受體可經由MAPK途徑傳導信號。為證實靶向c-Met受體，可監測ERK1/2之磷酸化，其係MAPK途徑中之 主要下游靶。出於此目的，將未經刺激細胞或經HGF處理 之細胞與非特異性親代對照抗體或雙特異性抗體並行培 育。或者，亦可評價具有自分泌HGF環之細胞，該HGF環 可活化c-Met信號傳導。 實例6 : 雙特異性Her2/c-Met抗體形式對HGF誘導HUVEC增殖之 抑制 可實施HUVEC增殖分析來證實HGF之血管生成及促有絲 ***效應。向HUVEC中添加HGF可導致細胞增殖增強，此 可由c-Met結合抗體以劑量依賴性方式來抑制。 實例7 : 雙特異性Her2/c-Met抗體對Sk-Br3增殖之抑制 a) Sk-Br3細胞顯示Her2之高細胞表面含量及c-Met之中 高細胞表面表現，如流式細胞計數術所獨立地確認。添加 親代Her2-結合抗體或雙特異性Her2/c-Met抗體可導致增值 降低，而c-Met-結合抗體對增殖僅具有較小作用。 b) 為模擬出現活性Her2-c-Met受體信號傳導網絡之情 景，根據所述在經HGF調整之培養基存在下實施增殖分 析。在此環境中，添加任一種親代抗體對細胞增殖僅具有 較小作用，如藉由cell titer glow分析所測定；而添加雙特 異性抗體或親代抗體之組合可導致細胞增殖降低。 實例8 : 146956.doc •79- 201039849 分析在癌細胞系DU145中雙特異性Her2/c_Met抗體形式對 HGF誘導細胞-細胞擴散（擴散）之抑制 HGF誘導擴散誘導細胞之形態改變，從而導致細胞變 圓、細胞產生偽足樣突出、紡錘體樣結構及獲得一定運動 性。雙特異性Her2/cMet抗體抑制HGF誘導之細胞-細胞擴 散。 實例9 : 雙特異性HER2/c-Met抗體形式對HGF誘導HUVEC增殖之 抑制 可實施HUVEC增殖分析來證實HGF之促有絲***效應。 將HGF添加至HUVEC可使增殖增強兩倍。以與雙特異性抗 體相同之濃度範圍添加人類IgG對照抗體對細胞增殖無影 響，而5D5 Fab片段可抑制HGF誘導增殖。 實例10 : 分析在癌細胞系A431中雙特異性HER2/c-Met抗體對HGF 誘導細胞-細胞擴散（擴散）之抑制 HGF誘導擴散包括細胞之形態改變，從而導致細胞變 圓、細胞產生偽足樣突出、紡錘體樣結構及獲得一定運動 性。實時細胞分析儀（Roche)測量給定細胞培養孔之阻抗 且由此可間接監測細胞形態及增殖之改變。將HGF添加至 A43 1及A549細胞導致阻抗改變，監測該阻抗且其隨時間 而變化。 實例11 : 在表現ErbB-2及c-Met之癌細胞系中分析抗體介導之受體内化 146956.doc -80- 201039849 已顯示將細胞與特異性結合Her2或c-Met之抗體一起培 育可誘發受體内化。為評價雙特異性抗體之内化能力，將 實驗設置設計為研究抗體誘導之受體内化。出於此目的， 在37°C下將OVCAR-8細胞（NCI細胞系名稱；購自NCI(國
家癌症研究所）〇VCAR-8-NCI ; Schilder RJ 等人，Int J
Cancer。1990 年 3 月 15 曰；45(3):416-22 ; Ikediobi ON 等 人 ’ Mol Cancer Ther. 2006 ; 5 ; 2606-12 ; Lorenzi，P.L·等 人 ’ Mol Cancer Ther 2009 ; 8(4):713_24)(其表現Her2以及 〇 、 c-Met ’如藉由流式細胞計數術所確認-參見圖7b)與各一級 抗體一起培育不同時間段（例如〇、3〇、60、120分鐘=0、 0.5、1、2小時（h))。藉由將細胞快速冷卻至4艽來終止細 胞過程。使用特異性結合一級抗體Fc之二級螢光體偶合抗 體來檢測與細胞表面結合之抗體。抗體-受體複合物之内 化耗盡了細胞表面之抗體-受體複合物且導致平均螢光強 度降低。在Ovcar-8細胞中研究内化。結果展示於下表及 Q 圖8中。經由各抗體之内化來測量各受體之内化％(在圖8 中’雙特異性 <ErbB2-cMet>抗體 BsAB〇2稱作 cMet/HER2, 親代單特異性二價抗體稱作<HER2>& <cMet>)。 表：在1小時後在OVCAR-8細胞上，使用faCS分析測量 之雙特異性Her2/ cMet抗體與親代單特異性二價c_Met及 HER2抗體之c-Met受體内化％的比較。將在〇 h(=不存在抗 體時）細胞表面上c-Met受體之測量％設定為細胞表面上c_ Met受體之100%。 146956.doc -81 - 201039849 抗體 在1小時後測量， 在OVCAR-8細胞表面上之 c-Met 受體。/。 在1小時後在OVCAR-8 細胞上c-Met之内化％ (ATCC 編號 CRL-1555) (=100-細胞表面上之抗體 A)單特異性<〇1^1:> 親代抗體 Mab 5D5 67~~~ 」 33 B)雙特異 抗體 BsAB02 107 - 一 -7 實例12 : 雙特異性Her2/c-Met抗體之糖改造形式之製備 在MPSV啟動子及合成性多聚a位點上游之控制下將雙 特異性Her2/c-Met抗體之DNA序列亞選殖至哺乳動物表現 載體中，各載體具有EBVOriP序列。 雙特異性抗體係使用墙酸鈣轉染方法藉由用哺乳動物雙 特異性抗體表現載體共轉染HEK293-EBNA細胞來產生。 藉由填酸約方法來轉染指數性生長之HEK293-EBNA細 胞。對於糖改造抗體之產生，用兩種額外質粒共轉染細 胞，一種用於融合GnTIII多肽表現（GnT-III表現載體），且 一種用於甘露糖苷酶II表現（高爾基體甘露糖苷酶π表現載 體），其比率分別為4:4:1:1。在T燒瓶中使用補加有10% FCS之DMEM培養基使細胞以黏附單層培養物形式生長， 且在其鋪滿50%至80%時進行轉染。對於T150燒瓶之轉 染，在轉染前24小時將1.5xl07個細胞接種於25 ml補加有 FCS(最終濃度為10% V/V)之DMEM培養基中，且將細胞在 3 7°C下於具有5% C02氣氛之培育器中置放過夜。對於欲轉 染之各T150燒瓶，藉由混合94 pg總質粒載體DNA(輕鏈與 146956.doc -82- 201039849 重鏈表現載體各一半）、終體積為469 μΐ之水及469 μΐ 1M CaCl2溶液來製備DNA、CaCl2與水之溶液。向此溶液中添 加 938 μΐ 50 mM HEPES、280 mM NaC卜 1.5 mM Na2HP04 溶液（pH 7.05)，立即混合10秒且在室溫下靜置20秒。用10 ml補加有2% FCS之DMEM稀釋懸浮液，且將其添加至 T150中來代替已有培養基。然後添加另外13 ml轉染培養 基。在37°C及5% C02下將細胞培育約17至20小時，然後將 培養基替換為25 ml DMEM，10% FCS。在轉染後第7天藉 由以210 X g離心15 min來收穫經調整培養基，對溶液實施 無菌過濾（0.22 μπι濾器）且以0.01% w/v之終濃度添加疊氮 化鈉，並保持在4°C下。 所分泌非岩藻糖化雙特異性糖改造抗體係藉由以下方式 來純化：實施蛋白A親和層析，之後實施陽離子交換層 析，且最後在 Superdex 200 管柱（AmershamPharmacia)上實 施尺寸排除層析步驟，且將緩衝液更換為25 mM磷酸鉀、 125 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸溶液（pH 6.7)並收集純淨的 單體IgGl抗體。使用分光光度計根據在280 nm下之吸光度 來估計抗體濃度。 藉由所述MALDI/TOF-MS來分析附接至抗體Fc區域之募 糖。藉由PNGaseF消化自抗體酶促釋放募糖，其中使抗體 固定在PVDF膜上或固定在溶液中。所得含有所釋放寡糖 之消化溶液直接經製備用於MALDI/TOF-MS分析，或經 EndoH糖苷酶進一步消化，之後製備為用於MALDI/TOF-MS分析之樣品。 146956.doc -83- 201039849 實例13 : 雙特異性Her2/c-Met抗體糖結構之分析 為確定含有岩藻糖與非岩藻糖（無岩藻糖）之寡糖結構之 相對比率，藉由MALDI-Tof-質譜法來分析純化抗體材料 之經釋放聚糖。為此，在37°C下將抗體樣品（約50 pg)與存 於0.1 Μ磷酸鈉緩衝液（pH 6.0)中之5 mU N-糖苷酶 F(Prozyme編號GKE-5010B)—起培育過夜，以自蛋白質骨 架中釋放寡糖。隨後，使用NuTip-Carbon吸量管管嘴（得 自 Glygen: NuTipl-ΙΟ μΐ，目錄Nr編號NT1CAR)分離所釋 放聚糖結構並進行除鹽。在第一步驟中，藉由依次用3 μί 1 M NaOH、20 pL純水（例如得自Baker之HPLC梯度級，編 號4218)、3 pL 3 0% v/v乙酸及20 μΐ純水（同上）洗滌來準備 NuTip-Carbon吸量管管嘴以供結合寡糖。為此，將各溶液 裝載至NuTip-Carbon吸量管管嘴中之層析材料頂部且加壓 使其經過管嘴。此後，藉由將上述N-糖苷酶F消化物上下 抽吸四至五次來使對應於10 pg抗體之聚糖結構結合至 NuTip-Carbon吸量管管嘴中之材料上。以上述方式用20 pL 純水洗條與NuTip-Carbon吸量管管嘴中之材料結合之聚 糖，且分別用0.5 μΐ^ 10%及2.0 pL 20%乙腈逐步洗脫。在 此步驟中，將各洗脫溶液填充於0.5 mL反應容器中且各自 上下抽吸四至五次。合併兩種洗脫液以供藉由MALDI-Tof 質譜法來分析。在此測量中，在MALDI靶上混合0.4 μί經 合併洗脫液與1.6 pL SDHB基質溶液（2.5-二羥基苯曱酸/2-經基-5-甲氧基苯甲酸[Bruker Dal tonics編號209813]，以 146956.doc -84- 201039849 5 mg/ml溶於20%乙醇/5 mM NaC1中）且用經適當調整之
Bmker Uhrafiex TOF/TOF儀器加以分析。以例行方式記錄 單次實驗之50-300次脈衝並進行加和。藉由打以分析軟體 (Bruker Daltonks)評估所得譜圖並確定所檢測各峰之質 里。隨後，藉由比較各結構（例如分別具有或不具有岩藻 糖之複雜結構、雜合體結構及寡·或高_甘露糖結構）質量之
计算值與理論預期值來將各峰分為含有岩藻糖或無岩蕩糖 (非岩藻糖）之聚糖結構。 為確定雜合體結構之比率，同時祕糖苦_及糖苦内 切酶Η消化抗體樣品。N_糖普酶？自蛋白質骨架釋放所有 Ν'連接聚糖結構（複雜結構、雜合體結構及募·及高甘露糖 結構），且糖普内切酶Η另外在聚糖還原端之兩個⑽心 殘基之間裂解所有雜合體型聚糖。隨後藉由MALDi_m 譜法以與上述用於N-糖芽酶㈣化樣品相同之方式處理並 分析該消化物。藉由比較N·糖㈣精化物與經合併N_糖 普酶F/内切酶Η消化物之描—,.^ , 之模式，使用指定糖結構之信號的 降低程度來估計雜合體結構之相對含量。 根據個別糖結構峰高度與所檢測所有糖結構峰高度之和 之比來計算各種糖結構之相對含量。岩藻糖含量係含岩薄 糖結構相對於Ν-㈣酶F處理樣品中所鐾定所有 分 別例如複雜構、雜合體結構及寡_及高·甘露糖結構）之百 分比°非以糖化程度係無岩藻糖結構相對於N_糖普酶F 處理樣品中所鑒定所有糖結構（分別例如複雜結構、雜人 體結構及寡-及高-甘露糖結構）之百分比。 146956.doc -85- 201039849 實例14 : 在用Her2/cMet雙特異性抗體處理後分析細胞遷移 活性c-Met信號傳導之一重要態樣係誘導遷移及侵入程 序。c-Met抑制性抗體之效能可藉由測量對HGF誘導細胞 遷移之抑制來確定。出於此目的，在不存在或存在雙特異 性抗體或IgG對照抗體時用HGF處理HGF可誘導癌細胞系 A43 1，且在Acea實時細胞分析儀上使用具有阻抗讀數器之 CIM板以時間依賴性方式測量穿過8 μηι管孔之遷移細胞 數。 實例15 :
雙特異性Her2/c-Met抗體之體外ADCC 本發明Her2/cMet雙特異性抗體在表現兩種受體之細胞 上顯示降低之内化。内化降低強有力地支持對該等抗體進 行糖改造之理論，此乃因延長抗體-受體複合物在細胞表 面上之暴露時間使得更有可能被Nk細胞所識別。内化降低 及糖改造可理解為抗體依賴性細胞毒性（ADCC)相對於親 代抗體有所增強。證實該等效應之體外實驗設置可設計為 使用在細胞表面上表現Her2及cMet二者之癌細胞（例如 A43 1)及效應子細胞（例如Nk細胞系或PBMC細胞系）。使腫 瘤細胞與親代單特異性抗體或雙特異性抗體一起預培育最 多24 h，之後添加效應子細胞系。量化細胞溶解且使得可 辨別單-與雙特異性抗體。 用胰蛋白酶/EDTA(Gibco編號25300-054)收集指數生長 期之靶細胞（例如PC-3，DSMZ編號ACC 465，***腺 146956.doc -86- 201039849 癌，在Ham’s F12營養混合物+2 mM L-内醯胺基-L-麩胺醯 胺+10% FCS中培養）。在實施洗滌步驟並檢查細胞數量及 活力後，在37°C下於細胞培育器中用詞黃綠素（Invitrogen 編號C3100MP ;在1個小瓶中，鈣黃綠素再懸浮於50 μΐ DMSO中，可用於標記存於5 ml培養基中之5χ106個細胞） 將所需等份樣品標記30 min。此後，用AIM-V培養基將細 胞洗滌三次，檢查細胞數量及活力並將細胞數量調整至 3x105 /ml 。 同時，根據製造商方案（洗滌步驟：1x400 g及2x350 g，每 次10 min)藉由密度梯度離心法（Histopaque-1077，Sigma編 號H8889)來準備作為效應子細胞之PBMC。檢查細胞數量 及活力並將細胞數量調節至1.5x1 07/ira。 將100 μΐ經鈣黃綠素染色之靶細胞平鋪於圓底96孔板 中，添加50 μΐ經稀釋抗體及50 μΐ效應子細胞。在某些實 驗中將靶細胞與Redimune ® NF液體（ZLB Behring)混合， 濃度為 10 mg/ml Redimune。 使用自發溶解作為對照，其係藉由在不存在抗體之情形 下共培養靶細胞及效應子細胞來測定；且使用最大溶解作 為對照，其係僅藉由靶細胞之1% Triton X-100溶解來測 定。在37°C下於加濕細胞培育器中將板培育4小時。 根據製造商說明書使用細胞毒性檢測套組（LDH檢測套 組，Roche編號1 644 793)藉由測量自受損細胞釋放之LDH 來評價靶細胞之殺滅。簡言之，將100 μΐ來自各孔之上清 液與100 μΐ來自套組之受質於透明平底96孔板中混合。在 146956.doc •87- 201039849 ELISA讀數器中於490 nm下經至少10 min測定受質顏色反 應之Vmax值。如下所述計算特定抗體介導殺滅百分比： ((A-SR)/(MR-SR)xlOO，其中A係在特定抗體濃度下之平均 Vmax，SR係自發釋放之平均Vmax且MR係最大釋放之平 均 Vmax。 實例16 雙特異性Her2/cMet抗體在具有旁分泌HGF環之皮下異種 移植模型中之體内效能 經Mrc-5細胞共注射之皮下KPL4模型模擬c-Met之旁分 泌活化環。KPL4在細胞表面上表現一定量之c-Met以及 Her2。將KPL4及Mrc-5細胞在標準細胞培養條件下維持於 對數生長期。以10:1之比注射KPL4及Mrc-5細胞，且將 lxlO7個KPL4細胞及lxlO6個Mrc-5細胞移植入SCID米色鼠 中。在出現腫瘤且尺寸到達100-1 50 mm3後開始處理。用 20 mg/kg(抗體/小鼠）之負荷劑量處理小鼠，且隨後每週一 次用10 mg/kg(抗體/小鼠）處理。每週兩次測量腫瘤體積且 並行監測動物體重。比較單一處理及單一抗體之組合與使 用雙特異性抗體之治療。 實例17 雙特異性Herl/c-Met抗體對OVCAR-8增殖之抑制 a) OVCAR-8細胞（NCI細胞系名稱；購自NCI(國家癌症 研究所）〇VCAR-8-NCI ; Schilder RJ 等人 ’ Int J Cancer. 1990 年 3 月 15 日；45(3):416-22 ; Ikediobi ON 等人，Mol Cancer Ther· 2006 ; 5 ; 2606-12 ; Lorenzi, P.L.等人，Mol 146956.doc -88 · 201039849
Cancer Ther 2009 ; 8(4):713_24)表現顯著細胞表面含量之 Her2及c-Met，如藉由流式細胞計數術獨立地確認（參見圖 7b)。在48小時後’在CellTiterGlowTM分析t測量雙特異 性Her2/c-Met抗體對OVCAR-8細胞增殖之抑制。結果展示 於圖9a中。對照為PBS緩衝液（磷酸鹽緩衝鹽水）。 測量顯示HER2抗體曲妥珠單抗之6%抑制（與設定為〇% 抑制之緩衝液對照相比）。雙特異性Her2/c-Met BsAB02 (BsAb)抗體對癌症細胞增殖產生更顯著之抑制（11%抑 制）。單價c-Met抗體單臂5D5 (OA5D5)對增殖未顯示任何 效應。HER2抗體曲妥珠單抗及單價C-Met抗體單臂5D5 (OA5D5)之組合產生顯著性較低之降低（6%抑制）。 b) OVCAR-8細胞依賴於HER2信號傳導。為模擬出現活 性HER-c-Met-受體信號傳導網絡之情景，根據a)中所述在 經HGF調節之培養基存在下實施進一步增殖分析（在48小 時後實施CellTiterGlowTM分析）。結果展示於圖9b中。 測量顯示Her2抗體曲妥珠單抗（2%抑制）及單價c-Met抗 體單臂5D5 (OA5D5)(3%抑制）與經HGF處理之細胞相比（設 定為0%抑制）幾乎無抑制效應。雙特異性Her2/c-Met抗體 BsAB02 (BsAb)(17%抑制）顯示可顯著抑制Ovcar-8細胞之 癌症細胞增殖。Her2抗體曲妥珠單抗與單價c-Met抗體單 臂5D5 (OA5D5)之組合以顯著性較低之程度使細胞增殖降 低（10%抑制）。 【圖式簡單說明】 囫1 不含CH4結構域之全長抗體的示意性結構，其可 146956.doc • 89- 201039849 以兩對重鏈及輕鏈特異性結合第一抗原1，該等 重鏈及輕鏈以典型順序包含可變結構域及恆定結 構域。 圖2a-c 二價雙特異性<ErbB-2/c-Met>抗體之示意性結 構，其包含：a)全長抗體中特異性結合人類 ErbB-2之輕鏈及重鏈；及b)全長抗體中特異性 結合人類C-met之輕鏈及重鏈，其中怪定結構域 CL及CH1、及/或可變結構域VL及VH彼此替代， 該等鏈經隆凸-孔洞結合技術修飾。 圖3 本發明三價雙特異性<ErbB-2/c-Met>抗體之示意 圖，其包含特異性結合ErbB-2之全長抗體，該全 長抗體上融合有 a) 圖3a:兩個多肽VH及VL(VH及VL結構域二者 一起形成特異性結合c-Met之抗原結合位點）； b) 圖3b:兩個多肽VH-CH1及VL-CL(VH及VL結 構域二者一起形成特異性結合c-Met之抗原結合 位點）； 圖3c :本發明三價雙特異性抗體之示意圖，其包 含特異性結合ErbB-2之全長抗體，該全長抗體上 融合有兩個多肽VH及VL(VH及VL結構域二者一 起形成特異性結合c-Met之抗原結合位點）且具有 「隆凸及孔洞」； 圖3d :本發明三價雙特異性抗體之示意圖，其包 含特異性結合ErbB-2之全長抗體，該全長抗體融 146956.doc -90- 201039849 圖4 圖5 〇 圖6 圖7a 〇 圖7b 圖8 圖9a 合有兩個多肽VH及VL(VH及VL結構域二者一起 形成特異性結合c-Met之抗原結合位點，其中該 VH及VL結構域在VH44位與VL100位之間包含鏈 間二硫橋）且具有「隆凸及孔洞」。 4a:四種可能的單鏈Fab片段之示意性結構 4b:兩種單鏈Fv片段之示意性結構 三價雙特異性<ErbB-2/c-Met>抗體之示意性結 構，其包含全長抗體及一個單鏈Fab片段（圖5a) 或一個單鏈Fv片段（圖5b)-具有隆凸及孔洞之雙 特異性三價抗體之實例。 四價雙特異性<ErbB-2/c-Met>抗體之示意性結 構，其包含全長抗體及兩個單鏈Fab片段（圖6a) 或兩個單鏈Fv片段（圖6b)-c-Met結合位點源自c-Met二聚化抑制性抗體。 在表皮樣癌細胞系A43 1中ErbB 1/2/3及c-Met之細 胞表面表現之流式細胞計數分析。 在卵巢癌細胞系OVCAR-8中ErbB 1/2/3及c-Met之 細胞表面表現之流式細胞計數分析。 在OVCAR-8癌細胞中之内化分析，在第〇、30、 60及120分鐘（=0、0.5、1及2小時）測量。 在OVCAR-8癌細胞中之增殖分析。與親代單特異 性<HER2>&<c-Met：^^體相比，本發明雙特異性 <HER2/c-Met>抗體BsAB02 (BsAb)對癌症細胞增 殖之抑制。 146956.doc -91- 201039849 圖9b 在癌細胞系Ovcar-8中在HGF存在下之增殖分 析-與親代單特異性<HER2>及<；c-Met>抗體相 比，本發明雙特異性<HER2/c-Met>抗體BsAB02 (BsAb)對癌症細胞增殖之抑制。 146956.doc -92- 201039849 序列表 <110>瑞士商羅齊克雷雅公司 <120>雙特異性抗-ErbB_2 /抗-〇Met抗體
<130> 26575 FT <140〉099110598 <141> 2010-04-06 <150> EP 09005109.5 <151> 2009-04-07 <160> 26 Ο <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> 人工的 <220> <2 2 3>重鏈可變結構域<£11^-2>曲妥珠單抗(trastuzumab) <400> 1
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn He Lys Asp Thr 20 25 30 OTyr lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Arg lie Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 146956·序列表.doc 201039849
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223>輕鏈可變結構域<£出6-2>曲妥珠單抗 <400> 2
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223〉重鏈可變結構域<c-Met>Mab 5D5 2· 146956-序列表.doc 201039849 <400> 3
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Met lie Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe 50 55 60 〇
Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 o <211> 113 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223〉輕鏈可變結構5D5 <400> 4
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 146956-序列表.doc 201039849
Ser Ser Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 工le Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 110
Lys <210> 5 <211> 449 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223〉重鏈 cMetMab5D5 <400> 5
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ma Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Met lie Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe 50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ma Tyr 65 70 75 80 -4 * 146956·序列表.doc 201039849
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175
Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 146956-序列表.doc 201039849
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335
Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380
Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415
Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445
Lys <210> 6 <211> 220 <212> PRT <213〉 人l的 <220> <223〉輕鏈 cMet Mab 5D5 <400> 6 146956·序列表.doc 201039849
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30
Ser Ser Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 0 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 195 200 205 -7- 146956-序列表.doc 201039849
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 7 <211> 226 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 重鏈 cMet Fab 5D5 <400> 7
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Met lie Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe 50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 146956-序列表.doc 201039849
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175
Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 〇
Thr His 225 <210> 8 <211> 220 <212> PRT <213> 人工的 <22〇> <223〉輕鏈 cMetFab5D5 <400> 8
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 o
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30
Ser Ser Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys. Gin Gin 85 90 95 146956-序列表.doc -9 201039849
Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210〉 9 <211> 330 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 146956·序列表.doc -10- 201039849
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn -11- 146956-序列表.doc 201039849 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 10 <211> 377 <212> PRT <213〉 智人 <400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 Ί0 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 • 12- 146956-序列表.doc 201039849
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175
o
Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Lys Trp Tyr 195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220
Gin Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin 260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300
Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gin Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 -13- 146956-序列表.doc 201039849
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn lie 340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gin
355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210〉 11 <211〉 107 <212> PRT <213> 智人 <400> 11
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 12 <211〉 104 -14- 146956-序列表.doc 201039849 <212> PRT <213> 智人 <400> 12
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 15 10 15
Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr 20 25 30
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 35 40 45
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr 50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His 65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 13 <211> 1390 <212> PRT ❹ <213〉 智人 <400> 13
Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly lie Leu Val Leu Leu Phe 15 10 15
Thr Leu Val Gin Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys 20 25 30
Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gin Leu Pro Asn Phe Thr Ala 35 40 45
Glu Thr Pro lie Gin Asn Val lie Leu His Glu His His lie Phe Leu 50 55 60 15- 146956·序列表.doc 201039849
Gly Ala Thr Asn Tyr lie Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gin Lys 65 70 75 80
Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe 85 90 95
Pro Cys Gin Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp 100 105 110
Lys Asp Asn lie Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp 115 120 125
Gin Leu lie Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gin Arg His 130 135 140
Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp lie Gin Ser Glu Val His Cys 145 150 155 160 lie Phe Ser Pro Gin lie Glu Glu Pro Ser Gin Cys Pro Asp Cys Val 165 170 175
Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe 180 185 190 工le Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr lie Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp 195 200 205
His Pro Leu His Ser lie Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp 210 215 220
Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gin Ser Tyr lie Asp Val Leu Pro Glu 225 230 235 240
Phe Arg Asp Ser Tyr Pro lie Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn 245 250 255
Asn Phe lie Tyr Phe Leu Thr Val Gin Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gin 260 265 270 • 16- 146956-序列表.doc 201039849
Thr Phe His Thr Arg lie lie Arg Phe Cys Ser lie Asn Ser Gly Leu 275 280 285
His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys lie Leu Thr Glu Lys Arg 290 295 300
Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn lie Leu Gin Ala Ala 305 310 315 320
Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gin Leu Ala Arg Gin lie Gly Ala Ser 325 330 335
Leu Asn Asp Asp lie Leu Phe 〇 340
Gly Val Phe Ala Gin Ser Lys Pro Asp 345 350
Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg 355
Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro lie Lys 360 365
Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn 370 375
Lys lie Val Asn Lys Asn Asn Val Arg 380
Cys Leu Gin His Phe Tyr Gly 385 390
Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg 395 400
Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser 405
Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr 410 415
Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala 420
Leu Gin Arg Val Asp Leu Phe Met Gly 425 430
Gin Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser lie Ser Thr Phe lie Lys Gly 435 440 445
Asp Leu Thr lie Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gin 450 455 460
Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu 465 470 475 480 17- 146956-序列表.doc 201039849
Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val lie Val Glu His Thr Leu 485 490 495
Asn Gin Asn Gly Tyr Thr Leu Val lie Thr Gly Lys Lys lie Thr Lys 500 505 510 lie Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gin Ser Cys Ser Gin 515 520 525
Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gin Cys Gly Trp Cys His Asp Lys 530 535 540
Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gin Gin lie 545 550 555 560
Cys Leu Pro Ala lie Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu 565 570 575
Gly Gly Thr Arg Leu Thr lie Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg 580 585 590
Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu 595 600 605
Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys 610 615 620
Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser lie lie lie 625 630 635 640
Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gin Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp 645 650 655
Pro Val lie Thr Ser lie Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly 660 665 670
Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg 675 680 685 18- 146956-序列表.doc 201039849
His lie Ser lie Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn 690 695 700
Ser lie Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gin Thr lie Ser Thr Glu Phe 705 710 715 720
Ala Val Lys Leu Lys 工le Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser lie Phe 725 730 735
Ser Tyr Arg Glu Asp Pro lie Val Tyr Glu lie His Pro Thr Lys Ser 740 745 750
Phe lie Ser Gly Gly Ser Thr O 755 lie Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn 760 765
Ser Val Ser Val Pro Arg Met 770 775
Val lie Asn Val His Glu Ala Gly Arg 780
Asn Phe Thr Val Ala Cys Gin 785 790
His Arg Ser Asn Ser Glu lie lie Cys 795 800
Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gin 805
Gin Leu Asn Leu Gin Leu Pro Leu Lys 810 815
Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu 820
Asp Gly lie Leu Ser Lys Tyr Phe Asp 825 830
Leu lie Tyr Val His Asn Pro W 835
Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val 840 845
Met 工le Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu lie Lys Gly Asn Asp 850 855 860 lie Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys 865 870 875 880
Ser Cys Glu Asn lie His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val 885 890 895
Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn lie Glu Trp Lys 19- 146956-序列表.doc 201039849 900 905 910
Gin Ala lie Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val lie Val Gin Pro Asp 915 920 925
Gin Asn Phe Thr Gly Leu lie Ala Gly Val Val Ser lie Ser Thr Ala 930 935 940
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gin 945 950 955 960 lie Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His 965 970 975
Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr 980 985 990
Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro 995 1000 1005
Glu Asp Gin Phe Pro Asn Ser Ser Gin Asn Gly Ser Cys Arg Gin 1010 1015 1020
Val Gin Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser Pro lie Leu Thr Ser Gly 1025 1030 1035
Asp Ser Asp lie Ser Ser Pro Leu Leu Gin Asn Thr Val His lie 1040 1045 1050
Asp Leu Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gin Ala Val Gin His 1055 1060 1065
Val Val lie Gly Pro Ser Ser Leu lie Val His Phe Asn Glu Val 1070 1075 1080 lie Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu Leu 1085 1090 1095
Asp Asn Asp Gly Lys Lys lie His Cys Ala Val Lys Ser Leu Asn 1100 1105 1110 -20 146956-序列表.doc 201039849
Arg lie Thr Asp lie Gly Glu Val Ser Gin Phe Leu Thr Glu Gly 1115 1120 1125 lie lie Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu Ser Leu Leu 1130 1135 1140
Gly lie Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val Val Leu Pro 1145 1150 1155
Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe lie Arg Asn Glu Thr 1160 1165 1170
O
His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu lie Gly Phe Gly Leu Gin Val 1175 1180 1185
Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His Arg 1190 1195 1200
Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val 1205 1210 1215
Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu 1220 1225 1230
Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys 1235 1240 1245
Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gin Thr Gin Lys Phe Thr Thr Lys 1250 1255 1260
Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met Thr 1265 1270 1275
Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp lie Thr 1280 1285 1290
Val Tyr Leu Leu Gin Gly Arg Arg Leu Leu Gin Pro Glu Tyr Cys 1295 1300 1305 -21 - 146956-序列表.doc 201039849
Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys 1310 1315 1320
Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser Arg lie Ser 1325 1330 1335
Ala lie Phe Ser Thr Phe lie Gly Glu His Tyr Val His Val Asn 1340 1345 1350
Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser Leu 1355 1360 1365
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Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser 1385 1390 <210> 14 <211> 1255 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 14
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 15 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gin Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45
Leu Tyr Gin Gly Cys Gin Val Val Gin Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gin Asp lie Gin Glu Val 65 70 75 80
Gin Gly Tyr Val Leu lie Ala His Asn Gin Val Arg Gin Val Pro Leu 22- 146956-序列表.doc 201039849 85 90 95
Gin Arg Leu Arg lie Val Arg Gly Thr Gin Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gin Leu Arg Ser 130 135 140
Leu Thr Glu lie Leu Lys Gly Gly Val Leu lie Gin Arg Asn Pro Gin 145 150 155 160 o
Leu Cys Tyr Gin Asp Thr lie Leu Trp Lys Asp lie Phe His Lys Asn 165 170 175
Asn Gin Leu Ala Leu Thr Leu lie Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys 180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gin Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys 210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gin Cys ❹ 225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu 245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly lie Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val 260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg 275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu 290 295 300 23- 146956-序列表.doc 201039849
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gin 305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gin Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys 325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu 340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn lie Gin Glu Phe Ala Gly Cys Lys 355 360 365
Lys lie Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gin Pro Glu Gin Leu Gin Val Phe 385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu lie Thr Gly Tyr Leu Tyr lie Ser Ala Trp Pro 405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gin Asn Leu Gin Val lie Arg 420 425 430
Gly Arg lie Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gin Gly Leu 435 440 445
Gly lie Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly 450 455 460
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Pro Trp Asp Gin Leu Phe Arg Asn Pro His Gin Ala Leu Leu His Thr 485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His 500 505 510 24- 146956·序列表.doc 201039849
Gin Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gin Cys 515 520 525
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Arg Val Leu Gin Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys 545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gin Pro Gin Asn Gly Ser Val Thr Cys 565 570 575 o
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gin Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp 580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu 595 600 605
Ser Tyr Met Pro lie Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly KLa Cys Gin 610 615 620
Pro Cys Pro lie Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys 625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gin Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser lie lie Ser 645 650 655
Ala Val Val Gly lie Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly 660 665 670 lie Leu lie Lys Arg Arg Gin Gin Lys lie Arg Lys Tyr Thr Met Arg 675 680 685
Arg Leu Leu Gin Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly 690 695 700
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Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys 725 730 735
Gly lie Trp lie Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys lie Pro Val Ala lie 740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu lie Leu 755 760 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg 770 775 780
Leu Leu Gly 工le Cys Leu Thr Ser Thr Val Gin Leu Val Thr Gin Leu 785 790 795 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg 805 810 815
Leu Gly Ser Gin Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gin lie Ala Lys Gly 820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala 835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys lie Thr Asp Phe 850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp lie Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp 865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro lie Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser lie Leu Arg 885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gin Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val 900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly lie Pro Ala 915 920 925
Arg Glu lie Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gin Pro 26· 146956·序列表doc 201039849 930 935 940
Pro lie Cys Thr lie Asp Val Tyr Met lie Met Val Lys Cys Trp Met 945 950 955 960 lie Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe 965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gin Arg Phe Val Val lie Gin Asn Glu 980 985 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu 995 1000 1005 ❹
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr 1010 1015 1020
Leu Val Pro Gin Gin Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly 1025 1030 1035
Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg 1040 1045 1050
Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu 1055 1060 1065
Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser 1070 1075 1080
Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu 1085 1090 1095
Gin Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gin Arg Tyr Ser 1100 1105 1110
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Asp Val Arg Pro Gin Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro 1145 1150 1155
Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu 1160 1165 1170
Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly 1175 1180 1185
Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gin Gly Gly Ala 1190 1195 1200
Ala Pro Gin Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp 1205 1210 1215
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Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr 1235 1240 1245
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 1255 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 重鏈CDR3H，<ErbB_2>曲妥珠單抗 <400> 15
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met 1 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> 人工的
Asp Tyr 10 -28- 146956-序列表 201039849 <220> <223〉重鏈CDR2H，<ErbB-2>曲妥珠單抗 <400> 16
Arg lie Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> 人工的
<220> <223> 重鏈CDR1H，<ErbB-2>曲妥珠單抗 <400> 17
Asp Thr Tyr lie His 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223〉輕鏈CDR3L，<ErbB-2>曲妥珠單抗 <400> 18
Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223〉輕鏈CDR3L，<ErbB-2>曲妥珠單抗 <400> 19
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 29· 146956-序列表.doc 201039849 <210> 20 . <211> 11 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 輕鏈CDR1L, <ErbB-2>曲妥珠單抗 <400> 20
Arg Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala 15 10 <210> 21 <211〉 10 <212> PRT <213〉 人工的 <220〉 <223> 重鏈 CDR3H, <c-Met>Mab 5D5 <400> 21
Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213〉 人工的 <220> < 2 2 3 > 重鏈 CDR2H，<c-Met>Mab 5D5 <400〉 22
Met lie Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe Lys 15 10 15
Asp <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> 人工的 -30- 146956-序列表.doc 201039849 <220> <223> 重鏈 CDR1H，<c-Met>Mab 5D5 <400> 23
Ser Tyr Trp Leu His 1 5 <210> 24 <211> <212> <213> 9 PRT 人工的 <220> <223> 輕鏈 CDR3H，<c-Met>Mab 5D5 O <4〇〇> 24
Gin Gin Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> <211> 25 7 <212> <213> PRT 人工的 <220> <223〉 輕鏈 CDR2H，<c-Met>Mab 5D5 <400> 25
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 ❹ 擎 <210> <211> <212〉 <213〉 26 17 PRT 人工的 <220> <223> 輕鏈 CDR1H, <c-Met>Mab 5D5 <400> 26
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr Ser Ser Gin Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala 146956-序列表.doc -31-

Claims (1)

  1. 201039849 七、申請專利範圍： 1. 一種雙特異性抗體，其特異性結合人類ErbB-2及人類c-Met，其包含特異性結合人類ErbB-2之第一抗原結合位 點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位點，其特徵 ' 在於在流式細胞計數分析中在1小時後對OVCAR-8細胞 測量時，與該雙特異性抗體不存在下c-Met之内化相比， 該雙特異性抗體顯示c-Met之内化不超過1 5%。 2. 如請求項1之雙特異性抗體，其特徵在於其為二價或三 Ο 價抗體，包含一個或兩個特異性結合人類ErbB-2之抗原 結合位點及一個特異性結合人類c-Met之第三抗原結合位 點。 3·如請求項2之抗體，其特徵在於包含 a) 特異性結合ErbB-2且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕鏈 組成之全長抗體；及 b) —個特異性結合人類c-Met之單鏈Fab片段， 其中b)中該單鏈Fab片段經由a)中該全長抗體重鏈或輕 〇 W 鏈C或N端之肽連接物與該全長抗體融合。 4. 一種雙特異性抗體，其特異性結合人類ErbB-2及人類C-. met，其包含特異性結合人類ErbB-2之第一抗原結合位 點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位點，其特徵 在於 該第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 15 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 16 之 CDR2H 區、及 8丑(^10>^0:17之€011111區，且在輕鏈可變結構域中包含 146956.doc 201039849 SEQ ID NO: 18 之 CDR3L 區、SEQ ID NO:19 之 CDR2L 區、及 SEQIDNO:20之 CDR1L 區；及 該第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO.· 21 之 CDR3H 區、SEQ ID NO:22之 CDR2H區、及 SEQ ID NO: 23之CDR1H區，且在輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 24之 CDR3L 區、SEQ ID NO:25 之 CDR2L 區、及 SEQIDN0:262CDRlLg。 5. 如請求項4之雙特異性抗體，其特徵在於 該特異性結合ErbB-2之第一抗原結合位點包含序列 SEQ ID ΝΟ:1作為重鏈可變結構域，且包含序列SEQ ID NO:2作為輕鏈可變結構域；及 該特異性結合c-Met之第二抗原結合位點包含序列SEQ ID NO:3作為重鏈可變結構域，且包含序列SEQ ID NO:4 作為輕鏈可變結構域。 6. 如請求項1至5中任一項之雙特異性抗體，其特徵在於包 含IgGl或IgG3亞類之恆定區。 7. 如請求項1至5中任一項之雙特異性抗體，其特徵在於該 抗體係在Asn297經糖鏈糖基化，其中該糖鏈内岩藻糖之 量為65%或更低。 8. 一種核酸，其編碼如請求項1至7中任一項之雙特異性抗 體。 9. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7中任一項之雙特 異性抗體。 10·如請求項9之醫藥組合物，其用於治療癌症。 146956.doc 201039849 11. 如請求項1至5中任一項之雙特異性抗體，其用於治療癌 症。 12. —種如請求項1至7中任一項之雙特異性抗體之用途，其 用於製造治療癌症之藥物。
    146956.doc
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