CN103415619B - 抗-c-met抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了结合c-Met的抗体以及相关组合物和使用方法。使用方法包括癌症的治疗和诊断。在某些实施方案中，抗体结合哺乳动物细胞表面抗原(例如，癌细胞表面抗原)。抗体还可在结合细胞后被内吞。可被所述抗体靶向的细胞包括癌细胞，例如肺、肾、肝、胃、乳腺和脑等中的癌细胞。

Description

抗-C-MET抗体及其使用方法
引言
肺癌是美国男性和妇性中癌症相关死亡的首要原因。2009年在美国约219,000例新肺癌病例被诊断，并且据估计已发生160,000例因该疾病导致的死亡。存在两种公知的肺癌形式--小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，后者约占肺癌的80%。NSCLC患者的5年存活率为约16%。虽然与手术切除术组合的化学疗法和放射疗法已被用于治疗不同分期的NSCLC，但预后仍然不良并且在初次治疗后复发率高至10%。
c-Met，肝细胞生长因子的受体，属于受体酪氨酸激酶(RTK)的亚家族。在正常生理中，HGF/c-Met途径参与各自生物功能，包括细胞增殖、存活、运动和伤口愈合(Birchmeier等人,2003)。然而，异常的c-Met激活，包括基因扩增、突变和过表达，在具有血液肿瘤和大多数实体瘤的临床病例中已有报导。已报导c-Met激活触发癌细胞增殖、迁移和侵袭，并且促进肿瘤血管生成，因为HGF直接刺激内皮细胞增殖和迁移。
此外，已在具有脑癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、头颈癌和胃癌(stomach cancer)的患者频繁地观察到过表达的c-Met。不良临床结果与升高的c-Met明确相关，表明c-Met的过表达是此类癌症类型的肿瘤进展的负性预后因子。
发明概要
本文中公开了结合c-Met的抗体以及相关组合物和使用方法。使用方法包括但不限于癌症的治疗和诊断。在某些实施方案中，本发明的抗体结合哺乳动物细胞表面抗原(例如，癌细胞表面抗原)。抗体还可在结合细胞后被内吞。可被抗体靶向的细胞包括癌细胞，例如肺、肾、胃、乳腺和脑等中的癌细胞。
附图简述
图1.结合c-Met蛋白的噬菌体展示scFv的选择和鉴定。A，将噬菌体展示的人天然scFv文库用于选择结合c-Met-Fc蛋白(生物淘选)的噬菌体。B，通过显示不同的结合的ELISA筛选随机选择的噬菌体克隆。C，通过ELISA，利用两个不同的滴度比较结合至c-Met-Fc蛋白的选择的噬菌体克隆。D，利用流式细胞术在过表达c-Met的293T细胞上评估噬菌体克隆的比较细胞c-Met细胞亲和力。E，通过免疫荧光染色进行的噬菌体克隆的结合特异性的测定。比例尺：50μm。
图2.抗-c-Met scFv对结合至c-Met的HGF的竞争。A，通过ELISA，将噬菌体展示的抗-c-Met scFv PC1、PC20和PC21用于抑制HGF与H1993细胞上表达的c-Met的结合。B，使用竞争性ELISA检测的抗-c-Met scFv S1、S20和S21对结合至c-Met蛋白的HGF的剂量依赖性抑制。C，人c-Met蛋白的结合域的图示。将人IgG1的Fc结构域融合至c-Met932和c-Met567的羧基末端。D，使用ELISA鉴定抗-c-Met scFvs的表位。E，在癌细胞中测定抗-c-Met scFv对HGF的拮抗作用。
图3.使用共聚集显微术进行的抗-c-Met scFv内化的分析。A，在4℃(a和b)或37℃(c和d)下分别用抗-c-Met scFv S1和S20温育H1993细胞30分钟。在低倍放大率下在大多数细胞中观察到内化的S20(e)。箭头表示细胞中内吞的scFv。B，S20至细胞内的内化在整个c-Met-介导的内吞过程中发生。在37℃下用S20温育c-Met野生型(a)和敲低H460细胞(MET-KD)(c)，进行30分钟。更高的放大视野显示大量内化至细胞的S20(b)。
图4.Ms20增强多柔比星脂质体结合和至人肺癌细胞系的内化。A，Ms20-LD和LD在37℃下用药物温育4小时的肺癌细胞系的内化研究。B，使用Ms20-QD，通过流式细胞术分析测定c-Met在癌细胞表面上的表达水平。C，H1993对脂质体药物的结合。D，脂质体药物吸收的动力学。E，在37℃下温育指定的时期后利用共聚焦显微术观察的H1993细胞对Ms20-LD和LD的吸收。在利用Ms20-LD温育2小时后细胞质和核质中分布的多柔比星。在利用Ms20-LD温育8小时后，多柔比星主要积累在细胞核中。多柔比星在利用LD处理的细胞几乎不可检测。更下方的图框显示与细胞膜(绿色，假色)和细胞核(蓝色)染色合并的多柔比星信号(红色)的图像。比例尺，50μm。
图5.Ms20-介导的脂质体增强多柔比星-诱导的细胞毒性作用。A，利用不同浓度的Ms20-LD和LD处理的人肺癌细胞系的体外细胞毒性测定。B，IC50比率被计算来阐明Ms20-LD相对于LD的细胞毒性的增强。C，在分别利用2.5μg/ml的Ms20-LD和LD处理0、24、48和72小时后H1993细胞的Western印迹分析。
图6.人肺癌异种移植物中抗-c-Met scFv的肿瘤导向能力的鉴定。A，具有人肺癌H460异种移植物的SCID小鼠分别用PC20和对照噬菌体(Con-P)静脉内注射。B，在寻靶测定中通过免疫组织化学染色进行的PC20定位的检查。C，静脉内注射400皮摩尔的Ms20-QD(量子点)(右)或QD(左)后具有H1933人肺肿瘤的SCID小鼠的体内成像。在注射后6小时获得NIR荧光图像(上图框)。红圈表示肿瘤位置。利用IVIS软件定量肿瘤区域的信号强度(下图框)。D，在注射后24小时测定Ms20-QD和QD的组织分布。处死小鼠，获得解剖的器官的NIR图像。利用IVIS软件测量肿瘤和器官的信号强度(下图框)。
图7.Ms20-LD在人肺癌异种移植物中的治疗效果。A，施用了Ms20-LD、LD或PBS的具有H460源性肺癌的小鼠的肿瘤体积。B，每一组的体重。C，处理结束时的肿瘤重量。D，C中描述的分析的代表性图像。E，肿瘤组织中的肿瘤血管的观察。F，使用TUNEL测定进行的肿瘤区域中凋亡细胞的分析。误差棒，SE.*，P<0.05。
图8.可溶性c-Met932-Fc蛋白和抗-c-Met scFv的纯化。A，考马斯蓝染色(左图)和使用抗-c-Met多克隆抗体的Western印迹分析(右图)。泳道1，总培养基，泳道2，蛋白G柱流过，和泳道3，纯化的可溶性c-Met932-Fc蛋白。B，从噬菌体感染的大肠杆菌(E-coli)HB2151的周质提取物纯化的可溶性抗-c-Met scFvs。Western印迹分析显示可溶性scFvs被抗-E标记抗体识别(下图框)。
图9.抗-c-Met scFvs对各种人癌细胞系和血管内皮细胞(HUVEC)的结合的观察。A，来自针对各种人癌细胞系的抗-c-MetscFv S1或S2的ELISA结果。B，通过流式细胞术分析的抗-c-Met scFvs对HUVEC的结合。
图10.抗-c-Met scFvs特异性结合人肺癌细胞上的内源c-Met。A，Western印迹分析显示在H460细胞(MET-KD H460细胞)中c-Met被利用慢病毒表达的c-Met shRNA的感染下调。B，抗-c-Met scFvs对c-Met野生型和敲低H460细胞的结合的FACS分析。
图11.Ms20-缀合的脂质体多柔比星(Ms20-LD)的合成。A，表达在羧基末端上包含Flag标签、六组氨酸和半胱氨酸残基的scFv蛋白(Ms20)的原核载体pFHC-S20的构建的图示。B，使用Ni+NTA琼脂糖和蛋白A琼脂糖层析纯化的Ms20的SDS-PAGE分析和考马斯蓝染色。PPE是指周质提取物；FL是指流过，C，示意性模型显示还原的Ms20与掺入了马来酰亚胺-PEG-DSPE的LD的缀合过程。D，在利用琼脂糖4B凝胶过滤纯化后缀合有Ms20的LD的SDS-PAGE分析和硝酸银染色。泳道3-8：缀合至马来酰亚胺-PEG-DSPE后的Ms20(上方的条带)。
图12.使用Ms20-QD，通过FACS分析鉴定人肺癌细胞系上c-Met的表达。A，在4℃下利用10μM Ms20-QD和QD温育人肺癌细胞系1小时。进行FACS分析以评估结合活性。B，在37℃下利用50nM Ms20-QD温育H1993细胞30分钟。使用共聚焦显微术检查H1993细胞对Ms20-QD的结合和吸收。比例尺，50μm。
定义
在下列的描述中，广泛地使用细胞培养领域中常规使用的许多术语。为了明确一致地理解说明书和权利要求以及赋予此类术语的范围，提供下列定义。
如本文中所用，“c-Met”是指可结合肝细胞生长因子(HGF)的受体酪氨酸激酶的成员，还可被称为"肝细胞生长因子受体"(HGFR)或“met原癌基因”。术语“c-Met”是指c-Met蛋白的任何天然存在的同种型。c-Met的氨基酸序列是已知的并且可见于GenBank登录号NP_000236.2和NP_001120972.1。
术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”在本文中可互换用于表示通过相邻残基的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的氨基酸残基的线性系列。此外，除20个“标准”遗传上可编码的氨基酸外，还包括氨基酸类似物。
“抗体”包括单独地包含或作为制剂包含抗原结合蛋白的组合物，所述制剂包含多种抗原结合蛋白，从而具有一种或多种多肽，所述多肽可由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段遗传编码，或包含从噬菌体展示文库获得或产生的CDR，并且结合目标抗原。轻链被分类为κ或λ链。重链可被分类为γ、μ、α、δ或ε链，其反过来分别定义免疫球蛋白种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
抗体的实例为具有由两对多肽链组成的四聚体的结构单位的抗体，每一对具有一个“轻链”和一个“重链”。每一个链的N末端部分定义介导抗原结合的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指轻链和重链。
“抗体”还包括包含连接在一起作为单个多肽的重链和轻链的单链抗体。
如上文中所提及的，“抗体”包括完整免疫球蛋白以及抗体的抗原结合片段。因此，如本文中所用，术语“抗体”还包括抗体的抗原结合部分，其可通过修饰完整抗体或使用重组DNA法从头合成来产生。实例包括但不限于Fab’、Fab'2或scFv。
单链Fv(“scFv”)多肽为共价连接的VH::VL异二聚体，其可从核酸(包括直接连接或通过肽编码接头连接的VH-和VL-编码序列)表达。许多结构可获得用于将来自抗体V区域的轻和重多肽链转换化成scFv分子，所述分子将折叠成与抗原结合位点的结构大体上相似的三维结构。除了为双链抗体(diabody)外，scFvs还可以以三链抗体(tribody)或四链抗体(tetrabody)的形式存在。
应当指出，可根据完整抗体的降解来定义各种抗体片段，本领域技术人员将理解此类片段可通过化学方法从头合成或利用重组DNA法合成。
术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体，并且还包括任何种类的抗体(例如，IgM、IgG及其亚类)。“抗体”还包括杂交抗体、异种抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及保留抗原结合的其功能性片段。可将抗体缀合至其它部分，和/或可将其结合至载体(例如，固体载体)，例如聚苯乙烯板或珠粒、测试条等。
免疫球蛋白轻链或重链可变区由被3个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)间断的“构架”区(FR)组成。可基于本领域已知的数据库确定构架区和CDR的范围。参见，例如，www.vbase2.org上的V Base。不同轻链或重链的构架区的序列在物种内是相对保守的。抗体的构架区，即组成的轻链和重链的组合构架区，用于安置和比对CDR。CDR主要负责结合抗原的表位。除非另外指出，否则根据V Base确定由本公开提供的所有CDR和构架。
“抗-c-Met抗体”是指特异性结合(优选以高亲和力)c-Met的抗体。相对于对c-Met的结合，c-Met的特异性抗体没有显示相当的对与c-Met无关的其它抗原的结合。
术语“高亲和力”，当用于抗体时，是指以小于或等于10-6M，小于10-7M，小于10-8M的亲和力(KD)值特异性结合(“识别”)其靶的抗体。更低的KD值对应于更高的结合亲和力(即，更强的结合)，这样10-7的KD值与10-6的KD值相比较表示更高的结合亲和力。
“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与免疫反应性抗原结合的抗体分子的部分(例如免疫球蛋白分子或scFv的片段)。抗原结合位点由重链(“H”)和/或轻链(“L”)的N末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区域内的3个高度趋异的区段被称为“高变区”，其间插在称为“构架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指在免疫球蛋白的高变区之间或其邻近天然发现的氨基酸序列。在四聚体抗体分子中，轻链的3个高变区和重链的3个高变区彼此相对置于3维空间中以形成抗原结合“表面”。该表面介导靶抗原的识别和结合。重链和/或轻链的每一个的3个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。
“表位”是抗体所结合的抗原上的位点(例如c-Met Sema或PSI结构域上的位点)。可从连续氨基酸或可从通过蛋白质的折叠(例如，三级折叠(tertiary folding))紧靠的非连续氨基酸形成表位。
″S21抗体”或“来自克隆21的抗体”是指由克隆S21或克隆21表达的抗体或指以其它方式合成，但具有与由克隆S21表达的抗体相同的CD和任选地相同的构架区的抗体。类似地，抗体S1(克隆1)和S20(克隆20)等是指由相应的克隆表达的抗体和/或指以其它方式合成的，但具有与所提及的抗体相同的CDR和任选地相同的构架区的抗体。此类抗体的CDR示于下列表1中。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换地用于指待进行治疗评估和/或待治疗的哺乳动物。在实施方案中，哺乳动物是人。术语“受试者”、“个体”和“患者”因此包括患有癌症(例如，肺癌、卵巢或***的腺癌、乳腺癌等)的个体。受试者可以是人，但还包括其它哺乳动物，特别地用作人疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。
如本文中所用，术语“治疗”、“医治”等是指施用试剂或进行方法(例如，放射、手术方法等)以获得效果。效果可以是预防性的(就完全或部分防止疾病或其症状发生而言)和/或可以是治疗性的(就实现疾病和/或疾病的症状的部分或完全治愈而言)。如本文中所用，“治疗”包括哺乳动物中，特别地人中的任何增殖性生长的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病或疾病的症状在可对疾病易感但还未被诊断为患有其(例如，包括可与原发性疾病相关或由原发性疾病引起的疾病)的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)减轻疾病，即引起疾病的消退。在肿瘤(例如，癌症)治疗中，治疗剂可直接减少肿瘤细胞的转移。
术语"细胞培养"或"培养"意指在人工、体外环境中维持细胞。然而，应理解，术语“细胞培养”是总称并且可用于的培养，包括不仅单个细胞的培养而且还有组织或器官的培养。
术语“肿瘤”，如本文中所用，是指所有瘤形成细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌变前和癌性细胞及组织。
术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”在本文中可互换地用于指显示自主的不受调节的生长(这样它们显示特征在于对细胞增殖的控制的明显丧失的异常生长表型)的细胞。一般地，用于本申请中的检测、分析、分类或治疗的目标细胞包括癌变前(例如，良性)、恶性、转移前、转移和非转移细胞。癌症的实例包括但不限于肺癌、肾癌(例如肾癌(renal cancer))、胃癌、乳腺癌、脑癌、肺癌、***、肝细胞癌、胰腺癌、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌(cancer of the urinarytract)、甲状腺癌、癌、黑素瘤、头颈癌和结肠癌。
取决于癌症的性质，获得适当的患者样品。如本文中所用，短语“癌组织样品”是指获自癌性肿瘤的任何细胞。在实体瘤的情况下，通常可利用常规技术获得和制备来自手术切除的肿瘤的组织样品以进行测试。或者，可收集体液样品例如淋巴、血液或血清样品或渗出液液体样品例如癌性器官渗出液(例如，来自乳腺的渗出物)，将其用作待分析的样品。在白血病的情况下，可获得和适当地制备淋巴细胞或白血病细胞。类似地，在任何转移的癌症的情况下，可从体液例如淋巴液、血液、血清或远侧感染的器官或其渗出液提取细胞。
癌症的“病理学”包括损害患者健康状况(well-being)的所有现象。这包括但不限于异常或不受控制的细胞生长、转移、干扰相邻细胞的正常功能、以异常水平释放细胞因子或其它分泌产物、炎症或免疫反应的抑制或加重、瘤形成、初癌(premalignancy)、恶性肿瘤、周围或远距离组织或器官例如***的侵袭等。
术语“诊断”在本文中用于指分子或病理学状态、疾病或病况的鉴定，例如乳腺癌、***癌或其它类型的癌症的分子亚型的鉴定。
术语“预后”在本文中用于指可归因于癌症的死亡或进展(包括肿瘤性疾病例如肺癌、结肠癌、皮肤癌或食管癌的复发、转移扩散以及抗药性)的可能性的预测。术语“预测”在本文中用于指基于观察、经验或科学推理进行预言或估计的行为。在一个实例中，医生可预测患者将在手术去除原发性肿瘤和/或化学疗法后存活一定的时期而无癌症复发的可能性。
如本文中所用，术语“相关”或“与……相关”等及类似术语，是指两个事件的实例之间的统计关联性，其中事件包括数目、数据组等。例如，当事件包括数目时，正相关(在本文中也称为“直接相关(directcorrelation)”是指随着一个事件增加，另一个事件也增加。负相关(在本文中也称为“反相关(inverse correlation)”)意指随着一个事件增加，另一个事件减少。
术语“分离的”意欲表示将化合物与天然地伴随其的全部或一些组分分离。“分离的”还指与在制造(例如，化学合成、重组表达、培养基等)过程中伴随其的全部或一些组分分离的化合物(例如蛋白质)的状态。
“生物样品”包括多种获自个体的样品类型。定义包括血液和生物来源的其它液体样品、实体组织样品例如活检标本或组织培养物或来源于其的细胞以及其后代。定义还包括在其获得后已以任何方式进行操作(例如通过利用试剂治疗；洗涤；或针对某些细胞群例如癌细胞进行富集)的样品。定义还包括已针对特定类型的分子例如核酸、多肽等进行了富集的样品。术语“生物样品”包括临床样品，并且还包括通过手术切除获得的组织，通过活组织检查获得的组织、培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、组织样品、器官、骨髓、血液、血浆、血清等。“生物样品”包括获自患者的癌细胞的样品，例如包含获自患者的癌细胞的多核苷酸和/或多肽的样品(例如，包含多核苷酸和/或多肽的细胞裂解物或其它细胞提取物)；和包含来自患者的癌细胞的样品。包含来自患者的癌细胞的生物样品还可包括非癌性细胞。
具体实施方案的描述
本文中公开了特异性结合c-Met的抗体，以及相关的组合物及其使用方法。使用方法包括癌症的治疗和诊断。
抗体包含来自克隆1、20或21的抗体的VH的至少1个、2个或全部3个CDR。抗体还包含来自克隆1、20或21的抗体的VL的至少1个、2个或全部3个CDR。可独立地选择每一个VH或VL CDR。或者，抗体与来自克隆1、20或21的抗体竞争对c-Met的结合(例如，结合与来自克隆1、20或21的抗体相同的表位)。
本公开的抗体还可包含来自克隆1、20或21的抗体的全部VHCDR和/或VL CDR。抗体可包含来自克隆1、20或21的抗体的全长VH链。抗体还可包含来自克隆1、20或21的抗体的全长VL链。
抗体可以是单链Fv(scFv)、Fab、(Fab’)2、(ScFv)2等。抗体可以是IgG(例如，IgG2)或任何其它同种型，或可以是双特异性抗体。
可将抗体缀合至抗癌药物、标记物、改善血清半衰期、内吞的部分(例如PEG)等。抗体还可存在于药学上可接受的赋形剂中(例如，单位剂量制剂中)。本公开还提供了组合物，所述组合物包括一种或多种选自本文所述的抗体和/或包含一个或多个来自此类抗体的CDR的抗体的不同抗体，和/或一种或多种包含此类抗体的突变体或衍生物的抗体。组合物可包括一种或多种抗体，例如克隆1、20或21。
本公开的方法包括提供以有效地治疗患有癌症(其表达被主题抗体结合的抗原)的受试者的量施用一种或多种本文公开的主题抗体的方法。由本公开提供的抗体还可用于癌症的诊断/预后。
本文中提供的核酸编码一种或多种本文所述的抗体。本文中还提供了包含此类核酸的宿主细胞以及产生主题抗体(例如通过分泌)的宿主细胞。还提供了用于制备包含主题抗体的组合物或用于进行主题方法的试剂盒。
抗体
优选抗体具有对于c-Met的高亲和力，所述c-Met为可暴露于癌细胞的细胞表面上的膜受体。癌细胞，例如，包括来源于肺癌细胞(例如H1993或H441)的癌细胞及其它癌细胞。主题抗体包括在结合抗原例如活哺乳动物细胞的表面上的抗原后被内化进入(例如，通过内吞例如受体介导的内吞)细胞的那些抗体。
主题抗体包括与来自克隆1、20或21的抗体竞争对c-Met的表位的结合的抗体。特定抗体识别与另一种抗体识别的表位相同的表位的能力可通过一种抗体竞争性抑制第二抗体对抗原的结合的能力(例如，如通过竞争性结合测定法测定的)来测定。本文中还包括结合与来自克隆1、20或21的抗体识别的表位相同的表位的主题抗体。
许多竞争性结合测定法中的任意测定法可用于测量两种抗体之间对相同的抗原的竞争。例如，夹心ELISA测定法可用于该目的。测定交叉反应性的方法对于本领域技术人员来说是公知的(参见，例如，Dowbenko等人(1988)J.Virol.62:4703-4711)。
如果在第一抗体存在的情况下，通过使用用于评估竞争性结合的任意测定法，第二抗体对抗原的结合被减少至少30%，通常至少约40%、50%、60%或75%，以及通常至少约90%，则抗体被认为竞争性抑制第二抗体的结合。
这可通过提供一种或多种连接至固体载体(例如使用表面等离子体共振技术)的分离的靶抗原(例如，全长c-Met或其片段)，和测定抗体结合靶或与本文所述的抗体竞争对靶的结合的能力来确定。
被抗-c-Met抗体(例如克隆1和20)结合的表位存在于c-Met配体(例如肝细胞生长因子)的结合位点中。肝细胞生长因子的结合位点存在于c-Met的约残基位置25-567的连续氨基酸序列中。表位还可通过其在SEMA和PSI结构域内的位置来描述。
或者，被抗-c-Met抗体(例如克隆21)结合的表位存在于c-Met的约残基位置567至大致位置932的连续氨基酸序列中。表位还可由其在c-Met的IgG样结构域中的位置来描述。
上文中使用的c-Met的残基位置编号基于GenBank登录号NP_000236.2或UniProt登录号P08581中所示的序列。
与c-Met共有相似表位的抗原还可以是主题抗体的结合靶。当结合至c-Met时，主题抗体可被表达c-Met蛋白的细胞内化。
抗-c-Met抗体对其具有亲和力的表位暴露于许多癌细胞的细胞表面上并且是溶剂可及的，特别地暴露于细胞的质膜上。当细胞活的时候，表位对于主题抗体是可及的。例如，表位可存在于来源于肺、肾、肝、胃、乳腺和脑等的癌细胞上。抗-c-Met抗体对其具有亲和力的癌细胞可以是包含表达c-Met的癌细胞的任何癌症。
如上文中所指出的，主题抗体包括与一个或多个来自克隆1、20或21等的抗体竞争的抗体。此外，抗体可具有与对于c-Met具有约1x10-6M的KD的抗体相当或比其更大的结合亲和力。本公开的针对c-Met的抗体的KD可约1×10-6M至约1×10-7M，约1×10-7M至约1×10-8，约1×10-8M至约1×10-9M的范围内变化。例如，本公开的抗体的KD可为约5×10-9M至约2×10-8M。
主题抗体的实例包括这样的抗体，所述抗体具有相同的结合特异性并且包含各自独立地与下列表1显示的抗体的VH CDR(例如，克隆21的VH CDR1)的氨基酸序列共有至少约80%，至少约87%，至少约93%，至少约94%或高至100%的氨基酸序列同一性的至少两个CDR。主题抗体还可包括来自表1显示的每一个抗体的任意VH CDR的全部3个CDR，以便主题抗体的每一个VH CDR选自表1显示的单个抗体并且每一个VH CDR独立地与表1显示的抗体的VH CDR的氨基酸序列共有至少约80%，至少约87%，至少约93%，至少约94%或高至100%的氨基酸序列同一性。例如，主题抗体的重链可包含克隆21的两个VH CDR或全部3个VH CDR。或者，重链可包含克隆21的两个VH CDR或全部3个VH CDR。
类似地，对于轻链，主题抗体具有相同的结合特异性并且可包含各自独立地与表1显示的每一个抗体的VL CDR(例如克隆21的VLCDR1)的氨基酸序列共有至少约80%，至少约87%，至少约93%，至少约94%或高至100%的氨基酸序列同一性的至少两个CDR。主题抗体还可包括来自表1显示的任意抗体的全部3个VL CDR并且每一个VL CDR独立地与表1显示的抗体的VL CDR的氨基酸序列共有至少约80%，至少约87%，至少约93%，至少约94%或高至100%的氨基酸序列同一性。例如，主题抗体的轻链可包含克隆21的两个VL CDR或全部3个VL CDR。或者，轻链可包含克隆21的两个VL CDR或全部3个VL CDR。
任选地，抗体可在表1提供的重链或轻链的任意相应的构架序列中包含相同(即100%的同一性)、相似或不同的构架序列(FR)。当构架序列相似时，构架可以与下列表1显示的任意抗体的相应构架序列具有至少约85%，至少约86%，至少约90%，至少约93%，至少约96%，至少约98%或高至100%的同一性。
本公开的抗体从而可包含与表1显示的全长VH或VL序列具有至少80%的同一性，至少85%，至少90%，至少95%，高至100%的氨基酸序列同一性的全长VH和/或全长VL序列。例如，主题抗体可包含克隆21的全长VH和/或全长VL。或者，主题抗体可包含克隆20的全长VH和/或全长VL。
抗体产生的方法
通过使用本文中提供的信息，使用本领域技术人员公知的标准技术制备本公开的抗-c-Met抗体。例如，可将本文中提供的多肽序列(参见，例如表1)用于确定编码抗体的适当核酸序列，随后将核酸序列用于表达一个或多个c-Met特异性抗体。可按照本领域技术人员公知的标准方法最优化核酸序列以反映各种表达***的特定密码子“优先性”。
通过使用提供的序列信息，可按照本领域技术人员已知的许多标准方法合成核酸。优选在商购可得的固相寡核苷酸合成仪上进行寡核苷酸的合成，或使用例如固相亚磷酰胺三酯法手工合成寡核苷酸。
在合成编码主题抗体的核酸后，其可按照标准方法扩增和/或克隆。实现这些目的的分子克隆技术在本领域是已知的。适用于重组核酸的构建的多种克隆和体外扩增法对于本领域技术人员来说是已知的。
编码本公开的抗体的天然或合成核酸的表达可通过将编码抗体的核酸有效地连接于启动子(其是组成型或诱导型的)，随后将构建体整合进入表达载体来实现。载体可适合于在原核生物或真核生物或两者中进行复制和整合。典型克隆载体包含转录和翻译终止子、起始序列和用于调节编码抗体的核酸的表达的启动子。载体任选地包含基因表达盒，所述表达盒包含至少一个独立的终止子序列、允许所述盒在真核和原核生物中复制的序列(即穿梭载体)以及用于原核和真核***的选择标记。
为了获得高水平的克隆核酸的表达，构建通常包含指导转录的强启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点以及转录/翻译终止子是常见的。在大肠杆菌中转化的DNA载体中包含选择标记也是有用的。此类标记的实例包括赋予对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。用于表达抗体的表达***可使用例如大肠杆菌、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)和沙门菌属(Salmonella)来获得。还可使用大肠杆菌***。
还可将抗体基因亚克隆进入表达载体，所述表达载体允许在抗体(例如scFv)的C末端或N末端添加标签(例如六组氨酸)以促进纯化。在哺乳动物细胞中转染和表达基因的方法在本领域是已知的。利用核酸转导细胞可包括例如将包含核酸的病毒载体与载体的宿主范围内的细胞一起温育。本公开中使用的细胞培养物(包括来自组织或血液样品的细胞系和培养细胞)在本领域是公知的。
在分离和克隆主题抗体的核酸后，可在本领域技术人员已知的多种重组工程细胞中表达核酸。此类细胞的实例包括细菌、酵母、丝状真菌、昆虫(例如使用杆状病毒载体的昆虫)和哺乳动物细胞。
可按照本领域已知的方法实现主题抗体的分离和纯化。例如，可从经遗传修饰以组成型和/或在诱导后表达蛋白质的细胞的裂解物，或利用免疫亲和层析(或使用蛋白G或A的沉淀法)(通过洗涤以除去非特异性结合的材料，随后洗脱特异性结合的抗体)从合成反应混合物分离蛋白质。还可通过透析和蛋白质纯化法中通常使用的其它方法进一步纯化分离的抗体。在一个实施方案中，可使用金属螯合层析法分离抗体。本公开的抗体可包含修饰以促进分离，如上文中所论述的。
可以以大体上纯或分离的形式(例如，不含其它多肽)制备主题抗体。蛋白质可存在于相对于可存在的其它组分(例如，其它多肽或其它宿主细胞组分)针对多肽富集的组合物中。可提供纯化的抗体以便抗体存在于大体上不含其它表达的蛋白质的组合物中，例如少于90%，通常少于60%，更常见地少于50%的组合物由其它表达的蛋白质组成。
本公开还提供了产生主题抗体的细胞。细胞可以是能够在体外产生抗体(例如单克隆抗体，例如IgG)的杂交细胞或“杂交瘤”。
本文中还包括省略杂交瘤产生的用于产生抗体分子的抗原结合区的重组DNA形式的技术。将DNA克隆进入例如细菌(例如，噬菌体)、酵母、昆虫或哺乳动物表达***。适当的技术的一个实例使用具有前导序列的噬菌体λ表达***，所述前导序列使得表达的抗体(例如Fab或scFv)迁移至周质空间(细菌细胞膜与细胞壁之间)或以待分泌。可快速产生大量结合c-Met的抗体的功能性片段(例如scFv)。
修饰
本公开包括经修饰以提供期望的性质(例如以促进至受试者的特定类型的组织和/或细胞的递送，以增加血清半衰期，以补充抗癌活性等)的抗体和核酸。可提供具有或不具有修饰的本公开的抗体，所述抗体包括人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。修饰主题抗体的一个方法是在抗体的N和/或C末端缀合(例如联接)一个或多个另外的元件，例如另一种蛋白质和/或药物或载体分子。
利用缀合物修饰的主题抗体保留期望的结合特异性，同时利用缀合物的第二分子的性质赋予另外的期望的特征。例如，可将主题抗体缀合至第二分子，所述第二分子可有助于溶解度、贮存或其它操作性质、细胞渗透性、半衰期、免疫原性的减小、控制释放和/或分布，例如通过靶向特定细胞(例如，神经元、白细胞、肿瘤细胞等)或细胞位置(例如，溶酶体、内体、线粒体等)、组织或其它身体部位(例如，血液、神经组织、特定器官等)。其它实例包括缀合染料、荧光团或其它可检测标记物或报道分子以用于测定、跟踪等。更具体地，可将主题抗体缀合至第二分子例如肽、多肽、染料、荧光团、核酸、碳水化合物、抗癌剂、脂质等(例如，在还原或非还原末端)，例如脂质部分的连接，包括N-脂肪酰基例如N-油酰基、脂肪胺例如十二烷基胺、油酰基胺等。
例如，鉴于抗体可被内化入细胞中，可进一步修饰本公开的抗体或核酸以增强或减小至细胞内的递送的效率。本文中还包括递送在细胞中表达主题抗体的核酸的基因递送方法。可通过联接至肽或蛋白质来减强或减小抗体的细胞吸收(例如内吞)的效率。例如，可将给定的抗体联接至靶受体的配体或更容易被内吞机制吞噬的大分子例如另一种抗体。当内吞小囊泡与溶酶体融合时，还可通过酸水解或酶促活性来释放缀合物负载。为了减少细胞吸收，缀合物可包括在细胞表面上保留抗体的配体，所述配体可用作细胞吸收的对照，或在一些情况下，减小一种细胞类型的吸收但增加其它细胞类型的吸收。
缀合抗体的其它性质可包括其中缀合物相对于未缀合的抗体减小细胞毒性的性质。另一种性质是缀合物可比未缀合的抗体更高效地靶向一种类型的细胞或器官(例如癌性细胞或癌性组织)。
其它实例包括与一种或多种分子缀合的抗体，所述分子补充、增进、增强所述抗体或可另外地与抗体结合协同作用。抗体可以已连接抗癌药物，例如以递送至癌症的位置，以进一步促进细胞杀伤或清除，例如抗-增殖部分(例如，VEGF拮抗剂，例如，抗-VEGF抗体)、毒素(例如，多柔比星、蓖麻蛋白、假单胞菌外毒素A等)、放射性核素(例如90Y、131I、177L、10B以进行硼中子捕获等)、抗癌剂和/或寡核苷酸(例如siRNA)。
包含抗体的脂质体。例如，可通过共价或非共价修饰将抗体配制在脂质纳米颗粒(例如，脂质体)中。可通过例如Fc区将抗体直接连接至脂质纳米颗粒的表面。还可通过接头将抗体共价连接至接在脂质纳米颗粒的表面上的聚合物的末端。此类缀合的脂质纳米颗粒在本文中被称为“免疫脂质体(immunoliposome)”。
可将编码本公开的抗体(例如S20)的基因与在C末端上产生的半胱氨酸融合。随后可通过定向缀合将该半胱氨酸融合蛋白通过其C末端半胱氨酸特异性偶联至脂质体外表面上的马来酰亚胺修饰的PEG链。可利用一种或多种抗癌剂(例如小分子、肽和/或核酸(例如siRNA)或本领域已知的任意试剂)装载免疫脂质体。脂质体可包含抗癌药物，例如多柔比星。免疫脂质体中的主题抗体可用作使得免疫脂质体能够特异性结合癌细胞表面上的c-Met的靶向部分。制备和装载脂质纳米颗粒例如脂质体和免疫脂质体的方法在本领域是已知的。参见，例如，US7749485和US20070031484，其公开内容通过引用并入本文。
可任选地修饰本公开的抗体以提供改善的药代动力学特性(例如，通过PEG化、高糖基化等)。可增加血清半衰期的修饰是目标修饰。主题抗体可被“PEG化”，如包含一个或多个聚(乙二醇)(PEG)部分。适用于蛋白质的PEG化的方法和试剂在本领域是公知的，并且可见于美国专利No.5,849,860，其公开内容通过引用并入本文。
当将从来源分离主题抗体时，可将主题蛋白质缀合至有利于纯化的部分，例如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员)、凝集素等。还可将主题蛋白质结合至(例如，固定至)固体载体上，包括但不限于聚苯乙烯板或珠粒、磁性珠粒、测试条、膜等。
当将在测定中检测抗体时，主题蛋白质还可包含可检测的标记，例如放射性同位素(例如，125I；35S等)、产生可检测的产物的酶(例如，荧光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光蛋白、生色蛋白、染料(例如，异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白等)；荧光发射金属例如152Eu或镧系的其它元素，通过金属螯合基团例如EDTA连接至蛋白质；化学发光化合物，例如，鲁米诺、异鲁米诺、吖啶盐等；生物发光化合物例如萤光素；荧光蛋白质；等。间接标记物包括对于主题蛋白质是特异性的抗体，其中可通过第二抗体检测所述抗体；和特异性结合对例如生物素-抗生物素蛋白等的成员。
可通过接头例如柔性接头将用于修饰主题抗体的任意上述元件联接至抗体。如果存在，接头分子通常具有足够的长度以允许抗体和联接的载体能够在抗体与载体之间进行一定的弯曲运动。接头分子通常为约6-50个原子长。接头分子还可以例如是芳基乙炔、包含2-10个单体单位的乙二醇寡聚体、二胺、二酸、氨基酸或其组合。
当接头是肽时，接头可具有任何适当的不同长度，例如1个氨基酸(例如，Gly)至20或更多个氨基酸，2个氨基酸至15个氨基酸，3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸，5个氨基酸至9个氨基酸，6个氨基酸至8个氨基酸，或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
柔性接头可包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n、GSGGSn(SEQ ID NO:1)和GGGSn(SEQ ID NO:2)，其中n为至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其它柔性接头。可使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物，其中相对无组织的氨基酸是目标氨基酸，并且可用作组分之间的中性系链(tether)。柔性接头的实例包括但不限于GGSG(SEQ IDNO:3)、GSGG(SEQ ID NO:4)、GSGSG(SEQ ID NO:5)、GSGGG(SEQID NO:6)、GGGSG(SEQ ID NO:7)、GSSSG(SEQ ID NO:8)等。本领域技术人员将承认，缀合至上述任意元件的肽的设计可包括完全或部分具有柔性(以便接头可包括柔性接头以及提供柔性较低的结构的一个或多个部分)的接头。
人工程化抗体。本公开的抗体可以以免疫球蛋白例如人IgG的形式存在。例如，可将以scFV形式存在的本公开的抗体联接至待整合入人免疫球蛋白例如完整IgG免疫球蛋白中的人恒定区(例如Fc区域)。
Fc区域。结合c-Met的本公开的抗体可包含Fc区域。Fc区域可以是在人或其它动物中发现的任意天然存在的同种型(例如，来源于免疫球蛋白的任意种类或亚类)并且可任选地被进一步修饰以具有改变的功能。当Fc区域为非人和CDR和/或FR区域为人时，抗体可被描述为嵌合抗体。可在一个或多个氨基酸位置上修饰Fc区域以具有增强的效应子功能，例如起始细胞介导的细胞毒性或激活补体活性(例如C1q结合或补体依赖性细胞毒性)、下调细胞表面受体等。可用作本公开的抗体的Fc变体的详细内容可见于例如US7,416,727、US7,371,826、US7,335,742、US7,355,008、US7,521,542和US7,632,497(将所述专利的公开内容通过引用并入本文)中。
组合物
主题组合物提供了抗体和/或编码其的核酸，其中抗体结合表达c-Met的癌细胞并且被癌细胞内化。本公开的组合物用于治疗含有癌症的受试者(例如，人)，并且可适合用于在疾病的任何阶段的治疗。
可以以药物组合物的形式提供包含1、2种或更多种不同的抗体的组合物，将组合物给有此需要的哺乳动物(例如，人)施用。
本文中包括的组合物可包含本公开的1、2、3种或更多种不同抗体(和/或编码其的核酸)。例如，组合物可包含下列抗体的一种或多种：克隆1、2和3。组合物可任选地还包括包含一个或多个来自此类抗体的CDR的抗体和/或一种或多种包含此类抗体的突变体或衍生物的抗体。
本公开的组合物的实例可包括表1公开的任意抗体。当组合物包含两种或更多种抗体时，每一种抗体可以对于相同或不同表位或对于不同抗原上的表位是特异性的。例如，组合物可包含至少一种对于c-Met的表位是特异性的抗体和另一种对于另一种细胞表面抗原(例如EGFR)是特异性的抗体。组合物还可包含双特异性、多特异性抗体或编码其的核酸。
可单独地和/或彼此组合地(例如以形成双特异性或多特异性抗体)和/或与其它已知抗癌剂(例如用于癌症治疗的抗体)组合地使用本公开的抗体。例如，组合物例如脂质体可包含两种或更多种抗体，其中至少一种抗体为本公开的抗体。如上所述，脂质体可包含一种或多种与主题抗体不同的抗体。这样的脂质体可以是双特异性、多特异性的等，以便脂质体对于除主题抗体的表位外的其他表位是特异性的。
可在单一制剂中提供组合，或可以在试剂盒中以单独的制剂提供组合，其中单独的制剂可包含单种抗体或两种抗体。试剂盒的此类分开的制剂可在施用之前组合或通过单独注射施用。
可在药学可接受的赋形剂中提供主题药物组合物，其可以是溶液例如含水溶液(通常盐水溶液)，或它们可以以粉剂形式提供。主题组合物可包含其它组分例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。组合物可按需要包含药学上可接受的辅助物质(以接近生理条件)，例如醋酸钠、氯化钠、氯化镁、氯化钙、乳酸钠等。
主题抗体(例如呈药学上可接受的盐的形式)可被配制来在下面随后描述的方法中用于口服、局部或胃肠外施用。在某些实施方案中，例如当以可注射的液体施用抗体时，以随时可用的剂量形式或以可重建的贮存稳定的粉剂或由药学上可接受的载体和赋形剂组成的液体的形式提供抗体制剂。
本公开的组合物根据需要可包括治疗有效量的主题抗体以及任何其它相容性组分。“治疗有效量”意指以单次剂量或作为一系列相同或不同的抗体或组合物的部分给个体施用该量有效地减少受试者的癌性细胞的增殖和/或转移。这样的治疗有效量的抗体及其对细胞生长的影响包括与一种或多种其它疗法(例如，免疫疗法、化学疗法、放射疗法等)结合的细胞生长的协作和/或协同抑制。如下文中所指出的，可结合给药方案和受试者状况的诊断分析(例如，使用对于c-Met是特异性的抗体监测细胞表面表位的存在或不存在)等调整治疗有效量。
量和剂量。抗体在药物制剂中的浓度可从按重量计低于约0.1%，通常2%或至少约2%变化至多至20%至50%或更多，并且可根据选择的特定施用模式和患者的需要主要按液体体积、粘性等来进行选择。所得的组合物可以以溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、凝胶、乳膏、洗剂、软膏剂、气溶胶等形式存在。
同样地，适当的剂量和给药方案还可通过已知实现期望的生长抑制剂或免疫抑制反应的抗癌剂或免疫抑制剂的比较来确定。此类剂量包括导致无明显的副作用的细胞生长的低剂量抑制的剂量。通过以适当的剂量适当地施用某些化合物，本公开的化合物可提供广泛的细胞内作用，例如从细胞生长的部分抑制至基本上完全抑制。剂量治疗可以是单次剂量方案或多次剂量方案(例如，包括斜坡剂量(ramp dose)和维持剂量)。如下文中所指示的，可将主题组合物与其它试剂结合施用，从而剂量和方案可在该情况下也发生变化以适合受试者的需要。
联合治疗
可将许多癌症疗法的任意疗法与主题抗体组合在组合物中。例如，用于化学治疗剂治疗或生物反应调节剂治疗的试剂可存在于包含抗体的药物组合物例如免疫脂质体中。下文中简要地论述了可与主题抗体组合使用的某些试剂。
化学治疗剂是减少癌细胞的增殖的非肽(即，非蛋白质性质的)化合物，包括细胞毒性剂和细胞抑制剂。化学治疗剂的非限定性实例包括烷化剂、亚硝基脲、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物(例如，长春花)生物碱、核酸例如抑制性核酸(例如siRNA)和类固醇激素。
抗代谢药包括例如叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物以及腺苷脱氨酶抑制剂。
适当的天然产物及其衍生物(例如长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)可用作抗癌剂。例如紫杉烷，例如紫杉醇以及任何活性紫杉烷衍生物或前体药物。
其它抗增殖性细胞毒性剂为诺维本、CPT-11、瑞宁德(anastrazole)、来曲唑、卡培他滨、reloxafine、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosamide)和屈洛昔芬。具有抗增殖活性的微管影响剂也适合使用。激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)适合使用。
治疗方法
本文中还公开了通过施用本公开的抗体减少癌细胞的增殖的方法。患有，怀疑患有癌症或处于发生癌症的风险中的受试者参与本文所述的治疗和诊断。
本方法包括给有此需要的患者施用治疗有效量的抗-c-Met抗体。抗体的施用可抑制癌细胞增殖、减轻肿瘤重量、减少转移和/或改善患者的临床结果。
本方法用于哺乳动物受试者(特别是人)的多种癌症疗法(包括癌症预防和诊断后癌症疗法)。患有，怀疑患有肿瘤或处于发生肿瘤的风险中的受试者参与本文所述的疗法。
在相关实施方案中，待治疗的受试者具有表达(例如过表达)c-Met的细胞。c-Met在癌细胞表面上表达并且通常以比相应的非癌性细胞更高的水平存在。该方面在本公开的方法的上下文中可以是有益的，因为表达或呈递c-Met的细胞可适于用本公开的抗体来治疗。可以例如给受试者施用抗体，其中在当抗原的存在是不可检测时的点上开始疗法，因此疗法无意是限定性的。还可能在疾病症状的第一征兆出现之前，可能的疾病的第一征兆出现时，或疾病诊断之前或之后开始抗体疗法。
例如，可利用本公开的方法抑制的癌症包括但不限于癌，包括腺癌，和特别地肺癌(非小细胞和小细胞肺癌)。可被治疗的其它癌症包括源自脑、结肠直肠、胃、头与颈、胃、肾、肝和乳腺中的癌性生长的癌症。
癌症类型
所述方法在治疗或预防多种癌症，特别地牵涉新血管形成的癌症和转移癌的背景中是有用的。适于使用本公开的方法进行的疗法的癌症的实例提供于下文中。
可适于利用本文所述的方法进行的疗法的癌包括但不限于食管癌、肝细胞癌、基底细胞癌(皮肤癌的形式)、鳞状细胞癌(各种组织)、膀胱癌(包括移行细胞癌(膀胱恶性肿瘤))、支气管癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌(papillary carcinoma)、***状腺癌(papillaryadenocarcinoma)、囊腺癌、髓样癌、肾细胞癌、原位导管癌或胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎癌(embryonal carcinoma)、肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)、***、子宫癌、睾丸癌、骨肉瘤、上皮癌和鼻咽癌。
可适于利用本文公开的方法进行的疗法的肉瘤包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其它软组织肉瘤。
可适于利用本文公开的方法进行的疗法的其它实体瘤包括但不限于胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
可适于根据本文公开的方法进行的治疗的其它癌症包括非典型脑膜瘤(脑)、胰岛细胞癌(胰腺)、髓样癌(甲状腺)、间叶瘤(肠)、肝细胞癌(肝)、肝母细胞瘤(肝)、透明细胞癌(肾)、和神经纤维瘤。
可适于使用本文公开的方法进行的治疗的其它示例性癌症包括但不限于神经外胚层和上皮来源的癌症。神经外胚层来源的癌症的实例包括但不限于尤因肉瘤、脊髓肿瘤、脑肿瘤、婴儿的幕上原始神经外胚叶瘤(supratenbrial primative neuroectodermal tumor)、管状囊性癌(tubulocystic carcinoma)、黏液性小管状和梭形细胞癌(mucinoustubular and spindle cell carcinoma)、肾肿瘤、纵隔肿瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤以及青少年和年轻成人的肉瘤。上皮来源的实例包括但不限于小细胞肺癌、乳腺、眼晶状体、结肠、胰腺、肾、肝、卵巢和支气管上皮的癌症。
其它癌症疗法的组合
抗-c-Met抗体的治疗性施用可包括作为治疗方案的部分的施用，所述施用可以与或可以不与另外的标准抗癌治疗剂(包括但不限于免疫疗法、化学治疗剂和手术(例如，下文中进一步描述的疗法))结合。
此外，抗-c-Met抗体的治疗性施用还可以是利用抗癌疗法对受试者进行的治疗后治疗，其中抗癌疗法可以是例如手术、放射疗法、化学治疗剂的施用等。还可将使用本公开的纤维状蛋白的癌症疗法与免疫疗法组合使用。在其它实例中，可将纤维状蛋白与一种或多种化学治疗剂(例如，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松(CHOP))组合施用和/或与放射疗法组合施用和/或与手术干预组合施用(例如，手前或术后以除去肿瘤)。当将纤维状蛋白与手术干预结合使用时，可在手术之前、手术时或手术之后施用纤维状蛋白以除去癌性细胞，以及可全身性施用或在手术部位局部施用纤维状蛋白。可全身性(例如，通过胃肠外施用，例如通过静脉内途径)或局部(例如，在局部肿瘤位置，例如通过瘤内施用(例如，至实体瘤内，至淋巴瘤或白血病中的牵涉的***内)，至供应实体瘤的血管内的施用等)施用单独的纤维状蛋白或上述组合的纤维状蛋白。
可将多种癌症疗法的任意疗法与本文所述的纤维状蛋白疗法组合使用。此类癌症疗法包括手术(例如，癌性组织的手术去除)、放射疗法、骨髓移植、化学治疗剂治疗、生物反应调节剂治疗以及前述疗法的某些组合。
放射疗法包括但不限于X射线或γ射线，其来源于外部施用源例如光束或通过植入小放射源来产生。
化学治疗剂是减少癌细胞增殖的非肽(即，非蛋白质性质的)化合物，并且包括细胞毒性剂和细胞抑制剂。化学治疗剂的非限定性实例包括烷化剂、亚硝基脲、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱及类固醇激素。
用于减少细胞增殖的试剂在本领域是已知的并且被广泛使用。此类试剂包括烷化剂，例如氮芥、亚硝基脲、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐(alkyl sulfonate)和三氮烯，包括但不限于氮芥、环磷酰胺(CYTOXANTM)、美法仑(L-溶肉瘤素)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(methyl-CCNU)、链佐星、氯脲霉素(chlorozotocin)、乌拉莫司汀、氮芥、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚乙基密胺(triethylenemelamine)、三乙烯基硫代磷胺、白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢药包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、胞嘧啶阿糖核苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(FudR)、6-硫鸟嘌呤、6-巯嘌呤(6-MP)、喷司他丁、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤、10-炔丙基-5,8-二脱氮叶酸(PDDF, CB3717)、5,8-二氮杂四氢叶酸(dideazatetrahydrofolicacid)(DDATHF)、甲酰四氢叶酸、磷酸氟达拉滨、喷司他丁和吉西他滨。
适当的天然产物及其衍生物(例如，长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)包括但不限于Ara-C、紫杉醇 多西他赛喷司他汀、丝裂霉素C、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤；布喹那；生物碱、例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛等；鬼臼毒素、例如依托泊苷、替尼泊苷等；抗生素、例如蒽环类抗生素、盐酸柔红霉素(道诺霉素(daunomycin)、柔红霉素(rubidomycin)、正定霉素(cerubidine))、伊达比星、多柔比星、表柔比星和吗啉代衍生物等；吩噁嗪酮二环肽(phenoxizone biscyclopeptide)，例如放线菌素D(dactinomycin)；碱性糖肽例如博来霉素；蒽醌苷(anthraquinone glycosides)、例如普卡霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin))；蒽二酮，例如米托蒽醌；氮丙啶并吡咯基吲哚二酮，例如丝裂霉素；大环免疫抑制剂，例如环孢菌素、FK-506(他克莫司、普乐可复)、雷帕霉素等；等等。
其它抗-增殖细胞毒性剂为诺维本、CPT-11、瑞宁德、来曲唑、卡培他滨、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺和droloxafine。
具有抗增殖活性的微管影响剂也是适用的，包括但不限于秋水仙碱(NSC 406042)、软海绵素b(Halichondrin B)(NSC 609395)、秋水仙碱(NSC 757)、秋水仙碱衍生物(例如，NSC 33410)、dolstatin 10(NSC376128)、美登碱(NSC 153858)、力索新(rhizoxin)(NSC 332598)、紫杉醇衍生物、多西他赛硫代秋水仙碱(NSC 361792)、三苯甲基-半胱氨酸(trityl cysterin)、硫酸长春碱、硫酸长春新碱，天然和合成埃博霉素包括但不限于埃博霉素A、埃博霉素B、discodermolide；雌莫司汀、诺考达唑等。
适用的激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)包括但不限于肾上腺皮质类固醇(adrenocorticosteroids)，例如***、***等；***和孕激素，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、***、氯米芬(clomiphene)、他莫昔芬等；和肾上腺皮质抑制剂(adrenocortical suppressants)，例如氨鲁米特；17α-炔雌醇；己烯雌酚、睾酮、氟***、丙酸屈他雄酮、睾内脂、甲泼尼龙、甲基***、***龙、曲安西龙、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺(氟他米特(Drogenil))、托瑞米芬(法乐通)和***刺激增殖和分化，从而结合***受体的化合物用于阻断该活性。皮质类固醇可抑制T细胞增殖。
其它化学治疗剂包括金属复合物，例如顺铂(顺-DDP)、卡铂等；尿素例如羟基脲；和肼，例如N-甲基肼；鬼臼毒素；拓扑异构酶抑制剂；丙卡巴肼；米托蒽醌；亚叶酸钙；替加氟等。其它目标抗增殖剂包括免疫抑制剂，例如霉酚酸、沙利度胺、去氧精胍菌素(desoxyspergualin)、重氮丝氨酸(azasporine)、来氟米特、咪唑立宾、氮杂螺环(azaspirane)(SKF105685)；(ZD1839,4-(3-氯-4-氟苯氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)等。
“紫杉烷”包括紫杉醇，以及任何活性紫杉烷衍生物或前体药物。“紫杉醇”(其在本文中应当理解为包括类似物、制剂和衍生物例如多西紫杉醇、泰素(TAXOL)、泰素帝(TAXOTERE)(多西紫杉醇的制剂)、紫杉醇的10-去乙酰基类似物和紫杉醇的3'N-脱苯甲酰基-3'N-叔丁氧基羰基类似物)可利用本领域技术人员已知的技术来容易地制备。
应当理解紫杉醇为不仅指紫杉醇的常见化学可获得形式而且还指类似物和衍生物(例如，TAXOTERETM多西紫杉醇，如上文中指出的)和紫杉醇缀合物(例如，紫杉醇-PEG、紫杉醇-葡聚糖或紫杉醇-木糖)。
在按照本公开的方法进行的一些个体的治疗中，可能期望使用与非恶性细胞的救援剂结合的高剂量方案。在这样的治疗中，可使用能够拯救非恶性细胞的任意试剂，例如噬橙菌因子、叶酸衍生物或甲酰四氢叶酸。此类救援剂对于本领域技术人员来说是公知的。拯救剂包括不干扰本发明的化合物调节细胞功能的能力的那些救援剂。
施用途径
抗-c-Met抗体的施用可通过针对身体的不同部分的不同方法来实现，包括瘤内、静脉内、真皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮肤(即，局部)、经粘膜、腹膜内、动脉内和直肠施用。其它适当的途径包括组合物以片剂、固体、粉剂、液体、气溶胶形式的口服、含服(bucally)、经鼻、经鼻咽、胃肠外、肠内、经胃、局部、经皮肤、皮下、肌内施用、至肿瘤内的损伤区注射、邻近肿瘤的损伤区注射和动脉内输注。可在添加或不添加赋形剂的情况下局部或全身性进行施用。施用还可通过在受试者的肿瘤位置或肿瘤位置周围进行缓慢释放方式来进行。
本领域技术人员将理解：许多将本公开的制剂施用至有此需要的受试者或宿主例如患者的适当方法是可获得的，虽然可使用超过一种途径来施用特定制剂，但特定途径可提供比另一种途径更直接更有效的反应。
短语"治疗有效量"是指以适用于任何医学治疗的合理效益风险比产生一些期望效果的量。有效量可视因素例如待治疗的疾病或病况、待施用的特定靶向构建体、受试者的大小或疾病或病况的严重度而变化。本领域技术人员可凭经验确定特定化合物的有效量而无需过度的实验。
根据示例性实现，可将蛋白质作为组合物的部分来进行施用，这在下文中进行更详细描述。组合物可以以不同的形式存在，包括粉剂、乳膏剂、凝胶、油膏、软膏、溶液、片剂、胶囊、喷雾剂和贴剂。媒介物和载体可用于将组合物递送至患者。此类载体包括增溶剂、稀释剂和分散介质。这类载体是生物相容性的，药学上可接受的，并且不改变纤维状蛋白的治疗特征。还可将赋形剂、佐剂和其它成分包含在组合物中。
剂量
在方法中，给有此需要的受试者施用有效量的抗-c-Met抗体。施用量可取决于施用目标、待治疗的个体的健康和身体状况、待治疗的个体的年龄、分类群(例如，人、非人灵长类动物、灵长类动物等)、期望的消退的程度、抗-c-Met抗体组合物的制剂、治疗医生对医学状况的评估以及其它相关因素而变化。预期量将落在相对广泛的范围内，所述量可通过常规试验来确定。例如，用于抑制癌症转移的抗-c-Met抗体的量大致不超过否则对受试者具有不可逆的毒性的量(即，最大耐受剂量)。在其它情况下，量为约毒性阈值或正好低于毒性阈值，但仍然在免疫有效浓度范围内，或甚至低至阈值剂量。
单个剂量通常不低于对受试者产生可测量的效果所需的量，并且可基于其副产物的抗-c-Met抗体的吸收、分布、代谢和***(“ADME”)的药代动力学和药理学，从而基于组合物在受试者内的分配来决定。这包括施用途径以及剂量的考虑，可调整所述剂量以进行局部(直接用于期望作用的地方以主要获得局部效应)、肠内(经由消化道施用以当保留在消化道的部分中保留时获得全身性或局部效应)或胃肠外(通过除消化道外的途径施用以获得全身性或局部效应)施用。例如，抗-c-Met抗体的施用通常通过注射以及通常通过静脉内、肌内、瘤内途径或其组合来进行。
可通过输注或通过局部注射，例如通过以约50mg/h至约400mg/h，包括约75mg/h至约375mg/h、约100mg/h至约350mg/h、约150mg/h至约350mg/h、约200mg/h至约300mg/h、约225mg/h至约275mg/h的速率输注来施用抗-c-Met抗体。示例性输注速率可实现例如约0.5mg/m2/天至约10mg/m2/天，包括约1mg/m2/天至约9mg/m2/天、约2mg/m2/天至约8mg/m2/天、约3mg/m2/天至约7mg/m2/天、约4mg/m2/天至约6mg/m2/天、约4.5mg/m2/天至约5.5mg/m2/天的期望的治疗剂量。可在期望的时期内重复施用(例如，通过输注)，例如在约1天至约5天的时期内重复施用，或在约1个月、约2个月等的时期内每隔几天例如约5天施用一次。其还可在其它治疗干预例如手术干预(以除去癌性细胞)之前、同时或之后施用。还可将抗-c-Met抗体作为联合治疗的部分施用，其中给受试者施用免疫疗法、癌症化学疗法或放射疗法的至少一种(如下文中更详细描述的)。
通常可根据存在于目标靶上的抗-c-Met抗体的分数来精确估计抗-c-Met抗体在受试者内的分布及其相应的生物活性。例如，施用后，抗-c-Met抗体可与浓缩物质的糖缀合物或其它生物靶一起积累在癌细胞和癌性组织中。因此其中施用抗-c-Met抗体以随时间过去在目标靶中积累的给药方案可以为允许更低的单次剂量的策略的部分。这也可表示，例如，可相对于从体外测定计算的有效浓度降低在体内被更慢清除的抗-c-Met抗体的剂量(例如，在体外有效量接近mM的浓度，相对于在体内低于mM的浓度)。
例如，可从用于抑制细胞迁移的给定的抗-c-Met抗体的IC50估计剂量或给药方案的有效量。“IC50”意指在体外产生50%的抑制所需的药物的浓度。或者，可从给定的抗-c-Met抗体浓度的EC50估计有效量。“EC50”意指在体内获得50%的最大效应所需的血浆浓度。在相关实施方案中，还可基于ED50(有效剂量)确定剂量。
一般地，关于本公开的抗-c-Met抗体，有效量通常不超过计算的IC50的200倍。通常，施用的抗-c-Met抗体的量低于计算的IC50的约200倍，低于约150倍，低于约100倍，许多实施方案低于约75倍，低于约60倍、50倍、45倍、40倍、35倍、30倍、25倍、20倍、15倍、10倍和甚至低于约8倍或2倍。在一个实施方案中，有效量为计算的IC50的约1倍至50倍，有时为计算的IC50的约2倍至40倍，约3倍至30倍或约4倍至20倍。在其它实施方案中，有效量与计算的IC50相同，在某些实施方案中，有效量为超过计算的IC50的量。
有效量可以不超过计算的EC50的100倍。例如，施用的抗-c-Met抗体量低于约100倍，低于约50倍，低于约40倍、35倍、30倍或25倍，并且许多实施方案低于计算的EC50的约20倍，低于约15倍和甚至低于约10倍、9倍、9倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍或1倍。有效量可以为计算的EC50的约1倍至30倍，有时为计算的EC50的约1倍至20倍，或约1倍至10倍。有效量还可以与计算的EC50相同或超过计算的EC50。IC50可通过在体外抑制细胞迁移/侵袭来计算。可通过本领域已知的方法或如下文的实施例中所述进行方法。
剂量和/或给药方案的有效量可凭经验根据测定，根据安全性以及按比例放大(escalation)和剂量范围试验、个别医生-患者关系以及体外和体内测定来容易地测定。
诊断方法
本公开提供了检测受试者的生物样品或从受试者分离的样品中的c-Met(例如，全长或片段)的方法。方法用于诊断和预后目的。主题方法通常包括将包含细胞的样品与本公开的抗体接触；和检测样品中抗体对细胞的结合。细胞可在体外，其中细胞存在于从怀疑具有癌细胞的受试者，正在进行癌症治疗的受试者或待测试其对治疗的易感性的受试者获得的生物样品中。细胞可在体内，例如细胞存在于怀疑具有癌细胞的受试者，正在进行治疗的受试者或待测试其对治疗的易感性的受试者中。
抗体可用于通过免疫诊断技术检测具有或怀疑具有癌性细胞的受试者的生物样品中的表达c-Met的细胞。此类诊断剂可用于鉴定适于下文中随后公开的疗法的患者和/或监测对疗法的反应。
适当的免疫诊断技术包括但不必限定于体外和体内(成像)方法。例如，可以可检测地标记抗-c-Met抗体，将其施用至怀疑具有特征在于c-Met的细胞表面表达的癌症的受试者，使用本领域可获得的成像方法检测结合的可检测地标记的抗体。
如本文中所用，短语“体内成像”是指在整个活哺乳动物中检测抗体(例如可检测地标记的克隆21)的存在的方法。可通过体内成像检测可光学检测的蛋白质例如荧光抗体和缀合有荧光素酶的抗体。荧光蛋白在活动物中的体内成像描述于例如，Hoffman,Cell Death andDifferentiation2002,9:786-789中。体内成像可用于提供哺乳动物的2-D以及3-D图像。电荷耦合器件照相机、CMOS或3D X线断层摄影术(tomographer)可用于进行体内成像。例如，Burdette JE Journal ofMol.Endocrin.,40:253-261,2008综述了利用计算机X线断层摄影术、磁共振成像、超声检查术、正电子发射断层摄影术、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)等。来自许多体内成像法如上述体内成像法的信息可提供关于受试者的癌细胞的信息。
当方法是体外法时，生物样品可以是其中可存在癌细胞的任意样品，包括但不限于血液样品(包括全血、血清等)、组织、完整细胞(例如，未受损的细胞)以及组织或细胞提取物。例如，测定可包括检测活细胞或组织学组织样品中的细胞上的c-Met。
具体地，可评估活细胞的细胞外表面上的检测。例如，可固定(例如，利用***处理)组织样品，将其包埋在支持物中(例如，石蜡中)或冷冻未固定的组织中。
测定可采取多种形式，例如竞争性、直接反应或夹心类型的测定。测定的实例包括Western印迹；凝集测试；酶标记的和介导的免疫测定例如酶联免疫吸附测定(ELISA)；生物素/抗生物素蛋白类型的测定；放射免疫测定；免疫电泳；免疫沉淀等。反应通常包括缀合至抗体的可检测的标记物。标记物包括为荧光、化学发光、放射性、酶促和/或染料分子的标记物，或用于检测样品中的抗原与与其反应的抗体之间的复合物的形成的其它方法。
当使用固体载体时，通常首先将固体载体在适当的结合条件下与固相组分反应，以使抗体被充分固定至载体。有时，至载体的固定可通过首先将抗体偶联至蛋白质来增强，所述蛋白质具有更好的结合性质或将抗体固定在载体上而无显著的抗体结合活性或特异性的损失。适当的偶联蛋白包括但不限于大分子例如血清白蛋白，包括牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白和本领域技术人员公知的其它蛋白质。可用于将抗体结合至载体的其它分子包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物等，前提是用于固定抗体的分子没有不利地影响抗体特异性结合抗原的能力。此类分子和将此类分子偶联至抗体的方法对于本领域技术人员来说是公知的。
可使用ELISA法，其中用主题抗体涂覆微量滴定板的孔。随后将包含或怀疑包含c-Met的生物样品添加至涂覆的孔中。在一段足以允许抗体结合的温育期后，可洗涤板以除去未结合的物质，添加可检测地标记的第二结合分子。使第二结合分子与任何捕获的抗原反应，洗涤板，使用本领域内公知的方法检测第二结合分子的存在或不存在。
当需要时，可使用第二结合剂(包括针对抗体配体的抗体)容易地检测来自生物样品的结合的c-Met的存在或不存在。例如，许多抗-牛免疫球蛋白(Ig)分子在本领域是已知的，可使用本领域技术人员已知的方法将其容易地缀合至可检测的酶标记物例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或尿素酶。随后将适当的酶底物用于产生可检测的信号。在其它相关实施文案中，可使用本领域技术人员已知的方法实施竞争型ELISA技术。
可在溶液中进行测定，以便抗体与抗原在沉淀条件下形成复合物。可在适当的结合条件下将抗体涂覆的颗粒与怀疑包含靶抗原的生物样品接触以提供颗粒-抗体-抗原复合物聚集物的形成，可沉淀所述聚集物，使用洗涤和/或离心将其与样品分离。可使用许多标准方法(例如上述的那些免疫诊断法)的任意方法分析反应混合物以测定抗体-抗原复合物的存在或不存在。
或者，用于活细胞的细胞吸收的测定法可以是阳性地鉴定癌性细胞的另一种诊断技术。由于主题抗体被表达c-Met的细胞特异性内化，因此可使细胞内化抗体，并且洗去(例如，酸洗)不被内化的任何抗体。可通过其标记物(如细胞内包含的)(例如FACS、分光计、放射性同位素计数器等)检测内化的抗体。
本文所述的诊断测定法可用于确定受试者是否患有更加适于或不太适于使用基于抗体的疗法的疗法的癌症，以及监测受试者的治疗的进展。其还可用于评估其它联合治疗的过程。因此，诊断测定法可为临床医生选择疗法和治疗方案提供信息。
可将上述测定试剂(包括本公开的抗体)与适当的说明书和其它必需试剂一起提供于试剂盒中，以进行上述免疫测定。取决于使用的具体免疫测定，试剂盒还可包含适当的标记物和其它包装的试剂和材料(即洗涤缓冲液等)。可使用这类试剂盒进行标准免疫测定例如上述的那些免疫测定。
试剂盒和***
还提供了用于实施上述方法的试剂盒和***。例如，试剂盒和***可包括本文所述的组合物的一种或多种，例如抗-c-Met抗体(例如克隆20或克隆21)、编码所述抗体的核酸(特别地编码上述任意主题抗体的重链和/或轻链的CDR的核酸)、或包含所述核酸的细胞。试剂盒的其它任选组分包括：缓冲液等，以施用主题抗体，和/或以进行诊断测定。试剂盒的重组核酸还可具有限制酶切位点、多克隆位点、引物位点等以帮助它们至核酸的恒定区的连接。试剂的各种组分可存在于单独的容器中或可根据需要，将某些相容性组分预先组合进入单个容器中。
用于实施方法的试剂盒和***可包括一种或多种药物制剂，所述制剂包括本文所述的抗体组合物。这样，试剂盒可包括以一个或多个单位剂量存在的单份药物组合物。试剂盒还可包括两种或更多种单独的药物组合物。
除了上述组分外，试剂盒还包括用于实施方法的说明书。此类说明书可以以多种形式存在于试剂盒中，所述说明书的一种或多种形式可存在于试剂盒中或试剂盒上。其中此类说明书可存在的一种形式是作为关于适当的介质或底物的打印的信息(例如一张或多张在其上打印了信息的纸)存在于试剂盒的包装中或其上，存在于包装说明书(package insert)中等。另一种方式还可以是已在其上记录了信息的计算机可读介质例如软盘、CD等。可存在的另一种方式是网址，可通过因特网使用该网址来访问在移除位点上的信息。任何方便的方式可存在于试剂盒中。
可提供用于治疗患有细胞增殖性疾病的宿主的试剂盒。该试剂盒包括含有对于c-Met是特异性的抗体的药物组合物，和用于在治疗患有癌性病况的宿主(通过抑制受试者的癌细胞生长)的方法中有效使用药物组合物的说明书。此类说明书可以不仅包括适当的操作性质、给药方案和施用方法等，而且还可包括任选地筛选具有c-Met-相关疾病的受试者的说明书。该方面可帮助试剂盒的操作者估计受试者对利用本公开的抗体的治疗的潜在反应性，包括与癌症的类型和生长期相关的治疗的时间安排和持续时间。因此在另一个实施方案中，试剂盒还可包括用于检测癌细胞的细胞外可及表面上的c-Met的表位的抗体或其它试剂。在另一种实施方案中，试剂盒包括包含具有可检测标记物例如荧光团的缀合物的抗体。
如本文中所用，术语"***"是指存在于单份组合物或不同组合物中的本文所述的抗体和一种或多种第二治疗剂的集合，为了实施方法，将所述抗体和第二治疗剂集合在一起。例如，被集合在一起并且给受试者共施用的单独获得的对于c-Met是特异性的抗体和化学疗法剂量形式是根据本公开的***。
提出下列实施例以为本领域技术人员提供如何产生和使用本发明的完整公开内容和描述，所述实施例无意限定被当作本发明的内容的范围。
实验
方法
细胞系和培养。将PC3(***癌)、人肺癌细胞系(包括H1993、H460、H441、A549和CL1-5)在37℃于含有5%CO2的潮湿大气下生长在含有10%FBS(Invitrogen)的RPMI1640中。SAS(口腔癌)、HCT116(结肠癌)、Mahlavu(肝癌)、NPC-TW04(鼻咽癌)(Lee等人(2004)Cancer Res64:8002-8008)、PaCa(胰腺癌)、U2OS(骨肉瘤)和293T生长在具有10%FBS的DMEM上。将A498(肾细胞癌)培养在MEM中。将MDA-MB231(乳腺癌)在10%CO2大气下培养于与50%DMEM混合的F12培养基中。CL1-5由Chu等人(1997)Am J RespirCell Mol Biol17:353-360建立。Mahlavu是来自Dr.Hsiao M(GRC,Academia Sinica,Taiwan)的礼物。其它细胞系获自美国典型培养物保藏中心。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人正常鼻粘膜(NNM)细胞的制备已描述于先前的研究(Lee等人(2007)Cancer Res67:10958-10965；Lee等人(2004)Cancer Res64:8002-8008)中。
噬菌体展示的人天然scFv文库的构建。简而言之，使用Superscript III逆转录酶(Invitrogen)，利用寡聚dT引物从人脾细胞组织的7个单独的样品的mRNA混合物合成cDNA。使用PfuUltra聚合酶(EMD Biosciences)，利用特异性引物通过PCR扩增VH和VL基因(Marks等人,1991)。使用核酸纯化试剂盒(Qiagene)从琼脂糖凝胶分离和纯化PCR产物。利用编码(GGGGS)3氨基酸残基的DNA片段(使用分别在5’(SfiI)和3’(NotI)末端包含特定限制性内切酶位点的引物通过PCR扩增的)装配编码VH和VL基因的区域。利用限制性内切酶SfiIa和NotI(NEB)降解装配的产物，随后将其连接进入pCANTAB-5E噬菌粒载体(GE Healthcare)。将包含人scFv基因的pCANTAB-5E载体电穿孔进入感受态TG1大肠杆菌细胞。在电穿孔后，回收TG1大肠杆菌细胞，在含有100μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的2YT培养基(BD)(2YT-AG)中继续温育。利用M13KO7噬菌体拯救TG1细胞，随后在培养基中产生展示scFv的噬菌体颗粒。
通过文库生物淘选选择噬菌体展示的抗-c-Met scFv。利用蛋白G免疫磁珠(dynabeads)(Invitrogen)选择展示特异性抗-c-Met scFv的噬菌体。将c-Met-Fc重组蛋白(R&D)与蛋白G免疫磁珠在室温(RT)下一起温育1小时。从scFv文库(2×109个成员)扣除蛋白G免疫磁珠中的非特异性结合，随后将所述文库与固定有c-Met-Fc的免疫磁珠在4℃下一起温育1小时。通过用PBST洗涤4次除去未结合的噬菌体。通过在37℃下感染大肠杆菌TG1细胞30分钟来回收结合至c-Met-Fc的噬菌体。将部分感染的细胞进行系列稀释以测定滴度，利用M13KO7辅助噬菌体(NEB)拯救其它细胞。在测定救援噬菌体滴度后，进行下一轮生物淘选。在第四和第五轮生物淘选中，随机选择噬菌体克隆来培养以进行ELISA筛选。
选择的噬菌体克隆对过表达c-Met的293T细胞的结合特异性的 评估。为了进行免疫荧光染色测定，将293T细胞生长在盖玻片上至80%的汇合。按照制造商的说明书使用Lipofectamin2000(Invitrogen)，利用pEF-c-Met表达载体转染细胞。在转染后48小时，在4℃下将细胞与1×1010噬菌体滴度的选择的抗-c-Met噬菌体或对照噬菌体一起温育30分钟。在用PBS洗涤细胞2次后，利用4%多聚甲醛固定它们，利用0.1%TritonX-100进行透化，利用3%BSA进行封闭。利用兔抗-myc抗体(Sigma-Aldrich)和小鼠抗-M13噬菌体抗体探测细胞，随后分别利用罗丹明-标记的山羊抗-兔IgG和FITC-标记的抗-小鼠IgG进行染色。利用DAPI对细胞核进行染色。利用倒置荧光显微镜(Axiovert200M,Zeiss)获得荧光图像。
为了进行流式细胞术分析，将293T细胞生长至80%汇合，利用上述pEF-c-Met表达载体转染细胞。48小时后，利用0.05%胰蛋白酶-EDTA收获转染的细胞，在4℃下将其与1×1010噬菌体滴度的选择的噬菌体或对照噬菌体一起于FACS缓冲液(包含1%胎牛血清的PBS)中温育1小时。在用FACS缓冲液洗涤细胞2次后，我们在4℃将它们与小鼠抗-M13噬菌体Ab一起温育1小时，随后在4℃下温育缀合有R-藻红蛋白的山羊抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)，进行30分钟。使用FACSCantoII(BD)进行分析，利用FACSDiva软件(BD)测量发射荧光强度，以定量比较它们的结合亲和力。
可溶性scFv的表达和纯化。将抗-c-Met scFv噬菌体克隆1、20和21单独地感染至大肠杆菌菌株HB2151，制备细菌的周质提取物。按照制造商的说明书，利用蛋白L琼脂糖柱(Thermo Scientific)纯化周质提取物中的可溶性scFv。利用PBS完全透析纯化的scFv，通过还原SDS-PAGE，然后进行考马斯蓝染色和Western印迹分析(通过用抗-E标签Ab(GE Healthcare)进行探测)分析纯化的scFv。
编码人c-Met基因的哺乳动物表达载体的构建。使用SuperscriptIII逆转录酶，利用特异性引物从HepG2细胞的总RNA合成完整人c-Met cDNA(NM_001127500.1)，随后将其用作PCR模板。利用PfuUltra酶通过PCR扩增编码全长c-Met的DNA，将其与myc-附加表位(tag epitope)pEF载体(Invitrogen)框内连接以产生pEF-c-Met-myc。通过PCR扩增编码c-Met的氨基酸残基1至932和1至567的DNA片段，将其克隆至pEF载体以分别产生pEF-c-MetF932和pEF-c-MetF567。人IgG1Fc的编码区获自人脾细胞cDNA文库，随后将其框内克隆至c-MetF932和c-MetF567的羧基末端以分别产生pEF-c-MetF932-Fc和pEF-c-MetF567-Fc。
c-Met-截短重组蛋白的产生和纯化。从已分别使用Lipofectamin2000和pEF-c-MetF932-Fc或c-MetF567-Fc瞬时转染的293T细胞的培养上清液制备c-MetF932-Fc和c-MetF567-Fc融合蛋白。在转染后72小时，将经过滤的上清液用于1ml蛋白G琼脂糖柱(GE healthcare)。在利用PBS洗涤后，利用0.1M甘氨酸-HCl pH2.8洗脱结合的蛋白质，随后利用1M Tris-HCl pH9.1进行中和。利用PBS完全透析洗脱液，使用Amicon Ultra-4离心过滤器(截断值10kDa；Millipore)进行浓缩。
利用共聚焦显微术观察的抗-c-Met scFv的内化。将H1993、H460和c-Met-敲低H460细胞接种在盖玻片上，并且生长至80%汇合。用抗-c-Met scFv S1或S20在4℃和37℃下温育细胞，进行30分钟。在利用PBS洗涤2次后，利用4%多聚甲醛固定细胞，通过添加3%BSA来进行封闭。利用抗-Flag抗体(Sigma-Aldrich)对细胞进行染色，随后用FITC-标记的山羊抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)和DAPI(Invitrogen)进行探测。利用共聚焦显微术(TCS-SP5,Leica)获得所有荧光图像。
用于产生抗-c-Met scFv20-cys(Ms20)的原核表达载体的构建。通过经由NotI-EcoRI酶降解从pCANTAB-5E取出E标签和pIII DNA片段，通过NotI-EcoRI位点将其***编码FLAG标签、六组氨酸和半胱氨酸残基的合成DNA片段来产生原核表达载体pFHC。通过NcoI-NotI位点将从pCANTAB-5E-S20降解的抗-c-Met S20基因连接至pFHC载体。将构建的载体转化进入大肠杆菌BL21(Novagen)以表达在羧基末端包含六组氨酸和半胱氨酸的scFv。
抗-c-Met scFv20-cys(Ms20)的表达和纯化。将大肠杆菌BL21的单个菌落接种在包含100μg/ml氨苄青霉素(TB-A)的Terrific液体培养基(TB；MDBio,Taiwan)中，在30℃下温育过夜。将1/50体积的过夜培养物的稀释物于30℃下生长在新鲜2.5升TB-A中，直至达到0.5的OD600。通过添加IPTG至0.4mM的终浓度和通过将0.4M蔗糖直接溶解在TB-A中来开始诱导。将培养物以250rpm在振荡下，于30℃下继续培养16小时。
通过以20,000×g离心30分钟除去上清液，随后将细菌沉淀重悬浮于冷的200ml TES缓冲液(10mM Tris,20%蔗糖和1mM EDTA pH8.0；EMD Biosciences)，在温和搅拌的条件下将其在4℃温育1小时。通过以22,000×g离心30分钟收集渗透冲击级分(osmotic shockfraction)。通过在温和搅拌的条件下将沉淀于冰冷的5mM MgSO4中温育1小时来获得周质提取物。
将渗透冲击级分与周质提取物组合以获得Ms20的最大回收，向组合样品中添加NaCl至0.5M的终浓度，添加咪唑至0.5mM的终浓度。用15ml结合缓冲液(20mM Tris,0.5M NaCl和5mM咪唑pH7.9)平衡5ml的Ni+-NTA琼脂糖柱(GE Healthcare)，随后加载样品。用洗脱缓冲液(20mM Tris,0.5M NaCl和1M咪唑pH7.9)洗脱结合的Ms20。将洗脱液在4℃针对PBS充分进行透析，进行两次交换。分析后，利用蛋白A琼脂糖柱(2ml)(GE Healthcare)再纯化样品。将再纯化的Ms20针对HEPES缓冲液(20mM HEPES,150mM NaCl和1mMEDTA,pH7.0)进行透析，进行两次交换，随后利用具有10kDa-截断值的管(Amicon Ultra,Millipore)进行浓缩。
结合动力学的测量。在BIAcore X(GE healthcare)中利用SRP测量抗-c-Met scFv的亲和力和动力学。在BIAcore流动池(flowcell)中，按照制造商的指导，将30μg/ml的c-MetF932-Fc蛋白偶联至EDC-和NHS-活化的CM5传感器芯片，随后用乙醇胺进行封闭。使用从5nM变化至200nM的scFv浓度在30μl/分钟的连续流动下，分别监测结合相和离解相3和5分钟。通过注射再生缓冲液(0.2M NaCl,10mM甘氨酸,pH2.7)进行再生。为了测定结合常数，使用BIAevaluation软件(GE healthcare)将传感图与样品1:1互动模型进行全局拟合。
竞争性结合测定。为了监测scFv的抑制作用，我们将c-MetF932-Fc蛋白涂覆在96孔板上，用3%的PBS中的BSA阻断非特异性结合剂。将1nM人HGF(R&D)+不同浓度的抗-c-Met scFv或正常小鼠IgG用于小孔。在HRP-标记的小鼠抗-山羊IgG(Jackson ImmunoResearch)和OPD底物(Sigma)+H2O2的温育后，使用山羊抗-人HGF(R&D)测定结合至c-Met的HGF的量。使用微量滴定板读数器在490nm处测量吸光度。利用下列公式：[(在无竞争剂的情况下结合的HGF的吸光度)-(在竞争剂存在的情况下结合的HGF的吸光度)]/(在无竞争剂的情况下结合的HGF的吸光度)×100%计算抑制百分数。
Ms20-靶向脂质体多柔比星(Ms20-LD)的构建。为了确保纯化的Ms20具有还原的巯基以用于缀合，我们处理2mM TCEP(三(2-羧乙基)膦；Sigma-Aldrich)以在N2气氛下于室温还原Ms20的分子间二硫键2小时。利用用HEPES缓冲液洗脱的HiTrap G-25柱(GE healthcare)对还原的Ms20进行脱盐。马来酰亚胺-羧基聚乙二醇(Mr2,000)-衍生的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(马来酰亚胺-PEG-DSPE；NOF Corporation,Japan)至PEG化的脂质体多柔比星(Lee等人,2004；Lo等人,2008)的掺入如下进行了描述。将马来酰亚胺-PEG-DSPE溶解在HEPES缓冲液中，将其添加至浓度为0.5摩尔%的脂质体磷脂的LD中，在轻轻振荡下将混合物在60℃温育1小时。将还原的Ms20与用于缀合的马来酰亚胺-PEG-DSPE-***LD一起在4℃下温育过夜，以在一个脂质体上产生约60个Ms20分子。在使用2-巯基乙醇(2mM的终浓度)灭活所有未反应的马来酰亚胺基团后，我们使用琼脂糖4B(GEhealthcare)凝胶过滤层析来除去释放的游离药物、未缀合的scFv和未掺入的缀合物。使用分光光度计(Spectra Max M5,Molecular Devices)在λEx/Em=485/590nm下测量洗脱液级分中的多柔比星浓度。通过还原SDS-PAGE分离Ms20-LD级分，随后用硝酸银缀合效率染色以评估缀合效率。
结合人肺癌细胞的Ms20-LD的鉴定。将细胞生长在12孔板上至90%汇合。用LD或Ms20-LD(0.625-10μg/ml多柔比星)的系列稀释物在4℃下温育铺板的细胞进行1小时。温育后，用PBS洗涤细胞，随后用200μl1%Triton X-100裂解细胞。为了提取多柔比星，将300μlIPA(0.75N的异丙醇中的HCl)添加至裂解物，振荡30分钟。在将裂解物以12,000rpm离心5分钟后，利用分光光度计在λEx/Em=485/590nm测量上清液的多柔比星。使用标准曲线通过外推计算多柔比星的浓度。
人癌细胞对Ms20-LD的吸收。将肿瘤细胞在12孔板上生长至90%汇合，添加2.5μg/ml的完全培养基中的Ms20-LD或LD，在37℃下继续温育，进行指定的时间。在用PBS洗涤细胞后，利用0.1M甘氨酸pH2.8除去细胞表面上的Ms20-LD和LD，进行10分钟。如上所述检测被细胞吸收的多柔比星的量。
Ms20-LD的细胞吸收的共聚焦显微术分析。将H1993细胞在盖玻片上生长至近汇合(subconfluency)。将细胞在37℃下于含有2.5μg/ml的Ms20-LD或LD的完全培养基中温育不同的时间。在用PBS洗涤2次后，用4%的多聚甲醛固定细胞，通过添加3%BSA进行封闭。分别用缀合有Alexa Fluor647的小麦胚凝集素(Invitrogen)和DAPI(Invitrogen)对细胞膜和细胞核进行染色。利用荧光在λEx/Em=485/590nm检测细胞内多柔比星。利用激光扫描共聚焦显微术(TCS-SP5,Leica)获得所有荧光图像，使用LAS AF软件(Leica)分析图像。
细胞活力测定。将细胞以3,000/孔接种在96孔板中，在37℃下用不同浓度(0-20μg/ml)的培养基(10%FBS)中的MS20-LD或LD温育细胞，进行24小时。在除去过量药物后，用PBS洗涤细胞1次，在37℃下利用培养继续温育48小时。利用MTT(Invitrogen)测定检测细胞活力。在37℃下利用含有0.1mg/ml MTT的培养基温育细胞，进行2.5小时。随后将甲臜晶体溶解在DMSO(Sigma-Aldrich)中，使用微量滴定板读数器(Model680,BioRad)于540nm测量吸光度。每一个测定重复3次。数据表示为与未处理的对照细胞的活细胞相比较活细胞的百分数。
体外细胞凋亡研究。将H1993细胞接种在24孔板上，使其附着过夜，随后分别用2.5μg/ml的含有10%FBS的RPMI1640中的Ms20-LD或LD培养细胞。在用药物温育24、48和72小时后，将细胞收获在裂解缓冲液(Cell Signaling)中，将其经历Western印迹分析。使用下列抗体：兔抗-裂解天冬氨酸蛋白水解酶9(Asp315)、兔抗-裂解天冬氨酸蛋白水解酶3(Asp175)、兔抗-PARP(全部购自CellSignaling)和小鼠抗-α-微管蛋白(Sigma-Aldrich)。使用BioSpectrum600成像***(UVP)检测化学发光信号，利用VisionWorksLS软件(UVP)进行定量。
缀合有scFv的量子点(QD)的合成。将Qdot705和Qdot800ITK氨基PEG量子点(Invitrogen)分别用于体外细胞结合和体内成像的研究。用于合成缀合有配体的QD的方法是从先前的报导(Cai和Chen(2008)Nat Protoc3:89-96)改进而来的。简而言之，利用磺基-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯；Pierce)缀合QD以在QD上产生马来酰亚胺活化的表面，利用NAP-10脱盐柱(GE healthcare)除去游离磺基-SMCC。利用TCEP还原Ms20以在羧基端产生活化的巯基，随后在4℃用马来酰亚胺功能化的QD温育过夜。使用琼脂糖4B凝胶过滤层析纯化缀合有Ms20的QD，利用HEPES缓冲液进行洗脱。利用分光光度计检查QD的浓度，使用标准曲线通过外推计算所述浓度。
人肿瘤异种移植物的体内荧光成像。用2×106个H1993细胞皮下植入6只12周龄的SCID雄性小鼠。当肿瘤的尺寸达到约300mm3时，将小鼠随机分成2组(每一组3只小鼠)，分别用400皮摩尔的Ms20-QD或QD进行静脉内注射。虽然小鼠处于异氟烷麻醉下，但在指定的时间上使用Xenogen IVIS200成像***(激发：525/50nm；发射：832/65nm)获得荧光图像。在成像期结束时，通过颈脱位法处死小鼠。将器官和肿瘤从小鼠切离，随后经历荧光成像。为了定量比较Ms20-QD的肿瘤积累与QD的积累，可通过使用Living image软件(Xenogen)扣除本底来计算荧光强度。
体内噬菌体靶向测定的动物模型。利用5×106个肺癌细胞皮下注射6只SCID小鼠(6周龄)。当肿瘤达到约300mm3时，将小鼠随机分成2组(每一组3只小鼠)，利用2×109个菌落形成单位(cfu)的抗-c-Met scFv噬菌体克隆20或对照噬菌体静脉内注射小鼠。在利用50ml PBS输注后，取出器官和肿瘤组织，用冷PBS洗涤并称重。通过生长TG1来回收结合至肿瘤组织的噬菌体，测量洗脱的噬菌体的滴度。
使用Super Sensitive Polymer-HRP IHC检测***(BioGenex)通过免疫组织化学评估靶向噬菌体在具有人肿瘤的小鼠中的组织分布。利用小鼠抗-M13Ab对石蜡包埋的组织样品进行染色，随后用Super增强试剂和聚合物辣根过氧化物酶标记的抗-小鼠IgG进行温育。在用PBST(0.1%的PBS中的Tween20)洗涤后，将切片浸没在3,3’-二氨基-联苯胺(DAB)溶液+0.01%H2O2中，随后用PBST洗涤。利用苏木精对组织切片进行复染色，使用50%的PBS中的甘油进行封片，使用正置显微镜(Axioplan2Imaging MOT,Zeiss)进行检查。动物养护遵照Academia Sinica,Taipei,Taiwan的指导方针。
用于测量scFv-靶向疗法产生的抗肿瘤功效的动物模型。以4mg/kg的总多柔比星剂量(1mg/kg，每周一次)在尾静脉给具有H460来源的肺癌异种移植物(～75mm3)的SCID小鼠静脉内注射Ms20-LD、LD或等体积的PBS。每周2次利用测径器测量肿瘤，常规地观察小鼠的体重减轻(作为药物毒性的症状)。按照该式：长×(宽)2×0.52计算肿瘤体积。
末端脱氧核糖核苷转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL) 测定。从被处理的小鼠取出肿瘤，利用液氮中的O.C.T化合物(Tissue-Tek)包埋肿瘤。制备冷冻的肿瘤组织切片，按照制造商的说明书(Roche Diagnostics)利用TUNEL试剂处理切片，利用DAPI进行复染色。使用TissueFAXS System显微术(TissueGnostics)扫描整个切片。通过将DAPI设置为用于鉴定所有细胞的主通道，利用MetaMorph软件(Molecular Devices)定量细胞的反应性。
肿瘤血管染色。从冷冻的肿瘤组织制备切片。用1%的多聚甲醛固定切片，用PBS进行洗涤，在正常马血清(Vector Laboratories)中进行封闭，随后用大鼠抗-小鼠CD31(BD)进行温育。在用含有0.1%Tween20的PBS洗涤后，用缀合有Alexa Fluor594的抗-大鼠IgG(Invitrogen)浸渍切片。利用TissueFAXS System显微术扫描切片，使用MetaMorph分析荧光图像。
实施例1
结合c-Met的噬菌体展示scFv的鉴定
为了选择结合c-Met的scFv，构建包含2×109个成员的噬菌体展示人天然scFv文库。首先在选择结合c-Met的噬菌体之前，利用缀合有c-Met的免疫磁珠从文库取出结合免疫磁珠的噬菌体。在5轮亲和选择后，第5轮的噬菌体回收已增加至第一轮的噬菌体回收的约1000倍(图1，图框A)。随机选择59个噬菌体克隆，利用ELISA测试其c-Met结合。发现14个噬菌体克隆具有优良的对c-Met-Fc蛋白的结合活性(A490>0.2)。对照噬菌体(Con-P)用作阴性对照。鉴定了特异性结合至c-Met但不结合至VEGFR2和BSA对照蛋白质的16个克隆(图1，图框B)。通过对所有16个单个克隆进行测序，鉴定了3个独特的抗-c-Met噬菌体克隆(PC1、PC20和PC21)。参见下面的表1。
表1.抗-c-Met scFvs的VH和VL结构域的氨基酸序列
VH和VL结构域的互补决定区1-3(CDR1-3)和构架区1-4(FW1-4)示于上表中。利用VBASE2数据库(www.vbase2.org)对V结构域家族进行比对。
为了检查3个噬菌体克隆的特异性和结合亲和力，进行使用相同噬菌体滴度的比较ELISA。PC1具有比PC20或PC21更强的结合c-Met的亲和力(图1，图框C)。使用异位表达人c-Met的293T细胞，利用流式细胞术和免疫荧光测定评估3个克隆的对细胞表面c-Met的结合。将噬菌体颗粒与过表达c-Met的293T细胞一起温育，随后利用抗-M13和抗-myc抗体分别检测噬菌体颗粒和外源c-Met。图1中的代表性图像，图框E举例说明了与c-Met-myc共定位的抗-c-Met噬菌体，这表示它们对于细胞表达的c-Met的结合特异性。所有3个克隆都结合具有过表达的c-Met的293T细胞，但不结合293T细胞(图1，图框D和E)。然而，类似地，PC1对于细胞c-Met的结合能力高于PC20和PC21的所述能力。随后，为了研究抗-c-Met scFv的动力学常数，产生c-Met932-Fc重组蛋白以及称为S1、S20和S21(分别对应于PC1、PC20和PC21)的可溶性抗-c-Met scFv。利用蛋白G琼脂糖柱从异位表达c-Met932-Fc的293T细胞的培养基纯化可溶性c-Met932-Fc蛋白(图8)。利用蛋白L琼脂糖层析从噬菌体感染的大肠杆菌HB2151的周质提取物纯化可溶性抗-c-Met scFv，随后通过考马斯蓝染色进行评估，显示纯化的抗-c-Met scFv蛋白(S1、S20和S21)位于30kDa(对应于蛋白质分子量标记)的附近(图8的上图框，图框B)。
利用表面等离子体共振技术(SPR)测量每一种可溶性scFv对于c-Met932-Fc蛋白的结合动力学常数(Kon和Koff)和亲和力。每一种可溶性scFv对于c-Met932-Fc蛋白的Kd值的范围为6.82至14.9nM。参见下面表2。
表2.抗-c-Met scFv的动力学常数和结合亲和力
使用纯化的scFv，在BIAcore通过SRP测量Kon和Koff，利用BIAevaluation软件计算Kd。
实施例2
结合至人癌症和VEGF刺激的内皮细胞的抗-c-Met scFv
利用ELISA在癌细胞中分析抗-c-Met scFv对内源c-Met的结合活性(图9，图框A)。与对照抗体相比较，发现抗-c-Met S1和S20结合几种类型的人癌细胞系，包括SKOV3、Mahlavu、SAS、PC3、MDA-MB-231、HCT116、Paca-2、NPC-TW04、H1993细胞。然而，scFv不与A498、U2OS和NNM细胞反应。正常小鼠IgG用作对照抗体。进行FACS分析以验证两种抗-c-Met scFv也结合VEGF刺激的HUVEC。将抗-CD31抗体和对照scFv分别用作阳性和阴性对照(图9，图框B)。
为了进一步确认抗-c-Met scFv可特异性结合人癌细胞上的内源c-Met，利用抗-c-Met scFv(S1或S20)对H460细胞和c-Met敲低H460细胞进行染色，进行FACS分析(图10，图框B)。两种scFv能够结合H460细胞，但scFv的结合活性在c-Met敲低H460细胞中急剧下降。β-微管蛋白用作阴性对照并且*bkg是指图10，图框A中的本底信号。
实施例3
抗-c-Met scFv与HGF竞争对癌细胞的结合
为了测试3种抗-c-Met scFv是否可抑制HGF对c-Met的结合，选择人肺癌细胞系H1993来进行竞争性ELISA(Lutterbach B等人(2007)Cancer Res67:2081-2088)。对照噬菌体(Con-P)在相同的条件下不影响结合。在无竞争剂存在的情况下HGF对H1993细胞的结合被认为是100%。已知H1993表达高水平的c-Met。当在噬菌体克隆存在的情况下用HGF温育H1993细胞时，抗-c-Met scFv PC1使HGF至H1993细胞的结合减少超过90%。PC20抑制超过50%的HGF对c-Met的结合(图2，图框A)。还测试不同浓度的可溶性scFv对HGF的竞争性抑制。正常小鼠IgG(NMIgG)用作阴性对照。在无竞争剂存在的情况下HGF对固定的c-Met蛋白的结合被认为是100%。如图2，图框B中所示，S1和S20以剂量依赖性的方式抑制HGF对c-Met的结合活性，但S21仅产生轻微的抑制。对于S1和S20，HGF对c-Met的结合的IC50分别为27.4nM和249.5nM(图2，图框B)。
因此，研究位于c-Met的HGF结合结构域内的抗-c-Met scFv的结合表位。检查抗-c-Met scFv对c-Met932-Fc蛋白(包括c-Met的整个细胞外结构域)和c-Met567-Fc蛋白(包括Sema和PSI结构域，所述两个结构域已被定义为HGF结合区(图2，图框C))的结合能力。将c-Met重组蛋白固定在滴定孔上，用抗-c-Met scFv进行温育。将抗-c-Met多克隆抗体和抗-E标签抗体分别用作阳性和阴性对照。如图2，图框D中所示，S21，与其对于c-Met932-Fc的结合活性相比较，显著地降低其对于c-Met567-Fc的结合活性。S1对于c-Met932-Fc的结合强度与对于c-Met567-Fc的结合强度相似。S20与c-Met567-Fc结合的效率不如与c-Met932-Fc结合的效率。这些结果表明S1和S20的结合表位位于c-Met的HGF结合区中，然而S21通过Ig-样结构域(图2，图框D)识别c-Met。
由于抗-c-Met scFv S1提供了优异的竞争能力，因此检查S1是否可拮抗HGF以激活癌细胞的c-Met。用HGF和S1在37℃下共处理A549细胞15分钟。使用抗-酪氨酸-磷酸化c-Met抗体和针对c-Metβ-链(c-Met)的抗体，将总的细胞裂解物经历Western印迹。磷酸化c-Met的定量基于发光强度，利用总c-Met对定量进行标准化。HGF-诱导的c-Met磷酸化被S1抑制，相对于无S1处理的癌细胞，抑制了65.7%的c-Met磷酸化(图2，图框E)。
实施例4
使用共聚焦显微术检查抗-c-Met scFv内化
抗体的内化能力对于抗体介导的脂质体药物的开发是至关重要的(Sapra和Allen(2002)Cancer Res62:7190-7194)。在H1993细胞中，在37℃下进行抗-c-Met scFv S1和S20的内化研究。利用抗-E标签抗体检测scFv，随后在固定和透化细胞后，用FITC-标记的第二抗体进行温育。用DAPI对细胞核进行染色。共聚焦显微术显示scFv在4℃下结合细胞膜(图3A，a和b)，并且内化scFv在37℃下在细胞质内发射荧光信号(图3，图框A；c和d)。S20处理的H1993细胞中的荧光信号的量高于S1处理的细胞，这表明S20的内化能力优于S1的内化能力。在低倍放大倍数下，在大多数癌细胞中观察到内化S20(图3，图框A；e)。
此外，为了验证S20的吸收是否依赖于细胞表面上的c-Met表达，在H460和c-Met敲低H460细胞中进行内化实验。共聚焦显微术显示H460细胞的细胞质中存在S20荧光信号(图3，图框B；a和b)，但在c-Met敲低H460细胞中不存在所述信号(图3，图框B；c)。这些结果表明抗-c-Met scFv S20在表达c-Met的癌细胞中显示特异性内化。这样，其可用于开发抗体介导的细胞内药物递送。
实施例5
缀合有Ms20的纳米颗粒增强药物结合、细胞内递送和细胞毒性
为了研究S20是否可促进脂质体药物至表达c-Met的肿瘤细胞内的递送，产生编码与C末端上的半胱氨酸融合的S20基因的细菌表达载体，随后产生该S20-半胱氨酸融合蛋白，其在本文中被称为Ms20(图11，图框A和B)。将定向缀合Ms20通过其c末端半胱氨酸特异性偶联至包含多柔比星的脂质体的外表面上的马来酰亚胺修饰的PEG链，从而产生缀合有Ms20的脂质体多柔比星(Ms20-LD)(图11，图框C和D)。
为了阐明缀合有Ms20的脂质体是否可增加药物至癌细胞内的递送，在37℃下用Ms20-LD和LD处理几种人肺癌细胞系。在酸性甘氨酸缓冲液(其除去表面结合的脂质体药物)洗涤后，定量内化的多柔比星。利用Ms20-LD的处理在H1993、H441和A549细胞中显著提高多柔比星的细胞吸收，但在H520和CL1-5细胞中无显著改变(图4，图框A)。为了进一步验证Ms20-LD吸收对细胞c-Met表达的依赖性，使用Ms20标记的量子点(Ms20-QD)，利用流式细胞术比较各自细胞系上的相对c-Met表达(图4，图框B)。有趣地，发现H520和CL1-5细胞仅表达最少量的c-Met(图4，图框B)，这对应于它们极少的Ms20-LD吸收(图4，图框A)。该发现表明肿瘤细胞对Ms20-LD的吸收依赖于细胞表面上的c-Met表达水平。
为了验证Ms20的确能够提高肿瘤细胞上的LD的结合效率，在4℃下分别用不同浓度的Ms20-LD和非靶向LD(LD)温育H1993细胞，进行1小时。在裂解细胞后，通过荧光定量脂质体药物的结合活性。与LD相比较，取决于药物浓度，Ms20-LD对H1993细胞的结合被显著地增加至13至26倍(图4，图框C)。在相同的实验条件下对于H460细胞观察到相似的结果。为了确认Ms20增强药物至癌细胞的细胞内递送，在逝去的时间点上用Ms20-LD和LD温育H1993细胞。在表面剥离未内化的脂质体药物后，测量细胞内多柔比星的吸收。在每一个时间点上与非缀合的LD相比较，Ms20显著增强药物至癌细胞的递送(图4，图框D)。
为了进一步评估Ms20是否可增强LD的细胞毒性，使用MTT测定在人肺癌细胞上研究Ms20-LD的细胞毒性效应(图5，图框A)。将细胞活力计算为活细胞的百分数。红色虚线表示平均50%的活力。每一个点表示4个实验的平均值。与LD相比较，Ms20-LD显著增强药物对癌细胞的细胞毒性，并且在H1993和H441细胞中使半数最大抑制浓度(IC50)减少6倍(图5，图框B)。Ms20-LD处理的H1993细胞还增强了细胞凋亡标志例如裂解PARP(cleavage PARP)、裂解天冬氨酸蛋白水解酶(cleavage caspase)9和裂解天冬氨酸蛋白水解酶3的表达(图5，图C)。探测作为上样对照的α-微管蛋白。将光密度测定法用于估计与未处理的细胞相比较裂解PARP的倍数增加，利用α-微管蛋白(最下方)进行标准化。
实施例6
抗-c-Met scFv的体内肿瘤导向和成像
为了在研究抗-c-Met scFv在体内的肿瘤导向能力，用抗-c-MetscFv PC20或对照噬菌体静脉内注射具有H460来源的肺肿瘤异种移植物的小鼠。从肿瘤回收的PC20的滴度高于从内脏器官回收的PC20的滴度。进行2次实验，获得相同的结果。在输注后，从肿瘤团块和正常器官回收结合噬菌体，并且测定结合噬菌体。结果显示抗-c-MetscFv PC20导向肿瘤的效率远高于导向正常器官的效率(图6，图框A)。对照噬菌体没有这样的导向能力。此外，通过使用抗-噬菌体抗体对组织切片进行免疫染色来检查抗-c-Met scFv PC20的组织分布。发现PC20噬菌体选择性定位在肿瘤组织中而非也来源于PC20处理的小鼠的正常器官组织例如脑、肺和心脏中，然而在肿瘤和正常器官组织中未检测到对照噬菌体(图6，图框B)。
为了测试抗-c-Met scFv S20是否可用于肿瘤成像测定，将缀合有Ms20的量子点(Ms20-QD)或未缀合的量子点(QD)注射入具有H1993来源的肺肿瘤异种移植物的小鼠。在注射后6小时，在Ms20-QD处理的小鼠的肿瘤组织中观察到的近红外线(NIR)荧光信号强度增加至QD处理的小鼠的5.2倍(图6，图框C)。在注射后24小时，处死小鼠，解剖以观察Ms20-QD的组织分布。代表性图像是3个独立实验的结果。如图6，图框D中所示，与在正常器官中相反，Ms20-QD大量地和选择性地在肿瘤中积累。Ms20-QD靶向肿瘤的效率是QD的5.4倍。这些结果表明抗-c-Met scFv适用于肿瘤成像。
实施例7
Ms20-LD在人肺癌异种移植物中的治疗效果
为了评价Ms20是否可提高抗癌药物的化学治疗功效，通过将Ms20与PEG化的脂质体多柔比星(Ms20-LD)偶联来制备靶向药物递送***。以4mg/kg的总多柔比星剂量(1mg/kg，以每周一次的间隔)给具有H460异种移植物(～75mm3)的SCID小鼠静脉内注射脂质体药物。给具有H460来源的肺癌的小鼠施用Ms20-LD、LD和PBS。LD组和对照PBS组中的小鼠的肿瘤尺寸分别为Ms20-LD组的1.9和4.4倍(n=8)**,P<0.01。图表中的点代表平均肿瘤体积。发现施用了Ms20-LD的小鼠的肿瘤的体积比仅施用LD的小鼠的肿瘤的体积小(P<0.01)(图7，图框A)。到第25天，LD组的肿瘤尺寸逐渐增加至Ms20-LD组的肿瘤尺寸的1.9倍。在处理期中，Ms20-LD和LD组在体重上没有显著的变化(图7，图框B)。处理结束时，与用LD处理的小鼠中的0.73g和利用PBS缓冲液处理的小鼠中的1.8g相比较，利用Ms20-LD处理的小鼠的终平均肿瘤重量为0.31g(图7，图框C和D)。因此，Ms20-LD组中的肿瘤重量低于LD组中的肿瘤重量(n=8)*,P<0.05。此外，利用抗-CD31抗体(以检测肿瘤血管)和末端脱氧核糖核苷转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定(以鉴定凋亡细胞)来检查每一组中的肿瘤组织。使用自动细胞获取仪(TissueGnostics)来分析切片，使用MetaMorph软件(Molecular Devices)定量CD31阳性和TUNEL阳性区域。如图7中所示，Ms20-LD处理的组的CD31阳性区域与LD处理的组相比较减小更多。因此，Ms20-LD组中CD31阳性内皮的量比LD组的低。Ms20-LD处理的组的凋亡细胞的数目为LD处理的组的2倍(图7，图框F)。

Claims (16)

1.一种分离的克隆20所示c-Met抗体，其特征在于：所述的抗体的重链可变区(VH)的互补决定区1-3(CDR1-3)如SEQ ID NOS：14、16及25的氨基酸序列所示，以及所述的抗体的轻链可变区(VL)的互补决定区1-3(CDR1-3)如SEQ ID NOS：35、37及46的氨基酸序列所示。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体，当结合活哺乳动物细胞表面上的c-Met时，其被细胞内吞。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其中所述抗体为单链Fv(scFv)、IgG、Fab、(Fab’)2或(scFv’)2。
4.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其中所述抗体被标记。
5.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其中所述抗体被缀合至抗癌剂。
6.一种包含表面和内部空间的脂质纳米颗粒，所述内部空间包含抗癌剂，其中将根据权利要求1或2所述的分离的抗体连接至所述脂质纳米颗粒的表面。
7.根据权利要求6所述的脂质纳米颗粒，其中将所述脂质纳米颗粒与表达细胞表面c-Met的细胞接触，所述抗体结合所述细胞表面c-Met并且所述脂质纳米颗粒被内吞。
8.一种组合物，其包含：
药学上可接受的载体；和
根据权利要求1或2所述的分离的抗体或根据权利要求6或权利要求7所述的脂质纳米颗粒。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中配制所述组合物以用于胃肠外施用。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中配制所述组合物以用于静脉内、硬膜内或心室内施用。
11.根据权利要求1所述的抗体或根据权利要求6或权利要求7所述的脂质纳米颗粒在制备治疗肺癌的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其中所述抗体被内化进入肺癌细胞。
13.根据权利要求1所述的抗体在制备用于检测癌细胞的试剂中的应用，其中所述癌细胞为卵巢癌细胞、肝癌细胞、口腔癌细胞、***癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、鼻咽癌细胞或肺癌细胞。
14.一种分离的核酸，所述核酸为编码如权利要求1或2所述的抗体的氨基酸序列的核苷酸序列。
15.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求14所述的核酸。
16.一种试剂盒，其包括根据权利要求8所述的组合物。
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