JP2015527869A - タンデムＦｃ二重特異性抗体 - Google Patents

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Abstract

本願は、タンデムＦｃｓ及びタンデムＦｃ抗体（「ＴＦｃＡ」）、例えば、１つ以上の細胞表面受容体に特異的に結合する１つ又は少なくとも２つの結合部を備えるタンデムＦｃ二重特異性抗体（「ＴＦｃＢＡ」）を提供する。これら結合部同士は、ＴＦｃを介して接続され、このＴＦｃは、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域を備え、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、ＴＦｃリンカーを介して結合され、隣接するポリペチドを生成し、二量化してＦｃダイマーを生成する。例示的なＴＦｃＢＡｓでは、ＴＦｃＢＡの結合部が特異的な細胞表面受容体を介しての信号伝達を抑止する。

Description

関連出願
本願は、２０１１年８月２６出願の米国仮特許出願第６１／５２７，８０２号に対する優先権を主張する。許容される箇所において、いかなるすべての目的のために、前述の出願は、各々その全体が参照により援用される。
腫瘍細胞が細胞の増殖を刺激する増殖因子及びサイトカインの受容体を発現すること、更にこのような受容体に対する抗体が、腫瘍細胞の増殖を抑制するために、増殖因子及びサイトカインにより仲介される細胞増殖の刺激をブロックする上で有効であり得ることが確認されている。癌細胞上の受容体を標的とする市販の治療用抗体としては、例えば、ＨＥＲ２受容体（ＥｒｂＢ２としても知られる）を標的とする、乳癌の治療用のトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、及び上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１又はＥｒｂＢ１としても知られる）を標的とする、結腸直腸癌及び頭頚部癌の治療用のセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））が挙げられる。
単一の治療的モノクローナル抗体を含む治療剤を投与するこのアプローチ（別の治療的抗体の投与がなく投与される場合、本明細書では単独療法と呼ばれる）は、癌治療においてかなりの成功を示したが、このような治療の失敗及び初回阻害後の腫瘍増殖の再発につながる可能性がある多数の要因がある。例えば、特定の腫瘍は、細胞増殖のために複数の増殖因子に仲介されるシグナル伝達経路に依存し、したがって、単一の経路の標的化は、腫瘍細胞増殖に大きな影響を与えるのに不十分であることを示す場合がある。或いは、１つの経路が唯一又は主な増殖刺激経路である場合であっても、特定の腫瘍細胞は、抗体によって元々のシグナル伝達経路がブロックされる場合、増殖刺激のための別のシグナル伝達経路を活性化することができる（治療に対する固有の抵抗性）。なお更に、一部の腫瘍は、抗体単独療法に初期反応性を示すが、その後別のシグナル伝達経路の使用に切り替えることによって、治療への抵抗性を発現する（治療に対する獲得された抵抗性）。
したがって、癌治療への更なる治療的アプローチが、抗体単独療法の限界を克服するために、並びに他の有益性を提供するために必要である。
本明細書において、タンデムＦｃ抗体（「ＴＦｃＡ」）などの改変抗体が提供される。例示的なＴＦｃＡはタンデムＦｃ二重特異性抗体（ＴＦｃＢＡ）である。ＴＦｃＢＡは、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域とを含むポリペプチド部分であるタンデムＦｃを含み、該第１のＦｃ領域及と第２のＦｃ領域のそれぞれは、Ｃ末端とＮ末端とを有し、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域は、Ｃ末端とＮ末端とを有するＴＦｃリンカーを通して単一のポリペプチド鎖として連結され（すなわち、第１のＦｃ領域のＣ末端が、ペプチド結合によってＴＦｃリンカーのＮ末端に連結され、このＴＦｃリンカーのＣ末端が、今度はペプチド結合によって第２のＦｃ領域のＮ末端に結合される）。ＴＦｃＢＡは、少なくとも２つの結合部位（少なくとも第１の結合部位と第２の結合部位）を含むことができる。各々のこのような結合部位は、細胞表面受容体の特定部分に特異的に結合する。例示的な細胞表面受容体は、癌細胞によって発現される又は過発現されるものである。例示的な結合部位としては、細胞表面受容体の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する抗体由来の結合部位が挙げられる。ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの第１又は第２の結合部位は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３（例えば、米国特許第７，８４６，４４０号に記載される結合部位）、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（α及びβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ及びＥｐｈＡ２からなる群から選択されるヒト受容体タンパク質に特異的に結合することができる。典型的には、このような結合は受容体タンパク質の細胞外部分に特異的であるだろう。本明細書で開示する特定の実施形態では、ＴＦｃＢＡに含まれる少なくとも２つの結合部位の１つは、ｃ−Ｍｅｔ、例えば抗−ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂ又は抗−ｃＭｅｔ ｓｃＦｖに特異的な結合部位である。特定の例示された実施形態では、ＴＦｃＢＡは、単一の抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位と、ｃ−Ｍｅｔに結合しない少なくとも１つの第２の結合部位、例えば、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１〜４、ＰＤＧＦＲ（α及びβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ及びＥｐｈＡ２に特異的な結合部位とを含むように提供され、抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位と第２の結合部位は、ＴＦｃを通して連結され、切れ目がなく連続するポリペプチドを形成する。ＴＦｃＢＡは、単一の受容体上２つのエピトープ（例えば、細胞外エピトープ）に、又は２つの別個の細胞表面受容体に結合し、このような結合時に、これが、ＴＦｃＢＡが結合する少なくとも１つの細胞表面受容体の認識リガンドによって通常の場合刺激されるシグナル伝達を強力に抑制するように提供される。例えば、抗−ｃ−Ｍｅｔ＋抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡは、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子、Ｃ−ｍｅｔの認識リガンド）及びＥＧＦ（上皮細胞増殖因子、ＥＧＦＲの認識リガンド）のいずれか又は両方によって誘起されるシグナル伝達を抑制することができ、又は抗−ｃ−Ｋｉｔ＋抗−ＲＯＮ ＴＦｃＢＡは、マクロファージ刺激タンパク質（ＲＯＮの認識リガンド）及び幹細胞因子（ｃ−Ｋｉｔの認識リガンド）のいずれか又は両方によって誘起されるシグナル伝達を抑制することができ、もしくは抗−ｃ−Ｍｅｔ＋抗−ＥＰＣＡＭ ＴＦｃＢＡは、ＨＧＦによって誘起されるシグナル伝達を抑制することができ、それぞれのこのような抑制は、ＴＦｃＢＡによって抑制されるシグナル伝達である受容体のリガンド誘導リン酸化の抑制により示されるような、１０ｎＭ以下又は１ｎＭ以下又は１００ｐＭ以下のＩＣ５０であるか、少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％の最大抑制パーセントである。特定の実施形態では、細胞中のＴＦｃＢＡの発現は、（ｉ）同一の受容体に結合するがＴＦｃを含まない多価抗体の発現に関するより多くの（すなわち、より大きなパーセンテージの）正確に形成されたＴＦｃＡＢ分子を産生するか、又は（ｉｉ）例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定されるような、８０％を超えて正確に形成されたＴＦｃＡＢ分子を産生する。
本明細書において更に、ＴＦｃＢＡであるＡｂが提供され、ＴＦｃＢＡは、第１の結合部位と第２の結合部位とを含み、この第１の結合部位は、第１の標的に結合し、第２の結合部位は第２の標的に結合し、（ｉ）第１及び第２の結合部位は、ＴＦｃを通して連結され、（ｉｉ）ＴＦｃは第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域とを含み、それぞれの該第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域はＣ末端とＮ末端を有し、（ｉｉｉ）第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域は、Ｃ末端とＮ末端とを有するＴＦｃリンカーを通して連結され、切れ目がなく連続するポリペプチドを形成し、（ｉｖ）第１及び第２のＦｃ領域は関連して（結合して）Ｆｃ二量体を形成し、並びに（ｖ）第１及び第２のＦｃ領域のいずれか又は両方は、第１及び第２のＦｃ領域の間の結合を強化する又は安定化するために、１つ以上のアミノ酸（ａａ）修飾を含む。ＴＦｃＢＡは、第１及び第２の標的のいずれか又は両方を通してシグナル伝達を抑制することができる。特定の実施形態では、宿主細胞中のＴＦｃＢＡの発現は、（ｉ）同一の受容体に結合するがＴＦｃを含まない多価抗体の一致した宿主細胞中の発現に関するより多くの正確に形成されたＴＦｃＡＢ分子を産生するか、又は（ｉｉ）例えば、ＳＥＣによって決定されるような、８０％を超えて正確に形成されたＴＦｃＢＡ分子を産生する。
本明細書において更に、一価タンデムＦＣ抗体（ＴＦｃＡ）が提供される。一価ＴＦｃＡは、標的に結合する単一の結合部位を含むことができ、この結合部位は、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域とを含むＴＦｃに連結され、それぞれのこのような第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域は、Ｃ末端とＮ末端とを有し、（ｉ）第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域は、Ｃ末端とＮ末端とを有するＴＦｃリンカーを通して連結されて切れ目がなく連続するポリペプチドを形成し、（ｉｉ）第１及び第２のＦｃ領域は関連してＦｃ二量体を形成し、並びに（ｉｉｉ）第１及び第２のＦｃ領域のいずれか又は両方は、第１及び第２のＦｃ領域の間の結合を強化する又は安定化するために、１つ以上のａａ修飾を含む。一価ＴＦｃＡは、標的を通してシグナル伝達を抑制することができる。特定の実施形態では、宿主細胞中の一価ＴＦｃＡの発現は、（ｉ）ＴＦｃを含まない抗体の一致した宿主細胞中の発現に関するより多くの正確に形成されたＴＦｃＡ分子を産生するか、又は（ｉｉ）例えば、ＳＥＣによって決定されるような、８０％を超えて正確に形成されたＴＦｃＡ分子を産生する。
ＴＦｃＢＡなどのＴＦｃＡに含まれるＴＦｃの第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域とは、それぞれ第１及び第２のＣＨ３ドメインを含むことができ、それぞれの該ＣＨ３ドメインはＣ末端及びＮ末端を有する。ＴＦｃＡに含まれるＴＦｃの第１及び第２のＦｃ領域は、それぞれ第１及び第２のＣＨ２ドメインを含むことができ、それぞれのこのようなＣＨ２ドメインは、Ｃ末端及びＮ末端を有する。ＴＦｃＡに含まれるＴＦｃの第１及び第２のＦｃ領域は、それぞれ第１及び第２のヒンジを含むことができ、それぞれの該第１のヒンジ及び該第２のヒンジはＣ末端及びＮ末端を有する。特定の実施形態では、第２のヒンジは、上部ヒンジサブドメインを含まない。ＴＦｃＡ内に含まれるＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含むことができる。ＴＦｃＡ内に含まれるＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含むことができる。ＴＦｃＡ内に含まれるＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のヒンジ、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含むことができる。第１のヒンジは、上部ヒンジサブドメイン、コアヒンジサブドメイン及び下部ヒンジサブドメインを含むことができ、第２のヒンジは、コアヒンジサブドメイン及び下部ヒンジサブドメインを含むことができるが、上部ヒンジサブドメインを含まず、それぞれの該ヒンジサブドメインは、Ｃ末端及びＮ末端を有する。ＴＦｃＡに含まれるＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のヒンジ（そのＣ末端で第１のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結される）、第１のＣＨ２ドメイン（そのＣ末端で第１のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結される）、第１のＣＨ３ドメイン（そのＣ末端でＴＦｃリンカーのＮ末端に連結される）、ＴＦｃリンカー（そのＣ末端で第２のヒンジのＮ末端に連結される）、第２のヒンジ（そのＣ末端で第２のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結される）、第２のＣＨ２ドメイン（そのＣ末端で第２のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結される）及び第２のＣＨ３ドメインを含むことができる。
ＴＦｃＡに含まれるＴＦｃのＴＦｃリンカーは、２０〜５０個のａａを含むことができる。ＴＦｃリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは４、５、６、７又は８である）などのＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーであってもよい。ＴＦｃリンカーはまた、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーのａａ配列に少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか、又は最大で２０、１５、１０、５、４、３、２、又は１個のａａ付加、ａａ欠失又はａａ置換でこれらとは異なるａａ配列を含むことができる。
ＴＦｃＡのＴＦｃは、ＩｇＧ１ ＴＦｃであってもよい。ＴＦｃは、ハイブリッドＴＦｃ、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃであってもよい。ＴＦｃＡのＴＦｃは、ＩｇＧ１ ＴＦｃであってもよく、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のＩｇＧ１ヒンジ、第１のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、第１のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＩｇＧ１ヒンジ、第２のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、及び第２のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含むことができる。ハイブリッドＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジ、第１のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、第１のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＩｇＧ４ヒンジ、第２のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、及び第２のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含むことができる。
ＴＦｃの第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインのいずれか又は両方は、例えば非変性ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル上の本質的に均一な産物（又はバンド）によって立証されるような、第１及び第２のＦｃ領域の間の結合を強化又は安定化する１つ以上のａａ修飾を含むことができる。ＴＦｃの第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインのそれぞれは、アミノ酸修飾を含むことができ、その修飾は、第２のＣＨ３ドメインとの第１のＣＨ３ドメインの結合を強化する結合強化修飾（「ＡＥＭ」）である。ＡＥＭは、ＡＥＭモジュール１、ＡＥＭモジュール２、ＡＥＭモジュール３及びＡＥＭモジュール４からなる群から選択されるモジュールに含まれることができる。ＴＦｃの第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のいずれか又は両方は、挿入又は置換としてシステインを付加するａａ修飾を含み、このシステインは、その他のＦｃ領域中のシステインとジスルフィド結合を形成する（「ＤｉＳ」修飾）。ＴＦｃの第１及び第２のＦｃ領域のいずれか又は両方は、ヒンジ内にＤｉＳ修飾を含むことができる。特定の実施形態では、第１及び第２のＦｃ領域のいずれか又は両方は、ＣＨ３ドメイン内にＤｉｓ修飾を含む。このＤｉＳ修飾はＤｉＳモジュール１又はＤｉＳモジュール２に含まれてもよい。ＴＦｃの第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインのそれぞれは、１つ以上のＡＥＭ修飾及び１つ以上のＤｉＳ修飾を含むことができる。
ＴＦｃの第１及び第２のＣＨ３ドメインのいずれか又は両方は、例えば、配列番号２７〜９８からなる群から選択される本明細書に提供されるＣＨ３ドメインのａａ配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか、又は最大で３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、又は１個のａａ付加、ａａ欠失又はａａ置換でこれらとは異なるａａ配列を含むことができる。特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインのａａ配列が配列番号２７〜９８の群から選択される配列に同一でないならば、この場合、ＣＨ３ドメインのａａ配列は、それでも、それが類似する配列の特定のＡＥＭ及び／又はＤｉＳを含む。ＴＦｃの第１のＣＨ３ドメイン又は第２のＣＨ３ドメインは、例えば、配列番号２７〜９８からなる群から選択される、本明細書で提供されるａａ配列を含むことができる。ＴＦｃの第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３ドメインは共に、一対の２つの異なるメンバーを含むことができ、各メンバーはＣＨ３のａａ配列であり、各対は、配列番号３１及び３５；配列番号３３及び３７；配列番号３９及び４３；配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１；配列番号６３及び６７；配列番号６５及び６９；配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５；配列番号８４及び８６；配列番号８７及び８９；配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに配列番号９６及び９８からなる対の群から選択され、各メンバーのａａ配列は、各々の該対の各々の配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか、又は各々の該組の各々の配列とは最大で３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、又は１個のａａ付加、ａａ欠失又はａａ置換で異なり、第１のＣＨ３ドメインは、第２のＣＨ３ドメインに含まれるものとは異なる対のメンバーを含む。ＴＦｃの第１及び第２のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５；配列番号３３及び３７；配列番号３９及び４３；配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１；配列番号６３及び６７；配列番号６５及び６９；配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５；配列番号８４及び８６；配列番号８７及び８９；配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに配列番号９６及び９８からなる対の群から選択されるＣＨ３のａａ配列の対のメンバーのａａ配列に同一であるａａ配列をそれぞれ含むことができる。
ＴＦｃの第１のヒンジは、例えば、配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群から選択される、本明細書に提供されるヒンジのａａ配列とは最大で３、２又は１個のａａ欠失、ａａ付加又はａａ置換で異なるａａ配列を含むことができる。ＴＦｃの第１のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群から選択されるａａ配列であるａａ配列を含んでもよい。ＴＦｃの第２のヒンジは、例えば、配列番号２３、２４、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群から選択される、本明細書に提供されるヒンジのａａ配列とは最大で３、２又は１個のａａ欠失、ａａ付加又はａａ置換で異なるａａ配列を含むことができる。第２のヒンジは、配列番号２３、２４、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群から選択されるａａ配列であるａａ配列を含んでもよい。
ＴＦｃのＣＨ２ドメインは、例えば、配列番号２５、２６、２６１又は２６２の本明細書に提供されるＣＨ２ドメインのａａ配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるａａ配列、もしくは最大で３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、又は１個のａａ欠失、ａａ付加又はａａ置換でこれらとは異なるａａ配列を含むことができる。
ＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、第２のヒンジ、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含むことができ、（ｉ）第１のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群から選択されるａａ配列を含み、（ｉｉ）第１のＣＨ２ドメインは、脱グリコシル化され、配列番号２５で記載するａａ配列を含み、（ｉｉｉ）第１のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５；配列番号３３及び３７；配列番号３９及び４３；配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１；配列番号６３及び６７；配列番号６５及び６９；配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５；配列番号８４及び８６；配列番号８７及び８９；配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに配列番号９６及び９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される一対の配列のいずれかの配列であるａａ配列を含み、（ｉｖ）第２のヒンジは、配列番号２３、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群から選択される配列からなるａａ配列を含み、（ｖ）第２のＣＨ２ドメインは脱グリコシル化され、配列番号２５で記載するａａ配列を含み、並びに（ｖｉ）第２のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５；配列番号３３及び３７；配列番号３９及び４３；配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１；配列番号６３及び６７；配列番号６５及び６９；配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５；配列番号８４及び８６；配列番号８７及び８９；配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに配列番号９６及び９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される一対の配列のいずれかの配列であるａａ配列を含み、第１のＣＨ３ドメインが、一対の配列の第１の配列を含む場合、第２のＣＨ３ドメインはこの配列の対の第２の配列を含み、並びに第１のＣＨ３ドメインが一対の配列の第２の配列を含む場合、第２のＣＨ３ドメインは、この配列の対の第１の配列を含む。
ＴＦｃは、アミノの末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、第２のヒンジ、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含むことができ、（ｉ）第１のヒンジは、配列番号２０、２１、２２、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群から選択されるａａ配列を含み、（ｉｉ）第１のＣＨ２ドメインは脱グリコシル化され、配列番号２６で記載するａａ配列を含み、（ｉｉｉ）第１のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５；配列番号３３及び３７；配列番号３９及び４３；配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１；配列番号６３及び６７；配列番号６５及び６９；配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５；配列番号８４及び８６；配列番号８７及び８９；配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに配列番号９６及び９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される一対の配列のいずれかの配列であるａａ配列を含み、（ｉｖ）第２のヒンジは、配列番号２４、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなるａａ配列を含み、（ｖ）第２のＣＨ２ドメインは、脱グリコシル化され、配列番号２６で記載するａａ配列を含み、並びに（ｖｉ）第２のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５；配列番号３３及び３７；配列番号３９及び４３；配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１；配列番号６３及び６７；配列番号６５及び６９；配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５；配列番号８４及び８６；配列番号８７及び８９；配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに配列番号９６及び９８からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群から選択される一対の配列のいずれかの配列であるａａ配列を含み、第１のＣＨ３ドメインが、一対の配列の第１の配列を含む場合、第２のＣＨ３ドメインは、この配列の対の第２の配列を含み、並びに第１のＣＨ３ドメインが一対の配列の第２の配列を含む場合、第２のＣＨ３ドメインは、この配列の対の第１の配列を含む。
ＴＦｃの第１又は第２のＦｃ領域は、例えば、配列番号９９〜１６６からなる群から選択される、本明細書に提供されるＦｃ領域のａａ配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるａａ配列、又は最大で５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、又は１個のａａ欠失、ａａ付加又はａａ置換でこれとは異なるａａ配列を含むことができる。第１又は第２のＦｃ領域は、配列番号９９〜１６６からなる群から選択されるａａ配列を含む。第１及び第２のＦｃ領域は、配列番号９９及び１００；配列番号１０１及び１０２、配列番号１０３及び１０４、配列番号１０５及び１０６；配列番号１０７及び１０８；配列番号１０９及び１１０；配列番号１１１及び１１２、配列番号１１３及び１１４、配列番号１１５及び１１６；配列番号１１７及び１１８；配列番号１１９及び１２０；配列番号１２１及び１２２、配列番号１２３及び１２４、配列番号１２５及び１２６；配列番号１２７及び１２８；配列番号１２９及び１３０；配列番号１３１及び１３２、配列番号１３３及び１３４、配列番号１３５及び１３６；配列番号１３７及び１３８；配列番号１３９及び１４０；配列番号１４１及び１４２、配列番号１４３及び１４４、配列番号１４５及び１４６；配列番号１４７及び１４８；配列番号１４９及び１５０；配列番号１５１及び１５２、配列番号１５３及び１５４、配列番号１５５及び１５６；配列番号１５７及び１５８；配列番号１５９及び１６０；配列番号１６１及び１６２、配列番号１６３及び１６４、並びに配列番号１６５及び１６６からなる群から選択される一対のａａ配列の１つのａａ配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるａａ配列、又は最大で５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、又は１個のａａ欠失、ａａ付加又はａａ置換でこれらとは異なるａａ配列を含むことができ、第１のＦｃ領域は、第２のＦｃ領域に含まれるものとは異なる対のメンバーを含む。第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は共に、一対の２つの異なるメンバーを含むことができ、各メンバーはＦｃ ａａ配列であり、各々の対は、配列番号９９及び１００；配列番号１０１及び１０２、配列番号１０３及び１０４、配列番号１０５及び１０６；配列番号１０７及び１０８；配列番号１０９及び１１０；配列番号１１１及び１１２、配列番号１１３及び１１４、配列番号１１５及び１１６；配列番号１１７及び１１８；配列番号１１９及び１２０；配列番号１２１及び１２２、配列番号１２３及び１２４、配列番号１２５及び１２６；配列番号１２７及び１２８；配列番号１２９及び１３０；配列番号１３１及び１３２、配列番号１３３及び１３４、配列番号１３５及び１３６；配列番号１３７及び１３８；配列番号１３９及び１４０；配列番号１４１及び１４２、配列番号１４３及び１４４、配列番号１４５及び１４６；配列番号１４７及び１４８；配列番号１４９及び１５０；配列番号１５１及び１５２、配列番号１５３及び１５４、配列番号１５５及び１５６；配列番号１５７及び１５８；配列番号１５９及び１６０；配列番号１６１及び１６２、配列番号１６３及び１６４、並びに配列番号１６５及び１６６からなる対の群から選択され、各メンバーのａａ配列は、各々の該対の各々の配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか、又は最大で５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、又は１個のａａ欠失、ａａ付加又はａａ置換でこれらとは異なり、第１のＦｃ領域は、第２のＦｃ領域に含まれるものとは異なる対のメンバーを含む。
ＴＦｃは、例えば、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９及び２２１からなる群から選択される、本明細書に提供されるＴＦｃのａａ配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるａａ配列か、又は最大で３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、又は１個のａａ欠失、ａａ付加又はａａ置換でこれらとは異なるａａ配列を含むことができる。ＴＦｃは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９及び２２１からなる群から選択されるａａ配列を含んでもよい。
ＴＦｃＡ、例えばＴＦｃＢＡ（例えば、抗−ｃ−Ｍｅｔ＋抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡ又は抗−ｃ−Ｋｉｔ ＋抗−ＲＯＮ ＴＦｃＢＡ又は抗−ＦＧＲ２＋抗−ＥＰＣＡＭ ＴＦｃＢＡ）は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ＴＦｃ、接続リンカー及び第２のＶＨドメインを含む重鎖を含むことができる。重鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、接続リンカー及び第２のＶＨドメインを含むことができる。重鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、接続リンカー、第２のＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー及び第２の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含むことができ、第２のＶＨ及びＶＬドメインは結合して、第２の結合部位を形成する。ＴＦｃＡは、第１のＶＨドメインと二量体化して第１の結合部位を形成する第１のＶＬドメインを含む軽鎖を含むことができる。軽鎖は、ＶＬドメインのカルボキシル末端に連結する軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含むことができる。第１結合部位は、抗−ｃ−Ｍｅｔ、抗−ｃ−Ｋｉｔ、抗―ＥｒｂＢ２、抗−ＥｒｂＢ３、抗−ＥｒｂＢ４、抗−ＩＧＦ１Ｒ、抗−ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗−ＲＯＮ、抗−ＥＧＦＲ、抗−ＶＥＧＦＲ１、抗−ＶＥＧＦＲ２、抗−ＴＮＦＲ、抗−ＦＧＦＲ１、抗−ＦＧＦＲ２、抗−ＦＧＦＲ３、抗−ＦＧＦＲ４、抗−ＰＤＧＦＲα、抗−ＰＤＧＦＲβ、抗−ＥＰＣＡＭ又は抗−ＥｐｈＡ２結合部位であってもよく、第２の結合部位は、抗−ｃ−Ｍｅｔ、抗−ｃ−Ｋｉｔ、抗―ＥｒｂＢ２、抗−ＥｒｂＢ３、抗−ＥｒｂＢ４、抗−ＩＧＦ１Ｒ、抗−ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗−ＲＯＮ、抗−ＶＥＧＦＲ１、抗−ＶＥＧＦＲ２、抗−ＴＮＦＲ、抗−ＦＧＦＲ１、抗−ＦＧＦＲ２、抗−ＦＧＦＲ３、抗−ＦＧＦＲ４、抗−ＰＤＧＦＲアルファ、抗−ＰＤＧＦＲβ、抗−ＥｐｈＡ２又は抗−ＥＧＦＲ結合部位であってもよい。ＴＦｃＡが一価ＴＦｃＡである場合、結合部位は、抗−ｃ−Ｍｅｔ、抗−ｃ−Ｋｉｔ、抗―ＥｒｂＢ２、抗−ＥｒｂＢ３、抗−ＥｒｂＢ４、抗−ＩＧＦ１Ｒ、抗−ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗−ＲＯＮ、抗−ＶＥＧＦＲ１、抗−ＶＥＧＦＲ２、抗−ＴＮＦＲ、抗−ＦＧＦＲ１、抗−ＦＧＦＲ２、抗−ＦＧＦＲ３、抗−ＦＧＦＲ４、抗−ＰＤＧＦＲアルファ、抗−ＰＤＧＦＲβ、抗−ＥＰＣＡＭ、抗−ＥｐｈＡ２又は抗−ＥＧＦＲ結合部位であってもよい。例示的な抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、ａ）配列番号２２３又は２８７中のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）３（ＶＨＣＤＲ３）のａａ配列及びｂ）配列番号２３１又は２８９中のＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含むＶＬＣＤＲ３のいずれか又は両方を含むＶＨドメインを含むことができる。別の例示的な抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、ＶＨＣＤＲ１、ＶＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３（このＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、及びＶＨＣＤＲ３は、配列番号２２３又は２３１中のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含む）を含む３つのＶＨ ＣＤＲのセットを含むＶＨドメイン、並びにＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３（このＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２８７又は２８９中のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含む）を含む３つのＶＬＣＤＲのセットを含むＶＬドメインを含むことができる。例示的な抗−ＥＧＦＲ結合部位は、ａ）配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９中のＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含むＶＨＣＤＲ３並びにｂ）配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９中のＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含むＶＬＣＤＲ３のいずれか又は両方を含むことができる。例示的な抗−ＥＧＦＲ結合部位は、ＶＨＣＤＲ１、ＶＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３を含む３つのＶＨＣＤＲのセットを含むＶＨドメイン（ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３は、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９中のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含む）、並びにＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３（ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３は、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９中のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含む）を含む３つのＶＬＣＤＲのセットを含むＶＬドメインを含むことができる。抗−ｃ−Ｍｅｔ、抗−ｃ−Ｋｉｔ、抗―ＥｒｂＢ２、抗−ＥｒｂＢ３、抗−ＥｒｂＢ４、抗−ＩＧＦ１Ｒ、抗−ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗−ＲＯＮ、抗−ＶＥＧＦＲ１、抗−ＶＥＧＦＲ２、抗−ＴＮＦＲ、抗−ＦＧＦＲ１、抗−ＦＧＦＲ２、抗−ＦＧＦＲ３、抗−ＦＧＦＲ４、抗−ＰＤＧＦＲα、抗−ＰＤＧＦＲβ、抗−ＥＰＣＡＭ、抗−ＥｐｈＡ２又は抗−ＥＧＦＲ結合部位は、重鎖のＮ末端部分及び軽鎖のＮ末端部分を含むことができる。抗−ＥＧＦＲ、抗−ｃ−Ｋｉｔ、抗―ＥｒｂＢ２、抗−ＥｒｂＢ３、抗−ＥｒｂＢ４、抗−ＩＧＦ１Ｒ、抗−ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗−ＲＯＮ、抗−ＶＥＧＦＲ１、抗−ＶＥＧＦＲ２、抗−ＴＮＦＲ、抗−ＦＧＦＲ１、抗−ＦＧＦＲ２、抗−ＦＧＦＲ３、抗−ＦＧＦＲ４、抗−ＰＤＧＦＲα、抗−ＰＤＧＦＲβ、抗−ＥＰＣＡＭ、抗−ＥｐｈＡ２又は抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、重鎖に完全に含まれるＣ末端のｓｃＦｖに含まれ、切れ目がなく連続するポリペプチドを形成することができる。
ＴＦｃＡ、例えばＴＦｃＢＡの抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれか又は両方に含まれることができ、ＶＨドメインは、例えば配列番号２２３、２３１、２８７又は２８９で記載する抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位のＶＨドメインに少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるａａ配列、又は最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のａａ欠失、ａａ付加又はａａ置換でこれらとは異なるａａ配列を含み、並びにＶＬドメインは、例えば配列番号２２３、２３１、２８７又は２８９で記載する本明細書に提供される抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位のＶＬドメインに少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるａａ配列、又は最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のａａ欠失、ａａ付加又はａａ置換でこれらとは異なるａａ配列を含む。
ＴＦｃＡ、例えばＴＦｃＢＡの抗−ＥＧＦＲ結合部位は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれか又は両方に含まれることができ、ＶＨドメインは、例えば配列番号２２３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９で記載する、本明細書に提供される抗−ＥＧＦＲ結合部位のＶＨドメインに少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるａａ配列、又は最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のａａ欠失、付加又は置換でこれらとは異なるａａ配列を含み、並びにＶＬドメインは、例えば配列番号２２３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９で記載する、本明細書に提供される抗−ＥＧＦＲ結合部位のＶＬドメインに少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であるａａ配列、又は最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のａａ欠失、付加又は置換でこれらとは異なるａａ配列を含む。
ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡであってもよく、例えば、電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、群Ａから選択されるアミノ酸と、群Ｂから選択されるアミノ酸を含む一対の荷電アミノ酸（電荷相補的対）を含むＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡであり、群Ａは、７を超えるｐＩを有するすべての天然アミノ酸を含み、群Ｂは、７未満のｐＩを有するすべての天然アミノ酸を含み、又は必要に応じて群ＡはＨｉｓ、Ｌｙｓ、及びＡｒｇを含み、群Ｂは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、及びＰｒｏを含み、該電荷相補的対は、第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基とからなり、該電荷相補的対は、２９７位の電荷相補的対又は２９９位の電荷相補的対であり、２９７位の電荷相補的対は、該第１のＦｃ領域のＥＵナンバリング２９７位に位置する該第１のアミノ酸残基及び該第２のＦｃ領域のＥＵナンバリング２９７位に位置する該第２のアミノ酸残基を有する電荷相補的対であり、２９９位の電荷相補的対は、該第１のＦｃ領域のＥＵナンバリング２９９位に位置する該第１のアミノ酸残基及び該第２のＦｃ領域のＥＵナンバリング２９９位に位置する該第２のアミノ酸残基を有する電荷相補的対である。電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、２９７位の電荷相補的対及び２９９位の電荷相補的対の双方を含むことができ、２９７位の電荷相補的対の第１及び第２のアミノ酸残基は、２９９位の電荷相補的対の第１及び第２のアミノ酸残基と同一であるか又は異なる。電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、２９７位の電荷相補的対を含んでもよく、電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡではないが、電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡに同一である（第１及び第２のアミノ酸残基に一致するアミノ酸残基が、共に同じ荷電アミノ酸からなる残基であり、該同じ荷電アミノ酸が、電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの２９７位の電荷相補的対のアミノ酸の１つであることを除いては）ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡよりも安定である。電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、２９９位の電荷相補的対を含んでもよく、電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡではないが、第１及び第２のアミノ酸残基に一致するアミノ酸残基が、両者共に同じ荷電アミノ酸からなる残基であり、該同じ荷電アミノ酸が、電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの２９９位の電荷相補的対のアミノ酸の１つであることを除いては、電荷相補的対形成ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡに同一であるＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡよりも安定である。
ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの第１又は第２の結合部位は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（α及びβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ及びＥｐｈＡ２からなる群から選択されるヒト受容体タンパク質に特異的に結合することができる。
本明細書で更に提供するものは、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡ及び薬学的に許容できるキャリアーを含む医薬組成物である。更に提供するものは、例えば、少なくとも１つのコード配列を含む核酸分子であり、該少なくとも１つのコード配列は、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの重鎖又は軽鎖をコード化する。核酸分子は、少なくとも２つのコード配列を含むことができ、一方のコード配列は、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの重鎖をコード化し、第２のコード配列はＴＦｃＢＡの軽鎖をコード化する。更に提供するものは、例えば、本明細書に提供する１つ以上の核酸分子を含むベクターである。更に提供するものは、細胞、例えば宿主細胞又は単離細胞であり、これらは、本明細書に提供する１つ以上のベクター及び／又は核酸分子を含む。細胞は、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの重鎖をコード化する核酸分子と、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの軽鎖をコード化する核酸分子とを含むことができる。
本明細書で更に包含するものは、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡを生成する方法であり、方法は、核酸が発現される条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養することと、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡを単離することを含む。ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡを生成するための方法は、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの発現に好適な条件下で、本明細書に記載の細胞を培養することを含む。
本明細書で更に提供するものは、癌を有する対象を治療する方法であり、該方法は、本明細書に記載のＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡ、核酸分子、又はベクターの治療的有効量を対象に投与することを含む。
例示的な抗−ｃ−Ｍｅｔ／抗−ＥＧＦＲタンデムＦｃ二重特異性抗体（「ＴＦｃＢＡ」）の図（図１Ａ）及びタンデムＦｃ（「ＴＦｃ」）のドメインのそれぞれにおける例示的な変異の図（図１Ｂ）である。 アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、以下の３つのモジュールを含む例示的な抗−ｃ−Ｍｅｔ／抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの図である。１）抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位からなる第１のモジュール；２）ＴＦｃからなる第２のモジュール；及び３）抗−ＥＧＦＲ結合部位からなる第３のモジュール。例示したＴＦｃＢＡでは、第１のモジュールは、抗−ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂであり、第３のモジュールは、抗−ＥＧＦＲ ｓｃＦｖである。ＴＦｃは、ＴＦｃリンカーを通して連結する２つのＦｃ領域を含む。例示したＴＦｃＢＡでは、第１のＦｃ領域は、完全長ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジ、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、及びＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＩｇＧ４のコア及び下部ヒンジ（しかし、上部ヒンジは含まない）、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む。例示したＴＦｃＢＡでは、ＣＨ３ドメインは、１つ以上の結合強化修飾（「ＡＥＭｓ」）を含み、これは２つのＣＨ３ドメイン又は２つのＦｃ領域の間の結合を強化する。ＴＦｃＢＡはまた、１つ以上のジスルフィド結合形成修飾（「ＤｉＳｓ」）を含むことができ、これは２つのＦｃ領域の間のジスルフィド結合の形成を可能にするシステインを導入する。 アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のヒンジ、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを示すＴＦｃの構造の図である。これらドメインのそれぞれについての例示的な配列及びドメイン修飾を図の下に示す。それぞれのＡＥＭ又はＤｉＳにおける第１又は第２のＣＨ３修飾の名称を、修飾の名称の後ろの括弧内に示し、「ＡＥＭ」又は「ＤｉＳ」の後ろの最初の数字は、それぞれＡＥＭ又はＤｉＳのモジュール番号を指し、次の数字は、２つのＣＨ３ドメインの第１又は第２を指す。例えば、「ＡＥＭ １．１」は、置換「Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ」の後ろに示され、この置換は、ＡＥＭモジュール１内の１対の修飾の２つのＣＨ３ドメインの１つにおける置換の組み合わせである。ＴＦｃは、ＴＦｃのＣＨ３ドメインの１つが、ＡＥＭ及び／又はＤｉＳの２つの修飾の１つを含む場合、その他のＣＨ３ドメインは第２の、すなわち、適合性のあるＡＥＭ及び／又はＤｉＳの修飾(複数可)を含むという条件で、これらドメインのそれぞれの任意の組み合わせを含むことができる。例えば、ＴＦｃの１つのＣＨ３ドメインがＡＥＭ １．１を含むならば、その他のＣＨ３ドメインはＡＥＭ １．２を含む。「Ｃ−ｔｅｒｍ．Ｃｙｓ」とは、ＣＨ３ドメインの最後の３つのａａを図に示すもので置換することによる、Ｃ末端システインをＣＨ３ドメインに付加する修飾を指す。この図及びその他の図におけるａａ残基番号は、カバットのＥＵインデックス番号による、無傷の抗体重鎖中のものである。 野生型及び変異型ヒンジのａａ配列のアライメントである。ある位置における点線「−」は、その位置で図の１行目のａａと同一であるａａを表す。Ａ）野生型（配列番号１〜４及び２３）又は修飾型（配列番号１６〜１９及び２６３〜２６５）である、完全長（配列番号４、１８及び１９）又は部分的（配列番号１、２、３、１６、１７、２３及び２６３〜２６５）ＩｇＧ１ヒンジのａａ配列。Ｂ）野生型（配列番号１、１３、１４、２０及び２４）又は修飾型（配列番号２１及び２２）である、完全長（配列番号２０、２１及び２２）又は部分的（配列番号１、１３、１４及び２４）ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジのａａ。Ｃ）完全長野生型ｍＩｇＧ１ヒンジ（配列番号２２６）及びハイブリッドｍＩｇＧ１／ｍＩｇＧ２Ａヒンジ（配列番号２６７）のａａ配列。Ｄ）完全長の野生型ｈＩｇＧ２ヒンジ（配列番号７）及び修飾型ｈＩｇＧ２ヒンジ（配列番号２６８及び２６９）のａａ配列。Ｅ）完全長の野生型ｈＩｇＡ２ヒンジ（配列番号２７０）及び修飾型ｈＩｇＡ２ヒンジ（配列番号２７１〜２７３）のａａ配列。 さまざまなａａ修飾の有無のＩｇＧ１ ＣＨ３ ａａ配列のアライメントである。各行は、異なるＣＨ３ドメインのａａ配列である。ある位置の点線「−」は、その位置における図の１行目にあるａａと同一のａａを表す。ＣＨ３修飾は、それらのモジュール、例えばＡＥＭモジュール１にしたがって組み込まれる。各モジュールは、２つの数字で標識付けされた２つの群に分けられる。例えば、ＡＥＭモジュール１は、群「ＡＥＭ １１」及び「ＡＥＭ １２」に分けられ、ＡＥＭ １１は、モジュールＡＥＭ １の１つのＣＨ３ドメイン（ドメイン「１」）で行われた修飾を表し、ＡＥＭ １２は、このモジュールの第２のＣＨ３ドメイン（ドメイン「２」）で行われた修飾を表す。モジュール内の各行は、その他の修飾の有無でモジュールの修飾を有するＣＨ３ドメインを表す。１つのモジュール内のＣＨ３のａａ配列は、例えばカルボキシル末端リジンの存在又は不在で及び／又は置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍの存在で、互いに異なる。 例示的ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアライメントである。各行は、異なるＦｃ領域のａａ配列である。ある位置の点線「−」は、その位置で図の１行目にあるａａと同一のａａを表す。各Ｆｃ領域は、ヒンジ（第１の配列中の太字部分）、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ドメインは第１の配列中の下線付き部分）を含む。この図の各Ｆｃのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３配列の配列番号を、表８に提供する。Ｆｃは、対で編成され、これらは、その他の対から線で離間され、各対は適合性のあるＦｃ、すなわち、互いに結合してＦｃ二量体を形成することができるＦｃを表す。 例示的ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃ領域のアライメントである。各行は、異なるＦｃ領域のａａ配列である。ある位置の点線「−」は、その位置で図の１行目にあるａａと同一のａａを表す。各Ｆｃ領域は、ヒンジ（第１の配列中の太字部分）、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ドメインは第１の配列中の下線付き部分）を含む。この図の各Ｆｃのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３配列の配列番号を、表９に提供する。Ｆｃは、対で編成され、これらは、その他の対から線で離間され、各対は適合性のあるＦｃ、すなわち、互いに結合してＦｃ二量体を形成することができるＦｃを表す。 以下のＩｇＧ１ ＴＦｃのａａ配列である。２３（配列番号１７１）；２３Ａ（配列番号１７３）；２３Ｂ（配列番号１７５）；２３Ｃ（配列番号１７７）；２３Ｄ（配列番号１７９）；２３Ｅ（配列番号１８１）；２３Ｆ（配列番号１８３）；２３Ｅ（３５Ｌ）（配列番号１８５）；２３Ｅ（逆方向３５Ｌ）（配列番号１８７）；２３Ｅ（３０Ｌ）（配列番号１８９）；２３Ｅ（２５Ｌ）（配列番号１９１）；２３Ｉ（配列番号１９３）；及び２３Ｊ（配列番号１９５）。これら配列のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、第１のＩｇＧ１ヒンジ（二重下線付き部分）、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線付き部分）、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（斜体字）、第２のＩｇＧ１ヒンジ（二重下線付き部分で、コア及び下部ヒンジのみからなる）、第２のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン及び第２のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線付き部部分）のドメインからなる。これら分子のそれぞれに特異的であるａａの変化を太字部分で示し、配列の上に名称を示す。 以下のＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃのａａ配列である：３９（配列番号１９７）；３９Ａ（配列番号１９９）；３９Ｂ（配列番号２０１）；３９Ｃ（配列番号２０３）、３９Ｄ（配列番号２０５）；３９Ｅ（配列番号２０７）；３９Ｆ（配列番号２０９）；３９Ｅ（３５Ｌ）（配列番号２１１）；３９Ｅ（逆方向３５Ｌ）（配列番号２１３）；３９Ｅ（３０Ｌ）（配列番号２１５）；３９Ｅ（２５Ｌ）（配列番号２１７）；３９Ｉ（配列番号２１９）；及び３９Ｊ（配列番号２２１）。これら配列のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、ＩｇＧ１上部ヒンジ並びにＩｇＧ４コア及び下部ヒンジからなる第１のＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジ（二重下線付き部分）、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線付き部分）、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（斜体字）、第２のＩｇＧ１ヒンジ（二重下線付き部分で、コア及び下部ヒンジのみからなる）、第２のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン及び第２のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線付き部部分）のドメインからなる。ＩｇＧ１配列は大文字であり、ＩｇＧ４配列は小文字である。これら分子のそれぞれに特異的であるａａの変化を太字部分で示し、配列の上に名称を示す。 Ａ）非還元条件又はＢ）還元条件下で、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離されたＴＦｃ ２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｄ、２３Ｅ、３９Ｂ及び３９Ｇのサンプルである。レーン１の分子量マーカー（Ｂｉｏｒａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｍａｒｋｅｒ）のタンパク質の分子量（ＫＤａ単位の）をゲルの左側に示す。 以下の例示的な抗−ｃ−Ｍｅｔ／抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である：ヒト化５Ｄ５ ＶＨドメインとＡ）、Ｂ）、Ｃ）、Ｄ）、Ｅ）、Ｌ）及びＭ）パニツムマブ（配列番号２３５）；Ｆ）２２２４（配列番号２３９）；Ｇ）セツキシマブＨ１Ｌ１（配列番号２６０）；Ｈ）セツキシマブＨ１Ｌ２（配列番号２８１）；Ｉ）セツキシマブＨ２Ｌ１（配列番号２８３）；並びにＪ）セツキシマブＨ２Ｌ２（配列番号２８５）のＶＨ及びＶＬドメインのａａ配列を含むＴＦｃＢＡ。Ｋ）は、抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位２のＶＨドメイン及びヒト化抗ＥＧＦＲセツキシマブｓｃＦｖ Ｈ１Ｌ１を含む、抗−ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である。ヒト化の目的で、セツキシマブのＶＨドメイン中に導入されたａａを、小文字で示す。抗−ｃ−Ｍｅｔ ＦａｂのＣＤＲには、点線で下線を施している。ＣＨ１ドメインには、波線で下線を施している。ヒンジには二重下線を施している。ＴＦｃリンカーは斜体字である。ＣＨ３ドメインには下線を付けている。ＣＨ３中のＡＥＭ及びＤｉＳ修飾は、太字である。ｓｃＦｖリンカーには斜体字でかつ下線を引いている。接続リンカーには斜体字で二重下線を引いている。 図面及び明細書で記載するａａ配列をコード化するヌクレオチド配列である。 実施例１及び２で使用したＴＦｃのヌクレオチド及びａａ配列である。ａａ配列のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、シグナルペプチド（下線が引かれかつ太字）、第１のＩｇＧ１ヒンジ（二重の下線）、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線）、ＴＦｃリンカー（斜体字）、第２のＩｇＧ１ヒンジ（二重下線付き部分で、コア及び下部ヒンジのみからなる）、第２のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン及び第２のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン（下線）のドメインからなる。ＩｇＧ１のａａは、大文字であり、ＩｇＧ４のａａは小文字である。これら分子のそれぞれに特異的であるａａの変化、例えばＡＥＭ及びＤｉＳ修飾を、太字で示し、配列の上に名称を示す。 オナルツズマブ（ＯＴＺＭ）モノクローナル細胞系の選択である：レーン１＝サイズ標準；レーン２〜１２；２＝ＯＴＺＭライン１、３＝ＯＴＺＭライン２、４＝ＯＴＺＭライン３、５＝ＯＴＺＭライン４、６＝ＯＴＺＭライン５、７＝ＯＴＺＭライン６、８＝ＯＴＺＭライン７、９＝ＯＴＺＭライン８、１０＝ＯＴＺＭライン９、１１＝ＯＴＺＭライン１０、１２＝ＯＴＺＭライン１１。 オナルツズマブ（ＯＴＺＭ）モノクローナル細胞系の選択である：レーン１＝サイズ標準；レーン２〜９；２＝ＯＴＺＭライン１２、３＝ＯＴＺＭライン１３、４＝ＯＴＺＭライン１４、５＝ＯＴＺＭライン１５、６＝ＯＴＺＭライン１６、７＝ＯＴＺＭライン１７、８＝ＯＴＺＭライン１８、９＝ＯＴＺＭライン１９。 荷電グリコシル化変異体の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥである：レーン１＝サイズ標準、レーン２〜８；２＝グリコ野生型、３＝グリコ型１、４＝グリコ型２、５＝グリコ型３、６＝グリコ型４、７＝グリコ型５、８＝グリコ型６。 荷電グリコシル化変異体の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥである：レーン１＝サイズ標準、レーン２〜８；２＝グリコ野生型、３＝グリコ型１、４＝グリコ型２、５＝グリコ型３、６＝グリコ型４、７＝グリコ型５、８＝グリコ型６。 例示的なＴＦｃＢＡのヌクレオチド及びａａ配列である。 ３９Ｅグリコ型４骨格、オナルツズマブ抗体並びに２２２４又はパニツムマブ抗体のいずれかを含むＴＦｃＢＡのｃＭｅｔ−Ｆｃ及びＥＧＦＲ−ｈｉｓへの結合を示すグラフである。 オナルツズマブ抗体及び２３、２３Ｅ、３９、３９Ｅグリコ型４骨格を含むさまざまな骨格を含むＴＦｃ（並びに３９Ｅグリコ型４骨格及び２２２４、セツキシマブ、又はパニツムマブ抗体を含むＴＦｃＢＡを含有させる）によるｐＭｅｔの抑制を示すグラフである。 表２３に記載する例示的なＴＦｃＢＡのグリコシル化変異体のヌクレオチド及びａａ配列である。
配列の簡単な説明：
本明細書中に言及され、配列表に記載されているアミノ酸（「ａａ」）配列を、以下に同定する。
配列番号１、２及び３は、それぞれ、野生型ＩｇＧ１の上部、中部（又はコア）及び下部ヒンジのａａ配列である（表２参照）。
配列番号４は、完全な野生型ＩｇＧ１ヒンジのａａ配列であり、連続した配列でアミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序での配列番号１、２及び３からなる（表２参照）。
配列番号５及び６は、それぞれ、野生型ＩｇＧ２上部及び下部ヒンジのａａ配列である（表２参照）。ＩｇＧ２中部ヒンジは、ＩｇＧ１、すなわち、配列番号２のヒンジと同じである。
配列番号７は、完全な野生型ＩｇＧ２ヒンジのａａ配列であり、連続した配列でアミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で配列番号５、２及び６からなる（表２参照）。
配列番号８、９及び１０は、それぞれ、野生型ＩｇＧ３上部、中部及び下部ヒンジのａａ配列である（表２参照）。
配列番号１１は、完全な野生型ＩｇＧ３ヒンジのａａ配列であり、連続した配列でアミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で配列番号８、９及び１０からなる（表２参照）。
配列番号１２、１３及び１４は、それぞれ、ＩｇＧ４上部、中部及び下部ヒンジのａａ配列である（表２参照）。
配列番号１５は、完全長ＩｇＧ４ヒンジのａａ配列であり、連続した配列でアミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で配列番号１２、１３及び１４からなる（表２）。
配列番号１６は、ａａ置換Ｈ２２４Ｃ及びＴ２２５Ｃを含む、ＩｇＧ１上部ヒンジのａａ配列（配列番号１）である（表４及び図２を参照）。
配列番号１７は、ａａ置換Ｔ２２３Ｃを含む、ＩｇＧ１上部ヒンジのａａ配列（配列番号１）である（表４及び図２を参照）。
配列番号１８は、ａａ置換Ｈ２２４Ｃ及びＴ２２５Ｃを含む、完全長ＩｇＧ１ヒンジのａａ配列（配列番号４）である（表４及び図２を参照）。
配列番号１９は、ａａ置換Ｔ２２３Ｃを含む、完全長ＩｇＧ１ヒンジのａａ配列（配列番号４）である（表４及び図２を参照）。
配列番号２０は、完全長ハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジのａａ配列であり、ＩｇＧ１の上部ヒンジ（配列番号１）並びに、ＩｇＧ４の中部及び下部ヒンジ（それぞれ、配列番号１３及び１４、表４及び図２を参照）からなる。
配列番号２１は、完全長ハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジのａａ配列であり、ａａ置換Ｈ２２４Ｃ及びＴ２２５Ｃを含むＩｇＧ１の上部ヒンジ（配列番号１６）並びにＩｇＧ４の中部及び下部ヒンジ（それぞれ、配列番号１３及び１４、表４及び図２を参照）からなる。
配列番号２２は、完全長ハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジのａａ配列であり、ａａ置換Ｔ２２３Ｃを含むＩｇＧ１の上部ヒンジ（配列番号１７）並びに、ＩｇＧ４の中部及び下部ヒンジ（それぞれ、配列番号１３及び１４、表４及び図２を参照）からなる。
配列番号２３は、中部及び下部ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号２及び３）を含むが、上部ヒンジを含まない、部分的なＩｇＧ１ヒンジのａａ配列である（表４及び図２を参照）。
配列番号２４は、中部及び下部ＩｇＧ４ヒンジ（配列番号１３及び１４）を含むが、上部ヒンジを含まない、部分的なＩｇＧ４ヒンジのａａ配列である（表４及び図２を参照）。
配列番号２５は、ａａ２９７でのグリコシル化を減少させるａａ置換Ｎ２９７Ｑを含む、完全長ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインのａａ配列である。
配列番号２６は、ａａ２９７でのグリコシル化を減少させる、ａａ置換Ｔ２９９Ｋを含む、完全長野生型ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのａａ配列である。
配列番号２７は、完全長野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６及び図３を参照）。
配列番号２８は、配列番号２７を有するが、Ｃ−末端リジンを欠損している野生型ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６及び図３を参照）。
配列番号２９は、置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを含む配列番号２７を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６及び図３を参照）。
配列番号３０は、配列番号２９を有し、Ｃ−末端リジンを欠損しているＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６及び図３を参照）。
配列番号３１は、置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４７０Ｖを含む配列番号２７を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列であり、「ホール」を作成する（結合強化修飾（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又は「ＡＥＭ」１．１、表６及び図３を参照）。
配列番号３２は、配列番号３１を有し、Ｃ−末端リジンを欠損しているＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６及び図３を参照）。
配列番号３３は、置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４７０Ｖを含む配列番号２９を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列であり、「ホール」を作成する（ＡＥＭ１．１、表６及び図３を参照）。
配列番号３４は、配列番号３３を有し、Ｃ−末端リジンを欠損している、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６及び図３を参照）。
配列番号３５は、置換Ｔ３６６Ｗを含む配列番号２７を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列であり、「バンプ」又は「ノブ」を作成する（ＡＥＭ１．２、表６及び図３を参照）。
配列番号３６は、配列番号３５を有し、Ｃ−末端リジンを欠損している、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６及び図３を参照）。
配列番号３７は、置換Ｔ３６６Ｗを含む配列番号２９を有するＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列であり、「バンプ」及び「ノブ」を作成する（ＡＥＭ１．２、表６及び図３を参照）。
配列番号３８は、配列番号３７を有し、Ｃ−末端リジンを欠損している、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６及び図３を参照）。
配列番号３９〜９８は、配列番号２７、２８、２９又は３０を有するＩｇＧ１ ＣＨ３に対して１つ以上のＡＥＭ及び／又はジスルフィド結合形成（「ＤｉＳ」）修飾を含むＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのａａ配列である（表６及び図３を参照）。
配列番号９９〜１３２は、連続した配列でアミノ末端からカルボキシル末端に向かう順序で、（ａ）ＩｇＧ１ヒンジ、１つ以上のａａ置換を含むＩｇＧ１ヒンジ、及び部分的なＩｇＧ１ヒンジからなる群から選択されるヒンジ；（ｂ）Ｎ２９７Ｑを含むＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン（配列番号２５）；及び（ｃ）配列番号２９及び、１つ以上のＡＥＭ及び／又はＤｉＳ修飾を含む、配列番号２９からなる群から選択されたＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む、例示的なＩｇＧ１ Ｆｃ領域のａａ配列である（図４）。ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、共有結合的に、介在配列なしで、結合している。配列番号９９〜１３２のそれぞれのドメインの配列番号を、表８に記載する。
配列番号１３３〜１６６は、カルボキシル末端の順序で連続的なアミノ内に、（ａ）ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジ、１つ以上のａａ置換を含むＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジ、部分的なＩｇＧ４ヒンジからなる群から選択されたヒンジ；（ｂ）Ｔ２９９Ｋを含むＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン（配列番号２６）及び、（ｃ）配列番号２９及び１つ以上のＡＥＭ及び／又はＤｉＳ修飾を含む配列番号２９からなる群から選択された、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む、例示的なＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃ領域のａａ配列である。ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、介在配列なしで、共有結合的に結合される。配列番号１３３〜１６６の各ドメインの配列番号を、表９に記載する。
配列番号１６７は、ＫＳＣＤＫＴであり、これは、システインを導入する、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインの例示的な修飾カルボキシ末端部分である。
配列番号１６８は、ＧＥＣであり、これは、システインを導入する、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインの例示的な修飾カルボキシ末端部分である。
配列番号１６９は、例示的な非Ｇｌｙ−Ｓｅｒ ＴＦｃリンカーのａａ配列である。
配列番号１７０〜１９５は、例示的なＩｇＧ１ ＴＦｃのヌクレオチド配列（偶数番号）及びａａ配列（奇数番号）であり、これらを図６に記載する。これらのＩｇＧ１ ＴＦｃのそれぞれを構成するドメインの配列番号を、表１２に記載する。
配列番号１９６〜２２１は、ハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む例示的なＴＦｃのヌクレオチド配列（偶数番号）及びａａ配列（奇数番号）であり、これらを図７に記載する。これらのハイブリッドＴＦｃのそれぞれを構成するドメインの配列番号を、表１３に記載する。
配列番号２２２〜２２３は、それぞれ、シグナルペプチドを含まない、抗−ｃ−Ｍｅｔ Ａｂ ５Ｄ５の重鎖Ｆａｂドメインのヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２２４〜２２５は、それぞれ、抗−ｃ−Ｍｅｔ ５Ｄ５ ＶＨドメイン、ＩｇＧ１ ＴＦｃ（ＡＥＭ１を含む）、及びパニツムマブｓｃＦｖを含む、ＩｇＧ１ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド及びａａ配列である（図９）。
配列番号２２６〜２２７は、それぞれ、抗−ｃ−Ｍｅｔ ５Ｄ５ ＶＨドメイン、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃ（ＡＥＭ１を含む）、及びパニツムマブｓｃＦｖを含む、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド及びａａ配列である（図９）。
配列番号２２８〜２２９は、それぞれ、抗−ｃ−Ｍｅｔ ５Ｄ５ ＶＨドメイン、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃ（ＡＥＭ１を含む）、及びパニツムマブｓｃＦｖを含む、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド及びａａ配列である（図９）。
配列番号２３０及び２３１は、それぞれ、例えば、配列番号２２５、２２７、２２９、２４４又は３４３などのヒト化５Ｄ５抗−ｃ−Ｍｅｔ ＶＨドメインを含む重鎖を用いる、使用のための、ヒト化５Ｄ５抗−ｃ−Ｍｅｔ ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖のヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２３２及び２３３は、パニツムマブの可変領域（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）を含む、抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖのヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２３４及び２３５は、それぞれ、（ａ）ヒト化５Ｄ５由来の抗−ｃ−Ｍｅｔ可変ドメイン、（ｂ）ＡＥＭ１及びＤｉＳ２を含むＴＦｃ（配列番号１８１）及び（ｃ）パニツムマブの可変領域（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）を含む抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ（配列番号２３３）を含む抗−ｃ−Ｍｅｔ／抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖の図９及び図１０に示した、ヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２３６及び２３７は、それぞれ、Ａｂ２２２４の可変領域を含む抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖのヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２３８及び２３９は、それぞれ、（ａ）ヒト化５Ｄ５由来の抗−ｃ−Ｍｅｔ可変ドメイン、（ｂ）ＡＥＭ１及びＤｉＳ２を含むＴＦｃ（配列番号１８１）及び（ｃ）Ａｂ２２２４の可変領域を含む抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ（配列番号２３７）を含む、抗−ｃ−Ｍｅｔ／抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖の図９及び１０に示した、ヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２４０及び２４１は、それぞれ、例示的なシグナルペプチドのヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２４２及び２４３は、それぞれ、例示的なシグナルペプチドのヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２４４及び２４５は、それぞれ、配列番号２４１を有するシグナルペプチドを含む、５Ｄ５及びＣＬドメインの抗−ｃ−Ｍｅｔ ＶＨドメインのヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２４６及び２４７は、配列番号２４３を有するシグナルペプチドを含む配列番号２３１を有する軽鎖のヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２４８〜２５４は、明細書に記載の変異体ヒンジのａａ配列である。
配列番号２５５及び２５６は、それぞれ、配列番号２４１からなり、実施例３に示したシグナルペプチドを含む、抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位２の重鎖Ｆａｂ領域（配列番号２８７）のヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２５７及び２５８は、それぞれ、ヒト化セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）Ｈ１Ｌ１の可変領域を含む抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖのヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２５９及び２６０は、それぞれ、（ａ）ヒト化５Ｄ５由来の抗−ｃ−Ｍｅｔ可変ドメイン、（ｂ）ＡＥＭ１及びＤｉＳ２を含むＴＦｃ（配列番号１８１）及び（ｃ）ヒト化セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）Ｈ１Ｌ１の可変領域を含む抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ（配列番号２５８）を含む、抗−ｃ−Ｍｅｔ／抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖の図９及び１０に示した、ヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号２６１は、完全長野生型ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインのａａ配列である。
配列番号２６２は、完全長野生型ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのａａ配列である。
配列番号２６３、２６４及び２６５は、変異体ｈＩｇＧ１ヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２６６は、野生型マウスＩｇＧ１ヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２６７は、マウスＩｇＧ１／ＩｇＧ２Ａハイブリッドヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２６８及び２６９は、変異体ｈＩｇＧ２ヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２７０は、野生型ｈＩｇＡ２ヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２７１〜２７３は、変異体ｈＩｇＡ２ヒンジのａａ配列である（図２）。
配列番号２７４〜２７９は、ヒト化セツキシマブＡｂｓ Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１及びＨ２Ｌ２の可変ドメインを含むｓｃＦｖｓのヌクレオチド（偶数番号）及びａａ（奇数番号）配列であり、それらは実施例３に記載されている。
配列番号２８０〜２８５は、（ａ）ヒト化５Ｄ５由来の抗−ｃ−Ｍｅｔ可変ドメイン、（ｂ）ヒト化セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）ＡｂｓＨ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１及びＨ２Ｌ２の可変領域を含む抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ（それぞれ配列番号２７５、２７７又は２７９）、及び（ｃ）ＡＥＭ１及びＤｉＳ２を含むＴＦｃ（配列番号１８１）を含む、抗−ｃ−Ｍｅｔ／抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド（偶数番号）及びａａ（奇数番号）配列である（図９）。
配列番号２８６及び２８７は、それぞれ、抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位２の重鎖Ｆａｂドメインのヌクレオチド及びａａ配列であり、実施例３に記載されている。
配列番号２８８及び２８９は、それぞれ、抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位２の軽鎖Ｆａｂドメインのヌクレオチド及びａａ配列であり、実施例３に記載されている。
配列番号２９０及び２９１は、それぞれ、（ａ）抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位２由来の抗−ｃ−Ｍｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン（配列番号２８７）、（ｂ）ＡＥＭ１及びＤｉＳ２を含むＴＦｃ（配列番号１８１）及び（ｃ）ヒト化セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）Ｈ１Ｌ１の可変領域を含む抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ（配列番号２５８）を含む、抗−ｃ−Ｍｅｔ／抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖の図９及び１０に示した、ヌクレオチド及びａａ配列である（図９）。配列番号２９１のａａ配列は、配列番号２６０を有する配列と同じであり、抗−ｃ−Ｍｅｔ結合ドメインは、抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位２のものと置換されている。
配列番号２９２〜３４１は、実施例１及び２において使用され、図１１に示したＴＦｃのヌクレオチド（偶数番号）及びａａ（奇数番号）配列である。
配列番号３４２及び３４３は、それぞれ、抗−ｃ−Ｍｅｔ５Ｄ５ ＶＨドメイン、ＩｇＧ１ ＴＦｃ（反転されたＡＥＭ１及びＤｉＳを含む）及びパニツムマブｓｃＦｖを含む、ＩｇＧ１ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド及びａａ配列である（図９）。
配列番号３４４及び３４５は、それぞれ、配列番号２４３からなり、実施例３に示したシグナルペプチドを含む、抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位２の軽鎖Ｆａｂ領域（配列番号２８９）のヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号３４６及び３４７は、それぞれ、ＩｇＧ１ ＴＦｃ（配列番号１６９を有するＡＥＭ１及び４０ａａＴＦｃリンカーを含む；図９）を含むヒト化５Ｄ５抗−ｃ−Ｍｅｔ及び抗−ＥＧＦＲパニツムマブｓｃＦｖを含む、抗−ｃ−ｍｅｔ／抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号３４８及び３４９は、それぞれ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃ（配列番号１６９を有するＡＥＭ１及び４０ａａＴＦｃリンカーを含む；図９）を含む、ヒト化５Ｄ５抗−ｃ−Ｍｅｔ及び抗−ＥＧＦＲパニツムマブｓｃＦｖを含む、抗−ｃ−ｍｅｔ／抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のヌクレオチド及びａａ配列である。
配列番号３５０は、抗−ＲＯＮ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ２２２４、及びＴＦｃ２３Ｅを含む、抗−ＲＯＮ／抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（配列番号３０３）；図１４。
配列番号３５１は、抗−ＲＯＮ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ２２２４、及びＴＦｃ３９Ｅｇｙ４（３９Ｅグリコ型４）を含む、抗−ＲＯＮ／抗−ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（配列番号３９４）；図１４。
配列番号３５２は、抗−ＲＯＮ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ＣＥＡｓｃＦｖ及びＴｆｃ２３Ｅを含む、抗−ＲＯＮ／抗−ＣＥＡ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（配列番号３０３）；図１４。
配列番号３５３は、抗−ＲＯＮ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ＣＥＡｓｃＦｖ及びＴＦｃ３９Ｅｇｙ４を含む、抗−ＲＯＮ／抗−ＣＥＡ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（配列番号３９４）；図１４。
配列番号３５４は、抗−ＣＥＡ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ｃ−Ｍｅｔ ｓｃＦｖ及びＴＦｃ２３Ｅを含む、抗−ＣＥＡ／抗−ｃＭｅｔ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（配列番号３０３）；図１４。
配列番号３５５は、抗−ＣＥＡ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ＲＯＮｓｃＦｖ及びＴＦｃ２３Ｅを含む、抗−ＣＥＡ／抗−ＲＯＮ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（配列番号３０３）；図１４。
配列番号３５６は、抗−ＣＥＡ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ｃＭｅｔ ｓｃＦｖ及びＴＦｃ３９Ｅｇｙ４を含む、抗−ＣＥＡ／抗−ｓｃＭｅｔ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（配列番号３９４）；図１４。
配列番号３５７〜３５８は、ＴＦｃ野生型ＣＨ２配列及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３ Ｃ−末端システインＫＳＣＤＫＴ：：ＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｗ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＧＥＣのａａ配列及びヌクレオチド配列である；図１７。
配列番号３５９は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ＣＥＡｓｃＦｖ及びＴＦｃ２３Ｅを含む、抗−ｃＭｅｔ／抗−ＣＥＡ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（配列番号３０３）；図１４。
配列番号３６０は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ＣＥＡｓｃＦｖ及びＴＦｃ ３９Ｅｇｙ４を含む、抗−ｃＭｅｔ／抗−ＣＥＡ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列である（配列番号３９４）；図１４。
配列番号３６１は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂ、抗−ＣＤ４４ｓｃＦｖ及びＴＦｃ３９Ｅｇｙ４を含む、抗−ｃＭｅｔ／抗−ＣＥＡＣＤ４４の重鎖のａａ配列である（配列番号３９４）；図１４。
配列番号３６２は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ＣＤ４４ｓｃＦｖ及びＴＦｃ２３Ｅを含む、抗−ｃＭｅｔ／抗−ＣＥＡＣＤ４４の重鎖のａａ配列である（配列番号３０３）；図１４。
配列番号３６３は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ＣＤ４４ｓｃＦｖ及びＴＦｃ２３Ｅを含む、抗−ｃＭｅｔ／抗−ＣＥＡＣＤ４４の重鎖のａａ配列である（配列番号３０３）；図１４。
配列番号３６４は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ＣＤ４４ｓｃＦｖ及びＴＦｃ３９Ｅｇｙ４を含む、抗−ｃＭｅｔ／抗−ＣＥＡＣＤ４４の重鎖のａａ配列である（配列番号３９４）；図１４。
配列番号３６５は、抗−ＣＤ４４重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ｃＭｅｔｓｃＦｖ及びＴＦｃ２３Ｅを含む、抗−ＣＤ４４／抗−抗−ｃＭｅｔの重鎖のａａ配列である（配列番号３０３）；図１４。
配列番号３６６は、抗−ＣＤ４４重鎖Ｆａｂドメイン、抗−ｃＭｅｔｓｃＦｖ及びＴＦｃ３９Ｅｇｙ４を含む、抗−ＣＤ４４／抗−ｃＭｅｔの重鎖のａａ配列である（配列番号３９４）、図１４。
配列番号３６７は、抗−ＣＤ４４ ＡＲＨ６０−１６−２軽鎖のａａ配列である。
配列番号３６８〜３６９は、抗−ｃＭｅｔ抗体オナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）及びＴＦｃ２３軽鎖のａａ配列及びヌクレオチド配列である；図１４。
配列番号３７０〜３７１は、抗−ｃＭｅｔ抗体オナルツズマブ及びＴＦｃ３９重鎖のａａ配列及びヌクレオチド配列である；図１４。
配列番号３７２〜３７３は、抗−ｃＭｅｔ抗体オナルツズマブ及びＴＦｃ２３Ｅ重鎖のａａ配列及びヌクレオチド配列である；図１４。
配列番号３７４〜３７５は、抗−ｃＭｅｔ抗体オナルツズマブ及びＴＦｃ３９Ｅｇｙ４重鎖のａａ配列及びヌクレオチド配列である；図１４。
配列番号３７６〜３７７は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、セツキシマブ抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ及びＴＦｃ２３Ｅを含む、抗−ｃＭｅｔ／抗−ＥＧＦＲのａａ配列及びヌクレオチド配列である（配列番号３０３）；図１４。
配列番号３７８〜３７９は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、パニツムマブ抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ及びＴＦｃ２３Ｅを含む、抗−ｃＭｅｔ／抗−ＥＧＦＲのａａ配列及びヌクレオチド配列である（配列番号３０３）；図１４。
配列番号３８０〜３８１は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、２２２４抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ及びＴＦｃ２３Ｅを含む、抗−ｃＭｅｔ／抗−ＥＧＦＲのａａ配列及びヌクレオチド配列である（配列番号３０３）；図１４。
配列番号３８２〜３８３は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、セツキシマブ抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ及びＴＦｃ３９Ｅｇｙ４を含む、抗−ｃＭｅｔ／抗−ＥＧＦＲのａａ配列及びヌクレオチド配列である（配列番号３９４）；図１４。
配列番号３８４〜３８５は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、パニツムマブ抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ及びＴＦｃ３９Ｅｇｙ４を含む、抗−ｃＭｅｔ／抗−ＥＧＦＲのａａ配列及びヌクレオチド配列である（配列番号３９４）；図１４。
配列番号３８６〜３８７は、抗−ｃＭｅｔ重鎖Ｆａｂドメイン、２２２４抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ及びＴＦｃ３９Ｅｇｙ４を含む抗−ｃＭｅｔ／抗−ＥＧＦＲのａａ配列及びヌクレオチド配列である（配列番号３９４）；図１４。
図１７に開示した配列について、二重下線はヒンジであり、一重下線はＣＨ３ドメインであり、第２の二重下線は第２のヒンジであり、第２の下線は第２のＣＨ３である。
配列番号３８８〜３８９は、ＣＨ２ドメイン中のＮ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｓ：：Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｓアミノ酸変化（下線付き、太字）及びＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＧＥＣを含むグリコシル化変異体１のａａ配列及びヌクレオチド配列であり；図１７。
配列番号３９０〜３９１は、グリコシル化変異体２のａａ配列及びヌクレオチド配列であり、ＣＨ２ドメイン中のＴ２９９Ｋ：Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｓアミノ酸変化（下線付き、太字）及びＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＧＥＣを含む；図１７。
配列番号３９２〜３９３は、ＣＨ２ドメイン中のＮ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｓ：：Ｔ２９９Ｓアミノ酸変化（下線付き、太字）及びＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＧＥＣを含むグリコシル化変異体３のａａ配列及びヌクレオチド配列である；図１７。
配列番号３９４〜３９５は、ＣＨ２ドメイン中のＴ２９９Ｋ：：Ｔ２９９Ｄアミノ酸変化（下線付き、太字）及び、ＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＧＥＣを含む、グリコシル化変異体４のａａ配列及びヌクレオチド配列である；図１７。
配列番号３９６〜３９７は、ＣＨ２ドメイン中のＴ２９９Ｄ：：Ｔ２９９Ｋアミノ酸変化（下線付き、太字）及びＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＧＥＣを含む、グリコシル化変異体５のａａ配列及びヌクレオチド配列である；図１７。
配列番号３９８〜３９９は、ＣＨ２ドメイン中のＴ２９９Ｄ：：Ｔ２９９Ｄアミノ酸変化（下線付き、太字）及びＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＫＳＣＤＫＴ：：Ｔ３６６Ｗ／ＣＨ３Ｃ−末端システインＧＥＣを含む、グリコシル化変異体６のａａ配列及びヌクレオチド配列である；図１７。
本明細書において、例えば、タンデムＦｃ二重特異性抗体（「ＴＦｃＢＡ」）などの、タンデムＦｃ抗体（「ＴＦｃＡ」）を提供する。分子は、例えば、癌などの細胞増殖性障害を治療するために使用することができる。
定義
便宜のため、明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語及び語句の意味を以下に提供する。
「ａａ修飾」又は「ａａ変化」は、ａａ配列への１つ以上のアミノ酸（ａａ）欠失、付加又は置換を意味する。ａａ配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ酸末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のａａ残基の配列内挿入を含む。配列内挿入は、一般的に、例えば、１〜５、例えば１〜３などの、約１〜１０残基の範囲であり得る。
「ＡＥＭ」又は「結合強化修飾」は、他のＣＨ３ドメインとの関連付けを強化するために、ＣＨ３ドメインへなされるａａ修飾を意味する。ＡＥＭは、ＴＦｃの一方又は両方のＦｃｓにおける、１つ以上のａａ置換、欠失又は付加を含み得る。ＡＥＭは、例えば、モジュール１（「ＡＥＭ１」）などのモジュールに分類され、二つのＣＨ３ドメインの内の一つへの修飾は、ＡＥＭ１．１と呼ばれ、他のＣＨ３ドメインへの修飾は、ＡＥＭ１．２と呼ばれる。例えば、ＡＥＭ１．１は、置換Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの組み合わせで構成され、ＡＥＭ１．２は、ａａ置換Ｔ３６６Ｗで構成される。ＣＨ３ドメインが、例えば、ａａ置換などの二つ以上のａａ修飾を含む場合、修飾は「／」により、お互いに分離される。二つのＣＨ３ドメイン内の修飾を参照する場合、ＣＨ３ドメインのそれぞれにおける修飾は、「：：」により分離される。
「アミノ酸置換」は、タンパク質中の一つの特定のアミノ酸（「ａａ」）の別のａａによる置換を指す。置換は、以下に定義するように、保存的置換であり得る。「抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位」は、ヒトｃ−Ｍｅｔへ特異的に結合する結合部位を意味する。「抗−ＥＧＦＲ結合部位」は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する結合部位を意味する。
抗原結合部位がその標的抗原に特異的に結合することを条件として、「抗原結合部位」は、抗体又は少なくとも一つのそのＣＤＲのＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む結合部位を指す。例えば、抗原結合部位は、ＶＨＣＤＲ３のみを又はＶＨＣＤＲ２及び必要に応じてＶＨＣＤＲ１とともに含む、それらから本質的に成る又は構成され得る。特定の実施形態において、抗原結合部位は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、それらは、同じポリペプチド上に存在し得る又は、例えば、ＶＨドメインは重鎖上に存在し、ＶＬドメインは軽鎖上に存在するなど、二つの異なるポリペプチド上に存在し得る。
抗体の「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す（例えば、ｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲ）。抗体の抗原−結合機能は、完全長抗体の断片により保持することができることが示されている。抗体の「抗原−結合部分」という用語内に包含される結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された、二つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含む。更に、ＶＬ及びＶＨは、Ｆｖ断片の二つのドメインであり、ＶＬ及びＶＨは別の遺伝子によりコードされるが、組み換え法を用いて合成リンカーによってそれらを結合することができ、それによってＶＬ及びＶＨ領域対が単一タンパク質鎖となっている単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている一価タンパク質を形成することができる（例えば、米国特許第５，８９２，０１９号を参照）。そのような単鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原−結合部分」内に包含されるものとする。二重特異性抗体などの単鎖抗体の他の形態も包含される。二重特異性抗体は二価の、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現された二重特異性抗体であるが、同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーの使用し、それによって、ドメインに別の鎖の相補性ドメインとの対を形成させ、二つの抗原結合部位を作る。
「結合親和性」は、結合相互作用の強さを指し、実際の結合親和性だけではなく、見かけの結合親和性の両方を含む。実際の結合親和性は、解離速度に対する会合速度の比率である。見かけの親和性は、例えば、多価の相互作用から生じる結合活性も含む可能性がある。解離定数（Ｋｄ）は、典型的には、結合親和性の逆数であり、例えば、分析物として組み換えＥＧＦＲ及びリガンドとして抗−ＥＧＦＲ抗体を用いて、又は細胞結合アッセイを用いるなど、（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００機器（ＧＥヘルスケア）を用いて測定されるように）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、簡便に測定することができ、各アッセイは、米国特許第７，８４６，４４０号の実施例３に記載されている。
「結合部分」、「結合ドメイン」又は「結合部位」は、結合ポリペプチドの一部、領域又は部位を指し、指定された場合には、それらの重鎖又は軽鎖の一部、領域又は部位を指し、それは、標的分子（すなわち、抗原）に対する抗体の特異性結合を媒介する際に、直接関与している。例示的な結合ドメインは、抗原結合部位、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン又は酵素ドメインを含む。好ましい実施形態において、結合ドメインは、抗原結合部位（例えば、別のフレームワーク領域（例えば、ヒトフレームワーク領域は、必要に応じて、１つ以上のａａ置換を含む）内に配置された抗体由来の、可変重（ＶＨ）鎖配列及び可変軽（ＶＨ）鎖配列又は６つのＣＤＲを含む）を含むか、又はそれから構成される。特定の実施形態において、結合部位は、ＶＨ又はＶＬ鎖配列のみから実質的に構成することができる。結合部位は、例えば、一種の生殖系列配列に由来する配列のみを有するなど、完全に一種のみ由来であり得る。例えば、結合部位は、ヒト（すなわち、ヒト種由来）、マウス又はラットであり得る。結合部位はまたヒト化することができる、すなわち、ＣＤＲは、一種由来であり、フレームワーク（ＦＲ）は、別の種由来である。例えば、結合部位は、マウス抗体由来のＣＤＲ及びヒト種由来のＦＲを有し得る。ＣＤＲが、ドナー抗体のＣＤＲにより類似するようにするために、特定のヒト化結合部位は１つ以上のＣＤＲ中に変異を含む。特定のヒト化抗体はまた、１つ以上のＦＲ中に変異を含み得る。一般的に、結合部位における変異は、その標的抗原に対する結合部位の結合親和性を高めることができる、及び／又は、例えば、その半減期を延長するために、結合部位を安定化させることができる。
「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で見つけられた非連続抗原結合部位を指す。これらの特定の領域は、お互いに比較した場合、その定義がａａ残基の重複又はサブセットを含む、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）並びにＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）並びにＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）により記載されている。上記で引用した参考文献のそれぞれによって定義されたＣＤＲを包含するａａ残基は、比較のために記載されている。本明細書において使用されるように、特に指定しない場合は、「ＣＤＲ」は、カバットにより定義される。
「ＣＨ１ドメイン」は、ＶＨドメイン及びヒンジの間に位置する、重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。それは、ＥＵポジション１１８〜２１５にまたがる。ＣＨ１ドメインが所望の生物学的特性を有することを条件として、ＣＨ１ドメインは、天然に存在するＣＨ１ドメイン又は、１つ以上のアミノ酸（「ａａ」）が置換され、加えられ又は削除された天然に存在するＣＨ１ドメインであり得る。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然に存在する配列と比較して、強化された生物学的活性又は低減された生物学的活性であり得る。
「ＣＨ２ドメイン」は、ヒンジ及びＣＨ３ドメインの間に位置する重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。本明細書において定義されたように、それは、ＥＵポジション２３７〜３４０にまたがる。ＣＨ２ドメインが所望の生物学的特性を有することを条件として、ＣＨ２ドメインは、天然に存在するＣＨ２ドメイン又は、１つ以上のａａが置換、付加又は削除されている天然に存在するＣＨ２ドメインであり得る。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然に存在するドメインのものと比較して強化された生物学的活性又は低減された生物学的活性であり得る。
「ＣＨ３ドメイン」は、例えば、ポジション３４１〜４４６ｂ（ＥＵナンバリングシステム）などの、ＣＨ２ドメインのＣ−末端に位置し、ＣＨ２ドメインのＮ−末端から約１１０残基にまたがる、重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。ＣＨ３ドメインが所望の生物学的特性を有することを条件として、ＣＨ３ドメインは、天然に存在するＣＨ３ドメイン又は、１つ以上のａａが置換、付加、削除された天然に存在するＣＨ３ドメインであり得る。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然に存在するドメインのものと比較して強化された生物学的活性又は低減された生物学的活性であり得る。ＣＨ３ドメインは、Ｃ−末端リジンを含み得る又は含まない可能性がある。「ＣＨ４ドメイン」は、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体中においてＣＨ３ドメインのＣ−末端に位置する重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。ＣＨ４ドメインが所望の生物学的特性を有することを条件として、ＣＨ４ドメインは、天然に存在するＣＨ４ドメイン又は、１つ以上のａａが置換、付加又は削除された天然に存在するＣＨ４ドメインであり得る。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然に存在するドメインのものと比較して強化された生物学的活性又は低減された生物学的活性であり得る。
「ＣＬドメイン」は、ＶＬドメインのＣ−末端に位置する軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。それは、カバットポジション１０７Ａ〜２１６にまたがる。ＣＬドメインが所望の生物学的特性を有することを条件として、ＣＬドメインは、天然に存在するＣＬドメイン又は、ａａが置換、付加又は削除された天然に存在するＣＬドメインであり得る。所望の生物学的活性は、天然の生物学的活性、天然に存在するドメインのものと比較して強化された生物学的活性又は低減された生物学的活性であり得る。ＣＬドメインは、Ｃ−末端リジンを含み得る又は含まない可能性がある。
「ｃ−Ｍｅｔ」又は「ｃ−ＭＥＴ」は、間葉上皮転換（ＭＥＴ）因子であり、これはまた、遺伝子番号４２３３に対応する、幹細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、分散因子（ＳＦ）受容体、ＡＵＴＳ９、ＲＣＣＰ２としても知られており、チロシン−キナーゼ活性を有する。一次単鎖前駆体タンパク質は、α及びβサブユニットを生成するために、翻訳後に切断され、これは、成熟した受容体を形成するためにジスルフィド結合している。異なるアイソフォームをコードする二つの転写変異体が、この遺伝子について発見されている。ＨＧＦは、ｃ−Ｍｅｔについての唯一の既知のリガンドである。ヒトｃ−Ｍｅｔアイソフォームａ前駆体のａａ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１２０９７２．１で提供され、アイソフォームｂ前駆体は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００２３６．２で提供される。
「保存的置換」又は「保存的アミノ酸置換」は、それぞれの置換前ａａ残基について、タンパク質又はペプチド中の１つ以上のａａ残基の、そのような特定のａａ残基がそのような特定の置換ａａで置換されているタンパク質もしくはペプチドの確認又は機能のいずれかを変化させる可能性が低いことが知られている、特定の置換ａａとの置換を意味する。そのような保存的置換は、典型的に、１つのａａを、第１のａａの電荷及び／又はサイズが類似しているａａで置換することを含み、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）のいずれかを相互に置換すること、アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換すること及びその逆、グルタミン（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）に置換すること及びその逆、並びに、セリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）に置換すること及びその逆を含む。他の置換は、特定の配列又は構造環境において、保存的であることが当該技術分野で知られている。例えば、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は、アラニン及びバリン（Ｖ）であり得るように、保存的置換を得るために、しばしば互いに置換することができる。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、ロイシン又はイソロイシン及び時にはバリンに頻繁に保存的に置換することができる又は、保存的に置換される。リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、ａａ残基の重要な特徴はその電荷であり、これらの二つの塩基性ａａ残基の異なるｐＫ’が有意であると予想されていない場所で頻繁に交換可能である。そのような置換の効果は、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２００及びＰＡＭ２５０などの置換スコアマトリックスを用いて計算することができる。例えば、同様の疎水性特徴（例えば、膜貫通ドメイン）を有する領域全体の置換などの、他のそのような保存的置換は、周知である。
免疫グロブリンの軽鎖の「定常領域」又はドメインは、「ＣＬ」、「軽鎖定常領域ドメイン」、「ＣＬ領域」又は「ＣＬドメイン」として、互換的に呼ばれている。免疫グロブリンの重鎖上の定常ドメイン（例えば、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン）は、「ＣＨ」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域又は「ＣＨドメイン」として互換的に呼ばれる。免疫グロブリン軽鎖上の可変ドメインは、「ＶＬ」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ領域」又は「ＶＬドメイン」として互換的に呼ばれる。免疫グロブリン重鎖上の可変ドメインは、「ＶＨ」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ領域」又は「ＶＨドメイン」として互換的に呼ばれる。
「ＤｉＳ」は、例えば、ヒンジ又はＣＨ３ドメインなどのドメインの修飾を指し、システインの付加をもたらし、別のシステインとジスルフィド結合を形成することができる。ＤｉＳは、ＴＦｃの一つ又は両方のＦｃｓ中に、１つ以上のａａ置換、削除又は付加を含み得る。ＤｉＳは、例えば、モジュール１（「ＤｉＳ１」）などのモジュールに分類され、二つのＦｃの内の一つへの修飾は、ＤｉＳ１．１と呼ばれ、他のＦｃへの修飾は、ＤｉＳ１．２と呼ばれる。例えば、ＤｉＳ１．１は、置換Ｙ３４９Ｃで構成され、ＤｉＳ１．２は、置換Ｓ３５４Ｃで構成される。
「ドメイン」は、例えば、β−プリーツシート及び／又は鎖内ジスルフィド結合により安定化することができる、ペプチドループ（例えば、１〜４個のペプチドループ）を含み得る、重鎖又は軽鎖ペプチドの、例えば、独立して折りたたむ球状領域又は非球状領域（例えば、リンカードメイン）などの領域を一般的に指す。免疫グルブリン重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域は、典型的には、ドメインへ折りたたまれる。具体的には、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、ＣＬ、ＶＨ及びＶＬドメインのそれぞれは、典型的にループ構造を形成する。
「ＥＣ５０」又は「ＥＣ５０」は、結合アッセイ又はシグナル伝達経路などの、特定のシステム上のタンパク質の最大効果の５０％を提供する、例えばＴＦｃＡなどの分子の濃度を示す。
「ＥＧＦＲ」は、上皮増殖因子受容体を指し、これはまた、ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ−１、ｍＥＮＡ及びＰＩＧ６１としても知られている。ＥＧＦＲは、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧｆ−α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、エピレグリンを含むリガンドへ結合することが知られており、遺伝子番号１９５６を有する（Ｈｅｒｂｓｔ， Ｒ． Ｓ．， ａｎｄ Ｓｈｉｎ， Ｄ． Ｍ．， Ｃａｎｃｅｒ ９４ （２００２） １５９３−１６１１；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ， Ｊ．， ａｎｄ Ｂａｓｅｌｇａ， Ｊ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９ （２０００） ６５５０−６５６５）。ＥＧＦＲは、細胞の増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管形成、有糸***及び転移を制御する、シグナル伝達経路の活性化を含むがそれに限定されない、チロシン−キナーゼ媒介シグナル伝達経路を介して、多数の細胞プロセスを調節する、タンパク質キナーゼスーパーファミリーのメンバーである、膜貫通糖タンパク質である（Ａｔａｌａｙ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４（２００３）１３４６−１３６３；Ｔｓａｏ，Ａ．Ｓ．，ａｎｄ Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．，Ｓｉｇｎａｌ ４（２００３）４−９；Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ Ｓｈｉｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ ９４ （２００２） １５９３−１６１１；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７３ （１９９６） ２２８−２３５）。ＥＧＦＲへのリガンドの結合は、受容体の二量体化及びチロシン自己リン酸化を誘導し、細胞増殖につながる。異なるタンパク質アイソフォームをコードする複数の選択的スプライシングした転写変異体が、この遺伝子について見出されている。ヒトＥＧＦＲアイソフォームａ〜ｄ前駆体についてのａａ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５２１９．２、ＮＰ＿９５８４３９．１、ＮＰ＿９５８４４０．１及びＮＰ＿９５８４４１．１で提供する。
「ＥｒｂＢ２」又は「ＨＥＲ２」は、ＥＧＦ受容体に類似の、推定のチロシンキナーゼ成長因子受容体ＥＧＦＲ２、ｐ１８５ＨＥＲ２／ＮＥＵ抗原を指す。ＥｒｂＢ２アイソフォームについてのａａ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４３９．２及びＮＰ＿００１００５８６２．１で提供され、ヌクレオチド配列は、遺伝子番号２０６４を有する。
「ＥｒｂＢ３」又は「ＨＥＲ３」は、ヒトＥＲＢＢ３遺伝子によりコードされ、タンパク質アミノ酸リン酸化の役割を有する、受容体チロシン−タンパク質キナーゼを指す。ＥｒｂＢ３アイソフォームについてのａａ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１９７３．２及びＮＰ＿００１００５９１５．１で提供され、ヌクレオチド配列は、遺伝子番号２０６５を有する。
「ＥｒｂＢ４」又は「ＨＥＲ４」は、細胞増殖及び分化を調節する、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達における役割を果たす。ＥｒｂＢ３アイソフォームについてのａａ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１９７３．２及びＮＰ＿００１００５９１５．１で提供され、ヌクレオチド配列は、遺伝子番号２０６６を有する。
ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３及びＥＲＢＢ４遺伝子は、ヘレグリン／ニューレグリン受容体、ＥＧＦＲ関連型Ｉ受容体チロシンキナーゼサブファミリーのメンバーをコードする。コードされたタンパク質は、ホモ及びヘテロ二量体を形成し、これは、機能の割り当てを複雑にし、ＥＲＢＢ２ホモ二量体はヘレグリンを結合しないが、ＥＲＢＢ２／ＥＲＢＢ３ヘテロ二量体はする。ヘルスタチンは、細胞外ドメインの分泌された代替ＥＲＢＢ２生成物であり、ｐ１８５ＥＲＢＢ２へ結合し、ＥＲＢＢ２二量体を破壊し、ｐ１８５リン酸化を減少させ、増殖を阻害する。ヒトＥＲＢＢ２遺伝子は、１７ｐ１２〜２１に位置する。ＨＥＲ−２の過剰発現は、乳癌における予後不良と相関している。
「ＩＧＦ１Ｒ」は、インスリン様増殖因子１受容体を指す。例示的なヒトＩＧＦ１Ｒ核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号３４８０及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００８６６．１中に記載されている。
「ＩＧＦ２Ｒ」は、インスリン様増殖因子２受容体を指す。例示的なヒトＩＧＦ２Ｒ核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号３４８２及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００８６７．２中に記載されている。
「インスリン受容体」は、インスリンについての細胞受容体を指す。例示的なヒトインスリン受容体核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号３６４３及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００１９９．２中に記載されている。
「ｃ−ＭＥＴ」は、幹細胞増殖因子についての受容体を指す。例示的なヒトｃ−Ｍｅｔ核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号４２３３及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１２０９７２．１中に記載されている。
「ＲＯＮ」は、マクロファージ刺激タンパク質受容体についての受容体を指す。例示的なヒトＲＯＮ核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号４４８６及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２４３８．２中に記載されている。
「ｃ−Ｋｉｔ」は、ｖ−ｋｉｔハーディ−ズッカーマン４ネコ科肉腫ウイルス癌遺伝子相同体を指す。例示的なヒトｃ−Ｋｉｔ核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号３８１５及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０８７２４１．１中に記載されている。
「ＶＥＧＦＲ１」は、血管内皮増殖因子１を指す。例示的なヒトＶＥＧＦＲ１核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号２３２１及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２０１０．２中に記載されている。
「ＶＥＧＦＲ２」は、血管内皮増殖因子２を指す。例示的なヒトＶＥＧＦＲ２核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号３７９１及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２２４４．１中に記載されている。
「ＴＮＦＲ」は、腫瘍壊死因子受容体を指す。例示的なヒトＴＮＦＲ核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号７１３２及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０５６．１中に記載されている。
「ＦＧＦＲ１」は、線維芽細胞増殖因子受容体１を指す。例示的なヒトＦＧＦＲ１核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号２２６０及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１６７５３７．１中に記載されている。
「ＦＧＦＲ２」は、線維芽細胞増殖因子受容体２を指す。例示的なヒトＦＧＦＲ２核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号２２６３及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１３８３９０．１中に記載されている。
「ＦＧＦＲ３」は、線維芽細胞増殖因子受容体３を指す。例示的なヒトＦＧＦＲ３核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号２２６１及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００１３３．１中に記載されている。
「ＦＧＦＲ４」は、線維芽細胞増殖因子受容体４を指す。例示的なヒトＦＧＦＲ４核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号２２６４及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０７５２５２．２中に記載されている。
「ＰＤＧＦＲ−α」は、血小板由来の増殖因子受容体αを指す。例示的なヒトＰＤＧＦＲ−α核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号５１５６及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６１９７．１中に記載されている。
「ＰＤＧＦＲ−β」は、血小板由来の増殖因子受容体βを指す。例示的なヒトＰＤＧＦＲ−β核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号５１５９及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２６００．１中に記載されている。
「ＥｐＣＡＭ」は、上皮細胞接着分子を指す。例示的なヒトＥｐＣＡＭ核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号４０７２及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２３４５．２中に記載されている。
「ＥｐｈＡ２」は、ＥＰＨ受容体Ａ２を指す。例示的なヒトＥｐｈＡ２核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号１９６９及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４２２．２中に記載されている。
「ＣＥＡ」は、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５を指す。例示的なヒトＣＥＡ核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号１０４８及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４３５４．２中に記載されている。
「ＣＤ４４」は、細胞表面糖タンパク質ＣＤ４４を指す。例示的なヒトＣＤ４４核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号９６０及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１８９４８６．１中に記載されている。
「ＡＬＫ」は、未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼを指す。例示的なヒトＡＬＫ核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号２３８及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４２９５．２中に記載されている。
「ＡＸＬ」は、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼを指す。例示的なヒトＡＸＬ核酸及びタンパク質配列は、それぞれ、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ遺伝子番号５５８及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６８７１３．２中に記載されている。
「ＥＵ」は、重鎖定常領域中のａａ位置を指し、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン中のａａ位置を含み、ＥＵインデックス番号付けシステムにしたがって本明細書において番号が付けられている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１を参照）。
「Ｆａｂ」は、抗体の抗原結合部分を指し、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む第１の鎖並びにＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む第２の鎖の二つの鎖を含む。Ｆａｂは、パパインで処理し、ヒンジ領域の一部を含む抗体のＮ−末端断片として典型的に記載されているが、それはまた、重鎖がヒンジの一部を含まない、結合ドメインを指すものとして本明細書中で使用される。
「Ｆｃ領域」は、パパイン切断部位のちょうど上流のヒンジ領域内で始まって（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として、ＩｇＧ内の残基２１６）、抗体のＣ末端で終わる、単一免疫グロブリン重鎖の一部をいう。したがって、完全なＦｃ領域は、少なくともヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。二量体化される２つのＦｃ領域は、「Ｆｃ」又は「Ｆｃ二量体」と呼ばれる。Ｆｃ領域が所望の生物学的性状を有するならば、Ｆｃ領域は天然起源のＦｃ領域、或いは１つ以上のアミノ酸が置換、付加、又は欠失されている天然起源のＦｃ領域であってもよい。所望の生物活性は、天然起源ドメインのそれと比べて、自然な生物活性、増強した生物活性又は低下した生物活性であり得る。
「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」又は「ＦＲ領域」は、可変領域の一部であるが、ＣＤＲの一部でない（例えば、ＣＤＲのカバット定義を用いて）アミノ酸残基を含む。したがって、可変領域フレームワークは、長さが約１００〜１２０個のアミノ酸であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸のみを含む。重鎖可変領域の特定の例及びＣＤＲについて、Ｋａｂａｔら、１９９１（前記の個所）によって定義されたように、フレームワーク領域１は１〜３０個のアミノ酸を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域２は３６〜４９の数のアミノ酸を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域３は６６〜９４アミノ酸を包含する可変領域のドメインに対応し、及びフレームワーク領域４は１０３アミノ酸からその可変領域の最後までの可変領域のドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域は、軽鎖可変領域ＣＤＲの各々によって、同じように分離される。同様に、Ｃｈｏｔｈｉａら、又はＭｃＣａｌｌｕｍらによるＣＤＲの定義を用いて、フレームワーク領域の境界は、上述のようにそれぞれのＣＤＲ末端で分離される。好適な実施形態において、ＣＤＲはカバットによって定義された通りである。
「全長抗体」又は「全長Ａｂ」は、任意に結合され得る１つ以上の重鎖及び１つ以上の軽鎖を含む抗体（Ａｂ）である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略される）及び重鎖定常領域で構成されている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインと、任意に４番目のドメイン、ＣＨ４とで構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略される）及び軽鎖定常領域で構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成されている。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、更に、相補性決定領域（complementarity determining region）（ＣＤＲ）と名付けられた超可変性の領域と共に散在するフレームワーク領域（framework region）（ＦＲ）と名付けられたより保存されている領域に細区画されることができる。ＶＨ及びＶＬの各々は、典型的に、アミノ末端からカルボキシル末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成されている。免疫グロブリンタンパク質は、任意のタイプ又はクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）であり得る。
「Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー」又は「Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチド」は、グリシン及びセリンの残基からなるペプチドを呼ぶ。例示的なＧｌｙ−Ｓｅｒペプチドは、ａａ配列（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上である。特定の実施形態において、ｎは１と５の間の数であり、ｎは６と１０の間の数であり、ｎは１１と１５の間の数であり、ｎは１６と２０の間の数であり、ｎは２１と２５の間の数であり、又はｎは２６と３０の間の数である。
「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「ヒンジドメイン」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する重鎖の可動部分をいう。ヒンジは、およそ２５個のアミノ酸の長さで、「上部ヒンジ」、「中央ヒンジ」又は「コアヒンジ」、及び「下部ヒンジ」に分割される。ヒンジが所望の生物学的性状であるならば、ヒンジは天然起源、或いは１つ以上のアミノ酸が置換、付加、又は欠失されている天然起源のヒンジであってもよい。所望の生物活性は、天然起源配列のそれと比へて、自然な生物活性、増強した生物活性又は低下した生物活性であり得る。
「ヒンジサブドメイン」は、上部ヒンジ、中央（もしくはコア）ヒンジ又は下部ヒンジをいう。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のヒンジサブドメインのａａ配列を表２に記載する。
全ヒンジは、アミノ末端からカルボキシ末端への順に、上部ヒンジサブドメイン、中央ヒンジサブドメイン及び下部ヒンジサブドメインからなり、介在配列を含まない。
「ＩＣ５０」又は「ＩＣ５０」は、最大活性（例えば、刺激又は恒常的活性への応答）の５０％阻害をもたらす、すなわち、最大活性とベースラインとの間の中間のレベルまで活性を減少させる、例えばＴＦｃＡなどの分子の濃度を示す。ＩＣ５０値は、例えば、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を用いて、絶対阻害定数（Ｋｉ）に変換されることができる。本明細書に示す抗体又はＴＦｃＡなどの結合剤によって阻害される系において、ＩＣ５０はＥＣ５０と区別がつかないこともある。
結合タンパク質による生物活性の「阻害」は、結合タンパク質によって仲介される生物活性における、いずれの再現性よく検出できる減少をいう。一部の実施形態において、阻害は生物活性における統計的に有意な減少、例えば、結合タンパク質の非存在で決定された生物活性と比べて、例えば約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％。８０％、９０％又は１００％の減少、をもたらす。
ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はタンパク質に関して「単離された」とは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はタンパク質がそれもしくはその類似体と共に自然界に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、又は他の巨大分子から実質的に除去されることを意味する。用語「単離された」は、特定の純度を必要とすることを目的としないが、一般的には、タンパク質の純度は少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０%、より好ましくは少なくとも約８５%、より好ましくは少なくとも約９０%、更により好ましくは少なくとも９５%、及び最も好ましくは少なくとも約９９%である。特定の実施形態において、ＴＦｃＡ、例えばＴＦｃＢＡは、単離されたＴＦｃＡである。特定の実施形態において、ＴＦｃＡは、モノクローナルＴＦｃＡである。
免疫グロブリンａａ配列位置の指摘と関連して「カバット」は、軽鎖定常領域内（例えばＣＬドメイン）のアミノ酸の位置がカバットインデックス番号付け系（Ｋａｂａｔら、１９９１、前掲書を参照されたい）により番号を付けられていることを示す。
本文中で「に結合された」とは、アミノ酸又はヌクレオチドの直接的又は間接的な結合又は連結をいう。「間接的な結合」とは、例えば、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを含むリンカー又はドメインによって仲介される結合をいう。２つのポリペプチドセグメントを参照する場合、「直接的な結合」又は「直接的に結合される」とは、この２つのポリペプチドセグメント間の共有結合の存在をいう、例えば、この２つのポリペプチドセグメントが介在配列なしに隣接して結合されている。
「リンカー」とは、２つのドメイン又は領域を一緒に結合している１つ以上のアミノ酸をいう。リンカーは、該リンカーによって結合されるドメインが適切な３次構造を形成することを可能にし、それによってドメインが必要な生物活性を有することを可能にするよう可動性であり得る。ｓｃＦｖのＶＨとＶＬを結合するリンカーは、本明細書では「ｓｃＦｖリンカー」という。ＶＨドメインのＮ末端又はＣＨ３ドメインのＣ末端を第２のＶＨドメイン又はＶＬドメイン（例えば、ｓｃＦｖのそれ）に結合するリンカーは、「結合リンカー」と呼ぶ。
「モジュール」とは、結合部位（例えば、ｓｃＦｖドメイン又はＦａｂドメイン）及びＴＦｃなどのＴＦｃＡの構造的に及び／又は機能的に区別できる部分をいう。本明細書に示すモジュールは、種々のＴＦｃＡ（例えば本明細書に開示される）を生成するために、他のモジュールとの多数の組み合わせで、（核酸を組み換えることによって、又は新規のポリヌクレオチドの完全もしくは小部分の新規合成によってのいずれかで、モジュールをコードする配列を組み換えることによって）再編成させることができる。また、「モジュール」を用いて、ＡＥＭ又はＤｉＳ修飾の種類をいう。本脈絡において、及び本明細書に更に説明するように、「モジュール」は、これらの修飾を含むＦｃ領域の結合又は二量体化を増強又は支持するように行われる、２つ以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失のうちの１つもしくは組み合わせである。
「パーセント同一」又は「％同一」とは、最大一致を求めて２つの配列を整列させて比較する場合、同じである（１００％同一）又は特定パーセンテージのヌクレオチドもしくは同じアミノ酸残基を有する２つ以上の核酸又はポリペプチドの配列もしくはサブ配列をいう。最大一致を求めて整列させるために、ギャップが比較される配列の１つに導入されることもある。次いで、対応する位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較されて、定量化される。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同じ残基によって占められている場合、これらの配列はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である（例えば、％同一性＝同一位置の＃／位置の総＃（例えば、重複する位置）×１００）。特定の実施形態において、これらの２つの配列は、同じ長さである。１つの配列が別の配列と％同一であると測定される決定は、数学的アルゴリズムを用いて決定されることができる。２つの配列のそのような比較のために利用される数学的アルゴリズムの非限定例は、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。例えば、ａａ配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を用いてもよい。配列分析のための付加的なアルゴリズムは、当技術分野で周知であり、オンラインで利用できるものが多い。
参照部分の「部分」又は「断片」（例えばドメイン）とは、全参照部分の個別部分（例えば、ドメイン、例えば天然起源のドメイン）をいい、参照部分のサイズの少なくとも、又は最大限でも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％である。
「ｓｃＦｖリンカー」とは、ｓｃＦｖのＶＬドメインとＶＨドメインとの間に挿入されたペプチドドメイン又はポリペプチドドメインをいう。ｓｃＦｖリンカーは、好ましくは、抗原結合立体構造中のＶＬドメイン及びＶＨドメインの配向を可能にする。一実施形態において、ｓｃＦｖリンカーは、グリシン及びセリンだけを含むペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーを含む、又はこれらのリンカーからなる（「Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー」）。特定の実施形態において、ｓｃＦｖリンカーは、ジスルフィド結合を含む。
２つ以上のポリペプチド配列と関連して「類似性」又は「パーセント類似性」とは、最大一致を求めて比較されかつ整列される場合、同一である又は保存的に置換されている特定パーセンテージのａａ残基を有する２つ以上の配列又はサブ配列をいう。例として、第１のａａ配列中に含まれる数と同じ数のアミノ酸と比較して、又は当技術分野で既知のコンピュータ類似性プログラムによって整列されたポリペプチドのアライメントと比較して、第１のａａ配列が、第２のａａ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％も同一である、もしくは保存的に置換されている場合、第１のａａ配列は第２のａａ配列と類似していると考えられる。これらの用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列にも適用できる。
結合部位のその標的エピトープ、又は複数の結合部位の組み合わせのそれらの標的エピトープとの結合参照する場合、「特異的結合」、「特異的に結合する」、「選択的結合」、及び「選択的に結合する」、並びに「特異的に結合する」、「選択的に結合する」とは、結合部位が標的エピトープへの免疫特異的結合を示すことを意味する。エピトープに特異的に結合する結合部位は、標的エピトープに対して明らかな親和性を示し、かつ通常、結合部位がいずれの無関係のエピトープに対して明らかな親和性を示さない他のエピトープとの交差反応性を示すことはなく、及び標的エピトープに対する親和性と等しい、該親和性よりも大きい、又は２桁以内で低いいずれの無関係のエピトープに対して明らかな親和性を示さないことが好ましい。「明らかな」又は好ましい結合とは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍの解離定数（Ｋｄ）又は更に低いＫｄ値での結合を含む。Ｋｄ（解離定数）の低い値は、より高い結合親和性を示し、したがって１０−７ＭのＫｄは、１０−８ＭのＫｄよりも高いＫｄ値であるが、１０−８ＭのＫｄよりも低い結合親和性を示すことに留意されたい。約１０−７Ｍの値及び約１０−８Ｍまで低い値の解離定数は、治療用抗体に適している解離定数の上限である。結合親和性は、解離定数の範囲、例えば、１０−６〜１０−１２Ｍ、１０−７〜１０−１２Ｍ、１０−８〜１０−１２Ｍ又は更によい値（すなわち、より低い値の解離定数）によって示され得る。ナノモル（１０−９Ｍ）からピコモル（１０−１２Ｍ）範囲内又はより低い解離定数は、通常、治療用抗体にとって最も有用である。適切な解離定数は、５０ｎＭ以下のＫｄ（すなわち、５０ｎＭ又はより高い結合親和性−例えば４５ｎＭのＫｄ）又は４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭもしくは１ｐＭ以下のＫｄである。特異的結合又は選択的結合は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析及び／又は競合的結合アッセイを含む、そのような結合を決定するための当技術分野で承認されているいずれの方法によって決定されることができる。
「ＴＦｃ」又は「タンデムＦｃ」とは、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、第１のＦｃ領域、そのＣ末端でＮ末端に結合されるＴＦｃリンカー、そのＣ末端でＮ末端に結合される第２のＦｃ領域を含み、第１及び第２のＦｃ領域が結合して１つのＦｃを形成する、実体をいう。
「ＴＦｃＡ」とは、タンデムＦｃ抗体をいう。ＴＦｃＡは、例えば、単一結合部位を含む一価又は単一特異的ＴＦｃＡであり得る。ＴＦｃＡは、二重特異性ＴＦｃＡでもあり得、本明細書ではＴＦｃＢＡという。ＴＦｃＡは、モノクローナルであってもよい。
「ＴＦｃＢＡ」とは、タンデムＦｃ二重特異性抗体をいい、少なくとも２つの異なる結合部分又はドメイン、したがって少なくとも２つの異なる結合部位（例えば、２つの異なる抗体結合部位）を含む人工ハイブリッドタンパク質であり、複数の結合部位のうちの１つ以上が、例えばペプチド結合を介して互いに共有結合されている。本明細書に記述されている例示的なＴＦｃＢＡは、抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡであり、これはｃ−Ｍｅｔタンパク質（例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質）に特異的に結合する第１の結合部位と、ＥＧＦＲタンパク質（例えば、ヒトＥＧＦＲタンパク質）に特異的に結合する１つ以上の第２の結合部位とを含む多価の二重特異性抗体である。ＴＦｃＢＡの名称にプラス記号（＋）によって分離された２つの抗原が含まれている場合、これは２つの抗原に対する結合部位が、分子中のカルボキシ配向に関連するアミノ末端がいずれかにあり得ることを示すのに対して、ＴＦｃＢＡの名称にスラッシュ（／）で分離された２つの抗原結合部位名が含まれている場合、スラッシュの左側の抗原結合部位は、スラッシュの右側の抗原結合部位へのアミノ末端である。ＴＦｃＢＡは、二価結合タンパク質、三価結合タンパク質、四価結合タンパク質又は４を超える結合部位を有する結合タンパク質であり得る。例示的なＴＦｃＢＡは、二価の二重特異性抗体、すなわち、２つの結合部位を有し、各々が異なる抗原又はエピトープに結合する抗体である。特定の実施形態において、ＴＦｃＢＡのＮ末端結合部位はＦａｂであり、Ｃ末端結合部位はｓｃＦｖである。
タンデムＦｃ抗体
本明細書では、一価又は多価、例えば、二価、三価又は四価であり得る、タンデムＦｃ抗体（Tandem Fc Antibody）（「ＴＦｃＡ」）が提供される。多価であるＴＦｃＡは、単一特異性、二重特異性（「タンデムＦc二重特異性抗体」又は「ＴＦｃＢＡ」）、三重特異性又は四重特異性のＴＦｃＢＡであり得る。ＴＦｃＢＡが多重特異性である場合、ＴＦｃＢＡは１つ以上の特異性に対して一価であり得る。
特定の実施形態において、ＴＦｃＡはＴＦｃＢＡである。例示的なＴＦｃＢＡは、ＴＦｃＢＡが標的とする受容体の１つ又は両方を介して、リガンド誘導シグナル伝達を阻害し、それによって腫瘍細胞増殖又は腫瘍成長を阻害し得る。また、ＴＦｃＢＡは、受容体ダウンレギュレーションを誘導し得る、又は受容体二量体化を阻止し得る。例示的な抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡは、単一抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位（抗ｃ−Ｍｅｔに対して一価）と、１つ以上の抗ＥＧＦＲ結合部位（抗ＥＧＦＲに対して一価又は多価）とを含む。ＴＦｃは、一般的に、ＴＦｃリンカーを介して第２のＦｃ領域に結合した第１のＦｃ領域を含み、第１及び第２のＦｃ領域は二量体化して一つのＦｃを形成する。
図１は、例示的なＴＦｃＢＡの略図であり、分子の種々のエレメントを示している。この図に示すように、ＴＦｃＢＡは、第１の結合部位（例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂ）、第２の結合部位（例えば、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ）、及び第１の結合部位と第２の結合部位を結合するタンデムＦｃ（「ＴＦｃ」）を含む。ＴＦｃＢＡは、３つのモジュールを含有すると記述されることもあり、第１のモジュールは第１の結合部位を含み、第２のモジュールはＴＦｃを含み、及び第３のモジュールは第２の結合部位を含む。ＴＦｃは、通常、隣接するａａ配列中に第１のＦｃ領域と、ＴＦｃリンカーと、第２のＦｃ領域とを含み、ＴＦｃリンカーが第１のＦｃ領域を第２のＦｃ領域に結合して、これら２つのＦｃ領域の結合を可能にする。図１に示す例示的なＴＦｃＢＡに図示するように、ＴＦｃの２つのＦｃ領域の各々は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み得る。これらの領域の各々は、同じ免疫グロブリンアイソタイプに由来する、又は異なるアイソタイプに由来することもある。例えば、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインのすべては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来することもあり、又はそのいくつかのドメインもしくは部分は１つの免疫グロブリンアイソタイプに由来することもあり、及び別のドメインもしくは部分は別の免疫グロブリンアイソタイプに由来することもある。例えば、図１に図示されるＴＦｃＢＡは、ＩｇＧ１に由来するドメインをすべて含む、又はその代わりに、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４のハイブリッドヒンジ、ＩｇＧ４ＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ１ＣＨ３ドメインを含み得る。Ｆｃ領域は、好ましくは、ヒトＦｃドメインを含むが、しかしＴＦｃＢＡがその生物活性を保持し、かつ好ましくはヒト対象において著しく免疫原性でないならば、他の哺乳類又は動物に由来する配列も用いられてよい。
好適な実施形態において、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、それらの結合を増強するため、及び／又はそのような結合を安定させるために、１つ以上の修飾を含む。特定の実施形態において、ＴＦｃＡの第１及び／又は第２のＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメイン又はそのようなドメインを含むＦｃの結合を増強するために１つ以上の修飾を含む。そのような修飾は、本明細書では結合強化修飾（Association Enhancing Modification）、又は「ＡＥＭ」と呼ぶ。例示的な修飾は、それらの相互作用（例えばノブ／ホールの変異）を増強するために、両ＣＨ３ドメインにアミノ酸置換を含む。
特定の実施形態において、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、１つ以上のシステインのＦｃ領域への付加をもたらし、それによってＴＦｃの他のＦｃ領域とジスルフィド結合を形成するアミノ酸修飾を含む。そのような修飾を本明細書ではジスルフィド形成修飾（disulfide forming modification）又は「ＤｉＳ」修飾と呼ぶ。Ｄｉｓ修飾は、ヒンジ、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインに存在し得る。
ＴＦｃは、１つ以上のＡＥＭ修飾及び／又は１つ以上のＤｉｓ修飾を含み得る。図１Ｂは、ＣＨ３領域又はヒンジ領域のいずれかになされ得る例示的な修飾を示す。また、Ｆｃ領域は、更なる修飾、例えば、ＡＤＣＣなどのＦｃ領域を介して仲介される生物活性を調節する修飾を含み得る。
通常、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むが、特定の実施形態においてＦｃ領域はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインを含み得るが、ヒンジは含まない。別の実施形態において、Ｆｃ領域はＣＨ３ドメイン及びヒンジを含むが、ＣＨ２ドメインを含まない。別の実施形態において、Ｆｃ領域はＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインを含み得るが、ＣＨ２ドメインもヒンジも含まない。別の実施形態において、Ｆｃ領域はＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＣＨ２ドメインを含み得るが、ヒンジを含まない。別の実施形態において、Ｆｃ領域はＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ヒンジを含み得るが、ＣＨ２ドメインを含まない。特定の実施形態において、１つ以上のドメインの一部が欠けている。
特定の実施形態において、第１のＦｃ領域は、１つ以上のアミノ酸付加、欠失又は置換によって第２のＦｃ領域のａａ配列と異なるａａ配列を含む（「ヘテロ二量体Ｆｃ」）。これは、通常、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域に異なる修飾を導入するＡＥＭ及びＤｉｓ修飾に当てはまる。別の実施形態において、第１のＦｃ領域は、第２のＦｃ領域と同じａａ配列を含む（「ホモ二量体Ｆｃ」）。
特定の実施形態において、Ｆｃドメイン（ヒンジ、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメイン）は、別のＦｃドメインに直接結合される。例えば、ヒンジはＣＨ２ドメインに直接結合され、及び／又はＣＨ２ドメインはＣＨ３ドメインに直接結合され得る。別の実施形態において、これらのドメインを含むＴＦｃＡが所望の生物活性と安定性及び任意の他の所望の特性を有するならば、Ｆｃドメインは、１つ以上のアミノ酸長であり得るリンカーを介して別のＦｃドメインに結合される。
特定の実施形態において、結合部位は、例えば、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合部位である。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、通常、３つの相補性決定領域（Complementarity Determining Region）（ＣＤＲ）を各々含むが、特定の実施形態では、抗原への特異的結合をもたらすために６よりも少ないＣＤＲが十分であり得る。特定の実施形態において、ＶＨドメインはＦａｂの一部であり、この場合には、ＶＨドメインは、通常、自然な順番でＣＨ１ドメインに結合される（すなわち、ＶＨドメインはＣＨ１のＮ末端に結合される）。抗原結合部位がＦａｂの一部である場合、ＶＬドメインは、通常、自然な順番で軽鎖定常（ＣＬ）ドメインに結合され得る（すなわち、ＶＬドメインはＣＬドメインのＮ末端に結合される）。
これらのドメインを含むＴＦｃＡが所望の生物活性と安定性及び任意の他の所望の特性を有するならば、可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）は、１つ以上のアミノ酸長であり得るリンカーを介して定常ドメイン（ＣＨ１及びＣｌ）に直接的に又は間接的に結合される。
特定の実施形態において、ＶＨドメインはｓｃＦｖの一部であり、この場合には、ＶＨドメインは、ｓｃＦｖリンカーを介してＶＬドメインに結合され、及びｓｃＦｖはＴＦｃのＮ末端及び／又はＣ末端に結合される。結合部位がｓｃＦｖである場合、可変領域は、通常、ＣＨ１ドメイン又はＣＬドメインに結合されない。
特定の実施形態において、ＴＦｃＡは一価及び単一特異性である。一価ＴＦｃＡは、ＴＦｃのアミノ末端又はＣ末端に結合部位を含み得る。一価ＴＦｃＡの結合部位は、Ｆａｂ又はｓｃＦｖであり得る。一価ＴＦｃＡの例示的な重鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端への順に、
ｉ）ＶＨドメイン及びＴＦｃ、
ｉｉ）ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン及びＴＦｃ、
ｉｉｉ）ＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー、ＶＬドメイン及びＴＦｃ、
ｉｖ）ＴＦｃ、結合及びＶＨドメイン、
ｖ）ＴＦｃ、結合リンカー、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン、並びに
ｖｉ）ＴＦｃ、結合リンカー、ＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びＶＬドメインを含む。
ＴＦｃＡがＦａｂを含む場合、ＴＦｃＡは、ＦａｂのＶＬドメインと任意にＣＬドメインとを含む軽鎖も含む。
特定の実施形態において、ＴＦｃＡはＴＦｃＢＡである。ＴＦｃＢＡは、第１の抗原に特異的に結合する１つのＦａｂと、第２の抗原に特異的に結合する第２のＦａｂとを含み得る。また、ＴＦｃＢＡは、第１の抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖと、第２の抗原に特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み得る。また、ＴＦｃＢＡは、第１の抗原に特異的に結合するＦａｂと、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖとを含み得る。特定の実施形態において、ＴＦｃのアミノ末端は、Ｆａｂに結合され、及びＴＦｃのカルボキシル末端は、ｓｃＦｖに結合される。或いは、ＴＦｃのアミノ末端はｓｃＦｖに結合され、及びＴＦｃのカルボキシル末端はＦａｂに結合される。例示的な分子は、Ｆａｂ−ＴＦｃ−ｓｃＦｖ；Ｆａｂ−ＴＦｃ−Ｆａｂ；ｓｃＦｖ−ＴＦｃ−ｓｃＦｖ；及びｓｃＦｖ−ＴＦｃ−Ｆａｂの構成を有する。
一実施形態では、ＴＦｃＢＡは、アミノ末端からカルボキシル末端への順に以下を有する重鎖を含む。
（ｉ）第１のＶＨドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー及び第２のＶＨドメイン；
（ｉｉ）第１のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー及び第２のＶＨドメイン；
（ｉｉｉ）第１のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、第２のＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー及び第２のＶＬドメイン、ここで、第２のＶＨドメインとＶＬドメインとは結合して第２の結合部位を形成する；
（ｉｖ）第１のＶＨドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、第２のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン；
（ｖ）第１のＶＨドメイン、第１のＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、第２のＶＨドメイン及び第２のＣＨ１ドメイン；
（ｖｉ）第１のＶＨドメイン、第１のｓｃＦｖリンカー、第１のＶＬドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー及び第２のＶＨドメイン、ここで、第１のＶＬドメインとＶＨドメインは結合して第１の結合部位を形成する；
（ｖｉｉ）第１のＶＨドメイン、第１のｓｃＦｖリンカー、第１のＶＬドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、第２のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン、ここで、第１のＶＬドメインとＶＨドメインは結合して第１の結合部位を形成する；並びに
（ｖｉｉｉ）第１のＶＨドメイン、第１のｓｃＦｖリンカー、第１のＶＬドメイン、ＴＦｃ、結合リンカー、第２のＶＨドメイン、第２のｓｃＦｖリンカー及び第２のＶＬドメイン、ここで、第１のＶＨドメインとＶＬドメインは第１の結合部位を形成し、及び第２のＶＨドメインとＶＬドメインは第２の結合部位を形成する。
（ｉ）〜(ｖ）のＴＦｃＢＡは、第１のＶＬドメインと、任意に、ＶＬドメインのＣ末端に位置するＣＬドメインとを有する軽鎖を更に含むことがあり、第１のＶＨドメインとＶＬドメインは結合して第１の結合部位を形成する。（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）のＴＦｃＢＡは、第２のＶＬドメインと、任意に、ＶＬドメインのＣ末端に位置するＣＬドメインとを有する軽鎖を含むことがあり、第１のＶＨドメインとＶＬドメインは結合して第２の結合部位を形成する。
特定の実施形態において、重鎖は第１のＶＨドメインを含み、第１のＶＨドメインはそのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、ＴＦｃはそのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、結合リンカーはそのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合される。特定の実施形態において、重鎖は第１のＶＨドメインを含み、第１のＶＨドメインはそのＣ末端でＣＨ１ドメインのＮ末端に結合され、ＣＨ１ドメインはそのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、ＴＦｃはそのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、結合リンカーはそのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合される。特定の実施形態において、重鎖は第１のＶＨドメインを含み、第１のＶＨドメインはそのＣ末端でＣＨ１ドメインのＮ末端に結合され、ＣＨ１ドメインはそのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、ＴＦｃはそのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、結合リンカーはそのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合され、第２のＶＨドメインはそのＣ末端でｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、ｓｃＦｖリンカーはそのＣ末端で第２のＶＬドメインのＮ末端に結合され、第２のＶＨドメインとＶＬドメインは結合して第２の結合部位を形成する。特定の実施形態において、重鎖は、第１のＶＨドメインを含み、第１のＶＨドメインはそのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、ＴＦｃはそのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、結合リンカーはそのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合され、第２のＶＨドメインはそのＣ末端でＣＨ１ドメインのＮ末端に結合される。特定の実施形態において、重鎖は第１のＶＨドメインを含み、第１のＶＨドメインはそのＣ末端で第１のＣＨ１ドメインのＮ末端に結合され、第１のＣＨ１ドメインはそのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、ＴＦｃはそのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、結合リンカーはそのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合され、第２のＶＨドメインはそのＣ末端で第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に結合される。特定の実施形態において、重鎖は第１のＶＨドメインを含み、第１のＶＨドメインはそのＣ末端で第１のｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、第１のｓｃＦｖリンカーはそのＣ末端で第１のＶＬドメインのＮ末端に結合され、第１のＶＬドメインはそのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、ＴＦｃはそのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、結合リンカーはそのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合され、第１のＶＨドメインとＶＬドメインは結合して、第１の結合部位を形成する。特定の実施形態において、重鎖は第１のＶＨドメインを含み、第１のＶＨドメインはそのＣ末端で第１のｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、第１のｓｃＦｖリンカーはそのＣ末端で第１のＶＬドメインのＮ末端に結合され、第１のＶＬドメインはそのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、ＴＦｃはそのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され、結合リンカーはそのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合され、第２のＶＨドメインはそのＣ末端でＣＨ１ドメインのＮ末端に結合され、第１のＶＨドメインとＶＬドメインは結合して、第１の結合部位を形成する。特定の実施形態において、重鎖は第１のＶＨドメインを含み、第１のＶＨドメインはそのＣ末端で第１のｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、第１のｓｃＦｖリンカーはそのＣ末端で第１のＶＬドメインのＮ末端に結合され、第１のＶＬドメインはそのＣ末端でＴＦｃのＮ末端に結合され、ＴＦｃはそのＣ末端で結合リンカーのＮ末端に結合され結合リンカーはそのＣ末端で第２のＶＨドメインのＮ末端に結合され、第２のＶＨドメインはそのＣ末端で第２のｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、第２のｓｃＦｖリンカーはそのＣ末端で第２のＶＬドメインのＮ末端に結合され、第１のＶＨドメインとＶＬドメインは第１の結合部位を形成し、第２のＶＨドメインとＶＬドメインは第２の結合部位を形成する。
特定の実施形態において、上述の構築物中でＶＬドメインはＶＨドメインの代わりに用いられ、ＶＨドメインはＶＬドメインの代わりに用いられる。
重鎖が第１のＶＬドメイン又は第２のＶＬドメインのいずれも含まない場合、ＶＬドメインは軽鎖によってもたらされることがある。軽鎖は、第１のＶＬドメイン又は第２のＶＬドメイン、及び任意にＣＬドメインを含み得る。例えば、ｓｃＦｖは、アミノ末端からカルボキシ末端の順に、ＶＬドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びＶＨドメインを含み得る。
特定の実施形態において、ＴＦｃＢＡは、第１の受容体に特異的に結合する第１の抗原結合部位と、第２の受容体に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む。特定の実施形態において、第１の受容体に特異的に結合する第１の抗原結合部位はＦａｂであり、及び第２の受容体に特異的に結合する第２の抗原結合部位はｓｃＦｖである。結合部位の例示的な組み合わせを表３に記載する。表中「ｙｅｓ」は、可能な組み合わせを示し、及び抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡを用いて可能な組み合わせを説明する。
特定の実施形態において、ＴＦｃＢＡは２つ以上の結合部位を含む。ＴＦｃＢＡは３、４、５、６以上の結合部位を含み得る。更なる結合部位は、例えば、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡのＮ末端及び／又はＣ末端に結合され得る。例えば、重鎖は、ＴＦｃのアミノ末端又はカルボキシル末端に結合された１つ以上のＦａｂ及び／又はｓｃＦｖを含み得る。
ＴＦｃＢＡの例示的なドメインを更に以下に記述する。
例示的なヒンジ
一実施形態では、ＴＦｃＡ、例えばＴＦｃＢＡの第１及び／又は第２のＦｃ領域は、ＩｇＧ上部ヒンジ、ＩｇＧ中央ヒンジ及び／又はＩｇＧ下部ヒンジを含む。例えば、Ｆｃ領域は、例えば、配列番号１、２及び３にそれぞれ記載されている１つ以上のＩｇＧ１上部、中央及び下部ヒンジを含み得る（表２を参照されたい）。また、Ｆｃ領域は、例えば、配列番号５、２及び６にそれぞれ記載されている、１つ以上のＩｇＧ２上部、中央及び下部ヒンジを含み得る（ＩｇＧ１とＩｇＧ２の中央ヒンジは同じアミノ酸配列を有する。表２を参照されたい）。また、Ｆｃ領域は、例えば、配列番号８、９及び１０にそれぞれ記載されている１つ以上のＩｇＧ３上部、中央及び下部ヒンジを含み得る（表２を参照されたい）。また、Ｆｃ領域は、例えば、配列番号１２、１３及び１４にそれぞれ記載されている１つ以上のＩｇＧ４上部、中央及び下部ヒンジを含み得る（表２を参照されたい）。また、Ｆｃ領域は、１つ以上のマウスＩｇ配列又はＩｇＡ１配列もしくはＩｇＡ２配列を含み得る。
また、ＴＦｃＡの第１及び／又は第２のＦｃ領域は、例えば、アミノ酸置換、欠失又は付加などの、最高１、２、３、４又は５までのアミノ酸修飾を含む、本明細書に記載の配列（例えば、配列番号１〜１４）などの、天然由来の配列と異なるアミノ酸配列を有する上部、中央又は下部ヒンジのアミノ酸配列を含み得る。例えば、以下のＩｇＧ１上部ヒンジを用いてもよい。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＣＣ（配列番号１６；アミノ酸置換Ｈ２２４Ｃ及びＴ２２５Ｃ（下線部）を有する配列番号１に対応する）及び
ＥＰＫＳＣＤＫＣＨＴ（配列番号１７；アミノ酸置換Ｔ２２３Ｃ（下線部）を有する配列番号１に対応する）。
本明細書で参照するヒンジ残基のアミノ酸番号付は、完全長抗体（ＥＵ番号付け；図２を参照されたい）におけるそれらの番号付けによる。
一実施形態では、ＴＦｃＡの第１及び／又は第２のヒンジは、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む完全長の野生型ＩｇＧ１ヒンジである。
ＴＦｃＢＡの第１及び／又は第２のヒンジも、例えば、アミノ酸置換、欠失又は付加などの、配列番号４に関連する最高１、２、３、４又は５までのアミノ酸修飾を含むＩｇＧ１ヒンジからなる。例えば、以下のＩｇＧ１ヒンジを用いてもよい。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＣＣＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１８；アミノ酸置換Ｈ２２４Ｃ及びＴ２２５Ｃを有する配列番号４に対応する）；及び
ＥＰＫＳＣＤＫＣＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１９；アミノ酸置換Ｔ２２３Ｃを有する配列番号４に対応する）。
一実施形態では、ＴＦｃＡの第１及び／又は第２のヒンジは、ハイブリッドヒンジ、すなわち、複数の異なるＩｇＧサブクラスに由来する複数の部分を含む１つのヒンジである。一実施形態では、ヒンジは、ＩｇＧ１由来の上部ヒンジ及びＩｇＧ４由来の中央ヒンジと下部ヒンジを含み、例えば以下のアミノ酸配列からなり得る。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴｃｐｓｃｐａｐｅｆｌｇ（配列番号２０；大文字残基はＩｇＧ１配列を表し、小文字残基はＩｇＧ４配列を表す）。
ＴＦｃＢＡの第１及び／又は第２のヒンジも、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加などの最高１、２、３、４又は５までのアミノ酸修飾を含む、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むハイブリッドヒンジであり得る。例えば、以下のＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジを用いてもよい。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＣＣｃｐｓｃｐａｐｅｆｌｇ（配列番号２１；アミノ酸置換Ｈ２２４Ｃ及びＴ２２５Ｃを含む配列番号２０に対応する；大文字残基はＩｇＧ１配列を表し、小文字残基はＩｇＧ４配列を表す）；及び
ＥＰＫＳＣＤＫＣＨＴｃｐｓｃｐａｐｅｆｌｇ（配列番号２２；アミノ酸置換Ｔ２２３Ｃを有する配列番号２０に対応する）。
特定の実施形態において、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、全長ヒンジの代わりにヒンジの一部を含む。例えば、ＴＦｃＢＡの第１及び／又は第２のＦｃ領域は、上部、中央及び／又は下部のヒンジが欠如しているヒンジを含み得る。特定の実施形態において、Ｆｃ領域は中央ヒンジ及び下部ヒンジを含むが、上部ヒンジを含まない。ＩｇＧ１中央ヒンジ及び下部ヒンジの例示的なアミノ酸配列は、以下の配列である。
ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号２３）。
ＩｇＧ４中央ヒンジ及び下部ヒンジの例示的なアミノ酸配列は、以下の配列である。
ＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号２４）。
上述のヒンジ及びその部分のアミノ酸数の概要を表４に記載する。ＩｇＧ１及びＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジのアライメントは、図２に記載する。
また、システインは、ヒンジ中のＴ２２３、Ｈ２２４及びＴ２２５以外の位置に、例えば国際公開第２０１０／０６４０９０号に記述された置換Ｋ２２２Ｃによって導入され得る。
ＴＦｃＡに用いてもよい更なるヒンジには、以下のアミノ酸配列の１つを含むｈＩｇＧ１ヒンジ変異体が挙げられる(図２）。
ＰＰＰＰＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２６３；ｈＩｇＧ１エクストラプロリンｖ１）
ＥＰＫＳＣＰＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号２６４；ｈＩｇＧ１エクストラプロリンｖ２）
ＥＰＫＳＣＰＰＣＰＣＰＰＣＰ（配列番号２６５；ｈＩｇＧ１様ダブルコア）
また、ＴＦｃＡで用いてもよいヒンにジは、例えば、ｍＩｇＧ１配列及びｍＩｇＧ２配列並びにそのハイブリッドのマウスヒンジ配列が挙げられる。例示的なｍＩｇＧ１／ｍＩｇＧ２Ａヒンジは、アミノ酸配列
ＶＰＲＤＣＴＩＫＰＣＰＰＣＰ（配列番号２６７）を含む。
ＴＦｃＡで用いてもよい他のヒンジには、ＩｇＧ２ヒンジ又はその変異体、例えば以下のアミノ酸配列の１つを含む変異体が挙げられる（図２）；
ＥＲＫＰＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２６８；ｈＩｇＧ２ Ｃ２３２Ｐ）
ＥＲＫＣＰＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２６９；ｈＩｇＧ２ Ｃ２３３Ｐ）
特定の実施形態において、ＴＦｃＡはＩｇＡ、例えばＩｇＡ２、ヒンジ又はその変異体を含む。
例示的なＩｇＡ２ヒンジ変異体には、以下のアミノ酸配列の１つを含む変異体が挙げられる（図２）。
ＥＰＫＳＣＰＣＰＰＰＰＰＣＣＰ（配列番号２７１；ｈＩｇＡ２修飾型ｖ１）
ＥＰＫＳＣＰＣＰＰＰＰＣＣＰ（配列番号２７２；ｈＩｇＡ２修飾型ｖ２）
ＥＰＫＳＣＰＶＰＰＰＰＰＣＣＰ（配列番号２７３；ｈＩｇＡ２修飾型ｖ３）
他の変異体、例えばアミノ酸修飾も、ヒンジに導入されてもよい。例えば、ＩｇＧ４中央ヒンジを含む２つのＦｃ領域間の相互作用を安定化するために、置換Ｓ２２８ＰがＩｇＧ４の中央ヒンジで作製され得る。
そのＦａｂドメイン中にＩｇＧ２配列を含むＴＦｃＡは、Ｆａｂドメインの重鎖部分に変異Ｃ１２９Ｓを含むことがある。これは、通常、重鎖を軽鎖に結合するシステインの変異である。そのような変異は、軽鎖システインと重鎖内のＣ２３２との間のジスルフィド架橋の形成を促し、及びＣ２３３は隣接するヒンジのＣ２３３と１対になる（ＣＰＰＣＰモチーフ内の２つのジスフィドに加えて）。
特定の実施形態において、ＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴ（配列番号２４８）、ＰＫＳＣＧＣＫＰＣＩＣＴ（配列番号２４９）、ＰＫＳＣＧＣＫＰＣＩＣＰ（配列番号２５０）、ＰＲＤＣＧＣＫＰＣＰＰＣＰ（配列番号２５１）、ＰＲＤＣＧＣＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２５２）、ＰＫＳＣＤＣＨＣＰＰＣＰ（配列番号２５３）及びＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２５４）の変異体ヒンジが用いられる。
特定の実施形態において、ＴＦｃＢＡは第１のヒンジ又は第２のヒンジを含まない。例えば、第１のヒンジの代わりに、ＴＦｃＢＡは、第１の結合部位を第１のＣＨ２ドメインに結合する結合リンカーを含み得る。そのようなリンカーは、本明細書ではＴＦｃリンカーと関連して更に記述するＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーであり得る。特定の実施形態において、結合リンカーは、（Ｇ４Ｓ）２又は（Ｇ４Ｓ）３又は（Ｇ４Ｓ）４の配列を含む。また、他のペプチド配列がそのリンカーの特定部分の所望の可動性及び剛性をもたらすならば、それらの配列を結合リンカーとして用いてもよい。特定の実施形態において、ＴＦｃＢＡは第２のヒンジを含まないが、代わりに結合リンカーを含み、該リンカーはＴＦｃリンカーのそれに似ているＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーであってもよい。
例示的なＣＨ２ドメイン
特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、又はそれらの組み合わせ（「ハイブリッド」ＣＨ２ドメイン）由来であってもよい。例示的な全長野生型ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインは、以下のアミノ酸配列からなる。
ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２６１）。
哺乳動物細胞中で発現すると、変異体が実質的に非グリコシル化されるように、その残基でグリコシル化を減少させるためにＮ２９７Ｑ置換を有する例示的な全長ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインは、以下のアミノ酸配列からなる。
ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２５）。
例示的な全長野生型ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む。
ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２６２）。
哺乳動物細胞中で発現すると、変異体が実質的に非グリコシル化されるように、残基２９７でグリコシル化を減少させるためにＴ２９９Ｋ置換を有する例示的な全長ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインは、以下のアミノ酸配列からなる。
ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＫＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２６）。
また、ＣＨ２ドメインは、例えば、アミノ酸欠失、付加又は置換の１つ以上のアミノ酸修飾においてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のそれと異なるアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、ＣＨ２ドメインは、天然起源（もしくは野生型）ＣＨ２ドメイン（例えば、配列番号２６１及び２６２）のそれと、又は配列番号２５又は２６のそれと、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５又は３０のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＣＨ２ドメインは、天然起源のＣＨ２ドメイン（例えば配列番号２６１及び２６２）又は配列番号２５もしくは２６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であるもしくは類似しているアミノ酸配列を含む。例示的な修飾には、アミノ酸２９７でグリコシル化を減少させる又は除去する他の修飾が挙げられる。修飾は、通常、哺乳動物細胞中で発現すると、変異体が実質的に非グリコシル化されるように、ＥＵ位２９７〜２９９（アミノ酸モチーフＮＸＴ）のいずれにおいてアミノ酸置換を含み得る。Ｔ２９９Ｋに加えて、アミノ酸２９７でグリコシル化を減少させるためにアミノ酸２９９でなされ得る他の置換には、例えば国際公開第２００５／０１８５７２号に記載されているように、Ｔ２９９Ｓ，Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｎ，Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｃ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｗ、及びＴ２９９Ｖが挙げられる。
他のアミノ酸変化は、抗体エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ及びＣＤＣ、もしくは安定性又は他の所望の抗体特性に影響を及ぼし得る。例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に結合するＦｃγＲＩは、Ｌｅｕ２３５及び／又はＧｌｙ２３７を修飾することによって調節され得る。ＣＤＣのＣ１ｑとの結合は、Ａｌａ３３０及び／又はＰｒｏ３３１の置換によって調節され得る。エフェクター機能を調節するためにＣＨ２ドメインになされ得る他の修飾には、２３４〜２３８位、２５３位、２７９位、３１０位、３１８位、３２０位及び３２２位で１つ以上のアミノ酸での置換が挙げられる。
例示的なＣＨ３ドメイン
特定の実施形態において、ＴＦｃＡ、例えばＴＦｃＢＡの第１及び／又は第２のＦｃ領域はＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインは、ヒト免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４又はそれらの組み合わせ（「ハイブリッド」ＣＨ３ドメイン）由来であってもよい。例示的な全長野生型ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む。
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２７）。
特定の実施形態において、配列番号２７の変異が、用いられ得る。例えば、ＣＨ３ドメインのＣ末端リジンは、欠失され得る（図３の配列番号２８を参照されたい）。別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを含み、及びＣ末端リジンは存在しても又は非存在でもよい（それぞれ配列番号２９及び３０、図３に示す）。
特定の実施形態において、第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインをそれぞれ含む第１のＦｃ及び第２のＦｃの結合を増強するために、ＴＦｃＡの第１及び／又は第２のＣＨ３が修飾される。そのようなＣＨ３修飾は、本明細書では結合強化修飾（Association Enhancing Modification）（「ＡＥＭ」）という。実施例で更に記述するように、抗体の２つのＦｃ領域を連結するＴＦｃリンカーを付加すると、抗体を適切に構築して安定性を高めるためにＡＥＭを有する抗体の能力が更に増強されることが、予想外に見出された。
使用できる例示的なＡＥＭ修飾は、「ノブ−イントゥ−ホール」を作製する修飾であり、これは例えば、米国特許第７，１８３，０７６号に記述されている。この戦略において、ＣＨ３ドメインを操作して、突出する「ノブ」又は「突起」及び他方の相補的な「ホール」をもたらし、それによってＣＨ３ドメインの結合を支持する。「ホール」を作製するＣＨ３ドメインへの例示的なアミノ酸修飾は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（例えば、配列番号３１〜３４中、図３）の組み合わせである。「ホール」を有するそのようなＣＨ３ドメインは、「ノブ」又は「突起」を有するＣＨ３ドメイン（例えば、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（例えば配列番号３５〜３８中、図３）を含むＣＨ３ドメイン）と有利に二量体化する。ノブ／ホール変異のこの対は、本明細書では「ＡＥＭモジュール１」又は「ＡＥＭ１」と呼ばれ、その第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、それぞれ「ＡＥＭ１．１」及び「ＡＥＭ１．２」と呼ばれる。
別の実施形態では、ＴＦｃＡの２つのＣＨ３ドメインの１つは、置換Ｙ４０７Ｔ（例えば、配列番号３９〜４２中、図３）によって作製されたホールを含み、及び他方のＣＨ３ドメインは、置換Ｔ３６６Ｙ（例えば、配列番号４３〜４６中、図３）によって作製されたノブを含む。ノブ／ホール変異のこの第２の対は「ＡＥＭモジュール２」又は「ＡＥＭ２」と呼ばれ、その第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、それぞれ「ＡＥＭ２．１」及び「ＡＥＭ２．２」と呼ばれる。
２つのＣＨ３ドメイン間の結合も、一般的なノブ／ホールを作製する以外の機序によって、例えば静電修飾によって増強されてもよい。一実施形態では、ＴＦｃＡの２つのＣＨ３ドメインの１つは、置換Ｓ３６４ＨとＦ４０５Ａの組み合わせ（例えば、配列番号４７〜５０中、図３）を含み、及び他方のＣＨ３ドメインは、置換Ｙ３４９ＴとＴ３９４Ｆの組み合わせ（例えば、配列番号５１〜５４中、図３）を含む。修飾のこの第３の対は、本明細書では「ＡＥＭモジュール３」又は「ＡＥＭ３」と呼ばれ、その第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、それぞれ「ＡＥＭ３．１」及び「ＡＥＭ３．２」と呼ばれる。
一実施形態において、ＴＦｃＡの持つ２つのＣＨ３ドメインの１つでは、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ（例えば、配列番号５５から５８；図３）からなる組み合わせの置換がなされており、もう一方のＣＨ３ドメインでは、Ｅ（或いはＤ）３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｋ及び Ｄ３９９Ｋ（例えば、配列番号５９から６２；図３）からなる組み合わせの置換がなされている。この４番目の修飾の組み合わせを、この明細書では“ＡＥＭモジュール４”、或いは、“ＡＥＭ ４”と呼び、この組み合わせでの第１と第２のＣＨ３ドメインをそれぞれ、“ＡＥＭ ４．１”、“ＡＥＭ４．２”と呼ぶことにする。３５６番目のアミノ酸は、Ｅ又はＤであり、使用される配列に依存するため、この部位での置換は、“Ｅ（或いはＤ）３５６”と呼ぶことにする。
特定の実施形態では、ＴＦｃＡの第１のＣＨ３ドメイン又は第２のＣＨ３ドメイン、或いはその両方で、１つ以上のアミノ酸の修飾がなされており、結果的に１つ以上のシステインが付加されることで、２つのＣＨ３間或いはＦｃドメイン間で１つ以上のジスルフィド結合の形成が可能となる。一実施形態において、ＴＦｃＡの持つ２つのＣＨ３ドメインの１つでは、Ｙ３４９Ｃ（例えば、配列番号６３から６６；図３）の置換がなされており、もう一方のＣＨ３ドメインでは、Ｓ３５４Ｃ（例えば、配列番号６７から７０；図３）の置換がなされている。このジスルフィド形成の修飾の組み合わせを、この明細書では“ＤｉＳモジュール１”、或いは、“ＤｉＳ １”と呼び、この組み合わせでの第１と第２のＣＨ３ドメインをそれぞれ、“ＤｉＳ １．１”、“ＤｉＳ １．２”と呼ぶことにする。
別の実施形態では、システインをＴＦｃＡの持つ２つのＣＨ３ドメインのそれぞれのＣ末に付加することで、２つのＣＨ３ドメイン間でジスルフィド結合の形成が可能となる。例えば、２つのＣＨ３ドメインのうち、１つ目では、そのカルボキシル末端のアミノ酸が、“ＰＧＫ”から“ＫＳＣＤＫＴ”（例えば、配列番号７１と７２；図３）へと置換されてもよいし、もう一方のＣＨ３ドメインでは、“ＰＧＫ”から“ＧＥＣ”（例えば、配列番号７３と７４；図３）へと置換されてもよい。
特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、２つ以上のアミノ酸の変化の組み合わせを含む。例えば、１つ以上のＡＥＭ修飾は、１つ以上のＤｉＳ修飾と組み合わせることができる。例示的な実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ｈｏｌｅ変異であるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び、ジスルフィド結合形成の変異であるＹ３４９Ｃを含む（ＡＥＭ １．１＋ＤｉＳ １．１）。このようなＣＨ３ドメインは、ｋｎｏｂ変異であるＴ３６６Ｗ及び、ジスルフィド結合形成の変異であるＳ３５４Ｃを含むＣＨ３ドメイン（ＡＥＭ １．２＋ＤｉＳ １．２）とＴＦｃにおいて組み合わせることができる。例示的なアミノ酸配列で、この置換の組み合わせを含むものとして、配列番号７５から８２がある（図３）。
ＣＨ３ドメイン、又はＦｃ領域の結合に有利に働くためにＣＨ３ドメインに導入されたＡＥＭｓとＤｉＳｓの例示的な組み合わせを表５に示す。“ｙｅｓ”は、使用可能な組み合わせを示す。
ＡＥＭ又はＤｉＳ、或いはその両方を持つ例示的なＩｇＧ１のＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３１から９８を含む。これらのアミノ酸配列のアライメント配図３に、配列の説明は表６に示す。表６及び図３のＣＨ３ドメインは、ＡＥＭモジュール（番号１、２、３又は４）とＤｉＳモジュール（番号１又は２）に応じて編成されている。互換性のあるＣＨ３ドメインは、“１”と“２”として、モジュール番号の後に表示する。
ＴＦｃＡｓで使用可能な他のＣＨ３ ＡＥＭｓは、以下の組み合わせからなるアミノ酸の修飾を含む。ここで、ＡＥＭの組み合わせ中で最初のメンバーと２番目のメンバーは、“及び”によって分けられている。
１）Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｆ；Ｓ３６４Ｄ及びＹ３４９Ｋ；Ｓ３６４Ｅ及びＬ３６８Ｋ；Ｓ３６４ＥＹ３４９Ｋ；Ｓ３６４Ｆ及びＫ３７０Ｇ；Ｓ３６４Ｈ及びＹ３４９Ｋ；Ｓ３６４Ｈ及びＹ３４９Ｔ；Ｓ３６４Ｙ及びＫ３７０Ｇ；Ｔ４１１Ｋ及びＫ３７０Ｅ；Ｖ３９７Ｓ／Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｆ；Ｋ３７０Ｒ／Ｔ４１１Ｋ及びＫ３７０Ｅ／Ｔ４１１Ｅ；Ｌ３５１Ｅ／Ｓ３６４Ｄ及びＹ３４９Ｋ／Ｌ３５１Ｋ；Ｌ３５１Ｅ／Ｓ３６４Ｅ及びＹ３４９Ｋ／Ｌ３５１Ｋ；Ｌ３５１Ｅ／Ｔ３６６Ｄ及びＬ３５１Ｋ／Ｔ３６６Ｋ；Ｐ３９５Ｔ／Ｖ３９７Ｓ／Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｆ；Ｓ３６４Ｄ／Ｋ３７０Ｇ及びＳ３６４Ｙ／Ｋ３７０Ｒ；Ｓ３６４Ｄ／Ｔ３９４Ｆ及びＹ３４９Ｋ／Ｆ４０５Ａ；Ｓ３６４Ｅ／Ｆ４０５Ａ及びＹ３４９Ｋ／Ｔ３９４Ｆ；Ｓ３６４Ｅ／Ｆ４０５Ｓ及びＹ３４９Ｋ／Ｔ３９４Ｙ；Ｓ３６４Ｅ／Ｔ４１１Ｅ及びＹ３４９Ｋ／Ｄ４０１Ｋ；Ｓ３６４Ｈ／Ｄ４０１Ｋ及びＹ３４９Ｔ／Ｔ４１１Ｅ；Ｓ３６４Ｈ／Ｔ３９４Ｆ及びＹ３４９Ｔ／Ｆ４０５Ａ；Ｙ３４９Ｃ／Ｓ３６４Ｅ及びＹ３４９Ｋ／Ｓ３５４Ｃ；Ｌ３５１Ｅ／Ｓ３６４Ｄ／Ｆ４０５Ａ及びＹ３４９Ｋ／Ｌ３５１Ｋ／Ｔ３９４Ｆ；Ｌ３５１Ｋ／Ｓ３６４Ｈ／Ｄ４０１Ｋ及びＹ３４９Ｔ／Ｌ３５１Ｅ／Ｔ４１１Ｅ；Ｓ３６４Ｅ／Ｔ４１１Ｅ／Ｆ４０５Ａ及びＹ３４９Ｋ／Ｔ３９４Ｆ／Ｄ４０１Ｋ；Ｓ３６４Ｈ／Ｄ４０１Ｋ／Ｆ４０５Ａ及びＹ３４９Ｔ／Ｔ３９４Ｆ／Ｔ４１１Ｅ；Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａ／Ｔ４１１Ｅ及びＹ３４９Ｔ／Ｔ３９４Ｆ／Ｄ４０１Ｋ（国際公開第２０１１／０２８９５２号）。
２）Ｔ３６６Ｗ及びＹ４０７Α；Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ；Ｌ３６８Α及びＹ４０７Υ；Ｋ４０９Ｅ及びＤ３９９Ｋ；Ｋ４０９Ｅ及びＤ３９９Ｒ；及びＫ４０９Ｄ及びＤ３９９Ｋ；Ｋ４０９Ｄ及びＤ３９９Ｒ；Ｋ３９２Ｅ及びＤ３９９Ｒ；Ｋ３９２Ｅ及びＤ３９９Ｋ；Ｋ３９２Ｄ及びＤ３９９Ｒ；及びＫ３９２Ｄ及びＤ３９９Ｒ（国際公開第２００９／０８９００４号）。
３）Ｔ３６６Ｗ及びＹ４０７Ａ；Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｗ；Ｙ４０７Ｔ及びＴ３６６Ｙ；Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ；Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ及びＴ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ；Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ；及びＦ４０５Ｗ及びＴ３９４Ｓ（米国特許第７，６４２，２２８号）。
一般に、当技術分野で記載されている他のすべてのＡＥＭ又はＤｉＳも使用可能である。
ＣＨ３ドメインは、例えば、配列番号２７〜９８のように、本明細書で記載されるＣＨ３アミノ酸配列と、最大限、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５又は３０箇所のアミノ酸において異なるアミノ酸を含んでもよい。特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、例えば、配列番号２７〜９８のように、本明細書で提供されるＣＨ３アミノ酸配列と、少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。抗体のいくつかのエフェクター機能、例えばＡＤＣＣやＣＤＣは、少なくとも部分的には、ＣＨ３ドメインの領域により媒介されるため、ＣＨ３ドメインに導入することが可能なアミノ酸の変化は、Ｆｃ領域のエフェクター機能に影響を及ぼすものが含まれる。ＣＨ３ドメインに導入することが可能な例示的な修飾を、本明細書で具体的に記載する。
例示的なＦｃ領域
ＴＦｃＡのＦｃ領域は、１つ以上のヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインからなり、全長であっても、そうでなくてもよく、野生型であっても、アミノ酸の修飾を含んでもよい。Ｆｃ領域は、ヒトの免疫グロブリン（“Ｉｇｓ”）由来でも、マウス免疫グロブリンのようにヒト由来でなくてもよく、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）やＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）のように、どのようなタイプ或いはアイソタイプの免疫グロブリン由来でもよい。
特定の実施形態では、ＴＦｃＡは、ヒトの免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１の最初又は２番目、或いはその両方のＦｃ領域を含むＴＦｃを含む。Ｆｃ領域は、アミノ末端からカルボキシル末端の順で隣接する形で、ＩｇＧ１ヒンジ或いはその一部（例えば、コア及び下部ヒンジ）、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含むことが好ましい。Ｆｃ領域は、ＴＦｃＡが望ましい活性と安定性を持つ限りにおいては、本明細書で記載したＩｇＧ１ヒンジ（或いはその一部）、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのいかなる組み合わせも含むことができる。
特定の実施形態では、ＴＦｃは、最初又は２番目、或いはその両方のハイブリッドＦｃ領域であるＦｃ領域を含む。ハイブリッドＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４中の２つ以上のＩｇＧのサブクラスからなるＦｃ領域を含んでもよい。一実施形態において、ハイブリッドＦｃ領域は、アミノ末端からカルボキシル末端の順で隣接する形で、ＩｇＧ１上部ヒンジ、ＩｇＧ４中央及び下部ヒンジ、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む。例示的なＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃ領域は、ＴＦｃを含むＴＦｃＡが望ましい活性と安定性を持つ限りにおいては、本明細書で記載したＩｇＧ１上部ヒンジ、ＩｇＧ４コアヒンジ、ＩｇＧ４下部ヒンジ、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのいかなる組み合わせも含むことができる。
特定の実施形態では、Ｆｃ領域はヒンジ全長を含まない。例えば、ＴＦｃＢＡは、第１のＦｃ領域でヒンジ全長を含んでいるが、第２のＦｃ領域は、コアヒンジ又は下部ヒンジ、或いはその両方を持つヒンジを含むが、上部ヒンジは含まれなくてよい。
特定の実施形態では、ＴＦｃは、システインを含むように修飾されたヒンジを含み、それによって、他のＦｃ領域の他のシステインとジスルフィド結合を形成し、ＴＦｃを安定化させる。一実施形態では、ＩｇＧ１ヒンジは、Ｈ２２４Ｃ及びＴ２２５Ｃの置換を含む（例えば、配列番号１８；図２）。別の実施形態では、ヒンジは、Ｔ２２３Ｃの置換を含む（例えば、配列番号１９；図２）。
一実施形態では、ＴＦｃＡは、ＩｇＧ１ ＴＦｃを含むが、そのＩｇＧ１ ＴＦｃは、アミノ末端 からカルボキシル末端の順で、ｉ）配列番号４（ＩｇＧ１ヒンジ全長）、配列番号１８（Ｈ２２４Ｃ／Ｔ２２５Ｃの置換を有する配列番号４）、配列番号１９（Ｔ２２３Ｃの置換を有する配列番号４）、配列番号２３（ＩｇＧ１の中央及び下部ヒンジのみ）のアミノ酸配列からなるヒンジの群から選択されるＩｇＧ１ヒンジ；ｉｉ）配列番号２６１又は２５を含むＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン；ｉｉｉ）配列番号３１〜９８（図３）のアミノ酸配列からなるＣＨ３ドメインの群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＨ３ドメイン、を含む。別の実施形態では、ＴＦｃＡは、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃを含むが、そのＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、ｉ）配列番号２０（ＩｇＧ１上部ヒンジと、ＩｇＧ４コア及び下部ヒンジ）、配列番号２１（Ｈ２２４Ｃ／Ｔ２２５Ｃの置換を有する配列番号２０）、配列番号２２（Ｔ２２３Ｃの置換を有する配列番号２０）、配列番号２４（ＩｇＧ４の中央及び下部ヒンジのみ）のアミノ酸配列からなるヒンジの群から選択されるヒンジ；ｉｉ）配列番号２６２又は２６を含むＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン；ｉｉｉ）配列番号３１〜９８（図３）のアミノ酸配列からなるＣＨ３ドメインの群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＨ３ドメイン、を含む。例示的なヒンジとＣＨ３ドメインの組み合わせを表７に記す。“ｙｅｓ”は使用可能な組み合わせを示し、互換性のある修飾は、空白行により他から分離している。
一実施形態では、ＴＦｃＡは、ＴＦｃを含むが、そのＴＦｃは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、そのＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号４を含むヒンジ、配列番号２５を含むＣＨ２ドメイン、配列番号２９を含むＣＨ３ドメインを含み、ＴＦｃＡは、例えば、配列番号９９を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を形成できる（表８と図４参照）。ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインの他の組み合わせ、及びこのような組み合わせで得られた例示的なＩｇＧ１ Ｆｃｓを表８に示す。表８にあげた例示的なＩｇＧ１ Ｆｃｓのアミノ酸配列は（配列番号９９〜１３２）は図４に示す。表８で、互換性のあるＩｇＧ１ Ｆｃｓは、空白行により他のＩｇＧ１ Ｆｃｓから分離している。
一実施形態において、ＴＦｃＡはＴＦｃを含むが、そのＴＦｃは、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４Ｆｃ領域を含み、そのＩｇＧ１／ＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、配列番号２０を含むヒンジ、配列番号２６を含むＣＨ２ドメイン、配列番号２９を含むＣＨ３ドメインを含み、ＴＦｃＡは、例えば、配列番号１３３を含むＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃ領域を形成できる（表９と図４参照）。ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインの他の組み合わせ、及びこのような組み合わせで得られた例示的なＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃｓを表９に示す。表９であげた例示的なＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃｓのアミノ酸配列は（配列番号１３３〜１６６）は図５に示す。表９で、互換性のあるＩｇＧ１ Ｆｃｓは、空白行により他のＩｇＧ１ Ｆｃｓから分離している。
ＴＦｃＡｓに使われるＦｃ領域は、本明細書で記載した例えば、配列番号９９〜１６６のアミノ酸配列と、１つ以上のアミノ酸の修飾、例えば、アミノ酸の欠失、付加もしくは置換により異なったアミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、本明細書で記載された配列、例えば、配列番号９９〜１６６の群から選択される配列と、最大限で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０箇所のアミノ酸において異なるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、本明細書で記載された配列、例えば、配列番号９９〜１６６の群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも、７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％，９７％，９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、配列番号９９〜１６６の群から選択される配列からなるＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、Ｃ末のリジンの欠失、Ｅ３５６Ｄ、Ｍ３５８Ｌのすべて、或いはこれらのいくつかを含むことができる。抗体のいくつかのエフェクター機能、例えばＡＤＣＣやＣＤＣは、Ｆｃ領域により媒介されるため、Ｆｃ領域に導入できるアミノ酸の変化は、Ｆｃ領域のエフェクター機能に影響を及ぼす変化が含まれる。この領域への例示的な変異を本明細書に記載する。Ｆｃ領域が、望まれる特性、例えば、生物活性、安定性、低い免疫原性を維持する限りにおいて、これらのどのような修飾も許容される。
エフェクター活性に影響を与える例示的なＦｃ修飾
ＴＦｃＡｓは、Ｆｃ領域のエフェクター活性に影響を与えるアミノ酸修飾を含むＴＦｃｓを含んでもよい。例示的なアミノ酸修飾を下に記載する。
Ｆｃ部分で抗体のエフェクター機能を変えるアミノ酸残基の置換は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号及び同５，６２４，８２１号参照）。抗体のＦｃ部分は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカインの誘導、抗体依存性細胞障害（“ＡＤＣＣ”）、食作用、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）や、抗体及び抗体−抗原複合体の半減期／排除速度を調整する。これらのエフェクター機能は、治療用抗体に望ましい場合もあるが、治療対象によっては、不必要又は、有害にすらなる場合がある。ヒトＩｇＧの特定のアイソタイプ、特にＩｇＧｌとＩｇＧ３とは、ＦｃγＲｓと補体Ｃ１ｑと結合することで、それぞれ、ＡＤＣＣとＣＤＣを媒介する。新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、循環する抗体の半減期を決定する重要な構成要素である。
一実施形態において、ＴＦｃＡは、１つ以上、好ましくはすべての以下の特性を持つ。ヒトで活性化ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体と抑制性ＦｃγＲＩＩｂ受容体との相互作用により決定されるＡＤＣＣと抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）；抗体が補体系の組成物と結合することで引き起こされるＣＤＣ；新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）による能動的なリサイクルを通じて媒介される長い半減期。必要な場合には、抗癌治療効果の最適化のため、これらすべての機能は調整できる。
上記で記載した定常ドメインの自然な生物活性を低下或いは増加させるため、特定のアミノ酸修飾、例えば、１つ以上のアミノ酸の付加や欠失、置換を免疫グロブリン定常領域に導入できる。
特定の実施形態では、ＴＦｃＡ（例えば、ＴＦｃＢＡ）は、アミノ酸修飾（例えば、アミノ酸の置換、付加或いは欠失）をＦｃ領域に含むことで、そのドメインの持つ１つ以上の抗原非依存的なエフェクター機能、例えば、そのドメインを含むタンパク質の循環半減期が変化する。例示的な抗体は、このようなアミノ酸の変化を欠いた抗体に比べＦｃＲｎとの結合が増加或いは減少し、そのために血清での半減期がそれぞれ増加又は減少する。ＦｃＲｎとの親和性が向上したＦｃ変異体を含む抗体が、より長い血清半減期を持つことが期待される一方、ＦｃＲｎとの親和性が低下したＦｃ変異体を含む抗体は、より短い半減期を持つことが予想される。一実施形態では、変化したＦｃＲｎ結合能を持つＴＦｃＡは、少なくとも１つのＦｃ領域で、１つ以上のアミノ酸の変化を、Ｆｃ領域の“ＦｃＲｎ結合ループ”内に含む。ＦｃＲｎ結合ループは、野生型の全長Ｆｃのアミノ酸残基２８０〜２９９（ＥＵ）からなる。特定の実施形態では、変化したＦｃＲｎ結合能を持つＴＦｃＡは、少なくとも１つのＦｃ領域において、１つ以上のアミノ酸の変化を、ＦｃＲｎの“接触ゾーン”から１５Å以内に含む。１５ÅＦｃＲｎ“接触ゾーン”は、野生型の全長Ｆｃドメイン内に、２４３〜２６１、２７５〜２８０、２８２〜２９３、３０２〜３１９、３３６〜３４８、３６７、３６９、３７２〜３８９、３９１、３９３、４０８、４２４〜４４０（ＥＵ）の部位の残基を含む。特定の実施形態では、変化したＦｃＲｎ結合親和性を持つＴＦｃＡは、少なくとも１つのＦｃ領域（例えば、１つ或いは２つのＦｃ成分）において、１つ以上のアミノ酸の変化を、２５６、２７７〜２８１、２８３〜２８８、３０３〜３０９、３１３、３３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４（例えば、Ｎ４３４Ａ或いはＮ４３４Ｋ）、４３８のＥＵ部位のいずれかに相当するアミノ酸の部位に含む。ＦｃＲｎ結合活性を変える例示的なアミノ酸変化は国際公開第０５／０４７３２７号に開示される。
他に、ＦｃＲｎ結合能を向上させるＦｃ修飾として、２５９、３０８、４２８、４３４の部位での置換があり、例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、４３４Ｍ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌが含まれる。他にＦｃＲｎ結合能を向上させる変異体：２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９（８）：６２１３−６２１６，Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６：３４６− ３５６）、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，２７６（９）：６５９１−６６０４、すべての記載内容を援用する）、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ（Ｄａｌｌ Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２， １６９：５１７１−５１８０，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１：２３５１４−２３５２４、すべての記載内容を援用する）。ＦｃＲｎ結合能を調節する他の修飾は、Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８２：７６６３−７６７１に記載されている。
特定の実施形態では、ＴＦｃＡはＦｃ変異体を含み、そのＦｃ変異体は、例えば野生型のＦｃドメインに比べ、ポリペプチドの抗原依存的エフェクター機能、特にＡＤＣＣ或いは補体活性化を変えるアミノ酸の変化を含む。例示的な実施形態では、該抗体は、Ｆｃガンマ受容体（例えば、ＣＤ１６）との結合能が変化する。このような抗体は、野生型のポリペプチドに比べＦｃγＲｓへの結合が向上或いは低下するが、それ故、それぞれにエフェクター機能が向上或いは低下する。ＦｃγＲｓに対する親和性が向上したＦｃ変異体は、エフェクター機能の向上が期待され、このようなタンパク質は、哺乳類動物の治療法で標的分子の破壊が望ましい場合、例えば癌治療において有効利用できる。対照的に、ＦｃγＲに対する結合親和性が低下したＦｃ変異体は、エフェクター機能の低下が予期される。一実施形態において、ＴＦｃＡは、オプソニン化、食作用、補体依存性細胞障害、抗原依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、エフェクター細胞調節の群から選択される抗原依存的なエフェクター機能のうち、少なくとも１つが野生型のＦｃ領域を含むＴＦｃＡに比べて変化している。
特定の実施形態では、ＴＦｃＡは、活性化ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）に対して変化した結合能を示す。特定の実施形態では、ＴＦｃＡは、抑制性ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩｂ）に対して変化した結合能を示す。別の実施形態では、向上したＦｃγＲ結合親和性（例えば、向上したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性）を持つＴＦｃＡは、２３９、２６８、２９８、３３２、３３４、３７８（ＥＵ）１つ以上の部位に相当するアミノ酸の部位でのアミノ酸の変化を少なくとも１つ持つＦｃドメインを少なくとも１つ含む。特定の実施形態では、低下したＦｃγＲ結合親和性（例えば、低下したＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性）を持つＴＦｃＡは、２３４、２３６、２３９、２４１、２５１、２５２、２６１、２６５、２６８、２９３、２９４、２９６、２９８、２９９、３０１、３２６、３２８、３３２、３３４、３３８、３７６、３７８、４３５（ＥＵ）の１つ以上の部位に相当するアミノ酸の部位でのアミノ酸の変化を少なくとも１つ持つＦｃドメインを少なくとも１つ含む。
特定の実施形態では、向上した補体結合親和性（例えば、向上したＣ１ｑ結合親和性）を持つＴＦｃＡは、２５１、３３４、３７８、４３５（ＥＵ）の１つ以上の部位に相当するアミノ酸の部位でのアミノ酸の変化を持つＦｃドメインを含む。特定の実施形態では、低下した補体結合親和性（例えば、低下したＣ１ｑ結合親和性）を持つＴＦｃＡは、２３９、２９４、２９６、３０１、３２８、３３３、３７６（ＥＵ）の１つ以上の部位に相当するアミノ酸の部位でのアミノ酸の変化を持つＦｃドメインを含む。ＦｃγＲ或いは補体への結合活性を変える例示的なアミノ酸の変化は、国際公開第０５／０６３８１５号に開示されている。特定の実施形態では、ＴＦｃＡは、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｍ２５２Ｔ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｋ（ＥＵ）のＦｃ領域での特異的な置換を１つ以上含む。
別のＦｃ変異体で、ＦｃγＲｓ又は補体、或いはその両方への結合能を低下したものは、３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、３２８Ｒ、２３６Ｒ／３２８Ｒ、２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ｖからなるアミノ酸の置換を１つ以上含む変異体である。部位２９７（下記参照）でグリコシル化を除去すると、やはりＦｃｙＲｓへの結合が低下する。
ＦｃγＲｓ又は補体、或いはその両方への結合を向上させるＦｃへの修飾を含むのは、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄ、３３２Ｅアミノ酸の置換を１つ以上含む変異体である。好ましい変異体に含まれるのは、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔであるが、これらに限定されない。ＦｃγＲや補体との相互作用を向上させる他の修飾は、２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉ、３９６Ｌの置換であるが、これらに限定されない。
ＦｃγＲｌｌｂへの結合を向上させる変異体は、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、３３２Ｅ、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、２６７Ｅ／３２８Ｆのアミノ酸の置換を１つ以上含む変異体である。
Ｆｃを調節するＦｃの修飾は、Ｓｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：６８５−６９１に開示される。
ＴＦｃＡは、ＴＦｃＡのグリコシル化に変化を与えるアミノ酸の置換もまた含んでもよい。例えば、ＴＦｃＡの免疫グロブリン定常領域は、グリコシル化（例えば、Ｎ又はＯ結合型グリコシル化）を低減する変異を持つＦｃドメインを含んでもよいし、変化したグリコ型（例えば、低フコース或いはフコースを含まないグリカン）を野生型のＦｃドメインに含んでもよい。”改変されたグリコ型”とは、共有結合によりＦｃ領域に結合した炭水化物組成物のことであり、該炭水化物組成物は、もとのＦｃ領域の炭水化物組成物とは化学的に異なる。改変されたグリコ型は、エフェクター機能の向上又は低下、或いはそれらに限定されることなく、さまざまな用途に有用である。改変されたグリコ型は、当技術分野で周知のさまざまな方法で製造できる（米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願公開第２０１０−０２５５０１３号；米国特許出願公開第２００３−０００３０９７号；国際公開第００／６１７３９Ａ１号；国際公開第０１／２９２４６Ａ１号；国際公開第０２／３１１４０Ａ１号；国際公開第０２／３０９５４Ａ１号）；（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｇｌｙｃａｒｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））。これらの技術の多くは、例えば、Ｆｃポリペプチドを、改変の有無によらないさまざまな生物や細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ ＣＨＯ細胞やラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）で発現させたり、グリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，−フコシルトランスフェラーゼ］及び／又は、３１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を制御したり、或いは、Ｆｃポリペプチドを発現させた後、炭水化物を修飾したりすることで、フコシル化のレベルを調節する、及び／又はＦｃ領域に共有結合しているオリゴ糖を二分することに基礎を置く。
例示的な実施形態では、あるアミノ酸の変化、例えばアミノ酸の置換は、Ｆｃ領域でアミノ酸部位２９７（ＥＵ）で通常見られるＮ結合型グリカンのグリコシル化の減少を引き起こす。Ｆｃ領域は、また、アミノ酸部位２９７（ＥＵ）で、低フコース或いはフコースを含まないグリカンを含むことができる。特定の実施形態では、ＴＦｃＡは、グリコシル化のモチーフ、例えばアミノ酸配列ＮＸＴ又はＮＳＸを含むＮ結合型グリコシル化モチーフの近く或いはその内側で、アミノ酸の置換を持つ。特定の実施形態では、ＴＦｃＡは、本明細書で具体的に述べるように、Ｆｃの２９７又は２９９（ＥＵ）に相当するアミノ酸の部位でのアミノ酸の置換を含む。グリコシル化を低減させたり変更する例示的なアミノ酸の置換は、国際公開第０５／０１８５７２号及び米国特許出願公開第２００７／０１１１２８１号に開示されている。
別の実施形態では、ＴＦｃＡは、溶媒曝露面に位置する１つ以上の改変されたシステイン残基或いはその類似物を持つＦｃドメインを、少なくとも１つ含む。改変されたシステイン残基或いはその類似物が、ＴＦｃＡの望ましい生物活性を阻害しないことが好ましい。例えば、変化が、ＦｃのＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、或いはＦｃγＲＩＩＩ）或いは補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）へ結合する能力や、免疫エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、食作用、或いはＣＤＣ）を誘導する能力を阻害しないことが望ましい。特定の実施形態では、ＴＦｃＡｓは、少なくとも１つの改変されたフリーのシステイン残基或いはその類似物を含み、実質的に２番目のシステイン残基とジスルフィド結合を行うことから免れるＦｃドメインを含む。ＴＦｃＡｓが含むＦｃ領域は、改変されたシステイン残基或いはその類似物を、ＣＨ３ドメイン中の、３４９−３７１、３９０、３９２、３９４−４２３、４４１−４４６、４４６ｂ（ＥＵ）、より具体的な部位として、３５０、３５５、３５９、３６０、３６１、３８９、４１３、４１５、４１８、４２２、４４１、４４３、ＥＵ部位４４６ｂの１つ以上の位置で持つことができる。
望ましいエフェクター機能は、Ｆｃを特定の免疫グロブリンクラス又はサブクラスから選択したり、例えば、ＩｇＧ１やＩｇＧ２等のように、特定の免疫グロブリンクラス又はサブクラスの特定の領域を組み合わせたりすることでも得られる。例えば、ＡＤＣＣとＣＤＣは（ＩｇＧが、それぞれＦｃγＲｓとＣ１ｑに結合することで）ヒンジとＣＨ２ドメインに位置する残基により媒介されるが、ＩｇＧ４には実質的にエフェクター機能がないため、ＩｇＧ４由来のヒンジ及びＣＨ２ドメインとＩｇＧ１由来のＣＨ３ドメインを組み合わせてＦｃを構築すると、そのＦｃのエフェクター機能は非常に低下したものとなる。ＩｇＧ１のＣＨ２又はＣＨ３、或いはその両方に位置するアミノ酸を、両者のアイソタイプで異なる場合、ＩｇＧ３のアミノ酸に置換することで、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド変異体を構築することができる。したがって、ハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体は、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒ、４３６Ｆの置換を１つ以上含むことで構築することができる。特定の実施形態では、ＩｇＧ２のＣＨ２又はＣＨ３、或いはその両方に位置するアミノ酸を、両者のアイソタイプで異なる場合、ＩｇＧ１のアミノ酸に置換することで、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド変異体を構築することができる。したがって、ハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体は、２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（位置２３６にグリシンを挿入したこと意味する）、３２７Ａの置換を１つ以上含むことで構築することができる。
例示的なＴＦｃリンカー
ＴＦｃＡは、第１のＦｃ領域が第２のＦｃ領域とＴＦｃリンカーにより連結されているＴＦｃを含むことができる。ＴＦｃ及びＴＦｃを含むＴＦｃＡが正確に構造形成されるのに十分な柔軟性がある限り、多種多様なリンカーを使用することができる。特定の実施形態では、リンカーが生物的に不活性であり、一例として生物反応、例えば免疫反応をほとんど誘導することができない。
ＴＦｃリンカーの長さは、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０であり、少なくとも９０〜１００のアミノ酸からなることもある。ＴＦｃリンカーのサイズは、第２のＦｃ領域が、ヒンジ又はその一部を含むのか、或いは全く含まないかに依存する。例えば、第２のＦｃ領域がヒンジを含む場合、ヒンジを含まない場合に比べて、より短いＴＦｃリンカーを使用できる。例えば、第２のＦｃ領域がヒンジを含まない場合、ヒンジの長さに相当するアミノ酸の数の分だけ長いＴＦｃリンカーを使用する。第２のＦｃ領域が上部ヒンジを含まない場合、上部ヒンジの長さに相当するアミノ酸の数の分だけ長いＴＦｃリンカーを使用する。好ましい実施形態では、ＴＦｃＡは、例えば、２番目のヒンジとして中央及び上部ヒンジを持つＴＦｃＡの場合、３５〜４５のアミノ酸、例えば、３７〜４３、３８〜４２、３９〜４１、より具体的には、４０のアミノ酸からなるＴＦｃリンカーを含む。
ＴＦｃリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含むことができる。“Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー”とは、グリシンとセリン残基からなるペプチドを意味する。例示的なＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎの式で表されるアミノ酸配列を含み、ｎは自然数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）を表す。例えば、特定の実施形態では、ＴＦｃリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６ 、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７ 、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８のいずれかを含むか、これらのいずれかから構成される。好ましい実施形態は、ＴＦｃリンカーが（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８である。
Ｇｌｙ及びＳｅｒを含むリンカーで他に使用可能なリンカーがあるが、（Ｇ４Ｓ）ｎの構成では使用できない。例えば、リンカーは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ又は（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎを含むことができ、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５或いはそれより大きい。他にリンカーは、Ｐｒｏ又はＴｈｒを含むことができる。適切なリンカーは、標準生物学的パーツ登録所のウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｐａｒｔｓｒｅｇｉｓｔｒｙ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｄｏｍａｉｎｓ／Ｌｉｎｋｅｒで見つけることができる（他の例として以下も参照。Ｃｒａｓｔｏ ＣＪ ａｎｄ Ｆｅｎｇ ＪＡ． ＬＩＮＫＥＲ： ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌｉｎｋｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ２０００ Ｍａｙ；１３（５） ３０９−１２、Ｇｅｏｒｇｅ ＲＡ ａｎｄ Ｈｅｒｉｎｇａ Ｊ． Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｌｉｎｋｅｒｓ： ｔｈｅｉｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ２００２ Ｎｏｖ；１５（１１） ８７１−９）。
特定の実施形態では、ＴＦｃリンカーは、ＴＲＰＡＰＰＳＴＡＴＴＡＧＳＴＰＱＰＥＳＡＳＰＳＧＫＥＰＡＡＳＳＰＳＳＴＮＴＧＳ（配列番号１６９）のアミノ酸配列を含む。
ＴＦｃリンカーは、配列番号１６９や（Ｇ４Ｓ）ｎと、最大限、１、２、３、４、５、６、７、８、９或いは１０箇所で異なるアミノ酸配列を含むことができる。
ＴＦｃリンカーは、また、非ペプチドポリマーのような非ペプチドリンカーでもよい。“非ペプチドポリマー”とは、２つ以上の繰り返し単位がお互いにペプチド結合以外の共有結合で連結されている生体適合性ポリマーを意味する。非ペプチドポリマーの例として、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸）やＰＬＧＡ（ポリ乳酸ーグリコール酸）のような生体分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸がある。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も好ましい。
例示的なＴＦｃｓ
ＴＦｃＡｓは、ＴＦｃリンカーにより第１のＦｃ領域が第２のＦｃ領域と連結されているＴＦｃを含んでもよい。特定の実施形態では、ＴＦｃは、互いに同じである第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域を含んでもよい。別の実施形態では、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸において互いに異なる（“ヘテロメリックＴＦｃ”）。第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域は、本明細書で開示したどのようなＦｃ領域でもよく、その変異体でもよい。例えば、ＴＦｃは、第１のＦｃ領域で、全長のヒンジ、例えば、全長のＩｇＧ１或いはＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヒンジを含んでもよく、第２のＦｃ領域は、ヒンジの一部、例えば、上部ヒンジの欠けたヒンジを含んでもよい。
第１と第２のＦｃ領域は、本明細書で記載したどのようなＴＦｃリンカーとも組み合わせることができる。上述の通り、ＴＦｃリンカーの長さは、一般的に、第２のＦｃ領域がヒンジ又はその一部を含むのか、或いは全く含まないかに依存する。
特定の実施形態では、ＩｇＧ１ ＴＦｃは、第１のＦｃ領域で配列番号９９を含み、第２のＦｃ領域で配列番号１００を含む。ＩｇＧ１ ＴＦｃｓで使用可能な第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域の組み合わせを、表１０に示す。
特定の実施形態では、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃは、第１のＦｃ領域で配列番号１３３を含み、第２のＦｃ領域で配列番号１３４を含む。ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃｓで使用可能な第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域の組み合わせを、表１１に示す。
ＴＦｃは、表１０又は１１で示した２つのＦｃの組み合わせのどれかを含み、２つのＦｃはＴＦｃリンカーにより連結されることで、連続したポリペプチドを形成するが、そのアミノ末端からカルボキシル末端の順は、第１のＦｃ領域のＣ末端がＴＦｃリンカーのＮ末端と連結し、ＴＦｃリンカーのＣ末端が第２のＦｃ領域のＮ末端と連結する。ＴＦｃリンカーは、２０〜５０の長さからなるアミノ酸を含んでもよいし、それによって構成されてもよい。
例示的なＴＦｃｓは、ｉ）第１のＦｃ領域は、配列番号４からなるヒンジ、配列番号２５からなるＣＨ２ドメイン、配列番号３３からなるＣＨ３ドメインを含み、ｉｉ）ＴＦｃリンカーは、（Ｇ４Ｓ）８を含み、ｉｉｉ）第２のＦｃ領域は、配列番号２３からなるヒンジ、配列番号２５からなるＣＨ２ドメイン、配列番号３７からなるＣＨ３ドメインを含む。これらの単位をセットで含む例示的なＩｇＧ１ ＴＦｃは、配列番号１７１を含むＴＦｃである。ＩｇＧ１及びＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドＴＦｃｓを形成するためのドメイン又は単位の更なる組み合わせは、表１２及び表１３にそれぞれ示す。表１２及び表１３の各単位又はドメインは、配列番号とそれらが含む特異的なＡＥＭ及び／又はＤｉＳにより表される。表１２及び表１３の各ドメイン又は単位は、直接的或いは間接的に連結されてもよい。
表１２に記載されている各ＴＦｃｓのアミノ酸配列（配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５）を図６に示す。表１３に記載されている各ＴＦｃｓのアミノ酸配列（配列番号１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１）を図７に示す。表１２及び表１３の最初のカラムは、例示的なＴＦｃの名前と配列番号を表示し、ＴＦｃが含む単位は、表の対応する列に表示する。
特定の実施形態では、ＴＦｃは、エフェクター機能の有無、正確な構造形成、十分な安定性と可溶性などの望ましい生物活性を示す場合、本明細書に記載したＴＦｃアミノ酸配列、例えば、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１の群から選択されるアミノ酸配列と、最大限、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０又は３００箇所のアミノ酸で、異なるアミノ酸配列を含む。その違いは、１つ以上のアミノ酸の挿入、又は欠失、又は置換、或いはそれらの組み合わせでもよい。特定の実施形態では、ＴＦｃは、それを含むＴＦｃＡが、エフェクター機能の有無、正確な構造形成、十分な安定性と可溶性などの望ましい生物活性を示す場合、本明細書に記載したＴＦｃアミノ酸配列、例えば、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１の群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
例示的な結合部位
ＴＦｃＡは、単一の結合部位を含む一価のＴＦｃＡでもよい。単一の結合部位は、ＴＦｃのアミノ末端或いはカルボキシル末端にあってもよい。単一の結合部位は、ＦａｂやｓｃＦｖでもよい。単一の結合部位がＦａｂである場合、一価のＴＦｃＡは、ＶＨドメイン及び任意選択でＣＨ１ドメインを含む重鎖と、ＶＬドメイン及び任意選択でＣＬドメインを含む軽鎖を含む。
ＴＦｃＡは、２つの結合部位を持つＴＦｃＢＡでもよく、例えば、各結合部位は同じ又は異なった抗原決定基又は抗原と結合する（二価の単一特異性或いは二重特異性ＴＦｃＡ）。ＴＦｃＢＡの結合部位は、同じでも異なったタイプでもよい。例えば、両方の結合部位がＴＦｃｓやＦａｂｓでもよいし、一方の結合部位がＦａｂで、他方の結合部位がｓｃＦｖでもよい。単一ドメインの結合部位も使用できる。Ｆａｂは通常、ＴＦｃＢＡの重鎖のＣＨ１ドメインと連結できるＶＨドメインと、同分子の軽鎖のＣＬドメインと連結できるＶＬドメインを含む。ｓｃＦｖは通常、ｓｃＦｖリンカーと連結するＶＨドメインを含み、ｓｃＦｖリンカーはＶＬドメインと連結される。
ｓｃＦｖは、接続リンカーによりＴＦｃと接続できる。接続リンカーは、大体１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０の長さのアミノ酸で、それより長くてもよい。接続リンカーは化学的に不活性で、非免疫原性であり、ｓｃＦｖを含むＴＦｃＢＡの正確な構造形成を可能にするために必要な柔軟性と剛性を持つことが好ましい。特定の実施形態では、接続リンカーはＧｌｙ−Ｓｅｒ配列を含み、アミノ酸配列、（Ｇ４Ｓ）ｎはその一例である。ｎは、１、２、３、４、５或いはそれより大きい。特定の実施形態では、接続リンカーは（Ｇ４Ｓ）２を含む（例えば、図９参照）。
ｓｃＦＶは、ＶＨとＶＬドメインを接続するｓｃＦＶリンカーを含む。ｓｃＦＶリンカーは、１５〜３０、或いは２０〜２５の長さのアミノ酸でよい。ｓｃＦＶリンカーは化学的に不活性で、非免疫原性であり、ｓｃＦｖを含むＴＦｃＢＡの正確な構造形成を可能にするために必要な柔軟性と剛性を持つことが好ましい。特定の実施形態では、ｓｃＦＶリンカーはＧｌｙ−Ｓｅｒ配列を含み、アミノ酸配列、（Ｇ４Ｓ）ｎはその一例である。ｎは、１、２、３、４、５或いはそれより大きい。しかし、他の配列も使用可能である。特定の実施形態では、ｓｃＦＶリンカーはヒンジの一部、或いはその全長を、単独で、或いは（Ｇ４Ｓ）ｎ配列などの他のアミノ酸と共に含んでもよい。特定の実施形態では、ｓｃＦＶリンカーは、配列“ＡＳＴ”（ＣＨ１ドメインの最初の３アミノ酸）を、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー等のペプチドリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）４の上流に含む（例えば、図９参照）。
特定の実施形態では、ＴＦｃＡは、最初又は２番目、或いはどのヒンジを含まない。ＴＦｃＡは、ヒンジの代わりに接続リンカーを含んでもよい。本明細書のＴＦｃリンカーの項目で具体的に記載されているように、そのようなリンカーはＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーでもよい。例示的な接続リンカーは、ＴＦｃリンカーより短くてもよい。特定の実施形態では、接続リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３或いは（Ｇ４Ｓ）４配列を含む。特定の実施形態では、接続リンカーはヒンジの一部、例えば、上部ヒンジ、中央ヒンジ、下部ヒンジ、或いはこれらの組み合わせ、又は、これらの中のどれか一つの一部と、別のペプチド配列、例えば、ｎが１、２、３、４又は５である（Ｇ４Ｓ）ｎ配列を含む。他のペプチド配列も、リンカーの特定の部位で必要な柔軟性と剛性を付与することができれば、接続リンカーとして使用できる。
特定の実施形態では、結合部位は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖや単一ドメインなどの抗原結合部位である。例示的なＴＦｃＡｓは、１つ以上のＶＨ又はＶＬ、或いはその両方のＣＤＲｓを含み、例として、本明細書で提供される１つ以上の可変領域由来のものが挙げられる。特定の実施形態では、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、図９に示されるＶＨＣＤＲ３又はＶＬＣＤＲ３、或いはその両方の配列を含み、例として、ヒト化抗体５Ｄ５（米国特許出願公開第２００６／０１３４１０４号）、或いは抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２の可変領域の配列が挙げられる（実施例３参照）。特定の実施形態では、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、図９に示されるＶＨドメインの１つに由来する１、２或いは３個のＣＤＲｓ及び／又は、図９に示されるＶＬドメインの１つに由来する１、２或いは３個のＣＤＲｓを含む。特定の実施形態では、抗ＥＧＲＦ結合部位は、図９に示されるＶＨＣＤＲ３又はＶＬＣＤＲ３、或いはその両方の配列を含む。特定の実施形態では、抗ＥＧＲＦ結合部位は、図９に示されるＶＨドメインの１つに由来する１、２或いは３個のＣＤＲｓ及び／又は、図９に示されるＶＬドメインの１つに由来する１、２或いは３個のＣＤＲｓを含む。結合部位は、また、図９で示される１つ以上のＣＤＲｓを含むことができ、結合部位がその標的に特異的に結合できる限りにおいては、１、２或いは３個のアミノ酸が、例えば、置換、付加、欠失により変化した。
特定の実施形態では、ＴＦｃＡｓは、図９で示された１つ以上の可変領域を含む。例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、図９に示されるＶＨ又はＶＬ、或いはその両方の配列を含むことができ、例として、ヒト化抗体５Ｄ５（米国特許出願公開第２００６／０１３４１０４号）、或いは抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２の可変領域が挙げられる。例示的な抗ＥＧＲＦ結合部位は、図９に示されるＶＨ又はＶＬ、或いはその両方の配列を含み、例として、パニツムマブ、２２２４、セツキシマブ、ヒト化セツキシマブＨ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、Ｈ２Ｌ２配列が挙げられる（実施例３参照）。
特定の実施形態では、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＲＦ ＴＦｃＡｓは、抗ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂ及び抗ＥＧＲＦ ｓｃＦｖを含む。表１４は、ＴＦｃＡｓを構築するのに使用可能な、抗ｃ−Ｍｅｔ及び抗ＥＧＲＦアミノ酸のそれぞれの配列のＣＤＲｓ又は可変ドメインでの組み合わせを示す。この表は、配列が本明細書に記載されている場合は、その配列番号を示し、組み合わせが可能な場合は、”ｙｅｓ”と記してあるが、結果的に得られるアミノ酸配列を具体的に示していない。当分野の技術者は、タンパク質とそれをコードする塩基配列を含むすべての要素が本明細書に記載されていることから、過度の実験をすることなく、このような分子を構築することができるであろう。
表１４の重鎖と共に使用可能な軽鎖は、ＴＦｃＡで使用される特定の抗−ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂの軽鎖である。例として、ヒト化５Ｄ５由来のＶＨドメインを含むＴＦｃＡ、例えば、配列番号２２５、２２７、２２９、２３５、２３９、２６０、２８１、２８３、２８５、３４２のどれか１つを含むＴＦｃＡは、ヒト化５Ｄ５由来のＶＬドメイン、つまり配列番号２３１を含む軽鎖と共に使用できる。抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位２由来のＶＨドメインを含むＴＦｃＡ、例えば、配列番号２９１を含むＴＦｃＡは、抗−ｃ−Ｍｅｔ結合部位２由来のＶＬドメイン、例えば、配列番号２８９のＶＬドメインを含む軽鎖と共に使用できる。
抗原結合部位、例えば本明細書で記載したものは、安定性の向上、不均一性の低下、発現量の向上、可溶性の向上或いは他の望ましい性質を目的として、改変することが可能である。向上した安定性や増加した発現量を備えるｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、Ｆａｂなどの抗体断片の改変法は、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１２７８９３号、米国特許出願公開第２００９／００４８１２２号、及びこれらに含まれる参考文献に記載されている。
修飾された可変領域の結合部位が、その標的抗原、例えば、ｃ−ＭＥＴ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インシュリン受容体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（α及びβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２の群から選択されるヒトの抗原との特異的な結合能を保持する限り、可変ドメインは、本明細書で記載されたものと異なるか、或いは、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００箇所のアミノ酸で異なってもよい。ＴＦｃＡｓ、例えばＴＦｃＢＡｓで使用される可変ドメインは、また、修飾された可変ドメインの結合部位が標的抗原との特異的な結合能を保持する限り、図９で記載されるＶＨ或いはＶＬアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％或いは９９％同一であるＶＨ或いはＶＬアミノ酸配列を含んでもよい。
抗ｃ−Ｍｅｔ又は抗ＥＧＲＦ、或いはその両方のＴＦｃＢＡｓは、本明細書に記された結合部位、例えば図９で記載された配列を持つ結合部位と、ヒトのｃ−Ｍｅｔ或いはヒトのＥＧＦＲ上で同じ抗原決定基と結合するような結合部位を含んでもよい。本明細書に包含される結合部位は、また、本明細書に記載されているある結合部位、例えば図９で記載された配列を持つ結合部位の結合を競合的遮断或いは、それと拮抗してもよい。ＴＦｃＡは、本明細書で記載される結合部位と、標的抗原や抗原決定基への結合において拮抗する結合部位を含み、その結合部位は、例えば、参照用の結合部位の後にＥＬＩＳＡに加えることで、参照用の結合部位（例えば、本明細書に記載されているような）を取り除くことができるか、その結合部位を参照用の結合部位の後にＥＬＩＳＡに加えることで、参照用の結合部位が結合するのを阻害する。
ＴＦｃＡは、また、当技術分野に周知の、抗−ｃ−Ｍｅｔ、抗−ｃ−Ｋｉｔ、抗−ＥｒｂＢ２、抗−ＥｒｂＢ３、抗−ＥｒｂＢ４、抗−ＩＧＦ１Ｒ、抗−ＩＧＦ２Ｒ、抗−インシュリン受容体、抗−ＲＯＮ、抗−ＶＥＧＦＲ１、抗−ＶＥＧＦＲ２、抗−ＴＮＦＲ、抗−ＦＧＦＲ１、抗−ＦＧＦＲ２、抗−ＦＧＦＲ３、抗−ＦＧＦＲ４、抗−ＰＤＧＦＲα、抗−ＰＤＧＦＲβ、抗−ＥＰＣＡＭ、抗−ＥｐｈＡ２或いは抗−ＥＧＦＲ抗体由来の可変ドメインを含むことができる。周知の抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体は、米国特許５，６８６，２９２、米国特許７，４７６，７２４号、国際公開第２００４／０７２１１７号、国際公開第２００４／１０８７６６号、国際公開第２００５／０１６３８２号、国際公開第２００５／０６３８１６号、国際公開第２００６／０１５３７１号、国際公開第２００６／１０４９１１号、国際公開第２００７／１２６７９９号、国際公開第２００９／００７４２７号に記載されている。例示的な周知の抗−ＥＧＦＲ抗体として、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ）（Ｙａｎｇ， Ｘ． Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍａｔｏｌ． ３８（２００１）１７−２３）及びヒト化したＩＣＲ６２（国際公開第２００６／０８２５１５号）がある。例示的な抗−ｃ−ｋｉｔ抗体は、米国特許第７９１５３９１号及び欧州特許第０５８６４４５Ｂ１号に記載されている。例示的な抗−ＥｒｂＢ２抗体は、米国特許第５８２１３３７と米国特許第７５６０１１１号に記載されている。例示的な抗−ＥｒｂＢ３抗体は、米国特許第７７０５１３０号、米国特許第７８４６４４０号、国際公開第２０１１／１３６９１１号に記載されている。例示的な抗−ＥｒｂＢ４抗体は、米国特許第７３３２５７９号及び米国特許出願公開第２０１０／０１９０９６４に号記載される。例示的な抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、米国特許第７８７１６１１号及び米国特許第７７００７４２号に記載されている。例示的な抗−インシュリン受容体抗体は、Ｂｈａｓｋａｒ Ｖ． ｅｔ ａｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ２０１２ Ｍａｙ；６１（５）：１２６３−７１に記載されている。例示的な抗−ＲＯＮ抗体は、国際公開第２０１２／００６３４１号、米国特許出願公開第２００９／０２２６４４２号、米国特許第７９４７８１１号に記載されている。例示的な抗−ＶＥＧＦＲ１抗体は、国際公開第２００５／０３７２３５号に記載されている。例示的な抗−ＶＥＧＦＲ２抗体は、米国特許第８０５７７９１号と米国特許第６３４４３３９号に記載されている。例示的な抗−ＴＮＦＲ１抗体は、欧州特許第１９７２６３７Ｂ１号及び米国特許出願公開第２００８／０００８７１３号に記載されている。例示的な抗−ＦＧＦＲ１抗体は、Ｒｏｎｃａ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ；９（１２）； ３２４４−５３，２０１０及び国際公開第２００５／０３７２３５号に記載されている。例示的な抗−ＦＧＦＲ２抗体は、国際公開第２０１１／１４３３１８号に記載されている。例示的な抗−ＦＧＦＲ３抗体は、国際公開第２０１０／００２８６２号及び欧州特許第１４２３４２８Ｂ１号に記載されている。例示的な抗−ＦＧＦＲ４抗体は、国際公開第０３／０６３８９３号、国際公開第２００８／０５２７９６号、米国特許出願公開第２０１０／０１６９９９２号に記載されている。例示的な抗−ＰＤＧＦＲα抗体は、米国特許第８１２８９２９号及び国際公開第１９９５／０００６５９号に記載されている。例示的な抗−ＰＤＧＦＲβ抗体は、米国特許第７７４０８５０号に記載されている。例示的な抗−ＥＰＣＡＭ抗体は、米国特許第７９７６８４２号、米国特許出願公開第２００３／０１５７０５４号、国際公開第２００１／００７０８２号に記載されている。例示的な抗−ＥｐｈＡ２抗体は、欧州特許第１５７５５０９Ｂ１号、米国特許第７４０２２９８号、米国特許第７７７６３２８号に記載されている。例示的な抗−ＣＤ−４４ｍ抗体は、米国特許第８０７１０７２号、国際公開第２００８／０７９２４６号、米国特許第６９７２３２４号に記載されている。例示的なＣＥＡ抗体は、米国特許第７６２６０１１に記載されている。例示的なＡＬＫ抗体は、米国特許第６６９６５４８号、米国特許第７９０２３４０、国際公開第２００８／１３１５７５号に記載されている。例示的なＡＸＬ抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０３３００９５号、米国特許出願公開第２０１２／０１２１５８７号、国際公開第２０１１／１５９９８０号に記載されている。
特定の実施形態では、結合部位は結合ペプチドである。Ｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドは、例えば、Ｍａｔｚｋｅ，Ａ．， ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５ （１４）（２００５） ６１０５−１０．及びＴａｍ，Ｅｒｉｃ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３８５（２００９）７９−９０によって周知である。
結合部位は標的に特異的に結合し、例えば、表面プラズモン共鳴（例えばＢＩＡｃｏｒｅシステムを使用）で測定したＫｄ値が１０−６、１０−７、１０−８、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、或いはこれより低いことが望ましい。
ＴＦｃＡｓはどのような標的タンパク質、例えば、可溶性や膜のヒト標的タンパク質とも特異的に結合できる。例示的な標的タンパク質として、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インシュリン受容体、ＲＯＮ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４ ＰＤＧＦＲ（α及びβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２の群から選択されるヒト受容体タンパク質がある。
例示的な重鎖および及び軽鎖
一実施形態において、ＴＦｃＡは重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡは、図９で記載されるａａ配列を含む重鎖及び／又は実施例３で記載されるａａ配列を含む軽鎖を含む。
ＴＦｃＢＡは更に、（最大）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、又は３００ａａにおいて図９で記載されるａａ配列と異なるａａ配列を含む重鎖及び／又は軽鎖を含む可能性がある。ただし、本明細書中で更に記載されるように、ＴＦｃＢＡは所望の生物学的特性を有するものとする。ＴＦｃＢＡは更に、図９の重鎖又は軽鎖のａａ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であるａａ配列を含む重鎖及び／又は軽鎖も含み得、この場合、ＴＦｃＢＡは所望の生物学的特性を有する。
ＴＦｃＢＡは更に、２より多い結合部位も含む可能性があり、この場合、重鎖は、１、２、３、４又はそれ以上のＶＨドメインを含み、これは次の分子：Ｆａｂ−ＴＦｃ−ｓｃＦｖ；Ｆａｂ−ＴＦｃ−Ｆａｂ；ｓｃＦｖ−ＴＦｃ−ｓｃＦｖ；及びｓｃＦｖ−ＴＦｃ−Ｆａｂのいずれか１つのＮ末端及び／又はＣ末端と結合させることができる。更なる結合部位はＦａｂ又はｓｃＦｖのいずれかであり得る。
ＴＦｃＡの生物学的活性
特定の実施形態において、１以上の標的タンパク質と結合するＴＦｃＡ、例えば、ＴＦｃＢＡは、１以上の標的タンパク質が介在するシグナル伝達を阻害する。例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡは、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲのいずれか又は両方が介在するシグナル伝達を阻害する可能性がある。シグナル伝達の阻害は、例えばＥＧＦＲ及びＥＲＫのリン酸化の阻害によって証明することができる。特定の実施形態において、ＴＦｃＡは、例えば実施例で記載するように、例えば実験の最後で測定すると、ＴＦｃＡの非存在下でのリン酸化と比べて少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及び／又はＥＲＫのリン酸化を阻害する。好ましいＴＦｃＡは、例えばｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲのリン酸化の阻害によって測定されるｃ−Ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲシグナル伝達をほぼ完全に、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％を阻害する。
このセクションで記載されている生物学的特性は主に抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡに関連して記載されているが、説明は他のＴＦｃＢＡ、並びに一価ＴＦｃＡにも同様に当てはまる。
ａ）ｃ−Ｍｅｔのリガンドが介在するリン酸化、及びｂ）ＥＧＦＲのリガンドが介在するリン酸化の阻害は、それぞれＴＦｃＢＡと接触しない対照細胞におけるリン酸化に対して、ａ）ＨＧＦファミリーリガンドによって誘導されるｃ−Ｍｅｔ、ｂ）ＥＧＦなどのＥＧＦＲリガンドによって誘導されるＥＧＦＲ、又はｃ）ｃ−ＭｅｔリガンドもしくはＥＧＦＲリガンドによって誘導されるＥＲＫのリン酸化レベルを再現可能に減少させるＴＦｃＢＡの能力によって示すことができる。ｃ−Ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲを発現する細胞は、天然に存在する細胞もしくは細胞系の細胞であり得るか、又はｃ−Ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲをコード化する核酸を宿主細胞に導入することによって組み換えにより産生することができる。特定の実施形態において、ＴＦｃＢＡは、ＨＧＦファミリーリガンドが介在するｃ−Ｍｅｔのリン酸化を、例えばＥＬＩＳＡによって測定し、実施例で記載するようにして算出すると、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％又はそれ以上阻害する。特定の実施形態において、ＴＦｃＢＡは、ＥＧＦＲのＥＧＦ介在性リン酸化を、例えばＥＬＩＳＡによって測定し、実施例で記載されるようにして算出すると、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％又はそれ以上阻害する。特定の実施形態において、ＴＦｃＢＡは、ＥＲＫのＥＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔ介在性リン酸化を、例えばＥＬＩＳＡによって測定し、実施例で記載されるようにして算出すると、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％又はそれ以上阻害する。
ＴＦｃＢＡは、ｃ−Ｍｅｔのリガンド誘導性リン酸化を少なくとも７０％又は８０％、ＥＧＦＲのリガンド誘導性リン酸化を少なくとも８５％、９０％又は９５％、場合によってＥＲＫのリガンド誘導性リン酸化を少なくとも５％又は１０％阻害し得る。ＴＦｃＢＡは更に、ｃ−Ｍｅｔのリガンド誘導性リン酸化を少なくとも８５％、ＥＧＦＲのリガンド誘導性リン酸化を少なくとも８５％、場合によってＥＲＫのリガンド誘導性リン酸化を少なくとも５％阻害し得る。特定の実施形態において、ＴＦｃＢＡは、ｃ−Ｍｅｔのリガンド誘導性リン酸化を少なくとも５０％、ＥＧＦＲのリガンド誘導性リン酸化を少なくとも９０％、場合によってＥＲＫのリガンド誘導性リン酸化を少なくとも５％阻害する。
ＴＦｃＢＡは更に、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫの１以上のリン酸化のそれらの阻害のＥＣ５０（すなわち、最大阻害の５０％が得られるＴＦｃＢＡの濃度）によって規定することができ、このＥＣ５０は、本明細書中で更に記載されるように決定することができる。例えば、本明細書中で開示されるＴＦｃＢＡｓは、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ又はそれ以下のＥＣ５０で阻害する可能性がある。それらは、ＥＧＦＲのリン酸化を１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ又はそれ以下のＥＣ５０で阻害する可能性がある。それらは、ＥＲＫのリン酸化を１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ又はそれ以下のＥＣ５０で阻害する可能性がある。本明細書中で開示されるいくつかのＴＦｃＢＡは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ又はそれ以下のＥＣ５０でｃ−Ｍｅｔのリン酸化を少なくとも８０％又は８５％阻害する；１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ又はそれ以下のＥＣ５０でＥＧＦＲのリン酸化を少なくとも８０％又は８５％阻害する；場合によって１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ又はそれ以下のＥＣ５０でＥＲＫのリン酸化を少なくとも５％阻害する。場合によっては、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化及びＥＧＦＲのリン酸化のいずれか又は両方は本明細書中で開示されているＴＦｃＢＡで本質的に完全に妨害され得るであろう。
特定の実施形態において、ＴＦｃＡを０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ｍｇ／ｍｌもしくはそれ以上の濃度（又はこれらのいずれか２つの数値間の濃度範囲）で含む溶液は、例えば後述する安定性試験に続いて、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定すると、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を超えるＴＦｃＢＡを非凝集形態（この文脈ではモノマーと称する）で含む。モノマーの百分率は、次の安定性試験のうちの１つの後の溶液中で測定することができる：ａ）４℃で１、２、３、４、５、もしくは６日間、又は１、２、３週間もしくはそれ以上のインキュベーション；ｂ）室温で１、２、３、４、５、もしくは６日間、又は１、２、３週間もしくはそれ以上のインキュベーション；ｃ）３７℃で１、２、３、４、５、もしくは６日、又は１、２、３週間もしくはそれ以上のインキュベーション；ｄ）１、２、３、４又は５サイクルの凍結／解凍、及びｅ）撹拌、例えばオービタルシェーカーで室温にて、例えば１、２、３、４、５時間又はそれ以上穏やかに撹拌。
特定の実施形態において、ＴＦｃＡは、血清中３７℃で１、２、３、４又は５日のインキュベーション後に、０日でのその安定性に比べて少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の安定性を示し、この場合、タンパク質の安定性は、例えばＳＥＣ又は、インキュベーション後のその標的抗原の１以上に結合するその能力を測定することによって決定される。
特定の実施形態において、ＴＦｃＡは、実施例で記載されるように、例えば示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって測定して、少なくとも５０℃、５５℃、５８℃又は６０℃の融点（Ｔｍ）を有する。
ＴＦｃＡは、本明細書中で記載される特性の２以上の組み合わせを有し得る。例えば、ＴＦｃＢＡは、リガンド誘導性ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を少なくとも７０％阻害する可能性があり、リガンド誘導性ＥＧＦＲのリン酸化を少なくとも７０％阻害する可能性があり、更に以下の特性の１以上も示す可能性がある：（ｉ）ＤＳＦによって測定して、少なくとも５５又は６０℃のＴｍ；及び（ｉｉ）室温で５日以上、４℃で２週間、１サイクル以上の凍結−解凍又は穏やかな撹拌後、１０ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ中少なくとも７０％、８０％又は９０％モノマーである。特定の実施形態において、ＴＦｃＢＡは、少なくとも６０℃のＴｍ、及び室温、４℃又は３７℃で少なくとも９０％の安定性（モノマーの初期濃度に対する、これらの条件下でインキュベーション後のモノマーの濃度）を有する。
特定の実施形態において、ＴＦｃＡ組成物は１以上の以下の特性を含む：１）タンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、タンパク質Ａに関して精製した後にＳＤＳ ＰＡＧＥで見ることができる；２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で観察される種の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が正しい分子量である；３）示差走査蛍光定量法によって測定される熱安定性プロフィールは溶融球挙動（ｍｏｌｔｅｎ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｂｅｈａｖｉｏｒ）を示さない；４）ＳＥＣによって可視化される５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％又はそれ以上のモノマーを含まない；及び５）ｐＥＧＦＲ阻害によって測定して、外因性ＥＧＦリガンドの添加によって活性化されるＥＧＦ受容体シグナリングの９５％超を阻害する。
ＴＦｃＢＡなどのＴＦｃＡの生物学的活性及び特性を決定するために標準的アッセイを用いることができる。例示的アッセイを実施例で提供する。
核酸、発現ベクター及び宿主細胞
本明細書中で記載されるポリペプチドをコード化する核酸、例えばＤＮＡ及びＲＮＡが本明細書中で提供される。本明細書中で提供される例示的ヌクレオチド配列は、図面で記載されるａａ配列をコード化する。特定の実施形態において、ＴＦｃＡの重鎖又は軽鎖をコード化するヌクレオチド配列は、細胞におけるヌクレオチド配列の発現を増強又は促進する配列と連結されて、タンパク質を産生する。そのような核酸は、ベクター、例えば発現ベクター内に含まれ得る。
分泌させる目的で、ＴＦｃＡの重鎖及び／又は軽鎖は、好ましくはシグナル配列を含み、これは通常、分泌後に切断されて、成熟ポリペプチドを提供する。以下のシグナル配列を使用することができる。
ＭＧＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号２４１）、例えば、重鎖の発現で使用するため；及び
ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２４３）、例えば、軽鎖の発現で使用するため。
配列番号２４１をコード化する例示的ヌクレオチド配列はａｔｇｇｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｇｔｃｇｔｇｇｃｔｔｔｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇａｔｔｃｔｔａａｇｇｇｇｇｔｃｃａｇｔｇｃ（配列番号２４０）であり、配列番号２４３をコード化する例示的ヌクレオチド配列はａｔｇｇｇｃａｃｃｃｃｃｇｃａｃａｇｃｔｃｔｔｇｔｔｃｔｔｇｃｔｇｃｔｔｃｔｔｔｇｇｃｔｃｃｃｔｇａｃａｃａａｃｔｇｇｔ（配列番号２４２）である。
本明細書中で記載されるポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列又は本明細書中で記載されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、本明細書中で更に記載されるようなＴＦｃＡの重鎖及びもしくは軽鎖、又はその一部をコード化するＤＮＡなどの核酸も本明細書中に含まれる。そのようなヌクレオチド配列は、本明細書中で記載されるタンパク質をコード化することができるか、又は本明細書中で記載されるタンパク質又はその一部（例えばドメイン）、例えば図面のいずれか１つで記載されるａａ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一又は類似しているタンパク質をコード化することができる。
本明細書中で提供される核酸又はベクターを含む宿主細胞などの細胞も本明細書中に含まれる。
本明細書中で記載されるＴＦｃＡは組み換え手段によって産生することができる。組み換え産生のための方法は当該技術分野で広く知られており、原核及び真核細胞におけるタンパク質発現とその後の抗体の単離及び通常は薬剤的に許容される純度まで精製することを含む。宿主細胞におけるＴＦｃＡの発現のために、例えば軽鎖及び重鎖などの各ポリペプチドをコード化する核酸を標準的方法によって発現ベクターに挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、又はイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような適切な原核もしくは真核宿主細胞で実施され、ＴＦｃＡを細胞（溶菌後の上清又は細胞）から回収する。抗体の組み換え産生のための一般的方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ， Ｓ．Ｃ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ １７ １８３−２０２ （１９９９）；Ｇｅｉｓｓｅ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ８ ２７１−２８２ （１９９６）；Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．， ＭｏＩ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６ １５１−１６１ （２０００）；Ｗｅｒｎｅｒ， Ｒ．Ｇ．， Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． ４８ ８７０−８８０ （１９９８）の総説で記載されている。
ＴＦｃＡは、好適には培養培地から、例えばタンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの通常の免疫グロブリン精製手順によって分離することができる。ＴＦｃＡをコード化するＤＮＡ及びＲＮＡは、通常の手順を使用して容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡなどの供給源としての働きをすることができる。一旦単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに挿入することができ、これを次いで、それ以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトさせて、宿主細胞での組み換えＴＦｃＡｓの合成が得られる。
ＴＦｃＡのａａ配列変異体（又は突然変異体）は、適切なヌクレオチド変化をＴＦｃＡ ＤＮＡに導入することによるか、又はヌクレオチド合成によって調製することができる。
「宿主細胞」は、本明細書中で記載されるＴＦｃＡを生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を意味する。一実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞は宿主細胞として使用される。ＮＳＯ細胞における発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ， Ｌ． Ｍ．，ｅｔ ａｌ， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２ １０９−１２３（２０００）；Ｂａｒｎｅｓ， Ｌ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ７３ ２６１−２７０（２００１）によって記載されている。一過性発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ３０ Ｅ９（２００２）によって記載されている。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６ ３８３３−３８３７（１９８９）；Ｃａｒｔｅｒ， Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ ４２８５−４２８９（１９９２）；及びＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４ ７７−８７（１９９７）によって記載されている。例示的一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ， Ｅ． −Ｊ．，ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．， ｉｎ Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０ ７１−８３（１９９９）及びＳｃｈｌａｅｇｅｒ， Ｅ．−Ｊ．，ｉｎ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４ １９１−１９９（１９９６）によって記載されている。
原核生物に好適な制御配列は、例えば、プロモータ、場合によってオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモータ、エンハンサ及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係にある場合に、「機能的に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダー（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡと機能的に連結され；プロモータ又はエンハンサは、配列の転写に影響を及ぼす場合は、コーディング配列と機能的に連結される；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置される場合は、コーディング配列に機能的に連結されている。一般的に、「機能的に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が近接し、分泌リーダーの場合は、近接し、リーディングフレーム中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサは近接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは従来の慣例にしたがって使用される。
細胞成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野で周知の他のものをはじめとする標準的技術によって除去するために、ＴＦｃＡの精製を実施してもよい。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， ｅｄ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと。例えば微生物タンパク質を使用するアフィニティークロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合モード交換）、チオフィリック（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）吸着（例えば、β−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを使用）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック（ａｒｅｎｏｐｈｉｌｉｃ）樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を使用）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）−及びＣｕ（ＩＩ）−アフィニティー物質を使用）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動法（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）などのさまざまな方法が十分に確立され、タンパク質精製のために広く使用されている（Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ，Ｍ．Ａ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ７５ ９３−１０２（１９９８））。
ＴＦｃＡを使用する方法
ＴＦｃＡ、例えばＴＦｃＢＡを使用する方法が本明細書中で提供される。ＴＦｃＢＡは、さまざまな癌をはじめとする、受容体依存性シグナリングに関連する疾患又は障害を治療するために使用することができる。
一実施形態において、例えばｃ−Ｍｅｔ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（α及びβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ及び／又はＥｐｈＡ２などのＴＦｃＡの標的を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法が提供される。方法は、腫瘍細胞の増殖が阻害、減速、もしくは停止されるように、又は腫瘍細胞が死滅するように、腫瘍細胞をＴＦｃＡと接触させることを含み得る。
患者にＴＦｃＢＡを、疾患又は障害を治療するために有効な量で投与することによって、例えばｃ−Ｍｅｔ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（α及びβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ及び／又はＥｐｈＡ２などのＴＦｃＢＡの標的のシグナリング経路に関連する疾患もしくは障害を治療するための方法が本明細書中で提供される。好適な疾患又は障害としては、限定されないが、例えば乳癌及び後述するものをはじめとするさまざまな癌が挙げられる。一実施形態において、癌などの増殖性疾患を有する対象を治療するための方法は、それを必要とする対象に治療有効量の１以上のＴＦｃＡを投与することを含む。
患者において、ＴＦｃＢＡなどのＴＦｃＡ、例えばｃ−Ｍｅｔ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（α及びβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２及び／又はＥＧＦＲなどの標的を発現する腫瘍を治療するための方法（又は治療するためのＴＦｃＡ、例えば薬剤）も提供され、この方法は、腫瘍成長を減速もしくは停止させるため、腫瘍を阻止もしくは縮小させるため、又は腫瘍侵襲性（ｉｎｖａｓｉｖｎｅｓｓ）又は腫瘍転移を減速もしくは停止させるために有効なＴＦｃＡ量を投与することを含む）。胃癌、食道癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、及び甲状腺癌、肝細胞癌、グリオーマ／グリア芽腫、及び乳癌（基底／三種陰性及びＨＥＲ２＋）の癌の腫瘍をはじめとする、ｃ−Ｍｅｔ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（α及びβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２及び／又はＥＧＦＲを発現する腫瘍を治療することができる。
腫瘍又は腫瘍を有する対象を治療する方法は、第２の抗癌剤をＴＦｃＡと組み合わせて投与することを更に含み得る。したがって、ＴＦｃＡを第２の抗癌剤、典型的には生物剤とあわせて、少なくとも１つの薬剤的に許容される担体又は賦形剤とともに含む新規組成物が企図される。
１以上のＴＦｃＡを含むキットも提供される。キットは、その内容物の意図される使用を表示し、場合によってＴＦｃＡ依存性シグナリング、例えばＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ依存性シグナリングの標的と関連する疾患又は障害の治療におけるキットの使用に関する注意を含むラベルを含んでもよい。ラベルという用語は、キット上もしくはキットに添えて提供されるか、又はその他の方法でキットに添付された任意の文書、マーケティング資料又は記録資料を含む。
医薬組成物
別の態様において、患者において腫瘍を治療するための組成物、例えば医薬組成物が提供され、また患者において腫瘍を治療するためのそのような組成物それぞれの使用方法も同様に提供される。本明細書中で提供される組成物は、薬学上許容される担体とともに処方された、本明細書中で開示される１以上の抗体、例えばＴＦｃＡを含む。本明細書中で用いられる場合、「薬学上許容される担体」は、生理学的に適合性であるすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は注入による）に好適である。投与経路に応じて、抗体は、タンパク質を不活性化する可能性がある酸や他の自然条件の作用から抗体を保護する材料でコーティングしてもよい。
医薬組成物は単独又は併用療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法は本開示の抗体と少なくとも１つの更なる治療薬、例えば抗癌剤とを含み得る。医薬組成物は更に、別の抗癌治療法、例えば放射線療法及び／又は外科手術と組み合わせて投与することもできる。
本開示の組成物は、当該技術分野で公知のさまざまな方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路及び／又は様式は所望の結果によって異なるであろう。
本明細書中で提供される組成物をある投与経路によって投与するために、抗体をその不活性化を防止する物質でコーティングするか、又は抗体をそのような物質と同時投与することが必要であるか、又は望ましい可能性がある。例えば、抗体を患者に適切な担体中、例えばリポソーム、又は希釈剤中で投与することができる。薬学上許容される希釈剤としては、生理食塩水及び水性緩衝液が挙げられる。リポソームには、水中油中水ＣＧＦエマルジョン並びに通常のリポソームが含まれる。
薬学上許容される担体としては、無菌水溶液又は分散液及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製用無菌粉末が挙げられる。薬学上活性な物質用のそのような媒体及び薬剤の使用は当該技術分野で知られている。任意の賦形剤、希釈剤又は薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、本明細書中で提供される医薬組成物におけるその使用が企図される。追加の活性化合物（例えば更なる抗癌剤）も組成物中に組み入れることができる。
治療用組成物は、典型的には、無菌であり、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならない。組成物を、溶液、ミクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として処方することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、並びにそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。生理食塩水溶液並びにデキストロース及びグリセロール水溶液を、特に注射溶液のための液体担体として用いることができる。組成物は、所望により、少量の湿潤剤もしくは溶解度増強剤、安定剤、防腐剤、又はｐＨ緩衝剤も含み得る。多くの場合、等張剤、例えば塩化ナトリウム、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールを組成物中に含有させるのが有用である。組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを含有させることによって、注射可能な組成物の長時間にわたる吸収をもたらすことができる。
以下の実施例は、本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
実施例全体にわたって、特に明記しない限り、以下の材料及び方法を使用する。一般的に、本開示の技術の実施は、特に明記しない限り、化学、分子生物学、組み換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば抗体技術）の従来技術、薬理学、薬学、及びポリペプチド調製における標準的技術を利用する。
実施例１：安定なタンデムＦｃ構造の同定
この実施例は、安定な多価Ａｂフォーマットの同定を記載する。この実施例及び実施例２では、結合部位を含まないタンパク質構築物を使用した。いくつかのフォーマットを比較し、これらのフォーマットのそれぞれは以下の２つのタンデムＦｃ構築物のうちのいずれか１つから誘導した。
１）ＴＦｃ「２３」又は「ＩｇＧ１ ＴＦｃ」：これは、ＩｇＧ１ヒンジ；置換Ｎ２９７Ｑを含むＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン；置換Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含むＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン；（Ｇ４Ｓ）８からなるＴＦｃリンカー、上部ヒンジ（ｕｐｐｅｒ ｈｉｎｇｅ）を含まないＩｇＧ１ヒンジ；置換Ｎ２９７Ｑを含むＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン；及び置換Ｔ３６６Ｗを含むＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１ ＴＦｃを含む。この構築物は配列番号２９３として記載されるａａ配列を含む（図１１を参照のこと）；並びに
２）ＴＦｃ「３９」又は「ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ ＴＦｃ」：これは、ＩｇＧ１上部ヒンジ及びコア及び下部ＩｇＧ４ヒンジを含むハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジ；置換Ｔ２９９Ｋを含むＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン；置換Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含むＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン；（Ｇ４Ｓ）８からなるＴＦｃリンカー；上部ヒンジを含まないＩｇＧ４ヒンジ；置換Ｔ２９９Ｋを含むＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン；及び置換Ｔ３６６Ｗを含むＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１／ＩｇＧ４タンデムＴＦｃを含む。この構築物は配列番号３１９として記載されるａａ配列を含む（図１１を参照のこと）。
ＴＦｃ２３及び３９の６つの修飾形を作成し、これらを表１５に記載する。簡単に言うと、最初の修飾はノブ又はホール（ｋｎｏｂ ｏｒ ｈｏｌｅ）（ＴＦｃ ２３Ａ）の近くにジスルフィド結合を付加することであった。別の修飾は、更に小さなノブ／ホール（ＴＦｃ ２３Ｂ）のための２３Ａのノブホールの変更であった。別の修飾によって、１又は２個のシステインを第１ヒンジの上部ヒンジに導入して、ＴＦｃ内にジスルフィド架橋を形成した（それぞれＴＦｃ２３Ｄ及びＣ）。別の修飾によって、ＣＨ３ドメインにＣ末端システインを導入した（ＴＦｃ２３Ｅ）。ＴＦｃにおける別の修飾は、ＴＦｃリンカーの長さを２０ａａ短くすることから構成されていた（ＴＦｃ２３Ｆ、「２３Ｇ」とも称する）。これらの新たに修飾されたＴＦｃのａａ配列（表１５に示す）は、この実施例で使用するＴＦｃが上部ヒンジの一部、すなわちａａｓ ＥＰＫＳＣを含まず、シグナルペプチドを含んでいたこと以外は、図６及び７で記載するものと同じである。これらのＴＦｃのヌクレオチド及びａａ配列を図１１に示し、ＴＦｃのドメイン又はエレメントのそれぞれの同一性を表１２及び１３に記載し、唯一の相違は、第１ヒンジがそのＮ末端でＥＰＫＳＣを含まないことであった。
異なる核酸（配列番号２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、又は３２８を有する）をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に過渡的にトランスフェクトし、本質的に以下のようにして１ステップタンパク質Ａ精製で精製した。タンパク質をコード化する核酸を単一タンパク質として発現プラスミドに標準的組み換えＤＮＡ技術を使用してクローン化する。用いられる発現ベクターはｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。発現プラスミドを、ポリエチレンイミン（２．５μｇ／ｍｌ培養物）及びＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ細胞培養物）を使用してトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートし、次いで収集する。すべてのタンパク質を、タンパク質Ａアフィニティープロトコルを使用し、製造業者の指示にしたがって精製する。タンパク質Ａアフィニティーステップを使用して、収集された細胞培養液（ＨＣＣＦ）から融合タンパク質を選択的かつ効率的に結合させる。これによって、単一ステップで生成物不純物の＞９５％を高効率及び高スループットで除去する。このステップ後の融合タンパク質について望ましい分子形態の部分は６０〜９８パーセントの範囲であった。ＧＥからのＭＡＢＳＥＬＥＣＴをタンパク質Ａアフィニティー樹脂として使用する。精製された物質を濃縮し、ＰＢＳ中に透析した。
Ａ）モノマーの百分率
ＴＦｃ溶液を、初期溶液中又は４℃、３７℃でインキュベーションした後、凍結−解凍後、又は室温にてオービタルシェーカーで穏やかに撹拌した後のいずれかで、存在するモノマーの百分率のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による測定に付した。ＳＥＣは本質的に以下のようにして実施した。ＳＥＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣシステムを使用して実施する。５０μｇの各分子をＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ３０００ゲルカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐ／Ｎ １８６７５）に注入する。ＰＢＳをランニング及び平衡化緩衝液として０．３５ｍｌ／分の流速で使用する。
表１６は、表示された濃度での初期溶液中の例示的ＴＦｃのモノマーの百分率を提供する。
別の実験では、モノマーの百分率は、本質的に前述の通りの分子の濃縮後の初期溶液中で測定した。表１７はその結果を提供する。
表１６及び１７を編集したものを表１８で後述する
表１９は、さまざまな条件にさらされた後に測定される、溶液中のＴＦｃｓ３９Ｅ及び２３Ｃのモノマーの百分率を示す。
結果は、ＴＦｃが０日の溶液中及び試験したさまざまな条件下で非常に異なる安定性を有することを示す。３９Ｅ及び２３Ｇは他のものよりも良好な安定性を有するようである。
Ｂ）ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
ＴＦｃを４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上非変性条件で実施し、クーマシー染色によって可視化した。結果を図８に示す。
実施例２：第２世代ＴＦｃの合成
ＴＦｃ分子の特性を更に改善するために、それらに更なる修飾を加えた。修飾は、（ｉ）ＴＦｃリンカーの長さの変更（「２３Ｅ（３５Ｌ）」、「３９Ｅ（３５Ｌ）」、「２３Ｅ（３０Ｌ）」、「３９Ｅ（３０Ｌ）」、「２３Ｅ（２５Ｌ）」及び「３９Ｅ（２５Ｌ）」）；（ｉｉ）２つのＣＨ３ドメインそれぞれの内部のＡＥＭ及びＣ末端システイン修飾の組み合わせの変更（「２３Ｅ（３５Ｌ）逆転」及び（「３９Ｅ（３５Ｌ）逆転」）；並びに（ｉｉｉ）ＣＨ３結合を増強する突然変異の変更（「２３Ｉ」、「３９Ｉ」、「２３Ｊ」及び「３９Ｊ」）を含んでいた。これらの修飾を表２０にまとめる。これらの新たに修飾されたＴＦｃのａａ配列を図１１に記載し、それらのドメイン又は要素のそれぞれの同一性を表１２及び１３に記載する。
第２世代ＴＦｃを本質的に実施例１で記載されているように発現させ、精製した。
Ａ）モノマーの百分率
ＴＦｃ溶液を、初期溶液中又は４℃で７日後のいずれかで存在するモノマーの百分率のＳＥＣによる測定に付した。ＳＥＣを本質的に実施例１で記載されている通りに実施した。
表２１は、初期溶液中、４℃にて７日後の例示的第２世代ＴＦｃのモノマー百分率を提供する。
結果は、例えば分子２３Ｅ及び３９Ｅでは、４０ａａリンカーが短いリンカーよりも安定なＴＦｃをもたらすことを示す。
実施例３：例示的抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡ
Ａ）例示的抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位
ＴＦｃＢＡは、ヒト化５Ｄ５Ａｂを含むか又はヒト化５Ｄ５Ａｂからなる抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位を含み得る（米国特許第７，４７６，７２４号）。重鎖は、以下のＦａｂドメイン又はそのＶＨドメインを含み得る。
１）シグナルペプチドなし：
（配列番号２２３；ＣＤＲは点線の下線部分、ＣＨ１ドメインは下線部分である）
２）配列番号２４１からなる例示的シグナルペプチド（下線）を含む：
（配列番号２４５；シグナルペプチドは下線・太字体部分、ＣＤＲは点線の下線部分、ＣＨ１ドメインは下線部分である）
軽鎖は以下のＦａｂドメイン又はそのＶＨドメインを含み得る。
１）シグナルペプチドなし：
（配列番号２３１；ＣＤＲは点線の下線部分、ＣＬドメインは下線部分である）
２）配列番号２４３からなる例示的シグナルペプチドを含む：
（配列番号２４７；シグナルペプチドは下線・太字体部分、ＣＤＲは点線の下線部分、ＣＬドメインは下線部分である）
ＴＦｃＢＡは、以下の重鎖及び軽鎖部分を含むか又は以下の重鎖及び軽鎖部分からなり、本明細書中では「抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２」と称される抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位も含み得る。重鎖は、以下のＦａｂドメイン又はそのＶＨドメインを含み得る。
１）シグナルペプチドなし：
（配列番号２８７；ＣＤＲは点線の下線部分、ＣＨ１ドメインは下線部分である）
２）配列番号２４１からなる例示的シグナルペプチド（下線）を含む：
（配列番号２５６；シグナルペプチドは下線・太字体部分；ＣＤＲは点線の下線部分、ＣＨ１ドメインは下線部分である）
軽鎖は以下のＦａｂドメイン又はそのＶＨドメインを含み得る。
１）シグナルペプチドなし：
（配列番号２８９；ＣＤＲは点線の下線部分、ＣＬドメインは下線部分である）
２）配列番号２４３からなる例示的シグナルペプチドを含む：
（配列番号３４５；シグナルペプチドは下線・太字体部分；ＣＤＲは点線の下線部分、ＣＬドメインは下線部分である）
アミノ末端からカルボキシ末端への順で、ｉ）抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位５Ｄ５のＦａｂドメイン（配列番号２２３）；ｉｉ）ＡＥＭ１及びＤｉＳ２を含むＴＦｃ（配列番号１８１）；並びにｉｉｉ）配列番号２３３を有するパニツムマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ Ｈ１Ｌ１（下記参照）を含む例示的成熟ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列を配列番号２３５として記載する（図９）。アミノ末端からカルボキシ末端への順で、ｉ）抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位２のＦａｂドメイン（配列番号２８７）、ｉｉ）ＡＥＭ１及びＤｉＳ２を含むＴＦｃ（配列番号１８１）；並びにｉｉｉ）配列番号２５８を有するセツキシマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ Ｈ１Ｌ１（下記参照）を含む例示的成熟ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列を配列番号２９１として記載する（図９）。一般的に、本明細書中で提供される例示的抗ｃ−Ｍｅｔ Ｆａｂ重鎖配列を本明細書中で開示されるＴＦｃ、又はＴＦｃを含む構築物のいずれかと連結させることができる。これらのタンパク質を、列番号２４１からなるシグナル配列であり得るシグナル配列で発現させることができる。
Ｂ）例示的抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ
ＴＦｃＢＡは、以下の抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖのいずれか（又はその可変ドメインもしくはＣＤＲ）を含み得る：
１）パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）ｓｃＦｖ
パニツムマブのＶＨ及びＶＬドメインのａａ配列は米国特許第６，２３５，８８３号で提供され、以下のａａ配列を有するｓｃＦｖにアセンブルされる。
（配列番号２３３；ｓｃＦｖリンカーは斜体部分、ＶＨ及びＶＬ ＣＤＲは点線の下線部分である）
２）２２２４ｓｃＦｖ
Ａｂ２２２４のＶＨ及びＶＬドメインのａａ配列はＵＳ特許公開第２０１０／０００９３９０号で提供され、以下のａａ配列を有するｓｃＦｖにアセンブルされる。
（配列番号２３７；ｓｃＦｖリンカーは斜体部分、ＶＨ及びＶＬ ＣＤＲには点線の下線部分である）
３）ヒト化セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）ｓｃＦｖ
セツキシマブの可変領域をヒト化し、以下のｓｃＦｖを構築するために使用した（ＣＤＲは点線の下線部分、ｓｃＦｖリンカーは斜体部分、ヒト化に起因するａａ修飾は小文字部分ある）。
３．１）セツキシマブｓｃＦｖ Ｈ１ Ｌ１
（配列番号２５８）
３．２）セツキシマブｓｃＦｖ Ｈ１ Ｌ２
（配列番号２７５）
３．３）セツキシマブｓｃＦｖ Ｈ２ Ｌ１
（配列番号２７７）
３．４）セツキシマブｓｃＦｖ Ｈ２ Ｌ２
（配列番号２７９）
ヒト化セツキシマブＡｂのＶＨ及びＶＬドメインを、Ａｂの任意の他のフォーマット、例えば２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む天然に存在する構造を有するＡｂで使用することができる。
ｉ）ヒト化５Ｄ５抗ｃ−ＭｅｔＶＨドメイン（配列番号２２３）；ｉｉ）ＡＥＭ１及びＤｉＳ２を含むＴＦｃ（配列番号１８１）；並びにｉｉｉ）配列番号２３３を有するパニツムマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを含む抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列を配列番号２３５として記載する（図９）。配列番号２３５においてと同じ結合部位を含むが、異なるＴＦｃを含む抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列を配列番号３４３、２２５、２２７及び２２９で記載する（図９）。ｉ）ヒト化５Ｄ５抗ｃ−Ｍｅｔ ＶＨドメイン（配列番号２２３）；ｉｉ）ＡＥＭ１及びＤｉＳ２を含むＴＦｃ（配列番号１８１）；並びにｉｉｉ）配列番号２３７を有する２２２４抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを含む抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列を、配列番号２３９で記載する（図９）。ｉ）ヒト化５Ｄ５抗ｃ−Ｍｅｔ ＶＨドメイン（配列番号２２３）；ｉｉ）ＡＥＭ１及びＤｉＳ２を含むＴＦｃ（配列番号１８１）；並びにｉｉｉ）配列番号２５８、２７５、２７７又は２７９からなるセツキシマブ抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを含む抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡの重鎖のａａ配列を、それぞれ、配列番号２６０、２８１、２８３及び２８５として記載する（図９）。一般的に、本明細書中で開示される抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖのいずれか、又はそれらの可変もしくはＣＤＲ配列は、本明細書中で開示されるＴＦｃのいずれか又はＴＦｃを含む構築物と連結されていてもよい。
Ｆａｂドメイン、ｓｃＦｖ及びＴＦｃＢＡをコード化するヌクレオチド配列を図１０で提供する。
他の例示的抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＴＦｃＢＡを表２１に記載し、この場合、配列のそれぞれは、介在配列なしでアミノ末端からカルボキシ末端への順で隣接する配列に結合されていてもよい。
実施例４： ＴＦｃＡ又はＴＦｃの調製法及び特性化法
Ａ）タンパク質発現及び精製
安定なトランスフェクション：核酸を、１：１（：１）プラスミド比を使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスター卵巣；ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号ＣＣＬ−６１（商標））にトランスフェクトし、１ステップタンパク質Ａ精製法で、例えば以下のプロトコルにしたがって精製する。ＴＦｃＡ又はＴＦｃをコード化する核酸を単一タンパク質として発現プラスミドに標準的組み換えＤＮＡ技術を使用してクローン化する。用いられる例示的発現ベクターはｐＭＰ １０Ｋ（ＳＥＬＥＸＩＳ）である。発現プラスミドを直線化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞に同時トランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＢＳを含むハムのＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で２日間選択圧なし、次いで選択圧を加えて４日間回復させる。４日後、それらを、グルタミンを含む無血清培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標））に変え、選択圧を加える。１週間後、細胞を発現についてチェックし、所望の体積までスケールアップする。全タンパク質を、製造業者の指示にしたがって実施されるタンパク質Ａアフィニティープロトコルを使用して精製する。タンパク質Ａアフィニティーステップを使用して、収集された細胞培養液（ＨＣＣＦ）からＴＦｃＡ又はＴＦｃタンパク質を選択的かつ効率的に結合させる。これによって、単一ステップにおける生成物不純物の＞９５％が高収率かつ高スループットで除去される。このステップ後のＴＦｃＡ又はＴＦｃの所望の分子形態の部分は６０〜９８パーセントの範囲内であると予想される。ＧＥからのＭＡＢＳＥＬＥＣＴをタンパク質Ａアフィニティー樹脂として使用する。精製された物質を濃縮し、ＰＢＳ中に透析する。
一過性トランスフェクション：核酸をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に過渡的にトランスフェクトし、１ステップタンパク質Ａ精製で本質的に以下のようにして精製する。タンパク質をコード化する核酸を単一タンパク質として、標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて発現プラスミドにクローン化する。用いられる例示的発現ベクターはｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｒ７９０−０７）である。発現プラスミドを、ポリエチレンイミン（２．５μｇ／ｍｌ培養物）及びＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ細胞培養物）を用いてトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートし、次いで収集する。タンパク質Ａアフィニティープロトコルを使用し、製造業者の指示にしたがって、全タンパク質を精製する。タンパク質Ａアフィニティーステップを使用して、収集された細胞培養液（ＨＣＣＦ）から融合タンパク質を選択的かつ効率的に結合させる。これによって、単一ステップで生成物不純物の＞９５％が高収率及び高スループットで除去される。ＧＥからのＭＡＢＳＥＬＥＣＴをタンパク質Ａアフィニティー樹脂として使用する。この精製された材料を濃縮し、ＰＢＳ中に透析する。
Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ＴＦｃＢＡ又はＴＦｃを４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに非変性条件でかけ、クーマシー染色で可視化する。この方法を用いて、ＴＦｃＡ又はＴＦｃが適切に形成又はアセンブルされるかどうかを確認することができる。
Ｃ）ＤＳＦによる熱安定性測定
ＴＦｃＡ又はＴＦｃがアンフォールドする温度を示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって本質的に次のようにして測定する。ＤＳＦアッセイをＩＱ５ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で実施する。１５ｕＭ ＴＦｃＡ又はＴＦｃ、１ｘＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１ｘＰＢＳの２０μｌ溶液を９６ウェルプレートに添加する。プレートを２０℃から９０℃まで１℃／分の加熱速度で加熱する。データを分析のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）に移す。
Ｄ）ｐＥＧＦＲ阻害
ＥＧＦＲによるシグナル伝達、例えばリガンドで誘導されるシグナル伝達のＴＦｃＢＡによる阻害は、ＥＧＦＲのリン酸化に対する特定のＴＦｃＡの効果を測定することによって決定することができる。
以下のプロトコルを使用して、ＥＧＦＲの阻害を測定する。細胞（例えば、Ａ４３１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号ＣＲＬ−１５５５（商標））又はＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを追加したＤＭＥＭ培地中で維持する。シグナリング実験のために、３．５×１０４細胞を９６ウェル組織培養プレート中完全培地中に蒔く。翌日、完全培地を無血清培地で置換し、細胞を一晩３７℃でインキュベートする。細胞を３００ｎＭの出発濃度で２時間前処理し、ＴＦｃＡ又はＴＦｃのそれぞれについて１１種の濃度に３倍減少させ、次いで１０分間８ｎＭのＥＧＦ（ヒト組み換えＥＧＦ；カタログ番号ＡＦ−１００−１５；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ， Ｉｎｃ．）で刺激する。細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（ＥＡＳＹパックで提供されるｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔ、カタログ番号４６９３１２４００１、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ；ＰｈｏｓＳＴＯＰ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ、カタログ番号４９０６８３７００１， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ）を追加したＭＰＥＲ緩衝液（カタログ番号ＰＩ７８５０５， ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）中で溶解させる。ホスホ−ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）のためのＥＬＩＳＡを、捕捉ＡｂがＥＧＦＲ Ａｂ−１１、Ｃｌｏｎｅ：１９９．１２（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＭＳ３９６Ｐ１ＡＢＸ）である以外は製造業者のプロトコル（ｐＥＧＦＲ ＥＬＩＳＡ Ｒ＆Ｄキット（カタログ番号ＤＹＣ１０９５−Ｃ））にしたがって実施する。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（カタログ番号ＰＩ３７０６９、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加し、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取る。最低濃度のＴＦｃＡ又はＴＦｃで観察されるシグナルに対して正規化後に発光値をプロットする。データ解析のために、２組の試料を平均し、エラーバーを使用して、２組間の標準偏差を表す。阻害曲線及び対応するＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を使用して、データの４パラメータロジスティック方程式への回帰によって算出する。阻害パーセントを算出するために、最大（「ｍａｘ」）及び最小（「ｍｉｎ」）阻害剤効力の回帰値を次のように使用することができる：
曲線スパン＝最大−最小；
ベースラインスパン＝最大；
阻害パーセント＝１００＊曲線スパン／ベースラインスパン
Ｅ）ｐＥＲＫ阻害
ｃ−Ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲによるシグナル伝達、例えばリガンドで誘導されるシグナル伝達のＴＦｃＡによる阻害を、ＥＲＫのリン酸化に対する特定のＴＦｃＡの影響を測定することによって決定することができる。以下のプロトコルを使用して、ｐＥＲＫの阻害を測定することができる。第１日：活発な対数中期（約８０％コンフルエンシー）成長細胞（例えばＡ４３１細胞）をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ＋Ｌ／グルタミン＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）培地中で***させる。９６ウェルプレート中、１ウェルあたりおよそ３５，０００細胞を播種する。第２日：培地を１０％ＦＢＳから無血清培地−０．５％ＦＢＳ（＋Ｌ／グルタミン＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）培地へと変える。第３日：阻害剤／抗体を適切な体積の血清培地中に希釈する。ウェルあたり濃度ごとに１００μＬの各阻害剤を添加する。阻害剤を３７℃で２時間インキュベートさせる。２時間の期間の最後に、８ｎＭの最終濃度のＥＧＦ（ヒト組み換えＥＧＦ；カタログ番号ＡＦ−１００−１５；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ， Ｉｎｃ．）を各阻害剤及び各濃度の阻害剤に１０分間添加する。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、後に４０μＬ／ウェルのＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）Ｌｙｓｉｓ緩衝液（ストックを水で１：５希釈）中で溶解させる。ライセートを通常溶菌後５分以内に−８０℃に置く。第４日：ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）ｐＥＲＫ１／２ＥＬＩＳＡの実施に関するプロトコルはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒウェブサイトで見出すことができる（ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ ＰＲＯＴＥＩＮ Ａ １０Ｋ ＰＴＳ ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．カタログ番号６７６０６１７Ｍ；ＴＧＲ Ｓｕｒｅｆｉｒｅ ＥＲＫ１ ３８４ Ｋｉｔ ｆｏｒ １０，０００ Ａｓｓ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．カタログ番号ＴＧＲＥＳ１０Ｋ）。本質的に、−８０℃ライセートを室温で解凍する。一方、反応緩衝液を調製し、この場合、活性化緩衝液及び反応緩衝液をプロトコルにしたがって混合する。タンパク質Ａ検出キット試薬を反応緩衝液に最後に添加した後、３８４ウェルプレートに添加する。４μＬの解凍されたライセートをＰｒｏｘｉプレート（登録商標）３８４白色浅型ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製；カタログ番号６００８２８０）に移す。タンパク質Ａ検出キット試薬の添加後、７μＬの最終反応緩衝液を各ウェル（すでにその中に４μＬのライセートを有する）に移す。プレートをアルミニウムシーラーで密閉する。プレートをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心分離機で１８００ｒｐｍにて１分間遠心沈殿させる。プレートを室温にて２時間穏やかに振とうする。プレートを次いでＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｒｅａｄｅｒで読み取る。発光データの正規化及びＩＣ５０の算出はｐＥＧＦＲについて記載されているようにしておこなわれる。
実施例５：ＥＬＩＳＡプレートに基づく抗体結合の測定のためのプロトコル
可溶性ｃＭｅｔ−Ｆｃ及びＥＧＦＲ−ｈｉｓに対する二重特異性抗体の結合
Ｒｅａｃｔｉ−ｂｉｎｄ（登録商標）プレート（９６ウェル）を５０μＬのｃＭｅｔ−Ｆｃ（ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ）でコーティングし、一晩４℃にてインキュベートする。翌日、プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、１時間室温にて１００μＬのブロッキング緩衝液でブロックし、ＰＢＳ−Ｔで再度洗浄する。プレートを５０μＬの二重特異性抗体とともに室温で２時間インキュベートし、次いでＰＢＳ−Ｔで洗浄する。抗体濃度は５００ｎＭ（ＰＢＳ−Ｔ中）から始まり、１０の更なる２倍希釈及び１つのブランク（ＰＢＳ−Ｔのみ）を含む。プレートを次いで５０μＬのＥＧＦＲ−ｈｉｓ（ＰＢＳ−Ｔ中１μｇ／ｍｌ）とともに１時間室温にてインキュベートする。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔ中で１：１０，０００希釈した抗ｈｉｓ−ＨＲＰ抗体とともに１時間室温にてインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで再度洗浄する。プレートを１００μＬのＴＭＢ基質とともに５〜１０分間室温にてインキュベートし、１００μＬの停止溶液を添加することによって反応を停止させる。吸光度を４５０ｎｍで測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用して結果として得られたデータを分析した。
前記方法でＴＦｃＢＡを使用した例示的結果を図１５で見ることができ、これはオナルツズマブ−３９Ｅｇｙ−２２２４（■）及びオナルツズマブ−３９Ｅｇｙ４−パニツムマブ（●）の結合アフィニティーを示す。
実施例６：非対称Ｆｃ−ドメインの現行の技術によって分子量不均一性を得る
ＣＨＯ−Ｋ１細胞の安定なトランスフェクション
懸濁液適合ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、８ｍＭのＬ−グルタミンを追加したＨｙｃｌｏｎｅ（登録商標）培地中で２００００００／ｍＬの密度まで成長させる。トランスフェクション当日に、細胞を無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ）中に８０，０００細胞／ｍＬの密度で再懸濁させる。細胞（５００μＬ）を次いで１μｇのＤＮＡ全体（１０ｎｇのｐＮｅｏベクター、ジェネテシン選択マーカーを有するインハウス（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）ベクターを含む）で、２．７５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）を使用して２４ウェルプレート中でトランスフェクトする。３時間後、１ｍＬの回復培地（ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｍｅｄｉａ）（ＨＡＭＳ−Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ）を添加し、トランスフェクトされた細胞を４８時間回復させた。細胞を次いで９６ウェルプレート中で増殖させ、選択マーカージェネテシンを回復培地に５００μｇ／ｍｌで添加した。更に４日後、培地を無血清Ｈｙｃｌｏｎｅ培地（Ｌ−グルタミンを追加）と置換し、トランスフェクトされた細胞を適応させた。１週間後、選択された細胞はコロニーを形成し、ウェルを上清からのウェスタンブロットで所望の特性について試験した。所望のクローンを２４ウェルプレートに、次いでＴ−２５フラスコに、最終的に振とうフラスコに拡大した。所望のクローンをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、所望の体積までスケールアップした。生存率が８０％を下回る場合、細胞を遠心分離（６０００ｇ、３０分）によって収集し、０．２２μｍフィルターを使用して上清を濾過した。
細胞を前述のようにトランスフェクトし、以下のように分析した。結果を下記表２２で示す。
Ａ）ウェスタンブロットプロトコル
オナルツズマブを発現する細胞上清を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に非変性状態でかけた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｌｏｔ（登録商標）を使用してタンパク質をニトロセルロース紙に移した。ブロットをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いでＩＲＤ７００と結合した抗ヒト−ＦＣとともに１時間インキュベートした。ブロットをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、Ｌｉ−Ｃｏｒ（登録商標）Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）を使用して画像化した。結果を図１２で示す。
Ｂ）モノマーの百分率
ＴＦｃ溶液を、ＳＥＣによって初期溶液中に存在するモノマーの百分率の測定に付した。ＳＥＣを本質的に実施例１で記載されているようにして実施した。
表２２は、初期溶液中の例示的第２世代ＴＦｃのモノマーの百分率を提供する。
実施例７：荷電（ｃｈａｒｇｅｄ）非グリコシル化突然変異体の産生及び分析
安定な多価Ａｂフォーマットの同定を後述する。結合部位を含まないタンパク質構築物を使用した。いくつかのフォーマットを表２３及び図１７で示すようにして比較した。
配列番号３５７、及び３８９〜３９９（奇数）を有する核酸を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞中に過渡的にトランスフェクトし、１ステップタンパク質Ａ精製で精製し、続いて実施例４で本質的に記載されているようにＤＳＦを行った。
Ｂ）ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
ＴＦｃを変性状態の４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、クーマシー染色によって可視化した。結果を図１３Ａ（非還元）及び図１３Ｂ（還元）で示す。
Ｃ）ＤＳＦによる熱安定性測定
ＴＦｃＡ又はＴＦｃがアンフォールドする温度を、本質的に以下のように示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって測定する。ＤＳＦアッセイをＩＱ５ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で実施する。１５ｕＭのＴＦｃＡ又はＴＦｃ、１ｘＳｙｐｒｏ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１ｘＰＢＳの２０μｌ溶液を９６ウェルプレートのウェルに添加する。プレートを２０℃から９０℃まで１℃／分の加熱速度で加熱する。データを分析のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）に移す。グリコシル化部位突然変異体のＤＳＦによる熱安定性測定から得られた例示的結果を表２５に示す。
実施例８：骨格変異体のＤＳＦ分析
ＤＳＦによる熱安定性測定
ＴＦｃＡ又はＴＦｃがアンフォールドする温度を、前述の示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって測定する。結果を下記表２６に示す。これらのデータは、ジスルフィド架橋の付加及びグリコシル化突然変異などの骨格修飾が熱安定性を改善し得ることを示す。
実施例９：オナルツズマブ結合部位を使用する一価及び二重特異性ｔＦｃ分子の産生及び分析
サイズ排除クロマトグラフィーを使用したモノマーパーセントの決定
５０μｇの試料を、ランニング緩衝液として２０ｍＭのリン酸ナトリウム（＋３００ｍＭのＮａＣｌ）を使用してＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４．６ｍｍＩＤ×３０ｃｍ）に注入する。すべての測定は、オートサンプラー、バイナリポンプ及びダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣで実施する。Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアでデータを分析することによって、モノマーのパーセントを決定する。典型的には、すべての試料は精製されたタンパク質Ａだけであり、１ＸＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬの濃度である。
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ結合プロトコル
必要な材料：
９６ウェル黒色円形平底ポリプロピレンマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ ＃ ６５５２０９）。
Ｏｃｔｅｔ装置及びソフトウェア（バージョン３．０）。
タンパク質Ａセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、＃１８−５０１０）
１ＸＰＢＳ、抗原（ｈｉｓ標識ｃＭＥＴ）、抗体
プロトコル：
すべての試薬を平衡化させ、試料を室温にする。タンパク質Ａセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ（登録商標）、＃１８−５０１０）を１ＸＰＢＳ中で１０分間水和させる。Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ソフトウェア及び製造業者の指示にしたがった手順を使用して、動態検査を実施する。アッセイステップは、典型的には以下を含む。１ＸＰＢＳ中で１〜２分平衡化、４分の抗体ローディング（濃度：１ＸＰＢＳ中５０μｇ／ｍＬ）、１〜２分のベースライン安定化、４分の抗体：抗原結合、４分の抗体：抗原解離。全体を通して１ＸＰＢＳをマトリックスとして使用する。データをＯｃｔｅｔ（登録商標）データ分析ソフトウェアで分析し、処理し、１：１結合モデルを使用する曲線に適合させて、動態パラメータ（Ｋｄ、Ｋｏｎ及びＫｏｆｆ）を決定する。
実施例１０：オナルツズマブ及び二重特異性変異体によるシグナリング阻害
表２８中の構築物がｐＭｅｔを阻害する能力を試験するために、ＴＦｃ変異体をＨＧＦで誘導したＳＷ６２０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号ＣＣＬ−２２７（商標））において次のようにして試験した。第１日に、活発な対数中期（約８０％コンフルエンス）成長細胞（例えばＳＷ６２０細胞）をＲＰＭＩ（＋１０％ＦＢＳ＋Ｌ／グルタミン（２ｍＭ）＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）培地中で***させる。９６ウェルプレート中のウェルあたり約２０，０００細胞を播種する。２日に、培地を１０％ＦＢＳから無血清培地−ＲＰＭＩ＋０．５％ＦＢＳ（＋Ｌ／グルタミン＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）培地へ変える。３日に、ＨＧＦ（刺激された対照）及びさまざまな阻害剤／抗体を適切な体積の無血清培地中に希釈する。１つのウェルあたり、濃度ごとに１００μＬの各阻害剤を添加する。阻害剤を３７℃で２時間インキュベートする。細胞を次いで冷ＰＢＳで２回洗浄し、後に、５０μＬ／ウェルのＭＰＥＲ（カタログ番号ＰＩ７８５０５、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤緩衝液（ＥＡＳＹパックで提供されるｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔ、カタログ番号４６９３１２４００１、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ；ＰｈｏｓＳＴＯＰ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ、カタログ番号４９０６８３７００１、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ）中で溶解させる。ライセートを通常溶菌後５分以内に−８０℃に置く。
ｐＭｅｔシグナルの測定のために、ＥＬＩＳＡキットを使用した（Ｈｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＧＦ Ｒ／ｃ−ＭＥＴ ＤｕｏＳｅｔ ＩＣ Ｅｃｏｎｏｍｙ Ｐａｃｋ、カタログ番号ＤＹＣ２４８０Ｅ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）からの３８４ウェルＨｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｌａｃｋ Ｓｏｌｉｄプレートを、ＰＢＳ緩衝液中、４μｇ／ｍＬ／ウェルの最終濃度にてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの捕捉抗ＭＥＴ抗体でコーティングする。プレートを一晩室温で放置する。４日に、−８０℃ライセートを室温で解凍する。プレートを次いで、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）を含むＰＢＳ）でＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャー中５０μｌ／ウェルで３回洗浄する。３８４ウェルプレートを５０μＬ／ウェルの２％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間室温にてブロックする。２組のライセートを１つのウェルにプールし、２％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／２５％ＭＰＥＲ／ＰＢＳ中で２倍に希釈する。２％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）／２５％ＭＰＥＲ／ＰＢＳ中で１０×２倍段階希釈を作成することによって組み換え標準曲線を作成する。ＥＬＩＳＡプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄する。２０μＬのライセートを９６ウェルプレートから４組で３８４ウェルプレートに移す。プレートを室温にて２時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで３回洗浄する。２０μＬの一次検出抗ホスホチロシン抗体、４Ｇ１０（カタログ番号０５−３２１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｕｐｓｔａｔｅ）を１：１０００の希釈度でＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間室温でインキュベートする。２０μＬのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（カタログ番号ＰＩ３７０６９、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を製造業者の指示にしたがって添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取る。データ解析のために、２組の試料を平均し、エラーバーを使用して２組間の標準偏差を表す。阻害曲線及び対応するＩＣ５０値は、４パラメータロジスティック方程式へのデータの回帰によってＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を用いて算出される。
図１６で示されるように、試験したすべての分子は、ＴＦｃコア領域の同一性に関係なく同様の方法でｐＭｅｔシグナリングを阻害した。二価オナルツズマブ＿３９Ｅｇｙ４＿２２２４、オナルツズマブ＿３９Ｅｇｙ４＿パニツムマブ、及びオナルツズマブ＿３９Ｅｇｙ４＿セツキシマブ変異体は、一価オナルツズマブ＿３９Ｅｇｙ４変異体と類似した程度まで阻害した。
等価物
当業者は、単に日常的実験を用いて、本明細書中で記載される特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、又は確認し、実施することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。従属クレームで開示される実施形態の任意の組み合わせは開示の範囲内に含まれることが想定される。
参照による組み込み
本明細書中で言及されるすべての米国及び外国特許並びに係属中の特許出願及び公報のそれぞれの開示は、その全体が参照によって明確に本明細書中に組み込まれる。

Claims (123)

  1. タンデムＦｃ二重特異性抗体（「ＴＦｃＢＡ」）である抗体であって、ＴＦｃＢＡは、単一の抗ｃ−Ｍｅｔ結合部である第１の結合部及びｃ−Ｍｅｔ以外の細胞表面リセプターに特異的に結合する少なくとも１つの第２の結合部を有し、任意に、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インシュリン受容体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ｃ−Ｋｉｔ、ＡＸＬ、ＡＬＫ、ＣＥＡ、ＣＤ４４、ＥＰＣＡＭ及びＥｐｈＡ２より選択される細胞表面受容体を有し、抗ｃ−Ｍｅｔ結合部及び第２の結合部は、タンデムＦｃ（「ＴＦｃ」）を介して結合され、
    ＴＦｃは、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域を備え、
    前記第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のそれぞれは、Ｃ末端及びＮ末端を有し、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、Ｃ末端及びＮ末端を有するＴＦｃリンカーを介して結合されて、隣接するポリペチドを形成し、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域が結合してＦｃダイマーを形成する抗体。
  2. ａ．ＴＦｃＢＡが、少なくとも１つの第２の結合部により特異的に結合されたｃ−Ｍｅｔ及び受容体の一方又は双方のリン酸エステル化の抑制によって示される場合、１０ｎＭ以下又は１ｎＭ以下又は１００ｐＭ以下のＩＣ５０で、又は最大抑制パーセンテージが少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％で、少なくとも１つの第２の結合部により特異的に結合されたＨＧＦ及び受容体の同種のリガンドの一方又は双方により誘発される信号伝達を抑制し、或いは、
    ｂ．細胞中のＴＦｃＢＡの発現が、（ｉ）ＴＦｃを備えない多価抗体の発現と比較してより正常に生成したＴＦｃＡＢ分子又は（ｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定される正常に生成したＴＦｃＡＢ分子の８０％以上を生成する請求項１に記載のＴＦｃＢＡ。
  3. 第１のＦｃ領域が第１のＣＨ３ドメインを、第２のＦｃ領域が第２のＣＨ３ドメインを、それぞれ有し、これらＣＨ３ドメインのそれぞれが、Ｃ末端及びＮ末端を有する請求項１又は２に記載のＴＦｃＢＡ。
  4. 第１のＦｃ領域が第１のＣＨ２ドメインを、第２のＦｃ領域が第２のＣＨ２ドメインを、それぞれ備え、これらＣＨ２ドメインのそれぞれが、Ｃ末端及びＮ末端を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  5. 第１のＦｃ領域が第１のヒンジを、第２のＦｃ領域が第２のヒンジをそれぞれ備え、前記第１のヒンジ及び前記第２のヒンジのそれぞれが、Ｃ末端及びＮ末端を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  6. 第２のヒンジが上側のヒンジサブドメインを備えない請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  7. ＴＦｃＢＡが有するＴＦｃが、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを備える請求項６に記載のＴＦｃＢＡ。
  8. ＴＦｃＢＡが有するＴＦｃがアミノからカルボキシル末端への順に、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを備える請求項６に記載のＴＦｃＢＡ。
  9. ＴＦｃＢＡが有するＴＦｃが、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のヒンジ、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを備える請求項６に記載のＴＦｃＢＡ。
  10. 第１のヒンジが、上側ヒンジサブドメイン、コアヒンジサブドメイン及び下側ヒンジサブドメインを備え、第２のヒンジが、コアヒンジサブドメイン及び下側ヒンジサブドメインを備えるが上側ヒンジサブドメインは備えず、前記ヒンジサブドメインのそれぞれは、Ｃ末端及びＮ末端を有する請求項９に記載のＴＦｃＢＡ。
  11. ＴＦｃＢＡが有するＴＦｃは、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のヒンジ、第１のヒンジのＣ末端で、Ｎ末端にリンクされる第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ２ドメインのＣ末端で、Ｎ末端にリンクされる第１のＣＨ３ドメイン、第１のＣＨ３ドメインＣ末端で、Ｎ末端にリンクされるＴＦｃリンカー、ＴＦｃリンカーのＣ末端で、Ｎ末端にリンクされる第２のヒンジ、第２のヒンジのＣ末端で、Ｎ末端にリンクされる第２のＣＨ２ドメイン、第２のＣＨ２ドメインのＣ末端で、Ｎ末端にリンクされる第２のＣＨ３ドメインを備える請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  12. ＴＦｃリンカーが、２０〜５０のアミノ酸を備える請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  13. ＴＦｃリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーである請求項１２に記載のＴＦｃＢＡ。
  14. ＴＦｃリンカーが（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを有し、ｎは４、５、６、７又は８である請求項１３に記載のＴＦｃＢＡ。
  15. ＴＦｃは、ＩｇＧ１ ＴＦｃである請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  16. ＴＦｃが、ハイブリッドＴＦｃである請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  17. ＴＦｃが、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ ＴＦｃである請求項１６に記載のＴＦｃＢＡ。
  18. ＴＦｃが、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のＩｇＧ１ヒンジ、第１のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、第１のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＩｇＧ１ヒンジ、第２のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン及び第２のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを備える請求項１５に記載のＴＦｃＢＡ。
  19. ハイブリッドＴＦｃが、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジ、第１のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、第１のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＩｇＧ４ヒンジ、第２のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン及び第２のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを備える請求項１７に記載のＴＦｃＢＡ。
  20. 第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインの一方又は双方が、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域との間の結合を強化し又は安定させるアミノ酸修飾を１つ以上有する請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  21. 第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインのそれぞれが、第１のＣＨ３ドメインの第２のＣＨ３ドメインとの関連を強化する関連強化修飾（「ＡＥＭ」）であるアミノ酸修飾を有する請求項２０に記載のＴＦｃＢＡ。
  22. ＡＥＭは、ＡＥＭモジュール１、ＡＥＭモジュール２、ＡＥＭモジュール３及びＡＥＭモジュール４からなる群より選択されるモジュールによって構成される請求項２１に記載のＴＦｃＢＡ。
  23. 第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の一方又は双方は、挿入又は置換によってシステインを付加して、そのシステインが別のＦｃ領域中のシステインとジスルフィド結合を生成するアミノ酸修飾（「ＤｉＳ」修飾）を備える請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  24. 第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の一方又は双方が、ヒンジ中にＤｉＳ修飾を備える請求項２３に記載のＴＦｃＢＡ。
  25. 第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の一方又は双方が、ＣＨ３ドメイン中にＤｉＳ修飾を備える請求項２３に記載のＴＦｃＢＡ。
  26. ＤｉＳ修飾が、ＤｉＳモジュール１又はＤｉＳモジュール２により構成される請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  27. 第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインのそれぞれが、１つ以上のＡＥＭ修飾及び１つ以上のＤｉＳ修飾を備える請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  28. 第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインの一方又は双方が、配列番号２７〜９８からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％が同一であるか、又は、最大で３０のアミノ酸付加、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換があるという点で異なるアミノ酸配列を備える、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  29. 第１のＣＨ３ドメイン又は第２のＣＨ３ドメインが、配列番号２７〜９８からなる群より選択されるアミノ酸配列を備える請求項２８に記載のＴＦｃＢＡ。
  30. 第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３ドメインが共に、対である２つの異なるメンバーを備え、それぞれのメンバーはＣＨ３アミノ酸配列であり、
    それぞれの対は、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに、配列番号９６及び９８の対からなる群から選択され、これらメンバーアミノ酸配列のそれぞれは、それぞれの前記対のそれぞれの配列と、少なくとも７０％が同一であるか、或いは、最大で３０のアミノ酸付加、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換がある点で異なり、
    第１のＣＨ３ドメインは、第２のＣＨ３ドメインが有する対の異なるメンバーを備える請求項１〜２８のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  31. 第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインそれぞれが、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに、配列番号９６及び９８からなる群より選択されるＣＨ３アミノ酸配列の対のメンバーであるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を備える請求項３０に記載のＴＦｃＢＡ。
  32. 第１のヒンジは、最大で３つのアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で、配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を備える請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  33. 第１のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列であるアミノ酸配列を備える請求項３２に記載のＴＦｃＢＡ。
  34. 第２のヒンジは、最大で３つのアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で配列番号２３、２４、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を備える請求項１〜３３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  35. 第２のヒンジは、配列番号２３、２４、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列であるアミノ酸配列を備える請求項３４に記載のＴＦｃＢＡ。
  36. 配列番号２５、２６、２６１又は２６２と、少なくとも７０％が同一であるか、又は最大で３０のアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で異なる、アミノ酸配列を備えるＣＨ２ドメインを有する請求項１〜３５のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  37. ＴＦｃは、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、第２のヒンジ、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを備え、
    ａ．第１のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を備え、
    ｂ．第１のＣＨ２ドメインは、非グリコシル化され、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を備え、
    ｃ．第１のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに、配列番号９６及び９８の配列からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群より選択される配列の対のいずれかの配列であるアミノ酸配列を備え、
    ｄ．第２のヒンジは、配列番号２３、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択される配列からなるアミノ酸配列を備え、
    ｅ．第２のＣＨ２ドメインは、非グリコシル化され、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を備え、
    ｆ．第２のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに、配列番号９６及び９８の配列からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群より選択される配列の対のいずれかの配列であるアミノ酸配列を備え、第１のＣＨ３ドメインが配列対の第１の配列を備える場合は、第２のＣＨ３ドメインは、配列の対の第２の配列を備え、第１のＣＨ３ドメインが配列対の第２の配列を備える場合は、第２のＣＨ３ドメインは、配列の対の第１の配列を備える請求項１〜３６のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  38. ＴＦｃは、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、第２のヒンジ、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを備え、
    ａ．第１のヒンジは、配列番号２０、２１、２２、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を備え、
    ｂ．第１のＣＨ２ドメインは、非グリコシル化され、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を備え、
    ｃ.第１のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに、配列番号９６及び９８の配列からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群より選択される配列の対のいずれかの配列であるアミノ酸配列を備え、
    ｄ．第２のヒンジは、配列番号２４、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなるアミノ酸配列を備え、
    ｅ．第２のＣＨ２ドメインは、非グリコシル化され、配列番号２６で与えられるアミノ酸配列を備え、
    ｆ．第２のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに、配列番号９６及び９８の配列からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群より選択される配列の対のいずれかの配列であるアミノ酸配列を備え、第１のＣＨ３ドメインが配列対の第１の配列を備える場合は、第２のＣＨ３ドメインは、配列の対の第２の配列を備え、第１のＣＨ３ドメインが配列対の第２の配列を備える場合は、第２のＣＨ３ドメインは、配列の対の第１の配列を備える請求項１〜３６のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  39. 第１のＦｃ領域又は第２のＦｃ領域は、配列番号９９〜１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％が同一であるか、又は、最大で５０のアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で異なるアミノ酸配列を備える、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  40. 第１のＦｃ領域又は第２のＦｃ領域が、配列番号９９〜１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を備える請求項３９に記載のＴＦｃＢＡ。
  41. 第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の一方又は双方が、配列番号９９及び１００、配列番号１０１及び１０２、配列番号１０３及び１０４、配列番号１０５及び１０６、配列番号１０７及び１０８、配列番号１０９及び１１０、配列番号１１１及び１１２、配列番号１１３及び１１４、配列番号１１５及び１１６、配列番号１１７及び１１８、配列番号１１９及び１２０、配列番号１２１及び１２２、配列番号１２３及び１２４、配列番号１２５及び１２６、配列番号１２７及び１２８、配列番号１２９及び１３０、配列番号１３１及び１３２、配列番号１３３及び１３４、配列番号１３５及び１３６、配列番号１３７及び１３８、配列番号１３９及び１４０、配列番号１４１及び１４２、配列番号１４３及び１４４、配列番号１４５及び１４６、配列番号１４７及び１４８、配列番号１４９及び１５０、配列番号１５１及び１５２、配列番号１５３及び１５４、配列番号１５５及び１５６、配列番号１５７及び１５８、配列番号１５９及び１６０、配列番号１６１及び１６２、配列番号１６３及び１６４、並びに、配列番号１６５及び１６６の配列からなる群より選択される対のアミノ酸配列の一方のアミノ酸配列と、少なくとも７０％が同一であるか、又は、最大で５０のアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で異なるアミノ酸配列を備え、第１のＦｃ領域は、第２のＦｃ領域によって構成されるメンバーとは異なる対のメンバーを備える請求項３９に記載のＴＦｃＢＡ。
  42. 第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は共に、対の２つの異なるメンバーを備え、メンバーのそれぞれは、Ｆｃアミノ酸配列であり、それぞれの対は、配列番号９９及び１００、配列番号１０１及び１０２、配列番号１０３及び１０４、配列番号１０５及び１０６、配列番号１０７及び１０８、配列番号１０９及び１１０、配列番号１１１及び１１２、配列番号１１３及び１１４、配列番号１１５及び１１６、配列番号１１７及び１１８、配列番号１１９及び１２０、配列番号１２１及び１２２、配列番号１２３及び１２４、配列番号１２５及び１２６、配列番号１２７及び１２８、配列番号１２９及び１３０、配列番号１３１及び１３２、配列番号１３３及び１３４、配列番号１３５及び１３６、配列番号１３７及び１３８、配列番号１３９及び１４０、配列番号１４１及び１４２、配列番号１４３及び１４４、配列番号１４５及び１４６、配列番号１４７及び１４８、配列番号１４９及び１５０、配列番号１５１及び１５２、配列番号１５３及び１５４、配列番号１５５及び１５６、配列番号１５７及び１５８、配列番号１５９及び１６０、配列番号１６１及び１６２、配列番号１６３及び１６４、並びに、配列番号１６５及び１６６の配列からなる対の群から選択され、それぞれのメンバーアミノ酸配列は、それぞれの前記対のそれぞれの配列と少なくとも７０％が同一であるか、又は最大で３０のアミノ酸付加、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換がある点で異なり、第１のＦｃ領域は、第２のＦｃ領域によって構成されるメンバーとは異なる対のメンバーを備える請求項４０に記載のＴＦｃＢＡ。
  43. 配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９及び２２１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％が同一であるか、又は最大で３０のアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で異なるアミノ酸配列を備えるＴＦｃを有する、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  44. 配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９及び２２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を備えるＴＦｃを有する請求項４３に記載のＴＦｃＢＡ。
  45. アミノからカルボキシル末端への順に、第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ＴＦｃ、接続リンカー及び第２のＶＨドメインを備える重鎖を備える請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  46. 重鎖は、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、接続リンカー及び第２のＶＨドメインを備える請求項４５に記載のＴＦｃＢＡ。
  47. 重鎖は、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、接続リンカー、第２のＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー及び第２の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを備え、第２のＶＨ及びＶＬドメインが結合して、第２の結合部を生成する請求項４６に記載のＴＦｃＢＡ。
  48. 第１のＶＨドメインと二量化して第１の結合部を生成する第１のＶＬドメインを備える軽鎖を有する請求項４７に記載のＴＦｃＢＡ。
  49. 軽鎖は、ＶＬドメインのカルボキシル末端にリンクされる軽鎖不変（ＣＬ）ドメインを備える請求項４８に記載のＴＦｃＢＡ。
  50. 第１の結合部はＮ末端結合部であり、第２の結合部はＣ末端結合部である請求項１〜４９のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  51. 抗ｃ−Ｍｅｔ結合部は、ａ）配列番号２２３又は２８７におけるＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）３（ＶＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列と、ｂ）配列番号２３１又は２８９におけるＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を備えるＶＬＣＤＲ３の一方又は双方を備えるＶＨを備える請求項１〜５０のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  52. 抗ｃ−Ｍｅｔ結合部は、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３を備える３つ一組のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲｓ）備えるＶＨドメインを備え、
    それぞれ、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３は、配列番号２２３又は２３１におけるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を備え、ＶＬドメインは、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３を備える３つ一組のＶＬＣＤＲｓを備え、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３は、配列番号２８７又は２８９におけるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を備える請求項１〜５１のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  53. 第２の結合部は、ａ）配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９におけるＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を備えるＶＨＣＤＲ３と、ｂ）配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９におけるＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を備えるＶＬＣＤＲ３との一方又は双方を備える抗ＥＧＦＲ結合部である請求項１〜５２のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  54. 第２の結合部は、ＶＨＣＤＲ１、ＶＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３を備える３つ一組のＶＨＣＤＲｓを備えるＶＨドメインであって、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３は、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９におけるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を備えるＶＨドメイン、及び、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３を備える３つ一組のＶＬＣＤＲｓを備えるＶＬドメインであって、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３は、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９におけるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を備えるＶＬドメイン、を備える抗ＥＧＦＲ結合部である、請求項１〜５３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  55. 抗ｃ−Ｍｅｔ結合部は、重鎖のＮ末端部分及び軽鎖のＮ末端部分を備える請求項１〜５４のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  56. 第２の結合部は、全体が重鎖によって構成されるＣ末端ｓｃＦｖによって構成される請求項１〜５５のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  57. 抗ｃ−Ｍｅｔ結合部は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの一方又は双方によって構成され、
    ＶＨドメインは、配列番号２２３、２３１、２８７又は２８９において示されるＶＨドメインと、少なくとも７０％が同一であるか、又は、最大で１０のアミノ酸欠失、添加又は置換がある点で異なるアミノ酸配列を備え、
    ＶＬドメインは、配列番号２２３、２３１、２８７又は２８９におけるＶＬドメインと、少なくとも７０％が同一であるか、又は最大で１０のアミノ酸欠失、添加又は置換がある点で異なるアミノ酸配列を備える請求項１〜５６のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  58. 第２の結合部は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの一方又は双方によって構成される抗ＥＧＦＲ結合部であり、
    ＶＨドメインは、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９におけるＶＨドメインと、少なくとも７０％が同一であるか、又は最大で１０のアミノ酸欠失、添加又は置換がある点で異なるアミノ酸配列を備え、
    ＶＬドメインが、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７又は２７９におけるＶＬドメインと、少なくとも７０％が同一であるか、又は、最大で１０のアミノ酸欠失、添加又は置換がある点で異なるアミノ酸配列を備える請求項１〜５７のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  59. ＴＦｃＢＡであるＡｂであって、
    ＴＦｃＢＡは、第１の結合部及び第２の結合部を備え、第１の結合部は、第１のターゲットに結合し、第２の結合部は、第２のターゲットに結合し、第１の結合部と第２の結合部は、ＴＦｃを通して結合し、
    ＴＦｃは、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域を備え、前記第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のそれぞれはＣ末端及びＮ末端を有し、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、Ｃ末端及びＮ末端を有するＴＦｃリンカーを介して結合して隣接するポリペチドを生成し、
    第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域が結合してＦｃダイマーを生成し、
    第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の一方又は双方が１つ以上のアミノ酸配列修飾を備えることで、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の間の結合を強化し又は安定させるＡｂ。
  60. ａ．ＴＦｃＢＡは、第１及び第２のターゲットの一方又は双方を通して、信号伝達を抑制するか、又は
    ｂ．細胞中のＴＦｃＢＡの発現が、（ｉ）ＴＦｃを備えない多価抗体の発現と比較してより正常に生成したＴＦｃＡＢ分子又は（ｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定される正常に生成したＴＦｃＡＢ分子の８０％以上を生成する請求項５９に記載のＴＦｃＢＡ。
  61. 第１のＦｃ領域が第１のＣＨ３ドメインを、第２のＦｃ領域が第２のＣＨ３ドメインを、それぞれ備え、これらＣＨ３ドメインのそれぞれが、Ｃ末端及びＮ末端を有する請求項５９又は６０に記載のＴＦｃＢＡ。
  62. 第１のＦｃ領域が第１のＣＨ２ドメインを、第２のＦｃ領域が第２のＣＨ２ドメインを、それぞれ備え、これらＣＨ２ドメインのそれぞれが、Ｃ末端及びＮ末端を有する請求項５９〜６１のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  63. 第１のＦｃ領域が第１のヒンジを、第２のＦｃ領域が第２のヒンジを、それぞれ備え、前記第１のヒンジ及び前記第２のヒンジのそれぞれが、Ｃ末端及びＮ末端を有する請求項５９〜６２のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  64. 第２のヒンジが上側のヒンジサブドメインを備えない請求項５９〜６３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  65. ＴＦｃＢＡが有するＴＦｃが、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを備える請求項６４に記載のＴＦｃＢＡ。
  66. ＴＦｃＢＡが有するＴＦｃがアミノからカルボキシル末端への順に、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを備える請求項６４に記載のＴＦｃＢＡ。
  67. ＴＦｃＢＡが有するＴＦｃが、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のヒンジ、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを備える請求項６４に記載のＴＦｃＢＡ。
  68. 第１のヒンジが、上側ヒンジサブドメイン、コアヒンジサブドメイン及び下側ヒンジサブドメインを備え、第２のヒンジが、コアヒンジサブドメイン及び下側ヒンジサブドメインを備えるが上側ヒンジサブドメインは備えず、前記ヒンジサブドメインのそれぞれは、Ｃ末端及びＮ末端を有する請求項６７に記載のＴＦｃＢＡ。
  69. ＴＦｃＢＡが有するＴＦｃは、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のヒンジ、第１のヒンジのＣ末端で、Ｎ末端にリンクされる第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ２ドメインのＣ末端で、Ｎ末端にリンクされる第１のＣＨ３ドメイン、第１のＣＨ３ドメインＣ末端で、Ｎ末端にリンクされるＴＦｃリンカー、ＴＦｃリンカーのＣ末端で、Ｎ末端にリンクされる第２のヒンジ、第２のヒンジのＣ末端で、Ｎ末端にリンクされる第２のＣＨ２ドメイン、第２のＣＨ２ドメインのＣ末端で、Ｎ末端にリンクされる第２のＣＨ３ドメインを備える請求項５９〜６８のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  70. ＴＦｃリンカーが、２０〜５０のアミノ酸を備える請求項５９〜６９のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  71. ＴＦｃリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーである請求項７０に記載のＴＦｃＢＡ。
  72. ＴＦｃリンカーが（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを有し、ｎは４、５、６、７又は８である請求項７１に記載のＴＦｃＢＡ。
  73. ＴＦｃは、ＩｇＧ１ ＴＦｃである請求項５９〜７２のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  74. ＴＦｃが、ハイブリッドＴＦｃである請求項５９〜７２のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  75. ＴＦｃが、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ ＴＦｃである請求項７４に記載のＴＦｃＢＡ。
  76. ＴＦｃが、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のＩｇＧ１ヒンジ、第１のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、第１のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＩｇＧ１ヒンジ、第２のＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン及び第２のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを備える請求項７３に記載のＴＦｃＢＡ。
  77. ハイブリッドＴＦｃが、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヒンジ、第１のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、第１のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第２のＩｇＧ４ヒンジ、第２のＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン及び第２のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを備える請求項７５に記載のＴＦｃＢＡ。
  78. 第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインの一方又は双方が、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域との間の結合を強化し又は安定させるアミノ酸修飾を１つ以上有する請求項５９〜７７のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  79. 第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインのそれぞれが、第１のＣＨ３ドメインの第２のＣＨ３ドメインとの関連を強化する関連強化修飾（「ＡＥＭ」）であるアミノ酸修飾を有する請求項７８に記載のＴＦｃＢＡ。
  80. ＡＥＭは、ＡＥＭモジュール１、ＡＥＭモジュール２、ＡＥＭモジュール３及びＡＥＭモジュール４からなる群より選択されるモジュールによって構成される請求項７９に記載のＴＦｃＢＡ。
  81. 第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の一方又は双方は、挿入又は置換によってシステインを付加して、そのシステインが別のＦｃ領域中のシステインとジスルフィド結合を生成するアミノ酸修飾（「ＤｉＳ」修飾）を備える請求項１〜８０のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  82. 第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の一方又は双方が、ヒンジ中にＤｉＳ修飾を備える請求項８１に記載のＴＦｃＢＡ。
  83. 第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の一方又は双方が、ＣＨ３ドメイン中にＤｉＳ修飾を備える請求項８１に記載のＴＦｃＢＡ。
  84. ＤｉＳ修飾が、ＤｉＳモジュール１又はＤｉＳモジュール２により構成される請求項８０〜８３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  85. 第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインのそれぞれが、１つ以上のＡＥＭ修飾及び１つ以上のＤｉＳ修飾を備える請求項５９〜８４のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  86. 第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインの一方又は双方が、配列番号２７〜９８からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％が同一であるか、又は、最大で３０のアミノ酸付加、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換があるという点で異なるアミノ酸配列を備える、請求項１〜８５のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  87. 第１のＣＨ３ドメイン又は第２のＣＨ３ドメインが、配列番号２７〜９８からなる群より選択されるアミノ酸配列を備える請求項２８に記載のＴＦｃＢＡ。
  88. 第１のＣＨ３及び第２のＣＨ３ドメインが共に、対である２つの異なるメンバーを備え、それぞれのメンバーはＣＨ３アミノ酸配列であり、それぞれの対は、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに配列番号９６及び９８の対からなる群から選択され、これらメンバーアミノ酸配列のそれぞれは、それぞれの前記対のそれぞれの配列と、少なくとも７０％が同一であるか、或いは、最大で３０のアミノ酸付加、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換がある点で異なり、第１のＣＨ３ドメインは、第２のＣＨ３ドメインが有する対の異なるメンバーを備える請求項１〜８６のいずれか１項に記載に記載のＴＦｃＢＡ。
  89. 第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインそれぞれが、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに、配列番号９６及び９８からなる群より選択されるＣＨ３アミノ酸配列の対のメンバーであるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を備える請求項８８に記載のＴＦｃＢＡ。
  90. 第１のヒンジは、最大で３つのアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で、配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を備える請求項５８〜８９のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  91. 第１のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２０、２１、２２、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列であるアミノ酸配列を備える請求項９０に記載のＴＦｃＢＡ。
  92. 第２のヒンジは、最大で３つのアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で配列番号２３、２４、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を備える請求項５９〜９１のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  93. 第２のヒンジは、配列番号２３、２４、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列であるアミノ酸配列を備える請求項９２に記載のＴＦｃＢＡ。
  94. 配列番号２５、２６、２６１又は２６２と、少なくとも７０％が同一であるか、又は最大で３０のアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で異なる、アミノ酸配列を備えるＣＨ２ドメインを有する請求項５９〜９３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  95. ＴＦｃは、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、第２のヒンジ、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを備え、
    ａ．第１のヒンジは、配列番号４、１８、１９、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を備え、
    ｂ．第１のＣＨ２ドメインは、非グリコシル化され、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を備え、
    ｃ．第１のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに、配列番号９６及び９８の配列からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群より選択される配列の対のいずれかの配列であるアミノ酸配列を備え、
    ｄ．第２のヒンジは、配列番号２３、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択される配列からなるアミノ酸配列を備え、
    ｅ．第２のＣＨ２ドメインは、非グリコシル化され、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を備え、
    ｆ．第２のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに、配列番号９６及び９８の配列からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群より選択される配列の対のいずれかの配列であるアミノ酸配列を備え、第１のＣＨ３ドメインが配列対の第１の配列を備える場合は、第２のＣＨ３ドメインは、配列の対の第２の配列を備え、第１のＣＨ３ドメインが配列対の第２の配列を備える場合は、第２のＣＨ３ドメインは、配列の対の第１の配列を備える請求項１〜９４のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  96. ＴＦｃは、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のヒンジ、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、第２のヒンジ、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを備え、
    ａ．第１のヒンジは、配列番号２０、２１、２２、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を備え、
    ｂ．第１のＣＨ２ドメインは、非グリコシル化され、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を備え、
    c.第１のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに、配列番号９６及び９８の配列からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群より選択される配列の対のいずれかの配列であるアミノ酸配列を備え、
    ｄ．第２のヒンジは、配列番号２４、２６３〜２６５及び２６７〜２７３からなるアミノ酸配列を備え、
    ｅ．第２のＣＨ２ドメインは、非グリコシル化され、配列番号２６で与えられるアミノ酸配列を備え、
    ｆ．第２のＣＨ３ドメインは、配列番号３１及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４３、配列番号４１及び４５、配列番号４７及び５１、配列番号４９及び５３、配列番号５５及び５９、配列番号５７及び６１、配列番号６３及び６７、配列番号６５及び６９、配列番号７１及び７３、配列番号７２及び７４、配列番号７５及び７９、配列番号７７及び８１、配列番号８３及び８５、配列番号８４及び８６、配列番号８７及び８９、配列番号８８及び９０、配列番号９１及び９３、配列番号９２及び９４、配列番号９５及び９７、並びに、配列番号９６及び９８の配列からなるＣＨ３ドメイン配列の対の群より選択される配列の対のいずれかの配列であるアミノ酸配列を備え、第１のＣＨ３ドメインが配列対の第１の配列を備える場合は、第２のＣＨ３ドメインは、配列の対の第２の配列を備え、第１のＣＨ３ドメインが配列対の第２の配列を備える場合は、第２のＣＨ３ドメインは、配列の対の第１の配列を備える請求項５９〜９４のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  97. 第１のＦｃ領域又は第２のＦｃ領域は、配列番号９９〜１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％が同一であるか、又は、最大で５０のアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で異なるアミノ酸配列を備える、請求項５９〜９６のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  98. 第１のＦｃ領域又は第２のＦｃ領域が、配列番号９９〜１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を備える請求項９７に記載のＴＦｃＢＡ。
  99. 第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の一方又は双方が、配列番号９９及び１００、配列番号１０１及び１０２、配列番号１０３及び１０４、配列番号１０５及び１０６、配列番号１０７及び１０８、配列番号１０９及び１１０、配列番号１１１及び１１２、配列番号１１３及び１１４、配列番号１１５及び１１６、配列番号１１７及び１１８、配列番号１１９及び１２０、配列番号１２１及び１２２、配列番号１２３及び１２４、配列番号１２５及び１２６、配列番号１２７及び１２８、配列番号１２９及び１３０、配列番号１３１及び１３２、配列番号１３３及び１３４、配列番号１３５及び１３６、配列番号１３７及び１３８、配列番号１３９及び１４０、配列番号１４１及び１４２、配列番号１４３及び１４４、配列番号１４５及び１４６、配列番号１４７及び１４８、配列番号１４９及び１５０、配列番号１５１及び１５２、配列番号１５３及び１５４、配列番号１５５及び１５６、配列番号１５７及び１５８、配列番号１５９及び１６０、配列番号１６１及び１６２、配列番号１６３及び１６４、並びに、配列番号１６５及び１６６の配列からなる群より選択される対のアミノ酸配列の一方のアミノ酸配列と、少なくとも７０％が同一であるか、又は、最大で５０のアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で異なるアミノ酸配列を備え、第１のＦｃ領域は、第２のＦｃ領域によって構成されるメンバーとは異なる対のメンバーを備える請求項９７に記載のＴＦｃＢＡ。
  100. 第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は共に、対の２つの異なるメンバーを備え、それぞれのメンバーは、Ｆｃアミノ酸配列であり、それぞれの対は、配列番号９９及び１００、配列番号１０１及び１０２、配列番号１０３及び１０４、配列番号１０５及び１０６、配列番号１０７及び１０８、配列番号１０９及び１１０、配列番号１１１及び１１２、配列番号１１３及び１１４、配列番号１１５及び１１６、配列番号１１７及び１１８、配列番号１１９及び１２０、配列番号１２１及び１２２、配列番号１２３及び１２４、配列番号１２５及び１２６、配列番号１２７及び１２８、配列番号１２９及び１３０、配列番号１３１及び１３２、配列番号１３３及び１３４、配列番号１３５及び１３６、配列番号１３７及び１３８、配列番号１３９及び１４０、配列番号１４１及び１４２、配列番号１４３及び１４４、配列番号１４５及び１４６、配列番号１４７及び１４８、配列番号１４９及び１５０、配列番号１５１及び１５２、配列番号１５３及び１５４、配列番号１５５及び１５６、配列番号１５７及び１５８、配列番号１５９及び１６０、配列番号１６１及び１６２、配列番号１６３及び１６４、並びに、配列番号１６５及び１６６の配列からなる対の群から選択され、それぞれのメンバーアミノ酸配列は、それぞれの前記対のそれぞれの配列と、少なくとも７０％が同一であるか、又は最大で３０のアミノ酸付加、アミノ酸欠失又はアミノ酸置換がある点で異なり、第１のＦｃ領域は、第２のＦｃ領域によって構成されるメンバーとは異なる対のメンバーを備える請求項９９に記載のＴＦｃＢＡ。
  101. 配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９及び２２１からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％が同一であるか、又は最大で３０のアミノ酸欠失、アミノ酸付加又はアミノ酸置換がある点で異なるアミノ酸配列を備えるＴＦｃを有する、請求項５９〜１００のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  102. 配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９及び２２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を備えるＴＦｃを有する、請求項１０１に記載のＴＦｃＢＡ。
  103. アミノからカルボキシル末端への順に、第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ＴＦｃ、接続リンカー及び第２のＶＨドメインを備える重鎖を備える請求項５９〜１０２のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  104. 重鎖は、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、接続リンカー及び第２のＶＨドメインを備える請求項１０３に記載のＴＦｃＢＡ。
  105. 重鎖は、アミノからカルボキシル末端への順に、第１のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、接続リンカー、第２のＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー及び第２の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを備え、第２のＶＨ及びＶＬドメインが結合して、第２の結合部を生成する請求項１０４に記載のＴＦｃＢＡ。
  106. 第１のＶＨドメインで二量化して第１の結合部を生成する第１のＶＬドメインを備える軽鎖を有する、請求項１０５に記載のＴＦｃＢＡ。
  107. 軽鎖は、ＶＬドメインのカルボキシル末端にリンクされる軽鎖不変（ＣＬ）ドメインを備える請求項１０６に記載のＴＦｃＢＡ。
  108. 第１の結合部は抗ｃ−Ｍｅｔ結合部であり、第２の結合部は抗ＥＧＦＲ結合部である請求項５９〜１０７のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
  109. ＴＦｃリンカーを通してリンクされる第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域を備えるＴＦｃにリンクされる結合部を備える一価のＴＦｃＡであって、
    第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域が結合してＦｃを生成し、
    第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の一方又は双方が１つ以上のアミノ酸修飾を備えることで、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域の間の結合を強化し又は安定させる一価のＴＦｃＡ。
  110. 電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡである請求項１〜１０９のいずれか１項に記載のＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡであって、
    電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、群Ａから選択されるアミノ酸及び群Ｂから選択されるアミノ酸（電荷相補対）を備える対の帯電アミノ酸を備えるＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡであり、
    群Ａは、ｐＩが７より大きいすべての天然のアミノ酸を含み、群Ｂは、ｐＩが７より小さいすべての天然のアミノ酸を含み、任意に、群Ａは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇを含み、群Ｂは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ａｌａ及びＰｒｏを含み、
    前記電荷相補対は、第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基からなり、
    前記電荷相補対は、位置２９７の電荷相補対又は位置２９９の電荷相補対であり、
    位置２９７の電荷相補対は、前記第１のＦｃ領域のＥＵ位置２９７に位置する前記第１のアミノ酸残基及び前記第２のＦｃ領域のＥＵ位置２９７に位置する前記第２のアミノ酸残基を有する電荷相補対であり、位置２９９の電荷相補対は、前記第１のＦｃ領域のＥＵ位置２９９に位置する前記第１のアミノ酸残基及び前記第２のＦｃ領域のＥＵ位置２９９に位置する前記第２のアミノ酸残基を有する電荷相補対であるＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡ。
  111. 請求項１１０に記載の電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡであって、
    電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、位置２９７の電荷相補対及び位置２９９の電荷相補対の双方を備え、位置２９７の電荷相補対の第１の及び第２のアミノ酸残基は、位置２９９の電荷相補対の第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基と同じ又は異なる請求項１１０に記載の電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡ。
  112. 電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡが、位置２９７の電荷相補対を備え、
    電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡではないが第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が共に同じ帯電アミノ酸からなる残留物であることを除いて電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡと同じであるＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡと比べて、より安定であり、
    前記同じ帯電アミノ酸が、電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの位置２９７の電荷相補対のアミノ酸の一方である請求項１１０又は１１１に記載の電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡ。
  113. 電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、位置２９９の電荷相補対を備え、
    電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡは、電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡではないが第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が共に同じ帯電アミノ酸からなる残留物であることを除いて電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡと同じであるＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡと比べて、より安定であり、
    前記同じ帯電アミノ酸が、電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの位置２９９の電荷相補対のアミノ酸の一方である請求項１１０、１１１又は１１２に記載の電荷相補対ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡ。
  114. 第１の結合部又は第２の結合部は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インシュリン受容体、Ｒｏｎ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１ ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭ及びＥｐｈＡ２からなる群より選択されるヒトタンパクに特異的に結合する請求項５９〜１１３のいずれか１項に記載のＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡ。
  115. 請求項１〜１１４のいずれかのＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡ及び薬学上許容される担体を含む医薬組成物。
  116. 少なくとも１つの暗号配列を備える核酸分子であって、前記少なくとも１つの暗号配列が、請求項１〜１１４のいずれかのＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの重鎖又は軽鎖をコード化する核酸分子。
  117. 少なくとも２つの暗号配列を備える核酸分子であって、第１の暗号配列は、請求項１〜１１４のいずれかのＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの重鎖をコード化し、第２の暗号配列は、ＴＦｃＢＡの軽鎖をコード化する核酸分子。
  118. 請求項１１６又は１１７の１つ以上の核酸分子を備えるベクター。
  119. 請求項１１８の１つ以上のベクター又は請求項１１６又は１１７の核酸分子を備える細胞。
  120. 請求項１〜１１４のいずれかのＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの重鎖をコード化する核酸分子及びＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの軽鎖をコード化する核酸分子を含む細胞。
  121. 請求項１１９又は１２０の宿主細胞を、核酸を発現する条件下で培養することと、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡを分離することとを有する、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡを製造する方法。
  122. ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡの発現のための適切な条件下で、請求項１１９又は１２０の細胞を培養することを有するＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡを製造する方法。
  123. 癌を有する対象を治療する方法であって、前記方法は、対象に、請求項１〜１２０のいずれか１項に記載の、ＴＦｃＡ又はＴＦｃＢＡ、核酸分子、又はベクターを、治療上有効な量投与することを含む方法。
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