SK11602001A3 - Deriváty benzaldehydu vhodné ako protinádorové prostriedky - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka derivátov benzaldehydu vhodných ako protinádorové prostriedky, antivirotiká, imunopotenciátory a/alebo ako prostriedky vhodné na potlačenie chorôb, ktoré vznikajú následkom zvýšenej proliferácie buniek a/alebo ako prostriedky na potlačenie autoimunitných chorôb. Niektoré z uvedených zlúčenín sú zlúčeniny nové.

Doterajší stav techniky

Väčšina v súčasnosti používaných protinádorových liečiv má cytotoxický účinok. Aj keď uvedené prostriedky majú pozitívne výsledky pri liečbe niektorých zhubných nádorov, ako je lymfóm, leukémia a testikulárne zhubné nádory, často pri ich použití dochádza k ťažkým a neprijateľným vedľajším účinkom, ktoré obmedzujú možnosti ich použitia v účinnej liečbe. Ďalej, u niektorých typov zhubných nádorov, ako sú solídne tumory (karcinómy) sa dosiaľ ukazuje, že chemoterapia má obmedzenú pôsobnosť, pretože súčasné cytostatiká zriedka zlepšia prognózu ochorenia pacienta. Schopnosť nádorových buniek vyvinúť si odolnosť proti cytotoxickým prostriedkom patrí medzi hlavné dôvody pre zlyhávania pri liečení solídnych tumorov. V odbore teda existuje značná potreba nových protinádorových prostriedkov, ktoré majú menej vedľajších účinkov, a ktoré by mali selektívnejšie účinky na malígne bunky.

Z dokumentov EP-0215395, JP-63264411, JP-8800940, JP55069510 a EP-0283139 je známe, že benzaldehydy a ich deriváty majú selektívny protinádorový účinok.

Aldehydy reagujú s rôznymi nukleofilnými skupinami, ktoré obsahujú O, S alebo N, ako sú hydroxyskupiny, tiolové skupiny a aminoskupiny za tvorby karbonylových kondenzačných produktov ako sú acetály, merkaptaly, aminály atď. Avšak s primárnymi amínmi obvykle reagujú za tvorby aduktov, Schiffovych báz

·· • •	···· ·	·· • · •	·· • · • ·	• ·
• · • ·	·· •
•	• ·	•	•	• ·
• t	•	···	····	··	··

(iminov). Je všeobecne známe, že tvorba Schiffovych báz in vivo je zahrnutá v kľúčových biochemických procesoch, ako je transaminácia, dekarboxylácia a ďalšie aminokyselinami modifikované reakcie sprostredkované pyridoxalfosfátom, pri pôsobení aldolázy alebo fruktózy-difosfátu pri glykolýze a pri kondenzácii retinalu s rodopsínom v procese videnia. Tiež je známe, že karbonylové kondenzačné reakcie sú zahrnuté v transmembránových signálnych procesoch, napríklad v generácii imunitnej odozvy.

Tvorba iminov prebieha dvojstupňovým mechanizmom: prídavkom amínového nukleofilu ku karbonylovej skupine vznikne karbinolamínový (aminohydrínový) medziprodukt, v ktorom v následnom dehydratačnom stupni vznikne C=N dvojitá väzba. Obidva stupne sú reverzibilné, pričom reakcia je podporovaná hodnotou pH. Reakcia teda prebieha spôsobom, kde závislosť pH/rýchlosť má charakteristický zvonovitý profil s najvyššími rýchlosťami reakcie v mierne kyslom prostredí.

		OH
,0		|
// R—C +	H8N—R' =	;==S= R—c—N—R’ = I I	.--- R—C—N—R‘ + . H2°
\ H		H H	H
aldehyd	amín	karbinolamín	imín
Avšak	je známe,	že Schiffove bázy	tiež ľahko vznikajú vo

fyziologických podmienkach, a že in vivo prebieha veľa karbonylových kondenzačných reakcií (E. Schauenstein a koľ., Aldehydes in biological systems, London, Pion Ltd., 1977).

Schiffove bázy sú samotné reaktívne, majú sklon zúčastňovať sa ďalších reakcií, ktoré vedú k adícii nukleofilných prostriedkov na dvojitú väzbu. Z určitých amínov, ktoré obsahujú síru, najmä z aminokyselín cysteínu, metionínu a tiež glutatiónu, prvotne vzniknuté Schiffove bázy môžu podliehať reverzibilnej vnútornej cyklizácii, pri ktorej sa sulfhydrylová skupina spojí s imínom za tvorby tiazolidínkarboxylátu (M. Friedman, The Chemistry and Biochemistry of Sulfhydryl Group in Amino Acids, Peptides and Proteins, Oxford, Pergamon Press, 1973).

·· • •	···· • · • ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	··
•	• ·	• ·	• ·
··	•	··· ····	··	··

H₂0

R-C*

H /?

H₂N—CH-C |h₂ oh

SH /^S ?*** R CH j

N—CH

H ' aldehyd cysteín ktoré prebiehajú medzi karbonylovými aminoskupinami proteínov tvoriacich Means a R. E.

125-138, San sú vo reakcií, a voľnými väzby Schiffovych báz opísali G. E. str.

aldehydy

Výskyt zlúčeninami reverzibilné

Feeney (Chemical Modification of Proteins, Francisko, Holden-Day, 1971). Aromatické všeobecnosti reaktívnejšie ako nasýtené alifatické aldehydy, a môžu tvoriť Schiffove bázy dokonca bez odstraňovania vody vzniknutej počas reakcie. (R. W. Layer, Chem: Rev. 63 (1963), 489-510). Táto skutočnosť je významná pri posudzovaní možností tvorby Schiffovych báz za fyziologických podmienok. Zaugg a kol. (J. Biol. Chem. 252 (1977), 8542-8548) preukázali s použitím hemoglobínu ako zdroja aminoskupin, že aromatické aldehydy majú pre tvorbu Schiffovych báz dvojnásobne až trojnásobne zvýšenú reaktivitu v porovnaní s alifatickými aldehydmi. Vysvetlenie obmedzenej reaktivity alkanálov spočíva v skutočnosti, že vo vodnom roztoku pri neutrálnom pH je na posun rovnováhy v prospech tvorby Schiffovych báz nutný veľmi veľký prebytok voľného aldehydu (E. Schauenstein a kol., Aldehydes in biological systems, London, Pion Ltd., 1977).

Benzaldehyd a salicylaldehyd ľahko tvoria imínové Schiffove bázy s aminoskupinami membrán, a na reakciu benzaldehydu s amínmi boli zistené vysoké hodnoty rovnovážnych konštánt (J. J. Pesek a J. H. Frost, Org. Magnet. Res., 8 (1976), 173-176; J. N. Wiliams Jr. a R. M. Jacobs, Biochim. Biophys. Acta, 154, (1968), 323-331). Pri reakcii so salicylaldehydom je vzniknutý imín stabilizovaný navyše, a to vďaka vodíkovej väzbe medzi voľným elektrónovým párom imínového dusíka a orto-hydroxylovou skupinou (G. E. Means a R. E. Feeney, Chemical Modification of Proteins, str. 125-138, San Francisko, Holden-Day, 1971; J. M. Dornish a E. O. Pettersen, Biochem. Pharmac. 39, (1990), 309-318).

··		·«··	• ··	··
•	•	•	·· · ·	• ·	··
•	•	•	• ·	• ·
•	•	•	• ·	• ·
··		•	··· ····	··	··

Autori vynálezu už skôr preukázali pomocou rádioaktívneho ulpieva na 0. : Cancer zhodný so interaguje Agric. že ako proti Cis-DDP že benzaldehyd nepreniká do bunky, ale Pettersen E.

poznatok je že benzaldehyd

Sakaguchi a kol., Tiež sa zistilo, chránia bunky (Dornish J. 235-243).

ktoré

M. a Tento preukazujú, E. coli (K. 1775-1777).

značenia, bunkovej membráne Letters 29 (1985) skoršími štúdiami, s membránovými proteínmi Biol. Chem., (1979), 43, pyridoxal tak pyridoxal-5-fosfát cytotoxickému a protinádorovému prostriedku cis-DDP. je prostriedok pôsobiaci na jadro bunky. Zatiaľ čo pyridoxal v zásade môže prenikať lipofilnou bunkovou membránou, u pyridoxal-5-fosfátu túto možnosť blokuje iónovo pripojená fosfátová skupina. Pyridoxal-5-fosfát teda musí vykazovať svoj chrániaci účinok pôsobením na bunkovú membránu zvonka. Tvorbe aduktu, Schiffovej bázy vzniknutej medzi aldehydom a aminoskupinami bunkovej membrány tiež zodpovedá súčasne pozorovaný spektrálny posun absorbancie pyridoxal-5-fosfátu smerom k nižším vlnovým dĺžkam (J. M. Dornish a E. 0. Pettersen, Cancer Lett., 29, (1985), 235-243).

Z týchto zistení vyplýva, že aldehydy sa viažu na amíny a ďalšie nukleofilné skupiny na bunkovej membráne za tvorby Schiffovych báz a ďalších kondenzačných produktov. Tiež je známe, že stimulácia rastu buniek je sprostredkovaná kaskádou procesov pôsobiacich na bunkovú membránu v vonkajšej strany. Rovnakým spôsobom môžu deriváty podľa predloženého vynálezu vyvolať tvorbou aduktov s ligandami na bunkovej membráne spúšťacie impulzy vnútri bunky, významné pre parametre rastu buniek, ako je syntéza proteínov a mitóza, a na expresiu génov supresie tumorov a imunitných reakcií. Pretože kondenzačné reakcie sú reverzibilné, účinky na bunku je možné modulovať posunom rovnováhy v nadväznosti na viažúce sa zložky. Prítomnosť tejto existujúcej rovnováhy na chemickej úrovni je konzistentná s reverzibilným a netoxickým účinkom pozorovaným u derivátov benzaldehydu.

Inhibiciu syntézy proteínov vyvolanú derivátmi benzaldehydu výskumná skupina autorov vynálezu dôkladne študuje in vitro. U solídnych tumorov môže redukcia syntézy proteínov spôsobovať nedostatok vitálnych proteínov, ktorý

- 5 • ···· vedie k bunkovej smrti. U normálnych buniek je potenciálna kapacita syntézy proteínov väčšia ako u väčšiny nádorových buniek solídnych tumorov. Túto skutočnosť je možné demonštrovať porovnaním času trvania bunkového cyklu normálnych kmeňových buniek, ktorý je často menší ako 10 hodín a je teda kratší ako u väčšiny nádorových buniek solídnych tumorov, kde uvedený čas je obvykle 30 až 150 hodín (viď. Gustavo a Pileri The Celí Cycle and Cancer. Ed. : Baserga, Marcel Dekker Inc., N. Y., 1971, str. 99). Pretože bunky počas svojho bunkového cyklu v priemere zdvojnásobujú proteín, znamená to, že akumulácia proteínu je u rastovo stimulovaných normálnych buniek vyššia ako u väčšiny typov nádorových buniek.

Okrem znalosti vyššie uvedeného rozdielu medzi normálnymi a nádorovými bunkami existuje ešte ďalší rozdiel s podobným významom. Zatiaľ čo normálne bunky majú odozvu na regulačné rastové podnety, nádorové bunky majú uvedenú odozvu zníženú alebo žiadnu. Ak sa inhibícia syntézy proteínov uplatní rovnaký dlhší čas ako na normálne bunky, tak na nádorové bunky, uvedené dva typy buniek môžu reagovať odlišne. Normálne tkanivo môže využiť svoje rastové rezervy a tým si zachovať svoju normálnu tvorbu buniek. Nádorové tkanivo však má malé alebo žiadne rezervy. V rovnakom čase sa môže rýchlosť akumulácie proteínu u väčšiny nádorových buniek hodnotiť ako nízka (t.j. syntéza proteínu je len mierne vyššia ako jeho degradácia). Preto môže byť inhibícia syntézy proteínu dostatočným faktorom na vyvolanie nerovnováhy v tumorovom tkanive pokiaľ ide o akumuláciu proteínu, a vyvolať tak negatívny posun vo vyváženosti určitých proteínov. Pri kontinuálnej liečbe počas niekoľkých dní sa tak môže dosiahnuť inaktivácia buniek a nekróza tumorového tkaniva, zatiaľ čo normálne tkanivo zostáva nepoškodené.

Najčastejšie hodnotenou zlúčeninou reverzibilnú inhibíciu proteínovej syntézy a indukujúcou vykazujúcou protinádorovú účinnosť je v súčasnosti kyselina 5,6benzylidén-di-askorbová, [zilaskorb(²H) ]. Táto už v odbore známa zlúčenina inhibujúca proteínovú syntézu je podrobne opísaná v práci autorov Petterson a kol., (Anticancer Res.,

- 6 ·· ····

Vol. 11, str. 1077-1082, 1991) a v EP-0283139. Zilaskorb (²H) indukuje nekrózu tumoru in vivo v ľudských tumorových xenoimplantátoch na holých myšiach (Petterson a kol., Br. J. Cancer, Vol. 67, str. 650-656, 1993). Okrem zilaskorbu(²H) je najbližšou dosial známou zlúčeninou v tejto oblasti na liečbu nádorových ochorení 4,6-O-benzylidén-D-glukopyranóza (zlúčenina 1) . O týchto dvoch zlúčeninách je známe, že majú všeobecnú protinádorovú účinnosť, a boli už hodnotené v klinických skúškach voči viacerým nádorovým chorobám. Avšak žiadna navrhovaná liečba orgánov alebo tkanív postihnutých nádorovým ochorením navrhovaná ako vhodná s použitím uvedených zlúčenín a obchodný vývoj týchto prostriedkov neboli dosiaľ schválené.

Autori vynálezu teraz s prekvapením zistili, že benzaldehydové deriváty cukrov hexozového typu (zahŕňajúce 4,6-0-(benzylidén-dx)-D-glukopyranózu, zlúčeninu 2) majú neočakávane silný účinok na nádory v určitých orgánoch alebo v tkanivách. Dosiaľ nie je možné vysvetliť mechanizmus vyššie uvedenej selektivity, ale predpokladá sa, že súvisí s cukrovou skupinou uvedených derivátov pôsobiacich na určité bunky alebo tkanivá.

Autori vynálezu tiež zistili, že určité nové produkty ako je napríklad zlúčenina 8, (2-acetamido-4,6-0-(benzylidén-di)-2deoxy-D-glukopyranóza), poskytujú nečakane dobré výsledky v modeli na holých myšiach (viď. príklad 3, tabuľka 1). V uvedenom pokuse boli 3 z 8 myší zbavené tumoru, čo je v podobných pokusoch na imunosupresívnych druhoch neobvyklý výsledok. Dôvod tohto javu môže spočívať v tom, že acetamidová skupina má vysokú afinitu k receptorom kyseliny hyalurónovej. Je známe, že malígne tumory majú vysoký obsah kyseliny hyalurónovej a preto tiež jej zodpovedajúcich receptorov.

Autori vynálezu tiež vo svojich štúdiách zistili, že deuterované analógy uvedených zlúčenín sú účinnejšie ako ich zodpovedajúce protónové analógy. Tento rozdiel je veľmi zrejmý v pokuse, ktorý hodnotí adhéziu na bunky (viď. príklad 5 a tiež príklad 8) . Pri náhrade atómu vodíka dvojnásobne ťažkým atómom ťažkého deutériového izotopu, kinetické vlastnosti • ·

- 7 ·· ···· •·· ··· · • ·· · · • · · · · · • · · · · ··· ···· ·· ··· molekuly sa zmenia v pomere, v ktorom sa zníži rýchlosť prerušenia väzby C-D k rýchlosti prerušenia väzby C-H. Je známe, okrem iného z práce M. I. Blake a kol., J. Pharm. Sci.,

64(1975), 367-391, že deuterácia liečiv môže zmeniť ich farmakologickú funkciu.

V odbore je tiež známe (EP 0 283 139 a Anticancer Res. 15: 1921-1928 (1995)), že náhrada acetálového protónu v 4,6-0benzylidén-D-glukopyranóze deutériom (zlúčenina 1 verzus zlúčenina 2), ovplyvňuje ako syntézu proteínu, tak frakciu prežívajúcich buniek stavovenú in vitro. Autori vynálezu predpokladajú, že jedno z možných vysvetlení spočíva v tom, že účinok D-izotopu na chemickej úrovni súvisí so spomalením oxidácie deuterovaného benzaldehydu na inaktívnu kyselinu benzoovú, čo tiež vedie k dlhšiemu polčasu deuterovanej účinnej zložky na bunkovej úrovni. Avšak na preukázanie významného rozdielu účinkov na prežívajúcu frakciu NHIK 3025 buniek exponovaných zlúčenine 1, resp. 2, sa musí aplikovať koncentrácia liečiva viac ako 6 mM. Rozdiel v účinkoch inhibujúcich syntézu proteínu je veľmi malý, pokiaľ sa bunky vystavia expozícii koncentráciám 1 až 10 mM.

Autori vynálezu uskutočnili úplne odlišný pokus. Pokus zahŕňa meranie adhéznej sily medzi bunkami NHIK 3025 a substrátom po preinkubácii buniek v roztokoch zlúčenín 1 a 2 (viď. príklad 5) . Aj pri koncentráciách 1 mM mal uvedený pokus s použitím D-izotopu prekvapujúce účinky. S použitím zlúčeniny 2 došlo k významnej redukcii adhéznej sily na 1/3 vzhľadom ku kontrolnému pokusu, zatiaľ čo u zlúčeniny nedošlo k významnej redukcii adhéznej sily. Autori vynálezu predpokladajú, že zlúčenina 2 môže interferovať s biosyntézou integrínov znižujúcich schopnosť buniek pripojiť sa k substrátu. Integríny sú štrukturálne transmembránové proteíny rozhodujúce pre väzbu buniek na extracelulárnu matricu a pre vzájomné bunkové interakcie. Inhibícia funkcie integrínov by tak mohla nepriamo pôsobiť na schopnosť nádorových buniek metastázovať. Z uvedeného pokusu vyplýva, že integríny by mohli byť mimoriadne citlivé na inhibíciu syntézy proteinov. Podľa vyššie uvedeného by tak zlúčenina 2 mohla mať vhodné použitie

• · ·· ···· • · · • · · ·· ·· pri prevencii šírenia metastáz pri vývoji nádorového ochorenia.

Chemicky indukovaná karcinogenéza má podobný mechanizmus ako karcinogenéza indukovaná určitými typmi vírusov, ako sú vírusy hepatitídy B a C, určité papilloma vírusy, určité herpes vírusy atď. Predovšetkým ide o prípad nádorového ochorenia pečene u pacientov infikovaných hepatitídou B a C. Preto sa dá predpokladať, že profylaktická liečba týchto pacientov zlúčeninami podlá vynálezu by mohla zabrániť alebo oddialiť vývoj nádorového ochorenia pečene. Tiež skutočnosť, že uvedené prostriedky majú nízku toxicitu, ich robí vhodnými na použitie v uvedenej liečbe.

Z UK patentovej prihlášky 9026080.3 je známe, že benzaldehydové zlúčeniny, už skôr známe ako protinádorové prostriedky, sa môžu použiť na potlačenie chorôb, ktoré sa prejavujú dôsledkom abnormálne zvýšenej proliferácie buniek. Uvedené zlúčeniny tiež vykazujú účinok na bunky vykazujúce zvýšenú rýchlosť bunkovej proliferácie, a môžu sa teda použiť na liečbu chorôb ako je psoriáza, zápalové choroby, reumatické choroby a ďalšie autoimunitné choroby ako je ulcerózna kolitída, Crohnova choroba a alergické dermatologické reakcie.

Dermatologické abnormality, ako je psoriáza, sú často charakterizované rýchlou obnovou epidermis. Zatiaľ čo normálna koža produkuje asi 1250 buniek/deň/cm² kože s obsahom asi 27000 buniek, psoriatická koža produkuje 35000 nových buniek/deň/cm² z 52000 buniek. Bunky, ktoré sa nachádzajú vo vyššie uvedených poruchách, sú však normálne bunky, ktoré sa rýchlo a opakovane reprodukujú bunkovým delením. Zatiaľ čo obnova normálnych kožných buniek trvá približne 211 hodín, u psoriatických kožných buniek sa zrýchli na asi 10 až asi 36 hodín.

V súčasnosti sa psoriáza, zápalové choroby, reumatické choroby a ďalšie autoimunitné ochorenia liečia kortikosteroidmi, NSAID a vo vážnych prípadoch imunosupresívnymi prostriedkami ako sú cytostatiká a cyklosporíny. Všetky tieto liečivá môžu mať vážne nežiadúce účinky. Pretrváva teda potreba prostriedkov, ktoré by mali menej vedľajších účinkov.

• ·

- 9 Je známe, že aromatické aldehydy a ich určité acetálové deriváty majú inhibičný účinok na rast buniek, ktorých obnova je prirodzene reverzibilná. Inhibicia rastu vyvolaná uvedenými zlúčeninami je predovšetkým spôsobená redukciou syntézy proteínov bunkami (Pettersen a kol., Eur. J. Clin. Oncol., Vol. 19, str. 935-940, 1983, a Cancer Res., Vol. 45, str.

2085-2091, 1981). Inhibicia syntézy proteínov je účinná len vtedy, ak sa uvedené prostriedky nachádzajú v mikroprostredí bunky. Syntézu bunkového proteínu je preto napríklad možné rýchlo vrátiť na obvyklú hladinu odstránením uvedeného prostriedku z buniek (t.j. vo väčšine prípadov počas 1 hodiny).

Vyššie uvedený postup vedie k tomu, zostávajú po ošetrení vyššie uvedenými poškodenia.

že normálne bunky prostriedkami bez

Schopnosť buniek prenášať signály mechanizmom závislým na kontakte buniek (adhéziou) sa už študuje vela rokov. Tento mechanizmus je mimoriadne dôležitý pre reaktivitu cirkulujúcich buniek ako sú lymfocyty, makrofágy atď., a tiež napríklad pre metastázujúce bunky a ich zachytenie v tkanivách a tvorbe nových tumorov. Možnosť zmeniť adhézne vlastnosti buniek, ktoré sú riadené imunitnou alebo zápalovou odozvou môže mať veľký terapeutický význam na liečbu mnohých chorôb ako je reumatoidná artritída, psoriáza, psoriatická artritída, lupus erythematodes, akné, Bechterovova artritída, progresívna systémová skleróza (PSS), seborrhoea a ďalšie autoimunitné choroby ako je ulcerózna kolitída a Crohnova choroba.

Imunitný systém je usporiadaný na identifikáciu a elimináciu všetkých zložiek, ktoré rozpozná ako cudzie, či už ide o bakteriálne, vírusové alebo protozoálne infekcie alebo abnormálne bunky, ako sú nádorové bunky. Aby imunitný systém poskytoval špecifické odozvy v širokom rozsahu biotických variácií predstavovaných rôznymi pôvodcami porúch, musí byť vysoko diverzifikovaný. Avšak nadmerná stimulácia tohto jemne vyladeného systému môže viesť k rôznym alergickým a zápalovým reakciám a môže vyvolať autoimunitné choroby. Tiež býva obtiažne prekonať rejekciu transplantátov. Významnou úlohou

- 10 súčasnej terapie je modulácia imunitného systému a to buď podporením alebo obmedzením špecifickej odozvy.

·· ····

• ··	··	•
·· · ·	• ·	··
• ·	•	•	•
• ·	• ·	•	•
• ·	•	•	•
··· ····	··	···

V imunologickom rozpoznávacom procese sa fragment cudzieho proteínu zachytí v záreze proteínu MHC triedy II na povrchu bunky predstavujúcej antigén (APC). K tomuto komplexu MHC-protilátka sa tiež pripojí receptor T-pomocného lymfocytu. Na aktiváciu T-pomocného lymfocytu sú potrebné najmenej dva signály: primárny signál poskytuje samotný antigén prostred níctvom komplexu MHC triedy II a zosilňuje sa koreceptormi CD4. Druhý signál poskytuje špecifická na plazmovej membráne naviazaná molekula na povrchu APC. Ligandový koreceptorový proteín je lokalizovaný na povrchu T-pomocného lymfocytu.

Obidva signály sú potrebné na aktiváciu T-lymfocytov. Akonáhle príde k ich aktivácii, sekréciou interleukínových ligandových povrchových stimulujú rastových bunkových vlastnú proliferáciu faktorov a syntézou receptorov. Väzba interleukínov na tieto receptory potom priamo stimuluje proliferáciu T-lymfocytov.

V dekáde rokov 1980 sa zistilo, že inklúzny cyklodextrínbenzaldehydový inklúzny komplex môže stimulovať imunitný systém zosilnením lymfokínmi aktivovaných zabijačích buniek v modeli na myšiach (Y. Kuroki a kol., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117 (1991), 109-114). V štúdiách in vitro uskutočnených neskôr sa zistila podstata chemických reakcií na miestach interakcie APC-donor/receptor T-lymfocytov zodpovedných za druhý kostimulačný signál, a že uvedené reakcie majú formu karbonyl-amínových kondenzácií (tvorba Schiffovych báz). Okrem toho sa zistilo, že uvedené reakcie sa môžu napodobniť syntetickými chemickými zložkami. Tieto zistenia otvárajú nové terapeutické možnosti prostredníctvom umelého zosilnenia imunitného systému. Vo WO 94/07479 je v patentových nárokoch uvedené použitie určitých aldehydov a ketónov, ktoré tvoria Schiffove bázy a hydrazóny s aminoskupinami na povrchu Tlymfocytov. V EP 0609606A je ako výhodná imunostimulačná zlúčenina uvedená kyselina 4-(2-formyl-3-hydroxyfenoxymetyl)benzoová (tukarezol), zlúčenina pôvodne navrhnutá na liečenie kosáčikovej anémie. Táto zlúčenina sa podáva orálne a je systémovo biologicky dostupná. Možné terapeutické možnosti

- 11 ·· ····

• ·	•	•
• ·	•
• ·	• ·
• ·	•
··	•	•

··	·· ·
• ·	• ·	··
•	• ·	•
•	• · ·	•
•	• ·	•
• ····	··	···

tukarezolu, ktoré zahŕňajú viacero chorôb zo skupiny zahŕňajúcej bakteriálne, vírusové a protozoálne infekcie, choroby súvisiace s autoimunitou a nádorové ochorenia, sú v súčasnosti v štádiu skúšok (H. Chen a J. Rhodes, J. Mol. Med. (1996) 74: 497-504) a súčasný vývoj liečiv zahŕňa aj kombinačné stratégie podávania, kde tukarezol sa podáva spoločne s vakcínou na liečbu chronickej hepatitídy B, HIV a malígneho melanómu.

Tiež sa zistilo stanovením imunologický významných hodnôt in vitro, že krivka závislosti dávka/odozva má zvonovitý priebeh (H. Chen a J. Rhodes, J. Mol. Med. (1996), 74: 497504). Tento inak neobvyklý priebeh závislosti dávka/odozva sa môže vysvetliť predpokladom, že vysoké koncentrácie aldehydového liečiva nasýtia kostimulačné ligandy potrebné na účinnú väzbu APC na T-lymfocyt a pôsobia preto inhibične. Zdá sa, že optimálna dávka je dávka dostatočná na dosiahnutie dynamickej rovnováhy na dosiahnutie kostimulácie bez blokovania intercelulárnej blokácie.

Vo všeobecnosti sú aldehydy samotné nestabilné kvôli oxidácii. Kyselina 4-(2-formyl-3-hydroxyfenoxymetyl)benzoová (tukarezol), opísaná v EP-0609606 je významne stabilnejšia in vivo ako in vitro. Dôvod tohto javu môže byť v náchylnosti na oxidáciu vo vodných roztokoch in vitro (H. Chen a J. Rhodes,

J. Mol. Med. (1996), 74: 497-504). Vela aldehydov je príliš reaktívnych na ich podávanie ako takých, aj keď majú overený účinok in vitro ako protinádorové liečiva, pri priamej aplikácii in vivo dráždia a sú pre uvedené podanie nevhodné. V biotickom systéme karbonylová skupina aldehydu rýchlo reaguje s nukleofilnými skupinami, ktoré sú predovšetkým prítomné vo všetkých telesných tekutinách. Tieto nežiadúce vedľajšie reakcie môžu viesť k rýchlej metabolizácii liečiva a obtiažnemu riadeniu hladiny účinnej zložky v sére. Na dosiahnutie účinného imunozosilnenia je rozhodujúce riadenie koncentrácie liečiva na bunkovej úrovni v úzkom rozsahu. Tukarezol sa podáva orálne ako nechránený aldehyd, a je podozrenie, že dochádza k rozkladu liečiva a problémom pri riadení jeho farmakokinetiky.

··	····
• ·	•	•
•	•	•
•	•	• ·
•	•	•
··	•	•

··	··
• ·	• ·	··
•	• ·	•
•	• · ·	•
•	• ·	•
• ····	··	···

U benzaldehydových derivátov 4,6-benzylidén-D-glukózy a ich deuterovaných analógov (zlúčenina 1 a 2) sa preukázalo, že majú vysokú biologickú dostupnosť buď pri i.v. podaní alebo pri p.O. podaní. Zistilo sa, že biologická dostupnosť stanovená koncentráciou liečiva v sére po orálnom podaní zlúčeniny 2 myšiam BALB je 93 až 99 %. (C. B. Dunsaed, J. M. Dornish a E. 0. Pettersen, Cancer Chemother. Pharmacol. (1995), 35: 464-470). Okrem toho glukózová skupina môže vykazovať afinitu k receptorom prítomným na povrchu bunky a tým zlepšiť dostupnosť liečiva na bunkovej úrovni. Voľný aldehyd sa môže ľahko uvoľniť hydrolýzou acetálu, čim príde k uvoľneniu karbonylovej skupiny, ktorá sa stane dostupnou na tvorbu Schiffových báz na cielených ligandoch.

Podľa predloženej patentovej prihlášky sa aldehydy derivatizujú biologicky prijateľnými glycidmi ako je glukóza, galaktóza a ďalšie za tvorby acetálov. Cukrová zložka prispieva k zlepšenej stabilite a tiež zvyšuje biologickú dostupnosť aldehydovej funkčnej skupiny pre cieľové bunky. V porovnaní s dosial známymi zlúčeninami, v spôsoboch s použitím zlúčenín podľa vynálezu sa prekvapujúco zvyšuje účinnosť kondenzačných reakcií a ich farmakokinetika sa ľahšie riadi.

Na porovnanie zlúčeniny 2 s tukarezolom z hľadiska ich účinkov na inaktiváciu buniek a proteínovú syntézu sa uskutočnilo stanovenie týchto dvoch účinkov v prítomnosti rovnakých koncentrácii obidvoch týchto liečiv. Ako je zrejmé z obr. 4 a obr. 5, preukázalo sa, že zlúčenina 2 je v obidvoch sledovaných parametroch účinnejšia ako tukarezol.

Imunostimulačný účinok zlúčenín podľa vynálezu je tiež možné využiť na liečbu určitých vírusových chorôb v kombinácii s ďalšou protivírusovou terapiou ako s použitím antivirotík alebo vakcín. Veľa druhov vírusov sa po prvej infikácii inkorporuje do bunkového jadra a zostávajú dlhý čas inaktívne. Onkogénne vírusy ako vírusy hepatitídy B a C, určité retrovírusy a určité papilloma vírusy môžu vyvolať vývoj nádorového ochorenia. V uvedených latentných obdobiach je veľmi obtiažne vírusovú infekciu liečiť. Následkom imunitných odoziev sa uvedené vírusy často uvoľňujú za vzniku virémie, a

·· •	•	···· •	• ·· ·· · ·	·· • ·	• ··
	•	•	• ·	•	•	•
•	•	• ·	• ·	• ·	•	•
•	•	•	• ·	• ·	•
··		•	··· ····	··	···

v tomto štádiu sa môžu odstrániť z organizmu. Schopnosť benzaldehydových derivátov vyvolať imunitnú odozvu sa môže použiť na vývoj liečby uvedených chorôb v kombinácii s antivirotikami alebo vakcínami.

Hlavným cielom vynálezu je poskytnúť nové zlúčeniny na prevenciu a/alebo liečbu nádorových ochorení a chorôb súvisiacich s poruchami imunitného systému.

Ďalším cielom vynálezu je poskytnúť nové zlúčeniny umožňujúce zosilnenie imunitných odoziev a tým možnosť potlačenia infekčných chorôb vyvolaných vírusmi, baktériami, hubami a ďalšími mikroorganizmami.

Tretím cielom vynálezu je poskytnúť zlúčeniny na prevenciu alebo liečbu nádorových ochorení a chorôb súvisiacich s poruchami imunitného systému, ktoré nemajú toxické vedlajšie účinky.

Štvrtým cielom vynálezu je poskytnúť zlúčeniny na profylaktickú liečbu alebo prevenciu vývoja nádoru pečene u pacientov infikovaných hepatitídou B alebo C.

Piatym cielom vynálezu je poskytnúť zlúčeniny na účinnú a priaznivú prevenciu a/alebo liečbu nádorov tkanív a buniek, ktoré obsahujú receptory s afinitou k zodpovedajúcim cukrovým zložkám.

Šiestym cielom vynálezu je poskytnúť zlúčeniny na liečbu chorôb, ktoré súvisia s imunitným systémom, ako je psoriáza, zápalové ochorenia čriev, artritída, SLE, PSS atď.

Uvedené dosiahnuté ciele a ďalšie dosiahnuté ciele vynálezu sú uvedené v pripojených patentových nárokoch.

·· ···· • · · • · · • · · ·· ·

Podstata vynálezu

Vynález zahŕňa zlúčeniny všeobecného vzorca (I):

kde L znamená H alebo D;

Ar znamená fenylovú skupinu alebo fenylovú skupinu substituovanú 1 až 3 substituentami, ktoré môžu mať rovnaký alebo rôzny význam, a znamenajú skupinu zvolenú zo skupiny, ktorá zahŕňa alkyl s obsahom 1 až 20 atómov uhlika, cykloalkyl s obsahom 3 až 6 atómov uhlika, fluóralkyl s obsahom 1 až 6 atómov uhlika, alkenyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlika, alkynyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlika, fenyl, halogén, nitro, kyano, NH₂, NHR¹, N (R¹) 2, NHCfOJR¹ alebo NtCfOJR¹]^ kde R¹ má rovnaký alebo rôzny význam a znamená alkylovú skupinu s obsahom 1 až 20 atómov uhlika alebo fluóralkylovú skupinu s obsahom 1 až 6 atómov uhlika, OR² alebo OC(O)R², kde R² znamená H, D, alkylovú skupinu s obsahom 1 až 20 atómov uhlika alebo fluóralkylovú skupinu s obsahom 1 až 6 atómov uhlika, SR², CA(OR¹)2 alebo CA[OC (0) R¹] 2, kde A znamená H alebo D, C (O) R², COOR³, kde R³ znamená H alebo alkylovú skupinu s obsahom 1 až 20 atómov uhlika, alebo fluóralkylovú skupinu s obsahom 1 až 6 atómov uhlika alebo CON(R³)₂, kde R³ má rovnaký alebo rôzny význam;

Y znamená atóm alebo skupinu zvolenú zo skupiny, ktorá zahŕňa H, D, alkyl s obsahom 1 až 20 atómov uhlika, cykloalkyl s obsahom 3 až 6 atómov uhlika, fluóralkyl s obsahom 1 až 6 atómov uhlika, alkenyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlika, alkynyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlika, fluór, chlór, nitro, OR², OC(O)R², SR², NH2, NHR¹, N(R¹)2, kde R¹ má rovnaký alebo rôzny ·· ···· · ·· ·· e · · ······· • · · · · · · ··· ·· ··· ·· · ··· ···· ·· ··· význam, NHCfOJR¹ alebo N[C(O)R¹]_2/ kde R¹ má rovnaký alebo rôzny význam.

R znamená skupinu zo skupiny, ktorá zahŕňa H, D, alkyl s obsahom 1 až 20 atómov uhlíka, cykloalkyl s obsahom 3 až 6 atómov uhlíka, fluóralkyl s obsahom 1 až 6 atómov uhlíka, alkenyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlíka, alkynyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlíka, alebo ich farmaceutický prijateľné soli.

Uvedený opis je potrebné chápať tak, že vynález zahŕňa všetky stereoizoméry zlúčeniny všeobecného vzorca (I).

Zlúčeniny 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 a 24 (viď. tabuľka na str. 23 až 29) sú zlúčeniny nové.

Podrobný opis vynálezu

Vynález je ďalej nižšie objasnený príkladmi uskutočnenia vynálezu a pripojenými obrázkami a tabuľkami.

Opis obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 sú znázornené výsledky pokusu, v ktorom bunky NHIK 3025 boli ošetrené zlúčeninou 8 (O) alebo zlúčeninou 9 (·) počas 20 hodín pri 37 °C za ich naviazania na Petriho misky z plastickej hmoty. Prežívajúca frakcia znamená frakciu buniek tvoriacich makroskopickú kolóniu po ošetrení. Každý bod znamená strednú hodnotu počtu kolónií z 5 pararelne ošetrených misiek. Štandardné chyby sú menšie ako je veľkosť použitých symbolov.

Na obr. 2 sú znázornené výsledky pokusu, v ktorom bunky NHIK 3025 boli ošetrené zlúčeninou 5 (O) alebo zlúčeninou 7 (*) počas 20 hodín pri 37 °C za ich naviazania na Petriho misky z plastickej hmoty. Prežívajúca frakcia znamená frakciu buniek tvoriacich makroskopickú kolóniu po ošetrení. Každý bod znamená strednú hodnotu počtu kolónií z 5 pararelne ošetrených misiek. Vyznačené vertikálne označenie znamená štandardnú chybu, pokiaľ jej veľkosť prevyšuje veľkosť symbolu.

·· ···· · ·· ·· ·· · ···· ··· • · · · · · · ··· ·· ··· • e · ··· ···· ·· ···

Na obr. 3 sú znázornené výsledky pokusu, v ktorom bunky NHIK 3025 boli ošetrené zlúčeninou 12 () počas 20 hodín pri 37 °C za ich naviazania na Petriho misky z plastickej hmoty. Prežívajúca frakcia znamená frakciu buniek tvoriacich makroskopickú kolóniu po ošetrení. Každý bod znamená strednú hodnotu počtu kolónií z 5 pararelne ošetrených misiek. Vyznačené vertikálne označenie znamená štandardnú chybu, pokiaľ jej veľkosť prevyšuje veľkosť symbolu.

Na obr. 4 sú znázornené výsledky pokusu, v ktorom bunky NHIK 3025 boli ošetrené zlúčeninou 2 (Δ) alebo tukarezolom (·) počas 20 hodín pri 37 °C za ich naviazania na Petriho misky z plastickej hmoty. Prežívajúca frakcia znamená frakciu buniek tvoriacich makroskopickú kolóniu po ošetrení. Každý bod znamená strednú hodnotu počtu kolónií z 5 pararelne ošetrených misiek. Štandardné chyby sú znázornené, pokial prevyšujú veľkosť použitých symbolov.

Na obr. 5 sú znázornené výsledky pokusu stanovenia rýchlosti syntézy proteínu, v ktorých bunky NHIK 3025 boli ošetrené zlúčeninou 2 () alebo tukarezolom (▲) počas 1 hodiny pri 37 °C vzhľadom k neošetreným kontrolným bunkám. Rýchlosť syntézy proteínov bola stanovená zistením množstva [³H]-valínu inkorporovaného počas prvej hodiny ošetrenia liečivom. Výsledky predstavujú štvornásobné uskutočnenie jedného pokusu. Štandardné chyby sú zaznamenané, pokial prevyšujú veľkosť použitých symbolov.

Obr. 6 znázorňuje stredné rastové krivky tumoru tumorovej línie SK-OV-3 xenoimplantátu ovariálneho karcinómu holým myšiam. Myši boli ošetrované denne i. v. podaním 1 mg/kg zlúčeniny 8 (▼) a 7,5 mg/kg zlúčeniny 8 (A). Kontrolná skupina () dostala 0,9 % NaCl. Každý uvedený výsledok predstavuje strednú hodnotu objemu tumoru u 4 až 5 myší vzhľadom ku dňu 1. Vertikálne obmedzenie znamená štandardnú chybu.

Na obr. 7 až 12 je znázornený morfologický vzhľad SK-OV-3 tumorov nasledujúcich troch skupín: skupiny zvierat ošetrených placebom (obr. 7 a obr. 8), skupiny zvierat ošetrených dávkou mg/kg/deň zlúčeniny 8 (obr. 9 a obr. 10) a skupiny zvierat ošetrených dávkou 7,5 mg/kg/deň (obr. 11 a obr. 12). Tumory boli fixované formalínom, uložené do parafínu, narezané na rezy s hrúbkou 6 mm a vyfarbené hematoxylínom a eozínom.

Zväčšenie je štyridsaťnásobné.

Na obr. 13 sú znázornené rastové krivky pľúcneho karcinómu bunkovej línie T-47D na základe stredného sféroidného objemu. Sféroidy boli ošetrené 0,1 mM zlúčeniny 8 (▼) a 1,0 mM zlúčeniny 8 (▲) rozpustenej v médiu. Kontrolná vzorka je znázornená symbolom (). Každý bod predstavuje strednú hodnotu sféroidného objemu 6 až 11 sféroidov. Vertikálne obmedzenie znamená štandardnú chybu.

Obr. 14 znázorňuje fotografie mikroskopických rezov 3 rôzne ošetrených NHIK 3025 bunkových sféroidov, z ktorých jeden predstavuje neošetrenú kontrolnú vzorku (A), jeden predstavuje vzorku ošetrovanú 0,1 mM zlúčeniny 8 počas 4 dní (B) a jeden predstavuje vzorku ošetrovanú 1,0 mM zlúčeniny 8 počas 4 dní (C).

Na obr. 15 až 18 sú uvedené výsledky stanovenia frakcií jadier v každej interfáze Gl, S a G2, kde je RB-proteín naviazaný na jadro po ošetrení zlúčeninou 8.

Na obr. 19 a 20 je znázornená rýchlosť syntézy proteínu u buniek NHIK 3025 (obr. 19) a T-47D-buniek (obr. 20) vzhľadom ku kontrolným bunkám. Každá hodnota znamená priemer zo štyroch pararelných stanovení. Štandardné chyby sú vyznačené vertikálnym obmedzením, pokiaľ prevyšujú veľkosť symbolov.

Obr. 21 znázorňuje medián adhéznych síl buniek exponovaných rôznym benzaldehydovým derivátom. Bunky boli exponované 1 mM koncentráciami zlúčeniny 1 a 2.

Obr. 22. Periférne krvné mononukleárne bunky a Superantigen v médiu ex vivo 10 boli vystavené expozícii buď benzaldehydu, deuterovanému benzaldehydu, zlúčenine 2 alebo zilaskorbu(²H) . Proliferácia periférnych mononukleárnych krvných buniek bola stanovená inkorporáciou tríciovaného tymidínu pri rôznych koncentráciách liečiva.

Obr. 23: NMRI myši boli infikované i.p. podaním vírusom

Friend-erytroleukémie, ktorý napáda slezinu. Infikované a neinfikované myši boli ošetrené i.p. dennou dávkou 5 mg/kg buď

·· • •	···· • · • ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	··
•	• ·	• ·	• ·
··	•	··· ····	··	··

zlúčeniny 2 alebo zlúčeniny 5. Po liečbe trvajúcej 19 dní boli sleziny vybraté a odvážili sa.

Obr. 24 znázorňuje účinok zlúčeniny 1, 2 a 5 na inváziu ľudského kolorektálneho tumoru C170HM2 do pečene.

Obr. 25 znázorňuje prežitie buniek ľudského cervikálneho karcinómu NHIK 3025 stanovené schopnosťou tvoriť kolónie, po ošetrení počas 20 hodín buď zlúčeninou 1 (O) alebo zlúčeninou 13 (·) .

Obr. 26 znázorňuje prežitie buniek ľudského cervikálneho karcinómu NHIK 3025 stanovené schopnosťou tvoriť kolónie, po ošetrení počas 20 hodín buď zlúčeninou 1 (O) alebo zlúčeninou 14 (·).

Obr. 27. Rýchlosť syntézy proteínu v bunkách ľudského cervikálneho karcinómu NHIK 3025, ošetrených zlúčeninou 1 alebo zlúčeninou 21 sa zistila stanovením množstva inkorporovaného [³H]-valinu buď počas obdobia do jednej hodiny od bezprostredného podania testovanej zlúčeniny (tmavé symboly) alebo počas jednej hodiny v čase od 2 hodín neskôr (svetlé symboly).

Obr. 28. Rýchlosť syntézy proteínu v bunkách ľudského cervikálneho karcinómu NHIK 3025, ošetrených zlúčeninou 1 alebo zlúčeninou 22 sa zistila stanovením množstva inkorporovaného [³H]-valínu buď počas obdobia do jednej hodiny od bezprostredného podania testovanej zlúčeniny (tmavé symboly) alebo počas jednej hodiny v čase od 2 hodín neskôr (svetlé symboly).

Na obr. 29 je znázornené prežitie buniek zistené schopnosťou buniek ľudského cervikálneho karcinómu NHIK 3025 tvoriť kolónie po ošetrení počas 20 hodín buď zlúčeninou 1 (·) alebo zlúčeninou 21 (O).

Na obr. 30 je znázornené prežitie buniek zistené schopnosťou buniek ľudského cervikálneho karcinómu NHIK 3025 tvoriť kolónie po ošetrení počas 20 hodín buď zlúčeninou 2 (O) alebo zlúčeninou 22 (▲) .

Na obr. 31 je znázornené prežitie buniek zistené schopnosťou buniek ľudského pľúcneho karcinómu T-47D tvoriť

·· ···· • · · • · ·	• ·· ·· · · • ·	·· • e • ·	··
• · · ·· ·	• · ··· ····	• · • ·	··

kolónie po ošetrení počas 20 hodín buď L-glukózou (·) alebo zlúčeninou 21 (O).

Na obr. 32 je znázornená reaktivita dýchacích ciest u myší 24 hodín po expozícii metacholinom vo forme aerosólu u myší senzibilizovaných ovalbuminom s reakciou vyvolanou soľným roztokom (svetlé stĺpce a horizontálne šrafované stĺpce) alebo ovalbuminom (tmavé stĺpce a vertikálne šrafované stĺpce), ktoré boli ošetrené roztokom s obsahom rozpúšťadla alebo zlúčeniny 2. Výsledky sú vyjadrené aritmetrickým priemerom ± SEM (n=9/skupina).

Na obr. 33 je znázornený počet neutrofilných buniek v bronchio-alveolárnej tekutine získaných 24 hodín po poslednom podaní soľného roztoku (svetlé stĺpce) alebo ovalbumínu (tmavé stĺpce) ovalbuminom senzibilizovaným myšiam na vyvolanie reakcie, kde myši boli ošetrené roztokom s obsahom rozpúšťadla alebo zlúčeniny 2. Výsledky sú vyjadrené aritmetrickým priemerom ± SEM (n=9/skupina).

zlúčenina Č .	chemická štruktúra	názov
1	H |l J OH OH	4,6-O-benzylidén-D-glukopyranóza
2	D	4,6-0-(benzylidén-di) -
	OH OH	-D-glukopyranóza

- 20 •e ····

zlúčenina č.	chemická štruktúra	názov
3	Ph H oi	4,6-O-benzylidén- -D-galaktopyranóza
4	H -Z-Un—-\HO J HO— OMe	metyl-4,6-0-(benzylidén-a-D-manopyranozid
5	D U^J HO— OH	4,6-0-(benzylidén-di) -2- -deoxy-D-glukopyranóza
6	H ] OH OH OMe	41 6-0-(4-karbometoxybenzylidén-Dglukopyranóza

·· ···· • · · • · ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	··
• · ·	• ·	• ·
·· ·	··· ····	··	··

zlúčenina č.	chemická štruktúra	názov
7	H OH	4,6-O-benzylidén- -2-deoxy-D-glukopyranóza
8	0 1* J HO— hnOh CH,	2-acetamido-4,6-0(benzylidén-di) -2-deoxy -D-glukopyranóza
9	H ho— HN OH NO* CH,	2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza
10	o x	4,6-0-(benzylidén-di) - -D-galaktopyranóza

··	····	• ··	··
• · ·	·· · ·	• ·	··
• · ·	• ·	• ·
• · ·	• ·	• ·
··	•	··· ····	··	··

zlúčenina č.	chemická štruktúra	názov
11	J O \O o z 1	4,6-0- (benzylidén-di) - -D-manopyranóza
12	o x J	2-acetamido-4,6-0-benzylidén-2-deoxy-a-D-galaktopyranóza
13	NO,	4,6-0-(3-nitrobenzylidén)- -D-glukopyranóza
14	OH OH	4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza

zlúčenina · č.	chemická štruktúra	názov
15		2-deoxy-4,6-0- -(2-hydroxybenzylidén)- -D-glukopyranóza
OH H |IJ HO-^~\ OH
16	OH H Me'X^O	2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranozid
17	u-A'-O H o/ HO-^V O OH	4, 6-0-(hydroxybenzylidén)- -D-galaktopyranóza
18	Q-fX O z	2-deoxy-4,6-0-(2hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza

	·· ····	• ··	• 9	9
•	• ·	99 · ·	• ·	99
•	• ·	• 9	t e	9
•	9 9	• 9	9 9	9
	99 ·	··· ····	99	• 9

zlúčenina č.	chemická štruktúra	názov
19	UXV*O H O| /A HN ’OH CH,	2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza
20	OH H O J HO— \í^ OH	4,6-0-(2- -hydroxybenzylidén)- -D-manopyranóza
21	n o>__ >>h H H0	4,6-0-benzylidén-L-glukopyranóza
22	H 0.__ A0H ' HO	4,6-0-(benzylidén-di) -L-glukopyranóza

. zlúčenina. č.	chemická štruktúra	názov
23				4,6-0-(2-
	X H3C ^O			acetoxybenzylidén)-
	H		-D-glukopyranóza
	U	O^V HO—1	L-0 OH OH
24	OH	H		4,6-0-(2,3-
	HO I ΪΊ	Ά·ΟΤ? o·^	k^o	-dihydroxybenzylidén)-
		HO—*	OH OH	-D-glukopyranóza
		/·

Príprava

Je známe, že aldehydy reagujú s alkoholmi v kondenzačných reakciách podporovaných prítomnosťou kyseliny za tvorby acetálov. Ako vedľajší produkt sa tvorí voda. Táto reakcia je reverzibilná a v roztoku sa tvorí rovnovážna zmes aldehyd/alkohol a acetál/voda. Stav rovnováhy určuje predovšetkým reaktivita a koncentrácia každej z reakčných zložiek. Aby sa reakcia posunula smerom k jej úplnému priebehu, obvykle sa jeden z produktov reakcie (acetál alebo voda) z reakčnej zmesi odstraňuje.

Podľa vynálezu sa rôzne cukry, deoxycukry a aminocukry nechajú kondenzovať s aldehydmi alebo s ekvivalentami aldehydov za tvorby acetálových derivátov cukru. Predovšetkým výhodná je stratégia reacetilizácie, kde namiesto samotného aldehydu sa použije aldehyd chránený vo forme dimetylacetálu. Ako koprodukt reakcie pritom vzniká metanol. Akonáhle príde k vzniku metanolu, reakčná zmes sa mierne zahreje za zníženého tlaku, aby sa metanol odstránil. Vo väčšine prípadov dochádza k posunu rovnováhy za uvedených reakčných podmienok plynulo v prospech acetálu.

·· ···· • · · • · ·	• ·· ·· · · • ·	··	··
• •	• •
• · ·	• ·	•	•
·· ·	··· ····	··		• ·

Acetalizácia cukrov obvykle vedie k zmesi regio- a stereoizomérov. Tiež môže prísť ku kontrakčným kruhovým transformáciám vedúcim k tvorbe zmesi pyranóz a furanóz a v niektorých prípadoch k tvorbe diacetálových aduktov. Dôsledkom toho je, pokial sa : zložitej reakčnej najmä s použitím prekvapujúco čisté produktov sa spôsobmi NMR.

tvorba velmi spracovaním, sa získali Totožnosť a rôznymi nepoužije stratégia chránenia, zmesi. Avšak ďalej opísaným kvapalinovej chromatografie podiely čistých produktov, uskutočňuje GC-MC spektroskopiou

Špecifické použité reakčné podmienky, rozpúšťadlo a katalyzátor v každom prípade závisia na rozpustnosti a reaktivite reaktantov a vlastnotiach produktu. Ako katalyzátor je možné použiť minerálnu kyselinu, napríklad kyselinu sírovú, organickú kyselinu, napríklad kyselinu para-toluénsulfónovú, kyslú iónomeničovú živicu, napríklad Amberlyst 15, Lewisovu kyselinu vo forme minerálnej hlinky, napríklad Montmorillonit K-10 alebo superkyselinu na nosnej živici, napríklad Nafion NR 50. Reakcia sa môže výhodne uskutočniť v dipolárnom aprotickom rozpúšťadle, ako je dimetylformamid, dimetylacetamid, dimetylsulfoxid, N-metylpyrolidón, dimetoxyetán alebo podobne. Najvýhodnejšie a najčastejšie aplikované reakčné podmienky zahŕňajú uskutočnenie s kyselinou para-toluénsulfónovou v dimetylformamide.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) , v ktorých L znamená deutérium, sa môžu pripraviť spôsobom opísaným vyššie s tým, že sa použije východiskový dimetylacetál aldehydu deuterovaný vo formylovej časti. Príprava deutero-benzaldehydu sa môže uskutočniť modifikovanou redukciou podľa Rosenmunda s použitím plynného D₂ v deuterovanom rozpúšťadle spôsobom opísaným v EP 0 283 139 BI. Deuterované benzaldehydové deriváty, ktoré obsahujú substituenty vo fenylovou kruhu, sa môžu pripraviť podľa príkladov opísaných v EP 0 493 883 Al a v EP 0 552 880 Al.

Možné prípravy zlúčenín podlá vynálezu znázorňujú nižšie uvedené príklady.

·· ···· · ·· ·· • · · ···· · · · • · · · · · · ··· ·· · · · ·· · ··· ···· ·· ···

Príklady uskutočnenia vynálezu

Zlúčenina 1

4.6- 0-benzylidén-D-glukopyranóza

Uvedená zlúčenina známa v odbore sa pripraví spôsobom opísaným pre zlúčeninu 2 s použitím nedeuterovaného benzaldehyd-dimetylacetálu. Totožnosť sa potvrdí ¹H-NMR spektroskopiou v DMSO-d₆.

δ vzhľadom k TMS: 7,58 - 7,29 (5H, m, Ar-H), 6,83 (0,4H, d, 0Hlfi), 6,60 (0,6H, d, ΟΗ-1-α) , 5,61 (1H, s+s, acetál-H), 5,25 (0,4H, d, ΟΗ-3-β), 5,21 (0,4H, d, ΟΗ-2-β), 5,62 (0,6H, d, OH3-a), 5,00 (0,6H, H-l-a) , 4,82 (0,6H, d, ΟΗ-2-α) , 4,49 (0,4H, t, Η-1-β), 4,18 - 4,02 (1H, m, Η-6'-α+β), 3,89 - 3,77 (0,6H, m, Η-5-α), 3,75 - 3,57 (1,6H, m, Η-6'’-α+β a Η-3-α) , 3,45 3,27 (2,5H, m, Η-3-β, Η-4-α+β, Η-5-β a Η-2-α) a 3,11 - 3,00 (0,4H, m, Η-2-β).

Zlúčenina 2

4.6- 0-(benzylidén-di)-D-glukopyranóza

Spôsobom opísaným v EP 0 283 139 BI sa pripraví benzaldehyd-di a prevedie sa na benzaldehyd-dimetylacetál-di. Príprava 4,6-0-(benzylidén-di) -D-glukopyranózy je tiež opísaná v EP 0 283 139 BI, ale z prednostných dôvodov na dosiahnutie vysokej čistoty sa v tomto prípade pripraví nižšie opísaným alternatívnym spôsobom.

V suchom zariadení na destiláciu pripojenom cez chladič pre spätný tok k vákuovej výveve sa zmieša D( + )-glukóza (706 g, 3,92 mol), benzaldehyd-dimetylacetál-di (571 g, 3,73 mol), suchý DMF (1,68 kg) a kyselina para-toluénsulfónová (4,5 g, 24 mmol). Mechanicky miešaná zmes sa ohreje na najviac 69 °C pri tlaku 4 kPa (30 Torr) na oddestilovanie metanolu, a po 2 hodinách sa oddelí 235 g. Potom sa spätný chladič vypne a teplota sa zvýši na asi 73 °C, aby sa oddestiloval DMF. Za

·· • •	···· • · • ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	··
•	• ·	• ·	• ·
··	•	··· ····	··	··

ďalšie 2 hodiny sa oddelí ďalších 1385 g a potom sa destilácia preruší.

Zvyšok sa ochladí na asi 40 ’C a počas 5 minút sa pridá zmes ľad/voda (2,9 1). Potom sa teplota pomaly zníži pod 0 °C, pričom sa vyzráža zrazenina čiastočne vo veľkých zhlukoch. Potom sa zmes prevedie do kadičky a pridá sa ďalších 8 až 9 1 zmesi ľad/voda, aby sa zhluky rozpadli a vznikla suspenzia. Potom sa suspenzia prefiltruje na dvoch odsávacích filtroch a získané dva filtračné koláče sa nechajú cez noc na filtroch za odsávania vodnou vývevou, pričom sa premývajú atmosférou N₂, kde sa dusík privedie cez opačne pripojenú nálevku. Potom sa filtračné koláče rozložia na dve dosky a sušia sa 20 hodín pri 32 °C vo vákuovej sušiarni. Vákuum sa najskôr nastaví na 1300 Pa (13 mbar) a potom sa zvýši na 100 Pa (1 mbar).

Surový produkt sa rekryštalizuje (aby sa odstránili dibenzylidén-acetály) a premýva sa vodou (na odstránenie DMF a glukózy) až do odstránenia uvedených kontaminantov. Surový produkt (500 g) sa potom rozpustí v horúcom dioxane (800 ml) a získaný roztok sa pridá cez skladaný filter do vriaceho chloroformu (9 1) . Potom sa roztok nechá vychladnúť najskôr na teplotu miestnosti a potom sa chladí v ľadovom kúpeli cez noc. Zrazenina sa odfiltruje, suší sa 2 hodiny na filtri (za premývania N₂ ako je opísané vyššie) a ďalej sa suší pri 31 ’C vo vákuu na rotačnej odparke. Produkt (142 g) sa potom suspenduje v zmesi ľad/voda (1 1), prefiltruje sa na filtroch s pomocou odsávania (s premytím 200 ml zmesi ľad/voda) a suší sa cez noc na filtri ako je opísané vyššie. Potom sa produkt rozomelie, preoseje sa (veľkosť ôk 0,5 mm) a suší sa 5 hodín pri 31 °C na rotačnom odparovači. Potom sa produkt ešte jedenkrát suspenduje v zmesi ľad/voda (500 ml), prefiltruje sa (s premytím zmesou 150 ml ľad/voda) a vysuší sa (7 hodín za premývania N₂) . Nakoniec sa rozomelie v trecej miske, preoseje sa (0,5 mm) a vysuší sa vo vákuovej sušiarni.

Produkt vo forme bieleho jemne deleného prášku s vysokou čistotou sa analyzuje metódou HPLC. Výťažok je 95 %, 10 % teoretického výťažku. Pomer anomérov a k β zistený NMR v DMSOd₆ je asi 7 : 3.

·· ···· • · · • · ·	• ·· ·· · · • e	·· • · • ·	··
• · ·	• ·	• ·
·· ·	··· ····	··	··

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-dg) , δ vzhľadom k TMS: 7,55 - 7,28 (5,00H, m, Ar-H) , 6, 85 (0,27H,

5,24 (0,27H, d, ΟΗ-3-β), d, ΟΗ-3-α), 4,99 (0,72H, (0,29H, t, H-l-B), 4,20 d, OH-lfi), 6,58 (0,71H, d, ΟΗ-1-α),

5,19 (0,28H, d, ΟΗ-2-β), 5,61 (0,71H, Η-1-α), 4,82 (0,71H, d, ΟΗ-2-α), 4,48

- 4,04 (l,04H, m, Η-6'-α+β), 3,88

3,73 (0,78H, m, Η-5-α) , 3,73 - 3,56 (1,72H, m, Η-6”-α+β a H

3-a), 3,46 - 3,21 (2,61H, m, Η-3-b, Η-4-α+β, Η-5-β a Η-2-α) a

3,09 - 2,99 (0,28H, m, Η-2-β); 137,881, 128,854, 128,042,

126,435 (Ar-C), 100,462 (acetál-C), 97,642 (C-1-α), 93,211 (C1-a), 81,729 (C-4-α), 80,897 (C-4-β), 75,796 (C-2-β), 72,906 (C-2-α a C-3-β), 69,701 (C-3-α), 68,431 (C-6-α), 68,055 (C-6β), 65,810 (C-5-β) a 62,032 (C-5-α).

Zlúčenina 3

4,6-O-benzylidén-D-galaktopyranóza

V destilačnom zariadení sa miešaním pri 50 °C zmieša D( + )-galaktóza (15,0 g, 0,083 mmol) so suchým DMF (80 ml). K vzniknutej suspenzii sa pridá benzaldehyd-dimetylacetál (12,2 g, 0,083 mol) a kyselina para-toluénsulfónová (0,14 g) a potom sa s použitím vodnej vývevy pomaly oddestiluje metanol/DMF. Za 3 hodiny po zreagovaní väčšiny galaktózy, sa odstráni zvyšný DMF na rotačnej odparke pripojenej k výveve. Zvyšok vo forme viskózneho sirupu sa prečistí na kolóne Lobar C RP-8 s použitím zmesi metanol/voda 1 : 1 ako elučného prostriedku. Potom sa produkt vysuší lyofilizáciou.

GC TMS-derivátov preukazuje, že produkt tvoria predovšetkým dva izoméry. Identifikácia pomocou ^XH-, ¹³C-, COSY-, DEPT- a C-H korelačných NMR spektier preukazuje, že ide o a a β anoméry zlúčeniny uvedenej v nadpise.

^XH- a ¹³C-NMR (D₂O), δ vzhľadom k TMS: 7,49 - 7,27 (5H, m, ΑΓΗ), 5,57 (1H, s, acetál-H, 5,22 (0,5H, d, Η-1-α), 4,56 (0,5H, d, Η-1-β), 4,23 + 4,18 (0,5H+0,5H, d+d, Η-4-α+β), 4,14 - 3,98 (2H, m, Η-6-α+β), 3,94 - 3,79 (1,5H, m, Η-2-α, Η-3-α a Η-5-α), 3,69 - 3,49 (1,5H, m, Η-2-β, Η-3-β a Η-5-β); 137,422, 129,981, 128,902, 126,639 a 126,590 (Ar-C), 101,325 (acetál-C), 96,540 (Cl-β), 93,161 (C-1-α), 76,581 (C-4-α), 76,093 (C-4-β), 71,889 + 71,802 (C-2-fi+C-3-fi) , 69,404 (C-6-α), 69,182 (C-6-β), 68,566 + 68,057 (C-2-a+C-3-B), 66,759 (C-5-β) a 62,886 (C-5-α).

·· • •	···· • · • ·	• ·· ·· · · • t	·· • · • ·	··
•	• ·	• ·	t ·
··	•	··· ····	··	··

Zlúčenina 4

Metyl-4,6-O-benzylidén-a-D-manopyranozid

V destilačnom zariadení sa miešaním zmieša pri 50 až 55 °C metyl-a-D-manopyranozid (18,1 g, 0,093 mol), benzaldehyd-dimetylacetál (21,0 g, 0,138 mol) a suchý DMF (90 ml). Potom sa pridá kyselina para-toluénsulfónová (asi 0,1 g) a za 10 minút sa potom pripojí vodná výveva na oddestilovanie metanolu. Za štyri hodiny sa reakčná zmes odparí na tuhý biely zvyšok. Tento zvyšok sa premyje dibutyléterom, prefiltruje sa a filtračný koláč sa rozpustí v acetonitrile. Vzniknutá zrazenina a zmes sa nechá v chladničke 5 dní. Potom sa zrazenina odfiltruje a filtrát sa odparí. Zvyšok sa prečistí na stĺpci Lobar C RP-8 s použitím zmesi 30 % acetonitrilu vo vode. Frakcie zo štyroch samostatných pokusov sa podrobia lyofilizácii a spoja sa.

GC analýza TMS derivátov preukazuje, že produkt tvoria z 95 % (plochy píkov) monoacetály. Uvedené monoacetály tvoria 4 piky s integrovanou plochou píkov 0,4, 3,2, 94,1 a 2,4 %.

Spôsoby, ktoré zahŕňajú ¹H-, ¹³C-, COSY-, DEPT- a C-H korelačnú NMR spektrometriu a GC/MC spektroskopiu potvrdzujú, že prevažujúce identifikované druhy zlúčenín zodpovedajú zlúčenine uvedenej v nadpise.

^XH- a ¹³C-NMR (acetón-d₆), δ vzhľadom k TMS: 7,54 - 7,30 (5H, m, Ar-H), 5,60 (1H, s, acetál-H), 4,71 (1H, s, H-1), 4,34 (1H, široký s, OH), 4,22 - 4,02 (2H, m+široký s, H-6’+OH), 3,94 3,82 (3H, m, H-2, H-3 a H-4), 3,80 - 3, 60 (2H, m, H-5+H-6) a 3,39 (3H, s, CH₃); 139,264, 129,396, 128,662 a 127,211 (Ar-C), 102,825 (C-l), 102,468 (acetál-C), 79,888 (C-4), 72,090 (C-3), 69, 308 (C-6), 69,127 (C-2), 64,363 (C-5) a 54,921 (CH₃) .

Zlúčenina 5

4,6-0-(benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranóza

Spôsobom opísaným v EP 0 283 139 BI sa pripraví benzaldehyd-di a prevedie sa na benzaldehyd-dimetylacetál-di.

2-deoxy-D-glukóza (10 g, 60,9 mmol), suchý DMF (35 ml), benzaldehyd-dimetylacetál-di (11,7 g, 76,4 mol) a kyselina para-toluénsulfónová (70 mg, 0,37 mmol) sa zmieša v atmosfére

·· ····
• · ·	··
• · ·
• · · ·
• · ·
·· ·	··

·· ·· ·
• · 4 ·	··
• · ·	•
• · · ·	•
• · ·	•
• ···· ··	···

N₂ na bielu kašu. Zahriatím na 45 až 50 °C sa počas 1/2 hodiny získa bezfarebný roztok. Potom sa cez chladiacu kolónu (na zabránenie strát benzaldehyd-dimetylacetálu-di) pripojí vákuová výveva na odstránenie metanolu. Tlak sa reguluje postupne od 7000 Pa (70 mbar) na 2000 až 3000 Pa (20 až 30 mbar) počas 4,5 hodiny, pričom teplota sa udržiava na 40 až 45 °C. Potom sa destilácia preruší, zariadenie sa upraví na destiláciu s krátkou cestou pár a DMF sa odstráni pri maximálnom vákuu pri 55 °C. Získa sa zvyšok vo forme svetlo žltého sirupu.

1/4 získaného sirupu sa rozpustí v slabo alkalickom (NaHCO₃) roztoku metanol/voda 60/40 a prečistí sa na kolóne s reverznou fázou Merck LiChroprep RP-8 s použitím zmesi metanol/voda 60/40 ako elučného prostriedku. Frakcie, ktoré obsahujú produkt, sa zahustia, aby sa odstránil metanol a vymrazením sa získa biela, vločkovitá tuhá hmota. Produkty zo štyroch samostatných pokusov sa spoja a získa sa 3,5 g produktu, čo je 23 % teoretického výťažku.

GC analýza TMS derivátov a NMR spektroskopia preukazuje, že produkt obsahuje zmes a a β anomérov v pomere 1:1.

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-de), δ vzhľadom k TMS: 7,52 - 7,28 (m, 5H,

Ar-H I+II), 6,9 - 6,65 (široký s, 1/2H, OH-1 II), 6,55 - 6,32 (široký s, 1/2H, OH-1 I), 5,25 - 5,12 (m, 1H, OH-3 II a H-1 I), 5,12 - 5,0 (d, 1/2H, OH-3 II), 4,84 - 4,73 (dd, 1/2H, H, H-1 II), 4,20 - 4,02 (m, 1H, H-6 I+II), 3,98 - 3,73 (m, 1H, H3 I a H-5 I), 3,73 - 3,58 (m, 1,5H, H-6' I+II, a H-3 II), 3,42 - 3,18 (2,5H, H-4 I+II a H-5 II a H₂O), 2,10 - 1,86 (m, 1H, H-2 I+II) a 1, 62 - 1, 34 (m, 1H, H-2' I+II); 137,979, 137,926,

128,841, 128,036 a 126,432 (Ar-C I+II), 101,5 - 100,0 (acetálC I+II), 94,057 a 91,424 (C-l I+II), 83,916 a 83,093 (C-4,

I+II), 68,374 a 68,119 (C-6, I+II), 66,889, 66,092, 64,174 a

62,604 (C-3 I+II a C-5 I+II) a 41,932 a 40,051 (C-2 I+II).

Zlúčenina 6

4,6-0-(4-karboxymetoxybenzylidén)-D-glukopyranóza

V trojhrdlovej banke s objemom 500 ml sa zmieša metyl-4formylbenzoát (100 g, 0,609 mol), metanol (91,5 g, 2,86 mol), trimetylortoformiát (71 g, 0,68 mol) a koncentrovaná kyselina ·· ···· • · · • · · • · · ·· · chlorovodíková (165 μΐ) . Získaná kaša počas niekoľkých minút prejde na mierne žltý roztok a teplota sa spontánne zvýši z 15 °C na 30 °C. Reakčná zmes sa mieša 15 minút, potom sa zahrieva za spätného toku pri 58 °C ďalších 25 minút a potom sa ochladí na 10 °C (ľad/voda) . K reakčnej zmesi sa potom pridá 7 ml alkalického roztoku pripraveného rozpustením KOH (8,3 g) v metanole (53 ml). Po 25 minútach miešania pri teplote 10 °C sa zariadenie prestaví na destiláciu s krátkou cestou pár a prchavé zložky sa odstránia vo vákuu (vodná výveva). Potom destilácia pokračuje s pripojenou vákuovou vývevou pri 112 až 114 °C/50 Pa (0,5 mbar) a získa sa bezfarebný olej. Olej prejde na bezfarebnú tuhú hmotu s teplotou topenia 32 až 33 °C, ktorou je stanovením totožnosti NMR spektroskopiou 4formylbenzoát-dimetylacetál. Získa sa 108,75 g produktu, čo je 85 % teoretického výťažku.

Pri 50 °C sa v atmosfére N₂ zmieša D( + )-glukóza (8,0 g,

44,4 mmol), suchý dimetylacetál (10,4 toluénsulfónová za

DMF (25 ml), metyl-4-formylbenzoátg, 49,5 mmol) a kyselina paravzniku bielej suspenzie. Potom sa zariadenie spojí s vákuovou vývevou cez zvislý chladič a začne sa odparovanie metanolu za počiatočných podmienok 8000 až 10000 Pa (80 až 100 mbar), 55 °C. Potom sa tlak postupne zníži na 4000 Pa (40 mbar) a teplota sa udržiava na 55 až 60 °C. Reakčná zmes sa postupne vyjasňuje a nakoniec je priehľadná. Za 8 hodín sa destilácia preruší a zariadenie sa prestaví na destiláciu s krátkou cestou pár na odstránenie DMF. Zvyšok je vo forme slabo nažltlého sirupu.

Získaný sirup sa rozpustí v horúcom roztoku 100 mg NaHCO3 v 20 ml metanolu a 8 ml vody a vyvolá sa zrážanie prídavkom 100 ml etylacetátu. Zrazenina sa potom oddelí od materského roztoku filtráciou, premyje sa chladnou vodou (4 x 15 až 20 ml) a prevedie sa do banky rotačného odparovača. Vlhkosť sa odstráni prídavkom etylacetátu a dvojitým odparovaním. Nakoniec sa produkt vysuší vo vysokom vákuu. Z materského roztoku sa odfiltruje ďalší podiel zrazeniny, premyje sa a po vysušení sa tak získa druhý podiel produktu. Obidva podiely sa spoja a získa sa tak 1,94 g čistého produktu, čo zodpovedá výťažku 13 % teórie.

·· • •	···· • · • ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	··
•	• ·	• ·	• ·
··	•	··· ····	··	··

GC analýza TMS derivátov preukazuje obsah dvoch izomérov v pomere 2:1.

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-dg), δ (ppm) vzhladom k TMS: 7,99 - 7,61 (dd, 2+2H, furfuryl-H), 6,87 (d, 0,67H, OH-1 II), 6,59 (d, 0,28H, OH-1 I), 5,68 (s+s, 1, acetál-H I+II), 5,29 (d, 0,68H, OH-3 II), 5,21 (d, 0,67H, OH-2 II), 5,16 (d, 0,31H, OH-3 I), 5,00 (t, 0,30H, H-1 I), 4,85 (d, 0,28H, OH-2 I), 4,48 (t,

0,73H, H-1 II), 4,25 - 4,08 (m, 1,14H, H-6) , 3,95 - 3,77 (m, 3,43H, OCH3 a H-5 I), 3,78 - 3,59 (m, l,40H, H-3 I a H-6'), 3,49 - 3,23 (m, 3,59H, H-4 I a II, H-5 II, H-2 I a H-3 II), 3,10 - 2,98 (m, 0,72H, H-2 II); 165, 978, 142,553, 142,553,

129,959, 129,067, 126,763, 99,982, 99,812, 97,661, 93,238,

81,794, 81,794, 80,963, 75,808, 72,902, 69,658, 68,487,

68,110, 65,714, 61,952 a 52,253.

Zlúčenina 7

4,6-0-benzylidén-2-deoxy-D-glukopyranóza

V atmosfére N2 sa zmieša 12-deoxy-D-glukóza (10,0 g, 60,9 mmol), suchý DMF (34 ml), benzaldehyd-dimetylacetál (11,6 g, 76,2 mmol) a kyselina para-toluénsulfónová (70 mg, 0,37 mmol) na bielu kašu. Potom sa reakčná zmes mieša 30 minút pri teplote miestnosti a následným zahriatím na 45 až 50 °C sa tuhé zložky postupne rozpustia. Potom sa cez chladenú kolónu (na zabránenie strát benzaldehyd-dimetylacetálu) pripojí vákuová výveva na odstránenie metanolu a reakcia sa nechá prebiehať 4,5 hodiny. Potom sa destilácia preruší, kolóna sa odstráni a pokračuje sa v destilácii s krátkou cestou pár pri 50 až 55 °C na odstránenie DMF. Zvyšok je vo forme slabo nažltlého sirupu.

Sirup sa rozpustí v slabo alkalickom (NaHCOa) roztoku metanol/voda 60/40 a prečistí sa na kolóne s reverznou fázou Merck LiChroprep RP-8 s použitím zmesi metanol/voda 60/40 ako elučného prostriedku. Frakcie s obsahom produktu sa zahustia, aby sa odstránil metanol a vymrazením sa získa biela, vločkovitá tuhá hmota. Produkty zo štyroch samostatných pokusov sa spoja a získa sa 3,18 g produktu, čo je 21 % teoretického výťažku.

·· ···♦ • · · · • · · ·· ·· • · · · · • · ·

GC analýza TMS derivátov a NMR spektroskopia preukazuje, že produkt obsahuje zmes a a β anomérov v pomere 1:1.

^XH-NMR (DMSO-de), δ (ppm) vzhľadom k TMS: 7,52 - 7,30 (m, 5H, Ar-H I+II), 6,85 - 6,68 (široký s, 1/2H, OH-1 II), 6,50 - 6,35 (široký s, 1/2H, OH-1 I), 5,61 (s+s, 1H, acetál-H I+II), 5,23 - 5,12 (m, 1H, OH-3 II a H-1 I), 5,12 - 5,02 (d, 1/2H, OH-3 II), 4,84 - 4,74 (dd, 1/2H, H-1 II), 4,20 - 4,04 (m, 1H, H-6 I+II), 3, 98 - 3,74 (m, 1H, H-3 I a H-5 I), 3,74 - 3,57 (m, 1,5H, H-6' I+II a H-3 II), 3,42 - 3,18 (2,5H, H-4 I+II a H-5 II a H₂O), 2,08 - 1,88 (m, 1H, H-2 I+II) a 1,62 - 1,32 (m, 1H, H+2' I+II).

Zlúčenina 8

2-acetamido-4,6-O-benzylidén-di~2-deoxy-D-glukopyranóza

Spôsobom opísaným v EP 0 283 139 BI sa pripraví benzaldehyd-di a prevedie sa na benzaldehyd-dimetylacetál-di.

Benzaldehyd-dimetylacetál-di (8,7 g, 56,8 mmol), N-acetylD-glukozamín (10,0 g, 45,2 mmol), suchý DMF (30 ml) a kyselina para-toluénsulfónová (88 mg, 0,46 mmol) sa zmieša v atmosfére N₂ za vzniku bielej suspenzie. Zmes sa mieša 45 minút pri 50 °C a potom sa spojí s vákuovou vývevou cez zvislý chladič a reakcia sa nechá prebiehať 2 hodiny pri 55 °C/6000 až 7000 Pa (60 až 70 bar). Potom sa zariadenie upraví na destiláciu s krátkou cestou pár a pokračuje sa v destilácii pri maximálnom vákuu pri 55 °C počas ďalšej hodiny. Získa sa zvyšok vo forme žltobielej tuhej hmoty.

Zvyšok sa zalkalizuje prídavkom roztoku pripraveného zmiešaním NaHCO₃ (150 mg) s 30 ml roztoku metanol/voda 60/40. Vzniknutá krémová kaša sa prefiltruje, premyje sa 2 až 3-krát 1 % roztokom NaHCO₃ a niekoľkokrát éterom. Analýzou (GC) sa potvrdí dostatočná čistota produktu a produkt sa vysuší vo vákuu. Získa sa 8,8 g produktu, čo zodpovedá 63 % teoretického výťažku.

GC analýza TMS derivátov indikuje, že produkt obsahuje zmes izomérov 1:1. NMR spektroskopia v DMSO-de preukazuje, že produkt tvorí zmes anomérov v pomere 3:1.

• e • •	···· • · • ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	•
• ··	• · •	• · ··· ····	• · ··	•

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-de), δ vzhľadom k TMS: 7,83 (s+s, 1H, NH), 7,51 - 7,28 (m, 6H, Ar-H), 7,0 - 6,2 (široký s, 1H, OH-1), 5,65 - 5, 05 (široký s, 1H, OH-3), 4,99 (d, 1H, H-1 I), 4,61 (d, 0,3H, H-1 II), 4,21 - 4,03, 3,92 - 3,67 a 3,51 - 3,22 (m, 6H, H-2, H-4, H-5 a H-6) a 1,85 (s+s, 3H, CH3); 169,452 (C=O), 137,818, 128,869, 128,035 a 126,438 (Ar-C), 100,505 (acetálC), 96,056, 91,500, 82,471, 81,505, 70,549, 68,300, 67,961,

67,218, 65,906, 62,123, 58,038, 54,790 (cukrová zložka-C) a

23,123 a 22,674 (CH3).

Zlúčenina 9

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza

V trojhrdlovej banke s objemom 500 ml sa zmieša 3nitrobenzaldehyd (100 g, 0,66 mol), metanol (99 g, 3,1 mol), trimetylortoformiát (77,3 g, 0,73 mol) a koncentrovaná kyselina chlorovodíková (165 μΐ) za získania žltej kaše, z ktorej počas 5 minút vznikne roztok. Reakčná zmes sa potom zahrieva pod spätným chladičom pri približne 50 °C 15 minút a potom sa ochladí zmesou lad/voda na 10 °C. Potom sa reakčná zmes zaleje 6,6 ml roztoku pripraveného rozpustením KOH (2,5 g) v metanole (16 ml). V miešaní sa pokračuje ďalších 15 minút a potom sa zariadenie upraví na destiláciu s krátkou cestou pár. Prchavé látky (CH3OH+HCOOCH3) sa odstránia vodnou vývevou, potom sa destilácia preruší a pripojí sa vákuová výveva. Potom sa v destilácii pokračuje a oddestiluje sa žltý olej pri 93 až 97,5 °C/2000 Pa (20 mbar). Identifikáciou oleja pomocou NMR sa preukáže, že ide o 3-nitrobenzaldehyd-dimetylacetál s vysokou čistotou. Získa sa 127 g produktu, čo zodpovedá 97,6 % teoretického výťažku.

Miešaním pri 50 °C sa zmieša 3-nitrobenzaldehyddimetylacetál (5,5 g, 0,028 mol), N-acetyl-D-glukozamín (5,0 g, 0,023 mol), kyselina para-toluénsulfónová (50 mg, 0,263 mmol) a suchý DMF (15 ml) za vzniku ľahko žlto zafarbenej suspenzie. Za 1/2 hodiny sa pripojí vákuová výveva a reakcia sa nechá prebiehať 11 hodín pri 56 “C/5000 Pa (50 mbar). Potom sa reakčná zmes odparí a zvyšok sa rozdelí medzi malý objem slabo alkalickej (NaHCCh) vody a chloroformu. Vodná fáza (tvoriaca hrudkovitú suspenziu) sa dvakrát reextrahuje

·· • •	···· • · • ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	··
•	• ·	• ·	• ·
··	•	··· ····	··	··

chloroformom a prefiltruje sa, premyje sa niekolkokrát vodou a éterom. Vysušením vo vákuu sa získa vo forme slabo nahnednutého prášku požadovaný produkt. Získa sa 570 mg produktu, čo zodpovedá 7 % teoretického výťažku.

GC analýza TMS derivátov preukazuje, že produkt obsahuje dva izoméry v pomere 2 : 1. NMR spektroskopia v DMSO-dg preukazuje, že produkt tvorí zmes a a β anomérov.

^ΧΗ- a ¹³C-NMR (DMSO-de) δ vzhladom k TMS: 8,4 - 8,1 (m, 2H, ArH), 8,05 - 7,79 (m, 2H, Ar-H), 7,79 - 7,60 (t, 1H, NH) , 6,80 (d, 1H, OH-1), 5,81 (s+s, 1H, acetál-H) , 5,30 a 5,18 (s+s, 1/2H + 1/2H, H-1), 4,30 - 4,10, 3,93 - 3,3 (m, 6H, H-2 - H-6) a 1,85 (d, 3H, CH-3); 169,331 (C=O), 147,490, 139,544,

133,018, 129,862, 123,732, 120,884 (Ar-C), 99,000, 98,806 (acetál-C), 95,924, 91,406, 82,433, 81,454, 70,320, 68,240, 67,907, 67,020, 65,574, 61,833, 57,875, 54,609 (cukrová zložka-C), 23,014 a 22,557 (CH3).

Zlúčenina 10

4,6-0-(benzylidén-di)-D-galaktopyranóza

Benzaldehyd-di sa pripraví a prevedie sa na benzaldehyddimetylacetál-di spôsobom opísaným v EP 0 283 139 BI.

V destilačnom zariadení sa pri 45 °C mieša D(+)-galaktóza (15,0 mg, 0,0833 mol) so suchým DMF (80 ml). Potom sa pridá benzaldehyd-dimetylacetál-di (12,8 g, 0,0836 mol) a kyselina para-toluénsulfónová (0,14 g) a metanol a DMF sa pomaly oddestiluje vo vákuu (vodná výveva). Za 3 hodiny sa pripojí vákuová výveva a oddestiluje sa zvyšný DMF. Zvyšok sa rozpusti v zmesi metanol/voda (1 : 1) s obsahom NaHCCh (11 mg/ml) a prečistí sa na kolóne Lobar C RP-8 s použitím zmesi metanol : voda (1 : 1) ako elučného prostriedku. Frakcie, ktoré obsahujú produkt zo 7 samostatných pokusov sa vysušia vymrazením a ich spojením sa získa biely vločkovitý produkt. Získa sa 6,62 g produktu, čo zodpovedá 30 % teoretickému výťažku.

Pomocou GC a NMR analýz sa môže preukázať, že produkt obsahuje zmes anomérov v pomere 1:1.

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-de), δ vzhladom k TMS: 7,52 - 7,30 (m, 5H,

Ar-H), 6,62 (0,5H, d, OH-1B), 6,32 (0,5H, d, ΟΗ-1-α) , 5,05 ·· ···· · ·· ·· • · · ······ • · · · · · · • · · · · · · ·· · ··· ···· ·· (0,5H, t, Η-1-α), 4,85 + 4,69 + 4,49 (1Η+0,5Η+0,5Η, m+d+d, OH2+OH-3), 4,35 (0,5H, t, Η-1-β) , 4,12 - 3,92 + 3,81 - 3,71 +

3,69 - 3,59 + 3,49 - 3,39 + 3,39 - 3,28 (3H+1H+0,5H+1H+2H, m+m+m+m+m, H-2-H-6-H2O); 138,753, 138,690, 128,607, 128,319,

127,913 a 126,3 (Ar-C), 99,345 (acetál-C), 97,307 a 93,178 (ΟΙ), 76,738 a 76,158 (C-4), 72,101, 72,605, 68,947, 68,862,

68,486 a 67,730 (C-2, C-3 a C-6) a 65,829 a 62,068 (C-5).

Zlúčenina 11

4,6-0-(benzylidén-di)-D-manopyranóza

Benzaldehyd-di sa pripraví a prevedie sa na benzaldehyddimetylacetál-di spôsobom opísaným v EP 0 283 139 BI.

V destilačnom zariadení sa pri 40 °C zmieša D(+)-manóza (15,0 mg, 0,0833 mol) so suchým DMF (70 ml). Potom sa pridá benzaldehyd-dimetylacetál-di a kyselina para-toluénsulfónová (0,14 g) za vzniku číreho roztoku. Potom sa pripojí vákuová výveva a pomaly sa oddestiluje metanol a DMF pri tlaku 7000 až 2000 Pa (70 až 20 mbar) a teplote 45 až 50 °C. Za tri hodiny sa oddestiluje zvyšný DMF za najvyššieho vákua a získa sa tak mierne nažltlý sirup.

Zvyšok sa opakovane premyje éterom, aby sa odstránili lipofilné zložky. Podiely, ktoré tvoria surový produkt, sa rozpustia v mierne alkalickej (NaHCO3) zmesi metanolu/vody (3 : 2) a prečistia sa na kolóne Lobar C RP-8 s použitím zmesi metanol/voda (3 : 2) ako elučného prostriedku. Metódou GC TMS derivátov sa môže preukázať, že produkt obsahuje 4 izoméry v pomere 10 : 3 : 1 : 4. Opätovnou elúciou zmesou metanol/voda (1 : 4) sa získa biely vločkovitý produkt, ktorý obsahuje na základe výsledkov GC analýzy len dva izoméry v pomere 70/30. Získa sa 1,42 g produktu, čo zodpovedá 6,4 % teoretického výťažku.

Na základe analýzy ¹H-, ¹³C-, COSY-, DEPT- a C-H korelačnej NMR analýzy je možné potvrdiť chemickú štruktúru a rovnováhu a a β anomérov v pomere 1:8.

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-de) prevládajúceho izoméru, δ vzhľadom k

TMS: 7,5 - 7,28 (m, 5H, Ar-H) , 6,56 (d, 1H, OH-1), 5,0 - 4,85 (m, 3H, H-1, OH-2 a OH-3) , 4,10 - 4,02 (m, 1H, H-6) , 3,63 38 ·· ···· · ·· ·· · • · · ········ ··· · · · · · • · · · · ····· ··· ·· ··· ·· · ··· ···· ·· ···

3,40 (m, 5H, H-2, H-3, H-4, H-5 a H-6’); 138,045, 128,825,

128,029, 126,438 (Ar-C), 100,802 (acetál-C), 95,233 (C-l),

78,987 (C-4), 72,032 (C-3), 68,317 (C-6), 67,252 (C-2), 63,495 (C-5).

Zlúčenina 12

2-acetamido-4,6-0-benzylidén-2-deoxy-a-D-galaktopyranóza

K miešanej suspenzii N-acetyl-D-galaktozamínu (1,50 g, 6,77 mmol) v acetonitrile (37 ml) sa pridá benzaldehyddimetylacetál (2,0 ml, 14 mmol) a potom kyselina paratoluénsulfónová (15 mg) . Potom sa reakčná zmes ponorí do horúceho olejového kúpeľa (60 ^eC) a mieša sa 3 hodiny v atmosfére dusíka, za tvorby hustej bielej zrazeniny. Potom sa reakčná zmes prefiltruje a tuhé zložky sa premyjú chladným dichlórmetánom (asi 2 ml) s následným odsávaním v atmosfére dusíka. Získaný biely prášok sa potom vnesie do vopred odváženej sklenenej fľaštičky a nechá sa 72 hodín vo vákuu (6 Pa (0,06 mbar)) za získania požadovaného produktu, ktorý obsahuje len a-izomér (1,74 g, 83 %).

¹H-NMR Ôh (300 MHz, d6-DMSO) 1,83 (3H, s, CH3) , 3,80 - 4,17 (6H, m, H-2, H-3, H-4, H-5 a H-6), 4,65 (1H, d, OH-3), 5,06 (1H, t, H-1), 5,59 (1H, s, ArCH), 6,52 (1H, d, OH-1), 7,33 - 7,55 (5H, m, ArH) a 7,69 (1H, d, NH) ; ¹³C-NMR δ0{^χΗ} (75 MHz, D₆-DMSO) 23 (CH₃), 50, 62, 65, 69 a 76 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-6), 91 (C-l), 100 (ArCH), 126, 128, 128 a 129 (aróm.C) a 170 (C=O).

Zlúčenina 13

4,6-0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza

3-nitrobenzaldehyd-dimetylacetál sa pripraví spôsobom opísaným pre zlúčeninu 9.

3-nitrobenzaldehyd-dimetylacetál (21,9 g, 0,11 mol), D(+)-glukóza (16,0 g, 0,09 mol), kyselina para-toluénsulfónová (100 mg, 0,5 mmol) a suchý DMF sa zmiešajú v atmosfére N₂ a miešajú sa 25 minút pri 58 °C. Potom sa pripojí vákuová výveva a cez pripojenú chladenú kolónu sa za 4 hodiny 15 minút pri 55 až 60 °C, 3000 až 4000 Pa (30 až 40 mbar) pomaly oddestiluje metanol a DMF. Potom sa zariadenie prestaví na destiláciu s krátkou cestou pár na odstránenie väčšiny DMF a v destilácii

··	····	• ··	··
•	• ·	·· · ·	•	•	··
•	• ·	• ·	• ·
•	• ·	• ·	•	•
··	•	··· ····	··	··

sa pokračuje 1,5 hodiny. Zvyšok je vo forme slabo žlto zafarbeného sirupu.

Sirup sa potom rozpustí v slabo alkalickej (NaHCOa) zmesi metanol/voda 60 : 40 a prečistí sa na kolóne Lobar C RP-8 s použitím metanolu/vody 60 : 40. Frakcie, ktoré obsahujú produkt, sa odparia (na odstránenie metanolu), vymrazia sa a spojením sa získa 5 g vločkovitého bieleho tuhého produktu.

Získaný produkt sa potom znovu prečistí s použitím metanolu/vody 60 : 40 a získa sa tak produkt s dostatočnou čistotou. Získa sa 3,3 g, t. j. 12 % teoretického výťažku. GC analýzou je možné potvrdiť, že produkt obsahuje dva izoméry v pomere 70 : 30.

¹H-NMR (DMSO-de), δ vzhľadom k TMS: 8,33 - 7,63 (5H, m, Ar-H), 6,89 + 6, 60 (1H, d+d, OH.l-I+II), 5,78 (1H, s+s, acetál-HI+II), 5,34 (0,65H, d, OH-3-II), 5,75 + 5,71 (1,12H, d+d, OH2-II + OH-3-I), 4,99 (0,56H, m, H-l-I) , 4,88 (0,32H, OH-2-I) , 4,49 (0,74H, m, H-l-II)., 4,28 - 4,12 (1H, m, H-6'-I+II), 3,85 - 3,53 (2,27H, m, H-3-I, H-5-I a H-6''-I+II), 3,49 - 3,32 (2,58H, m, H-2-I, H-3-II, H-4-I+II a H-5-II) a 3,12 - 2,98 (0,85H, m, H-2-II) .

Zlúčenina 14

4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza

2-hydroxybenzaldehyd (16,0 g, 0,13 mol), D-glukóza (23,6 g, 0,13 mol) a kyselina para-toluénsulfónová (katalytické množstvo) sa zmieša v DMF (100 ml) . Zmes sa zahrieva pri asi 60 °C 0,5 hodiny na získanie roztoku. Priebeh reakcie sa sleduje TLC analýzou (silikagél, etylacetát). Po 20 hodinách pri 20 °C sa zmes dvakrát zahreje na 60 °C na 1 hodinu a potom sa odparením pri 60 °C za zníženého tlaku odstráni väčšina DMF. Potom sa pridá etylacetát (asi 100 ml) , pričom vznikne zrazenina. Potom sa roztok oddelí dekantáciou, uskutoční sa analýza metódou TLC a odparením za zníženého tlaku sa získa olej. Olej sa rozpusti v etylacetáte, pridá sa silikagél (120 g, 200 až 500 pm) a rozpúšťadlo sa odparí. Asi polovica produktu sa spracuje chromatografiou na silikagéli (550 ml, 30 až 60 pm) s použitím etylacetátu ako elučného prostriedku. Zhromaždia sa frakcie po 100 ml a frakcie 15 až 25 sa odparia

	····	• ··	··
•	• ·	·· · ·	• ·	··
•	• ·	• ·	•	•
•	• ·	• ·	•	•
	·· ·	··· ····	··	··

za zníženého tlaku a získa sa tak olej (3,4 g) znečistený významným množstvom DMF. Produkt, len mierne rozpustný v chloroforme, sa vyzráža prídavkom asi 20 ml uvedeného rozpúšťadla. Premytím chloroformom a vysušením sa získa tuhá hmota (1,86 g). Zvyšok produktu sa spracuje a vyzráža sa vyššie uvedeným spôsobom a získa sa 2,43 g a ďalších 1,6 g sa získa z materských lúhov po zrážaní. Celkom sa získa 5,58 g produktu, t.j. 16 % teoretického výťažku.

Z výsledkov NMR a TLC analýzy vyplýva, že produkt je znečistený niekoľkými percentami 2-hydroxybenzaldehydu a glukózy. Chromatografiou opísanou vyššie sa získa produkt v podstate bez nečistôt. Z výsledkov NMR vyplýva, že produkt obsahuje zmes a a β anomérov. Pri stanovení v DMSO-de je pomer anomérov α/β najskôr rovný 2 : 1, ale mení sa s časom. Tiež GC spektroskopia silylovaných derivátov vykazuje dva piky v pomere 2:1.

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-de), δ vzhľadom k TMS: 9,50 (s, 1H, Ar-OH), 7,30 (m, 1H, Ar-H-6), 7,09 (m, 1H, Ar-H-4), 6,80 - 6, 68 (m, 2,34H, Ar-H-3 + Ar-H-5 + ΟΗ-1-β), 6,48 (d, 0,67H, OH-1-a), 5,71 (s, acetál-Η-α+β), 5,10 (t, 0,65H, ΟΗ-2-β + ΟΗ-3-β), 4,97 (d, 0,63H, ΟΗ-3-α), 4,90 (t, 0,66H, Η-1-α), 4,71 (d, 0,65H,

ΟΗ-2-α), 4,39 (t, 0,39H, Η-1-β), 4,10 - 3,93 (m, 1,13H, H-6'α+β), 3,80 - 3,67 (m, 0,71H, Η-5-α), 3,60 - 3,45 (m, 1,73H, H3-a a Η-6-α+β), 3,35 - 3,14 (m, 3,31H, Η-4-α+β, Η-2-α, H-3 β, Η-5-β a H₂O), 3,00 - 2,95 (m, 0,42, Η-2-β); 154,72, 154,69,

130,11, 127,85, 127,77, 124,44, 124,38, 118,97 a 115,69 (ArC), 97,95 (C-1-β), 96,95 a 96,87 (acetál-C),93,50

82,35 (C-4-α), 81,52 (C-4-β) , 76,04 (C-2-β),73,32

73,19 (C-2-α), 70,04 (C-3-α), 68,98 (C-6-α),68,61 (C-1-α), (C-3-β), (C-6-β),

66,24 (C-5-β) a 62,46 (C-5-α).

Zlúčenina 15

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza

K 2-hydroxybenzaldehydu (10,7 ml, 0,100 mol) a trimetylortoformiátu (11,0 ml, 0,100 mol) sa pridá katalytické množstvo kyseliny para-toluénsulfónovej. Za 60 minút sa pridá

2-deoxy-D-glukóza (16,4 g, 0,100 mol) a DMF (300 ml) a zmes sa rýchlo zahreje na asi 60 °C. Za asi 10 minút z výsledkov TLC analýzy vyplýva prítomnosť produktu a za 25 hodín sa pridá malé množstvo pyridinu. Odoberie sa vzorka a chromatografiou (etylacetát/metanol 9 : 1) sa oddelia frakcie, ktoré obsahujú nečistoty. Frakcie, ktoré obsahujú pomerne čistý produkt, sa

·· ···· • · · • · ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	··
• · ·	• ·	• ·
·· ·	··· ····	··	··

oddelia chromatografiou s použitím malého množstva zmesi heptán/etylacetát (1 : 4). Zvyšok reakčnej zmesi sa odparí vo vákuu a zvyšok sa rozpustí v etylacetáte, pridá sa silikagél (200 až 500 pm) a rozpúšťadlo sa odparí vo vákuu. Chromatografiou (heptán/etylacetát 1 : 4) sa získajú asi 2 g produktu so strednou čistotou.

Uvedený nízky výťažok je možné pravdepodobne zdôvodniť zbytočne dlhým reakčným časom a pokus sa opakoval s prídavkom pyridinu počas 2,5 hodiny. Spracovaním a chromatografiou vyššie uvedeným spôsobom sa tak získa 2,4 g znečisteného produktu. Izolované produkty sa zmiešajú a opakovaným chromatografickým spracovaním (heptán/etylacetát 1

4) sa získa biely tuhý produkt. Získa sa 4,1 g produktu, t. j. 7 % teoretického výťažku. NMR analýza poskytuje zodpovedajúce čistému požadovanému produktu až na spektrum niektoré signály, ktoré zodpovedajú niekoľkým percentám nečistôt (signály okolo 1 ppm; nečistoty pravdepodobne pochádzajú z rozpúšťadiel). Preto sa uskutoční opakované čistenie chromatografiou, ktoré však vedie k výrazným stratám produktu a ku konečnej izolácii len 1,2 g produktu. Z výsledkov NMR spektroskopie vyplýva pomer α : β asi 1:1.

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-de), Ô vzhľadom k TMS: 9,56 (s, 1H, Ar-OH), 7,41 - 7,29 (m, 1H, Ar-H), 7,18 - 7,06 (m, 1H, Ar-H), 6,86 6,70 (m, 2,54H, Ar-H + ΟΗ-1-β), 6,40 (d, 0,50H, ΟΗ-1-α), 5,83 a 5,80 (s+s, 1H, acetál-H), 5,17 (t, 0,51H, Η-1-α) , 5,11 (d,

0,46H, ΟΗ-3-β), 5,03 (d, 0,50H, ΟΗ-3-α), 4,79 (t, 0,46H, H-lβ), 4,14 - 3,95 (m, 1,25H, Η-6-α+β + EtOAc), 3,91 - 3,72 (m,

1,11H, H-3-a + Η-5-α), 3,72 - 3,57 (m, 1,48H, Η-3-β + H-6'α+β), 3,36 - 3,16 (m, 1,39H, Η-4-α+β, Η-5-β + H₂O), 2,05 - 1,86 (m, 0,93H, Η-2-α+β + EtOAc), 1,63 - 1,47 (m, 0,51H, H-2'-a) a 1,47 - 1,32 (m, 0,48H, Η-2'-β); 154,71 a 154,66 (Ar-C-OH),

130,09, 127,88, 127,78, 124,54, 124,48, 118,96, 118,93, 115,67 (Ar-C), 97,06 a 97,00 (acetál-C), 94,36 (C-1-β), 91,71 (C-l42 ·· ···· · ·· ·· · • · · ········ ··· · ···· • · · · · ····· • · · 9 · · · · ·· · ··· ···· ·· ···

α), 84,52 a 83,70 (C-4), 68,92 a 68,68 (C-6), 67,24 (C-3-β),

66,52 (C-5-β), 64,50 (C-3-α), 63,03 (C-5-α) a 42,29 (C-2).

Zlúčenina 16

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza

K 2-hydroxybenzaldehydu (10,7 ml, 0,100 mol) a trimetylortoformiátu (11,0 ml, 0,100 mol) sa pridá katalytické množstvo kyseliny para-toluénsulfónovej. Teplota sa spontánne zvýši na asi 60 °C a zmes sa nechá asi 2 hodiny, následne sa pridá N-acetylglukozamín (20,3 g, 0,092 mol) a DMF (150 ml). Potom sa reakčná zmes mieša 30 minút pri 20 ’C a krátko sa zahreje na 50 °C. Väčšina N-acetylglukozaminu sa rozpusti a z výsledkov analýzy TLC vyplýva v podstate úplná konverzia na očakávaný produkt. Potom sa reakčná zmes opäť krátko zahreje na asi 50 °C a prchavé zložky sa odparia pri 20 °C/2000 Pa (15 mm Hg) . Mierne zakalená reakčná zmes sa potom nechá 4 dni pri °C. Pridá sa malé množstvo pyridinu a väčšina rozpúšťadiel sa odparí pri 60 °C/2000 Pa (15 mm Hg) na olej. Olej sa vnesie do etylacetátu (350 ml) a získa sa malé množstvo zrazeniny a dekantovaný roztok sa odparí spoločne s prídavkom silikagélu (200 g, 200 až 500 pm).

Menší podiel produktu sa spracuje chromatografiou na silikagéli (550 ml, 30 až 60 pm) s použitím etylacetátu a za zhromažďovania 100 ml frakcií. Po získaní 58. frakcie sa elučný prostriedok vymení za zmes etylacetát/metanol 9:1a produkt sa získava pomocou nasledujúcich 20 frakcií. Odparením frakcií s obsahom produktu sa získa 3,3 g tuhého produktu. Zvyšok produktu sa spracuje chromatografiou na silikagéli s použitím zmesi etylacetát/metanol 9:1a získa sa tak ďalších g tuhého produktu. DMF sa odstráni miešaním jemne deleného produktu s etylacetátom (200 ml) počas 2 hodín. Filtráciou, premytím etylacetátom a vysušením sa získa 16,7 g čistého produktu, čo zodpovedá teoretickému výťažku 56 %. Z výsledkov GC analýzy vyplýva prevládajúci obsah jedného z izomérov v pomere 5 : 1. Z výsledkov NMR analýzy v DMSO-d₆ vyplýva, že β izomér sa nachádza vo stvor- až päťnásobnom prebytku vzhľadom k α izoméru.

·· ····	• ··	··
• · ·	·· · ·	• ·	··
• · ·	• ·	• ·
• · ·	• ·	• ·
·· ·	··· ····	··	··

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-de), δ vzhľadom k TMS: 9,59 (s, 1H, Ar-OH), 7,80 (d, 1H, NH), 7,38 (t, 1H, Ar-H), 7,17 (t, 1H, Ar-H), 6,86 - 6,72 (m, 3H, Ar-H a ΟΗ-1-α+β), 5,82 (s+s, 1H, acetál-H),

5,17 (d, 0,22H, ΟΗ-3-β), 5,10 - 4,98 (m, 1,54H, ΟΗ-3-α a HH-1a), 4,61 (t, 0,21H, Η-1-β), 4,17 - 4,10 (m, 0,24H, Η-6'-β),

4,10 - 4,03 (m, 0,78H, H-6'-a), 3,90 - 3,80 (m, 0,80H, Η-5-α), 3,79 - 3,61 (m, 2,53H, Η-6-α+β, Η-3-α a Η-2-α), 3,61 - 3,53 (m, 0,26H, Η-3-β) a 3,46 - 3,28 (m, 3,58H, Η-2-β, Η-4-α, Η-5-α a H₂O); 169,91, 169,77 (C=O) , 154,70, 130,15, 127,86, 127,75,

124,41, 124,36, 112,98 a 115,70 (Ar-C), 97,00 a 96, 86 (acetálC), 96,34 (C-1-β), 91,81 (C-1-α), 83,08 a 82,12 (C-4), 70,92 a 67,58 (C-3), 68,86 a 68,52 (C-6), 66,34 a 62,58 (C-5), 58,33 a 55,08 (C-2), 23,46 a 23,00 (CH₃) .

Zlúčenina 17

4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza

K 2-hydroxybenzaldehydu (10,7 ml, 0,100 mol) a trimetylortoformiátu (11,0 ml, 0,100 mol) sa pridá katalytické množstvo kyseliny para-toluénsulfónovej. Získaná reakčná zmes sa mieša 60 minút a potom sa pridá D-galaktóza (18,0 g, 0,100 mol) v DMF (300 ml) a zmes sa krátko zahreje na asi 60 °C. Počas niekoľkých minút sa roztok stane homogénny a analýza TLC preukazuje prítomnosť produktu. Za 20 hodín sa pridá malé množstvo pyridínu, väčšina rozpúšťadla sa odstráni a zvyšok sa vnesie do silikagélu, ako je opísané vyššie. Chromatografiou na stĺpci (etylacetát/metanol 9 : 1) sa získa požadovaný produkt s vysokým výťažkom (asi 17 g) znečistený len DMF. Opakovanou chromatografiou sa získa 4,9 g čistého produktu a súčasne asi 10 g produktu znečisteného niekoľkými percentami DMF. Z výsledkov NMR spektroskopie vyplýva pomer a a β anoméru 77 : 23. Na záznamoch GC analýzy silylovaných derivátov sú dva piky v podobnom pomere.

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-de), δ vzhľadom k TMS: 9,28 (s, 1H, Ar-OH), 7,43 - 7, 34 (m, 1H, Ar-H), 7,19 - 7,13 (m, 1H, Ar-H), 6,85 6,76 (m, 2H, Ar-H), 6,63 (d, 0,23H, ΟΗ-1-β) , 6,30 (d, 0,76H, ΟΗ-1-α), 5,75 (s, 1H, acetál-H), 5,06 (t, 0,76H, Η-1-α), 4,84 (d, 0,23H, ΟΗ-2-β), 4,79 (d, 0,22H, ΟΗ-3-β) , 4,60 (d, 0,76,

ΟΗ-3-α), 4,54 (d, 0,78-OH-2-a), 4,34 (t, 0,23H, Η-1-β), 4,13 - 44 -

·· ····	• ··	··
• · ·	·· · ·	• · ·
• · ·	• ·	• ·
• · · ·	• ·	• · ·
• · ·	• ·	• ·
·· ·	··· ····	·· ·

3,87 (m, 3H, Η-4-α+β, Η-6-α+β), 3,79 - 3,70 (m, 1,55H, Η-3-α a Η-5-α), 3, 66 - 3,59 (m, 0,78H, Η-2-α), 3,45 - 3,36 (m, 0,49H, Η-3-β a Η-5-β) a 3,36 - 3,27 (m, 0,95H, Η-2-β a H₂O); 154,76, 154,70, 129,96, 128,08, 128,03, 125,18, 125,06, 118,95, 118,88 a 115,69 (Ar-C), 97,57 (C-1-β), 96,68 a 96,49 (acetál-C),

93,49 (C-1-α), 77,19 a 76,62 (C-4), 72,36 a 71,88 (C-2-β a C3-β), 69,30 a 69,19 (C-6), 68,79 a 67, 99 (C-2-α a C-3-α), 66,10 a 62,33 (C-5).

Zlúčenina 18

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza

K 2-hydroxybenzaldehydu (0,65 ml, 6,1 mol) a trimetylortoformiátu (0,63 ml, 6,1 mol) sa pridá katalytické množstvo kyseliny para-toluénsulfónovej. Po 1 hodine sa pridá 2-deoxyD-galaktóza (1,0 g, 0,61 mmol) a DMF (25 ml) a zmes sa krátko zahreje na asi 60 °C za vzniku homogénneho roztoku. TLC preukáže do 10 minút prítomnosť produktu. Za 2,5 hodiny sa pridá pyridín, a ďalšie spracovanie sa uskutoční vyššie opísaným spôsobom. Chromatografia s etylacetátom poskytuje len malú separačnú schopnosť, preto sa elúcia uskutoční s použitím zmesi etylacetát/metanol 95 : 5 a získa sa tak 98 mg (6 %) produktu s prijateľnou čistotou. Z výsledkov NMR spektroskopie vyplýva prítomnosť dvoch izomérov v pomere 3 : 2. Na záznamoch GC analýzy silylovaných derivátov sú obidva piky v podobnom pomere.

¹H-NMR (DMSO-de), δ vzhladom k TMS: 9,26 (s, 1H, Ar-OH), 7,48 7,37 (m, 1H, Ar-H), 7,23 - 7,10 (m, 1H, Ar-H), 6,86 - 6,73 (m, 2H, Ar-H), 6,62 (d, 0,31H, ΟΗ-1-β), 6,21 (d, 0,48H, OH-1-a),

5,80 (s, 1H, acetál-H), 5,31 (s, 0,49H, Η-1-α), 4,78 (d,

0,31H, ΟΗ-3-β), 4,67 (d, 0,94H, ΟΗ-3-α + Η-1-β) , 4,07 - 3,79 (m, 3,49H, Η-4-α+β, Η-6-α+β + Η-3-α), 3,70 (m, 0,95H, Η-5-α,

Η-3-β), 3,33 (m, Η-5-β + H₂0), 1,89 - 1,77 (m, 0,53H, Η-2-α) , 1,77 - 1,62 (m, 0,90H, Η-2-β + Η-2'-β) a 1,72 - 1,51 (m,

0,53H, H-2'-a); 154,79 a 154,76 (Ar-C-OH) , 129, 96, 128,12,

125,24, 125,15, 118,94, 118,88 a 115,69 (Ar-C), 96,62 a 96,45 (acetál-C), 94,21 (C-1-β), 91,66 (C-1-α), 75,80 a 74,71 (C-4), 69,86 a 69,61 (C-6), 67,47 (C-3-β), 66,35 (C-5-β), 63,43 (C-3a), 62,38 (C-5-α) a 37,09 a 34,23 (C-2).

·· ···· · ·· ·· ·· · ······· • · · · · · · • · · · · · · ·· · ··· ···· ·· ·

Zlúčenina 19

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza

K 2-hydroxybenzaldehydu (0,48 ml, 4,5 mol) a trimetylortoformiátu (0,47 ml, 4,5 mol) sa pridá malé množstvo kyseliny para-toluénsulfónovej. Za 60 minút sa pridá N-acetylgalaktózamín (1,0 g, 4,5 mmol) v DMF (25 ml) a zmes sa krátko zahreje na asi 50 °C za vzniku homogénneho roztoku. Po 15 minútach analýza TLC preukazuje prítomnosť produktu. Za 2,5 hodiny sa pridá malé množstvo pyridinu, väčšina DMF sa odstráni za zníženého tlaku. Produkt sa vnesie na silikagél, ako je opísané vyššie a chromatografiou (etylacetát/metanol 9 : 1) sa získa 444 mg (30 %) zlúčeniny uvedenej v nadpise. Z výsledkov NMR spektroskopie vyplýva, že zlúčenina obsahuje prevažne jeden izomér, pravdepodobne a izomér.

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-dg), δ vzhladom k TMS (prevládajúci izomér) : 9,34 (s, 1H, Ar-OH), 7,63 (d, 1H, NH) , 7,47 - 7,39 (m, 1H, ΑΓΗ), 7,21 - 7,14 (m, 1H, Ar-H), 6,87 - 6,79 (m, 2H, Ar-H), 6,52 (d, 0,96H, OH-1), 5,80 (s, 1H, acetál-H), 5,08 (t, 0,97H, H1), 4,58 (d, 1H, OH-3), 4,12 (d, 1H, H-4), 4,08 - 3,98 (m, 2H, H-2 + H-6), 3,98 - 3,89 (m, 1H, H-6'), 3,89 - 3,79 (m, 1H, H3), 3,78 (s, 1H, H-5) a 1,83 (s, 3H, CH₃) ; 169, 92 (C=O) , 154,69 (Ar-C-OH), 130,00, 128,05, 125,15, 118,98 a 115,68 (Ar-C),

96,40 (acetál-C), 91,72 (C-l) , 76,45 (C-4), 69, 37 (C-6), 65,75 (C-3), 62,27 (C-5), 50,57 (C-2) a 23,09 (CH₃) .

Zlúčenina 20

4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-manopyranóza

K 2-hydroxybenzaldehydu (10,7 ml, 0,100 mol) a trimetylortoformiátu (11,0 ml, 0,100 mol) sa pridá katalytické množstvo kyseliny para-toluénsulfónovej. Za 60 minút sa pridá D-manóza (18,0 g, 0,100 mol) a DMF (300 ml) a zmes sa krátko zahreje na asi 60 °C. Reakčná zmes je už za 20 minút homogénna a analýza TLC preukazuje prítomnosť produktu. Za 2,5 hodiny sa pridá malé množstvo pyridinu a väčšina DMF sa odparí za zníženého tlaku. Zvyšok sa rozpustí v etylacetáte (pridá sa malé množstvo metanolu, aby vznikol homogénny systém) a

··	····	• ··	··
•	• ·	·· · ·	• ·	• ·
•	• ·	• ·	• ·
•	• ·	• ·	• ·
··	•	··· ····	··	··

rozpúšťadlá sa odparia vo vákuu. Malý podiel surového produktu sa spracuje chromatografiou (etylacetát/metanol 9 : 1) a totožnosť produktu sa preukáže NMR analýzou. Zvyšok produktu sa spracuje chromatografiou s výťažkom 7,7 g produktu znečisteného velkým množstvom DMF. Pokus odstrániť DMF miešaním produktu s chloroformom s následnou filtráciou vedie k výťažku 7,1 g tuhého produktu s obsahom asi 20 % mol. DMF. Produkt sa potom mieša 20 hodín s asi 300 ml etylacetátu a získa sa tak 1,7 g mierne načervenalých kryštálov, v podstate bez DMF. Chromatografiou sa získa produkt bez DMF, ale mierne zafarbený. Filtrát sa odparí a prečistením zvyšku chromatografiou sa získa ďalších 3,5 g produktu. Celkový výťažok izolovaného produktu je 4,7 g, čo je 16 % teoretického výťažku. Z výsledkov NMR spektroskopie vyplýva prítomnosť prevažne a izoméru (a : β približne 85 : 15).

a ¹³C-NMR (DMSO-dg), δ vzhladom k TMS (prevládajúci izomér): 9,51 (s, 1H, Ar-OH), 7,42 - 7,29 (m, 1H, Ar-H), 7,22 - 7,11 (m, 1H, Ar-H), 6,83 - 6,72 (m, 2H, Ar-H), 6,52 (d, 0,73H, OH1), 5,79 (s, 0,72, acetál-H), 4,96 - 4,79 (m, 2,88H, H-1, OH-2 + OH-2, + OH-3), 4,04 - 3, 98 (m, 0,58H, H-6), 3,83 - 3, 68 (m, 2,52H, H-3, H-4 + H-5) a 3, 68 - 3,54 (m, 2,84H, H-2 + H-6'); 154,65 (Ar-C-OH), 130,07, 127,84, 124,56, 118,92 a 115,69 (ArC), 97,29 (acetál-C), 95,51 (C-l), 79,55 (C-4), 72,38 (C-2), 68,88 (C-6), 67,53 (C-3) a 63,87 (C-5).

Zlúčenina 21

4,6-O-benzylidén-L-glukopyranóza

V destilačnom zariadení sa zmieša L(-)-glukóza (5,0 g, 27,8 mmol), benzaldehyd-dimetylacetál (4,66 g, 30,6 mmol) a kyselina para-toluénsulfónová (32 mg, 0,17 mmol) v suchom DMF (20 ml). Potom sa pripojí vodná výveva na destiláciu s krátkou cestou pár a destiláciou vo vákuu sa odstráni metanol a DMF. Počas 1/2 hodiny pri 55 °C sa bezfarebná suspenzia rozpusti a získaný roztok sa mieša 1/2 hodiny pri 12000 Pa (120 mbar) za postupného zvýšenia teploty na 65 °C. Potom sa vákuum zvýši na maximum a reakčná zmes sa odparuje ďalších 45 minút. Na konci destilácie sa reakčná teplota zvýši na 75 °C. Zvyšok je slabo ·· ···· · ·· ·· ·· · ······ • · · · · · · — 47 — ! ί · ¹ ί »* ’ ί ί ·· · ··· ···· ·· nažltlý sirup, ktorý sa zneutralizuje prídavkom NaHC03 (29 mg) a nechá sa vychladnúť.

Surový produkt sa rozpustí v metanole (10 ml) a prečistí sa chromatografiou na reverznej fáze RP-8 s použitím zmesi metanol/voda 1 : 1. Frakcie, ktoré obsahujú produkt, sa spoja a odparením sa odstráni metanol. Zvyšok roztoku sa ďalej zriedi vodou a vysuší sa vymrazením. Z troch samostatných pokusov sa získa biela vločkovitá tuhá hmota v celkovom množstve 2,42 g, čo zodpovedá 32,5 % teoretického výťažku.

Z výsledkov GC chromatografie silylovaných vzoriek vyplýva, že produkt obsahuje dva izoméry (a a β anomér) v pomere 35/65.

¹H-NMR posuny v DMSO-dg sú podobné posunom 4,6-O-benzylidénglukopyranózy: 7,51 - 7,30 (5H, m, Är-H), 6,86 (0,6H, široký s, ΟΗ-1β), 6,58 (0,3H, široký s, ΟΗ-1-α), 5,58 (0,9H, s+s, acetál-Η-α+β), 5,23 (0,7H, d, ΟΗ-3-β), 5,20 (0,6H, d, ΟΗ-2-β), 5,11 (0,4H, d, ΟΗ-3-α), 5,00 (0,4H, Η-1-α), 4,82 (0,3H, d, OH2-a), 4,47 (0,7H, d, Η-1-β), 4,21 - 4,08 (1H, m, Η-6'-α+β), 3,87 - 3,73 (0,4H, m, Η-5-α) , 3,73 - 3, 59 (1,3H, m, H-6-a+B a Η-3-α), 3,46 - 3,22 (3,7H, m, Η-3-β, Η-4-α+β, Η-5-β a Η-2-α) a 3,09 - 2,99 (0,6H, m, Η-2-β).

Zlúčenina 22

4,6-0-(benzylidén-di)-L-glukopyranóza

L-glukóza (5,14 g, 28,6 mmol) sa zahrieva v DMF (20 ml) pri 95 °C až do vzniku číreho roztoku. Potom sa banka s reakčnou zmesou vloží do vodného kúpeľa s teplotou 65 °C a pridá sa kyselina para-toluénsulfónová (33 mg, 0,17 mmol). Potom sa k miešanému roztoku glukózy v prostredí s tlakom 8000 Pa (80 mbar) pomocou vodnej vývevy pridá po kvapkách počas 20 minút injekčnou striekačkou benzylidén-dimetylacetál-di (4,7 ml, 31 mmol). Potom sa DMF odstráni vo vákuu (200 Pa (2 mbar)) pri 65 °C a získa sa tak veľmi svetložltý olej, ku ktorému sa potom pridá NaHCCh (345 mg) a zmes sa mieša 5 minút. K oleju s teplotou 65 °C sa za miešania (magnetické miešadlo) pridá horúca voda (67 °C, 15 ml) a obsah banky sa pretrepáva vo vodnom kúpeli, pokiaľ sa olej zjavne nerozpustí. Potom sa

·· •· •· •· •· ·· ···· · ·· ·· · • ·· · · · · ·· • · · · · · • · · ····· • · · · · · • ··· ···· ·· ··· banka s reakčnou zmesou vloží na asi 5 minút do prúdu chladnej vody. Už za asi jednu alebo dve minúty sa vylúči amorfná tuhá hmota. Vodná zmes sa potom umiestni do kúpela ľad-voda a nechá sa 40 minút. Vylúčená zrazenina sa potom izoluje filtráciou s pomocou vákua (po dekantácii amorfného materiálu), premytím chladnou vodou (25 ml) a potom chladným izopropanolom (5 °c, 2 x 5 ml) a vysušením v prúde dusíka a získa sa 1,85 g suchého bieleho prášku. Silylovaný produkt sa potom analyzuje plynovou chromatografiou a z výsledkov vyplýva 99 % čistota požadovaného produktu.

^XH-NMR δ (DMSO-de), δ vzhľadom k TMS: 7,55 - 7,25 (5H, m, Ar-H),

6.85 (0,48H, OH-1B), 6,55 (s, 0,·33Η, ΟΗ-1-α), 5,25 (d, 0,48H,

ΟΗ-3-β), 5,20 (d, 0,49H, d, ΟΗ-2-β), 5,10 (d, 0,35, ΟΗ-3-α), 4,98 (d, 0,35H, Η-1-α), 4,82 (d, 0,34H, ΟΗ-2-α), 4,48 (d, 0,51H, Η-1-β), 4,20 - 4,05 (m+m, 0,53H + 0,42H, Η-6'-α+β),

3.85 - 3, 73 (m, 0,44H, Η-5-α), 3,72 - 3,57 (m, 1,27H, m, H-

6”-α+β a Η-3-α), 3,45 - 3,20 (m, 7,8H, Η-3-β, Η-4-α+β, Η-5-β a Η-2-α) a 3,10 - 2,98 (m, 0,56H, Η-2-β).

Zlúčenina 23

4.6- 0-(2,3-acetoxybenzylidén)-D-glukopyranóza

K ekvimolárnej zmesi 2-acetoxybenzaldehydu a trimetylortoformiátu sa pridá katalytické množstvo kyseliny paratoluénbenzoovej. Reakčná zmes sa mieša 1 hodinu a potom sa pridá ekvimolárne množstvo D-glukózy a DMF a zmes sa zahreje asi na 60 °C. Konverzia sa sleduje TLC chromatografiou a po dosiahnutí rovnováhy sa reakcia preruší prídavkom malého množstva pyridínu. Väčšina DMF sa odparí za zníženého tlaku a zvyšok sa vnesie do silikagélu spôsobom opísaným vyššie. Po prečistení chromatografiou, izolácii požadovaných frakcií a odparení sa získaná zlúčenina analyzuje NMR spektroskopiou.

Zlúčenina 24

4.6- 0-(2,3-dihydrobenzylidén)-D-glukopyranóza

Zlúčenina uvedená v nadpise sa pripraví a prečistí sa vyššie uvedeným spôsobom s použitím 2,3-dihydrobenzaldehydu ako východiskovej zlúčeniny. Totožnosť sa preukáže NMR spektroskopiou.

·· ···· · ·· ·· • · · ···· ··· • · · · · · · • · · · · · · ·· · ··· ···· ·· ·

Biologické príklady

Príklad 1

Biologické materiály a spôsoby použité na preukázanie účinkov Techniky kultivácie buniek

Ľudské bunky, NHIK 3025, pôvodom z karcinómu in situ krčka maternice (Nordbye, K., a Oftebro, R., Exp. Celí Res. 58: 458, 1969; Oftebro, R., a Nordbye, K. Exp. Celí Res. 58:

459-460, 1969) sa kultivovali v Eaglovom minimálnom esenciálnom médiu (MEM) doplnenom 15 % fetálnym telacím sérom (Gibco BRL, Ltd.). Ľudské bunky karcinómu prsníka, T-47D (Keydar, I. a kol., Eur. J. Cancer, zväzok 15, str. 659-670, 1979) sa kultivovali v médiu RPMI-1640 doplnenom 10 % fetálnym teľacím sérom, 0,2 j/ml inzulínu, 292 mg/ml L-glutamínu, 50 j/ml penicilínu, 50 mg/ml streptomycínu. Bunky sa kultivovali bežným spôsobom ako monovrstvy pri 37 ^eC v skúmavkách pre tkanivové kultúry. Na udržiavanie buniek v kontinuálnom exponenciálnom raste sa bunky spracovali trypsínom a rekultivovali sa trikrát týždenne.

Prežívanie buniek

Prežívanie buniek sa meralo podľa schopnosti vytvárať kolónie. Pred naočkovaním sa exponenciálne rastúce bunky trypsinizovali, suspendovali sa ako jednotlivé bunky a naočkovali sa priamo na 5 cm plastové disky. Počet naočkovaných buniek sa vybral tak, aby počet životaschopných buniek bol približne 150 na disk. Po 2 hodinovej inkubácii pri 37 °C sa bunky naviazali na dno diskov. Potom sa zahájila aplikácia liekov pomocou nahradenia média médiom s obsahom požadovanej koncentrácie lieku. Po aplikácii lieku sa bunky premyli jedenkrát teplým (37 °C) Hankovým vyváženým roztokom solí a potom sa pridalo čerstvé médium. Po 10 až 12 dňoch pri 37 °C v C02~inkubátore sa bunky fixovali etanolom a farbili sa metylénovou modrou a potom sa spočítali kolónie.

Obr. 1 až 3 ukazujú frakcie prežívajúcich buniek pre NHIK

3025 bunky ošetrené počas 20 hodín zlúčeninou 8 a 9 (obr. 1), zlúčeninou 5 a 7 (obr. 2) alebo zlúčeninou 12 (obr. 3) . Údaje ukazujú, že všetky zlúčeniny indukujú inaktiváciu buniek

·· • •	···· • · • ·	• ·· ·· · · • t	·· • · • ·	··
•	• ·	• ·	• ·
··	•	··· ····	··	··

závislú na	dávke	podobnú	alebo lepšiu ako	zilaskorb (2H)
(Pettersen a	kol.,	Anticancer	Res., zväzok 11	(1991), str.
1077-1082).
Z obr.	4 je	zrejmé,	že	zlúčenina 2 indukuje lepšiu

inaktiváciu buniek ako tukarezol.

Príklad 2

Syntéza proteinu

Rýchlosť syntézy proteínov sa vypočítala spôsobom opísaným skôr (Ronning, O. W. a kol., J. Celí. Physiol. 107: 47-57, 1981). Stručne, bunkový proteín sa nasýtil značkovacím činidlom počas minimálne dvojdennej preinkubácie s [¹⁴CJ— valínom s konštantnou špecifickou rádioaktivitou (0,5 Ci/mol). Na udržanie špecifickej rádioaktivity na konštantnej hodnote sa v médiu použili vysoké koncentrácie valínu (1,0 mM). Pri tejto koncentrácii valínu je nariedenie [¹⁴C]-valínu intracelulárnym valínom a proteolyticky produkovaným valínom zanedbateľné (Ronning, O. a kol., Exp. Celí Res. 123: 63-72,

1979). Rýchlosť syntézy proteinu sa vypočíta z inkorporácie [³H]-valínu vzhladom k celkovej [¹⁴⁰C] rádioaktivite v proteíne na začiatku príslušného merania a vyjadrí sa v percentách na hodinu (Ronning, 0. W. a kol., J. Celí. Physiol. 107: 47-57,

1981).

Z obr. 5 je zrejmé, že zlúčenina 2 indukuje lepšiu inhibíciu syntézy proteinu ako tukarezol.

Príklad 3

Pokusy na ľudských xenotransplantátoch na holých myšiach

Lieky boli testované na liečbe troch ľudských xenotransplantátov implantovaných samiciam atymických myší. Použitými bunkovými líniami boli SK-OV-3 ovariálny karcinóm, A-54 9 karcinóm pľúc a Caco-2 kolorektálny karcinóm. Tieto bunkové línie sa získali z Američan Type Culture Collection a pred implantáciou holým myšiam sa krátko inkubovali in vitro. Nádorové línie sa pasážovali ako s. c. implantáty u holých myší. Malé kúsky nádorov sa implantovali s.c. do ľavého boku zvierat. Zvieratá s rastúcimi tumormi (objem nádorov 25 až 110 mm³) sa náhodne rozdelili do skupiny liečenej liekom alebo ·· ···· • · • · ··

• ·· ·· ·· · · · · · • · · · • · · · · • · · · ··· ···· ·· · kontrolnej skupiny tak, aby priemerný objem nádorov v obidvoch skupinách bol približne rovnaký. Protinádorová aktivita sa hodnotila meraním kriviek rastu objemu nádorov a histologickým vyšetrením niektorých nádorov. Počas liečby sa nádory merali 2-krát týždenne meraním v dvoch kolmých rozmeroch pomocou kalipera. Objem nádora sa vypočítal podlá vzorca: objem = (dĺžka x šírka²)/2. Krivky rastu objemu nádorov sa vytvorili štandardizáciou velkosti nádorov v rôznych skupinách pomocou relatívneho objemu nádora (RV), ktorý sa vypočítal podlá vzorca: RV = Vx/Vl, kde Vx je objem nádora v deň x a VI je objem nádora na začiatku liečby (deň 1), a grafickým znázornením priemerného objemu so štandardnými odchýlkami pre každú skupinu v závislosti na čase. Exponenciálna krivka sa upravila pre údaje rastu relatívneho objemu nádoru a interval, počas ktorého sa objem nádora v každej skupine zdvojnásobil (zdvojovací čas nádoru (TD)), sa určil z tejto krivky (log2/k, kde k je vypočítaná rýchlostná konštanta pre proces). Histologické vyšetrenie spočívalo v makroskopickom vyšetrení nádora a vyšetrení parafínovaných rezov nádorov farbených hematoxylínom a eozínom (6 až 8 mm) vo svetelnom mikroskope.

V tabulke 1 je uvedený zdvojovací čas nádorov (TD) pre ludské nádorové xenotransplantáty kultivované na holých myšiach, ktoré boli liečené i.v uvedenými liekmi a dávkami.

··	····	• ··	··
•	•	•	·· · ·	• ·	•
• ·	•	• ·	•	•
•	•	• ·	• · ·	•	•
• ·	•	• ·	•	•
··	•	··· ····	··	•

Tabuľka 1

Typ nádoru	Liečivo	Dávka (mg/kg/deň)	TD ± SE	Čas liečby (dni)
A5489	kontrola		13 ± 1	37
	zlúčenina 2	90	16 ± 1	52
	zlúčenina 5	90	17 ± 1	52
	zlúčenina 8	1	21 ± 1*	42
Caco-2	kontrola		27 ± 1	81
	zlúčenina 5	20	33 ± 1*	81
SK-OV-3	kontrola		20 ± 1	67
	zlúčenina 8	1	28 ± 1*	67
	zlúčenina 8	7,5	31 ± 1*	56
	zlúčenina 10	1	36 ± 1*	67
	zlúčenina 10	7,5	17 ± 1	56
SK-OV3	kontrola		25 ± 1	67
	zlúčenina 5	5	28 ± 1	67

štatisticky významný rozdiel medzi liečenou a kontrolnou skupinou, p < 0,05.

Na obr. 6 sú uvedené krivky rastu nádora pre xenotransplantát nádorovej línie SK-OV-3 ovariálneho karcinónu implantovaný holej myši, ktorá bola liečená denne 1 mg/kg a 7,5 mg/kg zlúčeniny 8. Krivky ukazujú významný inhibičný účinok na rast pre obidve dávky.

Obr. 7 až 12 ukazujú mikroskopické fotografie nádorov pre každú skupinu. Tieto fotografie ukazujú všeobecné nálezy pre túto zlúčeninu, konkrétne je viditeľný rozdiel v nekróze nádorových buniek medzi kontrolnými nádormi a nádormi liečenými zlúčeninou 8. Pretože sú liečené nádory nekrotizované v dôsledku liečby, sú v skutočnosti účinky lieku ešte silnejšie, ako je zrejmé z rastových kriviek.

·· ··«· •· •· •· •· ··

• ·· ·· · ·· · · · ··· • · · ·· • · · · · ·· • · · ·· ··· ···· ·· ···

Príklad 4

Multicelulárne sféroidy a aktivácia retinoblastomového proteínu (pRB)

Sféroidy sa inicializovali prenesením suspendovaných jednotlivých buniek do tkanivovej kultivačnej nádoby s objemom 25 cm² s obsahom 12 ml média. Nádoba sa potom umiestnila na naklápaciu dosku (MIXÉR 440, Swelab Inštrument) do priechodzej inkubátorovej komory pri teplote 37 °C. Rýchlosť náklonov sa nastavila na 10 náklonov za 18 sekúnd. Počas nakláňania sa bránilo naviazaniu buniek na dno nádoby. Namiesto toho sa bunky po približne 24 hodinách nakláňania naväzovali jedna na druhú a vytvárali malé agregáty buniek, ktoré sa skladajú obvykle z 50 až 100 buniek. Malé agregáty sa potom preniesli do inej tkanivovej kultivačnej nádoby s veľkosťou 25 cm². V tomto prípade sa dno nádoby vopred pokrylo (potiahlo) tenkou vrstvou 1,3 % sterilizovaného agaru (Bacto-Agar, Difco laboratories, USA). Bunkové agregáty sedimentovali na agarovej vrstve a nemohli sa naviazať na túto vrstvu. Bunky v agregátoch, naviazané na seba navzájom, sa začali deliť. Po 1 týždni zdvojnásobili agregáty svoj objem a začali sa podobať okrúhlym sféroidom. Počas tohto obdobia sa médium vymieňalo 3krát týždenne a sféroidy sa prenášali do nových nádob potiahnutých agarom jedenkrát týždenne.

Keď sféroidy dosiahli veľkosť priemeru približne 400 pm (po 2 až 3 týždňoch kultivácie), tak sa preniesli do malých mikrojamiek, s 1 sféroidom na jamku spoločne s 1 ml média. Zabezpečilo sa, aby mali všetky vybrané sféroidy približne rovnakú veľkosť. Jamky boli tiež potiahnuté agarom, aby sa zabránilo naviazaniu sféroidov na dno jamiek. Rôzne jamky sa doplnili novým médiom s obsahom testovanej substancie vo vybranej koncentrácii a potom sa každý deň meral priemer každého jednotlivého sféroidu. Toto meranie sa uskutočnilo pod mikroskopom, s použitím fázového kontrastu a mriežky so známou vzdialenosťou línií v jednom okulári (vzdialenosť medzi dvomi čiarami). V každej skupine sa použilo pararelne 8 až 12 sféroidov. Relatívny objem sféroidov (objem v deň n delený objemom v deň 1) sa počítal každý deň pre každý sféroid a

··	····	• ·· ·· a
• ·	•	·· · · · ·	··
• ·	•	• · · ·	•
• ·	• ·	• · · · ·	•
• ·	•	• · · ·	•
··	•	··· ···· ··	···

vytvorili sa rastové krivky ako závislosť priemerného relatívneho objemu všetkých sféroidov v skupine v závislosti na čase po zahájení liečby.

V tabuľke 2 je uvedený zdvojovací čas (TD) objemu T-47D sféroidov pri 259 hodinovej liečbe zlúčeninou 8 v uvedených dávkach. Tabuľka 2 ukazuje zdvojovacie časy objemov sféroidov T-47D buniek buď neliečených (dávka = 0 mM) alebo liečených kontinuálne 0,1 alebo 1,0 mM zlúčeniny 8 v médiu. Je zrejmé, že zlúčenina 8 predlžuje zdvojovací čas sféroidov (t.j. inhibuje rast sféroidov) v závislosti na dávke, pretože účinok je jasne silnejší pre 1,0 mM ako pre 0,1 mM zlúčeniny.

Tabuľka 2

Dávka	TD ± SE
0	75 ± 2
0,1 mM	85 ± 3
1,0 mM	98 ± 7W

štatisticky významný rozdiel medzi liečenou a kontrolnou skupinou, p < 0,05.

Na obr. 13 sú uvedené rastové krivky pre priemerný objem sféroidov pre bunkovú líniu T-47D karcinómu prsníka, kde boli sféroidy ošetrené 0,1 mM a 1,0 mM zlúčeniny 8 rozpustenej v médiu.

U sféroidov tvorených NHIK 3025 bunkami nebolo zväčšovanie objemu sféroidov v čase rovnakým spôsobom redukované ako u sféroidov tvorených T-47D bunkami. Namiesto toho sa sféroidy ošetrené zlúčeninou 8 rozpadali po relatívne krátkom čase liečby (7 až 10 dní). Na zistenie dôvodu tohto silného účinku sa uskutočnil pokus, pri ktorom sa sféroidy tvorené NHIK 3025 bunkami ošetrovali len 4 dni a potom sa pripravili histologické rezy sféroidmi. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 14.

Obr. 14 znázorňuje mikroskopické fotografie rezov 3 rôzne

NHIK 3025 bunkami, z ktorých (A), jeden bol ošetrený 0,1 mM a jeden bol ošetrený 1,0 mM

Sféroidy sa fixovali v 4 % liečených sféroidov tvorených jeden bol neliečenou kontrolou zlúčeniny 8 počas 4 dní (B) zlúčeniny 8 počas 4 dní (C) .

	·· ····	• ··		··
•	• ·	·· · ·	•	•	• ·
•	• ·	• ·	•	•
•	• ·	• ·	•	•
	·· ·	··· ····		• e	··

formaldehyde a ponorili sa do parafínu predtým, ako sa pripravili 6 mm rezy, ktoré sa vyfarbili hematoxylínom a eozínom.

Obidva sféroidy ošetrené zlúčeninou 8 mali významné centrálne oblasti, kde boli zrejmé bunky v apoptóze. Obraz apoptózy nebol pozorovaný nikde v kontrolnom sféroide, ale bol zrejmý na mnohých miestach sféroidov ošetrených zlúčeninou 8.

U obidvoch typov buniek liečených zlúčeninou 8 je zrejmý jasný účinok lieku,

Vo sféroidoch tvorených T-47D bunkami rastu objemu sféroidov ošetrených liekom, dávke lieku. Vo sféroidoch nedochádza k redukcii rastu naopak sa objem sféroidov rýchlejšie u liečených sféroidov. existuje významná frakcia buniek, aj keď sú porovnávané rôzne typy buniek, dochádza k redukcii ktorý je závislý na NHIK sféroidu počas

3025 počas prvých bunkami liečby, dní tvorených objemu zvyšuje

Avšak, v týchto sféroidoch ktoré podliehajú apoptóze, takže drť z mŕtvych buniek v tomto prípade zväčšuje objem sféroidu. Rýchle zvýšenie objemu týchto sféroidov je zrejme dôsledkom zmien osmotického tlaku po lýze fragmentov buniek. V dôsledku napučiavania sa tieto sféroidy stávajú nestabilné a rozpadajú sa po približne 9 dňoch.

Dôvod rozdielnej reakcie týchto dvoch typov buniek nie je jasný. Avšak, existuje významný geneticky rozdiel medzi týmito typmi buniek vzhiadom na reguláciu bunkového rastu a proliferácie, ktorý môže byť čiastočne dôvodom tohto rozdielu. T-47D bunky exprimujú funkčný pRB, retinoblastomový proteín, ktorý je normálnym tumor-supresorovým génom, ktorý je významný v regulácii progresie bunkového cyklu u normálnych buniek. Tento gén je často chybný v nádorových bunkách a NHIK 3025 bunky patria medzi bunky s chybou funkcie pRB. Zistilo sa, že pRB môže byť aktivovaný na zastavenie cyklu buniek za stresových podmienok aj vtedy, keď bunky vstúpili do S-fázy bunkového cyklu, čo naznačuje, že tento gén môže chrániť bunky pred inaktivačnými účinkami stresu v kombinácii so syntézou DNA (viď. Amellem, Sandvik, Stokke a Pettersen, British Journal of Cancer 77(1998), 862-872). V uvedenom pokuse pôsobí benzaldehydový derivát ako stresový vplyv inhibujúci rast.

	·· ····	• ··	··
•	• ·	·· · ·	• ·	• ·
•	• ·	• ·	•	•
•	• ·	• ·	•	•
	• e ·	··· ····	··	• ·

Preto je možné, a preto u nich nedochádza k indukcii apoptózy 3025 bunky s chybným pRB sa nemôžu že T-47D bunky sú chránené svojim funkčným pRB , zatiaľ čo NHIK vyhnúť apoptóze.

Na buniek, bunky.

testovanie aktivácie pRB ktoré majú obidva normálnu Jadrový pRB proteín prietokovou DNA a údaje DNA versus

Fixácia a farbenie sa uskutočnili spôsobom podľa Sandvik, of Cancer 77 (1998), 862detergenčným činidlom sa 1,5 ml detergenčnom pufri jadrá sa potom sa sa použili dva rôzne typy expresiu pRB, T-47D a MCF-7 sa detegoval cytometriou. Súčasne sa tiež uskutočnilo meranie sa predstavovali ako dvojparametrické histogramy pRB.

Stokke a Pettersen, British Journal 872. Stručne, bunky extrahované pripravili resuspendovaním buniek v s nízkym obsahom solí. Extrahované paraformaldehyde počas 1 hodiny a

PMG3-245 monoklonálnu protilátku (Pharmigen), ako hypo-, tak hyperfosforylované formy protilátka sa farbila streptavidínom-FITC a Hoechst 33258. Jadrá sa merali cytometri lasermi príslušnom hypo-, sa 33258.

(Becton-Dickinson) (Spectra poradí.

fixovali v 4 % pRB naviazal na ktorá rozoznáva proteínu. pRB DNA sa farbila na FACStart^plus prietokovom vybavenom dvomi argónovými Physics) nastavenými na 488 nm a UV, v na obr.

Gl, S a až 18 ukazujú frakciu jadier v každej G2 fáze, ktorá mala RB-proteín naviazaný na Keď je naviazaný týmto spôsobom, že RB reguluje bunky mimo bunkového cyklu, Stokke, T., O.: The retinoblastoma bound in hypoxic stress.

sú uvedené MCF-7 (obr.

hodín obidva vyšších pRB vo kontroluje bunkový cyklus (viď. Amellem, O., A. a Pettersen, E. reversibly dephosphorylated and S and G2 phase during (1996): 106-115). Údaje karcinómu prsníka,

18) a na čas liečby 16 a 18). Pre koncentráciách s naviazaným a

(obr.

v jadier gene the Celí

Exp. pre dva 15 a 16) (obr. 15 buniek 0,5 mm typy a T17) a a indukuje zvýšenie typy ako všetkých interfázach.

Údaje interfáze, jadro po liečbe zlúčeninou 8. tak sa predpokladá, t. j .

Sandvik, J. product is nucleus in Res. 227 buniek ľudského 47D (obr.

hodín zlúčenina frakcií

Účinok sa zvyšuje s predĺžením času liečby a je výraznejší po hodinách ako po 24 hodinách liečby. Dohromady tieto údaje ukazujú, že substancia aktivuje regulačný účinok pRB na ·· ···· • · · • · · • · · ·· · ·· ·· • ···· ·· bunkový cyklus, čo vedie k redukcii progresie bunkového cyklu. Závislosť účinku lieku na dávke je komplikovaná a vykazuje maximálny účinok pre dávky okolo 1 mM zlúčeniny 8 a zníženie pre vyššie dávky. Bola tak zistená krivka dávka-odpoveď v tvare zvonu, čo je podobný výsledok, ako pre zlúčeninu 10 v pokuse s SK-OV-3 xenotransplantátmi na holých myšiach (viď. tabulka 1). Aj keď nie je dosial známe, prečo je aktivácia pRB znížená pri dávkach zlúčeniny 8 nad 1 až 1,5 mM, je zaujímavé, že pri týchto dávkach sa zistila relatívne silná inhibícia syntézy proteínov. Po 24 hodinovej liečbe NHIK 3025 buniek 1,5 mM zlúčeniny 8 bola rýchlosť syntézy proteínov 70 % v porovnaní s kontrolnými bunkami (viď. obr. 19).

Obr. 20 znázorňuje, že syntéza proteínov po 24 hodinách liečby 1,5 alebo 2,5 mM zlúčeniny 8 je 75 % alebo 50 %, v príslušnom poradí, ale vracia sa k norme približne 6 hodín po odstránení lieku. Inhibícia bunkového cyklu, ktorá nevyhnutne vedie k inhibícii syntézy proteínov (viď. Ronning, 0. W.,

Lindmo, T., Pettersen, E. O. a Seglen, P. O.: Effect of sérum step-down on protein metabolism and proliferation kinetics of NHIK 3025 cells. J. Celí Physiol. 107 (1981): 47-57) je výsledkom regulačného účinku pRB pri koncentráciách v rozsahu 1,5 až 2,5 mM.

Príklad 5

Meranie bunkovej adhézie

Bunkové adhézne sily meranie manipulačnej sily microscope, Ph.D. thesis, sa merali pomocou mikroskopu na (G. Sagvolden, Manipulation force University of Oslo, 1998, a G.

Sagvolden, I. Giaver a J. Feder, Characteristic protein adhesion forces on glass and polystyréne substrates by atomic force microskopy, Langmuir 14(21): 5984-5987, 1998). Stručne, NHIK 3025 karcinómové bunky sa kultivovali v C02~independentnom médiu s obsahom 15 % fetálneho teľacieho séra. Tieto bunky sa vystavili pôsobeniu 1 mM koncentrácie zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny 2 počas 20 hodín predtým, ako sa uvoľnili z bunkových kultivačných skúmaviek pomocou trypsínu. Bunky sa udržiavali v suspenzii a umiestnili sa v médiu so zlúčeninou 1 alebo zlúčeninou 2 na polystyrénové tkanivové kultivačné

	·· • •	···· • · • ·	9 ·· ·· · · • ·	·· • · · • ·
—	•	• 9	• ·	9 9
	• e	9	··· ····	·· ·

substráty 90 minút po ukončení trypsínovej reakcie. Adhézne sily medzi bunkami a substrátom sa merali pomocou odstránenia buniek s použitím šikmej konzoly mikroskopu na meranie sily pôsobiacej ako snímač sily. V jednom okamihu sa odstránila jedna bunka a každá bunka sa odstránila len jedenkrát. Maximálna sila zistená pre každú bunku sa zaznamenala ako funkcia času, pretože bunky boli umiestnené na substráte. Medián sily pre skupinu 19 meraní je na obr. 21 uvedený ako funkcia priemerného času pre bunky vystavené pôsobeniu zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny 2, spoločne s adhéznymi silami buniek nevystavených pôsobeniu týchto zlúčenín.

Zlúčenina 2 má značné účinky v redukcii adhéznej sily pri tejto koncentrácii, zatiaľ čo zlúčenina 1 nemá významné účinky. Účinok zlúčeniny spočíva najmä v redukcii adhéznej sily buniek, nie však v priebehu adhézie.

Znížená schopnosť väzby na substrát môže súvisieť s blokovaním zakotvenia buniek sprostredkovaného integrínmi. Preukázalo sa, že také blokovanie môže indukovať programovanú bunkovú smrť u hepatómových a melanómových buniek (Paulsen, P. E., Halí, K. S., Rugstad, H. E., Reichelt, K. L., and Elgjo,

K., The synthetic hepatic peptides pyroglutamylglutamylglycylserylasparagin and pyroglutamylglutamylglycylserylaspartic acid inhibit growth of MH1C1 rat hepatoma cells tranplanted into buffalo rats and athymic mice. Cancer Res. 52 (1992), 1218-1221; a Mason, M.

D., Allman, R. a Quibell, M. Adhesion molecules in melanoma more then just superglue ?, J. Royal Soc. Med. 89 (1992),

393-395).

Adhézna sila medzi NHIK 3025 bunkami a substrátom sa merala po preinkubácii buniek v roztoku zlúčeniny 1 a 2. Aj pri koncentrácii 1 mM bol pozorovaný prekvapujúci účinok Dizotopu. Prekvapujúco, zlúčenina 2 významne znižuje adhéznu silu na 1/3 v porovnaní s kontrolou, zatiaľ čo zlúčenina 1 nevedie k významnému zníženiu. Autori vynálezu predpokladajú, že zlúčenina 2 môže interferovať s biosyntézou integrínov, čo znižuje schopnosť buniek väzby na substrát. Integríny sú štrukturálne transmembránové proteíny zásadné pre väzbu buniek

	··	····	• ··	··
•	•	•	·· · ·	• ·	• ·
•	•	•	• ·	• ·
•	•	•	• ·	• ·
	··	•	··· ····	··	• ·

na extracelulárnu

Inhibícia schopnosť integríny proteínov.

metastázovania pri vývoji nádoru.

medzibunkové môže priamo buniek. Pokus interakcie, ovplyvňovať ukázal, že matricu a pre funkcie integrínov tak metastázovania nádorových môžu byť predovšetkým citlivé na inhibíciu syntézy

Zlúčenina 2 sa môže použiť na prevenciu

Príklad 6

Pokusy so zlúčeninou 2 a zlúčeninou 5 na NMRI myšiach infikovaných FRIEND vírusom erytroleukémie (FLV)

Vírus: Eveline bunky sa získali od prof. Gerharha

Hunsmana, Mníchov. Preukázalo sa, že tento vírus, ktorý sa pôvodne používal ako zdroj Friend pomocného vírusu, obsahuje chybný vírus s rovnakou velkosťou ako Spleen Focis Forming Virus (SFFV), ktorý indukuje erytroleukémiu u NMRI myší počas 4 až 8 týždňov.

Myši: NMRI myši sa získali z Old Bomholt Farm, Dánsko, a zakúpili sa prostredníctvom SIFF. Myši sa získali 6.5. a do pokusu sa zaradili 11.5. Myši sa infikovali intraperitoneálne 50 pl supernatantu z Eveline kultúry. Po 24 hodinách sa zahájila liečba. Zlúčenina 2 a zlúčenina 5 sa rozpustili v sterilnom izotonickom glycerolovom roztoku v koncentrácii zodpovedajúcej 5 mg na kg pri intraperitoneálnej aplikácii 50 pl.

Pokus sa uskutočnil nasledovne:

10 myší	- neinfikovaná kontrola,
10 myší	- infikovaná kontrola,
5 myší	- neinfikované, liečené zlúčeninou 2,
10 myší	- infikované, liečené zlúčeninou	2,
5 myší	- neinfikované, liečené zlúčeninou 5,
10 myší	- infikované, liečené zlúčeninou	5.

Myšiam sa podávali intraperitoneálne injekcie jedenkrát denne počas 19 dní. Od 1.6. do 16.6., keď sa myši usmrtili, sa nepodávala žiadna liečba. 16.6. sa myši usmrtili. Odobrala sa krv (pre následnú analýzu). Odstránili sa sleziny a odvážili

·· • •	···· • · • ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	··
•	• ·	• ·	• ·
··	•	··· ····	··	··

sa (viď. tabulka 3) . Časť sleziny sa zmrazila dusíkom na prípravu tenkých rezov a časť sa fixovala formalínom.

Tabulka 3

Neinfikované kontroly	Infikované kontroly	Zlúčenina 2 neinfikované	Zlúčenina 2 infikované	Zlúčenina 5 neinfikované	Zlúčenina 5 infikované
125	154	266	151	185	308
160	240	143	153	161	162
94	214	106	168	188	150
146	212	153	145	155	153
118	165	117	149	120	195
120	171	157	127	161,8	129
115	190	63,824	131	27,472	157
103	204		170		176
130	203		127		153
147	148		148		197
125,8	190,1	157	146,9	162	178 priem, hmotnosť
20,5	24,5	63	15,228	27	50,206 štand. odchýlka

Výsledky sú uvedené tiež na obr. 23.

Ako je zrejmé, existuje významný rozdiel v hmotnosti slezín u infikovaných zvierat v porovnaní s neinfikovanými kontrolami. Hmotnosti u neinfikovaných zvierat liečených zlúčeninou 2 alebo zlúčeninou 5 sú vyššie ako hmotnosti neinfikovaných kontrol, aj keď rozdiel nie je štatisticky významný. Je možné povedať, že infikované zvieratá, ktoré sa liečili zlúčeninou 2, mali skutočne nižšiu priemernú hmotnosť sleziny v porovnaní s neinfikovanými zvieratami, ktoré sa liečili podobným spôsobom (tu sa predpokladá, že výsledok má pôvod v jednom zvierati v kontrolnej skupine, ktoré malo významne velkú slezinu).

Histologické vyšetrenie ukázalo, že neinfikované kontroly majú normálnu anatómiu sleziny. Všetky zvieratá v infikovanej neliečenej skupine mali inváziu patologických leukemických buniek do červenej drene. Sleziny, od infikovaných zvierat ·· ···· · ·· ·· • · · ······· • · · · · · · • · · ·· ··· ·· · ··· ···· ·· ··· liečených zlúčeninou 2 aj zlúčeninou 5, mali hypertrofické zárodočné centrá, ktoré sú interpretované ako dôsledok imunostimulácie. Nebolo možné nájsť leukemické zmeny v slezinách od infikovaných zvierat liečených zlúčeninou 2. V skupine liečenej zlúčeninou 5 malo zviera s najväčšou slezinou (308 g) leukemické zmeny, zatial čo všetky zvieratá v infikovanej kontrolnej skupine mali leukemické zmeny.

Tieto výsledky sú sľubné, ak sa zoberie do úvahy agresívny charakter FLV u myši a tiež, keď sa porovnajú s účinkami azidotymidínovej a inej antivírusovej liečby.

Príklad 7

Proliferácia mononukleárnych buniek periférnej krvi

Uskutočnil sa pokus, v ktorom sa mononukleárne bunky periférnej krvi vystavili pôsobeniu superantigénu spoločne s benzaldehydom, deuterizovaným benzaldehydom, zlúčeninou 2 alebo zilaskorbom(²H) . Superantigén sa použil ako veľmi aktívny štandard na proliferáciu T-lymfocytov a je predstavovaný ΤΙ ymfocy tom bunkami predstavujúcimi antigén.

Pokus preukázal (viď. obr. 22), deuterizovaného benzaldehydu alebo významne zvyšuje proliferácie že pridanie benzaldehydu, zlúčeniny 2 štatisticky mononukleárnych buniek periférnej krvi spôsobom závislým na dávke s krivkou v tvare zvona, zatial čo veľmi malý účinok bol pozorovaný pre zilaskorb(²H) . Skutočnosť, že sme boli schopní zosilniť proliferačný signál zo superantigénu, naznačuje, že zlúčeniny majú ďalší kostimulačný účinok na T-lymfocyty.

Príklad 8

Účinok na metastázy kolorektálneho karcinómu holých myší do pečene u

Materiál a postupy

Použitá bunková línia, C170HM2, je známa línia ľudského kolorektálneho karcinómu (S. A. Watson a kol., Eur. J. Cancer

29A (1993), 1740-1745) a pochádza pôvodne z primárneho nádoru pacienta. C170HM2 bunky sa kultivovali in vitro v RPMI 1640 kultivačnom médiu (Gibco, Paisley, UK) s obsahom 10 % (obj./obj.) teplom inaktivovaného fetálneho teľacieho séra (Sigma, Poole, UK) pri 37 °C v 5 % CO2 a vo zvlhčenej atmosfére. Bunky zo semi-konfluentných monovrstiev sa získali pomocou 0,025 % EDTA a premyli sa dvakrát v kultivačnom médiu opísanom vyššie.

·· • •	···· • · • ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	··
•	• ·	• ·	• ·
··	•	··· ····	··	··

C170HM2 bunky získané zo semi-konfluentných monovrstiev sa resuspendovali v koncentrácii 1 x 10⁶/ml v sterilnom fosfátom pufrovanom salinickom roztoku, pH 7,4 (PBS) a injektovali sa v objeme 1 ml do peritoneálnej dutiny 20 MFI samcom holých myší (chovaných v Cancer Studies Unit na University of Nottingham). Myši sa identifikovali elektronickým systémom (RS Biotech DL2000 Datalogger). V deň 10 po injekcii buniek sa myši náhodne rozdelili do kontrolnej skupiny (placebo) a do pokusných skupín:

Skupina

1:

Zlúčenina mg/kg mg/kg mg/kg

Skupina

2:

Zlúčenina mg/kg mg/kg mg/kg

Skupina

3:

Zlúčenina mg/kg sa

Lieky ukončenia terapie, buniek. Myši sa pilotnej štúdie.

aplikovali Pokus vážili mg/kg mg/kg intravenózne (i.v.) odo dňa 10 do sa ukončil v deň 40 po implantácii v pravidelných intervaloch počas

Na konci testu sa odobrala pečeň a spočítali sa viditeľné nádory pečene a zmerali sa ich plochy na reze. Nádory sa tiež vyfotografovali. Nebolo pozorované preto boli všetky nádory vyrezané tkaniva, odvážili sa a fixovali skvapalnenie nádorov a z normálneho pečeňového sa vo formaldehydovom salinickom roztoku. Peritoneálne uzly sa odobrali a zmerala sa

	··	····	• ··	··
		• ·	·· · ·	• ·
•		• ·	• ·	• ·
•		• ·	• ·	• ·
	·	•	··· ····	··

ich plocha na reze a hmotnosť. Uskutočnilo sa podrobné patologické hodnotenie nádorov.

Účinok zlúčenín 1, 2 a 5 na pečeňovú inváziu ľudského kolorektálne nádoru C170HM2 je uvedený na obr. 24.

Príklad 9

Biologické účinky zlúčeniny 13 v porovnaní so zlúčeninou 1 Prežívanie buniek

Obr. 25 znázorňuje prežívanie buniek, merané schopnosťou buniek tvoriť kolónie, pre ludské bunky karcinómu krčka maternice, NHIK 3025, po 20 hodinovej liečbe zlúčeninou 1 (o) alebo zlúčeninou 13 (·) . Bunky boli ošetrené v otvorených plastových Petriho miskách inkubovaných v C02~inkubátoroch pri teplote 37 °C. Graf hodnôt prežívania predstavuje priemerné hodnoty z 5 simultánne a podobne ošetrených misiek. Štandardné odchýlky sú uvedené na vertikálnom stĺpci vo všetkých prípadoch, keď presiahli veľkosť symbolov. Údaje ukazujú, že zlúčenina 13 indukuje približne 10-násobne silnejšiu inaktiváciu ako zlúčenina 1 pri rovnakej dávke.

Príklad 10

Biologické účinky zlúčeniny 14 v porovnaní so zlúčeninou 1 Prežívanie buniek

Obr. 26 ukazuje prežívanie buniek, merané schopnosťou buniek tvoriť kolónie, pre ludské bunky karcinómu krčka maternice, NHIK 3025, po 20 hodinovej liečbe zlúčeninou 1 (o) alebo zlúčeninou 14 (·) . Bunky boli ošetrené v otvorených plastových Petriho miskách inkubovaných v C02~inkubátoroch pri teplote 37 °C. Graf hodnôt prežívania predstavuje priemerné hodnoty z 5 simultánne a podobne ošetrených misiek. Štandardné odchýlky sú uvedené na vertikálnom stĺpci vo všetkých prípadoch, keď presiahli veľkosť symbolov. Údaje ukazujú, že tieto dve zlúčeniny majú podobný inaktivačný účinok pri všetkých koncentráciách do 12 nM.

··	····	• ··	··	•
•	• ·	·· · ·	•	•	··
•	• ·	• ·	•	•	•
•	• · ·	• ·	• ·	•	•
•	• ·	• ·	• ·	•
··	•	··· ····	··	···

Príklad 11

Biologické účinky zlúčenín 21 a 22 v porovnaní so zlúčeninami 1, 2a L-glukózou

Syntéza proteínov

Obr. 27 znázorňuje rýchlosť syntézy proteínov v bunkách ľudského karcinómu krčka maternice, NHIK 3025, meranej množstvom inkorporovaného [³H]-valínu počas pulzného obdobia 1 hodina, ktoré je zahájené bezprostredne po pridaní testovanej zlúčeniny (plné symboly) alebo o 2 hodiny neskôr (prázdne symboly). Testované zlúčeniny, zlúčenina 1 a zlúčenina 21, boli prítomné od času 0 do konca pulzov. Bunky boli vopred značené [¹⁴C]-valínom počas aspoň 4 dní preto, aby boli všetky bunkové proteíny nasýtené značkovacím činidlom. Inkorporované množstvo [³H] bolo vztiahnuté k inkorporovanému množstvu [¹⁴C] tak, že syntéza proteínov sa vypočítala ako percento z celkového množstva proteínu v bunkách. Rýchlosť syntézy proteínov je uvedená ako percento rýchlosti vzhľadom k neliečenej kontrole. Graf pre syntézu proteínov predstavuje priemerné hodnoty zo 4 simultánne a podobne ošetrených jamiek. Štandardné odchýlky sú uvedené na vertikálnom stĺpci vo všetkých prípadoch, keď presiahli veľkosť symbolov. Údaje ukazujú, že zlúčenina 1 indukuje inhibíciu syntézy proteínov, ktorá sa zvyšuje lineárne so zvyšujúcou sa koncentráciou lieku, zatiaľ čo pre zlúčeninu 21 bol pozorovaný slabý alebo žiadny účinok.

Obr. 28 znázorňuje rýchlosť syntézy proteínov v bunkách ľudského karcinómu krčka maternice, NHIK 3025, meranej množstvom inkorporovaného [³H]-valínu počas pulzného obdobia 1 hodina, ktoré je zahájené bezprostredne po pridaní testovanej zlúčeniny (plné symboly) alebo o 2 hodiny neskôr (prázdne symboly). Testované zlúčeniny, zlúčenina 2 a zlúčenina 21, boli prítomné od času 0 do konca pulzov. Bunky boli vopred značené [¹⁴C]-valínom počas aspoň 4 dní preto, aby boli všetky bunkové proteíny nasýtené značkovacím činidlom. Inkorporované množstvo [³H] bolo vztiahnuté k inkorporovanému množstvu [¹⁴C] tak, že syntéza proteínov sa vypočítala ako percento z celkového množstva proteínu v bunkách. Rýchlosť syntézy

- 65 ·· ····

··	·· ·
• ·	• ·	• e
•	• ·	•
• ·	• ·	•
•	• ·	•
• ····	• ·	···

proteínov je uvedená ako percento rýchlosti vzhľadom k neliečenej kontrole. Graf pre syntézu proteínov predstavuje priemerné hodnoty zo 4 simultánne a podobne ošetrených jamiek. Štandardné odchýlky sú uvedené na vertikálnom stĺpci vo všetkých prípadoch, keď presiahli veľkosť symbolov. Údaje ukazujú, že zlúčenina 2 a zlúčenina 22 indukujú účinnú inhibíciu syntézy proteínov približne s rovnakou úrovňou pre obidve zlúčeniny. Obidve tieto deuterizované zlúčeniny sú účinnejšie ako príslušné nedeuterizované zlúčeniny, ako je uvedené na obr. 27.

Prežívanie buniek

Obr. 29 znázorňuje prežívanie buniek, merané schopnosťou buniek tvoriť kolónie, pre ľudské bunky krčka maternice, NHIK 3025, po 20 hodinovej liečbe zlúčeninou 1 (·) alebo zlúčeninou 21 (o) . Bunky boli ošetrené v otvorených plastových Petriho miskách inkubovaných v C02~inkubátoroch pri teplote 37 °C. Graf hodnôt prežívania predstavuje priemerné hodnoty z 5 simultánne a podobne ošetrených misiek. Štandardné odchýlky sú uvedené na vertikálnom stĺpci vo všetkých prípadoch, keď presiahli veľkosť symbolov. Z kriviek dávka-odpoveď, ktoré majú pre tieto dve zlúčeniny rôzny tvar, je zrejmé, že zlúčenina 21 je účinnejšia ako zlúčenina 1 v inaktivácii buniek pri nízkych koncentráciách zlúčeniny. Rozdiel v tvare kriviek ukazuje na odlišný mechanizmus týchto dvoch zlúčenín v inaktivácii buniek.

Obr. 30 znázorňuje prežívanie buniek, merané schopnosťou buniek tvoriť kolónie, pre ľudské bunky karcinómu krčka maternice, NHIK 3025, po 20 hodinovej liečbe zlúčeninou 2 (o) alebo zlúčeninou 22 (▲) . Bunky boli ošetrené v otvorených plastových Petriho miskách inkubovaných v C02-inkubátoroch pri teplote 37 °C. Graf hodnôt prežívania predstavuje priemerné hodnoty z 5 simultánne a podobne ošetrených misiek. Štandardné odchýlky sú uvedené na vertikálnom stĺpci vo všetkých prípadoch, keď presiahli veľkosť symbolov. Zlúčenina 22 je účinnejšia ako zlúčenina 2 v inaktivácii buniek, najmä pri nízkych dávkach. Napríklad, prežívanie buniek je znížené na 50 % po ošetrení 0,5 mM zlúčeniny 22 a 4 mM zlúčeniny 2, čo

·· ···· • · · • · ·	• ·· ·· · · • ·	·· • · • ·	•
• · · ·· ·	• · ··· ····	• · ··	•

ukazuje na 8-násobne vyššiu inaktivačnú účinnosť zlúčeniny 22 v porovnaní so zlúčeninou 2 na tejto úrovni účinku. Pri 10 % prežívaní je tento rozdiel oveľa menší.

Obr. 31 znázorňuje prežívanie buniek, merané schopnosťou buniek tvoriť kolónie, pre ľudské bunky karcinómu prsníka, T47D, po 20 hodinovej liečbe L-glukózou (·) alebo zlúčeninou 21 (o). Bunky boli ošetrené v otvorených plastových Petriho miskách inkubovaných v C02-inkubátoroch pri teplote 37 °C. Graf hodnôt prežívania predstavuje priemerné hodnoty z 5 simultánne a podobne ošetrených misiek. Štandardné odchýlky sú uvedené na vertikálnom stĺpci vo všetkých prípadoch, keď presiahli veľkosť symbolov. Údaje ukazujú, že L-glukóza má slabý alebo žiadny vplyv na prežívanie pri koncentráciách až do 10 mM, čo bola najvyššia testovaná dávka. Zlúčenina 21 má tiež slabý účinok na tieto bunky pre koncentrácie do 2 mM, ale indukuje významný inaktivačný účinok pre vyššie koncentrácie a len 1 z 1000 buniek prežíva 20 hodín v prítomnosti 8 mM tejto zlúčeniny

Záver

Obidva testované deriváty L-glukopyranôzy (zlúčenina 21 a 22) inaktivujú bunky s vyššou účinnosťou ako príslušné deriváty D-glukopyranózy (zlúčenina 1 a 2). L-glukóza samotná však neindukuje žiadnu štatisticky významnú inaktiváciu buniek pri tu použitých koncentráciách. Pre benzylidénové deriváty je teda zistený lepší účinok L-glukózy v porovnaní s D-glukózou.

Príklad 12

Testovanie účinku zlúčeniny 2 na ova-senzitivované a exponované zvieratá

Samci Balb/c myší vo veku 6 týždňov boli sensibilovaní 7 i.p. injekciami 10 pg ovalbumínu v 0,5 ml salinického roztoku každý druhý deň. Za tri týždne po poslednej injekcii boli myši vystavené pôsobeniu 8 ovalbumínových (2 mg/ml) alebo 8 salinických aerosólov v nasledujúcich dňoch, v dávke 1 aerosól za deň na 5 minút. Dva dni pred prvou injekciou ovalbumínu alebo salinického roztoku sa zahájila liečba zlúčeninou 2, v dávke 5 mg na kg a deň i.p., počas 10 dní, a deviatim ·· ···· · ·· ·· • e · ······· • · · · · · · zvieratám sa aplikoval ovalbumín a deviatim zvieratám sa aplikoval salinický roztok a kontrolnej skupine sa aplikoval salinický roztok. 24 hodín po poslednej expozícii sa in vivo merala hyperreaktivita dýchacích ciest v reakcii na metacholín s použitím BUXCO prístroja. Po meraní v BUXCO sa myši usmrtili, pľúca sa vypláchli a izolované bunky sa premyli, spočítali sa a diferencovali sa. Odobrala sa krv na izoláciu séra na stanovenie koncentrácie celkových a ova-špecifických IgE. Hrudné lymfatické uzliny sa izolovali z paratracheálnej a parabronchiálnej oblasti na stanovenie IFN-γ, IL-4, IL-5 a IL12. V pokuse sa použilo 9 zvierat na skupinu.

Počet buniek (obr. 32) u muší liečených salinických roztokom alebo senzibilizovaných ovalbumínom nebol ovplyvnený liečbou zlúčeninou 2 a nebol pozorovaný rozdiel v počte makrofágov, lymfocytov alebo eozinofilov medzi dvomi skupinami.

Prekvapujúco sa zistilo, že migrácia neutrofilov bola inhibovaná liečbou zlúčeninou 2 (obr. 33). Počet neutrofilov v laváži pľúc bol rovnaký pre kontrolnú skupinu a pre ovalbumínom senzibilizované zvieratá liečené zlúčeninou 2, zatiaľ čo počet neutrofilov sa zvýšil u zvierat senzibilizovaných ovalbumínom liečených salinickým roztokom.

Podľa znalostí autorov vynálezu, nemá žiadny liek tento účinok. Inhibícia migrácie neutrofilov môže mať značný význam v medicíne, pretože poškodenie tkaniva spôsobené lyzozomálnymi enzýmami uvoľnenými z neutrofilov sa pokladá za značne významné u pľúcneho emfyzému (tiež indukovaného fajčením), chronickej astmy, zápalových črevných ochorení (ako je morbus Crohn a colitis ulcerosa), reumatoidnej artritídy a podobných imunologických ochorení. Ide o veľmi prekvapujúce zistenie. Závery

Benzaldehydové deriváty podľa predkladaného vynálezu reagujú s istými skupinami na povrchu buniek, napríklad s voľnými aminoskupinami a vytvárajú Schiffove bázy. Pretože veľa bunkových pochodov, ako je syntéza proteínov, bunkový cyklus, imunitná reakcia atď., je riadených z povrchu buniek, mení taká väzba správanie sa buniek. Preukázalo sa, že ·· ····

- 68 benzaldehydový komplex na povrchu buniek mení adhézne charakterisitky buniek. V pokusoch sa preukázalo, že zlúčeniny podía predkladaného vynálezu môžu slúžiť ako nová terapia nádorov, autoimunitných ochorení, vírusových infekcií a možno tiež infekcií inými mikroorganizmami.

Bolo zistené, že hexozové deriváty benzaldehydov sú prekvapujúco účinnejšie ako deriváty iných karbohydrátov v liečbe nádorov niektorých orgánov, ako sú nádory obličiek, pečene a pľúc. Predpokladáme, že tento jav súvisí s afinitou receptorov týchto orgánov k sacharidovým skupinám derivátov.

Podanie

Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sa môžu podávať pri liečbe nádorov, vírusových ochorení a pri liečbe chorôb vyvolaných abnormálne zvýšenou proliferáciou buniek a/alebo na potlačenie autoimunitných chorôb. Uvedené farmaceutické prostriedky sa môžu tiež podávať ako zosilňovače imunity.

Na vyššie uvedený účel sa môžu zlúčeniny všeobecného vzorca (I) podávať pacientovi v akejkoľvek vhodnej forme, buď samotné alebo v zmesi s farmaceutický prijateľnými nosičmi alebo adjuvantnými prostriedkami.

Predovšetkým vhodné sú prípravky na systémovú terapiu buď vo forme prípravkou na orálne podanie alebo na parenterálne podanie.

Vhodné prípravky na enterálne podanie zahŕňajú tablety, tobolky, napríklad mäkké alebo tvrdé granule, zrnené prášky alebo prášky, roztoky alebo čapíky. Uvedené liekové želatínové tobolky, sirupy, suspenzie, formy sa pripravia spôsobmi známymi v odbore zmiešaním jednej alebo zlúčenín všeobecného vzorca (I) s jedným alebo viacerých viacerými netoxickými, inertnými, tuhými alebo tekutými nosičmi.

Vhodné prípravky na parenterálne podanie s obsahom zlúčenín všeobecného vzorca (I) zahŕňajú injekčné alebo infúzne roztoky.

Na topické podanie sa môžu zlúčeniny všeobecného vzorca (I) podávať vo forme omývacieho prostriedku, masti, krému, gélu, tinktúry, spreja alebo podobného prípravku, kde uvedené ·· ·· ···· • · · • · · ·· • · • · • ···· • · ·· prípravky obsahujú zlúčeniny všeobecného vzorca (I) v zmesi s netoxickými, inertnými, tuhými alebo tekutými nosičmi, obvykle používanými na topické prípravky. Predovšetkým vhodné je použitie prípravku, v ktorom je účinná zložka chránená voči vzduchu, vode a podobne.

Uvedené prípravky môžu obsahovať inertné alebo farmakodynamické aktívne prísady. Tablety alebo granule môžu napríklad obsahovať rôzne spojivá, plnivá, nosiče a/alebo riedidlá. Tekuté prípravky môže byť napríklad vo forme sterilného roztoku. Tobolky môžu obsahovať okrem aktívnej zložky tiež plnivo alebo zahusťovací prostriedok. Ďalej sa môžu použiť aditíva na zlepšenie chuti a vône a tiež prísady obvykle používané ako konzervačné prostriedky, stabilizačné prostriedky, prostriedky na zachytenie vlhkosti a emulgátory, soli na ovplyvnenie osmotického tlaku, pufre a ďalšie aditíva.

Dávky prípravku určené na podanie môžu kolísať v závislosti na indikácii, spôsobe použitia a spôsobe podania, a tiež na požiadavkách pacienta. Obvyklá denná dávka na systémovú terapiu priemerného dospelého pacienta je asi 0,01 až 500 mg/kg telesnej hmotnosti, podávaná jedenkrát alebo dvakrát denne, výhodne je asi 0,5 až

100 mg/kg telesnej hmotnosti, podávaná jedenkrát alebo dvakrát najvýhodnejšie je asi 1 až 20 mg/kg telesnej podávaná jedenkrát alebo dvakrát denne.

denne, a hmotnosti,

Ak je to žiadúce, môže zlúčeniny všeobecného vzorca prostriedok ako je tokoferol, liečivý prípravok s obsahom (I) obsahovať antioxidačný N-metyl-tokoferamín, butylhydroxyanizol, kyselinu askorbovú alebo butylhydroxytoluén.

·· • 9 9 • · • · ·

UISŤ.

Claims (4)

PATENTOVÉ NÁROKY

1) Odkazy sa vzťahujú k nasledujúcim dokumentom:

Dl: Int. J. Oncol. , 2(1) 1993, str. 61-66 D2: EP-A2-0283139, D3: EP-A215295, D4: EP-A2-0166443, D5: US-A2-4882314 (nie je uvedené v ISR).

1 1 OJ rxi • • • P P •o •o c e '5 «9 0 0 «Η rH x. N N □ O B

c Ό * (0 0 <—< P X N 0 N P

·· ···· • ·· ·· · • • • ·· · · · • ·· • • • • · · • • • • • · • · · · • • • • • • · · • • ·· • ··* ··<· ·· ···

33/33 u > H ·Η N -P C H <V N <0 C φ Φ C U)

Obr.33 in ó

(f,0T X) xaxunq qeood i

·· ···· • ·· ·· • • · · ·· · · · · ·· • · · • · · · • · · · • · · · · • • • · · ·· · • · · · ··· ···· ·· • • •B

Správa o medzinárodnom predbežnom prieskume

V. Hodnotenie podlá či. 35(2), ktoré sa týka novosti, vynálezcovského kroku a priemyselnej využiteľnosti; citácie a vysvetlenia podporujúce také hodnotenie.

1, 20 h

13, 20 h

Obr.25

·· ···· • ·· • a • • • ·· · · • • • • ¹ · • · • • • • • · • · f • • • • • • · • *· ·· • ··· ···· ··

26/33 prežívajúce frakcie zlúčenina 1, 20 h zlúčenina 14, 20 h

Obr.26 ·· ···· • · · ·· ·· • · rýchlosť syntézy proteínu (% kontroly) • · ·· · • ···· • · ·· · zlúčenina 1, 0 až 1 h —O- zlúčenina 1, 2 až 3 h _A zlúčenina 21, o až 1 h -Δ-zlúčenina 21, 2 až 3 h ·· ···· · ·· ·· • t · ······· • · · · · · · • · · · · · · • ··· ···· ·· ··· rýchlosť syntézy proteínu (% kontroly)

28/33 zlúčenina zlúčenina zlúčenina zlúčenina

-· 1,5 mM zlúčenina 8

• ·· ·· · ·· · · • • ·· • · • • • · • · • 1 ₉ • · • • • ··· ···· ·· ···

Obr. 7 ww·» ·· aaaa • · · • · · • · · · • · · ·· ·

• ·· ·· a ·· · · • e ae • · a • • • · · • ·· ··· ···· a a aa e a aaa

Obr. 8 ·· ···· ··

9/33

Obr. 9 ·· ···· · ·· · · »1 . · , • · · ······ ··· · ···»-.

• · · ·· ··· ·· · ··· ···· ·· ···

10/33

Obr.10

Obr.11 ·· ···· ·· • · • · • ···· ··

12/33

Obr.12

13/33

·· • • ····, • · • · • ·· ·· · · • · ·· • · • · • • · • • ·· • · • • · ··· ···· • · ·· • • ···

kontrola

-Α,-zlúčenina 8, 0,1 (mM)

-Y-zlúčenina 8, 1,0 (mM) hodiny po začiatku liečby

Obr.13

Obr.14

H 0 ω Cd ' 0 Φ φ Φ N N N «Λ M0 Ή <H 0 0 0 > + + + cn cn dl dl Pí a a ω (0 m M M k Q) Φ φ •H •rd •rd •d tí (0 <0 <0 •r» n m Φ Φ Φ H rd •rd U o υ X x x <0 tí <0 b M h H-t a O □ 1 1 1 t

15/33 xsxunq exoxejj ·· ···· • · • · · • · · ·· ·

C •H C Φ •υ rd N (O rd o '(0 M P C Φ □ C o X • ·· ·· · · • · • · ··· ····

Obr ./15 ·· • · · • · • · ·· · ·· ···· • · · • · · ·· • · ·· • · · • ·

rd N 0 w 0 Φ N Φ N Φ N 16/33 •Λ •Λ M0 <M <M 0 O O > > > + + + M 0 m tí tí Pí tí Qa Ba ω (0 (A M k k <u Φ Φ •rM •ri •H u 0 •o (C to <0 •o o •m 0) <V Φ •rl •H •H o o U * (0 (0 <0 L h L <M «Μ a O c 1 □ 1 1 <?

• · · ·· · • · ·· ·

Obr. 16 xaxunQ ·· ···· · ·· ·· ·· · ······· • · · · · · · ··· · · ··· ·· · ··· ···· ·· ··· rl T-47D bunky. 24 h

T-47D bunky, 48 h r4 o

Obr.18

XSTunq stoxbjtj

·· ···· • ·· ·· • · · ·· · · • · · • · · • · • · • · · , · · • · · ·· · ··· «··· ’· ·· a

syntéza proteínu (% kontroly) koncentrácia zlúčeniny 8 (mM)

Obr.19

·· ···· • ·· ·· • • · ·· e · • • ·· • • · • · • · • • · .·· • • «· · ··· ···· ·· ··

syntéza proteínu (% kontroly).

1 mg/kg

7.5 mg/kg dni po prvej injekcii

Obr. 6

I

7/33 ·· ···· • · · • · · • · · · • · · ·· ·

1/33 prežívajúce frakcie .q. zlúčenina 8, 20 h

-·- zlúčenina 9, 20 h koncentrácia (mM)

Obr.l

1. Použitie derivátu benzaldehydu všeobecného vzorca (I) :

(I) kde L znamená H alebo D;

Ar znamená fenylovú skupinu alebo fenylovú skupinu substituovanú 1 až 3 substituentami, ktoré môžu mať rovnaký alebo rôzny význam, a znamenajú skupinu zvolenú zo skupiny, ktorá zahŕňa alkyl s obsahom 1 až 20 atómov uhlíka, cykloalkyl s obsahom 3 až 6 atómov uhlíka, fluóralkyl s obsahom 1 až 6 atómov uhlíka, alkenyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlíka, alkynyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlíka, fenyl, halogén, nitro, kyano, NH₂, NHR¹, N (R¹) 2, NHCfOJR¹ alebo NlCÍO^h, kde R¹ má rovnaký alebo rôzny význam a znamená alkylovú skupinu s obsahom 1 až 20 atómov uhlíka alebo fluóralkylovú skupinu s obsahom 1 až 6 atómov uhlíka, OR² alebo OC(O)R², kde R² znamená H, D, alkylovú skupinu s obsahom 1 až 20 atómov uhlíka alebo fluóralkylovú skupinu s obsahom 1 až 6 atómov uhlíka, SR², CA(OR¹)2 alebo CA [OC (O) R¹] 2, kde A znamená H alebo D, C (O) R², COOR³, kde R³ znamená H alebo alkylovú skupinu s obsahom 1 až 20 atómov uhlíka, alebo fluóralkylovú skupinu s obsahom 1 až 6 atómov uhlíka alebo CON(R³)₂, kde R³ má rovnaký alebo rôzny význam;

Y znamená atóm alebo skupinu zvolenú zo skupiny, ktorá zahŕňa

H, D, alkyl s obsahom 1 až 20 atómov uhlíka, cykloalkyl s obsahom 3 až 6 atómov uhlíka, fluóralkyl s obsahom 1 až 6 ·· ·· ·· ···· • · • · · • · · • · atómov uhlíka, alkenyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlíka, alkynyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlíka, fluór, chlór, nitro, OR², OC(O)R², SR², NH2, NHR¹, N (R¹) 2/ kde R¹ má rovnaký alebo rôzny význam, NHCfOJR¹ alebo N[C(O)R¹]2, kde R¹ má rovnaký alebo rôzny význam.

R znamená skupinu zo skupiny, ktorá zahŕňa H, D, alkyl s obsahom 1 až 20 atómov uhlíka, cykloalkyl s obsahom 3 až 6 atómov uhlíka, fluóralkyl s obsahom 1 až 6 atómov uhlíka, alkenyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlíka, alkynyl s obsahom 2 až 6 atómov uhlíka;

s výhradou, že vylúčené sú 4,6-O-benzylidén-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(benzylidén-di)-D-glukopyranóza, 4,6-benzylidén-D-alóza a deriváty 4,6-benzylidén-D-alózy, alebo akéhokolvek jeho stereoizoméru alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu nádorového ochorenia.

- 2 ·· ···· • ·· ·· ·· · · · · • · · · • · · · · • · · · ··· ···· ·· ·· ···

2.1 Nároky 1 až 18 sú nové z nasledujúcich dôvodov (čl. 33(2)

PCT) :

- Dokument Dl sa týka len farmakokinetiky 4,6-benzylidén-Dglukózy a 4,6-benzylidén-di-glukózy (zlúčeniny 1 a 2) .

Dokument D2 uvádza použitie zlúčenín 1 a 2 ako protinádorových prostriedkov a/alebo prostriedkov na liečbu chorôb, ktoré vznikajú z abnormálne zvýšenej proliferácie buniek.

Dokumenty D3 a D4 uvádzajú použitie retardáciu a redukciu kachexie a resp.

zlúčeniny 2 na na zmierňovanie bolesti.

- Dokument D5 uvádza použitie 4,6-benzylidén-D-glukózy ako karcinostatického prostriedku.

Z dokumentov nie je možné zistiť, že by zlúčeniny 1 a 2 mohli byť tiež vhodné na iné druhy liečby tak, ako sú uvedené v predloženej prihláške, a o zlúčeninách všeobecného vzorca (I) a ich použití ako liečiv nie je v doterajšej odbornej literatúre žiadna zmienka s výnimkou presne špecifikovaného použitia zlúčenín 1 a 2 ako protinádorových prostriedkov a/alebo prostriedkov na liečbu chorôb, ktoré pochádzajú z nadmerne zvýšenej proliferácie buniek, ktoré sú však z rozsahu príbuzných nárokov vybraté.

2) Novosť (čl. 33(2) PCT)

2, 0 až 1 h 2, 3 až 4 h

22, 0 až 1 h

22, 3 až 4 h

Obr .28

·· • · ···· • • ·· ·· ·· · · · t • • · • • · • · • • · : · · · · • · · · • • • · ·· • . · ··· ···· ·· > · ···« ···

29/33 prežívajúce frakcie zlúčenina 1, 20 h zlúčenina 21, 20 h

Obr.29 ·· ···· prežívajúce frakcie v

30/33 ·· ·· · ·: · : : : ’·

..........

zlúčenina 2, 20 h zlúčenina 22, 20 h

Obr.30

·· ···· • ·· ·· • • • · ·· · · • · ·· • • · • · • · • • • · • ·’» • · • ·· · ·<>_«··· ···

31/33

L-glukóza, 20 h zlúčenina 21, 20 h

Obr.31

CO quad

2,5 mM zlúčenina 8 čas liečby (h)

Obr.20

·· ···· • · · • · · • ·· ·· · · • · ·· • · • · • e • · · • · • · ·· · ··· ···· ·· ··

21/33 hodiny

Obr.21 ·· ···· • · · · • · · ·· ·· • · · · · • · · • · · ·· · • · · · · ··· ···· ··* ··· lAldO

·· ···· • ·· ·· • • • • ·· • · • • ·· • • • • • • • • • • • · • • • · . • • • • • • • ·**- • • ·· • ··· ···· ·· ···

23/33 *<1> c (0 > o Ai •H

C Ή Φ C 'Φ C <0 > o A! •H

C H myši infikované Friendovým vírusom erytroleukémie (3ui) Áuizajs ijsoujoinq ireipsui i

stredná plocha priečneho rezu nádoru pečene

24/33 skupina

Obr. 24 ·· ···· · ·· ·· • · · ···· ··· • · · · · · · • · · · · · · · ·· · ··· ···· ·· ···

25/33 prežívajúce frakcie zlúčenina zlúčenina

2/33 ·· ····

• • • • • • • • • • · • • • ·· • •

·· e· · • · • .· ·· • • • · • · • • • · • • ···· ·· • ···

prežívajúce frakcie zlúčenina 5, zlúčenina 7,

20 h

20 h

Obr .2

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dgalaktopyranózu,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-manopyranózu,

4.6- 0-(2-acetoxybenzylidén)-D-glukopyranózu,

4.6- 0-(2,3-dihydroxybenzylidén)-D-glukopyranózu, alebo jej zodpovedajúce izoméry s L-cukrovou zložkou, alebo jej farmaceutický prijateľná soľ.

·· ··

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranózu,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dglukopyranózu,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranózu,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranózu,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranózu,

4.6- 0-(benzylidén-di)-D-galaktopyranózu,

4.6- 0-(benzylidén-di)-D-manopyranózu,

4.6- 0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranózu,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranózu,

2-acetamido-4,6-0- (benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranózu,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dgalaktopyranózu,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-manopyranózu,

4.6- 0-(2-acetoxybenzylidén)-D-glukopyranózu, a/alebo

4.6- 0-(2,3-dihydroxybenzylidén)-D-glukopyranózu, alebo jej zodpovedajúce izoméry s L-cukrovou zložkou, alebo jej farmaceutický prijatelná soľ.

16. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje benzaldehydový derivát podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov a farmaceutický prijateľný nosič, riedidlo a/alebo prísadu.

17. Spôsob prípravy farmaceutického prostriedku, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa stupeň, v ktorom sa spojí derivát *··’ •ZMENENT’LIST * benzaldehydu podía ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov s farmaceutický prijateľným nosičom, riedidlom a/alebo prísadou.

18. Derivát benzaldehydu, ktorým je zlúčenina zo skupiny zahŕňajúcej

4.6- 0-(benzylidén-di)-2-deoxy-D-glukopyranózu,

4.6- 0-(4-karbometoxybenzylidén)-D-glukopyranózu,

4.6- 0-benzylidén-2-deoxy-D-glukopyranózu,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranózu,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dglukopyranózu,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranózu,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranózu,

2-acetamido-4,6-0-benzylidén-2-deoxy-a-D-galaktopyranózu,

4.6- 0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranózu,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranózu,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranózu,

4.6- 0- (benzylidén-di) -D-galaktopyranózu,

4.6- 0- (benzylidén-di) -D-manopyranózu,

2-acetamido-4,6-0- (benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranózu,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dgalaktopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-manopyranóza,

4.6- 0-(2-acetoxybenzylidén)-D-glukopyranóza, a/alebo

4.6- 0-(2,3-dihydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza, alebo jej zodpovedajúce izoméry s L-cukrovou zložkou, alebo jej farmaceutický prijateľná soľ, na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu autoimunitných chorôb ako je reumatoidná artritída, psoriáza, psoriatická artritída, lupus erythematodes, akné, Bechterovova artritída, progresívna systémová skleróza (PSS), seborrhoea a ďalšie autoimunitné choroby ako je ulcerózna kolitída a Crohnova choroba.

14. Použitie podľa nároku 12 alebo 13, 4,6-0-benzylidén-L- glukopyranózy a/alebo 4,6-0-(benzylidén-di)-L-glukopyranózy alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu autoimunitných chorôb ako je reumatoidná artritída, psoriáza, psoriatická artritída, lupus erythematodes, akné, Bechterovova artritída, progresívna systémová skleróza (PSS), seborrhoea a ďalšie autoimunitné choroby ako je ulcerózna kolitída a Crohnova choroba.

15. Derivát benzaldehydu, ktorý je vhodný ako liečivý prípravok a ktorým je zlúčenina zo skupiny, ktorá zahŕňa:

• · ·· ‘ZMENENÍ*’LlStC *

4.6- 0-benzylidén-D-galaktopyranózu, metyl-4,6-0-benzylidén-a-D-manopyranozid,

4.6- 0- (benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranózu,

4.6- 0-(4-karbometoxybenzylidén)-D-glukopyranózu,

4.6- 0-benzylidén-2-deoxy-D-glukopyranózu,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén) -Dglukopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

2-acetamido-4,6-0-benzylidén-2-deoxy-a-D-galaktopyranóza,

4.6- 0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0- (benzylidén-di) -D-galaktopyranóza, ’··’ ^MENENT’LIST

4.6- 0-(benzylidén-di)-D-manopyranóza,

2-acetamido-4,6-0- (benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4, 6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dgalaktopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-manopyranóza,

4.6- 0-(2-acetoxybenzylidén)-D-glukopyranóza, a/alebo

4.6- 0-(2,3-dihydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza, alebo jej zodpovedajúce izoméry s L-cukrovou zložkou, alebo jej farmaceutický prijateľná sol, na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu chorôb, ktoré majú pôvod v nadmerne zvýšenej proliferácii buniek.

11. Použitie podľa nároku 9, 4,6-0-benzylidén-L-glukopyranózy a/alebo 4,6-0-(benzylidén-di)-L-glukopyranózy alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu chorôb, ktoré majú pôvod v nadmerne zvýšenej proliferácii buniek.

12. Použitie derivátu benzaldehydu všeobecného vzorca (I) alebo akéhokoľvek jeho stereoizoméru alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli, na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu autoimunitných chorôb ako je reumatoidná artritída, psoriáza, psoriatická artritída, lupus erythematodes, akné, Bechterovova artritída, progresívna systémová skleróza (PSS), seborrhoea a ďalšie autoimunitné choroby ako je ulcerózna kolitída a Crohnova choroba.

13. Použitie podľa nároku 12, kde uvedená zlúčenina je

4.6- 0-benzylidén-D-galaktopyranóza, metyl-4,6-0-benzylidén-a-D-manopyranozid,

4.6- 0- (benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(4-karbometoxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0-benzylidén-2-deoxy-D-glukopyranóza,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza, ·· ···· · ·· ·· ·· · ·· · · ··· • · · · · · ·

- 76 ’··’ •ZMENENÍ*‘LIST *^:*

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dglukopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

2-acetamido-4,6-0-benzylidén-2-deoxy-a-D-galaktopyranóza,

4.6- 0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(benzylidén-di)-D-galaktopyranóza,

4.6- 0- (benzylidén-di) -D-manopyranóza,

2-acetamido-4,6-0- (benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dgalaktopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-manopyranóza,

4.6- 0-(2-acetoxybenzylidén)-D-glukopyranóza, a/alebo

4.6- 0-(2,3-dihydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza, alebo jej zodpovedajúce izoméry s L-cukrovou zložkou, alebo jej farmaceutický prijatelná sol, na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu infekcií vyvolaných mikroorganizmami ako sú vírusy, prvoky, huby a ďalšie, cestou alterácie imunitného systému.

·· ···· · ·· ·· · ·· · ········ ··· · ···· • · · · · ····· *··* ‘ZMENENÝ·LIST ·^:·

8. Použitie podľa nároku 6 alebo 7, 4,6-0-benzylidén-L-glukopyranózy a/alebo 4,6-0-(benzylidén-di)-L-glukopyranózy alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu infekcií vyvolaných mikroorganizmami ako sú vírusy, prvoky, huby a ďalšie, cestou alterácie imunitného systému.

9. Použitie derivátu benzaldehydu všeobecného vzorca (I) alebo akéhokoľvek jeho stereoizoméru alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli s výhradou, že uvedeným derivátom nie je 4,6O-benzylidén-D-glukopyranóza a 4,6-0-(benzylidén-di)-Dglukopyranóza, na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu chorôb, ktoré majú pôvod v nadmerne zvýšenej proliferácii buniek.

10. Použitie podľa nároku 9, kde uvedená zlúčenina je

4.6- 0-benzylidén-D-galaktopyranóza, metyl-4,6-0-benzylidén-a-D-manopyranozid,

4.6- 0- (benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(4-karbometoxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0-benzylidén-2-deoxy-D-glukopyranóza,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dglukopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

2-acetamido-4,6-0-benzylidén-2-deoxy-a-D-galaktopyranóza,

4.6- 0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(benzylidén-di)-D-galaktopyranóza,

4.6- 0-(benzylidén-di)-D-manopyranóza,

2-acetamido-4,6-0- (benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dgalaktopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-manopyranóza,

4.6- 0-(2-acetoxybenzylidén)-D-glukopyranóza, a/alebo

4.6- 0-(2,3-dihydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza, alebo jej zodpovedajúce izoméry s L-cukrovou zložkou, alebo jej farmaceutický prijateľná soľ, na prípravu liečivého prostriedku na preventívnu liečbu nádorových ochorení vyvolaných vírusmi ako sú vírusy hepatitídy B a C, onkogénne papilloma vírusy a ďalšie onkogénne vírusy.

6. Použitie derivátu benzaldehydu všeobecného vzorca (I) alebo akéhokoľvek jeho stereoizoméru alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli, na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu infekcií vyvolaných mikroorganizmami ako sú vírusy, prvoky, huby a ďalšie, cestou alterácie imunitného systému.

7. Použitie podľa nároku 6, kde uvedenou zlúčeninou je ·· ···· · ·· ·· · ·· · ········ ··· · ···· ··· · · ····· *··’ *zmenenť**lisť ·^:·

4.6- 0-benzylidén-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(benzylidén-di) -D-glukopyranóza,

4.6- 0-benzylidén-D-galaktopyranóza, metyl-4,6-0-benzylidén-a-D-manopyranozid,

4.6- 0-(benzylidén-di)-2-deoxy-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(4-karbometoxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0-benzylidén-2-deoxy-D-glukopyranóza,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dglukopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

2-acetamido-4,6-0-benzylidén-2-deoxy-a-D-galaktopyranóza,

4.6- 0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0- (benzylidén-di) -D-galaktopyranóza,

4.6- 0- (benzylidén-di) -D-manopyranóza,

2-acetamido-4,6-0- (benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dgalaktopyranóza,

4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-manopyranóza,

4,6-0-(2-acetoxybenzylidén)-D-glukopyranóza, a/alebo

4,6-0-(2,3-dihydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza, alebo jej izoméry s L-cukrovou zložkou, alebo jej farmaceutický prijateľné soli, na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu nádorového ochorenia.

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-Dglukopyranóza,

4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-galaktopyranóza,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza ·· ·· • 9 9

9 9 9 ·· ···· • · · · • · · ’··’ ’ZMENÉNT'LISŤ ·

2-acetamido-4,6-0-benzylidén-2-deoxy-a-D-galaktopyranóza,

4.6- 0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(2-hydroxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzylidén)-D-glukopyranóza,

4, 6-0-(benzylidén-di) -D-galaktopyranóza,

4.6- 0-(benzylidén-di)-D-manopyranóza,

2-acetamido-4,6-0- (benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranóza,

2. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1, kde uvedenou zlúčeninou je

4.6- 0-benzylidén-D-galaktopyranóza, metyl-4,6-O-benzylidén-a-D-manopyranozid,

4.6- 0-(benzylidén-di)-2-deoxy-D-glukopyranóza,

4.6- 0-(4-karbometoxybenzylidén)-D-glukopyranóza,

4.6- 0-benzylidén-2-deoxy-D-glukopyranóza,

3.8 Nárok 13

Ako je v predloženej prihláške uvedené (str. 7 1.16-22), z patentovej prihlášky UK 9026080.3 je známe, že benzaldehydové ·· ···· · ·· ·· ·· · ······· • · · · · · e • · · · · ··· ·· · ··· ···· ·· ··· zlúčeniny už skôr známe ako protinádorové prostriedky sa môžu tiež použiť na potlačenie chorôb, ktoré vznikajú následkom abnormálne zvýšenej proliferácie buniek, napríklad psoriázy alebo reumatických chorôb.

Problém riešený nárokom 13 je poskytnúť alternatívne benzaldehydové deriváty na liečbu uvedených chorôb.

V D2 sa uvádza, že 4,6-benzylidén-D-glukóza a 4,6-benzylidéndi-D-glukóza vykazujú inaktivačný účinok na bunky a tiež inhibičný účinok na syntézu proteínu (tabulky 7 a 8, str. 1617), kde uvedené zlúčeniny vedú k antiproliferačnému účinku. Avšak použitie zlúčení opísaných v nároku 13 nie je v D2 navrhované. Vzhladom na to sa predmet vynálezu v nároku 13 zdá ako obsahujúci vynálezcovský krok (čl. 33(3) PCT).

3.7 Nároky 6 až 8

V doterajšej literatúre odboru neboli zistené žiadne zmienky o použití citovaných benzaldehydových derivátov podľa nároku 6 až 8 na prevenciu a/alebo liečbu infekcií alteráciou imunitného systému.

Uvedené nároky sa zdajú ako obsahujúce vynálezcovský krok (čl. 33(3) PCT).

3.6 Nároky 4 a 5

V dokumente D5, ktorý je možné pokladať za najbližší, pokiaľ ide o predmet nárokov 4 a 5, sa uvádza:

prostriedok, s obsahom 4,6-O-benzylidén-D-glukopyranózy, ktorý je účinný proti malígnym prejavom indukovaným onkogénnym vírusom SV40 (nárok 1) . Predmet nárokov 4 a 5 predloženého vynálezu sa líši v tom, že sa podľa nich používa iný derivát benzaldehydu ako je 4,6-O-benzylidén-D-glukopyranóza, ako súčasť preventívnej liečby nádoru, ku ktorému dochádza indukciou onkogénnym vírusom. K predmetu vynálezu podľa nárokov 4 a 5 je možné z D5 dospieť až po dvoch stupňoch. Nároky 4 a 5 sa preto pokladajú za obsahujúce vynálezcovský krok (čl. 33(3) PCT).

3.5 Nároky 3, 11 a 14

Rovnako ako nároky 1 a 2, 9 a 10 a 12 a 13 uvedené nároky 3, 11 a 14 riešia problém poskytnúť alternatívne benzaldehydové deriváty vhodné ako protinádorové prostriedky alebo ako prostriedky vhodné proti nadmernej proliferácii buniek. Na obr. 29 a 30 je znázornené, že zlúčeniny podía uvedených nárokov, 4,6-O-benzylidén-L-glukopyranóza a 4,6-O-benzylidéndi-glukopyranóza, sú účinnejšie ako ich známe D-izoméry v inaktivácii buniek. To je možné pokladať za nečakaný výsledok, a z tohto dôvodu sa nároky 3, 11 a 14 zdajú ako nároky zahŕňajúce vynálezcovský krok (čl. 33(3) PCT).

3.4 Nároky 16 a 17

Použitie zlúčenín všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 nebolo posúdené ako zahŕňajúce vynálezcovský krok viď. (3.1). Preto nadväzujúce farmaceutické prostriedky a spôsoby prípravy tiež nezahŕňajú vynálezcovský krok.

Nároky zahŕňajúce vynálezcovský krok.

3.3 Nárok 12

Ako je v predloženej prihláške uvedené (str. 7 1.16-22), z patentovej prihlášky UK 9026080.3 je známe, že benzaldehydové zlúčeniny skôr známe ako protinádorové prostriedky, sa môžu tiež použiť na potlačenie chorôb, ktoré vznikajú následkom abnormálne zvýšenej proliferácie buniek, napríklad psoriázy alebo reumatických chorôb.

Problém riešený nárokom 12 je poskytnúť alternatívne benzaldehydové deriváty na liečbu uvedených chorôb.

V D2 sa uvádza, že 4,6-benzylidén-D-glukóza a 4,6-benzylidéndi-D-glukóza vykazujú inaktivačný účinok na bunky a tiež inhibičný účinok na syntézu proteínu (tabuľky 7 a 8, str. 16 a 17), kde uvedené účinky vedú k antiproliferačnému účinku. Pokiaľ pracovník v odbore spojí poznatky z UK patentovej prihlášky 9026080.3 s D2 dospeje k riešeniu podľa nároku 12.

Z vyššie uvedených dôvodov predmet vynálezu podľa nároku 12 nezahŕňa vynálezcovský krok (čl. 33(3) PCT).

3.2 Nároky 9 a 10

Je známe, že deriváty benzaldehydu vykazujú inhibičný účinok na syntézu proteínu v bunkách, z čoho vyplýva ich vhodnosť na

·· ···· * ·· ·· • • · • ·· · · · · ·· • · • • · ! í • • · • · • · · · • • · ·· • • • · · · ··· ···· ·· • ···

liečbu nádorov alebo chorôb vyvolaných nadmernou proliferáciou buniek. Tento účinok je dokumentovaný pre 4,6-O-benzylidén-Dglukózu a 4,6-benzylidén-di-D-glukózu v dokumente D2 (tabuľky 7 a 8, str. 16 a 17).

Problém riešený nárokmi 9 a 10 je poskytnúť alternatívne benzaldehydové deriváty na liečbu chorôb, ktoré vznikajú z nadmernej proliferácie buniek. Ako je uvedené v paragrafe 3.1, zlúčeniny podľa nárokov 9 a 10 sú veľmi blízke 4,6-0benzylidén-D-glukóze, takže nezahŕňajú žiadny vynálezcovský krok pri prihliadnutí na ich použitie na liečbu chorôb, ktoré majú pôvod v nadmerne zvýšenej proliferácii buniek.

V prípade absencie nejakého neočakávaného účinku, nároky 9 a 10 nespĺňajú požiadavky čl. 33(3) PCT.

3.1 Nároky 1 a 2, 15 a 18

Zlúčeniny, ktoré zahŕňajú 4,6-benzylidén-D-glukózu a jej deuterovaný analóg,

4,6-benzylidén-di-D-glukózu, sú v odbore známe ako protinádorové prostriedky (viď. napríklad Dl:

abstrakt, 1.1-3; D2: nárok 2; D3: str. 21.1-3; str. 1 1.1-4; D5: nárok 1) . Problém riešený nárokmi 1 a 2, 15 a 18 je poskytnúť alternatívne benzaldehydové deriváty ako protinádorové prostriedky a/alebo ako terapeutické prostriedky. Benzaldehydové deriváty vzorca (I) uvedené v nároku 1 majú rovnaké zloženie kruhu ako 4,6-benzylidén-D glukózy. Okrem toho niektoré zlúčeniny v rámci zlúčenín všeobecného vzorca (I) sú veľmi blízke 4,6-benzylidén-D glukóze, napríklad líšia sa len v tom, že majú ako substituent metylovú skupinu namiesto vodíka. Preto by im skúsený pracovník v odbore aj s prihliadnutím na rovnaké použitie ako protinádorových liečiv, neprisúdil vynálezcovský krok. Rovnaké dôvody sa môžu použiť pri posudzovaní nárokov 2, 15 a 18, v ktorých sa uvádzajú špecifické uskutočnenia zlúčenín všeobecného vzorca (I), a ktoré tiež vykazujú štruktúry veľmi blízke 4,6-benzylidén-D-glukóze, napríklad zlúčenina 11 (str. 65, 1.17 a str. 71 1.3 a 1.31), ktorá je deuterovaný stereoizomér.

Okrem prípadu výskytu nejakého neočakávaného účinku teda nároky 1 a 2, 15 a 18 nespĺňajú požiadavky čl. 33(3) PCT.

Okrem toho, so zohľadnením skutočnosti, že cukrová zložka je rozhodujúca pre selektívny profil každého navrhovaného liečiva a že obmena substituentov a/alebo trojrozmernej štruktúry cukrového kruhu môže úplne zmeniť väzbovú silu na bunkové receptory, vyplýva, že účinnosť zlúčenín všeobecného vzorca (I) by mala byť uvedená pre každú zlúčeninu samostatne na uspokojenie požiadaviek na vynálezcovský krok.

3) Vynálezcovský krok (čl. 33(3) PCT)

Nároky nespĺňajú požiadavky na vynálezcovský krok.

3/33

·· ···· • · • · • · • • · • · • e • ·· • ·

·· ·· • • · • · ·· • • · • • • · • • . · • • • • ···· ·· ···

zlúčenina 12

Obr. 3

4/33 ·· ···· • · · • · · • · · ·· · • ·· ·· ·· · · · · · • · · · • · · · · ··· ···· ·· ···

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 tukarezol, 20 h

-Δ- zlúčenina 12, 20 h koncentrácia (mM)

Obr. 4

5/33

·· ···· • ·· ·· • • • • ·· · · · • • · • • • • • • · • · · • · · · • • • • • ·· • • • • · · t·· ···· ·· • * ···

/ tukarezol ® zlúčenina 2

Obr. 5

'·· ···· • · · • · · • ·· ·· · • · ·· • · • · • · • · · • · • · ·· · ··· ···· ·· ··

kontrola zlúčenina 8, zlúčenina 8,

3. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1, kde uvedenou zlúčeninou je 4,6-0-benzylidén-L-glukopyranóza a/alebo 4, 6-0-(benzylidéndi)-L-glukopyranóza alebo jej farmaceutický prijateľná soľ, prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo nádorového ochorenia.

na liečbu podľa

4,6-04. Použitie derivátu benzaldehydu všeobecného vzorca (I) nároku 1 s výhradou, že uvedeným derivátom nie je (benzylidén-di)-D-glukopyranóza a 4,6-0-benzylidén-L-glukopyranóza a 4,6-0-(benzylidén-di)-L-glukopyranóza, alebo akéhokoľvek jeho stereoizoméru alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli, liečbu vírusy ďalšie na prípravu liečivého nádorových ochorení hepatitídy B a C, onkogénne vírusy.

prostriedku na preventívnu vyvolaných vírusmi ako sú onkogénne papilloma vírusy a

5. Použitie zlúčeniny je podľa nároku 4, kde uvedenou zlúčeninou

4,6-0-benzylidén-D-galaktopyranóza, metyl-4,6-0-benzylidén-a-D-manopyranozid,

4,6-0- (benzylidén-di) -2-deoxy-D-glukopyranóza,

4,6-0- (4-karbometoxybenzylidén)-D-glukopyranóza, ·· ···· · ·· ·· ·· · ······· • · · · · * · ···* ^:ZMENÉNT*LIST ·

4.6- 0-benzylidén-2-deoxy-D-glukopyranóza,

4) Predmet vynálezu spĺňa požiadavky čl. 33(4) PCT na priemyselnú využiteľnosť.

VII. Nedostatky zistené v prihláške

Podľa opisu na str. 13 1.22 sa zdá, že zlúčeniny 3 a 4 a 12 sú už známe. Podľa pravidla 5.1 (ii) PCT je nutné, aby doterajší stav v odbore bol v opise citovaný a stručne opísaný.