NO311005B1 - Anvendelse av benzaldehydderivater for fremstilling av et terapeutisk middel til behandling av autoimmune sykdommer - Google Patents

Description

Denne oppfinnelsen vedrører anvendelse av benzaldehydderivater for fremstilling av terapeutiske midler til forebygging og/eller behandling av autoimmune sykdommer.

Aldehyder reagerer med en rekke O-, S- eller N-holdige nukleofile grupper som hydroksylgrupper, sulfhydrylgrupper og aminogrupper under dannelse av karbonylholdige kondensasjonsprodukter som acetaler, merkaptaler, aminaler etc. Med primære aminer vil reaksjonen imidlertid normalt føre til en addisjonsforbindelse i form av en Schiff-base (et imin). Det er velkjent at in vivo Schiff-basedannelse er involvert i biokjemiske nøkkelprosesser som transaminering, dekarboksylering og andre aminosyremodifiserende reaksjoner som katalyseres ved hjelp av pyridoksalfosfat, virkningen av aldolase på fruktosedifosfat i glykolysen og kondensasjonen av retinal med rodopsin i synsprosessen. Det er også kjent at signalisering gjennom membraner innebærer karbonylkondensasjonsreaksjoner, f.eks. når det skal settes i gang en respons fra immunsystemet.

Dannelsen av iminer skjer ved en totrinnsmekanisme. Ved å tilsette en amino-nukleofil til karbonylgruppen dannes mellomproduktet karbinolamin (aminohydrin), deretter følger et dehydreringstrinn ved dannelsen av dobbeltbindingen C=N. Begge trinnene er reversible, men begunstiges ved forskjellige pH-verdier. Derfor går reaksjonen etter en karakteristisk klokkeformet pH-/hastighetsprofil hvor den høyeste totale reaksjonshastigheten opptrer ved moderat pH.

Imidlertid vet man at Schiff-baser lett dannes også ved fysiologiske betingelser, og mange karbonylkondensasjonsreaksjoner er vel kjent in vivo (E.Schauenstein et. al., Aldehydes in Biological Systems, London, Pion Ltd., 1977).

Schiff-basen er gjerne selv et reaktivt molekyl, og deltar ofte i ytterligere reaksjoner som fører til addisjon av nukleofile enheter til dobbeltbindingen. For visse svovelholdige aminer, spesielt aminosyrene cystein og metionin og for glutation, vil Schiff-basen som dannes først kunne gjennomgå reversibel intern ringdannelse hvor sulfhydrylgruppen adderes til iminet under dannelse av tiazolidinkarboksylat (M.Friedman, The Chemistry and Biochemistry of the Sulfhydryl Group in Amino Acids, Peptides and Proteins, Oxford, Pergamon Press, 1973).

Indikasjoner på reaksjoner mellom karbonylforbindelser og frie aminogrupper i proteiner under dannelse av reversible Schiff-baser ble rapportert av G.E.Means og R.E.Feeney (Chemical Modification of Proteins, s. 125 - 138, San Francisco, Holden-Day, 1971). Aromatiske aldehyder er generelt mer reaktive enn mettede alifatiske aldehyder, og kan danne Schiff-baser selv uten at man fjerner vann under reaksjonen. (R.W.Layer, Chem. Rev. 63 (1963), 489-510). Dette er viktig når man tar i betraktning dannelse av Schiff-baser under fysiologiske betingelser. Med hemoglobin som kilde for aminogrupper har Zaugg et. al. (J. Biol. Chem. 252

(1977), 8542 - 8548) vist at aromatiske aldehyder er to til tre ganger så reaktive som alifatiske aldehyder for dannelse av Schiff-baser. En forklaring på den begrensede reaktiviteten til alkanalene kunne være at det i vannløsning ved nøytral pH kreves et meget stort overskudd av fritt aldehyd for å forskyve likevekten i retning av Schiff-basedannelse (E.Schauenstein et. al., Aldehydes in Biological Systems, London, Pion Ltd., 1977).

Benzaldehyd og salicylaldehyd danner lett Schiff-baseiminer med membran-aminogrupper, og det er målt høye likevektskonstanter for reaksjonen av benzaldehyd med aminer (J.J. Pesek og J.H.Frost, Org. Magnet. Res. 8 (1976), 173 -176, J.N.Williams Jr. og R.M.Jacobs, Biochim. Biophys. Acta., 154 (1968), 323 - 331). Med salicylaldehyd kan iminet stabiliseres ytterligere ved hydrogenbinding mellom det enslige elektronparet i iminnitrogenet og orto-hydroksylgruppen (G.E.Means og R.E.Feeney, Chemical Modification of Proteins, s. 125 -138, San Francisco, Holden-Day, 1971, J.M.Dornish og E.O.Pettersen, Biochem. Pharmac. 39 (1990), 309-318).

Det er kjent fra den britiske patentsøknaden 9026080.3 (WO 9209276) at benzaldehyd-forbindelser som fra før er kjent som midler mot kreft kan brukes til å bekjempe sykdommer som skyldes en abnormt øket celleformering. Slike forbindelser utøver også en effekt på celler som har en abnormt hevet celledelingshastighet, derfor kan forbindelsene brukes til behandling av slike sykdommer som psoriasis, betennelsessykdommer, revmatiske sykdommer og andre autoimmune sykdommer som ulcerøs kolitt og Crohns sykdom, samt allergiske hudreaksjoner.

Dermatologiske abnormiteter som psoriasis karakteriseres ofte ved rask omsetning av epidermis. Normal hud produserer omtrent 1250-nye celler/dag/cm<2>hud som består av omtrent 27.000 celler, men psoriatisk hud produserer 35.000 nye celler/dag/cm<2>utfra 52.000 celler. Cellene som er involvert i disse sykdommene er imidlertid "normale" celler som formerer seg hurtig og gjentatte ganger ved celledeling. Normal hudfornyelse tar omtrent 311 timer, mens psoriatisk hud fornyer seg på 10 til 36 timer.

I dag behandles psoriasis, betennelsessykdommer, revmatiske sykdommer og andre autoimmune sykdommer med kortikosteroider, NSAID-medikamenter og i alvorlige tilfeller med immunsuppressive midler som cytostatika og cyklosporiner. Alle disse medikamentene kan gi alvorlige bivirkninger, og det er derfor behov for medikamenter med færre bivirkninger.

Det er kjent at aromatiske aldehyder og visse acetalderivater av disse har en reversibel veksthemmende effekt på menneskelige celler. Denne veskthemmingen skyldes først og fremst en reduksjon i cellenes proteinsyntese. (Pettersen et al., Eur. J. Clin. Oncol., 19. bind, d. 935-940, 1983 og Cancer Res., bind 45, s. 2085-2091, 1985). Hemmingen av proteinsyntesen er bare effektiv så lenge disse midlene finnes i det cellulære mikromiljøet. Celleproteinsyntesen går for eksempel raskt tilbake til det normale nivået etter at midlet er borte fra cellene (f.eks. innen en time i de fleste tilfeller).

Dette har den virkningen at de normale cellene ikke skades etter behandling med de ovennevnte forbindelsene.

Cellenes evne til å overføre signaler via mekanismer som er avhengige av cellekontakt ( binding ) har vært studert i mange år. Disse mekanismene er spesielt viktige for reaktiviteten av sirkulerende celler som lymfocytter, makrofager etc, og også for eksempel for metastatiske celler som forankrer seg i vev for å etablere nye tumorer. Muligheten til å endre bindingsegenskapene for celler som overvåker immun- eller betennelsesreaksjonene kan være av stor terapeutisk verdi for behandling av mange sykdommer som revmatoid artritt, psoriasis, psoriatisk artritt, lupus erythematosus, akne, Bechterews sykdom, progressiv systemisk sklerose (PSS), seborré og andre autoimmune sykdommer som ulcerøs kolitt og Crohns sykdom.

Immunsystemet er nøye konstruert for å identifisere og eliminere alle substanser som kjennes som fremmede, enten det stammer fra en bakterie-, virus- eller protozoinfeksjon eller fra abnorme celler som kreftceller. For å kunne gi en spesifikk respons overfor det store utvalget av biologisk variasjon som de invaderende substansene representerer, må immunsystemet være svært allsidig. Imidlertid kan overstimulering av dette finstemte systemet føre til forskjellige allergi- og betennelsesreaksjoner og til autoimmune sykdommer. Å modulere immunsystemet, enten ved å opp- eller nedregulere en spesifikk respons, er derfor en stor terapeutisk utfordring.

Ved en immunologisk gjenkjennelsesprosess sperres et fragment av et fremmed protein inne i kløften i et MHC-klasse ll-protein på overflaten av en antigenpresenterende celle (APC). Til dette MHC-antistoffkomplekset bindes også reseptoren for en T-hjelpercelle. For å aktivere en T-hjelpercelle trengs minst to signaler. Det primære signalet gis av antigenet selv, via MHC-klasse Jl-komplekset og forsterkes av CD4-koreseptorene. Det andre signalet kan fås fra et spesifikt signaliseringsmolekyl som er bundet i plasmamembranen på overflaten av APC-cellen. Et tilsvarende koreseptorprotein befinner seg på overflaten av T-hjelpercellen. Begge signalene er nødvendige for å aktivisere T-cellene. Når de aktiviseres vil de stimulere sin egen formering ved å skille ut interleukinbaserte vekstfaktorer og syntetisere tilsvarende reseptorer på overflaten. Bindingen av interleukinet til disse reseptorene stimulerer så T-cellene direkte til å formere seg.

På 1980-tallet ble det kjent at et syklodekstrin-benzaldehydbasert inklusjonskompleks kunne stimulere immunsystemet ved å styrke de lymfokinaktiverte drepercellene i en musemodell (Y. Kuroki et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117, (1991), 109-114). In wfro-studier har senere avslørt naturen til de kjemiske reaksjonene ved APC-donor-/T-cellereseptor-interaksjonsstedene som er ansvarlige for det andre stimulerende signalet, og at disse reaksjonene har form av karbonyl-aminokondensasjoner (Schiff-basedannelse). Videre kan disse interaksjonene imiteres av syntetiske kjemiske enheter. Disse oppdagelsene åpner for nye terapeutiske muligheter for kunstig modulering av immunsystemet. I WO 94/07479 kreves patent for bruk av visse aldehyder og ketoner som danner Schiff-baser og hydrazoner med aminogrupper på T-celleoverflaten. I EP 0609606 A2 er den foretrukne immunstimulerende substansen 4-(2-formyl-3-hydroksyfenoksymetyl)benzosyre (Tucaresol), en forbindelse som opprinnelig var konstruert for å kurere sigdcelleanemi. Denne substansen gis oralt og er systemisk biotilgjengelig. Potensialet til Tucaresol for å kurere et antall sykdommer som f.eks. bakterie-, virus- og protozoinfeksjoner, autoimmune sykdommer og kreft undersøkes nå (H.Chen og J.Rhodes, J. Mol. Med. (1996) 74:497-504) og kombinasjonsstrategier hvor Tucaresol gis sammen med en vaksine for å kurere kronisk hepatitt B, HIV og malignt melanom er under utvikling.

Måling av immunparametre in vitro og undersøkelser av virkningene in vivo resulterte i en klokkeformet dose-/responsprofil (H.Chen og J.Rhodes, J. Mol. Med. (1996) 74:497-504). Dette dose-/responsforholdet, som ellers er noe uvanlig, kan begrunnes ved å anta at en høy konsentrasjon av aldehydmedikamentet fører til at de ko-stimulerende ligandene som trengs for effektiv binding av APC til T-cellen mettes med medikamentmolekyler slik at virkningen svekkes. En dose som er nok til å danne en dynamisk likevekt som bidrar til stimulering uten å blokkere bindingen mellom cellene ser ut til å være optimal.

Generelt er aldehyder i seg selv ustabile overfor oksidasjon. 4-(2-formyl-3-hydroksyfenoksymetyl)benzosyre (Tucaresol) som presenteres i EP-0609606 er betydelig mer aktiv in vivo enn in vitro. Årsaken til dette kan være at medikamentet oksideres i vannløsning in vitro (H.Chen og J.Rhodes, J. Mol. Med. (1996) 74:497-504). Mange aldehyder er for reaktive til å gis som aldehyder, og selv om benzaldehyd har vist seg å være et aktivt anticancer medikament in vitro, er det svært irriterende og uegnet for direkte bruk in vivo. I et biologisk system vil karbonylgruppen i aldehydet reagere raskt med nukleofile grupper som finnes i store mengder i alle kroppsvæsker. Disse uønskede sidereaksjonene kan føre til rask metabolisering av medikamentet og vanskeligheter med å kontrollere konsentrasjonen i serum av det aktive medikamentet. Å kontrollere medikamentet på cellenivået innen et smalt konsentrasjonsvindu er avgjørende for å oppnå en effektiv immunmodulering. Tucaresol gis oralt som et ubeskyttet aldehyd, og det kan være grunn til å mistenke at medikamentet kan være utsatt for oksidasjon og at farmakokinetikken kan være vanskelig å kontrollere.

Benzaldehydderivatene 4,6-benzyliden-D-glukose og den deutererte analogen (forbindelse 1 og 2) har vist seg å ha høy biotilgjengelighet enten de gis intravenøst eller peroralt. Biotilgjengeligheten for BALB-mus målt som konsentrasjon i serum etter oral tilførsel av forbindelse 2 var 93-99% (C.B. Dunsaed, J.M. Dornish og E.O. Pettersen, Cancer Chemother. Pharmacol. (1995) 35: 464-470). Dessuten kan glukosegruppen ha affinitet til reseptorer på celleoverflaten slik at medikamentet blir mer tilgjengelig på cellenivået. Det frie aldehydet kan lett frigjøres ved hydrolyse av acetalet slik at karbonylgruppen blir tilgjengelig for Schiff-basedannelse med målligandene.

I den foreliggende patentsøknaden er aldehydene derivatiserte med biologisk akseptable karbohydrater som glukose, galaktose og andre og danner acetaler med dem. Sukkergruppen vil dermed gi bidrag til å øke stabiliteten og forbedre biotilgjengeligheten av aldehydfunksjonen for målcellene. Dette fører overraskende nok til, at karbonylkondensasjonsreaksjonene blir mer effektive og farmakokinetikken lettere kontrollerbar ved bruk av forbindelsene våre sammenliknet med tidligere kjente forbindelser.

For å sammenlikne forbindelse 2 med Tucaresol ble proteinsyntese og inaktivering av celler målt ved like store konsentrasjoner av de to medikamentene. Det påvist at forbindelse 2 var mer effektiv enn Tucaresol med hensyn til begge de målte parametrene.

Det er et hovedformål med oppfinnelsen å tilveiebringe forbindelser for forebygging og/eller behandling av sykdommer som er relatert til immunsystemet.

Et annet formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe forbindelser for forebygging eller behandling av autoimmune sykdommer, uten at forbindelsene har giftige bivirkninger.

Et tredje formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe forbindelser for behandling av sykdommer som er relatert til immunsystemet, som psoriasis, tarmbetennelser, leddbetenneise, SLE, PSS etc.

Disse og andre mål med oppfinnelsen oppnås ved de vedlagte patentkravene.

Forbindelsene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen har en generell formel

(I):

hvor L er H eller D;

Ar er fenyl eller mono- eller di- substituert fenyl, hvor substituenten (e) er valgt fra gruppen bestående av alkyl med 1-6 karbonatomer, CF3, fluor, klor, nitro, cyano, OR<1>, SR<1>, N(R<1>)2eller COOR<1>hvor R<1>er H, CF3eller alkyl med 1-6 karbonatomer, eller OC(0)R<2>, CA(OR<2>)2, CA[OC(0)R<2>]2, NHC(0)R<2>eller N[C(0)R<2>]2der A er H eller D og R<2>er CF3eller alkyl med 1-6 karbonatomer, eller C(0)R<3>der R<3>er H, D, CF3eller alkyl med 1-6 karbonatomer;

Y er valgt fra atomene eller gruppen bestående av H, D, fluor, klor, nitro, OR<1>, OC(0)R<2>, N(R<1>)2, NHC(0)R<2>eller N[C(0)R<2>]2hvorR1 og R2 er som angitt ovenfor;

R er H, CF3eller alkyl med 1-6 karbonatomer;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Det er underforstått at enhver stereoisomer i henhold til formel (I) omfattes av den foreliggende oppfinnelsen.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen beskrives videre nedenfor med eksempler og vedlagte figurer. Beskrivelse av figurene

Fig. 1: Perifere mononukleære blodceller og superantjgen i Ex Vivo 10-medium ble utsatt for enten benzaldehyd, deuterert benzaldehyd, forbindelse 2 eller zilascorb(<2>H). Formeringen av perifere mononukleære blodceller ble målt som inkorporering av tritiert tymidin ved de forskjellige medikamentkonsentrasjonene.

Fremstilling

5Som kjent gjennomgår aldehyder syrekatalyserte kondensasjonsreaksjoner med alkoholer under dannelse av acetaler. Samtidig fås vann som et biprodukt. Reaksjonen er reversibel, og i løsning dannes en likevektsblanding av aldehyd/alkohol og acetal/vann. Likevektsposisjonen bestemmes hovedsakelig av reaktiviteten og konsentrasjonen av hvert molekylslag. For å gjøre reaksjonen fullstendig fjerner man gjerne et av produktene (acetal eller vann) fra reaksjonsblandingen.

I den foreliggende patentsøknaden kondenseres forskjellige sukkere, deoksysukkere og aminosukkere med aldehyder eller aldehydekvivalenter til sukkeracetaler. Spesielt foretrukket er en reacetaliseringsstrategi hvor aldehydet innføres beskyttet som dimetylacetalet i stedet for aldehydet selv. Dermed dannes metanol som biprodukt. Reaksjonsblandingen oppvarmes moderat ved redusert trykk for å fjerne metanolen så snart den dannes. I de fleste tilfellene vil disse reaksjonsbetingelsene lett forskyve likevekten til fordel for acetalet.

Acetalisering av sukkere vil normalt føre til at det dannes blandinger av regio- og stereoisomerer. Det kan også opptre ringkontraksjoner som fører til blandinger av pyranoser og furanoser og i noen tilfeller dannes di-acetaliseringsprodukter. Hvis man ikke bruker beskyttelsesstrategier vil man derfor ofte få ytterst komplekse reaksjonsblandinger. Imidlertid ble det fremstilt overraskende rene produktfraksjoner etter passende opparbeiding, spesielt ved væskekromatografi. Identifikasjonen av produktene ble gjort ved GC-MS-spektroskopi og forskjellige NMR-teknikker.

De spesifikke reaksjonsbetingelsene og hvilke løsningsmidler og katalysatorer som brukes vil i hvert enkelt individuelt tilfelle avhenge av løseligheten og reaktiviteten av reaktantene og av egenskapene til produktet. Katalysatoren kan være en mineralsyre, f.eks. svovelsyre, en organisk syre, f.eks. paratoluensulfonsyre, et surt ionebyttemiddel, f.eks. Amberlyst 15, en elektrofil mineralleire, f.eks. montmorillonitt K-10 eller en resinstøttet supersyre, f.eks. Nafion NR 50. Reaksjonen kan gjerne utføres i et dipolart, aprotisk løsningsmiddel som dimetylformamid, dimetylacetamid, dimetylsulfoksid, N-metylpyrrolidon, dimetoksyetan eller liknende. Paratoluensulfonsyre i dimetylformamid var det foretrukne og mest brukte reaksjonsmediet.

Forbindelsene av formel (I) hvor L er deuterium kan fremstilles som bekrevet ovenfor, men med utgangspunkt i dimetylacetalet av et aldehyd som deutereres i formylposisjonen. Fremstilling av deutero-benzaldehyd kan utføres med en

modifisert Rosenmund-reduksjon med D2-gass i et deuterert løsningsmiddel, som beskrevet i EP 0 283 139 B1. Deutererte benzaldehydderivater med substituenter i fenylringen kan fremstilles i henhold til eksemplene som gis i EP 0 493 883 A1 og EP 0 552 880 A1.

De følgende eksemplene illustrerer hvordan forbindelsene til den foreliggende oppfinnelsen kan fremstilles.

Forbindelse 1:4, 6- 0- benzvliden- D- qlukopyranose

Denne kjente forbindelsen ble fremstilt som beskrevet for forbindelse 2, med utgangspunkt i udeuterert benzaldehyddimetylacetal. Identiteten ble bekreftet ved<1>H NMR-spektroskopi i DMSO-d6: 5 rel. til TMS: 7,58-7,29 (5H, m, Ar-H), 6,83 (0,4H, d, OH-1-B), 6,60 (0,6H, d, OH-1-a), 5,61 (1H, s+s, acetal-H), 5,25 (0.4H, d, OH-3-p), 5,21 (0,4H, d, OH-2-p), 5,62 (0,6H, d, OH-3-a), 5,00 (0,6H, H-1-a), 4,82 (0,6H, d, OH-2-a), 4,49 (0,4H, t, H-1-P), 4,18-4,02 (1H, m, H-6'-a+p), 3,89-3,77 (0,6H, m, H-5-a), 3,75-3,57 (1,6H, m, H-6"-a+p og H-3-a), 3,45-3,27 (2,5H, m, JH-3-p, H-4-a+p, H-5-p og IH-2-a) og 3,11-3,00 (0,4H, m, H-2-p).

Forbindelse 2: 4. 6- Q-( benzyliden- di)- D- glukopvranose

Benzaldehyd-di ble fremstilt og konvertert til benzaldehyddimetylacetal-di som beskrevet i EP 0 283 139 B1. Fremstillingen av 4,6-0-(benzyliden-di)-D-glukopyranose er også beskrevet i EP 0 283 139 B1, men denne gangen ble forbindelsen fremstilt etter en alternativ fremgangsmåte hvor høy renhet var prioritert: D(+)-glukose (706 g, 3,92 mol), benzaldehyddimetylacetal-d! (571 g, 3,73 mol), tørr DMF (1,68 kg) og paratoluensulfonsyre (4,5 g, 24 mmol) ble blandet i et tørrdestillasjonsapparat koblet til en vakuumpumpe gjennom en kaldreflukskondensator. Den mekanisk rørte blandingen ble oppvarmet til maks.

69°C ved 30 torr for å destillere av metanol og etter 2 timer var det samlet opp 235 g. Reflukskondensatoren ble så stengt av og temperaturen økt til maks. 73°C for å destillere av DMF. Etter ytterligere 2 timer var det samlet opp ytterligere 1385 g og destillasjonen ble avbrutt. Destillasjonsresten ble avkjølt til 40°C og tilsatt isvann (2,9 I) før det var gått 5 min. Temperaturen falt under 0°C og det dannet seg et bunnfall, delvis som store klumper. Blandingen ble overført til et begerglass og tilsatt ytterligere 8-9 I isvann for å få klumpene til å falle fra hverandre og gå i suspensjon. Suspensjonen ble filtrert på to nutch-filtre og man lot de to filterkakene stå over natten på filtrene tilkoblet vannstrålepumpe og begge filterkakene ble tilført N2 gjennom en omvendt trakt. Filterkakene ble spredd ut på to plater og tørket ved 32°C i 20 timer i en vakuumovn. Vakuumet ble først satt til 13 millibar og så regulert ned til 1 millibar.

Råproduktet ble omkrystallisert (for å fjerne dibenzylidenacetaler) og vasket med vann (for å fjerne DMF og glukose) inntil disse forurensningene var eliminert. Følgelig ble råproduktet (500 g) løst i varm dioksan (800 ml) og løsningen overført til kokende kloroform (9 I) gjennom et foldefilter. Løsningen ble avkjølt, først til romtemperatur, så i et isbad over natten. Bunnfallet ble filtrert fra, tørket i 2 timer på filteret (under tilførsel av N2 som beskrevet over) og tørket videre over natten ved 31 °C i vakuum på en rotavapor. Produktet (142 g) ble suspendert i isvann (1 I), filtrert på en nutch (vasking med 200 ml isvann) og tørket på filteret over natten som beskrevet over. Deretter ble det oppmalt, siktet (0,5 mm gitter) og tørket i vakuum i 5 timer ved 31 °C på en rotavapor. Produktet (96 g) ble igjen suspendert i isvann (500 ml), filtrert (vasking med 150 ml isvann) og tørket (7 timer under N2-strøm). Det ble til slutt oppmalt i en morter, siktet (0,5 mm) og tørket i en vakuumovn.

Produktet var et hvitt, finfordelt pulver av høy renhet ifølge HPLC-analysen. Utbyttet var 95 g, 10% av teoretisk utbytte. NMR i DMSO-d6 indikerte et a:B anomerforhold på omtrent 7:3.

<1>H og<13>C NMR (DMSO-d6), 6 rel. til TMS: 7,55-7,28 (5.00H, m, Ar-H), 6,85 (0.27H, d, OjH-1-6), 6,58 (0,71 H, d, OjH-1-a), 5,24 (0.27H, d, OH-3-B), 5,19 (0.28H,

d, OH-2-<p>), 5,61 (0,71 H, d, OH-3-a), 4,99 (0.72H, H-1-a), 4,82 (0,71 H, d, 0H-2-a), 4,48 (0.29H, t, H-1-p), 4,20-4,04 (1.04H, m, H-6'-a+P), 3,88-3,73 (0.78H, m, H-5-a), 3,73-3,56 (1.72H, m, H-6"-a+p og H-3-a), 3,46-3,21 (2,61 H, m, H-3-p, H-4-a+p, H-5-p og H-2-a) og 3,09-2,99 (0.28H, m, H-2-p); 137,881, 128,854, 128,042,

126,435 (Ar-C), 100,462 (acetal-C), 97,642 (C-1-p), 93,211 (C-1-ct), 81,729 (C-4-a), 80,897 (C-4-p), 75,796 (C-2-p), 72,906 (C-2-a og C-3-p), 69,701 (C-3-a), 68,431 (C-6-a), 68,055 (C-6-p), 65,810 (C-5-p) og 62,032 (C-5-a).

Forbindelse 3: 4, 6- O- benzvliden- D- qalaktopvranose

D(+)-galaktose (15,0 g, 0,083 mol) og tørr DMF (80 ml) ble blandet under omrøring ved 50°C i et destillasjonsapparat. Suspensjonen som dannet seg ble tilsatt benzaldehyddimetylacetal (12,2 g, 0,083 mmol) og paratoluensulfonsyre (0,14 g) og metanol/DMF ble sakte destillert av ved hjelp av en vannstrålepumpe. Etter 3 timer var det meste av galaktosen brukt opp og det resterende DMF fjernet på en rotavapor koblet til en vakuumpumpe. Destillasjonsresten, en nokså seig sirupsaktig masse, ble renset på en Lobar C RP-8-kolonne med metanol/vann (1:1) som eluent. Produktfraksjonene ble frysetørket.

Gasskromatografi for TMS-derivatene viste at produktet hovedsakelig besto av to isomerer. På basis av<1>H-,<13>C-, COSY-, DEPT- og C-H-korrelasjons-NMR-spektra ble produktet identifisert som a- og p-anomerene av tittelforbindelsen.

<1>H og<13>C NMR (DMSO-d6), 5 rel. til TMS: 7,49-7,27 (5H, m, Ar-H), 5,57 (1H, s, acetal-H), 5,22 (0,5H, d, H-1-a), 4,56 (0,5H, d, H-1-p), 4,23+4,18 (0,5H+0,5H, d+d, H-4-a+p), 4,14-3,98 (2H, m, IH-6-a+p), 3,94-3,79 (1,5H, m, H-2-a, H-3-ct og H-5-a), 3,69-3,49 (1.5H, m, H-2-p, H-3-p og H-5-p); 137,422, 129,981 128,902 126,639 og 126,590 (Ar-C), 101,325 (acetal-C), 96,540 (C-1-p), 93,161 (C-1-a), 76,581 (C-4-a), 76,093 (C-4-p), 71,889 + 71,802 (C-2-p+C-3-p), 69,404 (C-6-a), 69,182 (C-6-p), 68,566 + 68.057 (C-2-a + C-3-p), 66,579 (C-5-p) og 62,886 (C-5-a).

Forbindelse 4: metvl- 4, 6- 0- benzvliden- a- D- mannopyranosid

Metyl-a-mannopyranosid (18,1 g, 0,093 mol), benzaldehyddimetylacetal (21,0 g, 0,138 mol) og tørr DMF ble blandet under omrøring ved 50-55°C i et destillasjonsapparat. Det ble tilsatt paratoluensulfonsyre (ca. 0,1 g) og 10 min. senere ble det koblet til en vannstrålepumpe for å destillere av metanol. Etter 4 timer ble reaksjonsblandingen inndampet til et hvitt fast stoff. Inndampingsresten ble vasket med dibutyleter, filtrert og filterkaken ble løst i acetonitril. Det begynte å danne seg et bunnfall og blandingen ble satt i kjøleskap i 5 dager. Deretter ble bunnfallet filtrert fra og filtratet inndampet. Inndampingsresten ble renset på en Lobar C RP-8-kolonne med 30% acetonitril i vann som eluent. Produktfraksjoner fra 4 separate synteser ble frysetørket og kombinert.

Gasskromatografisk analyse av TMS-derivatene indikerte at produktet besto av 95 arealprosent monoacetaler. Monoacetalene besto for sin del av 4 topper som kunne integreres til henholdsvis 0,4, 3,2, 94,1 og 2,4 areal-%. På basis av<1>H-,<13>C-, COSY-, DEPT- og C-H-korrelasjons NMR-spektra sammen med gasskromatografi og MS-spektroskopi ble det dominerende molekylslaget identifisert som tittelforbindelsen.

<1>H og<13>C NMR (aceton-d6), 8 rel. til TMS: 7,54-7,30 (5H, m, Ar-H), 5,60 (1H, s, acetal-H), 4,71 (1H, s, H-1), 4,34 (1H, bred s, OH), 4,22-4,02 (2H, m+bred s, H-6'+OH), 3,94-3,82 (3H, m, H-2, H-3 og H-4), 3,80-3,60 (2H, m, H-5+H-6") og 3,39 (3H, s, CH3); 139,264, 129,396, 128,662 og 127,211 (Ar-C), 102,825 (C-1), 102,468 (acetal-C), 79,888 (C-4), 72,090 (C-3), 69,308 (C-6), 69,127 (C-2), 64,363 (C-5) og 54,921 (CH3).

Forbindelse 5: 4, 6-( benzvliden- di)- 2- deoksv- D- qlukopvranose

Benzaldehyd-di ble fremstilt og konvertert til benzaldehyddimetylacetal-di som beskrevet i EP 0 283 139 B1.

2-deoksy-D-glukose (10 g, 60,9 mmol), tørr DMF (35 ml),

benzaldehyddimetylacetal-di (11,7 g, 76,4 mmol) og paratoluensulfonsyre (70 mg,

0,37 mmol) ble blandet under N2til en hvit grøt. Ved oppvarming til 45-50°C ble det dannet en fargeløs løsning i løpet av en halv time. En vakuumpumpe ble tilkoblet for å fjerne metanol gjennom en avkjølt kolonne (for å hindre tap av benzaldehyddimetylacetal-di). Trykket ble regulert trinnvis ned fra 70 millibar til 20-30 millibar i løpet av 4,5 timer og temperaturen ble opprettholdt på 40-45°C. Deretter ble destillasjonen avbrutt, apparatet ombygd uten kolonnen og DMF ble fjernet ved kortbanedestillasjon ved 50-55°C, maks. vakuum. Resten var en svakt gul sirupsaktig masse.

1/4 av sirupsmassen ble løst i svakt alkalisk (NaHC03) metanol/vann 60/40 og renset på en Merck LiChroprep RP-8 omvendt fase-kolonne med metanol/vann 60/40 som eluent. Produktfraksjoner ble konsentrert for å fjerne metanol og frysetørket til et hvitt, ullent fast stoff. Produkter fra fire separate synteser ble kombinert til et utbytte på 3,5 g, 23% av det teoretiske.

Gasskromatografisk analyse av TMS-derivatene og NMR-spektroskopi viste at produktet besto av en 1:1 blanding av a- og B-anomerene.

<1>H og<13>C NMR (DMSO-d6), 5 (ppm) rel. til TMS: 7,52-7,28 (m, 5H, Ar-H I + II), 6,9-6,65 (bred s, 1/2 H, OH-1 II), 6,55-6,32 (bred s, 1/2 H, OH-1 I), 5,25-5,12 (m, 1 H, OH-3 II og H-1 I), 5,12-5,0 (d, 1/2 H, OH-3 II), 4,84-4,73 (dd, 1/2 H, H-1 II), 4,20-4,02 (m, 1H, H-6 l+ll), 3,98-3,73 (m, 1H, H-3 I og H-5 I), 3,73-3,58 (m, 1,5H, H-6' l+ll og H-3 II), 3,42-3,18 (2,5 H, H-4 l+ll og H-5 II og H2O), 2,10-1,86 (m, 1H, H-2 l+ll) og 1,62-1,34 (m, 1H, H-2' l+ll); 137,979, 137,926, 128,841, 128,036 og 126,432 (Ar-C l+ll), 101,5-100,0 (acetal-C l+ll), 94,057 og 91,424 (C-1 l+ll), 83,916 og 83,093 (C-4 l+ll), 68,374 og 68,119 (C-6 l+ll), 66,889, 66,092, 64,174 og 62,604 (C-3 l+ll og C-5 l+ll) og 41,932 og 40,051 (C-2 l+ll).

Forbindelse 6: 4, 6- Q-( 4- karbometoksvbenzvliden)- D- glukopvranose

Metyl-4-formylbenzoat (100 g, 0,609 mol), metanol (91,5 g, 2,86 mol), trimetylortoformiat (71 g, 0,67 mol) og konsentrert saltsyre (165 (il) ble blandet til en grøt i en 500 ml trehalset flaske. Grøten ble omdannet til en svakt gul løsning på få minutter og temperaturen økte spontant fra 15°C til 30°C. Etter 15 minutters omrøring ble reaksjonsblandingen refluksert ved 58°C i 25 minutter til og så nedkjølt til 10°C (isvann). Det ble laget en alkalisk løsning ved å løse KOH (8,3 g) i metanol (53 ml) og 7 ml av løsningen ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Etter 25 minutters omrøring ved 10°C ble reaktoren ombygd for kortbanedestillasjon og alle flyktige stoffer fjernet i vakuum (vannstrålepumpe). Destillasjonen fortsatte deretter med en vakuumpumpe til det var igjen en fargeløs olje ved 112-114°C/0,5 millibar. Oljen omdannet seg til et fargeløst fast stoff med smeltepunkt 32-33°C, og ble identifisert ved NMR som metyl-4-formylbenzoatdimetylacetal. Utbyttet var 108,75 g, 85% av det teoretiske.

D(+)-glukose (8,0 g, 44,4 mmol), tørr DMF (25 ml), metyl-4-formylbenzoatdimetylacetal (10,4 g, 49,5 mmol) og paratoluensulfonsyre ble blandet ved 50°C under N2til en hvit suspensjon. Apparatet var koblet til en vakuumpumpe gjennom en vertikal kondensator og fordampningen av metanol startet ved 80-100 millibar, 55°C. Vakuumet ble gradvis økt til 40 millibar mens temperaturen ble holdt på 55-60°C. Reaksjonsblandingen ble gradvis klar og apparaturen ble ombygd for kortbanedestillasjon av DMF. Destillasjonsresten var en svakt gul sirupsmasse.

Sirupsmassen ble løst i en varm løsning av 100 mg NaHC03i 20 ml metanol og 8 ml vann og felt ved tilsetning av 100 ml etylacetat. Bunnfallet ble isolert fra modervæsken ved filtrering, vasket med kaldt vann (4 x 15-20 ml) og overført til en rotavaporflaske. Fuktigheten ble fjernet ved å tilsette etylacetat og inndampe to ganger. Produktet ble endelig tørket under høyt vakuum. Det ble filtrert av mer bunnfall fra modervæsken og vasket og tørket til nok en produktporsjon. De to porsjonene ble slått sammen til 1,94 g rent produkt, 13% av det teoretiske utbyttet. Gasskromatografisk analyse av TMS-derivatene viste to isomerer i forholdet 2:1.

<1>H- og<13>C NMR (DMSO-d6), 8 (ppm) rel. til TMS: 7,99 og 7,61 (dd, 2+2H, furfuryl-H), 6,87 (d, 0.67H OH-1 II), 6,59 (d, 0.28H, OH-1 I), 5,68 (s+s, 1H, acetal-H l+ll), 5,29 (d, 0.68H, OH-3 II), 5,21 (d, 0.67H, OH-2 II), 5,16 (d, 0,31 H, OH-3 I), 5,00 (t, 0.30H, H-1 I), 4,85 (d, 0.28H, OH-2 I), 4,48 (t, 0,73H, H-1 II), 4,25-4,08 (m, 1.14H, H-6), 3,95-3,77 (m, 3.43H, OCH3 og H-5 I), 3,78-3,59 (m, 1.40H, H-3 I og H-6'), 3,49-3,23 (m, 3,59H, H-4 I og II, H-5 II, H-2 I og H-3 II), 3,10-2,98 (m, 0.72H, H-2 II); 165,978, 142,553, 142,553, 129,959, 129,067, 126,763, 99,982, 99,812, 97,661, 93,238, 81,794, 81,794, 80,963, 75,808, 72,902, 69,658, 68,487, 68,110, 65,714, 61,952 og 52,253.

Forbindelse 7: 4. 6- Q- benzvliden- 2- deoksv- D- qlukopvranose

12-deoksy-D-glukose (10,0 g, 60,9 mmol), tørr DMF (34 ml), benzaldehyddimetylacetal (11,6 g, 76,2 mmol) og paratoluensulfonsyre (70 mg, 0,37 mmol) ble blandet under N2til en hvit grøt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter og ved oppvarming til 45-50°C ble den faste substansen gradvis løst. Det ble koblet til en vakuumpumpe for å fjerne metanol gjennom en avkjølt kolonne (for å forhindre tap av benzaldehyddimetylacetal) og reaksjonen fortsatte i 4,5 timer. Deretter ble destillasjonen avbrutt, kolonnen fjernet og DMF destillert fra ved kortbanedestillasjon ved 50-55°C, maksimalt vakuum. Destillasjonsresten var en svakt gul sirupsmasse.

Sirupsmassen ble løst i svakt alkalisk (NaHCOa) metanol/vann 60/40 og renset på en Merck LiChroprep RP-8 omvendt fase-kolonne med metanol/vann 60/40 som eluent. Produktfraksjonene ble konsentrert for å fjerne metanol og frysetørket til et hvitt, ullent fast stoff. Produktene fra fire separate synteser ble kombinert til 3,18 g, 21% av det teoretiske utbyttet.

Gasskromatografisk analyse av TMS-derivatene og NMR-spektroskopi viste at produktet besto av en 1:1 blanding av a- og B-anomerene.

<1>H og<13>C NMR (DMSO-d6), 8 (ppm) rel. til TMS: 7,52-7,30 (m, 5H, Ar-H I + II), 6,85-6,68 (bred s, 1/2 H, OH-1 II), 6,50-6,35 (bred s, 1/2 H, OH-1 I), 5,61 (s+s, 1H,

acetal-H l+ll), 5,23-5,12 (m, 1 H, OH-3 II og H-1 I), 5,12-5,02 (d, 1/2 H, OH-3 II), 4,84-4,74 (dd, 1/2 H, H-1 II), 4,20-4,04 (m, 1H, H-6 l+ll), 3,98-3,74 (m, 1H, H-3 I og H-5 I), 3,74-3,57 (m, 1.5H, H-6' l+ll og H-3 II), 3,42-3,18 (2,5 H, H-4 l+ll og H-5 II og j±>0), 2,08-1,88 (m, 1H, H-2 l+ll) og 1,62-1,32 (m, 1H, H-2' l+ll).

Forbindelse 8: 2- acetamido- 4, 6- 0- benzvliden- di- 2- deoksv- D- qlukopyranose

Benzaldehyd-di ble fremstilt og konvertert til benzaldehyddimetylacetal-di som beskrevet i EP 0 283 139 B1.

Benzaldehyddimetylacetal-di (8,7 g, 56,8 mmol), N-acetyl-D-glukosamin (10,0 g, 45,2 mmol), tørr DMF (30 ml) og paratoluensulfonsyre (88 mg, 0,46 mmol) ble blandet under N2til en hvit suspensjon. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 50°C i 45 minutter, så ble det tilkoblet en vakuumpumpe gjennom en vertikal kondensator og reaksjonen fortsatte i 2 timer ved 55°C/60-70 mbar. Apparaturen ble ombygd for å fjerne DMF ved kortbanedestillasjon og destillasjonen fortsatte ved 55-60°C, maks. vakuum i 1 time til. Destillasjonsresten var en gulhvit, myk fast substans.

Det ble laget en løsning ved å blande NaHC03(150 mg) i 30 ml metanol/vann (3:2) og destillasjonsresten ble nøytralisert ved å tilsette løsningen. Dette resulterte i en kremaktig grøt som ble filtrert, vasket 2-3 ganger med en 1% NaHC03-løsning og flere ganger med eter. Produktet ble funnet å være tilstrekkelig rent ved analyse (GC) og tørket i vakuum. Utbyttet jvar 8,8 g, 63% av det teoretiske.

Gasskromatografisk analyse av TMS-derivatene indikerte en 1:1 isomerblanding. NMR-spektroskopi i DMSO-d6-løsning identifiserte produktet som en 3:1 anomerblanding.

<1>H og<13>C NMR (DMSO-d6), 5 rel. til TMS: 7,83 (s+s, 1H, NH), 7,51-7,28 (m, 6H, Ar-H), 7,0-6,2 (bred s, 1H, OH-1), 5,65-5,05 (bred s, 1 H, OH-3), 4,99 (d, 1H, H-1 I), 4,61 (d, 0.3H, H-1 II), 4,21-4,03, 3,92-3,67 og 3,51-3,22 (m, 6H, H-2, H-3, H-4,

H-5 og H-6), og 1,85 (s+s, 3H, CH3); 169,452 (C=0), 137,818, 128,869, 128,035 og 126,438 (Ar-C), 100,505 (Acetal-C), 96,056, 91,500, 82,471, 81,505, 70,549, 68,300, 67,961, 67,218, 65,906, 62,123, 58,038, 54,790 (sukker-C) og 23,123 og 22,674 (CH3).

Forbindelse 9: 2- acetamido- 2- deoksv- 4. 6- 0-( 3- nitrobenzvliden)- D- qlukopvranose

3-nitrobenzaldehyd (100 g, 0,66 mol), metanol (99 g, 3,1 mol), trimetylotroformiat (77,3 g, 0,73 mol) og konsentrert saltsyre (165 ju.l) ble blandet i en 500 ml trehalset flaske til en gul grøt som forvandlet seg til en løsning i etter 5 minutter. Reaksjonsblandingen ble refluksert av~50°C i 15 minutter og avkjølt til 10°C med isvann. Reaksjonen ble stanset ved å tilsette 6,6 ml av en løsning som var laget ved å løse 2,5 g KOH i 16 ml metanol. Omrøringen fortsatte i 15 minutter og reaktoren ble ombygd for kortbane-vakuumdestillasjon. Flyktige substanser (CH3OH + HCOOCH3) ble destillert fra med vannstrålepumpe, destillasjonen ble avbrutt og en vakuumpumpe tilkoblet. Deretter fortsatte destillasjonen og en gul olje ble destillert fra ved 93 - 97,5°C/20 mbar. Ved NMR ble oljen funnet å være 3-nitrobenzaldehyddimetylacetal av høy renhet. Utbyttet var 127 g, 97,6% av det teoretiske.

3-nitrobenzaldehyddimetylacetal (5,5 g, 0,028 mol), N-acetyl-D-glukosamin (5,0 g, 0,023 mol), paratoluensulfonsyre (50 mg, 0,263 mmol) og tørr DMF (15 ml) ble blandet under omrøring ved 50°C til en svakt gul suspensjon. Etter 1/2 time ble det tilkoblet en vakuumpumpe og reaksjonen fortsatte ved 56°C/50 mbar i 11 timer. Reaksjonsblandingen ble inndampet og inndampingsresten fordelt mellom et lite volum svakt alkalisk (NaHC03) vann og kloroform. Vannfasen (som dannet en osteaktig suspensjon) ble ekstrahert to ganger med kloroform og filtrert og vasket flere ganger med vann og eter. Produktet ble tørket i vakuum til et svakt brunlig pulver. Utbyttet var 570 mg, 7% av det teoretiske.

Gasskromatografisk analyse av TMS-derivatene indikerte at produktet besto av to isomerer i et 2:1 forhold. NMR-spektroskopi identifiserte produktet som en blanding av a- og B-anomerer.<1>H og13C NMR (DMSO-d6), 5 rel. til TMS: 8,4-8,1

(m, 2H, Ar-H), 8,05-7,79 (m, 2H, Ar-H), 7,79-7,60 (t, 1H, NH), 6,80 (d, 1H, OH-1), 5,81 (s+s, 1H, acetal-H), 5,30 og 5,18 (s+s, 1/2 H + 1/2 H, H-1), 4,30-4,10, 3,93-3,3 (m, 6H, H-2 - H-6), og 1,85 (d, 3H, CH3); 169,331 (0=O), 147,490, 139,544, 133,018, 129,862, 123,732, 120,884 (Ar-C), 99,000, 98,806 (acetal-C), 95,924, 91,406, 82,433, 81,454, 70,320, 68,240, 67,907, 67,020, 65,574, 61,833, 57,875, 54,609 (sukker-C) 23,014 og 22,557 (CH3).

Forbindelse 10: 4, 6- 0-( benzvliden- di)- D- qalaktopvranose

Benzaldehyd-di ble fremstilt og konvertert til benzaldehyddimetylacetal-di som beskrevet i EP 0 283 139 B1.

D(+)-galaktose (15,0 g, 0,0833 mol) og tørr DMF (80 ml) ble omrørt i et destillasjonsapparat ved 45°C. Det ble tilsatt benzaldehyddimetylacetal-di (12,8 g, 0,0836 mol) og paratoluensulfonsyre (0,14 g) og metanol og DMF sakte destillert av i vakuum (vannstråle). Etter 3 timer ble det montert en vakuumpumpe og det resterende DMF ble destillert fra. Porsjoner av destillasjonsresten ble løst i metanol/vann (1:1) som inneholdt NaHC03(11 mg/ml) og renset på en Lobar C RP-8-kolonne med metanol/vann (1:1) som eluent. Produktfraksjoner fra 7 individuelle synteser ble frysetørket og slått sammen til et hvitt, ullent produkt. Utbyttet var 6,62 g, 30% av det teoretiske.

Gasskromatografisk og NMR-analyse viste at produktet besto av en 1:1 anomerblanding.<1>H og<13>C NMR (DMSO-d6), 8 rel. til TMS: 7,52-7,30 (m, 5H, Ar-H), 6,62 (0.5H, d, OH-1-B), 6,32 (0,5H, d, OH-1-a), 5,05 (0,5H, t, H-1-a), 4,85+4,69+4,49 (1H+0,5H+0,5H, m+d+d, OH-2+OH-3), 4,35 (0,5H, t, H-1-B), 4,12-3,92+3,81-3,71+3,69-3,59+3,49-3,39+3,39-3,28 (3H+1H+0.5H+1H+2H, m+m+m+m+m, H-2-H-6+H20); 138,753, 138,690, 128,607, 128,319, 127,913 og 126,3 (Ar-C), 99,345 (acetal-C), 97,307 og 93,178 (C-1), 76,738 og 76,158 (C-4), 72,101, 71,605, 68,947, 68,862, 68,486 og 67,730 (C-2, C-3 og C-6) og 65,829 og 62,068 (C-5).

Forbindelse 11: 4. 6- 0-( benzvliden- di)- D- mannopvranose

Benzaldehyd-di ble fremstilt og konvertert til benzaldehyddimetylacetal-di som beskrevet i EP 0 283 139 B1.

D(+)-mannose (15,0 g, 0,0833 mol) og tørr DMF (70 ml) ble omrørt i en destillasjonsapparatur ved 40°C. Benzylidendimetylacetal-di og paratoluensulfonsyre (0,14 g) ble tilsatt og det dannet seg en klar løsning. Det ble tilkoblet en vakuumpumpe og metanol og DMF ble sakte destillert fra ved 70-20 mbar, 45-50°C. Etter 3 timer ble det resterende DMF destillert av ved maks. vakuum, slik at det ble igjen en svakt gul sirupsmasse.

Resten ble vasket flere ganger med eter for å fjerne lipofile substanser. Noen porsjoner av råproduktet ble løst i svakt alkalisk (NaHCOa) metanol/vann (3:2) og renset på en Lobar C RP-8-kolonne med metanol/vann (3:2) som eluent. gasskromatografi av TMS-derivatene indikerte at produktet besto av 4 isomerer i forholdet 10:3:1:4. Det ble re-eluert med metanol/vann (1:4) til et hvitt, ullent produkt som besto av bare to isomerer i forholdet 70/30, ifølge gasskromatografisk analyse. Utbyttet var 1,42 g, 6,4% av det teoretiske.

På basis av<1>H-,<13>C-, COSY-, DEPT- og C-H-korrelasjons-NMR ble den kjemiske strukturen bekreftet og a- og B-anomerene funnet å nå en likevekt ved et 1:8-forhold.

<1>H og<13>C NMR (DMSO-d6) av den dominerende isomeren, 8 rel. til TMS: 7,5-7,28 (m, 5H, Ar-H), 6,56 (d, 1H, OH-1), 5,0-4,85 (m, 3H, OH-2 og OH-3), 4,10-4,02 (m, 1H, H-6), 3,63-3,40 (m, 5H, H-2, H-3, H-4, H-5 og H-6'); 138,045, 128,825, 128,029, 126,438 (Ar-C), 100,802 (Acetal-C), 95,233 (C-1), 78,967 (C-4), 72,032 (C-3), 68,317 (C-6), 67,252 (C-2), 63,495 (C-5).

Forbindelse 12: 2- acetamido- 4. 6- 0- benzvliden- 2- deoksv- g- D- aalaktopvranose

Benzaldehyddimetylacetal (2,0 ml, 14 mmol) og deretter paratoluensulfonsyre-monohydrat (15 mg) ble tilsatt til en omrørt suspensjon av N-acetyl- D-galaktosamin (1,50 g, 6,77 mmol) i acetonitril (37 ml). Reaksjonsblandingen ble så senket ned i et varmt (60°C) oljebad og omrørt under nitrogen i 3 timer, mens man observerte at det dannet seg et tykt hvitt bunnfall. Reaksjonsblandingen ble så filtrert og det faste stoffet vasket med kald diklormetan (omtrent 2 ml), deretter fortsatte man med sugefiltrering under nitrogenstrøm. Det hvite pulveret ble så plassert i et forhåndsveid glass og satt under vakuum (0,06 mbar) i 72 timer slik at man fikk det rene, ønskede produktet som bare a-isomeren (1,74 g, 83%).

<1>H NMR 8H (300 MHz, d6-DMSO) 1,83 (3H, s, CH3), 3,80-4,17 (6H, m, H-2, H-3, H-4, H-5 og H-6), 4,65 (1H, d, OH-3), 5,06 (1H, t, H-1), 5,59 (1H, s, ArCH), 6,52 (1H,d, OH-1), 7,33-7,55 (5H, m, ArH) og 7,69 (1H,d, NH);<13>C NMR8C{<1>H}(75 MHz, d6-DMSO) 23 (CH3), 50, 62, 65, 69 og 76 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-6), 91 (C-1), 100 (ArCH), 126, 128, 128 og 138 (arom. C) og 170 (C=0).

Forbindelse 13: 4. 6- 0-( 3- nitrobenzen)- D- qlukopvranose

3-nitrobenzaldehyddimetylacetal ble fremstilt som beskrevet for forbindelse 9.

3-nitrobenzaldehyddimetylacetal (21,9 g, 0,11 mol), D(+)-glukose (16,0 g, 0,09 mol), paratoluensulfonsyre (100 mg, 0,5 mmol) og tørr DMF (50 ml) ble blandet under N2og omrørt ved 58°C i 25 minutter. Det ble tilkoblet en vakuumpumpe og metanol og DMF ble sakte destillert av gjennom en avkjølt kolonne ved 55-60°C, 30-40 mbar i løpet av 4 timer og 15 minutter. Apparaturen ble ombygd for å fjerne det meste av DMF ved kortbanedestillasjon og destillasjonen fortsatte i 1,5 time til. Destillasjonsresten var en svakt gul sirupsmasse.

Sirupsmassen ble løst i svakt alkalisk (NaHCOa) metanol/vann 60:40 og renset på en Lobar C RP-8-kolonne med metanol/vann 60:40 som eluent. Produktfraksjonene ble inndampet (for å fjerne metanol), frysetørket og slått sammen til 5 g av et hvitt, ullent fast stoff. Produktet ble renset en gang til med metanol/vann 60:40 som eluent for å få tittelforbindelsen tilstrekkelig ren. Utbyttet var 3,3 g, 12% av det teoretiske. Gasskromatografi indikerte at produktet besto av to isomerer i et 70:30-forhold.

<1>H NMR (DMS0-d6), 5 rel. til TMS: 8,33-7,63 (5H, m, Ar-H), 6,89+6,60 (1H, d+d, OH-1-I+II), 5,78 (1H, s+s, acetal-H-i+ii), 5,34 (0.65H, d, OH-3-II), 5,57+5,71 (1.12H, d+d, OH-2-II + OH-3-I), 4,99 (0.56H, m, H-1-1), 4,88 (0.32H, OH-2-1), 4,49 (0.74H, m, H-1-II), 4,28-4,12 (1H, m, H-6-I+II), 3,85-3,53 (2.27H, m, H-3-I, H-5-I og H-6"-l+ll), 3,49-3,32 (2.58H, m, H-2-I, H-3-II, H-4-I+II og H-5-II) og 3,12-2,98 (0.85H, m, H-2-II).

Forbindelse 14: 4, 6- 0-( 2- hvdroksvbenzvliden)- D- qlukopyranose

Salicylaldehyd (74,4 g, 0,609 mol), metanol (91,5 g, 2,86 mol), trimetylortoformiat (71 g, 0,67 mol) og konsentrert saltsyre (165 jo.1) blandes i en 500 ml trehalset flaske. Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i 15 minutter og reflukseres i ytterligere 25 minutter. Etter avkjøling (isvann) tilsettes en alkalisk løsning som lages ved å løse KOH (1,1 g) i metanol (7 ml) og omrøringen fortsetter i 25 minutter. Alle flyktige stoffer fjernes (vannstrålepumpe) og det dannede salicylaldehyddimetylacetalet destilleres i vakuum (vakuumpumpe).

D(+)-glukose (8,0 g, 44,4 mmol), tørr DMF (25 ml), salicylaldehyddimetylacetal (8,33 g, 49,5 mmol) og paratoluensulfonsyre blandes under N2ved 50°C. Apparaturen tilkobles til en vakuumpumpe og fordampingen av metanol starter. Temperaturen opprettholdes ved 55-60°C og vakuumet reguleres gradvis ned for å gjøre reaksjonen fullstendig. Apparaturen ombygges for kortbanedestillasjon for å fjerne DMF. Det dannes en sirupsaktig rest.

Resten løses i svakt alkalisk (NaHCCb) metanol/vann og renses på en Lobar RP-8-kolonne med metanol/vann som eluent. Produktfraksjonene frysetørkes og slås sammen. Identiteten bekreftes ved NMR-analyse.

Forbindelse 15: 2- deoksv- 4. 6- 0-( 2- hvdroksvbenzvliden)- D- qlukopvranose Salicylaldehyddimetylacetal fremstilles som beskrevet for forbindelse 14.

2-deoksy-D-glukose (7,3 g, 44,5 mmol), tørr DMF (25 ml),

salicylaldehyddimetylacetal (8,33 g, 49,5 mmol) og paratoluensulfonsyre blandes under N2ved 50°C. Apparaturen kobles til en vakuumpumpe og fordampingen av metanol starter. Temperaturen holdes ved like på 55-60°C og vakuumet reguleres gradvis ned for å drive reaksjonen til ende. Apparaturen ombygges for kortbanedestillasjon for å fjerne DMF. Det dannes en sirupsaktig rest.

Resten løses i svakt alkalisk (NaHCOa) metanol/vann og renses på en Lobar RP-8-kolonne med metanol/vann som eluent. Produktfraksjonene frysetørkes og slås sammen. Identiteten bekreftes ved NMR-analyse.

Forbindelse 16: 2- acetamido- 2- deoksv- 4. 6- 0-( 2- hvdroksvbenzvliden)-D- qlukopyranose

Salicylaldehyddimetylacetal fremstilles som beskrevet for forbindelse 14.

Salicylaldehyddimetylacetal (9,5 g, 56,5 mmol), N-acetyl-D-glukosamin (10,0 g, 45,2 mmol), tørr DMF (30 ml) og paratoluensulfonsyre (88 mg, 0,46 mmol) blandes under N2. Reaksjonsblandingen omrøres ved 50°C ved redusert trykk for å drive reaksjonen til ende. Apparaturen ombygges for å fjerne DMF ved kortbanedestillasjon og destillasjonen fortsettes ved 55-60°C, maks. vakuum.

Resten nøytraliseres ved å tilsette metanol/vann som inneholder litt NaHC03og renses på en Lobar RP-8-kolonne med metanol/vann som eluent. Identiteten bekreftes ved NMR-spektroskopi.

Forbindelse 17: 4, 6- 0-( 2- hvdroksvbenzvliden)- D- qalaktopvranose

D(+)-galaktose (8,0 g, 44,4 mmol), tørr DMF (25 ml), salicylaldehyddimetylacetal (8,33 g, 49,5 mmol) og paratoluensulfonsyre blandes under N2ved 50°C. Apparaturen kobles til en vakuumpumpe og fordampningen av metanol starter. Temperaturen holdes ved like ved 55-60°C og vakuumet reguleres gradvis ned for å drive reaksjonen til ende. Apparaturen ombygges for kortbanedestillasjon for å fjerne DMF. Det dannes en sirupsaktig rest.

Resten løses i svakt alkalisk (NaHCG*3) metanol/vann og renses på en Lobar RP-8-kolonne med metanol/vann som eluent. Produktfraksjonene frysetørkes og slås sammen. Identiteten bekreftes ved NMR-analyse.

Forbindelse 18: 2- deoksv- 4, 6- 0-( 2- hvdroksvbenzvliden)- D- qalaktopvranose Salicylaldehyddimetylacetal fremstilles som beskrevet for forbindelse 14.

2-deoksy-D-galaktose (7,3 g, 44,5 mmol), tørr DMF (25 ml),

salicylaldehyddimetylacetal (8,33 g, 49,5 mmol) og paratoluensulfonsyre blandes under N2ved 50°C. Apparaturen kobles til en vakuumpumpe og fordampningen av metanol starter. Temperaturen holdes ved like ved 55-60°C og vakuumet reguleres gradvis ned for å drive reaksjonen til ende. Apparaturen ombygges for kortbanedestillasjon for å fjerne DMF. Det dannes en sirupsaktig rest.

Resten løses i svakt alkalisk (NaHCOa) metanol/vann og renses på en Lobar RP-8-kolonne med metanol/vann som eluent. Produktfraksjonene frysetørkes og slås sammen. Identiteten bekreftes ved NMR-analyse.

Forbindelse 19: 2- acetamido- 2- deoksv- 4. 6-( 2- hvdroksvbenzvliden)-D- qalaktopvranose

Salicylaldehyddimetylacetal fremstilles som beskrevet for forbindelse 14.

N-acetyl-D-galaktosamin (10,0 g, 45,2 mmol), tørr DMF (25 ml), salicylaldehyddimetylacetal (8,33 g, 49,5 mmol) og paratoluensulfonsyre blandes under N2ved 50°C. Apparaturen kobles til en vakuumpumpe og fordampningen av metanol starter. Temperaturen holdes ved like ved 55-60°C og vakuumet reguleres gradvis ned for å drive reaksjonen til ende. Apparaturen ombygges for kortbanedestillasjon for å fjerne DMF. Det dannes en destillasjonsrest.

Det lages en svakt alkalisk løsning ved å blande NaHC03i metanol/vann og destillasjonsresten nøytraliseres ved å tilsette denne løsningen. Grøten som dannes filtreres og vaskes med 1% NaHCCMøsning og vann. Produktet analyseres ved gasskromatografi og omkrystalliseres hvis nødvendig. Produktet tørkes i vakuum når det er tilstrekkelig rent.

Identiteten bekreftes ved NMR-analyse.

Forbindelse 20: 4. 6- 2( hvdroksvbenzvliden)- D- mannopyranose Salicylaldehyddimetylacetal fremstilles som beskrevet for forbindelse 14.

D(+)-mannose (8,0 g, 44,4 mmol), tørr DMF (25 ml), salicylaldehyddimetylacetal (8,33 g, 49,5 mmol) og paratoluensulfonsyre blandes under N2ved 50°C. Apparaturen kobles til en vakuumpumpe og fordampningen av metanol starter. Temperaturen holdes ved like ved 55-60°C og vakuumet reguleres gradvis ned for å drive reaksjonen til ende. Apparaturen ombygges for kortbanedestillasjon for å fjerne DMF. Det dannes en sirupsaktig rest.

Resten løses i svakt alkalisk (NaHCOa) metanol/vann og renses på en Lobar RP-8-kolonne med metanol/vann som eluent. Produktfraksjonene frysetørkes og slås sammen. Identiteten bekreftes ved NMR-analyse.

Biologiske eksperimenter

Eksempel 1

Formering av perifere mononukleære blodceller

Oppfinnerne utførte et eksperiment hvor perifere mononukleære blodceller ble utsatt for superantigen sammen med benzaldehyd, deuterert benzaldehyd, forbindelse 2 eller zilascorb(<2>H). Superantigen brukes som en meget aktiv standard for formering av T-celler og presenteres til T-celler ved hjelp av antigenpresenterende celler.

Eksperimentet viste (se figur 1) at ved å tilsette benzaldehyd, deuterert benzaldehyd eller forbindelse 2 økte formeringen av perifere mononukleære blodceller signifikant på en klokkeformet doseavhengig måte, mens det ble funnet en svært liten virkning med zilascorb(<2>H). Det at vi var i stand til å øke formeringssignalet fra superantigenet tyder på at forbindelsene fungerer ved at de medvirker til å stimulere T-cellene.

Konklusjoner

Benzaldehydderivatene i henhold til denne oppfinnelsen reagerer til Schiff-baser med visse grupper på celleoverflaten, f.eks. frie aminogrupper..Siden mange celleprosesser, som proteinsyntese, cellesyklus, immunrespons etc, kontrolleres av signaler fra celleoverflaten vil disse bindingene endre oppførselen til cellen. Vi har også vist at benzalsehydkompleksene på celleoverflaten endrer adhesjonskarakteristikaene til cellen. Vi har vist at forbindelsene i henhold til denne oppfinnelsen kan være nyttige i nye behandlinger for å bekjempe autoimmune sykdommer.

Vi har funnet at heksosederivatene av benzaldehyder er overraskende mer effektive enn derivatene av andre karbohydrater.Vi tror at dette fenomenet er forbundet med reseptoraffiniteten til disse organene for sukkergruppen i derivatene.

Administrering

De terapeutiske midlene som fremstilles ved foreliggende oppfinnelse kan gis ved behandling av sykdommer som oppstår på grunn av abnormt økt celleformering

og/eller for å bekjempe autoimmune sykdommer. Disse terapeutiske midlene kan også gis som immunmodulatorer. Til dette formålet kan forbindelsene av formel (I) formuleres på en hvilken som helst egnet måte for å gis til en pasient, enten alene eller tilsatt egnede farmasøytiske bærere eller hjelpestoffer.

Det foretrekkes spesielt at formuleringene for systemisk terapi fremstilles enten som orale preparater eller parenterale formuleringer.

Egnede enterale preparater vil være tabletter, kapsler, f.eks. bløte eller harde gelatinkapsler, korn eller pulvere, geleer, suspensjoner, løsninger eller stikkpiller. Slike preparater vil fremstilles på kjent måte ved å blande en eller flere av forbindelsene av formel (I) med ikke-giftige, inerte faste eller flytende bærere.

Egnede parenterale preparater av forbindelsene av formel (I) er injeksjons- eller infusjonsløsninger.

Når de gis utvortes kan forbindelsene av formel (I) formuleres som en oppløsning, salve, krem, sirup, tinktur, spray eller liknende som inneholder forbindelsene av formel (I) med tilsetning av ikke-giftige, inerte faste eller flytende bærere som er vanlige i lokale preparater. Det er spesielt godt egnet å bruke en formulering som beskytter den aktive ingrediensen mot luft, vann eller liknende.

Preparatene kan inneholde inerte eller farmakodynamisk aktive tilsetninger. F.eks. kan tabletter eller granulater inneholde en serie bindemidler, fyllmaterialer, bærersubstanser og/eller fortynningsmidler. Flytende preparater kan for eksempel foreligge i form av en steril løsning. Kapsler kan inneholde et fyllmateriale eller et fortykningsmiddel i tillegg til den aktive ingrediensen. Preparatet kan dessuten også inneholde smaksforbedrende tilsetninger så vel som slike substanser som vanligvis brukes som holdbarhets-, stabilisator-, emulgeringsmidler eller fuktighetsbevarende midler, salter for å variere det osmotiske trykket, buffere og andre tilsetninger.

Doseringen kan variere i samsvar med sykdommen, bruksmåten og innføringsveien, så vel som pasientens behov. Generelt vil en daglig dose i en systemisk terapi for en gjennomsnittlig voksen pasient være omtrent 0,01-500 mg/kg kroppsvekt en eller to ganger om dagen, fortrinnsvis 0,5-100 mg/kg kroppsvekt en eller to ganger om dagen og helst 1-20 mg/kg vekt en eller to ganger om dagen.

Hvis man ønsker det kan det farmasøytiske preparatet av forbindelsen av formel (I) inneholde en antioksidant, f.eks. tokoferol, N-metyl-tokoferamin, butylert hydroksyanisol, askorbinsyre eller butylert hydroksytoluen.

Claims (2)

1. Anvendelse av et benzaldehydderivat med formel I:

hvor L er H eller D; Ar er fenyl eller mono- eller di- substituert fenyl, hvor substituenten (e) er valgt fra gruppen bestående av alkyl med 1-6 karbonatomer, CF3, fluor, klor, nitro, cyano, OR<1>, SR1, N(R<1>)2eller COOR<1>hvor R<1>er H, CF3eller alkyl med 1-6 karbonatomer, eller OC(0)R<2>, CA(OR<2>)2, CA[OC(0)R<2>]2, NHC(0)R<2>eller N[C(0)R<2>]2der A er H eller D og R2 er CF3eller alkyl med 1-6 karbonatomer, eller C(0)R3 der R3 er H, D, CF3eller alkyl med 1-6 karbonatomer; Y er valgt fra atomene eller gruppen bestående av H, D, fluor, klor, nitro, OR<1>, OC(0)R<2>, N(R<1>)2, NHC(0)R<2>eller N[C(0)R<2>]2hvorR1 og R2 er som angitt ovenfor; R er H, CF3eller alkyl med 1-6 karbonatomer; eller en hvilken som helst stereoisomer derav, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for fremstilling av et terapeutisk middel for forebygging og/eller behandling av autoimmune sykdommer som revmatoid artritt, psoriasis, psoriatisk artritt, lupus erythematosus, akne, Bechterews sykdom, progressiv systemisk sklerose (PSS), seborré og andre autoimmune sykdommer som ulcerøs kolitt og Crohns sykdom.

2. Anvendelse i henhold til krav 1, der benzaldehydderivatet er 4,6-O-benzyliden-D-glukopyranose, 4,6-0-(benzyliden-di)-D-glukopyranose, 4,6-O-benzyliden-D-galaktopyranose, metyl-4,6-0-benzyliden-a-D-mannopyranosid, 4,6-0-(benzyliden-di)-2-deoksy-D-glukopyranose, 4,6-0-(4-karbometoksybenzyliden)-D-glukopyranose, 4,6-0-benzyliden-2-deoksy-D-glukopyranose, 2-acetamido-4,6-0-(benzyliden-di)-2-deoksy-D-glukopyranose, 2-acetamido-2-deoksy-4,6-0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranose, 4,6-0-(benzyliden-di)-D-galaktopyranose, 4,6-0-(benzyliden-di)-D-mannopyranose, 2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoksy-a-D-galaktopyranose, 4,6-0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranose, 4,6-0-(2-hydroksybenzyliden)-D-glukopyranose, 2-deoksy-4,6-0-(2-hydroksybenzyliden)-D-glukopyranose, 2-acetamido-2-deoksy-4,6-0-(2-hydroksybenzyliden)-D-glukopyranose, 4,6-0-(2-hydroksybenzyliden)-D-galaktopyranose, 2-deoksy-4,6-0-(2-hydroksybenzyliden)-D-galaktopyranose, 2-acetamido-2-deoksy-4,6-0-(2-hydroksybenzyliden)-D-galaktopyranose, 4,6-0-(2-hydroksybenzyliden)-D-mannopyranose, 4,6-0-(2-acetoksybenzyliden)-D-glukopyranose og/eller 4,6-0-(2,3-dihydroksybenzyliden)-D-glukopyranose, eller de tilsvarende L-isomerene, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.