SE461334B - Cyklosporinderivat, foerfarande foer framstaellning daerav samt farmaceutisk komposition innehaallande naemnda derivat - Google Patents

Description

461 334 l0 15 20 25 30 35 2 ton, (8 -l0.lO.l98'+), presenterade postern), vidare olika cyklosporiner av icke naturlig härkomst, innefattande dehydro-cyklosporiner (där -x-y-gruppen i -MeBmt-resten - se formeln B ovan - är mättad, t.ex. som beskrivs i US-patenten nr. 4 108 985, 4 210 581 och 4 220 641), cyklosporiner, där -MeBmt-resten är närvarande i isomeriserad eller N-demetylerad form [se europeiska patentet nr. 0 034 567 och "Cyclosporin A", Proc. Internat. Conference on Cyclosporin A, Cambridge (U.K.) september 1981, Ed. D.J.G. White, Elsevier Press (1982) - båda innehållande det av R. Wenger utvecklade totalsyntetiska framställningsförfaran- det för cyklosporiner] och cyklosporiner, där olika aminosyror inbyggts på bestämda ställen i peptidsekvensen (se det europeiska patentet nr. 0 056 782).

Som exempel på sådana cyklosporiner som beskrivs i den ovannämnda litteraturen kan nämnas: (Thr]2-, (Val]2-, (Nva]2- och [Nva]2- (Nvaf-cyklosporin (även kända sam som eyklaspafin c, b, c resp. M), (dihydro-Meßmfll-(vailz- cyklosporin (även känd som dihydro-cyklosporin D) och [(D)Ser]8- och (dihydro- MeBmt] 1- ((D)ser J g-cyklosporin.

Enligt nu bruklig nomenklatur för cyklosporiner betecknas dessa i föreliggande beskrivning och i patentkraven med avseende på cyklosporin A.

Detta sker genom att man först anger de delar av molekylen, som avviker från dem i cyklosporin A, och sedan genom angivande av ordet “cyklosporin" karakteriserar de övriga delar, som motsvarar dem i cyklosporin A. Därtill används uttrycket -dihydro-Meßmt- för att beteckna den ovan angivna resten med formeln B, där -x-y- står för -CH2-CH2-. Sålunda betecknas med (dihydro- MeBmt]I-[VaÛZ-cyklosporin den cyklosporin, som uppvisar sekvensen enligt formeln A, där emellertid -MeBmt- (formel B, -x-y- = -CH=CH- (trans)] i ställning 1 är ersatt med -dihydro-Meßmt- [formel B, -x-y- = -CHZ-CHZÅ och -aAbu- i ställning 2 är ersatt med -Val-. Pâ liknande sätt betecknas med ((D)Ser)8-cyklosporin cyklosporinen med sekvensen enligt formeln A, där emellertid -(D)Ala- i ställning är ersatt med -(D)Ser-.

Vidare och enligt sedvanlig praxis uppvisar de aminosyror, som definieras genom förkortningar, t.ex. -Ala-, -MeVal- osv., (LJ-konfiguration, såvida inte annat anges. Rester med prefixet "Me" som t.ex. i -MeLeu- är N-metylerade rester. De olika resterna i cyklosporinmolekylen numreras som i litteraturen, dvs. medurs och utgående från -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-resten i ställning l. l föreliggande beskrivning och i patentkraven används alltid samma sifferföljd.

Enligt uppfinningen har man nu funnit, att nya cyklosporiner med _ farmaceutisk användbarhet kan erhållas, där resten i ställning 8 består av en acyloxi-cx-aminosyra med (m-konfiguration.

Uppfinningen avser således nya 'cyklosporiner med formeln I, 10 15 20 25 461 554 3 -Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-Al a-Q-HeLeu-MLeu- Nihl- 123 456 789 10 '11 (l) där X betecknar -MeBmt- eller -dihydro-MeBmt-, Y betecknar -aAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- eller -Nva-, Z betecknar -Val- eller va- och Q betecknar en rest med formeln ll R2 R1-CO-O-CH(B) (II) -NH-CH-CO- (D) där R I betecknar väte, alkyl med l till 4 kolatomer eller fenyl och Rz står för väte eller metyl.

I formeln I är Q företrädesvis en O-acyl-(m-seryl- eller O-acyl-(D)- treonyl-rest, där acylgruppen motsvarar formeln R 1-60-, vari R I har den ovan angivna betydelsen. Y står företrädesvis för -aAbu-, -Thr-, -Val- eller -Nva-.

En grupp av cyklosporiner enligt uppfinningen bildar de med formeln I, där Y betecknar -aAbu- eller -Nva-, Z betecknar -Val- och Rz betecknar väte.

En ytterligare grupp av cyklosporiner enligt uppfinningen bildar de med formeln l, där Y betecknar -aAbu- eller -Nva-, Z betecknar -Nva-, R 1 betecknar väte eller alkyl med l till l; kolatomer och RZ betecknar väte.

Föreliggande uppfinning avser vidare ett förfarande för framställning av en cyklosporin med formeln l, kännetecknat av att man a) acylerar en cyklosporin med formeln Ill, -Y-Sar-MeLeu-Z-HeLeu-Al a-H-MeLeu-MeLeu-Neva ~ F23 456 789 10 11 (lll) där X, Y och Z har den ovan angivna betydelsen och W står för en rest med formeln lV, R 2 l no-ca (IV) -uu-cu-co- (D) l0 15 20 25 30 35 461 354 I; där Rz har den ovan angivna betydelsen, genom att man inför en R l-CO-grupp, där R l har den ovan angivna betydelsen, i B-ställning, eller b) reducerar en cyklosporin med formeln I ovan, där X står för -MeBmt-, varvid man får motsvarande cyklosporin, där X betecknar -dihydro-MeBmt-.

Förfarande a) kan utföras enligt i och för sig kända metoder för acylering av hydroxigrupper, t.ex. genom omsättning med företrädesvis 2 ekvivalenter, eller, om Y = -Thr-, en ekvivalent av någon lämplig acyl-, t.ex. (C l_5)alka.noyl- eller bensoyl-halogenid, eller motsvarande -anhydrid eller, för formylering, genom omsättning med t.ex. ättiksyra-myrsyraanhydrid, vid en temperatur av t.ex. ca -10 till 50°C. Omsättningen sker under vattenfria betingelser, lämpligtvis i ett under reaktionsbetingelserna inert lösningsmedel såsom mety- lenklorid och i närvaro av ett kondensationsmedel såsom li-dimetylaminopyridin.

Under dessa betingelser sker acyleringen på hydroxigruppm i aminosyraresten i ställning 8 hellre än på hydroxigruppen i aminosyraresten i ställning 1.

Förfarande b) kan utföras på i och för sig känt sätt för reduktion av naturliga cyklosporiner till motsvarande dihydrocyklosporiner, exempelvis genom katalytisk hydrering, t.ex. enligt de i den engelska patentskriften nr. 1.567.201 beskrivna allmänna metoderna.

Hydreringen sker lämpligtvis i det neutrala omrâdet, vid temperaturer mellan ca 20 och 30°C och under atmosfärstryck eller lätt förhöjt tryck. Som hydreringskatalysator lämpar sig t.ex. platinaoxid eller palladiumlkatalysatorer, Lex. palladium på kol. Hydreringen kan t.ex. utföras i något under reaktions- betingelserna inert lösningsmedel, såsom etylacetat, eller en lägre alifatisk alkanol, såsom metanol eller isopropanol. _ Cyklosporiner med en B-hydroxi-a-aminosyrarest i ställning 8, särskilt ((D)Ser]8-cyklosporiner och (dihydro-Meßmt]1-[(D)Ser]8-cyklosporiner, som lämpar sig som utgångsprodukter för förfarande a), är t.ex. kända från det ovannämnda europeiska patentet nr. 0 056 782, där även förfaranden för deras framställning beskrivs. Ytterligare cyklosporiner lämpliga som utgångsprodukter för förfarande a) och med en hydroxi-a-aminosyrarest i ställning 8 kan framställas på analogt sätt eller enligt de i europeiska patentet nr. 0 034 567 (till vilket det hänvisas till i publikationen 0 056 782) beskrivna allmänna förfaran- dena för cyklosporin-totalsyntes, eller också enligt de i det följande, särskilt i exemplen beskrivna förfarandena.

De cyklosporiner, som är lämpliga som utgångsföreningar för förfarande b), kan framställas enligt det under a) angivna förfarandet.

Vissa av utgångsföreningarna med den ovan angivna formeln lll har tidigare inte beskrivits specifikt, nämligen föreningarna med formeln lila, .A 10 15 20 25 30 461 354 5 ' -Y ' -Sar-HeLeu-Z ' -HeLeu-Al a-H' -HeLeu-HeLeu-Hella 123 45678910 11 (llla) där .

Y' betecknar -uAbu-, -Thr-, -Val- eller -Nva-, Z' betecknar -Val- eller, om Y' betecknar -uAbu- eller -Nva-, står för -Nva-, W' betecknar -(D)Ser- eller, om Y' betecknar -aAbu- och Z' betecknar -Val-, står för -(D)'l'hr-, och X' betecknar -Meßmt- eller, om Y' betecknar -Thr-, -Val- eller -Nva-, Z' betecknar -Val- och W' betecknar -(D)Ser-, står för -dihydro-MeBmt-, t.ex. ' a) [(D)Thr ) g-cyklosporin b) (Thr ]2- ((D)Ser ] s-cyklosporin c) (Dihydro-MeBmt) 1- [Thr ] 2- [(D)Ser ) g-cyklosporin d) (Val ] 2- ((D)Ser ] s-cyklosporin e) (Dihydro-Meßmt) 1- (Val ]2- [(D)Ser )8-cyklosporin f) [N va ] 2- [(D)Ser )8-cyklosporin g) (Dlhydro-Meßmt] 1- [N va )2- [(D)Ser ] s-cyklosporin h) (N va ] 5- ((D)Ser ] s-cyklosporin och i) (N va J 2- (N va 1 5- f(D)Ser ] S-cyklosporin.

Föreningarna med formeln llla kan framställas genom att man c) i en i O-skyddad form föreliggande, ovan definierad, cyklosporín med formeln lll avspjälkar skyddsgruppen, eller . d) cykliserar en rakkedjig mdekapeptid innehållande sekvensen -H' -MeLeu-MeLeu-Mevai -X ' -Y ' -Sar-HeLeu-Z ' -HeLeu-Al l- 8910111234567 där Y', Z', W' och X' har den ovan angivna betydelsen, varvid mdekapeptiden kan föreligga i oskyddad eller O-skyddad form, och vid behov avspjälkar skydds- gruppen, eller e) för framställning av en cyklosporin med formeln llla, där Y' betecknar -Thr-, -Val- eller -Nva-, Z' betecknar -Val- eller, om' Y' betecknar -N va-, står för -Nva-, W' betecknar -(D)Ser- och X' betecknar -MeBmt-, 10 15 20 25 30 35 461 354 6 i närvaro av ett näringsmedium innehållande (D)-serin odlar en svampstam som producerar (ThÜZ-cyklosporin, (VaÛZ-cyklosporin, [NvaP-cyklosporin eller [Nva]2- (NvaP-cyklosporin och isolerar cyklosporinen med formeln Illa ur den erhållna odlingsbuljongen, eller f) för framställning av en cyklosporin med formeln Illa, 413;- X' befeçknar -dihydro-Meßmb, reducerar motsvarande cyklosporin med formeln Illa, där X' betecknar -MeBmt-.

Undekapeptider för användning vid förfarande d) kan framställas analogt med de allmänna metodernai det ovannämnda europeiska patentet' nr. 0 056 782, exempelvis med avseende på schemat i Exempel la i detta patent, genom att man kombinerar peptidsekvensen bestående av resterna 8 till ll i cyklosporin- molekylen med sekvensen bestående av resterna l till 7, med erforderlig substitution av resterna i ställning 2 och/eller 5 och/eller 8. -(D)Ser- eller -(D)Thr-resten i ställning 8 är lämpligtvis i O-skyddad form, t.ex. i form av O-t- butyl-derivatet. Cykliseringen utförs med användning av de speciella metoderna i det angivna europeiska patentet, med anslutande avspjälkning av O-skyddsgruç» perna, om så erfordras [förfarande c)], enligt i och för sig kända metoder inom peptidkemin. Û.

Den föredragna stammen för användning vid förfarande e) är stammen NRRL 8044 av svamparten Tolypocladium inflatum (GamsJ. En kultur därav har deponerats vid United- States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, lll., USA och står till allmänhetens förfogande.

En annan kultur därav har deponerats vid Fermentation Research Institute, lnage, Chiba City, Japan, under kulturnumret FRI FERM-P nr. 2796. De morfologiska kännetecknen för denna stam, som tidigare tillordnats svamparten Trichoderma polysporum (Link ex Pers.), liksom metoder för framställning och erhållande av för- och efterkulturer, finns utförligt beskrivna i litteraturen, t.ex. i den engelska patentskriften nr. l 491 509.

Enligt förfarande e) odlar man den utvalda stammen, t.ex. arten Tolypocladium inflatum (GamsJ, lämpligtvis under ca 2 veckor i ett närings- medium såsom beskrivs i de efterföljande exemplen och i närvaro av tillsatt (D)- eller (D,L)-serin vid 27°C. Aminosyra-prekursorn tillsätts lämpligtvis i en mängd av ca l till ca 15 g, företrädesvis ca ll- till ca l0 g/liter odlingsmedium.

Lämpligtvis innehåller odiingsmediet även tillsatt aminosyra-prekursor för resten i ställning 2 av den önskade cyklosporinen, t.ex. i mängder från ca 6,0 till ca . 10,0, företrädesvis ca 8,0 g/liter odlingsmedium. Efter inkubationstiden utvinns den erhållna cyklosporinen med formeln Illa ur odlingsbuljongen enligt i och för sig kända metoder, t.ex. genom separering av buljongen i mycel och odlings- filtrat, extraktion av mycelet under homogenisering, och avcentrifugering av I\ 10 l5 20 25 30 35 461 334 cellmaterialet.

Den erhållna råa cyklosporinen kan renas t.ex. kromatografiskt och/eller genom omkristallisation. Därmed avlägsnas särskilt de ytterligare cyklospori- nerna, särskilt de naturliga cyklosporinerna.

Förfarande f) kan exempelvis utföras genom att man använder de under b) beskrivna metoderna.

De efterföljande exemplen belyser utförandet av förfarandet enligt uppfinningen.

EXEMPEL l .

Syntes av [(O-acetyl)-(D)Ser)8-cyklosporin (formel I: X = -MeBmt-, Y = -aAbu-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl-(D)Ser-): Man sätter 20 mg li-dimetylaminopyridin till #7 mg ((D)Ser]8-cyklo- sporin (framställt i överensstämmelse med den i Exempel 1 eller 3 i det ovan- nämnda europeiska patentet nr. 0 056 782 beskrivna metoden) löst i 3 ml metylenklorid. Därefter tillsätter man 6,1 mg nyss destillerad acetylklorid i l ml metylenklorid och rör om den erhållna reaktionsblandningen under l timme vid rumstemperatur. Man späder reaktionsblandningen med 50 ml metylenklorid och skakar med 30 ml vatten. Den organiska fasen avskiljs, torkas över natriumsulfat, avfiltreras och indunstas. Återstoden filtreras på 60 g silikagel (0,062-O,20 mm), varvid man använder metylenklorid/596 metanol som elueringsmedel och upp- samlar i fraktioner om 25 ml. Titelföreningen utvinns ur fraktionerna 4 till 8 med hjälp av tunnskiktskromatografi med användning av CHCL3/ 596 metanol som bärarfas. (mig) = -2o2° (c = 0,921 cflcip.

EXEMPEL 2 Analogt med Exempel 1 framställs följande föreningar utgående från motsvarande ej acylerade cyklosporin: 2.1 (O-bensoyl-(Dßer]8'-cyklosporin (formel I: X = -MeBmt-, Y = -aAbu-, Z = -Val-, Q = -O-bensoyl-(Dßer-j: (ajg) = -2zo° (c = 1,0 1 cncial; 2.2 [O-acetyl-(Dïfhr)s-cyldosporin (formel I: X = -MeBmt-, Y =-aAbu-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl-(M-Thr-j: (u)â° = -219° (c = i,o 1 cflcip; 2.3 [Nva)2- (O-acetyl-(Dßerjs-cyklosporin (formel l: X = -MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl-(Dßer-j: (aJš) = -zao° (c = 1,01 ci-ici3)/ -233° (c = 0,3 1 cHc13)/-i77° (c = o,7e'i cnaoin: amp. = 143-147°c; 2J+ [Valjz- (O-acetyl-(Dßer)8-cyklosporin (formel l: X = -MeBmt-, Y = -Val-, Z = -Val-, Q = -O-acety1-(D)Ser-]: 20 25 30 35 461 354 8 (u)â° = -2i9° (c = 0,9 i ci-iciy; 2.5 (Nva]5- (O-acetyl-(Dßer)s-cyklosporin (formel i: X = -MeBmt-, Y = -aAbu-, Z = -Nva-, Q = -O-acetyl-(D)Ser-]: (c]â° = -21s° (c = 1,0 i cuciy; 2.6 ( Nva]2- (Nva) 5- (O-acetyl-(Dßer ) S-cyklosporin (formel l: X = -MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -Nva-, Q = -O-acetyl-(D)Ser-]: (a)â° = -19s,9° (c = 1,01 ciic13); och 2.7 (Thr]2- (O-acetyl-(Dßer) g-cyklosporin (formel l: X = -MeBmt-, Y -_- -Thr-, Z = -Val-, Q = -0-acetyl-(D)Ser-]: . [alšß -251° (c = 0,86 i cucial/-ivf (c = 0,81 i cflaoin: smp. m- iue°c.

EXEMPEL 3 ämm-S av [ÜïhYÜYO-Mßßmf)1-(O-acetyl-(Dßerf-cyklosporin (formel l: X = -dihydro-MeBmt-_, Y = -oiAbu-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl-(D)Ser-): 51+ mg ((O-acetyl)-(D)Ser)8-cyklosporin i lO ml etanol hydreras med användning av lO mg palladium/djurkol (1096) vid rumstemperatur och normal- tryck. Efter 20 timmar filtreras den erhållna reaktionslösningen genom ett tunt talgskikt, och etanolen avdunstas i vakuum. Efter ytterligare torkning i hög- vakuum får man titelföreningen. (dä) = -2o5,s° (c = 1,021 ci-ic13).

EXEMPEL 14 Följande föreningar framställs, antingen analogt med Exempel 1, utgående från motsvarande ej acylerad cyklosporin, eller analogt med Exempel 3, genom hydrering av motsvarande i Exempel 2 beskrivna cyklosporin: 4.1 (dihydro-Meßmt] 1- (Nva) 2- (O-acetyl-(D)Ser] s-cyklosporin (formel l: X = -dihydro-MeBmb, Y = -Nva-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl- (inser-h smp. = 139-i41°c; (a)å° = -2z§° (c = o,s'a i ci-ici3)/-isa° (c = 0,76 i ciiaom; 4.2 (dihydro-Meßmt ) 1- (Val ] 2- (O-acetyl-(Dlkr) s-cyklosporin (formel I: X = -dihydro-MeBmt-, Y = -Val-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl- (D)Ser-]: (aJšO = -zio° (c = 0,85 i cncian och 4.3 (dihydro-Meßmt] 1- (Thr ) 2- (O-acetyl-(Dßer ] s-cyklosporin (formel I: X = -dihydro-MeBmt-, Y = -Thr-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl- (D)Ser-): (ulšf -za1° (c = 1.0 i CHC13)/-1ez° (c = 1,0 'i ci-iaoii» smp. = ins-i 1so°c.

Framställning av utgàngsmaterialet: 10 15 20 25 30 35 461 334 9 EXEMPEL 5 Följande nödvändiga utgângsföreningar för framställningen av före- ningarna i Exemplen 2.2 till 2.7 framställs analogt med den kända föreningen [(D)Ser)8-cyklosporin. Framställningen av den senare beskrivs i Exempel I det europeiska patentet nr. 0 056 782, med substitution av motsvarande rester i ställningarna 2 och/eller 5 och/eller 8 i förfarandesekvensen, såsom anges i reaktionsschemat till Exempel la i det angivna patentet. 5.1 [(D)'l'hr]8-cyklosporin [formel Illa: X' = -MeBmt-, Y' = -aAbu-, Z' = -va1-, w- = -(o)rhr-]= (u)â° = -2as,7° (e = 1,01 cx-xc13); 5.2 (Nva)2-[(D)Ser]s-cyklosporin [formel Illa: X' = -MeBmt-, Y' = -Nva-, z' = -vax-, w' = -(p)ser-): smp. 1so-1s3°c; (u)š° = -zsz° (c = 0,71 1 cHc13)/-191° (c = o,73 i cflaom; 5.3 (VaUZ- flDlSezflx-cyklosporin (formel Illa: X' = -MeBmt-, Y' = -Val-, Z' = -va1-, w' = -(p)ser-]= ((11%) = -2s7° (c = 1,0 i cHc13)/-25§° (e = o,us1cHc13)/-1a9°(<; = 0,42 icnaou» smp. = 1ae-1ao°c. 5.4 [Nva)5- [(D)Ser)8-cyklosporin [formel Illa: X' = -MeBmt-, Y' = -aAbu-, Z' = -Nva-, W' = -(D)Ser-]: [a)å° = -212° (e = 1,01 cucl ); 5.5 (Nva]2- (Nva]5- ((D)Ser]8-cyklosporin (formel Illa: X' = -MeBmt-, Y' = -Nva-, Z' = -Nva-, W' = -(D)Ser-]: (a)â° = -217° (e = 1,0 i cHc13); och 5.6 (Thr)2- ((D)Ser]8-cyklosporin [formel llla: X' = -MeBmt-, Y' = -Thr-, Z' = -Val-, W' = -(D)Ser-]: - (a]š° = -2ss° (e = 0,39 i cHc13>/-17s° (c = 0,40 i cH3oH)= smp. = un- 152°c.

EXEMPEL 6 Föreningen i Exempel 5.2 kan på annat sätt framställas mikrobiologiskt som följer: a) 10 liter av ett näringsmedium innehållande 50 g maltos, 5 g (DL)- norvalin, 8 g (D)-serin, 0,75 g KHZPOw 0,5 g MgSOaJHzO; 0,1 g CaClïól-IZO och 8 g kaseinpepton per liter ympas med l liter av en konidie- och mycelsus- pension av svampstammen NRRL 801m, som uttagits från en 3 dagar gammal förkultur. Det ympade produktionsmediet fylls i portioner om 100 ml l 100 Erlenmeyer-kolvar, som sedan inkuberas under 11+ dagar vid 27°C pâçen' rundskaké maskin vid 180 varv per minut. Mycelet separeras från odlingsmediet och extraheras i en Turrax genom finfördelning och omrörning med 3 x 3 liter 9096-ig metanol. Det finfördelade mycelet separeras från lösningsmedlet genom sugíilt- 461 354 l0 15 20 25 30 35 10 rering, och de sammanslagna filtraten koncentreras genom indunstning i vakuum vid en temperatur av 40°C, ända tills ångan huvudsakligen består av vatten. Den erhållna blandningen extraheras 4 gånger med användning av 0,5 liter 1,2- dikloretan vid varje extraktion. De sammanslagna LZ-dikloretan-lösningarna koncentreras genom indunstning under vakuum vid en temperatur av 40°C.

Den erhållna återstoden underkastas en gelfiltrering på Sephadex LH-ZO, (1,4 kg; Pharmacia) med metanol och uppsamlas sedan i fraktioner om 280 ml.

Fraktionerna 9-11, innehållande en cyklosporin-blandning, slås ihop och separeras sedan med hjälp av silikagel-kolonnkromatografi (1 kg silikagel, kornstorlek 0,063-0,2 mm, “Merck") med användning av med vatten mättat etylacetat som elueringsmedel (fraktioner om 500 ml). l överensstämmelse med sin polaritet elueras först [Nva2]-cyklosporin (fraktionerna 7-9), följt av en blandning innehållande (Nva2)-((D)Ser8]-cyklosporin och cyklosporin. Separationen av (Nva2]-((D)Ser8]-cyklosporin och cyklosporin sker med hjälp av silikagel- kromatografi (280 g, "Merck", 0,63-0,2 mm) med användning av kloroforml- metanol (98:2) som elueringsmedel (fraktioner om 100 ml). Fraktionerna 20-30, innehållande rå [Nva2]-((D)Ser8)-cyklosporin, renas ytterligare genom tryck- kromatografi på en fasomvänd silikagelkolonn ("Merck LiChropep RP 18, 260 g, kornstorlek O,0I+-0,063 mm) med användning av metanol/vatten (85:15) som elueringsmedel och uppsamlas i fraktioner om 25 ml. De sammanslagna fraktíonerna 415-55 ger rent [Nva2]-((D)Ser8]-cyklosporin som amorft vitt pulver.

Den nödvändiga förkulturen för det ovan angivna förfarandet kan erhållas på följande sätt: b) Den för ympningen använda spor- och mycelsuspensionen, framställd av en kultur av den ursprungligen isolerade stammen NRRL 80414, odlas under 2l dagar vid 27°C på följande agarmedium: 20 g maltextrakt, 20g agar, 4 g jästextrakt per liter avmineraliserat vatten. Sporerna från denna kultur upptas i en fysiologisk koksaltlösning, varvid man får en slutkoncentration av 5 x 106 sporer/ml. 10 ml av denna suspension används för ympning av l liter av en näringslösning med samma sammansättning som odlingsmediet i Exempel 6a, med undantag av (D)-serin- och (DU-norvalin-komponenten. Inkubering sker under 3 dagar vid 27°C på en rundskakmaskin (200 varv per minut). Denna kultur används för ympning av produktionskulturen. [Nva2]-((D)Ser8)-cyklosporin kan fram- ställas på följande sätt i fermentor: c) Ca 109 sporer av en snedagarkultur av stammen NRRL 80114 sätts till en. rostfri stålfermentor innehållande 20 liter av ett förkulturmedium med följande sammansättning: u: l0 15 20 25 30 35 461 334 ll íruktos 75 g Amber EHC 25 g KHZPOÜ 5 g KC) 2,5 g Dest. vatten till l liter (PH = 5,5) Först sker sterilisering under 20 minuter vid l20°C. Gynnsamma inkubationsbetingelser är en temperatur av 27°C, ett luftflödelav 16 liter per minut vid ett övertrydr av 0,5 bar och ett varvtal av 200 varv per minut.

Den förkultur som utvecklas inkuberas under 6 dagar, och därefter sätts 15 liter till en rostfri stålfermentor innehållande 300 liter av ett pro- duktionsmedium med följande sammansättning: Maltos 75 g Amber EHC 25 g KH2PO4 5 g KCl 2,5 g (DlJ-norvalin 5 g (D)-serin 8 g Dest. vatten till l liter (pH = 5,5) Först sker sterilisering under 20 minuter vid l20°C. Kulturen hålls vid en temperatur av 27°c, iufras med en lufrflade på 120 mer per miner, vid en övertryck av 0,5 bar och omrörs vid ett varvtal av 70 varv per minut.

Skumkontroll sker genom tillsats av en silikonemulsion.

Efter inkuberingi ll; dagar kyler man kulturen, som har en totalvolym på 275 liter, till l0°C och avlägsnar mycelet med användning av en Westfalia- separator. Filtratet extraheras genom omrörning 2 gånger med etylacetat.

Extrakten tvättas med en liten mängd vatten, slås samman och torkas i vakuum.

Mycelet försätts med metanol, homogeniseras och filtreras. Denna extraktion upprepas två gånger med användning av 9096 metanol. De metanoliska extrakten slås samman och koncentreras i vakuum under tillsats av vatten. Det kvarvarande vattenhaltiga koncentratet extraheras 2 gånger med etylacetat, extrakten tvättas med en liten mängd vatten, slås samman och koncentreras i vakuum. Den _ extraherade vattenfasen extraheras ytterligare 2 gånger med etylacetat/iso- propanol (8:2). Dessa extrakt slås åter samman och indunstas åter i vakuum.

Mycel- och filtratextrakten filtreras, varvid man använder 50 x mängden Sephadex LH-20 med metanol som elueringsmedel. Toppfraktionerna renas sedan kromatografiskt, varvid man använder 100 x mängden silikagel 60 (kornstorlek = 10 15 20 25 30 35 461 534 l2 0,04-0,063 mm) och med vatten mättat etylacetat som elueringsmedel. Först elueras [Nvazl-cyklosporin, följt av cyklosporin och (Nvazj-flDßersj-cyklo- sporin. Dessa senare fraktioner underkastas en ytterligare kromatografisk rening, varvid man använder lllO x mängden silikagel 60 (kornstorlek 0,063-O,20 mm) och kloroform/metanol (98:2) som elueringsmedel. Man får rent (Nva2]-[(D)Ser8]- cyklosporin.

EXEMPEL 7 Föreningen i Exempel 5.3 kan även framställas mikrobiologiskt genom att man förfar analogt med Exempel 6a) men med följande ändringar:- a) I näringsmediet ersätts (DU-norvalin med lO g (L)-valin. Efter separa- tionen av mycelet från kulturmediet extraherar man på följande sätt: Det råa mycelet avskiljs från lösningsmedlet genom sugfiltrering, och de sammanslagna filtraten koncentreras under tillsats av vatten genom indunstning i vakuum vid en temperatur av løO°C, tills ångan huvudsakligen består av vatten.

Den erhållna blandningen extraheras 3 x med användning av 5 liter etylacetat vid varje extraktion. De sammanslagna etylacetat-lösningarna koncentreras genom indunstning under vakuum vid en temperatur av 40°C.

Den erhållna återstoden underkastas en gelfiltrering på Sephadex Li-l-ZO (1,4 kg; Pharmacia) med metanol. De fraktioner, som innehåller en cyklosporin- blandning, slås samman och separeras sedan med hjälp av silikagel-kolonnkroma- tografi (3 kg silikagel, kornstorlek 0,020-0,0l+5 mm, "Grace“) med användning av med vatten mättat etylacetat som elueringsmedel. I överensstämmelse med sin polaritet elueras först (Valzj-cyklosporin, följt av en blandning innehållande (Val2]-[(D)Ser8)-cyklosporin som huvudkomponent. Ytterligare rening av (vaizj-(llnsersLeyklosporin sker med hjälp av smkagel-kromarugfafi (so g, "Grace", 0,020-0,00l+5 mm) med användning av aceton/hexan (l:l) som eluerings- medel. De fraktioner, som innehåller rått (Val2]-((D)Ser8)-cyklosporin, renas ytterligare genom tryckkromatografi på en fasomvänd silikagelkolonn ("Merck" LlChropep RP 18, 160 g, kornstorlek 0,04-0,063 mm) med användning av metanol/vatten (80:20) som elueringsmedel, varvid man får rent [Val2]- [(D)Ser8 )-cyklosporin som amorft vitt pulver. b) Den nödvändiga förkultmiren erhålls som l Exempel 6b).

[Val2]- ((D)Ser8]-cyklosporin kan framställas på fermentorplanet genom att man går till väga analogt med Exempel 6c), dock med följande ändringar: c) I sammansättningen av proddctionsmediet ersätts (DL)-norvalin med l0 g_ (L)-valin. Efter tillsats av metanol till mycelet, homogenisering och filtrering (2 x med 9096 metanol), föríar man på följande sätt: De metanoliska extrakten slås samman och koncentreras i vakuum under tillsats av vatten. Det kvarvarande, vattenhaltiga koncentratet extraheras 3 x 10 15 20 25 30 35 461 334 13 med etylacetat, extrakten tvättas med en liten mängd vatten, slås samman och indunstas i vakuum.

Mycel- och fiitratextrakten filtreras, varvid man använder 50 x mängden Sephadex LH-ZO med metanol som elueringsmedel. Toppfraktionerna renas sedan kromatografiskt, varvid man använder 40 x mängden silikagel 60 (kornstorlek = 0,0l§-0,063 mm) och med vatten mättat etylacetat som elueringsmedel. Först elueras (Valz j-cyklosporin, följt av cyklosporin och [Val2]-[(D)Ser8]-cyklo- sporin. Dessa senare fraktioner underkastas en ytterligare kromatografisk rening, varvid man använder 100 x mängden silikagel 60 och aceton/hexan (1:1), och en tryckkromatografi på fasomvänd silikagel ("Mercl_<" LiChropep RP 18, kornstorlek 0,0#-0,063 mm) med användning av metanol/vatten (80:20) som elueringsmedel, varvid man får rent [Valzj-((D)Ser8]-cyklosporin.

EXEMPEL 8 Föreningen i-Exempel 5.6 kan även framställas mikrobiologiskt genom att man förfar analogt med Exempel 6a), dock med följande avvikelser: a) I näringsmediet ersätts (DL)-norvalin med 5 g (L)-treonin. Efter inkuba- tionen extraherar man på följande sätt: Mycelet separeras från odlingsmediet och extraheras i en Turrax genom finfördelning och omrörning med 3 x 9 liter 9096-ig metanol. Det finfördelade mycelet avskiljs från lösningsmedlet genom sugfiltrering, och de sammanslagna filtraten koncentreras genom indunstning i vakuum vid en temperatur av I+O°C under tillsats av vatten, tills ångan huvudsakligen består av vatten. Den erhållna blandningen extraheras 3 x med användning av 5 liter etylacetat vid varje extraktion. De sammanslagna etylacetat-lösningarna koncentreras genom in- dunstning under vakuum vid en temperatur av 40°C.

Den erhållna återstoden underkastas en gelfiltrering på Sephadex LH-20 (2 kg; Pharmacia) med metanol. De fraktioner som innehåller en cyklosporin- blandning slås samman och' separeras sedan med hjälp av silikagel-kolonn- kromatografi (2 kg silikagel, kornstorlek 0,02-0,045 mm, "Grace") med använd- ning av med vatten mättat etylacetat som elueringsmedel. I överensstämmelse med sin polaritet elueras först cyklosporin, sedan ((D)Ser8]-cyklosporin följt av (Thrzj-cyklosporín och till sist (Thr2]-((D)Ser8]-cyklosporin i rå form.

Ytterligare rening av (Thr2)- [(D)Ser8]-cyklosporin sker med hjälp av silikagel- kromatografi (50 g, “Grace“, 0,02-0,45 mm) med användning av aceton/hexan (2:l) som elueringsmedel, varvid man får rent [Thrzj- [(D)Ser8)-cyklosporin som amorft vitt pulver. b) Den nödvändiga förkulturen erhålls som i Exempel 6b).

[Thrzj- [(D)Ser8]-cyl genom att man går till väga analogt med Exempel 60), dock med följande lO 15 20 25 30 35 461 534 lll avvikelser: c) l sammansättningen av produktionsmediet ersätts (DlJ-norvalin med 5 g (L). treonín. . Efter inkubationen och avlägsnandet av mycelet med användning av en Westfalia-separator förfar man på följande sätt: Mycelet försätts med metanol, homogeniseras och filtreras. Denna extraktion upprepas 2 x med användning av 9096-ig metanol. De metanoliska extrakten slås samman och koncentreras i vakuum under tillsats av vatten. Det kvarvarande vattenhaltiga koncentratet extraheras 2 x med etylacetat, extrakten tvättas med en liten mängd vatten, slås samman och koncentreras-i vakuum.

Mycelextrakten filtreras, varvid man använder 50 x mängden Sephadex Ll-l-ZO med metanol som elueringsmedel. Toppfraktionerna renas sedan kremato- grafiskt, varvid man använder 30 x mängden silikagel 60 (kornstorlek = 0,0l4-0,063 mm) och med vatten mättat etylacetat som elueringsmedel. Först elueras cyklosporin, sedan [(D)Ser8)-cyklosporin följt av [Thr2]-cyklosporin och till sist (Thr2]-((D)Ser8]-cyl ligare kromatografisk rening, varvid man använder 250 x mängden Silikagel 60 (kornstorlek 0,02-0,0ll5 mm) och aceton/hexan (Zzl) som elueringsmedel. Man får rent [Thrz ] - [ (D)Ser8]-cyklosporin.

EXEMPEL 9 Följande föreningar, som kan användas som utgångsmaterial för fram- ställning av de i Exemplen 4.l till 14.3 angivna föreningarna, kan framställas av de i Exemplen 5 till 7 angivna cyklosporinerna, genom att man förfar analogt med Exempel 3. 9.1 (Dihydro-Meßmt]1-[Nva]2-[(D)Ser)8~cyklosporin (formel Illa: X' = -dihydro-MeBmt-, Y' =-Nva-, Z' = -Val-, W' = -(D)Ser-] - framställd av produkten i Exempel 5.2 eller 6: (nä) = -25l° (c = 1,23 i cllcl3)/-l79° (c = 1,16 i cl-laoll» amp. lss- l57°c. 9.2 [Dihydro-MeBmt] 1- [Val] 2- ((D)Ser]8-cyklosporin [formel Illa: x- = -dlllydro-Melamfe, v' = -val-, z' = -val-, w' = -uulser-J - ffamsfälld av produkten i Exempel 5.3 eller 7: (a)â° = -zza° (c = l,o l cllclß). 9.3 (Dlhydro-Meßmf)1-(rhflz-(mlsefls-cyklosporin (formel illa: x' = -dlhydw-Meßmß, v' = -rhf-, z' = -val-, w' = -(D)ser-) - framställd av produkten i Exempel 5.6 eller 8: (ag -zs2° (c = 0,731 cHcl3)/-l73° (c = 0,79 1 cl-lsofll: smp. = ise- lßs c. 10 15 20 25 30 35 461 554 is' Cyklosporinerna enligt uppfinningen har farmakologisk aktivitet, såsom framgår av följande testmetoder. 10 1.1 1.2 1.3 1.4 2.

Immunosuppressiva verkningar: Lokal hemolys in vitro i gel (R. I. Mishell och R. W. Dutton, J. Exp.

Medicine, lä, 423-442 (1976)). Cyklosporinerna enligt uppfinningen hämmar hemolyszoner jämfört med obehandlade kontroller i koncentra- tioner av 0,01 till 10,0 pg/ml.

Lymfocyt-stimulations-test enligt Janossy och Greaves (Clin. Exp. xmmunoi., 9, usa (1971) och io, 525 (197z)]= cykiospøfinerna enlig: uppfinningen hämmar den av konkanavalin A stimulerade DNA-syntesen (hämning av HB-tymidiminbyggningen), cell-proliferationen och blasto- genesen vid musmjältceller jämfört med obehandlade kontroller i koncentrationer av 0,001 till 10,0 pg/ml.

Blandad lymfocytreaktion (Bach et al, J. Exp. Med. 136, 1030 (l972)]: Reaktionen (dvs. proliferation och differentiering) av lymfocyter (möss (Balb/d-mjältceller) vid saminkubation under 5 dagar med allogena mjältceller från bestrålade möss (CBA Å' ) mäts i närvaro och i frånvaro av testsubstansen. Reaktionen i närvaro uttrycks som den procentuella ändringen av reaktionen jämfört med 10096 för kontrollreaktionen. Vid användning av cyklosporiner enligt uppfinningen observerar man en hämning av reaktionen vid en koncentration av 0,001 till 10,0 tig/ml.

Undertryckande av organ-avstötning: Njurar från givarråttor (F 344, P ) transplanteras i mottagarråttor (Wistar-Furth, Q). Testsubstansen administreras till mottagarráttorna p.o. under 14 dagar. Därefter avbryts behandlingen. 7 dagar efter transplantationen imderkastas testdjuren en bilateral nefrektomi. Efter- som testdjurens levnad beror på om det överförda organet accepteras och fungerar, tjänstgör ökningen av överlevnadstiden jämfört med den för kontrolldjur, som endast fått placebo, som parameter för testsubstansens verkan. Djur, som får cyklosporinerna enligt uppfinningen, uppvisar vid doser av 2,5 till 10 mg/kg p.o. en överlevnadstid på 60 till 250 dagar, jämfört med obehandlade kontroller, som samtliga avlider till följd av organavstötning inom loppet av ca 9 till 10 dagar. lnflam mationshäm mande verkan Den inflammationshämmande verkan kan visas med adjuvans-artrittestet på råtta. Vid detta test induceras adjuvans-artrit enligt metoden enligt Pearson och Wood, "Arthn Rheum." Z, #40 (1959). Cyklosporinerna enligt uppfinningen visar sig vid detta test vara verksamma vid artrit under utveckling och vid 461 554 10 15 20 25 30 35 16 etablerad artrit i doser av l0 till 30 mg/kg/dag p.o. 3. Antiparasitär verkan Anti-malaria-test enligt I.. Rane, “Chemotherapy and Drug Resistance in Malaria" ed. W. Peters, Academic Press, New York, 1970. Möss (OF l: av hankön) infekteras dag O med 0,2 ml av en suspension innehållande '104 parasitiska celler av arten Plasmodium berghei (stam NK 65). Administreringen sker i.p. Dag 3 administrerastestsubstansen s.c. i varierande doser med användning av 5 till 10 möss per dos. Överlevnadstiden fastställs, och den minimala effektiva dosen (MED) beräknas genom jämförelse av överlevnadstiden med den för obehandlade kontrolldjur. Vid kontrolldjuren uppgår överlevnadstiden till ca 7 dagar. MED är den dosering, vid vilken överlevnacLstiden är fördubblad. Cyklosporinerna enligt uppfinningen visar sig vid detta test vara verksamma i doser från 25 till 100 mg/kg/dag, s.c.

Tack vare sin immunosuppressiva verkan kan cyklosporinerna enligt uppfinningen användas för profylax och .behandling av tillstånd och sjukdomar, som kräver en nedsättning av immunsvaret. Sålunda kan cyklosporinerna enligt uppfinningen finna användning vid undertryckande av proliferation av lymfocyter och immunocyter, t.ex. vid behandling av autoimmuna sjukdomar, för att förhindra vävnadsavstötning vid transplantationer, t.ex. vid transplantationer av hud, lunga, hjärta, hjärt-lunga, benmärg, njurar, mjälte och hornhinna. Speciella autoimmuna sjukdomar, vid vilka cyklosporinerna enligt uppfinningen kan finna användning, är sådana, för vilka behandling med cyklosporin A föreslagits eller redan använts, t.ex. aplastisk anemi, "pure red cell anaemia", idiopatisk trombocytopeni, systemisk lupus erythematodes, polykondrit, sklerodermi, Wegeners granulomatos, kroniskt aktiv hepatit, myasthenia gravis, psoriasis, Steven-Johnsons syndrom, idiopatisk sprue, morbus Crohn, Graves oftalmopati, sarkoidos, multipel skleros, primär biliär cirros, primär juvenil diabetes, uveitis posterior, interstitiell lungfibros och psoriasis arthritis.

Tack vare sin inflammationshämmande verkan kan cyklosporinerna enligt uppfinningen finna användning vid behandling av inflammatoriska tillstånd, särskilt inflammatoriska tillstånd med en etiologi, som innefattar en autoimmun- komponent, t.ex. behandling av artrit och reumatiska sjukdomar såsom arthritis chronica progrediens.

Tack vare sin antiparasitära verkan kan cyklosporinerna enligt uppfin- ningen finna användning som antiparasitära läkemedel, t.ex. för behandling av parasitära infektioner av olika typer, särskilt vid protozoer liksom trematod- och nematodinfektioner. Specifika typer av parasitära infektioner, vid vilka cyklo- sporinerna enligt uppfinningen kan finna användning, är sådana, för vilka behandling med cyklosporiner redan föreslagits i litteraturen, t.ex. schistoso- ä 10 15 20 461 334 17 miasis, filariasis, leishmanios, koccidioidomykos OCh Särskilt malaria- För de ovan angivna indikationerna ligger dagsdosen vid ca 75 till ca 5.000, företrädesvis vid ca 2.000, speciellt vid ca 1.500 mg. Vidanvändning av en enhetsdos, t.ex. för oral administrering, är en dos på ca 25 till ca 2.500, företrädesvis ca 1.000, speciellt ca 800 mg av en cyklosporin enligt uppfinningen lämplig, i blandning med något farmaceutiskt godtagbart spädningsmedel eller någon farmaceutiskt godtagbar bärare.

Cyklosporinerna enligt uppfinningen kan administreras på vilken konven- tionell väg som helst, särskilt i överensstämmelse med sedvanliga metoder vid administrering av cyklosporin A, särskilt genom intravenös infusion, t.ex. i fallet med en organtransplantation, före och direkt efter transplantationen, liksom även vid uppträdande av någon gastrointestinal störning, som annars skulle försämra absorptionen eller oralt, t.ex. i form av en oral lösning.

I överensstämmelse med det ovanstående avser föreliggande uppfinning även följande: l. En farmaceutisk komposition innehållande en cyklosporin enligt uppfin- ningen tillsammans med ett farmaceutiskt godtagbart spädningsmedel eller en farmaceutiskt godtagbar bärare; 2. En cyklosporin enligt uppfinningen för användning som läkemedel, dvs. för användning vid behandling inom kirurgi eller terapi, särskilt för använd- ning som ett immunosuppressivum eller som inflammationshämmande eller antiparasitärt medel.

Claims (4)

1. 4-6 1 där fON-(X 10 där 15 där ÛN-<>< 20 '314 18 PÅTEN TKRAV Cyklosporin med formeln I, -Y-S ar-MeLeu-Z-MeLeu-Al a-Q-HeLeu-MeLeu- ßeVa . 123 4 5 6 78 9 10, lll] (1) betecknar -MeBmt- eller -dlhydro-MeBmt-, betecknar -aAbu-, -A1a-, -Thr-, -Val- eller -Nva-, betecknar -Val- eller -N va- och betecknar en rest med formeln II, R2 Rl-CU-O-CHUS) (II) -Nfl-cH-co- (0) betecknar väte, alkyl med l till I: kolatomer eller fenyl, och står för väte eller metyl. Föríarande för framställning av en cyklosporin med formeln I, -Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-Al a-Q-MeLeu-MeLeu- lich 1234567891011 (I) betecknar -MeBmt- eller -dihydrø-Meßmb, betecknar -cxAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- eller -Nva-, betecknar -Val- eller -Nva- och betecknar en rest med formeln II, R

2 R1-co-o-cH(ß) (11) -NH-cH-co- (0) 10 15 20 19 där R 1 betecknar väte, alkyl med 1 till ll kolatomer eller íenyl, och R2 står för väte eller metyl, kännetecknat avattman a) acylerar en cyklosporin med formeln III, -Y-S ar-MeLeu-Z-MeLeu-Al a-H-MeLeu-MeLeu-Mellal F23 456 78910 IIWUII) där X, Y och Z har den ovan angivna betydelsen, och W står för en rest med formeln IV, R2 no-ca (IV) -~H-cH-co- (D) där Rz har den ovan angivna betydelsen, genom att man inför en R FCC-grupp, där RI har den ovan angivna betydelsen, i B-ställning, eller b) reducerar en cyklosporin med formeln I ovan, där X står för -MeBmt-, varvid man får motsvarande cyklosporin, där X betecknar -dihydro- MeBmt-.

3. Cyklosporin med formeln I, -Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-Al a-Q-MeLeu-HeLeu- MV; FZ 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (I) där betecknar -MeBmt- eller -dihydro-Meßmb, betecknar -uAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- eller -Nva-, betecknar -Val- eller -N va- och betecknar en rest med formeln II, ON-<>< 461 534 10 15 20 R2 R1-co-o-cH(ß) (II) -NH-cH-co- (0) där R 1 betecknar väte, alkyl med I till l; kolatomer eller fenyl, och Rz står för väte eller metyl, till användning som läkemedel.

4. Farmaceutisk komposition, k ä n n e t e c k n a d av att den innehåller en cyklosporin med formeln I, -VY-Sar-MeLeu-Z-HeLeu-Al a-Q-MeLeu-MeLeu- Mek 123 45678910 11 (I) där X betecknar -Meßmt- eller -díhydro-Meßmh, Y betecknar -aAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- eller -Nva-, Z betecknar -Val- eller -Nva- och Q betecknar en rest med formeln Il, R2 Rl-CO-O-CHUS) (II) -NH-CH-CO- (D) . där R l betecknar väte, alkyl med l till l: kolatomer eller fenyl, och RZ står för väte eller metyl, som aktiv komponent tillsammans med ett iarmaceutiskt godtagbart spädnings- medel eller en íarmaceutiskt godtagbar bärare. in