NL8500828A

NL8500828A - Cyclosporinen en werkwijzen voor het bereiden en toepassen van deze verbindingen.

Info

Publication number: NL8500828A
Application number: NL8500828A
Authority: NL
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1984-03-23
Filing date: 1985-03-21
Publication date: 1985-10-16
Also published as: DE3509809A1; IT1199962B; PH23357A; IT8547852A1; GB8507270D0; NO851160L; JPH08838B2; FR2561651A1; AT388737B; GB2155936A; NZ211526A; IL74681A0; US4639434A; ES8702926A1; DK128285A; PH21868A; SE8501392D0; PT80149B; ES541465A0; ATA86385A

Description

- 1 - .. 'T....................’

Cyclosporinen en werkwijzen voor het bereiden en toepassen van deze verbindingen.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe cyclosporinen, op werkwijzen voor hun bereiding, farmaceutische preparaten die deze cyclosporinen bevatten, alsmede op het toepassen van deze verbindingen bij thera-5 peutische behandeling.

Met cyclosporinen wordt een reeks van structureel speciale, cyclische, poly-N-gemethyleerde undecapeptiden aangeduid, die gewoonlijk farmacologische werkingen, in het bijzonder immuunsuppressieve, ontstekings-10 remmende en anti-parasitaire werkingen bezitten. Het als eerste geïsoleerde cyclosporine, en eveneens de stamverbinding van deze reeks, is de natuurlijke schimmelmetaboliet cyclosporine A met formule A, waarin -MeBmt- de N-Methyl-(4R)-4-but-2E-en-l-yl-4-methyl-(L)threonyl-rest met for-15 mule B voorstelt, waarin -x-y- =-CH=CH- (trans).

Sinds de oorspronkelijke ontdekking van cyclosporine A werden talrijke, natuurlijke cyclosporinen geïsoleerd en geïdentificeerd en er werden vele andere, in de natuur niet voorkomende, cyclosporinen door een 20 totale of halfsynthetische werkwijze, doch eveneens door gemodificeerde cultuurwerkwijzen, bereid. Daarom heeft de cyclosporinereeks aan betekenis gewonnen en nu omvat ze bijvoorbeeld de natuurlijke cyclosporinen A-Z / zie Kabel en med., European Journal of applied Microbiology and Bio-25 technology 14, 237-240 (1982) en de door Traber en med., 24th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, (8. - 10.10*1984), aangeboden Poster^?, verder verschillende cyclosporinen van niet natuurlijke aard, waaronder dihydro-cyclosporinen (waarin 30 de -x-y-groep in de -MeBmt-rest, zie de hiervoor gegeven formule B, verzadigd is, zoals bijvoorbeeld beschreven in 85 00 8 28 ¥ 9 - 2 - t de Amerikaanse octrooischriften 3.108.985, 4.210.581 en 4.220.641), cyclosporinen waarin de -MeBmt-rest in een ge-isomeriseerde of N-gedemethyleerde vorm aanwezig is (zie het Europeseoctrooischrift 0 034 567 en "Cyclosporine A", 5 Proc. Internat. Conference on Cyclosporin A, Cambridge (U.K.) September 1981, Ed. D.J.G. White, Elsevier Press (1982), die beide de door R. Wenger ontwikkelde totaalsynthetische \ bereidingsmethode van cyclosporinen bevatten) en cyclosporinen, waarin verschillende aminozuren op bepaalde 10 plaatsen van de peptidereeks werden ingebouwd (zie het

Europese octrooischrift 0 056 782). Als voorbeeld van dergelijke, in de hiervoor vermelde literatuur beschreven, cyclosporinen kunnen worden genoemd: / Thr_7 -, /~Val 7 - -2 --2--5 / Nva / - en / Nva / -/ Nva_/ -cyclosporine (eveneens be- 15 kend als cyclosporine C, D, G resp. M), / Dihydro-MeBmt_7 _2 ~ / Val / -cyclosporine (ook bekend als dihydro-cyclosporine D) en / (D)Ser_/ - en / Dihydro-MeBmt_/ -/ (D)Ser_7-cyclo-sporine.

Volgens de nu gebruikelijke nomenclatuur 20 voor cyclosporinen worden deze in deze beschrijving en in \ de conclusies in verband met cyclosporine A aangeduid. Dit geschiedt door eerst de delen van het molecuul aan te geven die van die voorkomende in cyclosporine A afwijken en daarna door vermelding van het woord "Cyclosporine" de overige 25 delen, die overeenkomen met diejin cyclosporine A,Pkarakte- riseren. Daartoe wordt de uitdrukking -Dihydro-MeBmt- toegepast, ter aanduiding van de hiervoor genoemde rest met formule B, waarin -x-y- = -CH_CH„-. Zo wordt met / Dihydro--1 - -2

MeBmt / -/ Val / -cyclosporine elk cyclosporine aangeduid 30 dat de volgorde aangegeven in formule A heeft, waarbij echter -MeBmt- / formule B, -x-y- = -CH-CH-(trans) 7 op de 1-plaats door -Dihydro-MeBmt- / formule B, -x-y- = en -ctAbu- op de 2-plaats door -Val is vervangen. Op over- — —8 eenkomstige wijze wordt met / (D)Ser_/ -cyclosporine het 35 cyclosporine met de volgorde volgens formule A, waarin echter -(D)Ala- op de 8-plaats door -(D)Ser- is vervangen, 8500328 - 3 - * .

aangeduid. Verder hebben, volgens de gebruikelijke praktijk, de aminozuren die door afkortingen zijn gedefinieerd, bijvoorbeeld -Ala-, -MeVal- enz., de (L)-configuratie, voor • zover niet iets anders is vermeld. Resten met het voorvoeg- 5 sel "Me", zoals bijvoorbeeld in -MeLeu-, zijn N-gemethy- leerde resten. De verschillende resten van het cyclosporine-molecuul worden op de wijze als beschreven in de literatuur genummerd, dat wil zeggen in de richting van de klok en uitgaande van de -MeBmt- of -Dihydro-MeBmt-rest op de 10 1-plaats. In de onderhavige beschrijving en conclusies wordt steeds dezelfde getalsvolgorde toegepast.

Volgens de uitvinding werd nu gevonden dat nieuwe cyclosporinen die farmaceutisch kunnen worden toegepast kunnen worden verkregen, waarin de rest op de 15 8-plaats uit een acyloxy-a-aminozuur met de (D)-configura tie bestaat.

Dientengevolge heeft de onderhavige uitvinding in ruimste zin betrekking op een cyclosporine, waarin de aminozuurrest op de 8-plaats een (D)-acyloxy-a-amino- .

20 zuurrest is, dat wil zeggen de rest van een aminozuur van de (D)-reeks, waarin de zijketen aan het a-koolstofatoom door acyloxy is gesubstitueerd.

Het verdient aanbeveling dat de aminozuurrest op de 8-plaats een (D)-3-acyloxy-a-aminozuurrest, dat 25 wil zeggen een rest van een aminozuur van de (D)-reeks met een acyloxygroep, die via het β-koolstofatoom aan het aminozuur is gebonden, is.

(D)-β-acyloxy-a-aminozuurresten die de voorkeur hebben bezitten formule 2, waarin 30 Rj een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-4 koolstof- atomen of de fenylgroep, en R2 een waterstofatoom of de methylgroep voorstellen.

Bijzonder aanbevolen cyclosporinen volgens de onderhavige uitvinding zijn die verbindingen waarin 35 de aminozuurrest op de 8-plaats een 0-Acyl-(D)-seryl- of 0-Acyl-(D)-threonylrest is, in het bijzonder een 8500828 - 4 - Ο-Acyl-(D)-seryl- of Ο-Acyl-(D)-threonylrest met de hiervoor vermelde formule 2.

In een groep cyclosporinen volgens de uitvinding is de aminozuurrest op de 8-plaats een O-Acyl-(D)-5 serylrest, in het bijzonder een O-Acyl-(D)-serylrest, waarin de acylgroep formule R^-CO- heeft, waarin R^ een hiervoor aangegeven betekenis heeft.

In een andere groep cyclosporinen volgens de uitvinding is de aminozuurrest op de 8-plaats een (D)-fS-10 acyloxy-a-aminozuurrest, in het bijzonder een O-Acyl-(D)- serylrest, vooral een D-Acyl-(D)-seryl-rest, waarin de acylgroep met formule R^-COr overeenkomt, waarin R^ een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen voorstelt en de rest op de 5-plaats een (L)-norvalylrest 15 is.

Bijzonder aanbevolen cyclosporinen zijn die met formule 1, waarin X -MeBmt- of -Dihydro-MeBmt- voorstelt, Y -oAbu-, -Ala-, -Thr-,. -Val- of -Nva- weergeeft, 20 Z -Val- of -Nva- is en Q een hiervoor gedefinieerde rest met formule 2 voorstelt.

In formule 1 is Q bij voorkeur een O-Acyl-(D)-seryl- of 0-Acyl-(D)-threonyl-rest, waarin de acylgroep formule R^-CO- heeft, . waarin R^ een hiervoor 25 aangegeven betekenis heeft. Y is bij voorkeur een -aAbu-, -Thr-, -Val- of -Nva- groep.

Een groep cyclosporinen volgens de uitvinding vormen die met formule 1, waarin Y -otAbu- of -Nva-, Z -Val- en R^ waterstof voorstellen.

30 Een andere groep cyclosporinen volgens de uitvinding wordt gevormd door die met formule 1, waarin Y -aAbu- of -Nva-, Z -Nva-, R^ een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen en R^ een waterstofatoom voorstellen.

35 De onderhavige uitvinding heeft verder be trekking op een werkwijze voor het bereiden van een cyclo- 85 0 0 8 28 * « - 5 - sporine, waarin de aminozuurrest op de 8-plaats een (D)-acyloxy-a-aminozuurrest is, bijvoorbeeld een (D)-β-acyloxy-α-aminozuurrest, bijvoorbeeld ter bereiding van een cyclosporine met formule 1, welke gekenmerkt is door het feit 5 a) dat men een cyclosporine, waarin de amino zuurrest op de 8-plaats een (D)-hydroxy-a-aminozuurrest is, bijvoorbeeld een (D) -8-hydroxy-a-aminozuurrest, acyleert, bijvoorbeeld dat men een cyclosporine met formule 3, waarin X, Y en Z de hiervoor aangegeven betekenissen hebben 10 en W een rest met formule 4 is, waarin een hiervoor aan gegeven betekenis heeft, acyleert, door een R^-CO-groep, waarin een hiervoor aangegeven betekenis heeft, op de β-plaats in te voeren, of b) dat men een cyclosporine, waarin de amino-15 zuurrest pp de 1-plaats -MeBmt- is en de rest pp de 8-plaats een (D)-acyloxy-a-aminozuurrest voorstelt, bijvoorbeeld een (D)-8-acyloxy-a-aminozuurrest, reduceert, waarbij men het overeenkomstige cyclosporine verkrijgt, waarin de rest op de 1-plaats dihydro-MeBmt- is, bijvoorbeeld dat men een 20 cyclosporine met formule 1, waarin X * -MeBmt-, reduceert, waarbij men het overeenkomstige cyclosporine verkrijgt, waarin X -Dihydro-MeBmt- voorstelt.

Werkwijze a) kan men volgens pp zichzelf bekende methoden voor het acyleren van hydroxylgroepen ult-25 voeren, bijvoorbeeld door reactie met bij voorkeur twee equivalenten, of, indien Y - -Thr-, één equivalent van een geschikt acyl-, bijvoorbeeld (C1_g)alkanoyl- of benzoyl-halogenide of overeenkomstig -anhydride, of, ter fomjyle-ring, door reactie met bijvoorbeeld azijnzuur-mierezuur-30 anhydride, bij een temperatuur van bijvoorbeeld ongeveer -10° tot 50°C. De reactie vindt onder watervrije omstandigheden plaats, geschikt in een onder de reactie-omstandig-heden inert oplosmiddel, zoals methyleenchloride en in aanwezigheid van een condensatiemiddel, zoals 4-dimethyl-amino-35 pyridine. Onder deze omstandigheden vindt de acylering van de hydroxylgroep van de aminozuurrest op de 8-plaats eerder ------ _ m 85 0 0 8 28 » * - 6 - dan aan de hydroxylgroep van de aminozuurrest op de 1-plaats ! plaats.

Werkwijze b) kan volgens op zichzelf voor de reductie van natuurlijke cyclosporinen tot de overeenkom-5 stige dihydrocyclosporinen bekende wijze worden uitgevoerd, bijvoorbeeld door katalytische hydrogenering, bijvoorbeeld volgens de in het Britse octrooischrift 1.567.201 beschreven algemene methoden.

De hydrogenering verloopt geschikt in een 10 neutraal traject, bij temperaturen tussen ongeveer 20 en 30°C en onder atmosferische of een licht verhoogde druk.

Als hydrogeneringskatalysator zijn bijvoorbeeld platina-oxyde of palladiunikatalysatoren geschikt, bijvoorbeeld palladium op kool. De hydrogenering kan bijvoorbeeld in 15 een onder de reactie-omstandigheden inert oplosmiddel, zoals ethylacetaat of een laag alifatisch alkanol, zoals methanol of isopropanol worden uitgevoerd.

Cyclosporinen met een β-hydroxy-a-aminozuur- — -8 rest op de 8-plaats, in het bijzonder / (D)Ser_/ -cyclospo-20 rine- en / Dihydro-MeBmt_/*-/ (D)Ser /^-cyclosporine, die geschikt zijn als uitgangsmaterialen voor werkwijze a), zijn bijvoorbeeld bekend uit het hiervoor genoemde Europese octrooischrift 0 056 782, waarin eveneens werkwijzen voor hun bereiding zijn beschreven. Andere, als uitgangsmate-25 rialen voor werkwijze a) geschikte cyclosporinen met een hydroxy-a-aminozuurrest op de 8-plaats, kunnen op analoge wijze of volgens de in het Europese octrooischrift 0 034 567 (waarop in de publikatie 0 056 782 is verwezen)., beschreven algemene werkwijze van de cyclosporine-totaal-30 synthese worden bereid, of eveneens volgens de verder hier na, in het bijzonder in de voorbeelden, beschreven werkwijzen.

De cyclosporinen die als uitgangsmaterialen voor werkwijze b) geschikt zijn, kunnen volgens de onder 35 a) beschreven werkwijzen worden bereid.

Hoewel de uitgangsmaterialen met de hiervoor 85 0 0 8 28 « * - 7 - vermelde formule 3, die in de volgende voorbeelden specifiek zijn beschreven, onder de ruime omvang van het hiervoor genoemde Europese octrooischrift 0 056 782 vallen, zijn bepaalde verbindingen daarvan formeel nieuw, dat wil zeggen 5 dat ze tot nu toe nog niet met name zijn genoemd. Volgens de uitvinding werd nu eveneens gevonden dat deze cyclo-sporinen een geheel bijzonder,, interessant of gunstig werkingsspectrum bezitten, in het bijzonder wat betreft hun immuunsuppressieve werking en vooral wat betreft het 10 opheffen van met transplantaties, bijvoorbeeld van orga nen, verbonden ongewenste effecten (afweer), bijvoorbeeld vergeleken met de bekende cyclosporinen met formule 3, dat wil zeggen met die cyclosporinen met formule 3 die in het Eurcrpese octrooischrift 0 056 782 met name zijn genoemd.

15 Dientengevolge heeft de onderhavige uitvin ding in een ruimer aspect betrekking op een cyclosporine met formule 3a, waarin Y' -aAbu-, -Thr-, -Val- of -Nva- voorstelt, 2' -Val- weergeeft, of, indien Y' -aAbu- of -Nva- is, 20 -Nva- weergeeft, W* -(D)Sjer- voorstelt, of, indien Y' = -ctAbu- en Z' * (H/ -Val--T -(D) Thr- weergeeft, en X' -MeBmt- voorstelt, of, indien Y' -Thr-, -Val- of -Nva-, Z' -Val- en W' -(D)Ser- voorstellen, -Dihydro-25 MeBmt- weergeeft.

Specifieke cyclosporinen met formule 3a zijn: — —8 a) / (D)Thr / -Cyclosporine —2™ — —8 b) / Thr_/ -/ (D)Ser_/ -Cyclosporine 30 c) /”Dihydro-MeBmt_7‘^-/~Thr__7^-/-(D)Ser>_78-Cyclosporine d) / Val^72-/™(D)Ser_78-Cyclosporine e) / Dihydro-MeBmt_71 -/ Val_72-/ (D)Ser_78-Cyclosporine f) / Nva_72-/”(D)Ser_7S-Cyclosporine g) / Dihydro-MeBmt_7 -/ Nva 7 -/ (D)Ser 7 -Cyclosporine 35 h) / Nva_/ -/ (D)Ser 7 -Cyclosporine en i) / Nva_72-/ Nva_78-/ (D)Ser 78-Cyclosporine.

85 0 0 8 28 * * - 8 -

Van de hiervoor genoemde cyclosporinen zijn de verbindingen a), b), e), f) en i), in het bijzonder a), f) en i), met het oog op hun werking-werkingsspectrum, bijvoorbeeld hun immuunsuppressieve werking, van bijzonder be-5 lang, bijvoorbeeld vergeleken met de in het Europese oc- trooischrift 0 056 782 specifiek beschreven cyclosporinen.

Verder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor het bereiden van één van de hiervoor gedefinieerde cyclosporinen met formule 3a, welke 10 tot kenmerk heeft dat men c) van een in0-beschermde vorm aanwezig., hiervoor gedefinieerd cyclosporine met formule 3. de beschermende groep afsplitst, of d) een undecapeptide met rechte keten die met formule 15 de volgorde/5 bevat, waarin Y', Z', W' en X' de hiervoor aangegeven betekenissen hebben, ringsluit, waarbij het undecapeptide in onbeschermde of O-beschermde vorm aanwezig kan zijn en indien nodig de beschermende groep afsplitst, of 20 e) ter bereiding van een cyclosporine met formule 3a, waarin Y’ -Thr-, -Val- of Nva- voorstelt, 21 -Val- weergeeft, of, indien Y' = -Nva-, -Nva- voorstelt, 25 Wr -(D)Ser- en -2 X' -MeBmt- voorstelt, een / Thr_/ -cyclosporine, - -2 ~-2 / Val / -cyclosporine, / Nva / -cyclosporine of “-2 - -5 - - / Nva / -/ Nva / -cyclosporine producerende schimmel-stam in aanwezigheid van een (D)-serine bevattend 30 voedingsmedium kweekt en het cyclosporine met formule 3a van de verkregen cultuurvloeistof afscheidt, of f) men ter bereiding van een cyclosporine met formule 3a, waarin X' -Dihydro-MeBmt- voorstelt, het overeenkomstige cyclosporine met formule 3a, waarin X' = -MeBmt-, 35 reduceert.

Undecapeptiden ter toepassing bij werkwijze 850082? « + -θά) kunnen analoog aan de algemene methoden beschreven in het hiervoor vermelde Europese octroaischrift 0 056 782 worden bereid/ bijvoorbeeld onder toepassing van het schema van voorbeeld la van dit octrooischrift/ waarbij men de peptide-5 volgorde bestaande uit de resten 8-11 van het cyclosporine- molecuul met de volgorde bestaande uit de resten 1-7 combineert, met de nodige substitutie van de resten op de 2- en/of 5- en/of 8-plaats. De -(D)Ser- of -(D)Thr-rest op de 8-plaats is geschikt in een O-beschermde vorm, bijvoor-10 beeld in de vorm van het O-t-butyl-derivaat. De ringslui- ting wordt onder toepassing van de in het genoemde Europese octrooischrift vermelde speciale methoden uitgevoerd, met daaropvolgende afsplitsing van de 0-beschermende groepen^indien nodig (werkwijze c) volgens de in de pep-15 tidechemie op zichzelf bekende methoden.

De bij voorkeur toegepaste stam voor toepassing bij werkwijze e) is de NRRL 8044 stam van de schimmel soort Tolypocladium inf latum (Gams). Een cultuur : daarvan werd bij het Amerikaanse Ministerie van Landbouw 20 (Northern Research and Development Division), Peorie, 111.

U.S.A. gedeponeerd en staat ter beschikking aan derden.

Een andere cultuur daarvan werd bij het Fermentation Research Institute, Inage, Chiba City, Japan, onder het cultuurnum-mer FRI FERM-P Nr. 2796, gedeponeerd. De morfologische ken-25 merken van deze stam, die eerst aan de schimnelstam

Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) werden toegekend, evenals de methoden voor het bereiden en verkrijgen van de voor- en naculturen, zijn uitvoerig beschreven in de literatuur, bijvoorbeeld in het Britse octrooischrift 30 1.491.509.

Volgens werkwijze e) wordt de gekozen stam, bijvoorbeeld van de Tolypocladium inflatum (Gams) species, geschikt gedurende ongeveer 2 weken in een voeding smedium, zoals in de hierna volgende voorbeelden is beschreven en 35 in aanwezigheid van toegevoegd (D)- of (D,L)-serine bij 27eC gekweekt. De aminozuur-voorloper wordt geschikt in 85 00 828 - 10 - een hoeveelheid van ongeveer 1 tot ongeveer 15 gram, bij voorkeur ongeveer 4 tot ongeveer 10 g/liter cultuur- vloeistof toegevoegd. Geschikt bevat het cultuurmedium eveneens een toegevoegde aminozuur-voorloper voor de rest *« 5 op de 2-plaats van het gewenste cyclosporine, bijvoorbeeld in hoeveelheden van ongeveer 6,0 tot ongeveer 10,0, bij voorkeur ongeveer 8,0 g/liter, cultuurmedium. Na de incubatietijd wordt het verkregen cyclosporine met formule 3a volgens op zichzelf bekende methoden uit de cultuurvloei-10 stof gewonnen, bijvoorbeeld door scheiding van de vloeistof in mycelium en cultuurfiltraat, extractie van het mycelium onder homogeniseren en afcentrifugeren van het celmate-riaal.

Het verkregen ruwe cyclosporine kan bijvoor-15 beeld chromatografisch en/of door herkristalliseren worden gezuiverd. Daarmede worden in het bijzonder de andere cyclosporinen, vooral de natuurlijke cyclosporinen, verwijderd.. .

Men kan werkwijze f) bijvoorbeeld uitvoe-20 ren door toepassing van de onder b) beschreven methoden.

Voorbeeld I

— _g

Synthese van / (0-acetyl)-(D)Ser_/ -Cyclosporine / formule 1: X = -MeBmt-, Y = -aAbu-, Z = -Val-, Q = -0-acetyl- 25 (D)Ser-_7 ï

Men voegde 20 mg 4-dimethylaminopyridine — —g toe aan 47 mg / (D)Ser_/ -cyclosporine,(dat in overeenstemming met de in voorbeeld 1 of 3 van het hiervoor genoemde Europese octrooischrift 0 056 782 is bereid) opge-30 lost in 3 ml methyleenchloride. Daarna voegde men 6,1 mg vers gedestilleerde acetylchloride en 1 ml methyleenchloride toe en roerde het verkregen reactiemengsel een uur bij kamertemperatuur. Daarna verdunde men het reactiemengsel met 50 ml methyleenchloride en schudde met 30 ml water. 35

De organische fase werd afgescheiden, gedroogd boven na-........... triiimsulfaat, afgefiltreerd en ingedampt. Het residu werd 85 0 0 8 28 - 11 - over 60 g silicagel (0,062-0,20 mm) gefiltreerd, waarbij methyleenchloride-5 % methanol als elutiemiddel werd toegepast en het produkt werd in fracties van 25 ml verzameld.

De in de titel genoemde verbinding, werd met behulp van dunne-5 laagchromatografie onder toepassing van chloroform - 5 % methanol als dragerfase uit de fracties 4-8 gewonnen.

- -20 / α_/* - -202° (c = 0,92 in CHC13).

10 Voorbeeld IX

Analoog aan voorbeeld I werden de volgende verbindingen uitgaande van de overeenkomstige, niet-geacy- leerde cyclosporinen bereid: — —8 — 11.1 / (O-benzoyl)-(D)Ser / -Cyclosporine /formule 1: 15 X — -MeBmt-, Y * -öAbu-, Z = -Val-, Q * -O-benzoyl- (D)Ser-^7 : - -20** / a_/* “ ~220° (c = lf0 111 chc13)' — —8 — 11.2 / O-acetyl-(D)Thr_/ -Cyclosporine / formule 1: 20 X * -MeBmt-, Y = -oAbu-, Z =» -Val-, Q = -O-acetyl- (D)-Ser-_7: - -20 ~ / α _/*u = -219° (c = 1,0 in CHC13>; — —2 — —8 — 11.3 / Nva__/ -/ O-acetyl-(D)Ser_/ -Cyclosporine /formule 1: 25 X = -MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -Val-, Q = -0-acetyl- (D) Ser- 7-* - -20~ / αJ* = -240° (c = 1,0 in CHCl3)/-233° (c = 0,8 in CHC13)/-177° (c * 0,76 in CH3OH): Smp. = 143-147°C.

~ —2 — —8 — 30 II.4 / Val__/ -/ O-acetyl-(D)Ser_/ -Cyclosporine /formule 1: X = -MeBmt-, Y = -Val-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl- (D)Ser_7: - -20 / a_/D = -219° (c = 0,9 in CHC13); 35 II.5 / Nva_/ -/ O-acetyl-(D)Ser_7 -Cyclosporine /formule 1: X = -MeBmt-, Y = -otAbu-, Z = -Nva-, Q = -O-acetyl- 85 00828 - 12 -(D)Ser-_/: /“α_7^° = -215° (c = 1,0 in CHClj) ? — —2 — -5 — —8 11.6 / Nva / -/ Nva / -/ O-acetyl-(D)Ser_/ -Cyclosporine 5 / formule 1: X = -MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -Nva-, Q = -O-acetyl-(D)Ser- 7: fajl0 = -196,9° (c = 1,0 in CHCLj) ; en — _2 — —8 — 11.7 / Thr 7 -/ O-acetyl-(D)Ser / -Cyclosporine /formule 10 1: X = -MeBmt-, Y = -Thr-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl- (D)Ser-_7: - -20** / α /£ « -251° (c = 0,86 in CHC13)/-174° (c - 0,81 in CH3OH). Smpt. - 143-146°C.

15 Voorbeeld III

Synthese van / Dihydro-MeBmt_7 -/ O-acetyl-(D)Ser_/ -cyclosporine / formule 1: X = -dihydro-MeBmt-, Y = -otAbu-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl-(D)Ser-_7:

Men hydrogeneerde 54 mg / (O-acetyl)-(D)Ser_/ -20 cyclosporine in 10 ml ethanol onder toepassing van 10 mg palladium op dierlijke kool (10 %) bij kamertemperatuur en normale druk. Na 20 uren werd de verkregen reactie-oplossing door een dunne laag talk gefiltreerd en de ethanol werd onder verminderde druk af gedampt. Na verder drogen onder 25 hoog^.vacuum werd de in de titel genoemde verbinding ver kregen.

- -20 / <xj* = -205,8° (c = 1,02 in CHC13) .

Voorbeeld IV

30 De volgende verbindingen werden bereid, hetzij analoog aan voorbeeld I, uitgaande van overeenkomstige, niet-geacyleerde cyclosporinen, hetzij analoog aan voorbeeld III, door hydrogenering van het overeenkomstige, in voorbeeld II beschreven, cyclosporinei 85 0 0 8 28 - 13 - IV. 1 / Dihydro-MeBmt_/ *-/ Nva 7^-/ O-acetyl- (D) Ser 7®- cyclosporine / formule 1: X = -dihydro-MeBmt-, Y * -Nva-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl-(D)Ser-_7: - -20 ~ snpt. = 139-141°C? / a_/£ 3 ~225° (c 3 °'88 111 5 CHClg)/-163° (c = 0,76 in CH3OH); — -.1 — _2 — —8 IV.2 / Dihydro-MeBmt_7 -/ Val 7 -/ O-acetyl-(D)Ser / - cyclosporine / formule 1: X = -dihydro-MeBmt-, Y = -Val-, Z * -Val-, Q » -O-acetyl-(D)Ser 7: - -20 10 / ct_/p = -210° (c 0,85 in CHCl3); en — —1 — —2 — —8 IV. 3 / Dihydro-MeBmt 7 ·-/ Thr / -/ O-acetyl- (D) Ser_/ - cyclosporine / formule 1; X =-dihydro-MeBmt-, Y * -Ihr-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl-(D)Ser- 7: - -20 ” 15 / ct_/g = -241° (c = 1,0 in CHC13)/-162° (c = 1,0 in CH3OH): Smpt. * 148-150eC.

Bereiding van het uitgangsmateriaal.

20 Voorbeeld V

De volgende, voor de bereiding van de verbindingen van de voorbeelden II.2-II.7 benodigde uitgangsmaterialen werden analoog aan de bekende verbinding — —8 / (D)Ser_/ -cyclosporine bereid. De bereiding van deze 25 laatste verbinding is beschreven in voorbeeld 1 van het

Europese octrooischrift 0 056 782, met substitutie van de overeenkomstige resten op de 2- en/of 5- en/of 8-plaats bij de bereidingsvolgorde, zoals ze in het reactie schema bij voorbeeld la van het genoemde octrooischrift is aan-30 gegeven.

— —8 — V.l /(D)Thr_7 -cyclosporine / formule 3a: X' = -MeBmt-, Y' = -ctAbu-, Z' * -Val-, W' = -(D)Thr-_7: /‘«_7q° - -248,7° (c = 1,0 in CHC13); 35 —2 — —8 — V.2 / Nva / -/ (D)Ser / -cyclosporine / formule 3a: X' = 85 0 0 8 28 - 14 - -MeBmt-, Y' = -Nva-, Z' = -Val-, W' = -(D)Ser- 7: - -20 smpt. 150-153°C; / α 7β = -262° (c = 0,71 in CHCl^)/ -191° (c = 0,73 in CH3OH); — —2 — —8 — 5 V.3 / Val / -/ (D)Ser / -cyclosporine / formule 3a: X' = -MeBmt-, Y' = -Val-, Z' = -Val-, W' = -(D)Ser- 7: - -20 / a_/p = -257° (c = 1,0 in CHCl3)/-255° (c - 0,45 in CHC13)/-189° (c = 0,42 in CH3OH): Smpt. 136-140°C; 10 V.4 / Nva / -/ (D)Ser 7 -cyclosporine /formule 3a: X' = -MeBmt-, Y' = -aabu-, Z' = -Nva-, W' = -(D)Ser-_7: - -20 ” / aj£ = -212° (c = 1,0 in CHCl3) ? _ —2 — —5 — —0 V.5 / Nva 7 “/ Nva /:-/ (D) Ser_/ -cyclosporine / formule 15 3a: X' = -MeBmt-, Y' = -Nva-, Z' = -Nva-, W' = -(D)- _ _ „20

Ser-/: / o- -217° (c = 1,0 in CHCl3) ,· en V.6 / Thr_7 -/ (D)Ser_/ -cyclosporine / formule 3a: X' = - -MeBmt-, Y’ = -Thr-, Z' =-Val-, W’ = -(D)Ser-_7: 20 />^0 = -258° (c 0,39 in CHC13)/-178° (c = 0,40,in CH30H)s Smpt. « 147-152°C.

Voorbeeld VI

De verbinding van voorbeeld V.2 kan even-25 eens op andere wijze microbiologisch als volgt worden be reid: a) 10 liter van een voedingsmedium dat 50 g maltose, 5.g (DL)-norvaline, 8 g (D)-serine, 0,75 g KH2PC>4, 0,5 g MgS04.7H20; 0,1 CaCl2.6H20 en 8 g caseïne- 30 pepton per liter bevatte werden geënt met 1 liter van een

konidia- en mycelium-suspensie van de schimmelstam NEED

werden 8044, die aan een 3 dagen oude voorcultuur \ onttrokken. Het geënte produktiemedium werd in porties van 100 ml in Erlenmeyerkolven van 100 ml gebracht, die daarna gedurende 35 14 dagen bij 27°C op een rondschudmachine met 180 omwente lingen per minuut werden geïncubeerd. Het mycelium werd 8500828 - 15 - van het cultuurmedium afgescheiden en in een Turrax door verkleinen en roeren met 3x3 liter 90 %-ige methanol geëxtraheerd. Het verkleinde mycelium werd door filtreren onder afzuigen van het oplosmiddel afgescheiden en de samen-5 gevoegde filtraten werden door verdampen onder verminderde druk bij een temperatuur van 40°C geconcentreerd, totdat de damp in hoofdzaak uit water bestond. Het verkregen mengsel werd 4 x onder toepassing van 0,5 liter 1,2-dichloorethaan bij elke extractie geëxtraheerd. De samengevoegde 1,2-di-10 chloorethaanoplossingen werden door verdampen onder vermin derde druk bij een temperatuur van 40°C geconcentreerd.

Het verkregen residu werd onderworpen aan een gelfiltratie over Sephadex LH-20 (1,4 kg; Pharmacia) met methanol en daarna verzameld in fracties van 280 ml.

15 De fracties 9-11, die een cyclosporinemengsel bevatten, werden samengevoegd en daarna met behulp van Silicagel-kolomchromatografie (1 kg Silicagel, korrelgrootte 0,063-0,2 mm, "Merck'*) onder toepassing van met water verzadigde .

ethylacetaat als elutiemiddel (fracties van 500 ml) geschei- 20 den. In overeenstemming met hun polariteit werd eerst - -2 / Nva / -cyclosporine (fracties 7-9) geëlueerd, gevolgd ““ ^ _ _2 — —3 door een mengsel dat / Nva / -/ (D)Ser / -cyclosporine en “ — ~ ~ _ 2 - — 8-cyclosporine bevatte. De scheiding van / Nva /-/ (D)Ser /- cyclosporine en cyclosporine geschiedde met behulp van 25 silicagel-chromatografie (280 g, "Merck", 0,63-0,2 mm) onder toepassing van een mengsel van chloroform en methanol (98ï2) als elutiemiddel (fracties van 100 ml). De fracties - 2 - - 8 - 20-30, die ruw / Nva /-/ (D)Ser /-cyclosporine bevatten^ werden verder gezuiverd door drukchromatografie over een f 30 fasenomgekeerde, silicagelkolom ("Merck" LiChropep RP 18, 260 g, korrelgrootte 0,04-0,063 mm) onder toepassing van een mengsel van methanol en water (85:15) als elutiemiddel en in fracties van 25 ml verzameld. De verenigde fracties 45- — 2 — — 8 — 55 geven zuiver / Nva _/-/ (D)Ser /-cyclosporine als een 35 amorf, wit poeder.

De voor de hiervoor beschreven werkwijze be- 8500828 .-16- nodigde voorcultuur kan als volgt worden verkregen: b) De voor het enten toegepaste sporenen myceliumsuspens ie, bereid uit een cultuur van de oor-; sprohkelijk geïsoleerde stam NRRL· 8044, werd 21 dagen bij 5 27°C op het volgende agarmedium gekweekt: 20 g moutextract, 20 g agar, 4 g gistextract per liter gedemineraliseerd water. De sporen van deze cultuur werden opgenomen in een fysiologische natriumchloride-oplossing, waarbij een eind- g concentratie van 5 x 10 sporen per ml werd verkregen.

10 Van deze suspensie werden 10 ml voor het enten van 1 liter van een voedingsoplossing met dezelfde samenstelling als het cultuurmedium van voorbeeld Vla, met uitzondering van de- (D)-serine- en (DL)-norvaline-component, toegepast. Het bebroeden geschiedde 3 dagen bij 27°C met een schud- 15 machine (200 omwentelingen per minuut) . Deze cultuur werd voor het enten van de produktiecultuur toegepast.

— 2 - _ 8 / Nva _/-/ (D)Ser J-cyclosporine kan op de volgende wijze in een fermenteerinrichting worden geproduceerd: 9 20 c) Ongeveer 10 sporen van een schuine agar- cultuur van de NRRL 8044 stam werden toegevoegd aan een roestvrij stalen fermenteerinrichting waarin 20 liter van een voor cultuurmedium met de volgende samenstelling aanwezig was: 25 Fructose 75 g

Amber EHC 25 g KH2P04 5 g KC1 2,5 g

Gedest. water tot 1 liter 30 (pH = 5,5)

Voorafgaand werd 20 minuten bij 120°C gesteriliseerd. Gunstige incubatie-omstandigheden zijn een temperatuur van 27°C, een luchtsnelheid van 16 liter per 35 minuut bij een overdruk van 0,5 bar en een omwentelings- snelheid van 200 omwentelingen per minuut.

85 0 0 828 - 17 -

De zich vormende voorcultuur werd 6 dagen bebroed en hierna werden 15 liter aan een roestvrij stalen fermenteerinrichting die 300 liter van een produktiemedium met de volgende samenstelling bevatte toegevoegd: 5 maltose 75 g

Amber DEC 25 g KH2P04 5 g KCl 2,5 g (DL)-norvaline 5 g 10 (D)-serine 8 g

Gedest.water tot 1 liter (pH = 5,5)

Voorafgaand werd 20 minuten bij 120°C ge-15 steriliseerd. De cultuur werd op een temperatuur van 27°C

gehouden, belucht met een luchtsnelheid van 120 liter lucht per minuut, bij een overdruk van 0,5 Bar en geroerd bij een omwentelingssnelheid van 70 omwentelingen per minuut. Door toevoegen van een silicon-emulsie werd de 20 vorming van schuim tegengegaan.

Na 14 dagen bebroeden werd de cultuur, die een totaal volume van 275 liter had, afgekoeld tot 10°C en het mycelium werd onder toepassing van een 'Westfalia-afscheider verwijderd. Het filtraat werd door 25 twee malen roeren met ethylacetaat geëxtraheerd. De extrac ten werden met een weinig water gewassen, samengevoegd en onder verminderde druk gedroogd.^ Men voegde aan het mycelium methanol toe, homogeniseerde en filtreerde. Deze extractie werd twee malen herhaald onder toepassing van 30 90 % methanol . De methanolische extracten werden samenge voegd en onder toevoeging van water onder verminderde druk geconcentreerd. Het achterblijvende, waterige concentraat werd twee melen geëxtraheerd met ethylacetaat en de verkregen extracten werden gewassen met een weinig water, samen-35 gevoegd en onder verminderde druk geconcentreerd. De ge ëxtraheerde waterige fase werd nog twee malen geëxtraheerd 8500828 - 18 - met een mengsel van ethylacetaat en isopropanol (8:2) .

Deze extracten werden samengevoegd en weer onder verminderde druk ingedampt.

De mycelium- en filtraatextracten werden ge- 5 filtreerd, waarbij 50 malen de hoeveelheid aan Sephadex LH- 20 met methanol als elutiemiddel werden toegepast. Hierna werden de top-fracties chromatografisch gezuiverd, waarbij 100 malen de hoeveelheid aan Silicagel 60 (korrelgrootte = 0,04-0,063 mm) en met water verzadigde ethylacetaat als - 2 - 10 elutiemiddel werden toegepast. Eerst elueerde / Nva _/- cyclosporine, gevolgd door cyclosporine en / Nva^ 7-/ (D)- 3 _ ”

Ser /-cyclosporine. Deze latere fracties werden aan een volgende chromatografische zuivering onderworpen, waarbij 140 malen de hoeveelheid aan Silicagel 60 (korrelgrootte 15 0,063-0,20 mm) in een mengsel van chloroform, en methanol (98:2) als elutiemiddel werden gebruikt. Aldus verkreeg - 2 - - 8 - men zuiver / Nva J-f (D)Ser ^/-cyclosporine.

Voorbeeld VII

20 De verbinding van voorbeeld V.3 kan even eens microbiologisch worden bereid, waarbij men analoog -aan voorbeeld Vla) tewerk gaat, echter onder toepassing van de volgende wijzigingen: a) In een voedingsmedium werd het (DL)—nor-25 valine door 10 g (L·)-valine vervangen. Na het afscheiden van het mycelium: van het cultuurmedium werd als volgt geëxtraheerd:

Het ruwe mycelium werd door zuigfiltratie van het oplosmiddel gescheiden en de samengevoegde extrac-30 ten werden onder toevoegen van water door verdampen onder verminderde druk bij een temperatuur van 40°C geconcentreerd, totdat de damp hoofdzakelijk uit water bestond.

Het verkregen mengsel werd drie malen onder toepassing van 5 liter ethylacetaat bij elke extractie geëxtraheerd. De 35 samengevoegde ethylacetaat-oplossingen werden door indam

pen onder verminderde druk bij een temperatuur van 40°C

85 0 0 8 28 - 19 - geconcentreerd.

Het verkregen residu werd onderworpen aan een gelfiltratie over Sephadex LH-20 (1,4 kg; Pharmacia) met methanol. De fracties die een cyclosporine-mengsel bevat-5 ten werden samengevoegd en daarna met behulp van silicagel- kolomchromatografie (3 kg Silicagel, korrelgrootte 0,020-0,045 mm, "Grace") onder toepassing van met water verzadigde ethylacetaat als elutiemiddel gescheiden. In overeen- 2 - stemming met hun polariteit werd eerst / Val /-cyclosporine _ 2 — — g __ 10 geêlueerd, gevolgd door een mengsel dat / Val /-/ (D)Ser _/- cyclosporine als hoofdbestanddeel bevatte. De verdere zui-— 2 - - 8 — vering van / Val /-/ (D)Ser J-cyclosporine geschiedde met behulp van Silicagel-chromatografie (80 g, "Grace", 0,020- 0,0045 mm) onder toepassing van een mengsel van gelijke 15 delen aceton en hexaan als elutiemiddel. De fracties die — 2 — 8 “ ruw / Val /-/ (D)Ser /-cyclosporine bevatten werden verder gezuiverd door drukchromatografie over een fasenomge-keerde silicagelkolom ("Merck" LiChropep RP 18, 160 g, .

korrelgrootte 0,04-0,063 mm), onder toepassing van een meng- 20 sel van methanol en water (80:20) als elutiemiddel, waarbij - 2 - - 8 - zuiver / Val /-/ (D)Ser ^/-cyclosporine als amorf, wit poeder werd verkregen.

b) De benodigde voorcultuur werd verkregen 25 op de wijze als beschreven in voorbeeld VI b).

— 2 - - 8 — / Val /-/ (D)Ser /-cyclosporine kan op het fermenteeroppervlak worden bereid, waarbij men tewerk gaat op de wijze als beschreven in voorbeeld VI c), echter 30 met de volgende wijzigingen: c) In de samenstelling van het produktie-medium werd het (DL)-norvaline vervangen door 10 g (L)-valine. Na toevoeging van methanol aan het mycelium, homoge- 35 niseren en filtreren (2 x met 90 % methanol), werd als volgt tewerk gegaan: 85 00 8 28 - 20 -

De methanolische extracten werden samengevoegd en onder toevoeging van water onder verminderde druk geconcentreerd. Het achterblijvende, waterige concentraat werd drie malen geëxtraheerd met ethylacetaat, waarna de 5 extracten met een weinig water werden gewassen, samenge voegd en onder verminderde druk ingedarapt.

Het mycelium en de filtraat-extracten werden gefiltreerd, waarbij 50 malen de hoeveelheid aan Sephadex LH-20 met methanol als elutiemiddel werd toegepast. De top-10 fracties werden hierna chromatografisch gezuiverd, waarbij 50 malen de hoeveelheid aan Silicagel 60 (korrelgrootte = 0,04-0,063 mm) en met water verzadigde ethylacetaat als 2 - elutiemiddel werden gebruikt. Eerst elueerde / Val /- -~ 2 -” - cyclosporine, gevolgd door cyclosporine en / Val /-/ (D)- 3 — ~~ — — 15 Ser /-cyclosporine. Deze latere fracties werden aan een volgende chromatografische zuivering onderworpen, waarbij 100 malen de hoeveelheid aan Silicagel 60 en een mengsel van gelijke delen aceton en hexaan werden toegepast en aan een drukchromatografie over fasenomgekeerde silicagel 20 C"Merck" LiChroprep RP 18, korrelgrootte 0,04-0-,063 mm) onder toepassing van een mengsel van methanol en water - 2 - - (80s20) als elutiemiddel, waarbij zuiver / Val /-/ (D)- 8 ** "" — —

Ser /-cyclosporine werd verkregen.

25 Voorbeeld VIII

De verbinding van voorbeeld V.6 kan eveneens microbiologisch worden bereid, door analoog aan voorbeeld VI a) te werk te gaan, echter onder toepassing van de volgende wijzigingen: 30 a) In het voedingsmedium wordt het (DL) -nor-valine vervangen door 5 g (L)-threonine. Na de incubatie wordt als volgt geëxtraheerd:

Het mycelium wordt van het cultuurmedium 35 gescheiden en in een Turrax door verkleinen en roeren met 3x9 liters 90 %-ige methanol geëxtraheerd. Het verklein- 85 00 8 28 - 21 - de mycelium wordt door afzuigfiltratie van het oplosmiddel afgescheiden en de samengevoegde filtraten worden onder toevoeging van water door verdampen onder verminderde druk bij een temperatuur van 40°C geconcentreerd, totdat de damp 5 hoofdzakelijk uit water bestaat. Het verkregen mengsel wordt driemalen onder toepassing van 5 liter ethylacetaat bij elke extractie geëxtraheerd. De verenigde ethylacetaat-oplossin-gen worden door verdampen onder verminderde druk bij een temperatuur van 40°C geconcentreerd.

10 Het verkregen residu werd onderworpen aan een gelfiltratie over Sephadex LH-20 (2 kg; Pharmacia) met methanol. De fracties die een cyclosporine-mengsel bevatten werden samengevoegd en daarna met behulp van silicagel-kolomchromatografie (2 kg Silicagel, korrelgrootte 0,02-15 0,045 mm, "Grace") onder toepassing van met water verzadig de ethylacetaat als elutiemiddel gescheiden. Inovereen- stemming met hun polariteit werd eerst cyclosporine ge-~ 8 - elueerd, daarna / (D)Ser /-cyclosporine gevolgd door ; — 2— *” _ 2 - - 8 -/ Thr _/-cyclosporine en tenslotte / Thr _/-/ (D)Ser _/- 20 cyclosporine in ruwe vorm. De verdere zuivering van — 2 - - 8 - / Thr /-/ (D)Ser /-cyclosporine geschiedt met behulp van

Silicagel-Chromatographie (50 g, "Grace", 0,02-0,45 mm) onder toepassing van een mengsel van aceton en hexaan (2:1) — 2 — — 8 — als elutiemiddel, waarbij zuiver / Thr /-/ (D)Ser _/-25 cyclosporine als een amorf, wit poeder wordt verkregen.

b) De benodigde voorcultuur wordt verkregen op de wijze als beschreven in voorbeeld VI b).

— 2 — — 8 - 30 / Thr _/-/ (D)Ser /-cyclosporine kan op het fermenteer-oppervlak worden verkregen door analoog aan voorbeeld VI,c) tewerk te gaan, echter onder toepassing van de volgende wijzigingen: 1 85 00 8 28 c) In de samenstelling van het produktie- medium werd het (DL)-norvaline vervangen door 5 g (L)-threo- - 22 - nine. Na de incubatie en het verwijderen van het mycelium onder toepassing van een Westfalia-afscheider werd als volgt tewerk gegaan:

Aan het mycelium werd methanol toegevoegd, 5' daarna werd gehomogeniseerd en gefiltreerd. Deze extractie werd twee malen onder toepassing van 90 %-ige methanol herhaald. De methanolische extracten werden samengevoegd en onder toevoeging van water onder verminderde druk geconcentreerd. Het achtergebleven, waterige concentraat werd 10 twee malen geëxtraheerd met ethylacetaat en de verkregen extracten werden met een weinig water gewassen, samengevoegd en onder verminderde druk geconcentreerd.

De mycelium-extracten werden gefiltreerd, waarbij de 50-voudige hoeveelheid aan Sephadex LH-20 met 15 methanol als elutiemiddel werd toegepast. De top-fracties werden hierna chromatografisch gezuiverd, waarbij 30 malen de hoeveelheid aan Silicagel 60 (korrelgrootte = 0,04-0,063 mm) en met water verzadigde ethylacetaat als elutiemiddel werden toegepast. Eerst elueerde cyclosporine, daar- — 8 -* — 2 — 20 na / (D)Ser /-cyclosporine gevolgd door / Thr /-cyclo- ~ — 2 - - 8 —— "* sporine en tenslotte / Thr /-/ (D)Ser /-cyclosporine.

Deze laatste fracties werden aan een volgende chromatogra-fische zuivering onderworpen, waarbij 250 malen de hoeveelheid aan Silicagel 60 (korrelgrootte 0,02-0,045 mm) en 25 een mengsel van aceton en hexaan (2:1) als elutiemiddel — 2 — — 8 — werden toegepast. Aldus werd zuiver / Thr /-/ (D)Ser _/-cyclosporine verkregen.

Voorbeeld IX _ 30 De volgende verbindingen, die als uitgangs materiaal voor het bereiden van de in de voorbeelden IV. 1-IV.3 vermelde verbindingen kunnen worden toegepast, kunnen uit de in de voorbeelden V-VII vermelde cyclosporinen worden bereid, waarbij men analoog aan voorbeeld III te-35 werk gaat.

85 0 0 8 28 ^ - 23 - — —1 — —2 — —8 IX.1 / Dihydro-MeBmt / -/ Nva_/ -/ (D)Ser / -cyclo sporine / formule 3a: X1 = -dihydro-MeBmt-, Y' = -Nva-, 2' = -Val-, W' = -(D)Ser- 7 - bereid uit het produkt van voorbeeld V.2 of VI: — —9Π 5 L = -251° <c = lf23 111 CHCl3)/-179e (c = 1,16 in CH3OH): Smpt. = 155-157°C.

— _9 — —8 IX.2 / Dihydro-MeBmt / -/ Val / -/ (D)Ser / -cyclo sporine / formule 3a: X' = -dihydro-MeBmt-, Y' = 10 -Val-, Z' = -Val-, W = -(D)Ser-_7 - bereid uit het produkt van voorbeeld V.3 of VII: - -20 / a J* = -224° (c = 1,0 in CHC13) .

IX.3 / Dihydro-MeBmt_7 -/ Thr / -/ (D)Ser / -cyclo- 15 sporine / formule 3a: X' = -dihydro-MeBmt-, Y' = -Thr-, Z' = -Val-, W' = -(D)Ser-_7 - bereid uit het produkt van voorbeeld V.6 of VIII: - -20 / α /- -262° (c - 0,73 in CHCl,)/-173° (c * .

0,79 in CH30H) ï Smpt. * 156-158°C

20

De cyclosporinen, waarin de aminozuurrest op de 8-plaats een (D)-acyloxy-a-aminozuurrest is, zoals hiervoor is gedefinieerd en beschreven, hierna als cyclosporinen volgens de uitvinding aangeduid, bezitten een 25 farmacologische werking, zoals uit de volgende onderzoek methoden bleek.

1. Immunosuppressieve werkingen: 1 2 3 4 5 6 8500828 1.1 Lokale hemolyse in vitro in Gel / R.I.

2

Mishell en R.W. Dutton, J. Esq?. Medicine, 126, 423-442 3 (1976)J. De cyclosporinen volgens de uitvinding remmen 4 hemolysezones vergeleken met niet-behandelde controles in 5 een concentratie van 0,01-10,0^tg/ml. .

6 1.2 De lymfocyten-stimuleringsproef volgens - 24 -

Janossy en Greaves / Clin. Exp. Immunol., _9, 483 (1971) en 10, 525 (1972) /: De cyclosporinen volgens de uitvinding remmen de door cqncanavaline A gestimuleerde DNA-synthese ’3 (remming van de H -Thymidine-inhouw) , de cel vermeerdering 5 enblastogenese bij miltcellen van muizen ten opzichte van niet-behandelde controles in een concentratie van 0,00Ι-ΙΟ, 0 ^ig/ml.

1.3 Gemengde lymfocytenreactie / Bach en med., 10 J. Exp. Med. 136, 1430 (1972)_/:

De reactie (dat wil zeggen vermeerdering en differentiëring) van lymfocyten / muizen (Balb/c) miltcellen / bij co-incubatie gedurende 5 dagen met allogene miltcellen van bestraalde muizen (CBA £ ) werd in aan- en IS afwezigheid van de te onderzoeken verbinding gemeten. De reactie in aanwezigheid werd in de procentuele verandering van de reactie, vergeleken met 100 % van de controle-reac-tie, uitgedrukt. Bij gebruik van de cyclosporinen volgens de uitvinding werd een remming van de reactie bij een con-20 eentratie van 0,001-10,0 ^ig/ml waargenomen.

1.4 Onderdrukking van de orgaan-afstoting: Nieren van Geber-ratten (F 344, ?) werden in ontvanger-ratten (Wistar-Furth, ?) getransplanteerd.

25 Gedurende 14 dagen werd p.o. de te onderzoeken verbinding aan de ontvanger-ratten toegediend. Daarna werd de behande- \ ling onderbroken. 7 dagen na de transplantatie werden de proefdieren aan een bilaterale nefrectomie onderworpen. Aangezien het leven van de proefdieren van de acceptatie 30 en het functioneren van de overgedragen organen afhing, is de verhoging van de overlevingstijd, vergeleken met die van controle-dieren, die slechts een placebo ontvingen, een parameter voor de werking van de te onderzoeken verbinding. Dieren die de cyclosporinen volgens de uitvinding ont— ‘ 35 vingen vertoonden bij doses van 2,5-10 mg/kg p.o. een ! ! overlevingstijdsverloop van 60 tot 250 dagen, vergeleken 8500828 - 25 - met niet-behandelde controle-dieren, die alle ten gevolge van orgaanafstoting binnen ongeveer 9 tot 10 dagen stierven.

5 2. De ramende werking tegen ontstekingen.

De remmende werking tegen ontstekingen kan met de adjuvans-arthritis-proef bij ratten worden aangetoond. Bij deze proef werd de adjuvans-arthritis volgens 10 de methode van Pearson en Wood, "Arthr. Rheum." _2, 440 (1959) geïnduceerd. De cyclosporinen volgens de uitvinding bleken bij deze proef in doses van 10-30 mg/kg per dag p.o. werkzaam bij zich ontwikkelende en reeds gevestigde arthritis te zijn.

15 3. Werking tegen parasieten.

De anti-malaria-proef volgens L. Rane, "Chemotherapie and Drug Resistance in Malaria" ed. W.Peters, 20 Academie Press, New York, 1970. Muizen (OFl: mannetjes) -7 werden op de dag 0 met 0,2 ml van een suspensie die 10 parasietencellen van de Plasmodium berghei species (stam NK 65) bevatten geïnfecteerd. De toediening geschiedde i.p.. Op de derde dag werd de te onderzoeken verbinding 25 met variërende doses onder toepassing van 5-10 muizen per dosis s.c. toegediend. De overlevingstijd werd genoteerd en de mini-male doeltreffende dosis (MED) werd door vergelijking van de overlevingstijd met die van niet-behandelde controledieren berekend. Bij de controle-dieren bedraagt 30 de overlevingstijd ongeveer 7 dagen. De MED is die dose ring, waarbij de overlevingstijd verdubbeld is. De cyclosporinen volgens de uitvinding blijken bij deze proef in dosis van 25-100 mg/kg per dag, s.c., werkzaam te zijn. 1 85 0 0 8 28

Op grond van hun immunosuppressieve wer king kunnen de cyclosporinen volgens de uitvinding ter » - 26 - voorkoming en behandeling van condities en ziekten, die een verlaging van de immuunreactie nodig maken, worden toege-• past. Zo kunnen de cyclosporinen volgens de uitvinding wor den toegepast bij de onderdrukking van de vermeerdering van 5 lymfocyten en imraunocytenf zo bijvoorbeeld bij de behande ling van autoimmuunziekten, ter verhindering van weefsel-afstoting bij transplantaties, bijvoorbeeld bij de huid, longen, hart, hart-longen, beendermerg, nieren, milt en hoornvlies transplantaties. Specifieke autoimmuunziekten, 10 waarbij de cyclosporinen volgens de uitvinding kunnen wor den aangewend, zijn die, waar'onda: de behandeling met cyclosporine A wordt voorgesteld of reeds is aangewend, bijvoorbeeld aplastische anemie, "pure red cell anaemia", idio-pathische trombocytopaenie, systemische Lupus erythematoden, 15 polychondritis, sclerodermie, Wegener granulomatose, chronisch actieve hepatitis, myasthenia gravis, psoriasis, Steven-Johnson syndroom, idiopathische spruw, Morbus Crohn, Graves opthalmopathie, sarcoidose, multiple sclerose, primaire billiare cirrhose, primaire juvenüe diabetes, 20 uveitis posterior, interstitiele longfibrose en psoriasis arthritis.

Op grond van hun remmende werking tegen ontstekingen kunnen de cyclosporinen volgens de uitvinding worden toegepast bij de behandeling van door ontsteking ver-25 oorzaakte aandoeningen, in het bijzonder door ontsteking veroorzaakte ziekten met een ethiologie, die een autoimmuun-component inhoudt, bijvoorbeeld de behandeling van arthritis en rheumatische aandoeningen, zoals Arthritis chronica progredien-s.

30 Op grond van hun anti-parasitaire werking kunnen de cyclosporinen volgens de uitvinding worden toegepast als anti-parasitaire geneesmiddelen, bijvoorbeeld voor de behandeling van parasitaire infecties van verschillende aard, in het bijzonder bij protozoën, zoals eveneens trema-1 35 toden- en nematodeninfecties. Specifieke typen van para- ________sitaire infecties, waarbij de cyclosporinen volgens de uit- 8500828 -. * - 27 - vinding kunnen worden toegepast, zijn die waarvoor de behandeling met cyclosporinen reeds in de literatuur is voorgesteld, bijvoorbeeld schistomosomiase, filariase, leishmania, coccidioidomycose en in het bijzonder malaria.

5 Voor de hiervoor genoemde indicaties ligt de dagelijkse dosis bij ongeveer 75 tot ongeveer 5000, bij voorkeur bij ongeveer 2000, vooral bij ongeveer 1500 mg.

Bij toepassing van een eenheidsdosis, bijvoorbeeld voor orale toediening, is een dosis van ongeveer 25 tot onge-10 veer 2500, bij voorkeur ongeveer 1000, vooral ongeveer 800 mg, van een cyclosporine volgens de uitvinding geschikt, gemengd met een farmaceutisch aanvaardbaar verdunning smiddel of drager.

De cyclosporinen volgens de uitvinding kun-15 nen op een conventionele wijze worden toegediend, in het bijzonder in overeenstemming met gebruikelijke methoden bij het toedienen van cyclosporine A, in het bijzonder via een intraveneus infuus, bijvoorbeeld in het geval van een orgaantransplantatie, voor en onmiddellijk na de 20 transplantatie, zoals eveneens bij het voorkomen van een maag-darmstoomis, die anders de absorptie zou verslechteren, of oraal, bijvoorbeeld in de vorm vein een orale oplossing .

In overeenstemming met het vDorgaande heeft 25 de onderhavige uitvinding eveneens betrekking op: 1. Een farmaceutisch preparaat dat één of een aantal cyclosporinen volgens de uitvinding, desgewenst tezamen met een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel en/ 30 of drager bevat, 2. Een cyclosporine volgens de uitvinding ter toepassing als farmaceuticum, dat wil zeggen voor toepassing bij de behandeling in de chirurgie of voor therapeuti-35 sche doeleinden, in het bijzonder voor het ___________ gebruik als immunosuppressivum of als 85 00 8 28 - 28 - middel ter remming van ontstekingen of als anti-parasitair werkzaam middel.

Zoals hiervoor reeds werd opgemerkt, zijn eveneens de cyclosporinen met formule 3a nieuw. Behalve dat 5 ze als tussenprodukten kunnen worden toegepast, vertonen ze een farmaceutische werking en/of profiel, in het bijzonder in verband met hun immunosuppressieve werking en vooral in verband met hun toepassing bij het verhinderen van transplantaatafstoting. Dit maakt ze bijzonder interessant 10 ten opzichte van andere cyclosporinen, zoals deze specifiek .

vermeld zijn in het Europese octrooischrift 0 056 782.

De farmacologische werking van de cyclosporinen met formule 3a kan bijvoorbeeld aangetoond worden met behulp van de hiervoor beschreven onderzoekmethoden 1.1, 1.2, 1.3, 2 of 3. 15 De cyclosporinen met formule 3a zijn in overeenstemming met de onderhavige uitvinding actief:

Bij proef 1.1 in concentraties van 0,01-10 ^ig/ml;

Bij proef 1,2 in concentraties van 0,001-10 ^ig/ml; -

Bij proef 1.3 in concentraties van 0,001-10 ^g/ml; 2Q Bij proef 2 in doses van 10-30 mg/kg/dag p.o. en

Bij proef 3 in doses van 50-100 mg/kg/dag s.c.

Gezien hun immunosuppressieve werking zijn de cyclosporinen met formule 3a nuttig ter voorkoming en behandeling van ziekten en aandoeningen die een verminde-25 ring van de- immuunreactie nodig maken, bijvoorbeeld ter onderdrukking van de vermeerdering van lymfocyten en immu-nocyten t bijvoorbeeld bij de behandeling van autoimmuun-ziekten, bijvoorbeeld bij de behandeling van specifieke autoimmuunziekten zoals die welke hiervoor werden vermeld 30 in verband met het gebruik van de cyclosporinen volgens de uitvinding of ter voorkoming van transplantaataf stoting, bijvoorbeeld bij de hiervoor vermelde, verschillende specifieke soorten in verband met het toepassen van de cyclosporinen volgens de uitvinding.

35 Gezien hun ontsteking_remmende werking zijn __________de cyclosporinen met formule 3a eveneens bruikbaar voor de 85 00 828 - 29 - behandeling van ontstekingstoestanden, in het bijzonder die met een ethiologie welke een auto-immuuncomponent omvat of inhoudt, bijvoorbeeld ter behandeling van arthritis en rheumatische aandoeningen, zoals polyarthritis chronica 5 progrediens.

Gezien hun anti-parasitaire werking zijn de cyclosporinen met formule 3a eveneens bruikbaar als middelen tegen parasieten, bijvoorbeeld ter behandeling van verschillende soorten parasitaire infecties, in het bijzon-iO der die welke hiervoor in verband met het gebruik van de cyclosporinen volgens de uitvinding zijn beschreven.

Voor de hiervoor vermelde indicaties ligt de dagelijkse dosis tussen ongeveer 75 en ongeveer 5000 mg en bij toepassing van een eenheidsdosis, bijvoorbeeld voor 15 orale toediening, is een dosis van ongeveer 25 tot ongeveer 2500 mg cyclosporine met formule 3a geschikt, desgewenst gemengd met een farmaceutisch aanvaardbare verdunner en/ of drager.

De cyclosporinen met formule 3a kunnen op 20 een gebruikelijke wijze worden toegediend, in het bijzonder in overeenstemming met gebruikelijke methoden voor het toedienen van cyclosporinen, in het bijzonder door intraveneus infuseren, bijvoorbeeld in het geval van een orgaan-transplantatie, voor en onmiddellijk na de transplantatie, 25 evenals bij het optreden van een maag-darmstoornis, die anders de absorptie zou verslechteren, of oraal., bijvoorbeeld in de vorm van een orale oplossing.

In overeenstemming met het voorgaande heeft de onderhavige uitvinding eveneens betrekking op: 30 1. Een farmaceutisch preparaat dat één of een aantal cyclosporinen met formule 3a, zoals hiervoor gedefinieerd, desgewenst tezamen met een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel en/of drager, be-, 35 vat.

. 2. Een cyclosporine met formule 3a, zoals 85 00 S28 %* - 30 - hiervoor gedefinieerd, ter toepassing als farmaceuticum, dat wil zeggen voor toepassing bij de behandeling op chirurgisch of therapeutisch gebied, in het bijzonder 5 voor het gebruik als een immunosuppressivum of als een middel tegen ontstekingen of anti-parasitair middel.

10 * 85 0 0 8 28

Claims

1. Een cyclosporine waarin de aminozuur-rest op de 8-plaats een (D)-acyloxy-a-aminozuurrest is. 5 2„ Een cyclosporine met formule 1, waarin X -MeBmt- of -Dihydro-MeBmt-, Y -oAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- of -Nva-, Z -Val- of -Nva- en Q een rest met formule 2 voorstellen, waarin 10 Rj een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-4 koolstof- atomen of een fenylgroep en R2 een waterstofatoom of een methylgroep weergeven. 3f Werkwijze voor het bereiden van een cyclosporine, met het kenmerk, dat men een cyclosporine 15 waarin de aminozuurrest op de 8-plaats een (D)-acyloxy-a- aminozuurrest voorstelt bereidt door a) een cyclosporine, waarin de aminozuurrest op de 8-plaats een (D)-hydroxy-a-aminozuurrest is, . te acyleren, of 20 b) een cyclosporine, waarin de aminozuur rest op de 1-plaats -MeBmt- voorstelt en de rest op de 8-plaats een (D)-acyloxy-a-aminozuurrest is, te reduceren, waardoor men het overeenkomstige cyclosporine verkrijgt, waarin de rest op de 1-plaats -Dihydro-MeBmt- is. 25 4, Werkwijze voor het bereiden van een cyclo sporine met formule 1 volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men a) een cyclosporine met formule 3, waarin X -MeBmt- of -Dihydro-MeBmt-,

30 Y -oAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- of -Nva-, Z -Val- of -Nva- en W een rest met formule 4 voorstellen, waarin R„ een 2 waterstofatoom of een methylgroep weergeeft, acyleert door een R^-CO-groep, waarin R^ een waterstofatoom, een alkyl-35 groep met 1-4 koolstofatomen of een fenylgroep is, op de β-plaats in te voeren, of 850082? _ ^^ 9 -32 - b) een cyclosporine met formule 1 volgens conclusie 2, waarin X een -MeBmt- groep voorstelt, reduceert, waardoor men het overeenkomstige cyclosporine verkrijgt waarin X -Dihydro-MeBmt- is. 5 , ' 5. Een cyclosporine volgens conclusie 1 of 2, ter toepassing als farmaceuticum.

6. Een farmaceutisch preparaat dat een cyclosporine volgens een der conclusies 1 of 2, desgewenst tezamen met een farmaceutisch aanvaardbaar verdunnings- 10 middel en/of drager, bevat.

7. Een cyclosporine met formule 3a, waarin Y' -aAbu-, -Thr-, -Val- of -Nva- voorstelt, Z' -Val- is, of, indien Y' -aAbu- of -Nva- weergeeft, -Nva- voorstelt,

15 W' -(D)Ser- voorstelt, of, indien Y' -aAbu- en Z' -Val- weergeven, -(D)Thr- voorstelt en X' -MeBmt- voorstelt, of, indien Y' -Thr-, -Val- of -Nva-y Z' -Val7 en W’ -(D)Ser- weergeven, -Dihydro- -MeBmt- voorstelt.

8. Werkwijze voor het bereiden van een cyclo sporine, met het kenmerk, dat men een cyclosporine met formule 3a volgens conclusie 7 bereidt door c) van een in een O-beschermde vorm aanwezig cyclosporine met formule 3 volgens conclusie 4 de 25 beschermende groep af te splitsen, of. d) een undecapeptide met rechte keten die de reeks met formule 5 bevat, waarin Y’ -aAbu-, -Thr-, -Val- of -Nva- voorstelt, Z’ -Val- weergeeft, of, indien Y' -aAbu- of -Nva- voor- 30 stelt, -Nva- is, W' -(D)Ser- voorstelt, of, indien Yj -aAbu- en Z' -Val-weergeven, -(D)Thr- voorstelt en, Xr -MeBmt- weergeeft, of, indien Y' -Thr-, -Val- of -Nva-, Z' -Val- en W' -(D)Ser- voorstellen, -Dihydro-

35 MeBmt- is, __________________ ring te sluiten, waarbij het undecapeptide in een onbescherm- 8500828 -33 - de of in een O-beschermde vorm aanwezig kan zijn en desgewenst de beschermende groep af te splitsen, of e) ter bereiding van een cyclosporine met formule 3a, waarin

5 Y' -Thr-, -Val- of -Nva- voorstelt, Z' -Val- weergeeft, of, indien Y' -Nva- is, -Nva- voorstelt, W' -(D)Ser- weergeeft en X' -MeBmt- is, - -2 - -2 10 een / Thr / -cyclosporine, / Val / -cyclosporine, - ~ -2 ~ -“ -2 - -5 / Nva_/ -cyclosporine of / Nva_/ -/ Nva / -cyclosporine producerende schimmel stam in aanwezigheid van een (D) -serine bevattend voedingsmedium te kweken en het cyclosporine met formule 3a van de verkregen cultuurvloeistof 15 af te scheiden, of f) ter bereiding van een cyclosporine met formule 3a, waarin X' -Dihydro-MeBmt- voorstelt, het overeenkomstige cyclosporine met formule 3a, waarin X' - -MeBmt- weergeeft, te reduceren.

9. Ben cyclosporine met formule 3a volgens conclusie 7 ter toepassing als farmaceuticum.

10. Een farmaceutisch preparaat dat één of een aantal cyclosporinen met formule 3a volgens conclusie 7, desgewenst tezamen met een farmaceutisch 25 aanvaardbaar verdunningsmidde1 en/of drager bevat.

11. Verbindingen, preparaten en werkwijze als beschreven in de beschrijving en/of voorbeelden. <^85 00 828