LU85819A1 - Nouveaux derives de la cyclosporine,leur preparation et leur utilisation comme medicaments - Google Patents

Description

* 1 * *5

La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de la cyclosporine , leur préparation et leur utilisation en thérapeutique , à titre >ς> de principes actifs de médicaments.

5 Les cyclosporines appartiennent à une classe î- - d'undécapeptides cycliques poly-N-mëthylës qui possè dent d'intéressantes propriétés pharmacologiques, ’ en particulier une activité immunosuppressive, une activité anti-inflammatoire et une activité antiparasitaire.

10 La première des cyclosporines et avoir été isolée est la Cyclosporine, un métabolite fongique naturel, également dénommée cyclosporine A et répondant à la formule A JdeBmt-aAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal—.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (A) 15 - dans laquelle -MeBmt- représente le reste N-méthyl-(4R)"

2E-4-butène-l-yl-4-mêthyl-(L)thrêonyle de formule B

CH3 20 x | (B) y \h2

Γ I

5 ' 25 H0\!R) uH MR) CH3 -N—CH—C0-| (S) " ch3 30 ^ dans laquelle -x-y- représente -CH=CH- (trans).

Depuis la découverte de la Cyclosporine, un grand nombre de cyclosporines naturelles ont été * 2 'β isolées et identifiées et plusieurs autres cyclosporines non naturelles ont été préparées par voie totalement synthétique ou semi-synthétique ou par application s. de techniques de culture modifiées. La classe des 5 cyclosporines est constituée actuellement par un -λ, nombre substantiel de représentants et comprend par exemple les cyclosporines naturelles A à Z [voir Kobel et col 1. European Journal of applied Microbio-logy and Biotechnology 14, 237-230 (1982) et Traber 10 et coll, 24th. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, 8-10 octobre, 1984 ], ainsi que diverses cyclosporines non naturelles ou synthétiques, comprenant les dihydro-cyclos-porines dans lesquelles le groupe -x-y- du reste 15 -MeBmt- (voir formule B .ci-dessus) est saturé, par exemple comme décrit dans les brevets américains n° 4 108 985, 4 210 581 et 4 220 641, les cyclos porines dans lesquelles le reste -MeBmt- est sous forme isomère ou N-déméthylée [voir brevet européen 20 n° 0 034 567 et "Cyclosporine A", Proc. Internat.

Conference on Cyclosporin A, Cambridge (Grande-Bretagne) septembre 1981, ed. D.J.G. White, Elsevier Press (1982), r ces deux documents décrivant un procédé de synthèse totale mis au point par R. Wenger pour la préparation f. 25 des cyclosporines] et les cyclosporines dans lesquelles des amino-acides variés ont été incorporés â des positions spécifiques de la séquence peptidique (voir brevet européen n° 0 056 782). Des exemples ^ de telles cyclosporines décrites dans les documents 2 30 antérieurs comprennent par exemple 1 a [Thr]-cyclosporine (cyclosporine C),1 a [ValÎ-cyclosporine (cyclosporine D), ^'2 2 5 la [Nvg] -cyclosporine (cyclosporine G), la[Nva] {Nva] - cyclosporine (cyclosporine M), la [di hydro-MeBmtj -[Val]2-

O

cyclosporine (dihydrocyclosporine D) et la[(D)Sefl - I « 3 1 8 et idihydro-MeBrnül-[(D)-Ser] -cyclosporine.

Selon la nomenclature adoptée actuellement pour les cyclosporines, ces composés seront définis s, dans la présente description par référence à la 5 structure de la C-yclosporine, c'est-à-dire la cyclosporine A. Selon cette nomenclature, on indique d'abord les restés de la molécule qui diffèrent de ceux prë-* sents dans la Cyclosporine et on accole le terme

"cyclosporine1' pour caractériser les autres restes 10 qui sont identiques à ceux présents dans la Cyclosporine. Par ailleurs, 1'expression -dihydro-MeBmt-est utilisée pour désigner le reste de formule B

ci-dessus dans laquelle -x-y- signifie -CH--CH«·*· 12 ce

Ainsi, la [di hydro-MeBmt]-[Val] -cyclospori ne est la 15 cyclosporine ayant la séquence indiquée dans la formule A, mais dans laquelle le· reste -MeBmt- [formule B, -x-y- = -CH=CH- (trans)] en position 1 est remplacé par le reste-dihydro-MeBmt- [formule B, -x-y- = -CHgCl·^-] et le reste -ctAbu- en position 2 est remplacé par le

Q

20 reste -Val-. De même, la [(D)Ser] -cyclosporine est la cyclosporine ayant la séquence indiquée dans la formule A, mais dans laquelle le reste -(D)-Ala- en position 8 a été remplacé par le reste -(D)-Ser-.

De plus, les restes des amino acides désignés par une ψ. ' 25 abréviation, par exemple -Ala-, -MeVal- etc..., doi- * vent être compris , conformément à la nomenclature actuelle, comme ayant la configuration L , sauf indication contraire. Les abréviations î, précédées par "Me", comme dans le cas de -MeLeu-, 30 représentent des restes N-mëthylés. Les restes indi-^ viduels de la molécule de cyclosporine sont numérotés, comme dans l'état de la technique, dans le sens des aiguilles d'une montre et en commençant par le reste -MeBmt- ou -dihydro-MeBmt- en position 1. Le même w 4 système de numérotation sera utilisé dans la présente description.

Selon la présente invention, on a trouvé ς, maintenant qué les cyclosporines dans lesquelles le 5 reste en position 8 est le reste d'un acyloxy-a-amino-^ __ acide ayant la configuration D, se signalent par d'intéres santes propriétés pharmacologiques.

Selon un premier aspect, la présente invention concerne donc une cyclosporine dans laquelle 10 le reste de l'amino-acide en position 8 est le reste d'un (D)-acyloxy-a-amino-acide. Par reste d'un (D)-acyloxy-a-amino-acide, on entend le reste d'un α-amino-acide de la série D dans lequel la chaîne latérale fixée sur l'atome de carbone a est 15 substituée par un groupe acyloxy.

De préférence, le reste de 1'amino-acide en position 8 est le reste d'un (D)-ß-acyloxy-a-amino -acide, c'est-à-dire le reste d'un α-amino-acide de la série D ayant un groupe acyloxy fixé sur l'atome 20 de carbone ß.

Des restes préférés de (D)-ß-acyloxy-a-amino -acidessont ceux correspondant à la formule II

- R2 î ’ 25 Ri-CO-O-CH(ß) | (II) -NH-CH-CO- (D) 30 dans laquelle R signifie 1 ' hvdrogëne ou un groupe alkyle en C,-C4 «*.1 I ‘r ou phényle, et signifie l'hydrogène ou un groupe méthyle.

•V

* 5 s

Les cyclosporines spécialement préférées selon la présente invention sont celles dans lesquelles le reste de Γami no-acide en position 8 est un reste i 0-acyl-(D)-séryle ou 0-acyl-(D)-thréonyle, en particu- 5 lier un reste 0-acyl-(D)-séryle ou 0-acyl-(D)-thréonyle de formule II.

Dans un groupe de cyclosporines selon l'in-» vention, le reste de 1‘amino-acide en position 8 est un reste 0-acyl-(D)-séryle, spécialement un reste 10 0-acyl(D)-séryle dans lequel le groupe acyle correspond à la formule R^-CO-, R-j ayant la signification donnée précédemment.

Dans un second groupe de cyclosporines selon l'invention, le reste de 1'ami no-acide en position 8 15 est le reste d'un (D)-ß-acyloxy-a-amino-acide, spécialement un reste 0-acyl-(D)-séryle, plus spécialement un reste 0-acyl-(D)-séryle dans lequel le groupe acyle correspond à la formule R^-CO-, R^ signifiant l'hydrogène ou un groupe alkyle en C^-C^, et le reste 20 en position 5 est un reste (L)-norvalyle.

Les cyclosporines particulièrement préférées sont celles répondant à la formule I

w _X-Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-Ala-Q-MeLeu-MeLeu-Val— 1 2 3 4 5 5 7 8 9 10 11 (I) f * 25 im 1—— - — " *1 1 ' -i·" 1 -— 11 " — — — — — dans laquelle X signifie -MeBmt- ou -dihydro-MeBmt-, Y signifie -aAbu-, -Al a-, -Thr-, -Val- ou -Nva- , 30 Z signifie -Val- ou -Nva-, et Q est un reste de formule II tel que défini précédemment.

Dans la formule I, Q signifie de préférence un reste 0-acyl-(D)-séryle ou 0-acyl-(D)-thréonyle * : 6 dans lesquels le groupe acyle correspond à la formule R^-CO- s R.j ayant la signification donnée pour la formule II. Y signifie de préférence -aAbu-, -Thr-, -Val- ou -Nva-.

5 Un groupe de cyclosporines selon l'invention comprend les composés de formule I tels que définis ci-dessus,dans lesquels Y signifie -aAbu- ou -Nva-, Z signifie -Val- et R2 signifie l'hydrogène.

Un autre groupe de cyclosporines selon 10 l'invention comprend 1 es composés de formule I tels que définis ci-dessus, dans lesquels Y signifie -aAbu- ou -Nva-, Z signifie -Nva-, R-j signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C^-C^ et R2 signifie l'hydrogène.

L'invention concerne également un procédé 15 de préparation d'une cyclosporine dans laquelle le reste de 1'amino-acide en position 8 est le reste d'un (D)-acyloxy-a-amino-acide, par exemple le reste d'un (D)-ß-acyloxy-a-amino-acide, ledit procédé comprenant: a) l'acylation d'une cyclosporine dans laquelle le reste 20 de 1'amino-acide en position 8 est le reste d'un (D)-hydroxy-a-amino-acide, par exemple le reste d'un (D)-ß-hydroxy-a-amino-acide, ou b) la réduction d'une cyclosporine dans laquelle le reste de 1'ami no-acide en position 1 est un reste 25 -MeBmt- et le reste en position 8 est le reste d'un (D)-acyloxy-a-amino-acide, par exemple le reste d'un (D)-ß-acyloxy-a-amino-acide, pour obtenir la cyclosporine correspondante dans laquelle le reste en position 1 est le reste-dihydro-MeBmt-.

30 En particul ierjes cyclosporines de formule I

défi nies ci-dessus peuvent être préparées selon un procédé qui comprend

a) l'acylation d'une cyclosporine de formule III

7 .—X-Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-Ala-W-MeLeu-MeLeu-MeVal--123 4 5 6 78 9 10 11 (ΠΙ) 5 dans laquelle X, Y et Z ont les significations données c - précédemment pour la formule I etW représente un

reste de formule IV

R2 10 HO-CH (IV) -NH-CH-CO- (D) 15 dans laquelle Rg a la signification donnée ci-dessus pour la formule II, pour introduire en position β dudit reste IV un groupe R-j-CO- dans lequel R-j a la signification donnée ci-dessus pour la formule II, ou 20 b) la réduction d'une cyclosporine de formule I telle que définie précédemment, dans laquelle X signifie -MeBmt-, pour produire la cyclosporine correspondante £- dans laquelle X signifie le reste -dihydro-MeBmt-.

- Les procédés a) ci-dessus peuvent t 25 être effectués selon les méthodes connues pour l'acyla tion des groupes hydroxy, par exemple par réaction avec de préférence 2 équivalents ou, lorsque Y = -Thr-, 1 équivalent d'un lialo-gënure d'acyle approprié,pàr exemple un halogénure d'alcanoyle ^ en C,-Ce ou un halogénure de benzoyle,ou avec l'anhydride i ö 30 d'acide correspondant, ou, pour la formylation, par k réaction par exemple avec l'anhydride formique-acétique,à une température comprise par exemple entre environ -10 et 50°C. La réaction est effectuée sous des conditions anhydres, de façon appropriée en présence d'un solvant ou s 8 diluant inerte tel que le chlorure de méthylène» et en présence d'un agent de condensation tel que la 4-diméthyl-amino-pyridine. A ce sujet» il convient de noter que l'acylation se produit sélectivement sur le groupe OH primaire du reste de 1'amino-acide en -5 position 8.

:r ' Les procédés b) peuvent être effectués de manière analogue aux méthodes connues pour réduire des cyclosporines naturelles en dihydrocyclospo-rines correspondantes, par exemple par hydrogénation 10 catalytique, par exemple comme décrit dans le brevet britannique n° 1 567 201.

L'hydrogénation est effectuée de façon appropriée sous des conditions de pH neutre à des températures comprises entre environ 20° et environ 30°C 15 et à la pression atmosphérique ou sous une pression légèrement supérieure , en présence d'un catalyseur tel que le platine ou, de préférence, la palladium, par exemple le palladium sur charbon . On opère en présence d'un solvant ou diluant inerte tel que l'acétate 20 d'éthyle ou un alcanol aliphatique inférieur tel que le mëthanol ou 1'isopropanol.

Les cyclosporines ayant un reste de ß-hydroxy-α-amino-acide en position 8, en particulier 1 aC(D)-Serf-cyclosporine et 1 a [di hydroxy-MeBmtf-[(D)Serf-cycl ospo- « k 25 rine, appropriées comme produitsde départ dans les procédés a) ci-dessus »sont connues et ont été décrites, ainsi que leur procédé de préparation, par exemple dans le brevet européen n° 0 056 782 mentionné prëcé- •i.

demment. D'autres cyclosporines ayant un reste d'hydrôxy-30 α-amino-acide en position 8 et nécessaires comme produits de départ pour les procédés a) peuvent être préparées de manière analogue ou selon les procédés décrits dans le brevet européen n° 0 034 567 , ou selon les procédés décrits dans la présente description.

9

Les cyclosporines de départ utilisées dans les procédés b) ci-dessus, peuvent être obtenues sel on 1e procédé a).

Bien que les cyclosporines de départ de 5 formule III spécifiquement décrites dans les exemples ci-joi nts soient comprises dans, l'enseignement général du brevet européen n° 0 056 782, ces cyclosporines n'ont jamais été décrites comme telles auparavant et sont donc nouvel 1 es.Sel on la présente in-10 vention , on a trouvé maintenant que ces cyclosporines possèdent spécialement une activité ou un profil biologique intéressant ou avantageux, en particulier en ce qui concerne l'activité immunosuppressive et spécialement en ce qui concerne la prévention des rejets après 15 transplantations d'organes ou greffes de moelle,en comparaison par exemple avec les cyclosporines connues de formule III, c'est-à-dire les cyclosporines de formule III spécifiquement décrites dans le brevet européen n° 0 056 782.

Selon un autre aspect, la présente inven-20 tion concerne donc une cyclosporine de formule Ilia __X'-Y'-Sar-MeLeu-Z'-MeLeu-Ala-W-MeLeu-MeLeu-MeVal— 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (II la) 25 dans laquelle Y' signifie -aAbu-, -Thr-, -Val- ou -Nva-, 1' signifie -Val- ou , lorsque Y' signifie -aAbu- ou -Nva-, également -Nva-, ^ W' signifie -(D)Ser- ou, lorsque Y' signifie -aAbu- et 30 V signifie -Val-, également -(D)Thr-, et X' signifie -MeBmt ou, lorsque Y' signifie -Thr-,-Val- -W* ou -Nva-, Z' signifie -Val- et W signifie -(D)Ser-, également -dihydro-MeBmt- .

ο 10

Des cyclosporines spécifiques de formule 111a sont les suivantes : a) [(D)Thr]8-cyclosporine b) [Thr]2-[(o)Ser]8-cyclosporine 5 c) [Dihydro-MeBmt]l-[Thr]2-[(D)Ser]8-cyclosporine d) [Val]2-[(o)Ser]8-cyclosporine e) [Dihydro-MeBmt]^-[Val]2-[(o)Ser]8-cyclosporine f) [Nva]2-[(D)Ser]8-cyclosporine g) [Dihydro-MeBmt]l-[Nva]2-[(D)Ser]8-cyclosporine jq h) [Nva]5-[(D)Ser]8-cyclosporine; et i) [Nva]2-[Nva]5-[(D)Ser]8-cyclosporine .

Parmi ces cyclosporines, celles indiquées sous a), b), e), f) et i), et en particulier sous a), f) et i), sont d'un intérêt spécial, compte tenu 15 de leur activité , par exemple de leur activité immuno-suppressive, ou de leur profil d'action par rapport par exemple aux cyclosporinés spécifiquement décrites dans le brevet européen n° 0 056 782.

L'invention comprend également un procédé 20 de préparation des cyclosporines de formule 111a telles que définies ci-dessus, ledit procédé comprenant : c) la déprotection d'une cyclosporine de formule IIIa “ telle que définie ci-dessus, sous forme protégée à 1'oxygène, * 25 d) la cyclisation d'un undêcapeptide à chaîne droite comprenant la séquence -W'-MeLeu-MeLeu-MeVal-X'-Y'-Sar-MeLeu-Z'-MeLeu-Ala-8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 30 dans laquelle Y', Z', W et X' ont les significations données ci-dessus pour la formule Ilia, ledit undë-capetide étant sous forme non protégée ou sous forme protégée à l'oxygène et, si nécessaire, 11 la mise en oeuvre du procédé c), e) pour l'obtention d'une cyclosporine de formule 111a dans laquelle Y' signifie -Thr-, -Val-ou -Nva-, 5 Z' signifie -Val- ou, lorsque Y' signifie -Nva-, . également -Nva-, W signifie -(D)-Ser- et X' signifie -MeBmt-, la culture d'une souche fongique produisant la 2 2 10 [Thr] -cyclosporine, la [Val] -cyclosporine, 2 2 5 la [Nva] -cyclosporine ou la [Nva] -[Nva] -cyclosporine , dans un milieu nutritif contenant de la (D)-sérine et isolement de la cyclosporine de formule Ilia à partir du milieu de culture, 15 f) pour l'obtention d'une cyclosporine de formule 111a dans laquelle X' signifie -dihydro-MeBmt, la réduction de la cyclosporine correspondants de formule Ilia dans laquelle X* signifie -MeBmt-,

Les undecapeptides appropriés à utiliser 20 dans le procédé d) ci-dessus peuvent être obtenus de manière analogue au procédé décrit dans le brevet européen n° 0 056 782, en combinant la séquence pepti-l dique qui comprend les restes 8 à 11 de la molécule * de cyclosporine avec la séquence qui comprend les s 25 restes 1 à 7 de la molécule de cyclosporine mais avec les restes appropriés en position 2 et/ou 5 et/ou 8.

Le reste -(D)-Ser- ou -(D)-Thr- en position 8 est avantageusement sous forme protégée à l'oxygène, par '* exemple sous forme de dérivé 0-tert.-butylique.La cycli- 30 sation est effectuée comme indiqué dans le brevet européen n° 0 056 782, avec élimination finale des groupes protecteurs de l'oxygène lorsqu'ils sont présents [procédé c)] selon les méthodes connues dans la chimie des peptides.

» 12

La souche fongique utilisée dans le procédé e) est de préférence la souche NRRL 8044 de l'espèce Tolypocladium inflatum (Gams), dont une culture a été =. déposée au United States Department of Agriculture 5 (Northern Research and Development Division), Peoria, 111., USA,et est librement accessible au public. Une autre culture de cette souche a été déposée au Fermentation Research Institute, Inage, Chiba City, Japan, sous le numéro de code FRI FERM-p No. 2796. Les 10 caractéristiques morphologiques de cette souche, classée I l'origine comme appartenant à l'espèce Trichoderma polysporum (Link ex Fers.), ainsi queles techniques pour l'obtention et la conservation de prêcultures et de sous-cultures sont décrites en détail par exemple 15 dans le brevet britannique n° 1 491 509.

Selon le procédé e), la souche sélectionnée , par exemple la souche de Tolypocladium inflatum (Gams), est cultivée avantageusement pendant une période d'environ 2 semaines à une température d'environ 27°C 20 dans un milieu de culture tel que décrit dans les exemples suivants, avec adjonction de (D)- ou de (D,L)-sërine au milieu de production. L'amino-acide précurseur ?· est ajouté avantageusement en quantités comprises entre environ 1 et environ 15g, plus préférablement l 25 entre environ 4 et environ 10 g/litre de milieu de culture. Avantageusement, le milieu de culture contient également 1'ami no-acide précurseur pour le reste présent en position 2 de la cyclosporine désirée, par exemple ï· en des quantités comprises entre environ 6,0 et en 30 environ 10,0 g, de préférence environ 8,0 g/litre de milieu de culture. Après incubation, on recueille la culture et on extrait selon les méthodes connues la cyclosporine de formule IIIa ainsi obtenue, par exemple par broyage des conidies et du mycélium et 13 s

II

isolement subséquent par extraction et/ou absorption.

„ La cyclosporine brute obtenue peut ensuite être purifiée, par exemple par chromatographie et/ou par recristallisation , en particulier pour la séparer des autres cyclos-5 porines qui la contaminent , en particulier de la cyclosporine naturelle.

Le procédé f) ci-dessus peut être effectué par exemple en utilisant les mêmes méthodes que celles précédemment en relation avec le procédé b).

10 Dans les exemples suivants qui illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée, les températures sont indiquées en degrés celsius.

Exemple 1 - 15 [(0-acétyl)- (D)Ser] -cyclosporine (formule I : X = -MeBmt-, • Y = -aAbu-, Z = -Val-, Q = -0-acëtyl-(D)Ser-3 A 47 ml de [(D)Serf-cyclosporine (préparée selon le procédé décrit à l'exemple 1 ou 3 du brevet européen n° 0 056 782) dissous dans 3 ml de chlorure 20 de méthylène,on ajoute 20 mg de 4-dimêthylaminopyridine.

On ajoute ensuite 6,1 mg de chlorure d'acétyle fraîchement distillé dissous dans 1 ml de chlorure de méthy-% lène et on agite le mélange réactionnel pendant 1 heure à la température ambiante. On dilue ensuite le s ' 25 mélange réactionnel avec 50 ml de chlorure de méthylène et on le secoue avec 30 ml d'eau. On sépare la phase organique, on la sèche sur sulfate de sodium , on la filtre et on l'évapore. Le résidu est filtré v sur 60 g de gel de silice (0,062 - 0,20 mm) en utilisant 30 comme éluant du chlorure de méthylène à 5% de méthanol et est recueilli en fractions de 25 ml. Le composé du titre est récupéré à partir des fractions 4 à 8 par chromatographie sur couche mince en utilisant du chloroforme ä 5% de méthanol comme phase mobile ; 14 $ » * [α]ρ° = -202° (c = 0,92 dans CHC13).

Exemple 2

Les composés suivants peuvent être préparés de manière analogue à l'exemple 1 en partant de la cyclosporine 5 non acylêe correspondante : 2.1 C(0-benzoyl-(D)Ser]8-cyclosporine [formule I: X = -MeBmt-, Y = -aAbu-, Z = -Val-, Q = -0-benzoyl-(D)Ser-]: [<x]20 = -220e (c =1,0 dans C H C1 3 ) ; 1 q 2.2 [0-ace'tyl-(D)Thr]8-Cyclosporine [formule I: X = -MeBmt-, Y = -otAbu-, Z = -Val-, Q = -0-ace'tyl-(D)-Ser-]: [a]20 = -219* (c =1,0 dansCHCl3); 2.3 [Nval^-CO-ace^yl-iDjSerlS-Cyclosporine [formule I: 1 g X = -MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -Val-, Q = -0-acétyl-(D)Ser-]: [a]20 = -240* (c =1,0 dans CHC13)/- 233 * (c = 0,8 dans CHC13)/-177 * (c =0,76 dans CH3OH) : F = 143 - 147 * .

2.4 [Val]2-[0-acétyl-(D)Ser]8-Cyclosporine [formule I: 20 X = -MeBmt-, Y = -Val-, Z = -Val-, Q = -0-acétyl-(D)Ser-]: [a]20 = -219* (c =0,9 dans CHCI3); 2.5 [Nva]8-[0-acétyl-(D)Ser]8-cyclosporine [formule I: : X = -MeBmt-, Y = -otAbu-, Z = -Nva-, Q = -0-acetyl-(D)Ser-]: 25 [a]20 = -215* (c = l,0dans CHC13); 2.6 [Nva]2-[Nva]5-[0-ace'tyl-(D)Ser]8-cyclosporine [formule I: X = -MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -Nva-, Q = -0-acétyl-(D)Ser-]: [a]20 = - 196.9 * (c =1,0 dans CHC13); et 30 , 2.7 [Thr]2-[0-acétyl-(D)Ser]8-cyclosporine [formule I: X = -MeBmt-, Y = -Thr-, Z = -Val- Q = -0-acetyl-(D)Ser-]: [a]20 = - 251 * (c =0,86 dansCHC13)/- 174 " (c =0,81 dansCH3OH): F = 143 - 146 * .

* 15 9

Exemple 3 1 ο [Di hydro-MeBmt] —- [0-acêty1 -(D)Ser]-cyclosporine (formule I : X =-dihydro-MeBmt-, Y = -aAbu-, Z =-Val-, Q = -0-acétyl-(D)Ser-] 5 On hydrogène à la température ambiante et g sous pression normale 54 mg de [(0-acétyl)-(D)-Ser ]-cyclosporine dans 10 ml d'éthanol en utilisant 10 mg de charbon palladié à 10%. Après 20 heures, on filtre le mélange réactionnel sur une mince couche de talc 10 et on élimine l'éthanol par évaporation sous vide.

Après séchage sous vide poussé , on obtient le composé du titre ; [a]^ = -205,8° (c = 1,02 dans CHC1 ^) -

Exemple 4

Les composés suivants peuvent être préparés 15 de manière analogue à l'exemple 1 en partant de la cyclosporine non-acylëe correspondante,ou de manière analogue à l'exemple 3 par hydrogénation de la cyclosporine correspondante décrite à l'exemple 2: 4.1 [Dihydro-MeBmt]l-[Nva]2-[0-acetyl-(D)Ser]8-cyclosporine ^ [formule I: X = -dihydro-MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -Val-, Q = -0-acétyl-(D)Ser-]: F = 139 - 14Γ ; [a]20 = -225* (c * 0,88 dans CHCl3)/-163* (c =0,76 dans CH3OH) ; «► 4.2 [Dihydro-MeBmt]l-[Val]2-[0-acetyl-(D)Ser]8-cyclosporine r 25 [formule I: X = -dihydro-MeBmt-, Y = -Val-, Z = -Val-, Q = -0-acétyl-(D)Ser-]: [α]§0 = -210* (c = 0,85 dansCHCI3) ; et 4.3 [Di hydro-MeBmt] l-[Thr]2-[0-ace/tyl-(D)Ser]8-cyclospori ne v [formule I: X = -dihydro-MeBmt-, Y = -Thr-, Z = -Val-, Q = 30 0-acetyl-(D)Ser-1: [a]20 = - 241 (c =1,0dans CHC13)/ v,. - 162 * (c =1,0 dans CH3OH): F * 148 - 150 * .

a 16

Préparation des produits de départ:

Exemple 5

Les composés suivants, nêcessairescomme , produits de départ pour la préparation des composés 5 des exemples 2.2 à 2.7, peuvent être préparés de

O

ÿ - manière analogue au composé connu la [(D)Ser] - cyclosporine, dont la préparation est décrite à l'exemple 1 du brevet européen n° 0 056 782,mais en utilisant les séquences peptidiques comportant les restes appro-10 priés en position 2 et/ou 5 et/ou 8 : 5.1 [(0)Thr]8-cyclosporine [formule ί11a: X' = -MeBmt-, Y' = -aAbu-, V = -Val-, W * -(D)Thr-]: [a]20 = -248,7e(c = 1,0 dans CHCI3) ; 5.2 [Nva]2-[(D)Ser]8-c,yclosporine [formule Ilia: X' = -MeBmt-, 15 Y' = -Nva-, V = -Val-, W = -(D)Ser-]: F = 150 - 153’ ; [o]20 = -262’ (c =0,/1 dans CHC13)/-191’ (c = 0,73 dans CH3OH) ; 5.3 [Val]2-[(D)Ser]8-cyclospori ne [formule 111a: X1 = -MeBmt-, Y' = -Val-, V = -Val-, W = -(D)Ser-]: [a]20 = -257’ (c = 20 1,0 dans CHCI3)/- 255’ (c =0;45 dans CHC13)/- 189 ’ (c = 0;42 dans CH3OH): F = 136 - 140 ’ ; 5.4 [Nva]5-[(D)Ser]8-eyclosporine [formule 11la: V = -MeBmt-, ï V = -aAbu-, V = -Nva-, W = -(D)Ser-]: [a]20 = -212’ (c = 1,0 dansCHC13) ; i 2 5 5.5 [Nva]2-[Nva]5-[(D)Ser]S-cyclosporine [formule IIla: V = -MeBmt-, V = -Nva-, V - -Nva-, W = -(D)Ser-] [a]§0 = -217* (c =1,0 dans CHCI3); et 5.6 [Thr]2.[(D)Ser]8-cyclosporine [formule 111 a : X' = -MeBmt-, Y' = -Thr-, V = -Val-, W = -(D)Ser-]: [o]J0 = - 258 ’ 3Q (c =0,39 dans CHCI3)/- 178 ’ (c =0,40 dans CH3OH): F = -Ç 147 - 152 * .

e » 17

Exemple 6

Le composé de l'exemple 5.2 peut également être préparé par voie microbiologique de la manière suivante: 5 a) 10 litres d'un milieu nutritif contenant 50 g de maltose, 5 g de (DL)-norvaline, 8 g de (D)-sërine, 0,75 g de KH2P04, 5,0 g de MgS04.7H20, 0,1 g de CaCl2.6H20 et 8 g de peptone de caséine par litre sont inoculés avec 1 litre d'une suspension de conidies 10 et de mycélium de la souche fongique NRRL 8044,pré levée d'une prêculture cultivée pendant 3 jours.

Le milieu de production inoculé est versé par portions de 100 ml dans 100 erlenmeyer que l'on incube ensuite pendant 14 jours à 27° sur un agitateur rotatif 15 (180 tours/minute) . Le mycélium est séparé du milieu de culture et extrait dans un appareil Turrax par broyage et agitation avec 3x3 litres de méthanol à 90¾. Le mycélium broyé est séparé du solvant par essorage et les filtrats combinés sont concentrés 20 par évaporation sous vide à une température de 40°, jusqu'à ce que la vapeur soit constituée essentiellement d'eau. Le mélange obtenu est extrait 4 fois - en utilisant 0,5 litre de 1,2-dichloroëthane à chaque extraction et les solutions combinées de ’ 25 1,2-dichloroéthane sont concentrées par évaporation sous vide à une température de 40° .

Le résidu obtenu est soumis à une filtration sur Sephadex LH-20 (1,4 kg , Pharmacia) avec du méthanol, i et est recueilli par fractions de 280 ml.

_ 30 Les fractions 9-11, contenant un mélange de ^ cyclosporines, sont réunies et ensuite chromatographiëes par fractions de 500 ml sur colonne de gel de silice (1 kg de gel de silice "Merck", dimension des particules 0,063-0,2 mm) en utilisant comme êluant 18 de l'acétate d'éthyle saturé d'eau. Selon leur polarité, la [Nva] -cyclosporine est diluée d'abord (fractions 719), suivie par un mélange comprenant 2 fi la [Nva] -[(D)Serl cyclosporine et la Cyclosporine.

2 S

5 La séparation de la [Nva] ~[(D)Ser] -cyclosporine et de la cyclosporine est effectuée par chromato-Jli " graphie sur gel de silice (280 g , Merck, dimension des particules 0,63-0,2 mm) en utilisant un mélange 98:2 de chloroforme et de mêthanol comme 10 ëluant (fractions de 100 ml). Les fractions 20 à 2 8 30, contenant la [Nva] -[(D)Ser] -cyclosporine brute, sont purifiées par chromatographie à faible pression sur une colonne de gel de silice à phase inversée (Merck LiChropep RP 18, 260 g , 15 dimension des particules 0,04 - 0,063 mm) en utili sant un mélange 85:15 de mêthanol et d'eau comme éluant (fractions de 25 ml). Les fractions

2 C

45 à 55 donnent la [Nva]-[(D)Ser]-cyclosporine à l'état pur sous forme d'une poudre blanche amorphe: 20 F = 150-153°; [a]20 = -262°C (c = 0,71 dans CHC13) et -191° (c = 0,73 dans CH30H).

La préculture nécessaire pour le procédé ci-dessus peut être obtenue comme suit : b) La suspension de sporeset de mycélium utilisée pour 25 l'inoculation , est préparée à partir d'une culture de la souche NRRL 8044 isolée à l'origine, cultivée : pendant 21 jours à 27° sur un milieu gélosê conte nant 20 g d'extrait de malte, 20 g de gélose et 4 g d'extrait de levure par litre d'eau déminéralisée. 30 Les spores de ces cultures sont reprises dans une solution physiologique de chlorure de sodium pour 5 donner une concentration finale de 5 x 10 spores/ml. 10 ml de cette suspension sont utilisés pour inoculer 1 litre d'une solution nutritive ayant la même » 19 composition que le mileu de culture de l'exemple 6a, excepté la (D)-sérine et la (DL)-norvaline, et l'incubation est effectuée à 27° pendant 3 jours sur un agitateur rotatif (200 tours/minu te). Cette 5 culture est utilisée comme inoculum pour le milieu de production.

'5. * 2 8

La [Nva ]-f(D)Ser ] -cyclosporine peut être produite en bioréacteur de la manière suivante : g c) Environ 10 spores d'une culture sur milieu gêlosë 10 incliné de la souche NRRL 8044 sont transférées dans un fermenteur en acier inoxydable contenant 20 litres d'un milieu de prêculture ayant la composition suivante: Fructose 75 g

Amber EHC 25 g 15 KH20P4 5 g KC1 2,5 g

Eau distillée pour 1 litre (pH = 5,5) stérilisé au préalable pendant 20 minutes à 120°.

Les conditions favorables pour l'incubation sont les 20 suivantes : température 27°, débit d'air 16 litres par minute à une surpression de 0,5 bar et agitation rotative à 200 tours/minute . On laisse la préculture - se développer en l'incubant pendant 6 jours et on transfère ensuite 15 litres dans un fermenteur en £ 25 acier inoxydable contenant 300 litres d'un milieu de production ayant la composition suivante :

Maltose 75 g

Amber EHC 25 g v KH2P04 5 g " 30 KC1 2,5 g (DL)-norvaline 5 g (D)-sérine 8 g

Eau distillée pour 1 litre (pH = 5,5) 5 20 stérilisé au préalable pendant 20 minutes à 120°.

La culture est maintenue à une température de 27° sous une aération de 120 litres par minute et à une surpression de 0,5 bar et sous agitation 5 à 70 tours par minute. Pour éviter la formation * - de mousse, on ajoute une émulsion de silicone.

Après incubation pendant 14 jours , la culture, qui a une volume total de 275 litres, est refroidie à 10° et le mycélium est éliminé en utili-10 sant un séparateur Westfalia. On extrait le filtrat en l'agitant 2 fois avec de l'acétate d'éthyle, on lave les extraits avec un peu d'eau, on les combine et on les sèche sous vide. Le mycélium est combiné avec du méthanol, homogénéisé et filtré. Cette 15 extraction est répétée 2 fois en utilisant du métha nol à 90¾. Les extraits méthanoliques sont combinés et, sous addition d'eau, concentrés sous vide.

On extrait 2 fois le concentré aqueux restant avec de l'acétate d'éthyle, on lave les extraits avec un 20 peu d'eau, on les combine et on les concentre sous vide. La phase aqueuse · est extraite à nouveau 2 fois avec un mélange 8:2 d'acétate d'éthyle * et d'isopropanol. Ces extraits sont combinés et évaporés à nouveau sous vide.

11 25 Les extraits de mycélium et de filtrat s sont filtrés en utilisant 50 fois la quantité de

Sephadex LH-20 et du méthanol comme éluant. On purifie ensuite par chromatographie les fractions contenant * les pics d'élution en utilisant 100 fois la quantité 30 de gel de silice 60 (dimension des particules = 0,04- >v.

w 0,063 mm)et de l'acétate d'éthyle saturé d'eau comme éluant. La [Nva]2 -cyclosporine est éluëe d'abord suivie par la cyclosporine et la [Nval -[(D)-Ser]°-cyclosporine. Ces dernières fractions sont soumises * 21 Λ à une autre purification par chromatographie en utilisant 140 fois la quantité de gel de silice 60 (dimension des particules 0,063 - 0,20 mm) et un mélange 98:2 de chloroforme et de méthanol comme 2 a 5 éluant, ce qui donne la [Nva] -[(D)Ser] -cyclosporine.

" Exemple 7

Le composé de l'exemple 5.3.peut également être préparé par voie microbiologique en procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple 6a) 10 mais avec les modifications suivantes : a) Dans le milieu nutritif, on remplace la (DL)-norva-line par 10 g de (L)-valine. Après séparation du mycélium du milieu de culture, on effectue l'extraction comme suit : 15 Le mycélium broyé est séparé du solvant par essorage et les filtrats combinés sont concentrés, sous addition d'eau , par évaporation sous vide à une température de 40°, jusqu'à ce que la vapeur soit essentiellement constituée d'eau. On extrait 20 3 fois le mélange en utilisant à chaque extraction 5 litres d'acétate d'éthyle et on concentre les solutions d'acétate d'éthyle combinées par évaporation * sous vide à une température à 40° .

Le résidu obtenu est soumis à une filtration 25 sur Sephadex LH-20 (1,4 kg, Pharmacia) avec du méthanol. Les fractions constituées d'un mélange de cyclosporinés sont réunies et ensuite séparées par chromatographie sur colonne de gel de silice (3 kg de silicagel, dimension des particules = ^ 30 0,020 - 0,045 mm, "Grâce") en utilisant de l'acétate d'éthyle saturé d'eau comme éluant. Selon leur pola-2 ritê, la [Val] ,-cyclosporine est ëluée d'abord suivie par un mélange constitué principalement de [Val]L-[(D)Ser] -cyclosporine. On purifie à nou- * 9 î 22 2 8 veau la [Val ] -[(D)Serl -cyclosporine par chromatographie sur gel de silice (80 g, "Grâce", dimension des particules =? 0,020 - 0,0045 mm) en utilisant un mélange 1:1 d'acétone / hexane comme éluant.

2 8 5 Les fractions contenant la [Val! -[(D)Ser! -cyclos porine à l'état brut sont purifiées à nouveau par chromatographie à faible pression sur une colonne de gel de silice à phase inversée ("Merck" LiChroprep RP 18, 160g, dimension des particules = 10 0,04 - 0,063 mm) en utilisant un mélange 80:20 de mëthanol et d'eau comme éluant, ce qui donne la [Val]8-[(D)Ser]8-cyclosporine à l'état pur sous forme d'une poudre blanche amorphe, b) La préculture requise est obtenue de manière 15 analogue à celle décrite à l'exemple 6b).

2 8

La [Val] -[(D)Ser3 -cyclosporine peut être préparée dans un biorëacteur en procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple 6c) mais avec les modifications suivantes : 20 c) Dans le milieu de production,on remplace la (DL)-nor-valine par 10 g de (L)-valine. Après combinaison du mycélium avec du méthanol, homogénéisation et filtration (répété 2 fois en utilisant du méthanol à 90%), on procède ensuite de la manière suivante: 25 Les extraits mëthanoliques sont combinés et, avec addition d'eau, concentrés sous vide.

On extrait 3 fois le concentré aqueux restant avec de l'acétate d'éthyle, on lave les extraits avec v un peu d'eau, on les combine et on les évapore sous 30 vide.

V. Les extraits de mycélium et de filtrat sont filtrés en utilisant 50 fois la quantité de Sephadex LH-20 et du méthanol comme éluant.

Les fractions contenant les pics d'élution sont % 23 ensuite purifiées par chromatographie en utilisant 40 fois la quantité de gel de silice 60 (dimension des particules = 0,04 - 0,063 mm) et de l'acétate 2 d'éthyle saturé d'eau comme ëluant. La [Val! -cyclos-5 porine est ëluëe d'abord suivie de la Cyclosporine et ~ * (je la [Val] -[(D)Ser] -cyclosporine. Ces dernières fractions sont purifiées à nouveau par chromatographie sur 100 fois la quantité de gel de silice 60 en utilisant un mélange 1:1 d'acétone et d'hexane comme 10 ëluant et par chromatographie à faible pression sur gel de silice à phase inversée ("Merck"

LiChroprep RP 18, dimension des particules = 0,04- 0,063 mm) en utilisant un mélange 80:20 de mëthanol 2 8 et d'eau comme éluant, ce qui donne la [Val j -[(D)Ser] -15 cyclosporine à l'état pur.

Exemple 8

Le composé de l'exemple 5.6 peut également être préparé par voie microbiologique en procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple 6a) mais avec les 20 modifications suivantes : a) Dans le milieu nutritif, on remplace la (DL)-norva-line par 5 g de (L)-thréonine. Après incubation, ς on extrait de la manière suivante:

On sépare le mycélium du milieu de culture - 25 et on l'extrait dans un appareil Turrax par broyage et agitation avec 3x9 litres de méthanol à 90%.

Le mycélium broyé est séparé du solvant par essorage et les filtrats combinés sont concentrés, sous addi-^ tion d'eau, par évaporation sous vide à une tempëra- % 30 ture de 40° jusqu'à ce que la vapeur soit essentielle- ment constituée d'eau. On extrait 3 fois le mélange obtenu en utilisant 5 litres d'acétate d'éthyle à chaque extraction et on concentre les solutions d'acétate d'éthyle réunies par évaporation sous vide * * 24 à une température de 40° .

Le résidu obtenu est soumis à une filtration sur Sephadex LH-20 (2kg, Pharmacia) avec du mëthanol. Les fractions constituées d'un mélange de cyclosporines 5 sont réunies et ensuite séparées par chromatographie - · sur colonne de gel de silice (2 kg de gel de silice, dimension des particules = 0,02 - 0,045 mm, "Grâce") en utilisant de l'acétate d'éthyle saturé d'eau comme éluant. Selon leur polarité, la Cyclosporine 10 est éluêe d'abord, suivie de la[(D)Ser]^-cyclosporine, 2 de la [Thr] -cyclosporine et finalement de la 2 8 [Thr] -C(D)Ser] -cyclosporine à l'état brut. On purifie la [Thr] -[(D)Serl -cyclosporine par chromatographie sur gel de silice (50 g, "Grâce", dimen-15 sion des particules = 0,02 - 0,45 mm) en utilisant un mélange 2:1 d'acétone et d'hexane comme éluant, ce qui donne la [Thr] -[(D)Ser] -cyclosporine à l'état pur sous forme d'une poudre blanche amorphe, b) La préculture requise est obtenue comme décrit à 20 1'exemple 6b).

2 8

La [Thr] -[(D)$er] -cyclosporine peut être préparée en bioréacteur en procédant de manière ~ analogue à celle décrite à l'exemple 6c) mais avec les modifications suivantes : 25 c) Dans le milieu de production, on remplace la (DL)- norvaline par 5 g de (L)-thrëonine. Après incubation et élimination du mycélium en utilisant un séparateur Westfalia, on procède de la manière suivante: v

On combine le mycélium avec du méthanol, ,/* 30 on homogénéise et on filtre. Cette extraction est répétée 2 fois en utilisant du mëthanol à 90%.

Les extraits méthanoliques sont combinés et, sous addition d'eau, concentrés sous vide. On extrait 3 fois le concentré aqueux restant avec de l'acétate * s 25 d'éthyle, on lave les extraits avec un peu d'eau, on les combine et on les concentre sous vide.

L'extrait de mycélium est filtré en utilisant 50 fois la quantité de Sephadex LH-20 et du mêthanol * 5 comme êluant. Les fractions contenant les pics , d'élution sont ensuite purifiées par chromatographie en utilisant 30 fois la quantité de gel de silice 60 (dimension des particules = 0,04 - 0,063 mm) et de l'acétate d'éthyle saturé d'eau 10 comme ëluant. La Cyclosporine est êluée d'abord g suivie de la [(D)Ser] -cyclosporine, de la [Thr] -cyclosporine et finalement de la [Thr] -[(D)Ser]s-cyclosporine. Ces dernières fractions sont purifiées à nouveau par chromatographie 15 en utilisant 250 fois la quantité de gel de silice 60 (dimension des particules = 0,02-0,045 mm) et un mélange 2:1 d'acétone et d'hexane comme ëluant., ? 8 ce qui donne la [Thr] -[(D)Ser] -cyclosporine à 11 état pur.

20 Exemple 9

Les composés suivants ,qui peuvent être utilisés comme produitsde départ pour la préparation a des composés des exemples 4.1 â 4.3, peuvent être préparés à partir des cyclosporines indiquées aux , * 25 exemples 5 à 7, en procédant de manière analogue à . celle décrite à l'exemple 3.

9.1 [Dihydro-MeBmt]1-[Nva]2-[(D)Ser]8.cyclosporine [formule 11la: X' = -dihydro-MeBmt-, Y' = -Nva-, Z' = -Val-, W = -(D)Ser-] -préparées partir du produit de l'ex. 5.2 ou 6: [a]20 =

on D

; JU - 251 * (C =1,23 dans CHCI3)/- 179 * (c =1,16 dans CH3OH): A F » 155 - 157 e .

T

* 26 9.2 [Dihydro-MeBmt]l-[Val]2-[(D)Ser]8-Cyc1osporine [formule IHa: X* = -dihydro-MeBmt-, Y* = -Val-, V = -Val-, W = -(D)Ser-] - préparéeà partir du produit de l'ex. 5.3 ou 7: [a]jJ0 = 5 - 224 e (c =1,0 dans CHC13).

9.3 [Dihydro-MeBmt]l-[Thr]2-[(D)Ser]8-cyclosporine [formule Ilia: X' = -dihydro-MeBmt-, V = -Thr-, V = -Val-, W = -(D)Ser-] - préparées partir du produit de l'ex. 5.3 ous^lp0 = 10 - 262 * (c =0,73 dans CHCI3)/- 173 * (c =0,79 dans CH3OH): F = 156 - 158 β .

Les cyclosporines de l'invention qui contiennent en position 8 le reste d'un (D)-acyloxy-a-amino-acide, par exemple les cyclosporines de formule I, se signais lent par d'intéressantes propriétés pharmacologiques et peuvent par conséquent être utilisées en thérapeutique comme médicaments. L'activité pharmacologique de ces composés a été mise en évidence dans les essais suivants : 20 1. Activité immunosuppressive 1.1. Hémolyse locale sur gel in vitro [R.I. Mishell et R.W. cutton, J. Exp. Medicine, 126, 423-442 (1976].

Les cyclosporines de formule I selon l'invention 25 inhibent à des concentrations de 0,01 à 10,0 ^ug/ml les zones d'hémolyse, par comparaison aux essais témoins non.traités.

1.2. Essai de stimulation lymphocytaire selon Janossy et Greaves [Clin. Exp. Immunol.,9, 483 (1971) et

î, 30 T_0, 525 (1972)]:- les cyclosporines de formule I

selon l'invention inhibent, à des concentrations ^ comprises entre 0,001 et 10,0 /jg/ml, la synthèse de l'acide désoxyribonucléique (DNA) stimulée par la concanavaline A (inhibition de l'assimila-

X

s η 3 tion de la H -thymidine), la prolifération des cellules et la blastogénèse des lymphocytes spléniques de souris,par comparaison aux essais témoins C non traités.

5 1.3. Réaction lymphocytaire mixte [J.F. Bach et coll., , , J. Exp. Med. 1 36., 1430 ( 1972)]:

La réaction, c'est-à-dire la prolifération et la différentiation , des lymphocytes [cellules spléniquesde souris Balb/c] par co-incubation 10 pendant 5 jours avec des cellules spléniques .

allogéniques provenant de souris irradiées (CBA^f ) , est mesurée en présence et en l'absence de la substance à essayer. La réaction en l'absence de la substance à essayer sert de témoin et est considérée 15 comme 100¾. La réaction en présence de la substance à essayer est exprimée par le changement en %, comparé avec la réaction témoin 100%. On observe une inhibition de réaction en utilisant les cyclosporines de formule I selon l'invention à une 20 concentration comprise entre 0,001 et 10,0 yug/ml \ 1.4. Suppression des rejets d'organes:

On transplante des reins de rats donneurs . (F 344,?) chez des rats receveurs (Wistar-Furth, ? ).

On administre la substance à essayer par voie . 25 orale pendant 14 jours aux rats receveurs et on arrête ensuite le traitement. 7 jours après la transplantation, les animaux d'essais sont soumis à une néphrectomie bilatérale. Etant donné que1 la vie % des animaux d'essais dépend de la tolérance à l'organe 30 et du fonctionnement de ce dernier, une augmen- * ^ tation du temps de survie par rapport aux animaux témoins recevant un placëbo sert seulement de paramètre pour l'efficacité de la substance à essayer. Dans cet essai, les animaux présentent une durée

X

s « 28 de survie de plus de 60 à plus de 250 jours après administration par voie orale des cyclosporines de formule I à des doses comprises entre - 2,5 et 10 mg/kg, alors que les animaux témoins 5 non traités meurent tous dans environ 9 I 10 jours L * par suite du phénomène de rejet de l'organe.

2. Activité anti-inf1ammatoire L'activité anti-inflammatoire a été mise en évidence chez le rat dans l'essai del'arthrite expéri-10 mentale par adjuvant. Dans cet essai, l'arthrite expérimentale par adjuvant est provoquée selon la méthode décrite par Pearson et Wood dans "Arthr. Rheum".^ 440 ( 1959). Dans cet essai, les cyclosporines de formule I sont actives aussi bien contre 15 l'apparition de l'arthrite que contre l'arthrite établie, après administration par voie orale à des doses comprises entre 10 et 30 mg/kg/jour.

3. Activité anti-parasitaire 20 L'activité anti-malarique a été déterminée selon la méthode décrite par L. Rane dans "Chemo-therapyand Drug Resistance in Malaria" ed. W. Peters, Academie Press, New York, 1970. Des souris mâles . (0F1 ) sont infestées le jour 0 avec 0,2 ml d'une 25 suspension contenant 107 cellules de parasites * de l'espèce Plasmodium berghei (souche NK 65) administrée par voie intrapéritonéale. La substance à essayer est administrée par voie sous-cutanée i.

le jour 3 à des doses variées en utilisant 5 à 10 30 souris/dose. Le temps de survie est enregistré et la dose efficace minimale (DEM) est calculée en comparant le temps de survie avec celui des animaux témoins non traités. Pour les animaux témoins, le temps de survie est d'environ 7 jours.

V

29 m

La DEM est la dose à laquelle le temps de survie est doublé. Dans cet essai, les cyclosporines de formule I sont actives lorsqu'elles sont administrées : par voie sous-cutanée à des doses comprises entre 5 25 et 100 mg/kg/jour.

·. * Grâce à leur activité immunosuppressive, les cyclosporines de formule I peuvent être utilisées en thérapeutique pour la prophylaxie et le traitement des maladies et des conditions nécessitant une réduction 10 de la réponse immunitaire par exemple pour supprimer la prolifération des lymphocytes et des immunocytes, en particulier dans le traitement des maladies auto-immunes ou pour la prévention du rejet après greffe ou transplantation, par exemple dans les greffes ou transplantations de 15 peau , de poumon , de coeur , de coeur -poumon , de moelle osseuse, de rein ., de pancréas, de rate et de cornée.

Les maladies auto-immunes spécifiques pour lesquelles les cyclosporines de formule I sont utiles comprennent toutes celles pour lesquelles un traitement 20 par la cyclosporine a été proposé ou utilisé, par exemple 1' anémie aplastique, l'anémie pure, la thrombopénie idiopathique, le lupus érythémateux disséminé, '? la polychondrite, la sclérodermie, la granulomatose de

Wegener, l'hépatite chronique active, la myasthénie J 25 grave, le psoriasis, le syndrome de Steven-Johnson, la sprue idiopathique, la maladie de Crohn, 1'ophtalmopa-thie de Graves, la sarcoidose, la sclérose multiple, la cirrhose biliaire primitive, le diabète v juvénile, l'uvéite postérieure,1 a fibrose interstitielle ^ 30 du poumon et l'arthrite psoriasique.

Grâce à leur activité anti-inf1ammatoire, les cyclosporines de formule I peuvent également être utilisées en thérapeutique pour le traitement des conditions inflammatoires , en particulier des conditions i s -c 30 inflammatoires avec une éthiologie auto-immune ou à composante auto-immune, par exemple pour le traitement de l'arthrite et des maladies rhumatismales telles que la polyarthrite rhumatoïde.

5 Grâce à leur activité anti-parasitaire, * _ les cyclosporines de formule I peuvent également être utilisées en thérapeutique comme agents anti-parasitaires, c'est-àrdire pour le traitement des infestations parasitaires variées,en particulier pour le traitement des parasitoses 10 à protozoaire ainsi que des parasitoses â trêmatode et à nématode. Les types spécifiques d'infestations parasitaires pour lesquelles les cyclosporines peuvent être utilisées, comprennent toutes celles pour lesquelles un traitement par la Cyclosporine a déjà été proposé 15 antérieurement dans la littérature, comprenant la schistosomiase, la filariose, la leishmaniose, la cocci-dioidomycose et en. parti cul i er le paludisme.

Pour les indications mentionnées ci-dessus, la dose quotidienne à administrer sera de l'ordre d'environ 20 75 jusqu'à environ 5000, de préférence jusqu'à environ 2000 et plus préférablement jusqu'à environ 1500 mg de substance active à prendre en une seule fois ou , en doses fractionnées 2 à 3 fois par jour. Les doses unitaires,par exemple pour l'administration par voie 25 orale, comprennent avantageusement d'environ 25 jusqu'à environ 2500, de préférence jusqu'à environ 1000 et plus préférablement jusqu'à environ 800 mg de substance active en mélange avec un diluant ou véhicule acceptable ς du point de vue pharmaceutique.

Λ 30 Les cyclosporines comportant le reste d'un (D)-acyloxy-a-amino-acide en position 8, par exemple les cyclosporines de formule I, peuvent être administrées par n'importe quelle voie habituelle, en particulier comme indiqué pour l'administration de la Cyclosporine, en particulier 31 « ¥ ¥ par perfusion intraveineuse,par exemple dans le cas d'une greffe ou d'une transplantation, avant ou immédiatement après la greffe ou la transplantation, ainsi que durant les épisodes de troubles gastro-v intestinaux susceptibles d'entraver l'absorption du produit, ou par ;i. 5 voie orale, par exemple sous forme d'un soluté buvable.

f , Conformément à ce qui précède, la présente invention concerne par conséquent une cyclosporine dans laquelle le reste de 1'amino-acide en position 8 est le reste d'un (D)-acyloxy-a-amino-acide, par exemple 10 une cyclosporine de formule I, pour l'utilisation comme médicament , en particulier pour l'utilisation comme immunosupresseur ou comme agent anti-inf1ammatoire ou agent anti-parasitaire.

L'invention concerne également un médicament 15 contenant, comme substance active, une cyclosporine dans laquelle le reste de l'amino-acide en position 8 est le reste d'un (D)-acyloxy-a-amino-acide, par exemple une cyclosporine de formule I.

L'invention concerne également une composi-20 tion pharmaceutique comprenant , comme substance active, une cyclosporine dans laquelle le reste de l'amino-acide en position 8 est le reste d'un (D)-acyloxy-a-amino-* acide, en particulier une cyclosporine de formule I> en association avec un diluant ou véhicule acceptable du 25 point de vue pharmaceutique.

, Comme indiqué précédemment, les cyclosporines de formule 111a sont des composés nouveaux qui, en plus de leur utilité comme produits intermédiaires, se W signalent par une activité et/ou un profil pharmacolo- ^ 30 gique intéressant, en particulier en ce qui concerne *<- leur activité immunosuppressive et spécialement leur utilité pour la prévention du rejet après greffe ou transplantation. L'activité et/ou le profil pharmacologique de ces composés est d'un intérêt tout particulier 3 32 β « comparé par exemple aux autres cyclosporines spécifiquement décrites dans le brevet européen n° 0 056 782. L'activité pharmacologique des cyclosporines de formule ^ Ilia peut être mise en évidence par exemple dans les ^ 5 essais 1.1, 1.2, 1.3, 2 ou 3 décrits précédemment.

^ * Ces ainsi que les cyclosporines de formule 111a selon l'invention sont actives

Dans l'essai 1:1 ci-dessus à des concentrations comprises entre 0,01 à 10 μg/ml, 10 Dans l'essai 1:2 ci-dessus à des concentrations comprises entre 0,001 et 10 yug/ml,

Dans l'essai 1.3 ci-dessus à des concentrations comprises entre 0,001 et 10 /îg/ml,

Dans l'essai 2 ci-dessus à des doses comprises entre 15 10 et 30 mg/kg/jour par voie orale,et

Dans l’essai 3 ci-dessus à des doses comprises entre 50 et 100 mg/kg/jour par voie sous-cutanée.

Grâce à leur activité immunosuppressive, 20 les cyclosporines de formule 111a peuvent être utilisées en thérapeutique pour la prophylaxie et le traitement des maladies et des conditions nécessitant une réduction de la réponse immunitaire, par exemple pour supprimer la prolifération des lymphocytes et des immuno- 25 cytes,en particulier dans le traitement des maladies * auto-immunes, par exemple dans le traitement des maladies auto-immunes spécifiques indiquées précédemment pour l'utilisation des cyclosporines de formule I , ou pour la prévention du rejet après greffe ou trans-30 plantation , par exemple des types spécifiques variés indiqués précédemment pour l'utilisation des cyclosporines de formule I. Grâce à leur activité anti-inflammatoire, les cyclosporines de formule 111a peuvent également être utilisées en thérapeutique pour le traitement ijr 33 des conditions inflammatoires, en particulier des conditions inflammatoires avec une éthiologie autoimmune ou à composante auto-immune , par exemple pour le traitement de l'arthrite et des 5 maladies rhumatismales telles que la polyarthrite rhuma-.. . toïde.

Grâce à leur activité anti-parasitaire, les cyclosporines de formule III peuvent également être utilisées en thérapeutique comme agents anti-10 parasitaires, par exemple pour le traitement des infections parasitaires variées, en particulier comme indiqué précédemment pour les cyclosporines de formule I .

Pour les indications mentionnées ci-dessus, K la dose quotidienne à administrer sera de l'ordre d'environ 75 à environ 5000 mg,à prendre avantageusement en une seule fois ou en doses fractionnées 2 â 3 fois par jour. Les doses unitaires, par exemple pour l'administration par voie orale, comprennent avantageusement 20 par exemple d'environ 25 à environ 2500 mg de cyclosporine de formule 111a en mélange avec un diluant ou véhicule acceptable du point de vue pharmaceutique.

& Les cyclosporines de formule 111a peuvent être administrées selon n'importe quelle voie habituelle, 25 par exemple comme indiqué pour l'administration par la , cyclosporine, en particulier par perfusion intraveineuse , par exemple dans le cas d'une greffe ou d'une transplantation ,avant et immédiatement après la greffe ou la ^ transplantation , ainsi que durant les épisodes de 30 troubles gastro-intestinaux susceptibles d'entraver l'absorption du produit , ou par voie orale, par exemple sous forme d'un soluté buvable.

Conformément à ce qui précède, la présente invention concerne par conséquent une cyclosporine i» 34 fc de formule 111a pour l'utilisation comme médicament , en particulier pour l'utilisation comme immunosuppresseur ou comme agent anti-inf1ammatoire ou comme agent ^ anti-parasitaire.

5 L'invention comprend également un médicament v comprenant , comme substance active, une cyclosporine de formule IIIa.

L'invention comprend également une composition pharmaceutique contenant, comme substance active, 10 une cyclosporine de formule Illaen association avec un diluant ou véhicule acceptable du point de vue pharmaceutique.

V

* V,

'V

Claims (18)

1. 35
2. 1,- Une cyclosporine dans laquelle le reste de l'amino-acide en position 8 est le reste ^ d'un (D)-acyloxy-a-amino-acide.
3. 2. Une cyclosporine selon la revendication 1, ; . caractérisée en ce que le reste de l'amino-acide en position 8 est le reste d'un (D)-ß-acyloxy-a-amino-acide.
4. 3.- Une cyclosporine , caractérisée en ce 10 qu'elle répond à la formule I —X-Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-Ala-Q-MeLeu-MeLeu-MeVal—^ j ^ 123 456 789 10 11 15 dans laquelle X signifie -MeBmt- ou -dihydro-MeBmt-, Y signifie -aAbu-r,-Al a-, -Thr-, -Val- ou -Nva-, Z signifie -Val- ou -Nva- , et Q est un reste de formule II 20 R2 (Π) Rl-CO-O-CH * -NH-CH-CO- .25 (D) „ dans laquelle Ri signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C-j-C4 ou phényle et ^ R0 signifie l'hydrogène ou un groupe méthyle. L g v 30 4.- La [0-acétyl-(D)-Ser] -cyclosporine.
5. 5.- Une cyclosporine , caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi - la [Nva]2-[0-acétyl-(D)-Ser]8-cyclosporine, 1 8 - la [dihydro-MeBmt] -[0-acëtyl-(D)Ser] -cyclosporine, L 4. 36 Ο - la [O-benzoyl-(D)Ser] -cyclosporine, - laCdihydro-MeBmt]^-[Nva]^-[0-acétyl-(D)Ser]^-cyclospo-ri ne, C Q - la CNva] -[0-acêtyl-(D)-Ser] -cyclosporine, 5. la [0-acétyl-(D)Thr]8-cyclosporine, 2 8 - la [Val] -[0-acêtyl-(D)Ser] -cyclosporine, - la [dihydro-MeBmt]1-[Val]2-[0-acëtyl-(D)Ser]8-cyclos-porine, - la [Nva]2-[Nva]^-[0-acétyl-(D)Ser]8-cyclosporine, 2 8 10. la [Thr] -[0-acëtyl-(D)Ser] -cyclosporine, et - la [dihydro-MeBmt]^-[Thr]2-[0-acéty1-(D)Ser]8-cyclos-pori ne.
6. 6.- Procédé de préparation d'une cyclosporine dans laquelle le reste de 1'ami no-acide en position 8 15 est le reste d'un (D)-acyloxy-a-amino-acide , par exemple le reste d'un (D)-ß-acyloxy-a-amino-acide, caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'acylation d'une cyclosporine dans laquelle le reste de l'amino-acide en position 8 est le reste d'un 20 (D)-hydroxy-a-amino-acide, par exemple le reste d'un (D)-ß-hydroxy-a-amino-acide, ou b) la réduction d'une cyclosporine dans laquelle le • reste de l'amino-acide en position 1 est un reste -MeBmt- et le reste en position 8 est le reste 25 d'un (D)-acyloxy-a-amino-acide, par exemple le reste d'un (D)-ß-acyloxy-a-amino-acide, pour obtenir la cyclosporine correspondante dans laquelle le reste en position 1 est le reste-dihydro-MeBmt-.
7. 7.- Procédé de préparation des cyclosporines Je 30 formule I définies à la revendication 3, caractérisé , en ce qu'il comprend a) l'acylation d'une cyclosporine de formule III 37 —X-Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-AIa-W-MeLeu-MeLeu-MeVaL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (III) 5 dans laquelle X, Y et Z ont les significations données à la revendication 3 et W représente un reste de formule IV *2 10 HO-CH . (IV) -NH-CH-CO- (D) 15 dans laquelle Rg a la signification donnée à la revendication 3, pour introduire en position & dudit reste IV un groupe R-j -CO- dans lequel R-j a la signification donnée à la revendication 3, 20 ou b) la réduction d'une cyclosporine de formule I telle que définie à la revendication 3,dans laquelle X signifie -MeBmt-, pour produire la cyclosporine correspondante dans laquelle X signifie le reste -dihydro-MeBmt-. 25 8,- Une cyclosporine telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour l'utilisation comme médicament .
8. 9. Une cyclosporine telle que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour l'utilisa- 30 tion comme immuno-suppresseur ou comme agent anti-inflammatoire ou comme agent anti-parasitaire.
9. 10. Un médicament, caractérisé en ce qu'il contient, comme substance active, une cyclosporine 38 telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 5.
10. 11. Une composition pharmaceutique , caractérisée en ce qu'elle comprend une cyclosporine telle 5 que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 5, en association avec un diluant ou véhicule acceptable du point de vue pharmaceutique .
11. 12. Une cyclosporine de formule 111a 10 |—X'-Y'-Sar-MeLeu-Z'-MeLeu-Al a-W'-MeLeu-Meteu-MeVal—. 123 45 6 78 9 10 11 (IHa) 15 dans laquelle Y' signifie -aAbu-, -Thr-, -Val- ou -Nva-, Z' signifie -Val-.ou , lorsque Y1 signifie -aAbu- ou -Nva-, également -Nva-, W signifie -(D)Ser- ou, lorsque Y' signifie -aAbu- et 20 Z1 signifie -Val-, également -(D)Thr-, et X' signifie -MeBmt ou, lorsque Y1 signifie -Thr-,-Val-ou -Nva-, Z1 signifie -Val- et W signifie -(D)Ser-, également -dihydro-MeBmt- .
12. 13. Une cyclosporine, caractérisée en ce 25 qu'elle est choisit par la [(D)Thr]8-cyclosporine, la [Nva]^-[(D)-Ser]^-cyclosporine et la [Nva]^-[Nva]^-[(D) g Ser] -cyclosporine.
13. 14. Procédé de préparation d' une cyclosporine de formule 111a telle que définie à la revendica- 30 tion 12, caractérisé en ce qu'il comprend : c) la déprotection d'une cyclosporine de formule Ilia, telle que définie à la revendication 12, sous forme protégée à l'oxygène, 39 d) la cyclisation d'un undécapeptide à chaîne droite comprenant la séquence -W1-MeLeu-MeLeu-MeVal-X'-Y'-Sar-MeLeu-Z'-Meleu-Ala-5 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 dans laquelle Y', Z', W et X' ont les significations données à la revendication 12 pour la formule IIla,ledit undë-capetide étant sous forme non protégée ou sous 10 forme protégée à l'oxygène et, si nécessaire, la mise en oeuvre du procédé c), e) pour l'obtention d'une cyclosporine de formule 111a dans laquelle Y' signifie -Thr-, -Val-ou -Nva-,
14. 15 Z' signifie -Val- ou, lorsque Y' signifie -Nva-, également -Nva-, W signifie -(D)-Ser- et X' signifie -MeBmt-, la culture d'une souche fongique produisant la 2 2 20 [Thr] -cyclosporine, la [Val] -cyclosporine, 2 2 5 la [Nva] -cyclosporine ou la [Nva] -[Nva] -cyclosporine , dans un milieu nutritif contenant de la (D)-sérine et isolement de la cyclosporine de formule 111a à partir du milieu de culture, 25 f) pour l'obtention d'une cyclosporine de formule IIIa dans laquelle X' signifie -dihydro-MeBmt, la réduction de la cyclosporine correspondante de formule Ilia dans laquelle X' signifie -MeBmt-. 15, - Une cyclosporine telle que définie à la 30 revendication 12 ou 13,pour l'utilisation comme médicament.
15. 16. Une cyclosporine telle que définie à la revendication 12 ou 13, pour l'utilisation comme immunosuppresseur ou comme agent anti-inflammatoire ou agent anti-parasi tai re. 40
16. 17. Un médicament, caractérisé en ce qu'il contient, comme substance active, une cyclosporine telle que définie à la revendication 12 ou 13.
17. 18. Une composition pharmaceutique, caractë-5 risée en ce qu'elle comprend une cyclosporine telle que définie à la revendication 12 ou 13, en association avec un diluant ou véhicule acceptable du point de : vue pharmaceutique.
18. 19. Produits et procédés en substance comme 10 ci-dessus décrit avec référence aux exemples cités.