RU2200562C2 - Functionalized nanotubes - Google Patents

Abstract

FIELD: molecular biology. SUBSTANCE: invention describes graphite nanotubes that comprise tubular fullerenes and fibrils that are functionalized by chemical substitution or adsorption of functional moieties of biological molecules. Invention relates to graphite nanotubes that are substituted with molecule chemical moieties uniformly or non-uniformly or containing some cyclic compounds adsorbed on nanotubes and to complex structures consisting of such functionalized nanotubes linked with each other. Invention relates also to methods of incorporation of functional groups on surface of such nanotubes. EFFECT: expanded arsenal of biologically active agents. 63 cl, 10 dwg, 5 ex

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Эта заявка является частичным продолжением заявки США, сер. 08/352400, поданной 8 декабря 1994 года, содержание которой включено здесь в качестве ссылки.CROSS REFERENCE TO A RELATED APPLICATION
This application is a partial continuation of the application US, ser. 08/352400, filed December 8, 1994, the contents of which are incorporated herein by reference.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к графитовым нанотрубкам, которые включают трубчатые фуллерены (обычно называемые "buckytubes") и фибриллы, которые функционализованы (присоединение функциональных групп) химическим замещением или адсорбцией функциональных частей молекул. Более конкретно данное изобретние относится к графитовым нанотрубкам, которые однородно или неоднородно замещены химическими частями молекул или на которых адсорбированы некоторые циклические соединения, и к комплексным структурам, содержащим такие функционализованные фибриллы, соединенные друг с другом. Данное изобретение относится также к способам введения функциональных групп на поверхность таких структур.FIELD OF THE INVENTION
This invention relates to graphite nanotubes, which include tubular fullerenes (commonly called "buckytubes") and fibrils that are functionalized (attachment of functional groups) by chemical substitution or adsorption of the functional parts of the molecules. More specifically, the present invention relates to graphite nanotubes that are uniformly or nonuniformly substituted by the chemical parts of the molecules or on which some cyclic compounds are adsorbed, and to complex structures containing such functionalized fibrils connected to each other. The present invention also relates to methods for introducing functional groups onto the surface of such structures.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение лежит в области субмикронных графитовых фибрилл, иногда называемых выращенными в парах углеродными волокнами. Углеродные фибриллы представляют собой червеобразные углеродные отложения, имеющие диаметры менее 1,0 мкм, предпочтительно менее 0,5 мкм и, даже более предпочтительно, менее 0,2 мкм. Они существуют в разнообразных формах и были получены каталитическим разложением различных углеродсодержащих газов на металлических поверхностях. Такие червеобразные углеродные отложения наблюдали почти со времени появления электронной микроскопии. Хороший ранний обзор и ссылки можно найти в Baker and Harris, Chemistry and Physics of Carbon, Walker and Thrower ed. , Vol. 14, 1978, p. 83, включено здесь в качестве ссылки. См. также Rodriguez N., J. Mater. Research, Vol. 8, р. 3233 (1993), включено здесь в качестве ссылки.BACKGROUND OF THE INVENTION
This invention lies in the field of submicron graphite fibrils, sometimes referred to as carbon fiber grown in pairs. Carbon fibrils are worm-like carbon deposits having diameters of less than 1.0 microns, preferably less than 0.5 microns, and even more preferably less than 0.2 microns. They exist in various forms and were obtained by catalytic decomposition of various carbon-containing gases on metal surfaces. Such worm-like carbon deposits have been observed almost since the advent of electron microscopy. A good early review and links can be found in Baker and Harris, Chemistry and Physics of Carbon, Walker and Thrower ed. , Vol. 14, 1978, p. 83, incorporated herein by reference. See also Rodriguez N., J. Mater. Research, Vol. 8, p. 3233 (1993), incorporated herein by reference.

В 1976 году Endo et а1. (см. Obelin A. and Endo M., J. of Crystal Growth, Vol. 32 (1976), pp. 335-349, включено здесь в качестве ссылки) выяснили основной механизм, по которому происходит рост таких углеродных фибрилл. Было обнаружено, что они происходят из частицы металлического катализатора, который в присутствии содержащего углеводород газа становится пересыщенным по углероду. Экструдируется цилиндрический графитовый сердечник, который немедленно, согласно Endo et аl., становится покрытым наружным слоем пиролитически отлагающегося графита. Эти фибриллы с пиролитическим покрытием, как правило, имеют диаметры более 0,1 мкм, более типично 0,2-0,5 мкм. In 1976, Endo et a1. (see Obelin A. and Endo M., J. of Crystal Growth, Vol. 32 (1976), pp. 335-349, incorporated herein by reference) have elucidated the basic mechanism by which such carbon fibrils grow. It was found that they come from a particle of a metal catalyst, which in the presence of a hydrocarbon-containing gas becomes carbon supersaturated. A cylindrical graphite core is extruded, which immediately, according to Endo et al., Becomes coated with an outer layer of pyrolytically deposited graphite. These pyrolytic coated fibrils typically have diameters greater than 0.1 microns, more typically 0.2-0.5 microns.

В 1983 году Tennent, US Patent No. 4663230, включено здесь в качестве ссылки, удалось вырастить цилиндрические графитовые сердечники, незагрязненные пиролитическим углеродом. Таким образом, изобретение Tennent обеспечило доступность фибрилл меньшего диаметра, как правило, 35-700

(0,0035-0,07 мкм), и упорядоченной, "как бы выращенной" графитовой поверхности. Фибриллярные углеродные материалы менее совершенной структуры, но без наружного слоя пиролитического углерода также были выращены.In 1983, Tennent, US Patent No. 4663230, incorporated herein by reference, succeeded in growing cylindrical graphite cores not contaminated with pyrolytic carbon. Thus, the invention of Tennent provided the availability of smaller fibrils, usually 35-700

(0.0035-0.07 microns), and an ordered, "as if grown" graphite surface. Fibrillar carbon materials of less than perfect structure, but without the outer layer of pyrolytic carbon, were also grown.

Фибриллы (трубчатые фуллерены) и нановолокна отличаются от непрерывных углеродных волокон, коммерчески доступных в качестве материалов усиливающих волокон. В противоположность фибриллам, которые имеют желательно большие, но неизбежно конечные относительные удлинения, непрерывные углеродные волокна имеют относительные длины (L/D, длина/диаметр) по меньшей мере 10⁴ и часто 10⁶ или более. Диаметр непрерывных волокон также гораздо больше, чем диаметр фибрилл, будучи всегда >1,0 мкм и, как правило, 5-7 мкм.Fibrils (tubular fullerenes) and nanofibers differ from continuous carbon fibers commercially available as reinforcing fiber materials. In contrast to fibrils, which have preferably large, but inevitably finite elongations, continuous carbon fibers have relative lengths (L / D, length / diameter) of at least 10 ⁴ and often 10 ⁶ or more. The diameter of continuous fibers is also much larger than the diameter of fibrils, being always> 1.0 μm and usually 5-7 μm.

Непрерывные углеродные волокна производят пиролизом органических предшественников-волокон, обычно гидратцеллюлозного волокна, полиакрилонитрила (PAN) и смолы. Таким образом, они могут содержать гетероатомы в их структурах. Графитовая природа "как бы изготовленных" непрерывных углеродных волокон изменяется, но они могут быть подвергнуты последующей стадии графитизации. Различия в степени графитизации, ориентации и кристалличности графитовых поверхностей, если они присутствуют, потенциальное присутствие гетероатомов и даже абсолютное различие в диаметре субстрата делает опыт работы с непрерывными волокнами малоперспективным для химии нановолокон. Continuous carbon fibers are produced by pyrolysis of organic fiber precursors, typically cellulose hydrate, polyacrylonitrile (PAN) and resin. Thus, they can contain heteroatoms in their structures. The graphite nature of the “as-made” continuous carbon fibers is changing, but they can be subjected to a subsequent graphitization step. Differences in the degree of graphitization, orientation and crystallinity of graphite surfaces, if present, the potential presence of heteroatoms and even the absolute difference in the diameter of the substrate makes the experience with continuous fibers unpromising for the chemistry of nanofibers.

Tennent, US Patent No. 4663230, описывает углеродные фибриллы, которые не имеют непрерывного термического углеродного покрытия и имеют множественные графитовые наружные слои, которые по существу параллельны оси фибриллы. Как таковые, они могут быть охарактеризованы как имеющие с-оси, оси, которые являются перпендикулярными касательным изогнутых слоев графита, по существу перпендикулярными их цилиндрическим осям. Как правило, они имеют диаметры не более 0,1 мкм и отношения длины к диаметру по меньшей мере 5. Желательно, чтобы они были по существу свободны от непрерывного термического углеродного покрытия, т. е. пиролитически отлагающегося углерода, происходящего вследствие термического разрушения подаваемого газа, используемого для их изготовления. Tennent, US Patent No. No. 4,663,230 describes carbon fibrils that do not have a continuous thermal carbon coating and have multiple graphite outer layers that are substantially parallel to the axis of the fibrils. As such, they can be characterized as having c-axes, axes that are perpendicular to the tangent of the curved layers of graphite, essentially perpendicular to their cylindrical axes. As a rule, they have diameters of not more than 0.1 μm and a ratio of length to diameter of at least 5. It is desirable that they be substantially free of continuous thermal carbon coating, i.e., pyrolytically deposited carbon resulting from the thermal destruction of the feed gas used for their manufacture.

Tennent et al., US Patent No. 5171560, включено здесь в качестве ссылки, описывает углеродные фибриллы, не содержащие термического покрытия и имеющие графитовые слои, по существу параллельные осям фибрилл, так что проекция этих слоев на оси фибрилл простирается на расстояние по меньшей мере двух диаметров фибрилл. Как правило, такие фибриллы являются по существу цилиндрическими, графитовыми нанотрубками по существу постоянного диаметра и содержат цилиндрические графитовые слои, с-оси которых по существу перпендикулярны их цилиндрической оси. Они практически не имеют пиролитически отложенного углерода, имеют диаметр менее 0,1 мкм и отношение длины к диаметру более 5. Эти фибриллы являются фибриллами первостепенного интереса в данном изобретении. Tennent et al., US Patent No. 5171560, incorporated herein by reference, describes carbon fibrils that are not thermally coated and have graphite layers substantially parallel to the axes of the fibrils, so that the projection of these layers on the axis of the fibrils extends over at least two diameters of the fibrils. Typically, such fibrils are essentially cylindrical, graphite nanotubes of essentially constant diameter and contain cylindrical graphite layers whose c-axes are substantially perpendicular to their cylindrical axis. They have practically no pyrolytically deposited carbon, have a diameter of less than 0.1 μm and a ratio of length to diameter of more than 5. These fibrils are fibrils of primary interest in this invention.

Дальнейшие подробности, касающиеся образования агрегатов углеродных фибрилл, могут быть найдены в описании Snyder et al., US Patent Application Serial No. 149573, поданной 28 января 1988 года, и PCN Application No. US 89/00322, поданной 28 января 1989 года ("Углеродные фибриллы"), WO 89/07163, и Моy et al., US Patent Application Serial No. 413837, поданной 28 сентября 1989 года, и PCN Application No. US 90/05498, поданной 27 сентября 1990 ("Агрегаты фибрилл и способ их приготовления"), WO 91/05089, все переуступленные правопреемнику, являющемуся также правопреемником данного изобретения, и включенные в качестве ссылки. Further details regarding the formation of aggregates of carbon fibrils can be found in the description of Snyder et al., US Patent Application Serial No. 149573, filed January 28, 1988, and PCN Application No. US 89/00322, filed January 28, 1989 (Carbon Fibrils), WO 89/07163, and My et al., US Patent Application Serial No. 413837, filed September 28, 1989, and PCN Application No. US 90/05498, filed September 27, 1990 (“Aggregates of fibrils and a method for their preparation”), WO 91/05089, all assigned to the assignee, which is also the assignee of this invention, and incorporated by reference.

Моу et al., USSN 07/887307, filed May 22, 1992, включено здесь в качестве ссылки, описывает фибриллы, приготовленные в виде агрегатов, имеющих различные макроскопические морфологии (как определено сканирующим электронным микроскопом), в которых они произвольно спутаны друг с другом с образованием спутанных шариков или фибрилл, напоминающих гнезда птиц ("BN", bird nests), или в виде агрегатов, состоящих из пучков прямых, слегка изогнутых или загнутых углеродных фибрилл, имеющих по существу одну и ту же относительную ориентацию и имеющих вид, например, расчесанной пряжи ("CY", combed yarn), продольная ось каждой фибриллы (несмотря на индивидуальные изгибы или загибы) простирается в том же самом направлении, что и направление окружающих фибрилл в пучках, или в виде агрегатов, состоящих из прямых или слегка согнутых или загнутых фибрилл, которые рыхло спутаны друг с другом с образованием структуры "открытой сетки" ("ON", open net). В структурах открытой сетки степень спутанности фибрилл является большей, чем в агрегатах типа расчесанной пряжи (в которых отдельные фибриллы имеют по существу одну и ту же относительную ориентацию), но меньшей, чем в случае типа птичьих гнезд. CY- и ON-агрегаты более легко диспергируются, чем BN, что делает их применимыми в изготовлении композиционного материала, где желательны однородные свойства по всей структуре. Moe et al., USSN 07/887307, filed May 22, 1992, incorporated herein by reference, describes fibrils prepared as aggregates having different macroscopic morphologies (as determined by a scanning electron microscope) in which they are randomly confused with each other with the formation of entangled balls or fibrils resembling bird nests ("BN", bird nests), or in the form of aggregates consisting of bundles of straight, slightly curved or curved carbon fibrils having essentially the same relative orientation and having the form, for example combed pr yazhi ("CY", combed yarn), the longitudinal axis of each fibril (despite individual bends or bends) extends in the same direction as the direction of the surrounding fibrils in bundles, or in the form of aggregates consisting of straight or slightly bent or bent fibrils that are loosely entangled with each other with the formation of the structure of "open mesh" ("ON", open net). In open-grid structures, the degree of confusion of fibrils is greater than in aggregates such as combed yarn (in which individual fibrils have essentially the same relative orientation), but less than in the case of type of bird nests. CY and ON aggregates are more easily dispersed than BN, which makes them applicable in the manufacture of composite materials, where uniform properties throughout the structure are desired.

Когда проекция графитовых слоев на ось фибриллы простирается на расстояние, меньшее, чем два диаметра фибриллы, углеродные плоскости графитового нановолокна, в поперечном сечении, имеют вид скелета селедки. Они названы фибриллами рыбьего скелета. Geus, US Patent No. 4855091, включено здесь в качестве ссылки, обеспечивает процедуру для приготовления фибрилл рыбьего скелета, практически не содержащих пиролитического покрытия. Эти фибриллы применимы также в практике данного изобретения. When the projection of graphite layers onto the axis of the fibril extends to a distance less than two diameters of the fibril, the carbon planes of the graphite nanofiber, in cross section, have the form of a skeleton of a herring. They are called fibrils of a fish skeleton. Geus, US Patent No. 4855091, incorporated herein by reference, provides a procedure for preparing fish skeleton fibrils that are substantially free of pyrolytic coating. These fibrils are also applicable in the practice of this invention.

Углеродные нанотрубки с морфологией, сходной с каталитически выращенными фибриллами, описанными выше, были выращены в высокотемпературной угольной дуге (Iijima. , Nature, 354, 56, 1991). Сейчас, как правило, признается (Weaver, Science, 265, 1994), что эти выращенные в угольной дуге нановолокна имеют ту же самую морфологию, что и более ранние каталитически выращенные фибриллы Tennent. Выращенные в угольной дуге углеродные нановолокна также применимы в данном изобретении. Carbon nanotubes with a morphology similar to the catalytically grown fibrils described above were grown in a high temperature carbon arc (Iijima., Nature, 354, 56, 1991). It is now generally recognized (Weaver, Science, 265, 1994) that these carbon-arc-grown nanofibers have the same morphology as earlier catalytically grown Tennent fibrils. Carbon nanowires grown in a carbon arc are also useful in the present invention.

McCarthy et al., US Patent Application Serial No. 351967, filed May 15, 1989, включено здесь в качестве ссылки, описывают способы окисления поверхности углеродных фибрилл, которые предусматривают контактирование этих фибрилл с окислителем, который включает серную кислоту (Н₂SО₄) и хлорат калия (КСlO₃), в реакционных условиях (например, времени, температуре и давлении), достаточных для окисления поверхности фибриллы. Фибриллы, окисленные в соответствии с процессами McCarthy et al., являются неоднородно окисленными, т.е. атомы углерода замещены смесью карбоксильных, альдегидных, кетоновых, фенольных и других карбонильных групп.McCarthy et al., US Patent Application Serial No. 351967, filed May 15, 1989, incorporated herein by reference, describes methods for oxidizing the surface of carbon fibrils that involve contacting these fibrils with an oxidizing agent that includes sulfuric acid (H ₂ SO ₄ ) and potassium chlorate (KClO ₃ ) under reaction conditions (e.g. time, temperature, and pressure) sufficient to oxidize the surface of the fibril. Fibrils oxidized according to the processes of McCarthy et al. Are heterogeneously oxidized, i.e. carbon atoms are replaced by a mixture of carboxyl, aldehyde, ketone, phenolic and other carbonyl groups.

Фибриллы также неоднородно окислялись обработкой азотной кислотой. International Application PCN/US 94/10168 описывает образование окисленных фибрилл, содержащих смесь функциональных групп. Hoogenvaad M. S. et al. ("Metal Catalysts supported on Novel Carbon Support", Presented at Sixth International Conference on Scientific Basis for the Preparation of Heterogeneous Catalysts, Brussels, Belgium, September 1994) также обнаружили, что удобно при приготовлении удерживаемых на фибриллах благородных металлов предварительно окислять поверхности фибрилл азотной кислотой. Такая предварительная обработка кислотой является стандартной стадией в приготовлении удерживаемых на углеродных носителях катализаторов -благородных металлов, где, при обычных источниках такого углерода, она служит настолько же для очистки поверхности от нежелательных материалов, насколько для функционализации ее. Fibrils were also heterogeneously oxidized by treatment with nitric acid. International Application PCN / US 94/10168 describes the formation of oxidized fibrils containing a mixture of functional groups. Hoogenvaad M. S. et al. ("Metal Catalysts supported on Novel Carbon Support", Presented at Sixth International Conference on Scientific Basis for the Preparation of Heterogeneous Catalysts, Brussels, Belgium, September 1994) also found it convenient to pre-oxidize the surfaces of nitrogen fibrils when preparing noble metals held on fibrils acid. Such acid pretreatment is a standard step in the preparation of noble metal catalysts held on carbon carriers, where, with conventional sources of such carbon, it serves as much to clean the surface of undesirable materials as to functionalize it.

В опубликованной работе McCarthy and Bening (Polymer Preprints ACS Div. of Polymer Chem., 30 (1) 420 (1990)) производные окисленных фибрилл получают для демонстрации того, что эта поверхность содержит множество окисленных групп. Соединения, которые были получены, фенилгидразоны, галогенароматические сложные эфиры, соли таллия и т.д., были выбраны из-за их аналитической применимости, вследствие, например, их яркой окраски или проявления какого-либо сильного и легко индентифицируемого и дифференцируемого сигнала. Эти соединения не были выделены и, в отличие от производных, описанных здесь, не имеют практического значения. In a published paper by McCarthy and Bening (Polymer Preprints ACS Div. Of Polymer Chem., 30 (1) 420 (1990)), oxidized fibril derivatives are prepared to demonstrate that this surface contains many oxidized groups. The compounds that were obtained, phenylhydrazone, halogenated aromatic esters, thallium salts, etc., were chosen because of their analytical applicability, due, for example, to their bright color or the manifestation of any strong and easily identifiable and differentiable signal. These compounds were not isolated and, unlike the derivatives described herein, have no practical significance.

Хотя были найдены многие возможности использования углеродных фибрилл, описанные в патентах и патентных заявках, которые даны в виде ссылок выше, многочисленные и различные применения могут быть разработаны при функционализации поверхностей фибрилл. Функционализация, однородная или неоднородная, делает возможным взаимодействие функционализованных фибрилл с различными субстратами с образованием уникальных композиций с уникальными свойствами и образование фибриллярных структур на основе связей между функциональными сайтами на поверхности фибрилл. Although many uses for carbon fibrils have been found, described in patents and patent applications, which are given in the form of links above, numerous and various applications can be developed for the functionalization of the surfaces of fibrils. Functionalization, homogeneous or heterogeneous, makes it possible to interact functionalized fibrils with various substrates with the formation of unique compositions with unique properties and the formation of fibrillar structures based on the bonds between functional sites on the surface of fibrils.

ОБЪЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таким образом, первым объектом данного изобретения являются функционализованные фибриллы, т.е. фибриллы, поверхности которых однородно или неоднородно модифицированы таким образом, что они имеют связанную с ними функциональную химическую группу.OBJECTS OF THE INVENTION
Thus, the first object of this invention are functionalized fibrils, i.e. fibrils whose surfaces are uniformly or heterogeneously modified in such a way that they have a functional chemical group associated with them.

Следующим и связанным с этим объектом данного изобретения являются фибриллы, поверхности которых функционализованы реакцией в окислительной или других химических средах. The next and related object of the present invention are fibrils, the surfaces of which are functionalized by reaction in oxidizing or other chemical environments.

Другим и связанным с этим объектом данного изобретения являются фибриллы, поверхности которых однородно модифицированы либо химической реакцией, либо физической адсорбцией молекул, которые сами обладают химической реакционной способностью. Another and related object of this invention are fibrils, the surfaces of which are uniformly modified either by a chemical reaction or by physical adsorption of molecules that themselves have chemical reactivity.

Следующим объектом данного изобретения являются фибриллы, поверхности которых были модифицированы, например, окислением, которые затем дополнительно модифицированы реакцией с функциональными группами. The next object of this invention are fibrils, the surfaces of which were modified, for example, by oxidation, which are then further modified by reaction with functional groups.

Еще одним дополнительным и связанным с этим объектом данного изобретения являются фибриллы, поверхности которых модифицированы спектром функциональных групп, так что эти фибриллы могут химически взаимодействовать или физически связываться с химическими группами в различных субстратах. Another additional and related object of the present invention are fibrils, the surfaces of which are modified by a spectrum of functional groups, so that these fibrils can chemically interact or physically bind to chemical groups in various substrates.

Еще одним дополнительным и связанным с этим объектом данного изобретения являются комплексные структуры фибрилл путем связывания функциональных групп на фибриллах друг с другом посредством ряда линкерных химических групп. Another additional and related object of the present invention is the complex structures of fibrils by linking functional groups on fibrils to each other through a number of linker chemical groups.

Еще одним дополнительным и связанным с этим объектом данного изобретения являются способы химической модификации поверхностей фибрилл и способы физической адсорбции частиц на поверхностях фибрилл для создания таким образом, в каждом случае, функциональной группы, связанной с поверхностью фибриллы. Another additional and related object of the present invention are methods of chemical modification of the surfaces of fibrils and methods of physical adsorption of particles on the surfaces of fibrils in order to create, in each case, in this case, a functional group associated with the surface of the fibril.

Дополнительным объектом данного изобретения являются новые композиции на основе функционализованных фибрилл. An additional object of the present invention are new compositions based on functionalized fibrils.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Фиг.1 является графическим представлением анализа связывания БСА с обыкновенными фибриллами, карбоксифибриллами и модифицированными PEG (ПЭГ) фибриллами.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Figure 1 is a graphical representation of the analysis of the binding of BSA with ordinary fibrils, carboxy fibrils and modified PEG (PEG) fibrils.

Фиг.2 является графическим представлением анализа связывания β-лактоглобулина с карбоксифибриллами и модифицированными PEG (ПЭГ) фибриллами, полученными двумя различными способами. Figure 2 is a graphical representation of an analysis of the binding of β-lactoglobulin to carboxy-fibrils and modified PEG (PEG) fibrils obtained in two different ways.

Фиг. 3 является графическим представлением в виде диаграммы профиля элюции бычьего сывороточного альбумина (БСА) на колонке фибрилл, модифицированных третичным амином. FIG. 3 is a graphical representation of an elution profile of bovine serum albumin (BSA) on a tertiary amine modified fibril column.

Фиг.4 является графическим представлением в виде диаграммы профиля элюции БСА на колонке фибрилл, модифицированных четвертичным амином. 4 is a graphical representation of a BSA elution profile on a quaternary amine modified fibril column.

Фиг.5 представляет последовательность реакций для получения дендримерных фибрилл на основе лизина. Figure 5 represents the sequence of reactions for obtaining dendrimeric fibrils based on lysine.

Фиг. 6 является графическим представлением циклических вольтамперограмм, демонстрирующих использование модифицированных железо-фталоцианином фибрилл в проточной ячейке. FIG. 6 is a graphical representation of cyclic voltammograms demonstrating the use of iron-phthalocyanine-modified fibrils in a flow cell.

Фиг. 7 представляет последовательность реакций для получения бифункциональных фибрилл путем присоединения N_ε-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина.FIG. 7 is a reaction sequence for producing bifunctional fibrils by addition of N _ε - (tert-butoxycarbonyl) -L-lysine.

Фиг.8 является графическим представлением результатов синтеза этилбутирата с применением иммобилизованной фибриллами липазы. Fig is a graphical representation of the results of the synthesis of ethyl butyrate using immobilized fibrils lipase.

Фиг.9 является графическим представлением результатов выделения щелочной фосфатазы (АР) из смеси АР и β-галактозидазы (βG) с использованием модифицированных ингибиторами фибрилл. Figure 9 is a graphical representation of the results of the isolation of alkaline phosphatase (AP) from a mixture of AP and β-galactosidase (βG) using modified fibril inhibitors.

Фиг. 10 является графическим представлением результатов выделения βG из смеси АР и βG с применением модифицированных βG фибрилл. FIG. 10 is a graphical representation of the results of isolating βG from a mixture of AP and βG using modified βG fibrils.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к композициям, которые в общем имеют общую формулу

где n обозначает целое число, L обозначает число менее 0,1n, m обозначает число менее 0,5n,
каждый из R является одним и тем же и выбран из SО₃Н, СООН, NH₂, ОН, R'CHOH, CHO, CN, COCl, галогена, COSH, SH, COOR', SR', SiR'₃,

R'', Li, AlR'₂, Hg-X, TlZ₂ и Мg-Х,
y обозначает целое число, равное или меньше 3,
R' обозначает водород, алкил, арил, циклоалкил или аралкил, циклоарил или поли(алкиловый эфир),
R'' обозначает фторалкил, фторарил, фторциклоалкил, фтораралкил или циклоарил,
Х обозначает галоген и
Z обозначает карбоксилат или трифторацетат.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
This invention relates to compositions that generally have the general formula

where n is an integer, L is a number less than 0.1n, m is a number less than 0.5n,
each R is the same and is selected from SO ₃ H, COOH, NH ₂ , OH, R'CHOH, CHO, CN, COCl, halogen, COSH, SH, COOR ', SR', SiR ' ₃ ,

R '', Li, AlR ' ₂ , Hg-X, TlZ ₂ and Mg-X,
y is an integer equal to or less than 3,
R ′ is hydrogen, alkyl, aryl, cycloalkyl or aralkyl, cycloaryl or poly (alkyl ether),
R ″ is fluoroalkyl, fluoroaryl, fluorocycloalkyl, fluororalkyl or cycloaryl,
X is halogen and
Z is carboxylate or trifluoroacetate.

Атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки по существу постоянного диаметра. Нанотрубки включают трубки, имеющие отношение длины к диаметру более 5 и диаметр менее 0,5 мкм, предпочтительно менее 0,1 мкм. Нанотрубки могут быть также практически цилиндрическими графитовыми нанотрубками, которые по существу не содержат пиролитически отложенного углерода, более предпочтительно нанотрубками, характеризующимися тем, что они имеют проекцию графитовых слоев на ось фибриллы, которая простирается на расстояние по меньшей мере двух диаметров фибриллы, и/или нанотрубками, имеющими цилиндрические графитовые слои, с-оси которых по существу перпендикулярны их цилиндрической оси. Эти композиции являются однородными в том смысле, что каждый из R является одним и тем же.The carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube of substantially constant diameter. Nanotubes include tubes having a length to diameter ratio of more than 5 and a diameter of less than 0.5 microns, preferably less than 0.1 microns. Nanotubes can also be substantially cylindrical graphite nanotubes, which essentially do not contain pyrolytically deposited carbon, more preferably nanotubes, characterized in that they have a projection of graphite layers onto the axis of the fibril, which extends over at least two diameters of the fibril, and / or nanotubes having cylindrical graphite layers, the c-axis of which is essentially perpendicular to their cylindrical axis. These compositions are uniform in the sense that each of R is the same.

Также были получены неоднородно замещенные нанотрубки. Они включают композиции формулы

где n, L, m, R и сама нанотрубка аналогичны описанным выше, при условии, что каждый из R не содержит кислорода или, если каждый из R является кислородсодержащей группой, СООН не присутствует.Inhomogeneously substituted nanotubes were also obtained. They include compositions of the formula

where n, L, m, R and the nanotube itself are similar to those described above, provided that each of R is oxygen free or, if each of R is an oxygen-containing group, COOH is not present.

Функционализованные нанотрубки, имеющие формулу

где n, L, m, R и R' имеют указанные выше значения и атомы углерода являются поверхностными атомами углерода фибриллы типа рыбьего скелета, имеющими отношение длины к диаметру более 5, также включены в данное изобретение. Они могут быть однородно или неоднородно замещенными. Предпочтительно эти нанотрубки не имеют термического покрытия и имеют диаметры менее 0,5 мкм.Functionalized nanotubes having the formula

where n, L, m, R and R 'have the above meanings and carbon atoms are surface carbon atoms of a fish skeleton type fibrils having a length to diameter ratio of more than 5 are also included in this invention. They may be uniformly or non-uniformly substituted. Preferably, these nanotubes are not thermally coated and have diameters of less than 0.5 microns.

В изобретение также включены функционализованные нанотрубки, имеющие формулу

где n, L, m, R' и R имеют указанные выше значения.Functionalized nanotubes having the formula are also included in the invention.

where n, L, m, R 'and R have the above meanings.

Атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки по существу постоянного диаметра. Эти нанотрубки имеют отношение длины к диаметру более 5 и диаметр менее 0,5 мкм, предпочтительно менее 0,1 мкм. Эти нанотрубки могут быть нанотрубками, которые по существу не содержат пиролитически отложенного углерода. Более предпочтительно эти нанотрубки являются нанотрубками, которые имеют проекцию графитовых слоев на оси фибрилл, которая простирается на расстояние по меньшей мере двух диаметров фибриллы, и/или нанотрубками, имеющими цилиндрические графитовые слои, с-оси которых по существу перпендикулярны их цилиндрической оси.The carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube of substantially constant diameter. These nanotubes have a length to diameter ratio of more than 5 and a diameter of less than 0.5 microns, preferably less than 0.1 microns. These nanotubes can be nanotubes that essentially do not contain pyrolytically deposited carbon. More preferably, these nanotubes are nanotubes that have a projection of graphite layers on the axis of the fibrils, which extends over at least two diameters of the fibrils, and / or nanotubes having cylindrical graphite layers whose c-axes are substantially perpendicular to their cylindrical axis.

Как в однородно, так и в неоднородно замещенных нанотрубках реагируют поверхностные атомы С_n. Большинство атомов углерода в поверхностном слое графитовой фибриллы, как в графите, являются углеродами базисной плоскости. Углероды базисной плоскости относительно инертны к химической атаке. В дефектных местах, где, например, графитовая плоскость не простирается полностью вокруг фибриллы, имеются атомы углерода, аналогичные краевым атомам углерода графитовой плоскости (см. Urry, Elementary Equilibrium Chemistry of Carbon, Wiley, New York, 1989, в отношении обсуждения концевых углеродов и углеродов базисной плоскости).Both uniformly and nonuniformly substituted nanotubes react with surface C _n atoms. Most carbon atoms in the surface layer of graphite fibrils, as in graphite, are basal plane carbons. Carbons of the basal plane are relatively inert to chemical attack. In defective places where, for example, the graphite plane does not extend completely around the fibril, there are carbon atoms similar to the edge carbon atoms of the graphite plane (see Urry, Elementary Equilibrium Chemistry of Carbon, Wiley, New York, 1989, for a discussion of terminal carbons and carbon basal plane).

В дефектных местах могут быть обнажены краевые углероды или углероды базисной плоскости нижних, внутренних слоев нанотрубки. Термин поверхностный углерод включает все углероды, базисной плоскости и краевые, самого верхнего слоя нанотрубки, а также углероды как базисной плоскости, так и/или краевые более нижних слоев, которые могут быть обнажены в дефектных местах самого верхнего слоя. Краевые углероды являются реакционноспособными и должны содержать какой-либо гетероатом или группу в соответствии с валентностью углерода. In defective places, edge carbons or carbons of the basal plane of the lower, inner layers of the nanotube can be exposed. The term surface carbon includes all the carbons, the basal plane and the edges, of the uppermost layer of the nanotube, as well as the carbons of both the basal plane and / or the edges of the lower layers, which can be exposed in defective places of the uppermost layer. Edge carbon is reactive and must contain some heteroatom or group in accordance with the valency of carbon.

Замещенные нанотрубки, описанные выше, могут быть выгодно функционализованы дополнительно. Такие композиции включают композиции формулы

где углероды являются поверхностными углеродами нанотрубки,
n, L и m имеют указанные выше значения,
А выбран из

-CR'₂-OY, N=Y,

Y обозначает подходящую функциональную группу белка, пептида, аминокислоты, фермента, антитела, нуклеотида, олигонуклеотида, антигена или субстрата фермента, ингибитора фермента или аналога переходного состояния субстрата фермента или выбран из R'-OH, R'-NR'₂, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'N⁺(R')₃Х^-, R'SiR'₃,

R'-R'', R'-N-CO,

(С₃Н₆О)_w-R',

и w обозначает целое число более одного и менее 200.The substituted nanotubes described above can be further advantageously functionalized. Such compositions include compositions of the formula

where the carbon is the surface carbon of the nanotube,
n, L and m have the above meanings,
A is selected from

-CR ' ₂ -OY, N = Y,

Y denotes a suitable functional group of a protein, peptide, amino acid, enzyme, antibody, nucleotide, oligonucleotide, antigen or substrate of the enzyme, an inhibitor of the enzyme or an analogue of the transition state of the substrate of the enzyme, or is selected from R'-OH, R'-NR ' ₂ , R'SH , R'CHO, R'CN, R'X, R'N ⁺ (R ') ₃ X ^- , R'SiR' ₃ ,

R'-R '', R'-N-CO,

(C ₃ H ₆ O) _w -R ',

and w is an integer of more than one and less than 200.

Атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки по существу постоянного диаметра. Эти нанотрубки включают нанотрубки, имеющие отношение длины к диаметру более 5 и диаметр менее 0,5 мкм, предпочтительно менее 0,1 мкм. Нанотрубки могут быть также по существу цилиндрическими графитовыми нанотрубками, которые по существу не содержат пиролитически отложенного углерода. Более предпочтительно они характеризуются тем, что они имеют проекцию графитовых слоев на оси фибрилл, которая простирается на расстояние по меньшей мере двух диаметров фибриллы, и/или они состоят из цилиндрических графитовых слоев, с-оси которых по существу перпендикулярны их цилиндрическим осям. Предпочтительно эти нанотрубки не содержат термического покрытия и имеют диаметры менее 0,5 мкм.The carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube of substantially constant diameter. These nanotubes include nanotubes having a length to diameter ratio of more than 5 and a diameter of less than 0.5 microns, preferably less than 0.1 microns. Nanotubes can also be essentially cylindrical graphite nanotubes, which essentially do not contain pyrolytically deposited carbon. More preferably, they are characterized in that they have a projection of graphite layers on the axis of the fibrils, which extends over at least two diameters of the fibrils, and / or they consist of cylindrical graphite layers whose c-axes are essentially perpendicular to their cylindrical axes. Preferably, these nanotubes do not contain a thermal coating and have diameters of less than 0.5 microns.

Функциональные нанотрубки структуры

могут быть также функционализованы с образованием композиций, имеющих формулу

где n, L, m, R' и А имеют указанные выше значения.Functional Nanotube Structures

can also be functionalized to form compositions having the formula

where n, L, m, R 'and A have the above meanings.

Атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки по существу постоянного диаметра. Эти нанотрубки включают нанотрубки, имеющие отношение длины к диаметру более 5 и диаметр менее 0,5 мкм, предпочтительно менее 0,1 мкм. Нанотрубки могут быть также по существу цилиндрическими графитовыми нанотрубками, которые по существу не содержат пиролитически отложенного углерода. Более предпочтительно они характеризуются тем, что они имеют проекцию графитовых слоев на оси фибрилл, которая простирается на расстояние по меньшей мере двух диаметров фибриллы, и/или имеют цилиндрические графитовые слои, с-оси которых по существу перпендикулярны их цилиндрической оси. Предпочтительно эти нанотрубки не имеют термического покрытия и имеют диаметры менее 0,5 мкм.The carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube of substantially constant diameter. These nanotubes include nanotubes having a length to diameter ratio of more than 5 and a diameter of less than 0.5 microns, preferably less than 0.1 microns. Nanotubes can also be essentially cylindrical graphite nanotubes, which essentially do not contain pyrolytically deposited carbon. More preferably, they are characterized in that they have a projection of graphite layers on the axis of the fibrils, which extends over at least two diameters of the fibrils, and / or have cylindrical graphite layers whose c-axis is substantially perpendicular to their cylindrical axis. Preferably, these nanotubes are not thermally coated and have diameters of less than 0.5 microns.

Композиции по данному изобретению включают также нанотрубки, на которых адсорбированы определенные циклические соединения. Они включают композиции вещества формулы

где n обозначает целое число, L обозначает число менее 0,1n, m является меньше 0,5n, а равно нулю или обозначает число менее 10, Х является полициклической ароматической, полигетероциклической ароматической или металлополигетероциклической ароматической частью молекулы и R имеет указанное выше значение.The compositions of this invention also include nanotubes on which certain cyclic compounds are adsorbed. These include compositions of a substance of the formula

where n is an integer, L is a number less than 0.1n, m is less than 0.5n, and equal to zero or a number less than 10, X is a polycyclic aromatic, polyheterocyclic aromatic or metallopolyheterocyclic aromatic part of the molecule, and R has the above meaning.

Атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки по существу постоянного диаметра. Эти нанотрубки включают нанотрубки, имеющие отношение длины к диаметру более 5 и диаметр менее 0,5 мкм, предпочтительно менее 0,1 мкм. Нанотрубки могут быть также по существу цилиндрическими графитовыми нанотрубками, которые по существу не содержат пиролитически отложенного углерода, и более предпочтительно нанотрубками, характеризующимися тем, что они имеют проекцию графитовых слоев на оси фибрилл, которая простирается на расстояние по меньшей мере двух диаметров фибриллы, и/или нанотрубками, имеющими цилиндрические графитовые слои, с-оси которых по существу перпендикулярны их цилиндрическим осям. Предпочтительно эти нанотрубки не имеют термического покрытия и имеют диаметры менее 0,5 мкм.The carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube of substantially constant diameter. These nanotubes include nanotubes having a length to diameter ratio of more than 5 and a diameter of less than 0.5 microns, preferably less than 0.1 microns. Nanotubes can also be essentially cylindrical graphite nanotubes, which essentially do not contain pyrolytically deposited carbon, and more preferably nanotubes, characterized in that they have a projection of graphite layers on the axis of the fibrils, which extends to a distance of at least two diameters of the fibril, and / or nanotubes having cylindrical graphite layers whose c-axes are substantially perpendicular to their cylindrical axes. Preferably, these nanotubes are not thermally coated and have diameters of less than 0.5 microns.

Предпочтительные циклические соединения представляют собой плоские макроциклы, описанные на стр. 76 Cotton and Wilkinson, Advanced Organic Chemistry. Более предпочтительными циклическими соединениями для адсорбции являются порфирины и фталоцианины. Preferred cyclic compounds are planar macrocycles described on page 76 of Cotton and Wilkinson, Advanced Organic Chemistry. More preferred cyclic adsorption compounds are porphyrins and phthalocyanines.

Адсорбированные циклические соединения могут быть функционализованы. Такие композиции включают соединения формулы

где m, n, L, а, Х и А имеют описанные выше значения и атомы углерода являются поверхностными атомами углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, как описано выше.Adsorbed cyclic compounds can be functionalized. Such compositions include compounds of the formula

where m, n, L, a, X and A have the meanings described above and the carbon atoms are the surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube, as described above.

Углеродные фибриллы, функционализованные, как описано выше, могут быть включены в матрицу. Предпочтительно матрица представляет собой органический полимер (например, термореактивная смола, такая как эпокси-, бисмалеимидная, полиамидная или полиэфирная смола; термопластичная смола; реакционная полученная литьем под давлением смола, или эластомер, такой как природный каучук, бутадиенстирольный каучук, или цис-1,4-полибутадиен); неорганический полимер (например, полимерный неорганический оксид, такой как стекло); металл (например, свинец или медь) или керамический материал (например, клей Портланда). Из матрицы, в которую были включены эти фибриллы, могут быть образованы гранулы. Альтернативно функционализованные фибриллы могут быть присоединены к наружной поверхности функционализованных гранул. Carbon fibrils functionalized as described above may be included in the matrix. Preferably, the matrix is an organic polymer (e.g., a thermosetting resin such as an epoxy, bismaleimide, polyamide or polyester resin; a thermoplastic resin; a reaction injection molded resin or an elastomer such as natural rubber, styrene butadiene rubber, or cis-1, 4-polybutadiene); inorganic polymer (for example, a polymer inorganic oxide such as glass); metal (e.g. lead or copper) or ceramic material (e.g. Portland glue). Granules can be formed from the matrix into which these fibrils were incorporated. Alternatively, functionalized fibrils may be attached to the outer surface of the functionalized granules.

Без связывания с конкретной теорией, функционализованные фибриллы лучше диспергируются в полимерных системах, поскольку свойства их модифицированной поверхности более совместимы с полимером или поскольку модифицированные функциональные группы (в частности, гидроксильные или аминогруппы) связываются непосредственно с полимером при концевых группах. Таким путем полимерные системы, такие как поликарбонаты, полиуретаны, полиэфиры или полиамиды/имиды связываются непосредственно с фибриллами, что позволяет фибриллам легче диспергироваться с улучшенным сцеплением. Without binding to a specific theory, functionalized fibrils are better dispersed in polymer systems because the properties of their modified surface are more compatible with the polymer or since the modified functional groups (in particular, hydroxyl or amino groups) bind directly to the polymer at the end groups. In this way, polymer systems such as polycarbonates, polyurethanes, polyesters or polyamides / imides bind directly to the fibrils, which allows the fibrils to more easily disperse with improved adhesion.

Данное изобретение относится также к способам введения функциональных групп на поверхность углеродных фибрилл путем контактирования углеродных фибрилл с сильным окислителем в течение периода времени, достаточного для окисления поверхности этих фибрилл, и дополнительного контактирования этих фибрилл с реагентом, пригодным для присоединения функциональной группы к окисленной поверхности. В предпочтительном варианте данного изобретения окислитель состоит из раствора хлората щелочного металла в сильной кислоте. В других вариантах хлорат щелочного металла представляет собой хлорат натрия или хлорат калия. В предпочтительных вариантах в качестве сильной кислоты используют серную кислоту. Периоды времени, достаточные для окисления, составляют от ~0,5 часа до ~ 24 часов. The present invention also relates to methods for introducing functional groups onto the surface of carbon fibrils by contacting the carbon fibrils with a strong oxidizing agent for a period of time sufficient to oxidize the surface of these fibrils and further contacting these fibrils with a reagent suitable for attaching the functional group to the oxidized surface. In a preferred embodiment of the invention, the oxidizing agent consists of a solution of an alkali metal chlorate in a strong acid. In other embodiments, the alkali metal chlorate is sodium chlorate or potassium chlorate. In preferred embodiments, sulfuric acid is used as the strong acid. The time periods sufficient for oxidation are from ~ 0.5 hours to ~ 24 hours.

В дополнительном предпочтительном варианте композицию, имеющую формулу

где n, L, R' и m имеют указанные выше значения, образуют реакцией R'CH₂OH с поверхностными углеродами нанотрубки в присутствии свободнорадикального инициатора, такого как бензоилпероксид.In a further preferred embodiment, a composition having the formula

where n, L, R 'and m are as defined above, are formed by the reaction of R'CH ₂ OH with surface carbon of a nanotube in the presence of a free radical initiator such as benzoyl peroxide.

Данное изобретение относится также к способу присоединения белков к нанотрубкам, модифицированным NHS-эфиром, путем образования ковалентной связи между NHS-эфиром и аминогруппой такого белка. The present invention also relates to a method for attaching proteins to NHS ester modified nanotubes by forming a covalent bond between the NHS ester and the amino group of such a protein.

Данное изобретение относится также к способам получения сетки углеродных фибрилл, предусматривающим контактирование углеродных фибрилл с окислителем в течение периода времени, достаточного для окисления поверхности углеродных фибрилл, контактированием поверхностно-окисленных фибрилл с реагентом, пригодным для присоединения функциональной группы к поверхности углеродных фибрилл, и дополнительным контактированием поверхностно-функционализованных фибрилл со сшивающим агентом, эффективным для образования сетки углеродных фибрилл. Предпочтительным сшивающим агентом является полиол, полиамин или поликарбоновая кислота. The present invention also relates to methods for producing a carbon fibril network, comprising contacting the carbon fibrils with an oxidizing agent for a period of time sufficient to oxidize the surface of the carbon fibrils, contacting the surface-oxidized fibrils with a reagent suitable for attaching a functional group to the surface of the carbon fibrils, and further contacting surface-functionalized fibrils with a crosslinking agent effective to form a carbon fibril network . A preferred crosslinking agent is a polyol, polyamine or polycarboxylic acid.

Функционализованные фибриллы могут быть также в форме жестких сеток фибрилл. Хорошо диспергированная трехмерная сетка функционализованных кислотой фибрилл может, например, быть стабилизирована сшиванием кислотных групп (межфибрилльных) с полиолами или полиаминами с образованием жесткой сетки. Functionalized fibrils can also be in the form of rigid networks of fibrils. A well dispersed three-dimensional network of acid-functionalized fibrils can, for example, be stabilized by crosslinking acidic groups (interfibril) with polyols or polyamines to form a rigid network.

Данное изобретение включает также трехмерные сетки, образованные связыванием функционализованных фибрилл данного изобретения. Эти комплексы включают по меньшей мере две функционализованные фибриллы, связанные одним или несколькими линкерами, содержащими прямую связь или химическую часть молекулы. Эти сетки содержат пористые среды с удивительно однородным эквивалентным размером пор. The invention also includes three-dimensional grids formed by binding the functionalized fibrils of the invention. These complexes include at least two functionalized fibrils connected by one or more linkers containing a direct bond or chemical part of the molecule. These nets contain porous media with surprisingly uniform equivalent pore sizes.

Хотя промежутки между этими фибриллами являются неправильными как по размеру, так и по форме, их можно считать порами и характеризовать при помощи способов, применяемых для характеристики пористых сред. Размер промежутков в таких сетках может регулироваться концентрацией и уровнем диспергирования фибрилл и концентрацией и длинами цепей сшивающих агентов. Такие материалы могут действовать в качестве структурированных носителей катализаторов и могут быть сконструированы таким образом, что они исключают или включают молекулы определенного размера. Кроме общепринятого промышленного катализа, они могут иметь особое применение в качестве больших пористых носителей для биокатализаторов. Although the gaps between these fibrils are irregular in both size and shape, they can be considered pores and characterized using methods used to characterize porous media. The size of the gaps in such networks can be controlled by the concentration and level of dispersion of the fibrils and the concentration and chain lengths of the crosslinking agents. Such materials can act as structured catalyst supports and can be designed to exclude or include molecules of a specific size. In addition to conventional industrial catalysis, they can be of particular use as large porous supports for biocatalysts.

Жесткие сетки могут также служить в качестве каркаса в биомиметических системах для молекулярного узнавания. Такие системы были описаны в US Patent No. 5110833 и International Patent Publication No. W0 93/19844. Подходящий выбор сшивающих агентов и комплексирующих агентов позволяет стабилизировать специфические молекулярные структуры. Rigid meshes can also serve as a framework in biomimetic systems for molecular recognition. Such systems have been described in US Patent No. 5110833 and International Patent Publication No. W0 93/19844. A suitable selection of crosslinking agents and complexing agents allows the stabilization of specific molecular structures.

СПОСОБЫ ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИИ НАНОТРУБОК
Однородно функционализованные фибриллы по данному изобретению могут быть непосредственно получены сульфонированием, электрофильным присоединением к деокисленным поверхностям фибрилл или металлированием. При использовании выращенных в угольной дуге нанофибрилл может быть необходима интенсивная очистка перед функционализацией. Ebbesen et al. (Nature 367 519 (1994)) приводят метод такой очистки.METHODS FOR FUNCTIONALIZING NANOTUBES
The uniformly functionalized fibrils of this invention can be directly obtained by sulfonation, electrophilic addition to deoxidized surfaces of fibrils, or metallization. When using nanofibrils grown in a carbon arc, intensive cleaning before functionalization may be necessary. Ebbesen et al. (Nature 367 519 (1994)) provide a method for such purification.

Предпочтительно, углеродные фибриллы обрабатывают перед контактированием их с функционализирующим агентом. Такая обработка может включать диспергирование фибрилл в растворителе. В некоторых случаях углеродные фибриллы могут быть затем отфильтрованы и высушены перед последующим контактом. Preferably, the carbon fibrils are treated before being contacted with a functionalizing agent. Such processing may include dispersing fibrils in a solvent. In some cases, carbon fibrils can then be filtered and dried before subsequent contact.

1. СУЛЬФОНИРОВАНИЕ
Известные методы описаны March J.P., Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed. Wiley, New York, 1985; House H., Modern Synthetic Reactions, 2nd Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA, 1972.1. SURFING
Known methods are described March JP, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed. Wiley, New York, 1985; House H., Modern Synthetic Reactions, 2nd Ed., Benjamin / Cummings, Menlo Park, CA, 1972.

Активированные С-Н (в том числе ароматические С-Н) связи могут быть сульфонированы при помощи дымящей серной кислоты (олеума), которая представляет собой раствор концентрированной серной кислоты, содержащей до 20% SО₃. Общепринятым методом является метод сульфонирования в жидкой фазе при Т~80^oС с применением олеума; однако, активированные С-Н связи могут быть также сульфонированы с применением SО₃ в инертных апротонных растворителях или SОз в паровой фазе. Реакция представляет собой
-С-Н+SО₃ --> -С-SО₃Н
Побочная реакция приводит к образованию сульфонов в соответствии с реакцией
2-С-Н+SО₃ --> -С-SО₂-С-+Н₂О
ПРИМЕР 1
Активация связей С-Н с применением серной кислоты.Activated CH (including aromatic CH) bonds can be sulfonated with fuming sulfuric acid (oleum), which is a solution of concentrated sulfuric acid containing up to 20% SO ₃ . The generally accepted method is the method of sulfonation in the liquid phase at T ~ 80 ^o With the use of oleum; however, activated CH bonds can also be sulfonated using SO ₃ in inert aprotic solvents or SO ₃ in the vapor phase. The reaction is
-C-H + SO ₃ -> -C-SO ₃ H
Adverse reaction leads to the formation of sulfones in accordance with the reaction
2-C-H + SO ₃ -> -C-SO ₂ -C- + H ₂ O
EXAMPLE 1
Activation of CH bonds using sulfuric acid.

Реакции проводили в газовой фазе и в растворе без какого-либо значимого различия в результатах. Реакцию в газовой фазе проводили в горизонтальном кварцевом трубчатом реакторе, нагреваемом печью Линдберга. Многогорлую колбу, содержащую 20% SО₃ в концентрированной Н₂SO₄, снабженную трубками входа/выхода, использовали в качестве источника SО₃.The reactions were carried out in the gas phase and in solution without any significant difference in the results. The reaction in the gas phase was carried out in a horizontal quartz tube reactor heated by a Lindberg furnace. A multi-necked flask containing 20% SO ₃ in concentrated H ₂ SO ₄ equipped with inlet / outlet tubes was used as the source of SO ₃ .

Взвешенную пробу фибрилл (BN и СС) в фарфоровой лодочке помещали в однодюймовую трубку, снабженную впускным отверстием для газа; выпускное отверстие соединяли с барботерным улавливателем концентрированной Н₂SО₄. Аргон продували через реактор в течение 20 минут для удаления всего воздуха и пробу нагревали до 300^oС в течение 1 часа для удаления оставшейся влаги. После высушивания температуру доводили до температуры реакции в атмосфере аргона.A weighted sample of fibrils (BN and SS) in a porcelain boat was placed in a one-inch tube equipped with a gas inlet; the outlet was connected to a bubbler catcher concentrated H ₂ SO ₄ . Argon was purged through the reactor for 20 minutes to remove all air and the sample was heated to 300 ^{° C.} for 1 hour to remove the remaining moisture. After drying, the temperature was brought to the reaction temperature in an argon atmosphere.

Когда устанавливалась желаемая температура, источник SО₃ соединяли с реакторной трубкой и ток аргона использовали для введения паров SО₃ в кварцевой трубчатый реактор. Реакцию проводили в течение желаемого периода времени при желаемой температуре, после чего реактор охлаждали продуванием аргоном. Затем фибриллы сушили при 90^oС при вакууме 5'' рт. ст. с получением прироста сухого веса. Содержание сульфоновой кислоты (-SО₃Н) определяли реакцией с 0,100 н. NaOH и обратным титрованием 0,100 н. НСl с применением рН 6,0 в качестве конечной точки.When the desired temperature was established, the SO ₃ source was connected to the reactor tube and an argon current was used to introduce SO ₃ vapors into the quartz tube reactor. The reaction was carried out for a desired period of time at a desired temperature, after which the reactor was cooled by blowing with argon. Then the fibrils were dried at 90 ^{° C.} under a vacuum of 5 р mercury. Art. with gain in dry weight. The content of sulfonic acid (-SO ₃ H) was determined by reaction with 0.100 N. NaOH and back titration of 0.100 N. Hcl using a pH of 6.0 as an endpoint.

Реакцию в жидкой фазе проводили в концентрированной серной кислоте, содержащей 20% SО₃, в многогорлой колбе на 100 мл, снабженной термометром/терморегулятором и магнитной мешалкой. Суспензию фибрилл в концентрированной Н₂SO₄ (50) помещали в колбу. Раствор олеума (20 мл) предварительно нагревали до ~ 60^oС перед добавлением в реактор. После реакции кислую суспензию выливали на раздробленный лед и разбавляли немедленно 1 л деионизованной (ДИ) воды. Твердые вещества отфильтровывали и промывали интенсивно ДИ-водой до тех пор, пока рН эффлюента не переставал изменяться. Фибриллы сушили при 100^oС при вакууме 5'' рт. ст. Вследствие потерь при переносе для фильтрования точные увеличения в весе нельзя было получить. Результаты представлены в таблице I.The reaction in the liquid phase was carried out in concentrated sulfuric acid containing 20% SO ₃ in a 100 ml multi-necked flask equipped with a thermometer / temperature controller and a magnetic stirrer. A suspension of fibrils in concentrated H ₂ SO ₄ (50) was placed in a flask. The oleum solution (20 ml) was preheated to ~ 60 ^{° C.} before being added to the reactor. After the reaction, the acid suspension was poured onto crushed ice and immediately diluted with 1 L of deionized (DI) water. The solids were filtered off and washed intensively with DI water until the pH of the effluent ceased to change. The fibrils were dried at 100 ^{° C.} under a vacuum of 5 т mercury. Art. Due to transfer losses for filtering, accurate weight gains could not be obtained. The results are presented in table I.

Не было значимого различия в содержании сульфоновой кислоты при реакции в паровой фазе или в жидкой фазе. Наблюдали температурный эффект. Более высокая температура реакции (паровая фаза) дает более высокие количества сульфонов. В 118-61В увеличение веса 4,2% согласовалось с содержанием сульфоновой кислоты (теоретическое содержание было 0,51 мэкв/г). Опыты 60А и 61А имели слишком высокое увеличение в весе, чтобы относить его только к содержанию сульфоновой кислоты. Поэтому было сделано предположение, что были образованы также приемлемые количества сульфонов. There was no significant difference in the sulfonic acid content during the reaction in the vapor phase or in the liquid phase. The temperature effect was observed. A higher reaction temperature (vapor phase) gives higher amounts of sulfones. In 118-61B, an increase in weight of 4.2% was consistent with the sulfonic acid content (theoretical content was 0.51 meq / g). Tests 60A and 61A were too high in weight to be attributed only to the sulfonic acid content. Therefore, it was hypothesized that acceptable amounts of sulfones were also formed.

2. ПРИСОЕДИНЕНИЯ К НЕСОДЕРЖАЩИМ ОКСИДОВ ПОВЕРХНОСТЯМ ФИБРИЛЛ
Известные методы описаны Urry G., Elementary Equilibrium Chemistry of Carbon, Wiley, New York, 1989.2. JOINING OXIDE-FREE SURFACES OF FIBRILLA
Known methods are described by Urry G., Elementary Equilibrium Chemistry of Carbon, Wiley, New York, 1989.

Поверхностные углероды в фибриллах ведут себя подобно графиту, т.е. они размещены гексагональными слоями, содержащими как углероды базисной плоскости, так и концевые углероды. В то время как углероды базисной плоскости относительно инертны к химической атаке, концевые углероды являются реакционноспособными и должны содержать какой-либо гетероатом или группу в соответствии с валентностью углерода. Фибриллы также имеют дефектные участки поверхности, которые являются в основном краевыми углеродами и содержат гетероатомы или группы. Surface carbons in fibrils behave like graphite, i.e. they are placed in hexagonal layers containing both the carbons of the basal plane and the terminal carbons. While carbons of the basal plane are relatively inert to chemical attack, terminal carbons are reactive and must contain some heteroatom or group in accordance with the valency of carbon. Fibrils also have defective surface regions, which are mainly edge carbon and contain heteroatoms or groups.

Наиболее обычными гетероатомами, присоединенными к углеродам поверхности, являются водород, преобладающий газообразный компонент во время изготовления; кислород, вследствие его высокой реакционной способности и вследствие того, что его следов очень трудно избежать, и Н₂O, которая всегда присутствует благодаря катализатору. Пиролиз при ~1000^oС в вакууме будет деокислять эту поверхность в комплексной реакции с невыясненным механизмом, но с известной стехиометрией. Продуктами являются СО и СO₂ в соотношении 2:1. Полученная поверхность фибриллы содержит радикалы в размещении C₁-C₄, которые очень реакционноспособны в отношении активированных олефинов. Эта поверхность является стабильной в вакууме или в присутствии инертного газа, но сохраняет ее высокую химическую активность, пока она экспонируется с реакционноспособным газом. Таким образом, фибриллы могут быть пиролизованы при ~ 1000^oС в вакууме или в инертной атмосфере, охлаждены в тех же самых условиях и могут взаимодействовать с подходящей молекулой при более низкой температуре с образованием стабильной функциональной группы. Типичными примерами являются

затем

RFS+малеиновый ангидрид-->Фибрилла-R'(COOH)₂
RFS+Цианоген-->Фибрилла-CN
RFS+CH₂=CH-CH₂X-->Фибрилла-R'-СН₂Х, X = NH₂, -ОН, -галоген
RFS+H₂O-->Фибрилла=O (хиноидальная)
RFS+CH₂=CHCHO-->Фибрилла-R'CHO (альдегидная)
RFS+CH₂=CH-CN-->Фибрилла-R'CN
где R' обозначает углеводородный радикал (алкил, циклоалкил и т.д.)
ПРИМЕР 2
Получение функционализованных фибрилл реакцией акриловой кислоты с не содержащими оксидов поверхностями фибрилл.The most common heteroatoms attached to surface carbons are hydrogen, the predominant gaseous component during manufacture; oxygen, due to its high reactivity and due to the fact that its traces are very difficult to avoid, and H ₂ O, which is always present due to the catalyst. Pyrolysis at ~ 1000 ^o C in vacuum will deoxidize this surface in a complex reaction with an obscure mechanism, but with a known stoichiometry. The products are CO and CO ₂ in a ratio of 2: 1. The resulting fibril surface contains radicals in the C ₁ -C ₄ arrangement, which are very reactive with activated olefins. This surface is stable in a vacuum or in the presence of an inert gas, but retains its high chemical activity while it is exposed with a reactive gas. Thus, fibrils can be pyrolyzed at ~ 1000 ^° C in vacuum or in an inert atmosphere, cooled under the same conditions, and can interact with a suitable molecule at a lower temperature to form a stable functional group. Typical examples are

then

RFS + Maleic Anhydride -> Fibril-R '(COOH) ₂
RFS + Cyanogen -> Fibril-CN
RFS + CH ₂ = CH-CH ₂ X ->Fibril-R'-CH ₂ X, X = NH ₂ , -OH, -halogen
RFS + H ₂ O -> Fibril = O (quinoid)
RFS + CH ₂ = CHCHO ->Fibril-R'CHO (aldehyde)
RFS + CH ₂ = CH-CN ->Fibril-R'CN
where R 'is a hydrocarbon radical (alkyl, cycloalkyl, etc.)
EXAMPLE 2
Obtaining functionalized fibrils by reacting acrylic acid with oxide-free fibril surfaces.

1 г фибрилл BN в фарфоровой лодочке помещают в горизонтальную однодюймовую кварцевую трубку, снабженную термопарой, и помещают в трубчатую печь Линдберга. Концы снабжены входным/выходным отверстиями для газа. Трубку продувают сухим деоксигенированным аргоном в течение 10 минут, после чего температуру печи повышают до 300^oС и поддерживают в течение 30 минут. После этого при непрерывном токе аргона температуру повышают с приращениями в 100^oС до 1000^oС и поддерживают на этом уровне в течение 16 часов. В конце этого периода времени трубку охлаждают до комнатной температуры при пропускании аргона. Затем ток аргона шунтируют для прохождения через многогорлую колбу, содержащую неразбавленную очищенную акриловую кислоту при 50^oС и снабженную входным/выходным отверстиями для газа. Ток паров акриловой кислоты/аргона продолжают при комнатной температуре в течение 6 часов. В конце этого периода времени оставшуюся непрореагировавшую акриловую кислоту удаляют, сначала выдуванием аргоном, затем сушкой в вакууме при 100^oС при вакууме <5'' рт. ст. Содержание карбоновой кислоты определяют реакцией с избытком 0,100 н. NaOH и обратным титрованием 0,100 н. НСl до конечной точки при рН 7,5.1 g of BN fibrils in a porcelain boat is placed in a horizontal one-inch quartz tube equipped with a thermocouple and placed in a Lindberg tube furnace. The ends are provided with gas inlet / outlet openings. The tube is purged with dry deoxygenated argon for 10 minutes, after which the temperature of the furnace is raised to 300 ^o C and maintained for 30 minutes. After that, with a continuous flow of argon, the temperature is increased in increments of 100 ^o C to 1000 ^o C and maintained at this level for 16 hours. At the end of this time period, the tube is cooled to room temperature while passing argon. Then, an argon current is shunted to pass through a multi-necked flask containing undiluted purified acrylic acid at 50 ^{° C.} and provided with gas inlet / outlet openings. The vapor flow of acrylic acid / argon is continued at room temperature for 6 hours. At the end of this period of time, the remaining unreacted acrylic acid is removed, first by blowing with argon, then drying in vacuum at 100 ^° C under vacuum <5 '' RT. Art. The carboxylic acid content is determined by reaction with an excess of 0.100 N. NaOH and back titration of 0.100 N. Hcl to the end point at pH 7.5.

ПРИМЕР 3
Получение функционализованных фибрилл реакцией акриловой кислоты с несодержащими оксидов поверхностями фибрилл.EXAMPLE 3
Obtaining functionalized fibrils by reacting acrylic acid with oxide-free fibril surfaces.

Способ повторяют аналогично вышеописанному способу за исключением того, что пиролиз и охлаждение проводят при вакууме 10^-4 Торр. Очищенные пары акриловой кислоты разбавляют аргоном, как в предыдущей процедуре.The method is repeated similarly to the above method, except that the pyrolysis and cooling are carried out under vacuum of 10 ^-4 Torr. The purified acrylic acid vapors are diluted with argon, as in the previous procedure.

ПРИМЕР 4
Получение функционализованных фибрилл реакцией малеиновой кислоты с несодержащими оксидов поверхностями фибрилл.EXAMPLE 4
Obtaining functionalized fibrils by the reaction of maleic acid with oxide-free fibril surfaces.

Способ повторяют, как в примере 2, за исключением того, что реагентом при комнатной температуре является очищенный малеиновый ангидрид (MAN), который подают в реактор путем прохождения газа аргона через баню с расплавленным MAN при 80^oС.The method is repeated as in example 2, except that the reagent at room temperature is purified maleic anhydride (MAN), which is fed into the reactor by passing argon gas through a bath with molten MAN at 80 ^o C.

ПРИМЕР 5
Получение функционализованных фибрилл реакцией акрилоилхлорида с несодержащими оксидов поверхностями фибрилл.EXAMPLE 5
Obtaining functionalized fibrils by reacting acryloyl chloride with oxide-free fibril surfaces.

Способ повторяют, как в примере 2, за исключением того, что реагентом при комнатной температуре является очищенный акрилоилхлорид, который подают в реактор путем прохождения аргона над неразбавленным акрилхлоридом при 25^oС. Содержание галогенангидрида определяют реакцией с избытком 0,100 н. NaOH и обратным титрованием 0,100 н. НСl.The method is repeated as in Example 2, except that the reagent at room temperature is purified acryloyl chloride, which is fed to the reactor by passing argon over undiluted acryl chloride at 25 ^° C. The content of the halide is determined by the reaction with an excess of 0.100 N NaOH and back titration of 0.100 N. Hcl.

Пиролиз фибрилл в вакууме деокисляет поверхность фибрилл. В аппарате TGA пиролиз при 1000^oС либо в вакууме, либо в токе очищенного Аr дает среднюю потерю веса 3% для трех проб фибрилл BN. Анализ газовой хроматографией обнаружил только СО и CO₂ в соотношении ~2:1 соответственно. Полученная поверхность является очень реакционноспособной, и активированные олефины, такие как акриловая кислота, акрилоилхлорид, акриламид, акролеин, малеиновый ангидрид, аллиламин, аллиловый спирт или аллилгалогениды, будут реагировать даже при комнатной температуре с образованием чистых продуктов, содержащих только функциональную группу, связанную с активированным олефином. Таким образом, поверхности, содержащие только карбоновые кислоты, доступны с применением реакции с акриловой кислотой или малеиновым ангидридом; поверхности только с галогенангидридом с применением реакции с акрилоилхлоридом; только с альдегидом из акролеина; только с гидроксилом из аллилового спирта; только с амином из аллиламина и только с галогенидом из аллилгалогенида.Pyrolysis of fibrils in a vacuum deoxidizes the surface of fibrils. In the TGA apparatus, pyrolysis at 1000 ^° C either in vacuum or in a stream of purified Ar gives an average weight loss of 3% for three samples of BN fibrils. Analysis by gas chromatography found only CO and CO ₂ in a ratio of ~ 2: 1, respectively. The resulting surface is very reactive, and activated olefins, such as acrylic acid, acryloyl chloride, acrylamide, acrolein, maleic anhydride, allylamine, allyl alcohol or allyl halides, will react even at room temperature to produce pure products containing only a functional group associated with the activated olefin. Thus, surfaces containing only carboxylic acids are accessible by reaction with acrylic acid or maleic anhydride; surfaces with an acid halide only using reaction with acryloyl chloride; only with acrolein aldehyde; only with hydroxyl from allyl alcohol; only with an amine from allyl amine and only with a halide from allyl halide.

3. МЕТАЛЛИРОВАНИЕ
Предыдущие способы представлены в March, Advanced Organic Chemistry, 3rd ed., p. 545.3. METALING
Previous methods are presented in March, Advanced Organic Chemistry, 3rd ed., P. 545.

Ароматические связи С-Н могут быть металлированы разнообразными металлоорганическими реагентами с образованием связей углерод-металл (С-М). М обычно представляет собой Li, Be, Mg, Al или Тl, однако могут быть также использованы другие металлы. Самой простой реакцией является простое замещение водорода в активированных ароматических соединениях. Aromatic CH bonds can be metallized with a variety of organometallic reagents to form carbon-metal (CH) bonds. M usually represents Li, Be, Mg, Al or Tl, but other metals may also be used. The simplest reaction is the simple substitution of hydrogen in activated aromatic compounds.

1. Фибрилла-Н+R-Li-->Фибрилла-Li+RH
Эта реакция может требовать дополнительно сильного основания, такого как трет-бутоксид калия или хелатирующие диамины. Необходимы апротонные растворители (парафины, бензол).1. Fibrill-H + R-Li -> Fibrill-Li + RH
This reaction may require an additional strong base, such as potassium tert-butoxide or chelating diamines. Aprotic solvents (paraffins, benzene) are required.

2. Фибрилла-Н+АlR₃-->Фибрилла-AlR₂+RH
3.

Металлированные производные являются примерами первичных один раз функционализованных фибрилл. Однако они могут взаимодействовать дополнительно с образованием других первичных один раз функционализованных фибрилл. Некоторые реакции могут проводиться последовательно в одном и том же аппарате без выделения промежуточных продуктов.2. Fibril-H + AlR ₃ -> Fibril-AlR ₂ + RH
3.

Metallized derivatives are examples of primary once functionalized fibrils. However, they can interact additionally with the formation of other primary once functionalized fibrils. Some reactions can be carried out sequentially in the same apparatus without isolation of intermediate products.

4. Фибрилла-М+О₂-->Фибрилла-ОН+МО, М = Li, Al

Фибрилла-М+X₂-->Фибрилла-Х+MX, Х = галоген

Фибрилла-Tl(TFA)₂+вод.KCN-->Фибрилла-CN+TlTFA+KTFA
Фибрилла-CN+H₂-->Фибрилла-СН₂-NН₂
ПРИМЕР 6
Получение фибриллы-Li.4. Fibrilla-M + O ₂ -> Fibrilla-OH + MO, M = Li, Al

Fibrilla-M + X ₂ -> Fibrilla-X + MX, X = halogen

Fibrill-Tl (TFA) ₂ + water.KCN -> Fibrill-CN + TlTFA + KTFA
Fibril-CN + H ₂ -> Fibril-CH ₂ -NH ₂
EXAMPLE 6
Getting fibrils-Li.

1 г фибрилл СС помещают в фарфоровую лодочку и вставляют в однодюймовый кварцевый трубчатый реактор, который закрывают в трубчатой печи Линдберга. Концы трубки снабжены входным/выходным отверстиями для газа. При непрерывном токе H₂ фибриллы нагревают до 700^oС в течение 2 часов для превращения любых оксигенатов поверхности в связи С-Н. Затем реактор охлаждают до комнатной температуры при прохождении H₂.1 g of SS fibrils was placed in a porcelain boat and inserted into a one-inch quartz tube reactor, which was closed in a Lindberg tube furnace. The ends of the tube are provided with gas inlet / outlet openings. With a continuous stream of H _{2, the} fibrils are heated to 700 ^{° C.} for 2 hours to convert any surface oxygenates to the CH bond. Then the reactor was cooled to room temperature while passing H ₂ .

Гидрированные фибриллы переносят сухим деокисленным гептаном (с LiAlH₄) в однолитровую многогорлую круглодонную колбу, снабженную системой продувания очищенным аргоном, для удаления всего воздуха и поддержания инертной атмосферы, холодильником, магнитной мешалкой и резиновой перегородкой, через которую жидкости могут подаваться при помощи шприца. В атмосфере аргона шприцем добавляют 2% раствор, содержащий бутиллитий в гептане, и суспензию перемешивают при осторожном нагревании с обратным холодильником в течение 4 часов. В конце этого периода времени фибриллы отделяют гравитационным фильтрованием в атмосфере аргона в боксе с перчатками и промывают несколько раз на фильтре сухим деокисленным гептаном. Фибриллы переносят в круглодонную колбу на 50 мл, снабженную запорным краном, и сушат при вакууме 10^-4 Торр при 50^oС. Концентрацию лития определяют реакцией пробы фибрилл с избытком 0,100 н. НСl в ДИ-воде и обратным титрованием 0,100 н. NaOH до конечной точки при рН 5,0.Hydrogenated fibrils are transferred with dry deoxidized heptane (with LiAlH ₄ ) to a one-liter multi-necked round-bottom flask equipped with a purged argon blowing system to remove all air and maintain an inert atmosphere, a refrigerator, a magnetic stirrer and a rubber partition through which liquids can be supplied via a syringe. In an argon atmosphere, a 2% solution containing butyllithium in heptane was added by syringe, and the suspension was stirred under gentle heating under reflux for 4 hours. At the end of this time, the fibrils are separated by gravity filtration in an argon atmosphere in a glove box and washed several times on the filter with dry deoxidized heptane. The fibrils are transferred to a 50 ml round-bottom flask equipped with a shut-off valve and dried under vacuum of 10 ^-4 Torr at 50 ^° C. The lithium concentration is determined by the reaction of a fibril sample with an excess of 0.100 n. Hcl in DI water and back titration of 0.100 N. NaOH to the end point at pH 5.0.

ПРИМЕР 7
Получение фибриллы-Тl(TFA)₂.EXAMPLE 7
Obtaining fibrils-Tl (TFA) ₂ .

1 г фибрилл СС гидрируют, как в примере 5, и загружают в многогорлую колбу с HTFA, которую дегазируют повторяющимся продуванием сухим аргоном. В колбу через резиновую перегородку добавляют 5% раствор 5 ммоль Tl(TFA)₂ в HTFA и суспензию перемешивают при осторожном нагревании с обратным холодильником в течение 6 часов. После реакции фибриллы собирают и сушат, как в получении 1.1 g of SS fibrils was hydrogenated as in Example 5 and loaded into a multi-necked flask with HTFA, which was degassed by repeated blowing with dry argon. A 5% solution of 5 mmol Tl (TFA) ₂ in HTFA was added to the flask through a rubber septum, and the suspension was stirred under gentle heating under reflux for 6 hours. After the reaction, the fibrils were collected and dried, as in Preparation 1.

ПРИМЕР 8
Получение фибриллы-ОН (окисленного производного, содержащего только функциональную группу ОН).EXAMPLE 8
Obtaining fibrils-OH (oxidized derivative containing only a functional group OH).

0,5 г литированных фибрилл, полученных в примере 6, переносят сухим деокисленным гептаном в перчаточном боксе с атмосферой аргона в одногорлую колбу на 50 мл, снабженную запорным краном и стержнем для магнитной мешалки. Колбу вынимают из перчаточного бокса и перемешивают на магнитной мешалке. Затем запорный кран открывают для доступа воздуха и суспензию перемешивают в течение 24 часов. В конце этого периода времени фибриллы отделяют фильтрованием, промывают водным МеОН и сушат при 50^oС в вакууме 5'' рт. ст. Концентрацию ОН-групп определяют реакцией со стандартизованным раствором уксусного ангидрида в диоксане (0,252 М) при 80^oС для превращения ОН-групп в ацетатные эфиры с высвобождением 1 эквивалента уксусной кислоты на моль прореагировавшего ангидрида. Общее содержание кислоты, свободной уксусной кислоты и непрореагировавшего уксусного ангидрида определяют титрованием 0,100 н. NaOH до конечной точки при рН 7,5.0.5 g of the lithiated fibrils obtained in Example 6 were transferred with dry deoxidized heptane in an argon atmosphere glove box to a 50 ml single neck flask equipped with a stopcock and a rod for a magnetic stirrer. The flask is removed from the glove box and mixed on a magnetic stirrer. Then the shut-off valve is opened for air access and the suspension is stirred for 24 hours. At the end of this time period, the fibrils were separated by filtration, washed with aqueous MeOH and dried at 50 ^{° C.} in a 5 'mercury vacuum. Art. The concentration of OH groups is determined by reaction with a standardized solution of acetic anhydride in dioxane (0.252 M) at 80 ^{° C.} to convert OH groups to acetate esters with the release of 1 equivalent of acetic acid per mole of reacted anhydride. The total content of acid, free acetic acid and unreacted acetic anhydride is determined by titration of 0.100 N. NaOH to the end point at pH 7.5.

ПРИМЕР 9
Получение фибриллы-NH₂.EXAMPLE 9
Obtaining fibrils-NH ₂ .

1 г таллированных фибрилл получают, как в примере 7. Эти фибриллы суспендируют в диоксане и добавляют 0,5 г трифенилфосфина, растворенного в диоксане. Суспензию перемешивают при 50^oС в течение нескольких минут, после чего добавляют при 50^oС газообразный аммиак в течение 30 минут. Затем фибриллы отделяют фильтрованием, промывают в диоксане, затем в ДИ-воде и сушат при 80^oС при вакууме 5'' рт. ст. Концентрацию амина определяют реакцией с избытком уксусного ангидрида и обратным титрованием свободной уксусной кислоты и непрореагировавшего ангидрида 0,100 н. NaOH.1 g of thallated fibrils was prepared as in Example 7. These fibrils were suspended in dioxane and 0.5 g of triphenylphosphine dissolved in dioxane was added. The suspension is stirred at 50 ^{° C.} for several minutes, after which ammonia gas is added at 50 ^{° C.} over 30 minutes. Then the fibrils are separated by filtration, washed in dioxane, then in DI-water and dried at 80 ^{° C.} under 5 'mercury vacuum. Art. The concentration of amine is determined by the reaction with an excess of acetic anhydride and back titration of free acetic acid and unreacted anhydride of 0.100 N. NaOH.

4. ПРОИЗВОДНЫЕ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ, ПОЛИГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ И ПЛОСКИХ МАКРОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
Графитовые поверхности фибрилл делают возможной физическую адсорбцию ароматических соединений. Притяжение происходит с помощью сил Ван дер Ваальса. Эти силы являются значительными между многокольцевыми гетероциклическими ароматическими соединениями и углеродами базисной плоскости графитовых поверхностей. Десорбция может происходить при условиях, в которых возможна конкурентная поверхностная адсорбция, или когда адсорбат обладает высокой растворимостью. Например, было обнаружено, что фибриллы могут быть функционализованы адсорбцией производных фталоцианинов. Эти фибриллы с производными фталоцианинов могут затем использоваться в качестве твердых носителей для иммобилизации белков. Путем простого выбора различных производных фталоцианина различные химические группы могут быть введены на поверхность фибриллы.4. DERIVATIVES OF POLYCYCLIC AROMATIC, POLYHETEROCYCLIC AROMATIC AND PLANE MACROCYCLIC COMPOUNDS
The graphite surfaces of fibrils make possible the physical adsorption of aromatic compounds. Attraction occurs with the help of Van der Waals forces. These forces are significant between multi-ring heterocyclic aromatic compounds and carbons of the basal plane of graphite surfaces. Desorption can occur under conditions in which competitive surface adsorption is possible, or when the adsorbate has high solubility. For example, it has been found that fibrils can be functionalized by adsorption of phthalocyanine derivatives. These fibrils with phthalocyanine derivatives can then be used as solid carriers to immobilize proteins. By simply selecting various phthalocyanine derivatives, various chemical groups can be introduced onto the surface of the fibril.

Использование фибрилл с производными фталоцианина для иммобилизации белков имеет значительные преимущества над прежними способами иммобилизации белков. В частности, оно проще, чем ковалентные модификации. Кроме того, фибриллы с производными фталоцианина имеют высокую площадь поверхности и стабильны почти
во всех типах растворителей в широком диапазоне температуры и рН.The use of fibrils with phthalocyanine derivatives for protein immobilization has significant advantages over previous methods of protein immobilization. In particular, it is simpler than covalent modifications. In addition, fibrils with phthalocyanine derivatives have a high surface area and are almost stable
in all types of solvents over a wide range of temperature and pH.

ПРИМЕР 10
Адсорбция порфиринов и фталоцианинов на фибриллы.EXAMPLE 10
Adsorption of porphyrins and phthalocyanines on fibrils.

Предпочтительными соединениями для физической адсорбции на фибриллах являются производные порфиринов или фталоцианинов, которые, как известно, сильно адсорбируются на графитовой или углеродной саже. Некоторые соединения являются доступными, например тетракарбоновая кислота-порфирин, кобальт(II)-фталоцианин или дилитий-фталоцианин. Два последних могут быть превращены в производные в форме карбоновой кислоты. Preferred compounds for physical adsorption on fibrils are derivatives of porphyrins or phthalocyanines, which are known to be strongly adsorbed on graphite or carbon black. Some compounds are available, for example tetracarboxylic acid-porphyrin, cobalt (II) -phthalocyanine or dilithium-phthalocyanine. The latter two can be converted into derivatives in the form of a carboxylic acid.

Дилитийфталоцианин. Dilithium phthalocyanine.

Как правило, два иона Li⁺ замещали из группы фталоцианина (Рс) наибольшими (в частности, многовалентными) комплексами металлов. Таким образом, замещение ионов Li⁺ ионом металла, связанного с нелабильными лигандами, представляет собой способ помещения стабильных функциональных групп на поверхности фибрилл. Комплексы почти всех металлов переходного ряда будут замещать Li⁺ из Рс с образованием стабильного, нелабильного хелата. Следующей задачей является связывание этого металла с подходящим лигандом.As a rule, two Li ⁺ ions were substituted from the group of phthalocyanine (Pc) by the largest (in particular, multivalent) metal complexes. Thus, the replacement of Li ⁺ ions with a metal ion bound to unstable ligands is a way of placing stable functional groups on the surface of fibrils. Complexes of almost all transition metal metals will replace Li ⁺ from Pc with the formation of a stable, unstable chelate. The next task is the binding of this metal with a suitable ligand.

Кобальт(II)-фталоцианин. Cobalt (II) -phthalocyanine.

Комплексы кобальта(II) являются особенно подходящими для этого. Ион Со⁺⁺ может быть заместителем двух ионов Li⁺ с образованием очень стабильного хелата. Ион Со⁺⁺ может затем быть координирован с лигандом, таким как никотиновая кислота, которая содержит кольцо пиридина с боковой карбоксильной группой и которая, как известно, связывается предпочтительно с группой пиридина. В присутствии избытка никотиновой кислоты Со(II)Рс может электрохимически окисляться до Co(III)Pc с образованием нелабильного комплекса с пиридиновой частью никотиновой кислоты. Таким образом, свободная карбоксильная группа никотиновой кислоты прочно присоединяется к поверхности фибриллы.Cobalt (II) complexes are particularly suitable for this. Co ⁺⁺ ion can be a substitute for two Li ⁺ ions with the formation of a very stable chelate. The Co ⁺⁺ ion can then be coordinated with a ligand, such as nicotinic acid, which contains a pyridine ring with a carboxyl side group and which is known to bind preferably to the pyridine group. In the presence of an excess of nicotinic acid, Co (II) Pc can be electrochemically oxidized to Co (III) Pc with the formation of an unstable complex with the pyridine part of nicotinic acid. Thus, the free carboxyl group of nicotinic acid adheres firmly to the surface of the fibril.

Другими подходящими лигандами являются аминопиридины или этилендиамин (боковая группа NH₂), меркаптопиридин (SH) или другие полифункциональные лиганды, содержащие любую из амино- или пиридильной части молекулы на одном конце и любую желательную функциональную группу на другом конце.Other suitable ligands are aminopyridines or ethylene diamine (NH ₂ side group), mercaptopyridine (SH), or other polyfunctional ligands containing any of the amino or pyridyl moieties at one end and any desired functional group at the other end.

Загрузочная способность для порфиринов или фталоцианинов может быть определена обесцвечиванием растворов при их добавлении с приращениями. Глубокие цвета растворов (темно-розовый для тетракарбоновой кислоты-порфирина в МеОН, темный сине-зеленый для Со(II)- или дилитий-фталоцианина в ацетоне или пиридине) отбрасываются, так как эти молекулы удаляются адсорбцией на черную поверхность фибрилл. The loading capacity for porphyrins or phthalocyanines can be determined by discoloration of the solutions when added in increments. The deep colors of the solutions (dark pink for tetracarboxylic acid porphyrin in MeOH, dark blue-green for Co (II) - or dilithium phthalocyanine in acetone or pyridine) are discarded because these molecules are removed by adsorption on the black surface of the fibrils.

Загрузочные способности оценивали по этому способу и осаждение этих производных рассчитывали из их приблизительных измерений (~140 кв. ангстрем). Для средней площади поверхности для фибрилл 250 м²/г максимальная загрузка будет ~0,3 ммоль/г.Loading abilities were evaluated by this method and the precipitation of these derivatives was calculated from their approximate measurements (~ 140 sq. Angstroms). For an average surface area for fibrils of 250 m ² / g, the maximum load will be ~ 0.3 mmol / g.

Тетракарбоновую кислоту-порфирин анализировали титрованием. Целостность адсорбции испытывали высвобождением красителя в водных системах при температуре окружающей среды и повышенных температурах. Tetracarboxylic acid-porphyrin was analyzed by titration. Adsorption integrity was tested by dye release in aqueous systems at ambient temperature and elevated temperatures.

Суспензии фибрилл сначала смешивали (в смесителе Уоринга) и перемешивали во время загрузки. Часть суспензий обрабатывали ультразвуком, после того как краска больше не выделялась, но безуспешно. Fibril suspensions were first mixed (in a Waring mixer) and mixed during loading. Part of the suspensions was sonicated after the paint no longer stood out, but to no avail.

После загрузки (Опыты 169-11, -12, -14 и -19-1, см. таблицу II) промывали в том же самом растворителе для удаления окклюдированного пигмента. Все давали непрерывный слабый оттенок в промывном эффлюенте, так что было трудно точно определить точку насыщения. Опыты 168-18 и -19-2 использовали рассчитанные количества пигмента для загрузки и промывались лишь очень слабо после загрузки. After loading (Experiments 169-11, -12, -14 and -19-1, see table II) were washed in the same solvent to remove occluded pigment. All gave a continuous faint hue in the wash effluent, so it was difficult to accurately determine the saturation point. Tests 168-18 and -19-2 used the calculated amounts of pigment for loading and were washed only very weakly after loading.

Тетракарбоновая кислота-порфирин (из ацетона) и Со-фталоцианин (из пиридина) загружались на фибриллы для дальнейшей характеристики (Опыты 169-18 и -19-2 соответственно). Tetracarboxylic acid-porphyrin (from acetone) and Co-phthalocyanine (from pyridine) were loaded onto fibrils for further characterization (Experiments 169-18 and -19-2, respectively).

Анализы тетракарбоновой кислоты-порфирина. Tetracarboxylic acid porphyrin assays.

Добавление избытка основания (рН 11-12) вызвало немедленное розовое окрашивание в титрующейся суспензии. Хотя это не мешало фильтрованию, это показало, что при высоком рН порфирин десорбируется. Концентрацию карбоновой кислоты определяли обратным титрованием избытка NaOH с рН 7,5 в качестве конечной точки. Титрование давало загрузку 1,10 мэкв/г кислоты, что эквивалентно 0,275 мэкв/г порфирина. The addition of excess base (pH 11-12) caused an immediate pink color in the titrated suspension. Although this did not interfere with filtration, it showed that porphyrin is desorbed at high pH. The concentration of carboxylic acid was determined by reverse titration of excess NaOH with a pH of 7.5 as the end point. Titration gave a loading of 1.10 meq / g of acid, which is equivalent to 0.275 meq / g of porphyrin.

Анализ кобальт- или дилитий-фталоцианина. Analysis of cobalt or dilithium phthalocyanine.

Концентрации этих адсорбатов оценивали только на основании экспериментов с обесцвечиванием. Точку, в которой сине-зеленый оттенок не выцветал после 30 минут, брали как точку насыщения. The concentrations of these adsorbates were evaluated only on the basis of experiments with bleaching. The point at which the blue-green hue did not fade after 30 minutes was taken as the saturation point.

Ряд замещенных полициклических ароматических или полигетероциклических ароматических соединений адсорбировали на поверхностях фибрилл. Для адгезии число ароматических колец должно было быть большим чем два на кольца/боковую функциональную группу. Таким образом, замещенные антрацены, фенантрены и т. д. , содержащие три конденсированных кольца, или полифункциональные производные, содержащие четыре или более конденсированных колец, могут быть использованы вместо производных порфирина или фталоцианина. Подобно этому могут быть использованы замещенные ароматические гетероциклы, такие как хинолины, или множественно замещенные гетероароматические соединения, содержащие четыре или более колец. A number of substituted polycyclic aromatic or polyheterocyclic aromatic compounds were adsorbed on the surfaces of fibrils. For adhesion, the number of aromatic rings had to be greater than two per ring / side functional group. Thus, substituted anthracenes, phenanthrenes, etc., containing three condensed rings, or polyfunctional derivatives containing four or more condensed rings, can be used instead of porphyrin or phthalocyanine derivatives. Similarly, substituted aromatic heterocycles, such as quinolines, or multiple substituted heteroaromatic compounds containing four or more rings, can be used.

В таблице II суммированы результаты экспериментов по определению загрузки для трех производных порфирина/фталоцианина. Table II summarizes the results of experiments to determine the load for the three derivatives of porphyrin / phthalocyanine.

Следующие примеры 11 и 12 иллюстрируют способы адсорбции двух различных производных фталоцианина на углеродных нанотрубках. The following examples 11 and 12 illustrate methods of adsorption of two different phthalocyanine derivatives on carbon nanotubes.

ПРИМЕР 11
Фибриллы, функционализованные адсорбцией никель(II)-фталоцианинтетрасульфоновой кислоты.EXAMPLE 11
Fibrils functionalized by the adsorption of nickel (II) -phthalocyanine tetrasulfonic acid.

2 мг никель(II)-фталоцианинтетрасульфоновой кислоты (тетранатриевой соли) смешивали с 4,2 мг простых фибрилл в 1 мл dH₂O. Смесь обрабатывали ультразвуком в течение 50 минут и вращали при комнатной температуре в течение ночи.2 mg of nickel (II) -phthalocyanine tetrasulfonic acid (tetrasodium salt) was mixed with 4.2 mg of simple fibrils in 1 ml of dH ₂ O. The mixture was sonicated for 50 minutes and rotated at room temperature overnight.

Эти фибриллы промывали 3 х 1 мл dH₂O, 3 х 1 мл МеОН и 3 х 1 мл CH₂Cl₂ и сушили в вакууме.These fibrils were washed with 3 x 1 ml of dH ₂ O, 3 x 1 ml of MeOH and 3 x 1 ml of CH ₂ Cl ₂ and dried in vacuum.

Термолизин иммобилизовали на этих модифицированных производным фталоцианина фибриллах адсорбцией. 0,5 мг фибрилл суспендировали в 250 мкл dH₂O и обрабатывали ультразвуком в течение 20 минут. Супернатант отбрасывали и фибриллы суспендировали в 250 мкл 0,05 М Трис (рН 8,0) и смешивали с 250 мкл 0,6 мМ раствора термолизина, приготовленного в том же самом буфере. Смесь вращали при комнатной температуре в течение 2 часов и выдерживали при 4^oС в течение ночи. Затем фибриллы промывали три раза 1 мл 25 мМ Трис (рН 8) и суспендировали в 250 мкл буфера, содержащего 40 мМ Трис и 10 мМ CaCl₂, при рН 7,5.Thermolysin was immobilized on these adsorption modified phthalocyanine derivative fibrils. 0.5 mg of fibrils was suspended in 250 μl of dH ₂ O and sonicated for 20 minutes. The supernatant was discarded and the fibrils suspended in 250 μl of 0.05 M Tris (pH 8.0) and mixed with 250 μl of a 0.6 mm solution of thermolysin prepared in the same buffer. The mixture was rotated at room temperature for 2 hours and kept at 4 ^{° C.} overnight. The fibrils were then washed three times with 1 ml of 25 mM Tris (pH 8) and suspended in 250 μl of buffer containing 40 mM Tris and 10 mM CaCl ₂ at pH 7.5.

Количество термолизина на этих фибриллах определяли измерением активности фермента этих фибрил. Термолизин может взаимодействовать с субстратом FAGLA (N-(3-[2-фурил]акрилоил)-glu-leu-амид) и продуцировать соединение, которое вызывает уменьшение поглощения при 345 нм с коэффициентом экстинкции 310 М^-1м^-1. Для этой реакции использовали тест-буфер 40 мМ Трис, 10 мМ CaCl₂ и 1,75 М NaCl при рН 7,5. Реакцию проводили в кювете на 1 мл путем смешивания 5 мкл исходного раствора FAGLA (25,5 мМ в 30% ДМФ в dH₂O) и 10 мкг термолизин-фибрилл в 1 мл тест-буфера. Уменьшение поглощения при 345 нм определяли мониторингом на протяжении 10 минут. Затем активность фермента (мкМ/мин) рассчитывали из первоначального наклона кривой с использованием коэффициента экстинкции 310 М^-1м^-1. Количество активного термолизина на грамм фибрилл было равно 0,61 мкмоль.The amount of thermolysin on these fibrils was determined by measuring the activity of the enzyme of these fibrils. Thermolysin can interact with the FAGLA substrate (N- (3- [2-furyl] acryloyl) -glu-leu-amide) and produce a compound that causes a decrease in absorption at 345 nm with an extinction coefficient of 310 M ^-1 m ^-1 . A 40 mM Tris test buffer, 10 mM CaCl _2, and 1.75 M NaCl at pH 7.5 were used for this reaction. The reaction was carried out in a 1 ml cuvette by mixing 5 μl of FAGLA stock solution (25.5 mm in 30% DMF in dH ₂ O) and 10 μg of thermolysin-fibrils in 1 ml of test buffer. The decrease in absorbance at 345 nm was determined by monitoring for 10 minutes. The enzyme activity (μM / min) was then calculated from the initial slope of the curve using an extinction coefficient of 310 M ⁻¹ m ⁻¹ . The amount of active thermolysin per gram of fibrils was 0.61 μmol.

ПРИМЕР 12
Фибриллы, функционализованные адсорбцией 1,4,8,11,15,18,22,25-октабутокси-29Н,31Н-фталоцианина.EXAMPLE 12
Fibrils functionalized by adsorption of 1,4,8,11,15,18,22,25-octabutoxy-29H, 31H-phthalocyanine.

3 мг 1,4,8,11,15,22,25-октабутокси-29Н,31Н-фталоцианина и 5,3 мг простых фибрилл смешивали в 1 мл СНСl₃. Смесь обрабатывали ультразвуком в течение 50 минут и вращали при комнатной температуре в течение ночи.3 mg of 1,4,8,11,15,22,25-octabutoxy-29H, 31H-phthalocyanine and 5.3 mg of simple fibrils were mixed in 1 ml of CHCl ₃ . The mixture was sonicated for 50 minutes and rotated at room temperature overnight.

Фибриллы промывали 3 х 1 мл СН₂Сl₂ и сушили в вакууме. Термолизин иммобилизовали на фибриллах с производным фталоцианина адсорбцией согласно способу примера 34. Количество активного термолизина на грамм фибрилл было 0,70 мкмоль.The fibrils were washed with 3 x 1 ml of CH ₂ Cl ₂ and dried in vacuum. Thermolysin was immobilized on fibrils with a phthalocyanine derivative adsorption according to the method of Example 34. The amount of active thermolysin per gram of fibrils was 0.70 μmol.

ПРИМЕР 13
Синтез предшественника аспартама с использованием модифицированных производным фталоцианина фибрилл с иммобилизованным на них термолизином.EXAMPLE 13
Synthesis of aspartame precursor using phthalocyanine derivative-modified fibrils with thermolysin immobilized on them.

Фибриллы, модифицированные фталоцианином, на которых был иммобилизован термолизин, могут быть использованы для катализа синтеза предшественника синтетического подслащивающего вещества аспартама. Реакцию проводят путем смешивания 80 мМ L-Z-Asp и 220 мМ L-PheOMe в этилацетате с 10 мкМ иммобилизованным на фибриллах термолизином. Продукт Z-Asp-PheOMe подвергают мониторингу при помощи ВЖХ для определения выхода. Phthalocyanine-modified fibrils on which thermolysin was immobilized can be used to catalyze the synthesis of the aspartame synthetic sweetener precursor. The reaction is carried out by mixing 80 mM L-Z-Asp and 220 mM L-PheOMe in ethyl acetate with 10 μM thermolysin immobilized on fibrils. The Z-Asp-PheOMe product was monitored by HPLC to determine the yield.

5. ОКИСЛЕНИЕ ХЛОРАТОМ ИЛИ АЗОТНОЙ КИСЛОТОЙ
Литературные источники по окислению графита сильными окислителями, такими как хлорат калия в концентрированной серной кислоте или азотная кислота, включают R. N. Smith, Quarterly Review 13, 287 (1959); M. J. D. Chem. Rev., 60, 267 (1960). Как правило, атакуются концевые углероды (в том числе дефектные участки) с образованием смесей карбоновых кислот, фенолов и других окисленных групп. Этот механизм является сложным, включающим радикальные реакции.5. OXIDATION BY CHLORATE OR NITRIC ACID
Literature sources on the oxidation of graphite by strong oxidizing agents such as potassium chlorate in concentrated sulfuric acid or nitric acid include RN Smith, Quarterly Review 13, 287 (1959); MJD Chem. Rev. 60, 267 (1960). As a rule, terminal carbons (including defective sites) are attacked with the formation of mixtures of carboxylic acids, phenols and other oxidized groups. This mechanism is complex, including radical reactions.

ПРИМЕР 14
Получение функционализованных карбоновой кислотой фибрилл с применением хлората.EXAMPLE 14
Obtaining functionalized carboxylic acid fibrils using chlorate.

Пробу фибрилл СС суспендировали в концентрированной H₂SO₄ смешиванием шпателем и затем переносили в реакционную колбу, снабженную входным/выходным отверстиями для газа и верхней мешалкой. При перемешивании и при медленном токе аргона загрузку NaClO₃ добавляли порциями при комнатной температуре на протяжении опыта. Пары хлора образовывались во время всего хода опыта и выносились из реактора в улавливатель с водным раствором NaOH. В конце опыта суспензию фибрилл выливали на раздробленный лед и фильтровали в вакууме. Фильтровальный осадок переносили затем в камеру Сокслета и промывали в экстракторе Сокслета ДИ-водой со сменой свежей воды каждые несколько часов. Промывание продолжали до тех пор, пока проба фибрилл при добавлении к свежей ДИ-воде не переставала изменять рН воды. Затем фибриллы отделяли фильтрованием и сушили при 100^oС при вакууме 52" рт. ст. в течение ночи.A sample of SS fibrils was suspended in concentrated H ₂ SO _{4 by} mixing with a spatula and then transferred to a reaction flask equipped with a gas inlet / outlet and an overhead stirrer. With stirring and with a slow flow of argon, a NaClO ₃ charge was added in portions at room temperature over the course of the experiment. Chlorine vapors were formed during the entire course of the experiment and were taken out of the reactor into a trap with an aqueous solution of NaOH. At the end of the experiment, a suspension of fibrils was poured onto crushed ice and filtered in vacuo. The filter cake was then transferred to a Soxhlet chamber and washed in a Soxhlet extractor with DI-water with a change of fresh water every few hours. Washing was continued until the fibril sample, when added to fresh DI water, ceased to change the pH of the water. Then the fibrils were separated by filtration and dried at 100 ^{° C.} under a vacuum of 52 "Hg overnight.

Содержание карбоновой кислоты определяли реакцией пробы с избытком 0,100 н. NaOH и обратным титрованием 0,100 н. НСl до конечной точки, рН 7,5. Результаты представлены в таблице III. The carboxylic acid content was determined by the reaction of the sample with an excess of 0.100 N. NaOH and back titration of 0.100 N. Hcl to the end point, pH 7.5. The results are presented in table III.

ПРИМЕР 15
Получение функционализованных карбоновой кислотой фибрилл с применением азотной кислоты.EXAMPLE 15
Obtaining functionalized carboxylic acid fibrils using nitric acid.

Взвешенную пробу фибрилл суспендировали с азотной кислотой подходящей концентрации в многогорлой индентированной реакционной колбе со связанным дном, снабженной верхней мешалкой и водным холодильником. При постоянном перемешивании температуру доводили до нужного уровня и реакцию проводили в течение указанного времени. Коричневый дым выделялся вскоре после превышения температуры до 70^oС независимо от концентрации кислоты. После реакции суспензию выливали на раздробленный лед и разбавляли ДИ-водой. Суспензию фильтровали и избыток кислоты удаляли промыванием в экстракторе Сокслета с заменой воды в резервуаре свежей водой каждые несколько часов, пока суспендированная проба не переставала изменять рН ДИ-воды. Фибриллы сушили при 100^oС при вакууме 5'' рт. ст. в течение ночи. Взвешенную порцию фибрилл подвергали взаимодействию со стандартным 0,100 н. NaOH и содержание карбоновой кислоты определяли обратным титрованием 0,100 н. НСl. Содержание поверхностного кислорода определяли с применением XPS. Диспергируемость в воде испытывали при 0,1 мас.% смешиванием в смесителе Уоринга при высокой скорости в течение 2 мин. Результаты суммированы в таблице 1V.A weighted sample of fibrils was suspended with nitric acid of the appropriate concentration in a multi-necked indented reaction flask with a bottom attached, equipped with an overhead stirrer and water cooler. With constant stirring, the temperature was brought to the desired level and the reaction was carried out for the specified time. Brown smoke was released shortly after exceeding the temperature up to 70 ^o With regardless of the concentration of acid. After the reaction, the suspension was poured onto crushed ice and diluted with DI water. The suspension was filtered and excess acid was removed by washing in a Soxhlet extractor with replacing the water in the tank with fresh water every few hours, until the suspended sample stopped changing the pH of the DI water. The fibrils were dried at 100 ^{° C.} under a vacuum of 5 т mercury. Art. during the night. A weighted portion of fibrils was reacted with a standard 0.100 N. NaOH and carboxylic acid content were determined by reverse titration of 0.100 N. Hcl. The surface oxygen content was determined using XPS. Water dispersibility was tested at 0.1 wt.% By mixing in a Waring mixer at high speed for 2 minutes. The results are summarized in table 1V.

6. АМИНО-ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ ФИБРИЛЛ
Аминогруппы могут вводиться непосредственно на графитовые фибриллы обработкой фибрилл азотной кислотой и серной кислотой для получения нитрованных фибрилл, затем восстановлением нитрованной формы восстановителем, таким как дитионит натрия, с получением амино-функционализованных фибрилл согласно следующей формуле:

Полученные фибриллы имеют много применений, в том числе для иммобилизации белков (например, ферментов и антител) и аффинной и ионообменной хроматографии.6. AMINO-FUNCTIONALIZATION OF FIBRILLA
Amino groups can be introduced directly onto graphite fibrils by treating the fibrils with nitric acid and sulfuric acid to obtain nitrated fibrils, then reducing the nitrated form with a reducing agent, such as sodium dithionite, to obtain amino-functionalized fibrils according to the following formula:

The obtained fibrils have many uses, including for the immobilization of proteins (for example, enzymes and antibodies) and affinity and ion exchange chromatography.

ПРИМЕР 16
Получение амино-функционализованных фибрилл с использованием азотной кислоты.EXAMPLE 16
Obtaining amino-functionalized fibrils using nitric acid.

К охлажденной суспензии (0^oС) фибрилл (70 мг) в воде (1,6 мл) и уксусной кислоте (0,8 мл) добавляли по каплям азотную кислоту (0,4 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Медленно добавляли смесь серной кислоты (0,4 мл) и соляной кислоты (0,4 мл) и перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакцию останавливали и центрифугировали. Водный слой удаляли и фибриллы промывали водой (х 5). Остаток обрабатывали 10% гидроксидом натрия (х 3) и промывали водой (х 5) с получением нитрованных фибрилл.Nitric acid (0.4 ml) was added dropwise to a cooled suspension (0 ^{° C.} ) of fibrils (70 mg) in water (1.6 ml) and acetic acid (0.8 ml). The reaction mixture was stirred for 1 hour at room temperature. A mixture of sulfuric acid (0.4 ml) and hydrochloric acid (0.4 ml) was slowly added and stirred for 1 hour at room temperature. The reaction was stopped and centrifuged. The aqueous layer was removed and the fibrils were washed with water (x 5). The residue was treated with 10% sodium hydroxide (x 3) and washed with water (x 5) to obtain nitrated fibrils.

К суспензии нитрованных фибрилл в воде (3 мл) и гидроксиде аммония (2 мл) добавляли дитионит натрия (200 мг) в виде трех порций при 0^oС. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 минут при комнатной температуре и нагревали с обратным холодильником в течение 1 часа при 100^oС. Реакцию останавливали, охлаждали до 0^oС и рН доводили уксусной кислотой (рН 4). После стояния в течение ночи при комнатной температуре суспензию фильтровали, промывали водой (х 10), метанолом (х 5) и сушили в вакууме с получением амино-фибрилл.To a suspension of nitrated fibrils in water (3 ml) and ammonium hydroxide (2 ml) was added sodium dithionite (200 mg) in three portions at 0 ^° C. The reaction mixture was stirred for 5 minutes at room temperature and heated under reflux for 1 hour at 100 ^° C. The reaction was stopped, cooled to 0 ^{° C.} and the pH was adjusted with acetic acid (pH 4). After standing overnight at room temperature, the suspension was filtered, washed with water (x 10), methanol (x 5) and dried in vacuo to give amino fibrils.

Для испытания амино-функционализованных фибрилл фибриллы связывали с пероксидазой хрена. Затем HRP-связанные аминофибриллы интенсивно диализовали. После диализа фибриллы промывали 15 раз на протяжении следующей недели. Модифицированные ферментом фибриллы тестировали следующим образом:

Результаты показали, что HRP, связанная с Фиб-NH₂, показала хорошую ферментативную активность, которая сохранялась в течение одной недели.For testing amino-functionalized fibrils, fibrils were linked to horseradish peroxidase. HRP-linked aminofibrils were then intensively dialyzed. After dialysis, the fibrils were washed 15 times over the next week. Enzyme-modified fibrils were tested as follows:

The results showed that HRP associated with Fib-NH ₂ showed good enzymatic activity that persisted for one week.

7. ПРИСОЕДИНЕНИЕ КОНЦЕВЫХ СПИРТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ИНИЦИАТОРА
Высокая степень стабильности углеродных нанотрубок, хотя и позволяющая использовать их в жестких (неблагоприятных) условиях, затрудняет их активацию для дальнейшей модификации. Предшествующие способы включали использование сильных окислителей и кислот. Теперь неожиданно было обнаружено, что к углеродным нанотрубкам могут быть присоединены концевые спирты при помощи свободнорадикального инициатора, такого как пероксид бензоила (ВРО). Углеродные нанотрубки добавляют к спирту, имеющему формулу RCH₂OH, где R обозначает водород, алкил, арил, циклоалкил, аралкил, циклоарил или поли(алкиловый эфир), вместе со свободнорадикальным инициатором и нагревают до от около 60^oС до около 90^oС. Предпочтительные спирты включают этанол и метанол. После прохождении достаточного периода времени для разрушения всего свободнорадикального инициатора реакционную смесь фильтруют и материал углеродных нанотрубок промывают и сушат с получением модифицированных нанотрубок формулы Нанотрубка-СН(R)ОН. Этот способ можно также использовать для связывания бифункциональных спиртов. Это позволяет соединять один конец с углеродной нанотрубкой, а другой использовать для непрямого связывания другого материала с поверхностью.7. CONNECTION OF END ALCOHOLS USING A FREE RADICAL INITIATOR
The high degree of stability of carbon nanotubes, although allowing their use in harsh (unfavorable) conditions, complicates their activation for further modification. Previous methods have included the use of strong oxidizing agents and acids. Now it has now been unexpectedly discovered that terminal alcohols can be attached to carbon nanotubes using a free radical initiator such as benzoyl peroxide (BPO). Carbon nanotubes are added to an alcohol having the formula RCH ₂ OH, where R is hydrogen, alkyl, aryl, cycloalkyl, aralkyl, cycloaryl or poly (alkyl ether), together with a free radical initiator and heated to from about 60 ^{° C.} to about 90 ^{° C.} Preferred alcohols include ethanol and methanol. After passing a sufficient period of time to destroy the entire free radical initiator, the reaction mixture is filtered and the carbon nanotube material is washed and dried to obtain modified nanotubes of the formula Nanotube-CH (R) OH. This method can also be used to bind bifunctional alcohols. This allows one end to be connected to a carbon nanotube, and the other used to indirectly bind the other material to the surface.

ПРИМЕР 17
Получение функционализованных спиртом нанотрубок с использованием бензоилпероксида.EXAMPLE 17
Obtaining alcohol-functionalized nanotubes using benzoyl peroxide.

0,277 г углеродных нанотрубок диспергировали в МеОН при помощи зондового ультразвукового дезинтегратора. 0,126 граммов ВРО добавляли при комнатной температуре и температуру увеличивали до 60^oС и добавляли еще 0,128 г ВРО. Еще после 45 минут при 60^oС добавляли конечную загрузку ВРО 0,129 г и смесь выдерживали при 60^oС в течение еще 30 минут. Продукт фильтровали на мембрану и промывали несколько раз МеОН и EtOH и сушили в термостате при 90^oС. Выход был 0,285 г. ESCA-анализ показал содержание кислорода 2,5 ат.% по сравнению с 0,74% для контрольной пробы, нагреваемой с обратным холодильником в МеОН без ВРО.0.277 g of carbon nanotubes were dispersed in MeOH using a probe ultrasonic disintegrator. 0.126 grams of BPO was added at room temperature and the temperature was increased to 60 ^{° C.} and another 0.128 g of BPO was added. After another 45 minutes at 60 ^{° C., a} final loading of BPO of 0.129 g was added and the mixture was kept at 60 ^{° C.} for another 30 minutes. The product was filtered on a membrane and washed several times with MeOH and EtOH and dried in a thermostat at 90 ^o C. The yield was 0.285 g. ESCA analysis showed an oxygen content of 2.5 at.% Compared with 0.74% for a control sample heated with reflux condenser in MeOH without BPO.

ПРИМЕР 18
Модификация углеродных нанотрубок поли(этиленгликолем) с использованием бензоилпероксида.EXAMPLE 18
Modification of carbon nanotubes with poly (ethylene glycol) using benzoyl peroxide.

0,1 г углеродных нанотрубок, 0,5 г ВРО и 10 г поли(этиленгликоля) со ср. мол. массой 1000 (PEG-1000), смешивали вместе при комнатной температуре. Смесь нагревали до 90^oС для расплавления PEG и оставляли реагировать при 90^oС в течение ночи. Затем всю смесь фильтровали и промывали для удаления избыточного PEG и затем сушили. Полученный продукт можно было использовать в таком виде или его можно было модифицировать дополнительно присоединением представляющих интерес материалов к свободному концу PEG.0.1 g of carbon nanotubes, 0.5 g of BPO and 10 g of poly (ethylene glycol) cf. pier weighing 1000 (PEG-1000), mixed together at room temperature. The mixture was heated to 90 ^{° C.} to melt the PEG and allowed to react at 90 ^{° C.} overnight. Then the whole mixture was filtered and washed to remove excess PEG and then dried. The resulting product could be used in this form, or it could be further modified by attaching materials of interest to the free end of PEG.

ПРИМЕР 19
Применение углеродных нанотрубок, модифицированных PEG, для уменьшения неспецифического связывания.EXAMPLE 19
The use of carbon nanotubes modified with PEG to reduce non-specific binding.

Неспецифическое связывание с углеродным материалом с высокой площадью поверхности является повсеместным. Было обнаружено, что присоединение гидрофильных олигомеров, таких как PEG, к углеродным нанотрубкам может уменьшать неспецифическое связывание. Кроме того, было обнаружено, что в результате присоединения одного конца подобных цепям молекул, таких как PEG, к поверхности нанотрубок свободный конец может содержать функциональную группу, которая может быть использована для присоединения других представляющих интерес материалов, с сохранением все еще способности слоя PEG (или другого вещества) уменьшать неспецифическое связывание. Nonspecific binding to carbon material with a high surface area is ubiquitous. It has been found that the attachment of hydrophilic oligomers, such as PEG, to carbon nanotubes can reduce non-specific binding. In addition, it was found that, by attaching one end of a chain-like molecule, such as PEG, to the surface of the nanotubes, the free end may contain a functional group that can be used to attach other materials of interest, while still maintaining the ability of the PEG layer (or other substance) reduce non-specific binding.

Уменьшение неспецифического связывания бычьего сывороточного альбумина модифицированными PEG фибриллами. Reduction of non-specific binding of bovine serum albumin with modified PEG fibrils.

Исходные дисперсии немодифицированных фибрилл, окисленных хлоратом фибрилл и фибрилл, модифицированных ПЭГ, при 0,1 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буфере при рН 7,0 получали диспергированием 1,0 мг каждого из них в 10 мл буфера с обработкой ультразвуком. 2 мл 2-кратных серийных разведении каждой из них помещали в каждую из 9 полипропиленовых пробирок. 100 мкл исходного раствора 0,2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в том же самом буфере добавляли в каждую пробирку и в 3 пробирки слепого контроля (буфер). Также готовили три пробирки с буфером без белка. Все пробирки перемешивали на вортексе и давали им инкубироваться в течение 30 минут при 30-секундном перемешивании вортексом каждые 10 минут. Все пробирки центрифугировали для отделения фибрилл и аликвоты 1 мл супернатанта переносили в новые пробирки и анализировали на содержание общего белка с использованием микротеста на белок БСА (Pierce). Уровень белка, остающегося в супернатанте, был непрямой мерой количества, которое было не специфически связано с фибриллами. Весь БСА оставался в супернатанте для модифицированных PEG фибрилл, в то время как было почти полное связывание с не модифицированными или окисленными хлоратом фибриллами (см. фиг.1). The initial dispersion of unmodified fibrils, chlorate-oxidized fibrils and fibrils, modified with PEG, at 0.1 mg / ml in 50 mM potassium phosphate buffer at pH 7.0 was obtained by dispersing 1.0 mg of each of them in 10 ml of sonication buffer. 2 ml of 2-fold serial dilutions of each of them was placed in each of 9 polypropylene tubes. 100 μl of a stock solution of 0.2 mg / ml bovine serum albumin in the same buffer was added to each tube and to 3 blind control tubes (buffer). Three tubes with protein-free buffer were also prepared. All tubes were vortexed and allowed to incubate for 30 minutes with 30 second vortexing every 10 minutes. All tubes were centrifuged to separate fibrils and aliquots of 1 ml supernatant were transferred to new tubes and analyzed for total protein using a microtest for BSA protein (Pierce). The level of protein remaining in the supernatant was an indirect measure of the amount that was not specifically related to fibrils. All BSA remained in the supernatant for modified PEG fibrils, while there was almost complete binding to unmodified or oxidized chlorate fibrils (see FIG. 1).

Сравнение уменьшения неспецифического связывания фибриллами, модифицированными PEG, полученными с использованием бензоилпероксида и путем NHS-эфирного связывания. Comparison of the reduction of non-specific binding by PEG-modified fibrils obtained using benzoyl peroxide and by NHS-ether binding.

Исходные дисперсии окисленных хлоратом фибрилл, фибрилл, модифицированных ПЭГ с использованием бензоилпероксида, и окисленных хлоратом фибрилл, модифицированных PEG путем NHS-эфирного связывания, получали при 0,1 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буфере при рН 7,0 получали диспергированием 1,0 мг каждого из них в 10 мл буфера с обработкой ультразвуком. 2 мл 3-кратных серийных разведении каждой из них помещали в каждую из 7 полипропиленовых пробирок. 100 мкл исходного раствора 0,2 мг/мл β-лактоглобулина (βLG) в том же самом буфере добавляли в каждую пробирку и в 3 пробирки слепого контроля (буфер). Также готовили три пробирки с буфером без белка. Все пробирки перемешивали на вортексе и давали им инкубироваться в течение 60 минут при 30-секундном перемешивании вортексом каждые 10 минут. Все пробирки центрифугировали для отделения фибрилл и аликвоты 1 мл супернатанта переносили в новые пробирки и анализировали на содержание общего белка с использованием микротеста на белок БСА (Pierce). Уровень белка, остающегося в супернатанте, был непрямой мерой количества, которое было не специфически связано с белком (см. фиг. 2). Для каждой из пробирок βLG оставался в супернатанте для фибрилл, модифицированных PEG с применением NHS-эфира, что демонстрировало отсутствие неспецифического связывания. Фибриллы, модифицированные PEG через путь ВРО, обнаруживали лишь слабое (приблизительно 10%) связывание βLG при наивысшем уровне фибрилл 1,0 мг/мл и отсутствие значимого связывания при более низких уровнях. В противоположность этому было почти полное связывание с окисленными хлоратом фибриллами при уровнях фибрилл 0,1 мг/мл и выше и существенное связывание при уровнях ниже 0,01 мг/мл этих фибрилл. The initial dispersion of chlorate-oxidized fibrils, fibrils, modified PEG using benzoyl peroxide, and chlorate-oxidized fibrils, modified PEG by NHS-ether binding, was obtained at 0.1 mg / ml in 50 mm potassium phosphate buffer at pH 7.0 was obtained by dispersion 1 , 0 mg of each of them in 10 ml of sonication buffer. 2 ml of 3-fold serial dilutions of each of them was placed in each of 7 polypropylene tubes. 100 μl of a stock solution of 0.2 mg / ml β-lactoglobulin (βLG) in the same buffer was added to each tube and to 3 blind control tubes (buffer). Three tubes with protein-free buffer were also prepared. All tubes were vortex-agitated and allowed to incubate for 60 minutes with 30-second vortex agitation every 10 minutes. All tubes were centrifuged to separate fibrils and aliquots of 1 ml supernatant were transferred to new tubes and analyzed for total protein using a microtest for BSA protein (Pierce). The level of protein remaining in the supernatant was an indirect measure of the amount that was not specifically related to the protein (see FIG. 2). For each tube, βLG remained in the supernatant for fibrils modified with PEG using NHS ester, which demonstrated the absence of non-specific binding. PEG modified fibrils via the BPO pathway showed only weak (approximately 10%) βLG binding at the highest fibril level of 1.0 mg / ml and no significant binding at lower levels. In contrast, there was an almost complete binding to chlorate-oxidized fibrils at fibril levels of 0.1 mg / ml and higher, and substantial binding at levels below 0.01 mg / ml of these fibrils.

8. ВТОРИЧНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ФУНКЦИОНАЛИЗОВАННЫХ НАНОТРУБОК
Функционализованные карбоновой кислотой нанотрубки.8. SECONDARY DERIVATIVES OF FUNCTIONALIZED NANOTUBES
Carbonic acid functionalized nanotubes.

Число вторичных производных, которые могут быть получены только из карбоновой кислоты, является по существу неограниченным. Спирты или амины легко связываются с кислотой с образованием стабильных эфиров или амидов. Если спирт или амин является частью ди- или полифункциональной молекулы, то связь через O- или NH- оставляет другие функциональности в виде боковых групп. Типичными примерами вторичных реагентов являются реагенты, приведенные в таблице A. The number of secondary derivatives that can only be obtained from carboxylic acid is essentially unlimited. Alcohols or amines readily bind to acid to form stable esters or amides. If the alcohol or amine is part of a di- or polyfunctional molecule, then the bond through O- or NH- leaves the other functionalities in the form of side groups. Typical examples of secondary reagents are the reagents shown in table A.

Эти реакции могут проводиться с применением любых способов, разработанных для этерификации или аминирования карбоновых кислот со спиртами или аминами. Из них использовали способы Н. A. Staab, Angew. Chem. Internat. Edit. , (1), 351 (1962), с применением N,N'-карбонилдиимидазола (CDI) в качестве ацилирующего агента для эфиров или амидов и G.W. Anderson et al., J. Amer. Chem. Soc., 86, 1839 (1964), с применением N-гидроксисукцинимида (NHS) для активации карбоновых кислот для амидирования. These reactions can be carried out using any of the methods developed for the esterification or amination of carboxylic acids with alcohols or amines. Of these, the methods of N. A. Staab, Angew. Chem. Internat. Edit , (1), 351 (1962), using N, N'-carbonyldiimidazole (CDI) as an acylating agent for esters or amides and G.W. Anderson et al., J. Amer. Chem. Soc., 86, 1839 (1964), using N-hydroxysuccinimide (NHS) to activate carboxylic acids for amidation.

ПРИМЕР 20
Получение вторичных производных функционализованных фибрилл N,N'-карбонилдиимидазола.EXAMPLE 20
Preparation of secondary derivatives of functionalized N, N'-carbonyldiimidazole fibrils.

Для этой процедуры необходимы чистые сухие апротонные растворители (например, толуол или диоксан). Стехиометрические количества реагентов являются достаточными. Для эфиров карбоновую кислоту подвергают взаимодействию в инертной атмосфере (аргон) в толуоле со стехиометрическим количеством CDI, растворенным в толуоле, при комнатной температуре в течение 2 часов. Во время этого времени выделяется CO₂. После двух часов добавляют спирт вместе с каталитическими количествами этоксида натрия и реакцию продолжают при 80^oС в течение 4 часов. Для нормальных спиртов выходы являются количественными. Реакции представляют собой

Амидирование аминов происходит без катализа при комнатной температуре. Первая стадия в этой процедуре является той же самой. После выделения CO₂ добавляют стехиометрическое количество амина при комнатной температуре и реакцию проводят в течение 1-2 часов. Реакция является количественной. Реакция представляет собой
3. R-CO-Im+R'-NH₂-->R-CO-NHR+HIm
Силилирование.This procedure requires pure dry aprotic solvents (e.g. toluene or dioxane). Stoichiometric amounts of reagents are sufficient. For esters, the carboxylic acid is reacted in an inert atmosphere (argon) in toluene with a stoichiometric amount of CDI dissolved in toluene at room temperature for 2 hours. During this time, CO _{2 is released} . After two hours, alcohol is added along with catalytic amounts of sodium ethoxide and the reaction is continued at 80 ^{° C.} for 4 hours. For normal alcohols, yields are quantitative. Reactions are

Amidation of amines occurs without catalysis at room temperature. The first stage in this procedure is the same. After the CO _{2 is} isolated, a stoichiometric amount of amine is added at room temperature and the reaction is carried out for 1-2 hours. The reaction is quantitative. The reaction is
3. R-CO-Im + R'-NH ₂ -> R-CO-NHR + HIm
Silylation.

Триалкилсилилхлориды или триалкилсиланолы взаимодействуют непосредственно с кислотным Н в соответствии с
R-COOH+Cl-SiR'₃-->R-CO-SiR'₃+НСl
Небольшие количества диаза-1,1,1-бициклооктана (DABCO) используют в качестве катализатора. Подходящими растворителями являются диоксан и толуол.Trialkylsilyl chlorides or trialkylsilanols interact directly with acid H in accordance with
R-COOH + Cl-SiR ' ₃ ->R-CO-SiR' ₃ + Hcl
Small amounts of diaz-1,1,1-bicyclooctane (DABCO) are used as a catalyst. Suitable solvents are dioxane and toluene.

Функционализованные сульфоновой кислотой фибриллы. Sulfonic acid functionalized fibrils.

Арилсульфоновые кислоты, полученные, как в примере 1, могут взаимодействовать далее с образованием вторичных производных. Сульфоновые кислоты могут быть восстановлены до меркаптанов при помощи LiAlH₄ или сочетания трифенилфосфина и иода (March, J.Р., р. 1107). Они могут быть также превращены в сульфонатные эфиры реакцией с диалкиловыми эфирами, т.е.Arylsulfonic acids obtained as in example 1, can interact further with the formation of secondary derivatives. Sulfonic acids can be reduced to mercaptans using LiAlH ₄ or a combination of triphenylphosphine and iodine (March, J.P., p. 1107). They can also be converted to sulfonate esters by reaction with dialkyl ethers, i.e.

Фибрилла-SО₃Н+R-O-R-->Фибрилла-SO₂OR+ROH
N-Гидроксисукцинимид.Fibril-SO ₃ H + ROR -> Fibril-SO ₂ OR + ROH
N-hydroxysuccinimide.

Активация карбоновых кислот для амидирования первичными аминами происходит через N-гидроксисукцинамиловый эфир; карбодиимид используют для связывания воды, выделяющейся в виде замещенной мочевины. Затем NHS-эфир превращают при комнатной температуре в амид реакцией с первичным амином. Реакции представляют собой
1. R-COOH+NHS+CDI-->R-CONHS+замещ. мочевина
2. R-CNHS+R'-NH₂-->R-CO-NHR'
Этот способ применим, в частности, для ковалентного присоединения белка к графитовым фибриллам через свободную NH₂ на боковой цепи белка. Примеры белков, которые могут быть иммобилизованы на фибриллах согласно этому способу, включают трипсин, стрептавидин и авидин. Стрептавидин- (или авидин)-фибриллы обеспечивают твердый носитель для любого биотинилированного вещества.The activation of carboxylic acids for amidation with primary amines occurs via N-hydroxysuccinamyl ether; carbodiimide is used to bind water released as substituted urea. The NHS ester is then converted to an amide at room temperature by reaction with a primary amine. Reactions are
1. R-COOH + NHS + CDI -> R-CONHS + substitution. urea
2. R-CNHS + R'-NH ₂ -> R-CO-NHR '
This method is applicable, in particular, for covalent attachment of a protein to graphite fibrils via free NH ₂ on the protein side chain. Examples of proteins that can be immobilized on fibrils according to this method include trypsin, streptavidin and avidin. Streptavidin (or avidin) fibrils provide a solid carrier for any biotinylated substance.

ПРИМЕР 21
Ковалентное присоединение белков к фибриллам через NHS-эфир.EXAMPLE 21
Covalent attachment of proteins to fibrils via NHS-ether.

Для демонстрации того, что белок может быть ковалентно присоединен к фибриллам через NHS-эфир, стрептавидин, авидин и трипсин присоединяли к фибриллам следующим образом. To demonstrate that the protein can be covalently attached to fibrils via NHS ether, streptavidin, avidin and trypsin were attached to fibrils as follows.

0,5 мг NHS-эфир-фибрилл промывали 5 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,1) и супернатант отбрасывали. К этим фибриллам добавляли 200 мкл раствора стрептавидина (1,5 мг в том же самом буфере) и смесь вращали при комнатной температуре в течение 5,5 часов. Затем фибриллы промывали 1 мл следующих буферов в такой последовательности: 5 мМ фосфат натрия (рН 7,1), PBS (0,1 М фосфат натрия, 0,15 М NaCl, рН 7,4), ORIGEN^ТМ тест-буфер (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) и PBS. Стрептавидин-фибриллы хранили в буфере PBS для последующего использования.0.5 mg NHS-ether-fibrils were washed with 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.1) and the supernatant discarded. To these fibrils were added 200 μl of streptavidin solution (1.5 mg in the same buffer) and the mixture was rotated at room temperature for 5.5 hours. Then the fibrils were washed with 1 ml of the following buffers in the following sequence: 5 mM sodium phosphate (pH 7.1), PBS (0.1 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.4), ORIGEN ^TM test buffer (IGEN , Inc., Gaithersburg, MD) and PBS. Streptavidin fibrils were stored in PBS buffer for later use.

2,25 мг соединенных с NHS-эфиром фибрилл обрабатывали ультразвуком в 500 мкл 5 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,1) в течение 40 минут и супернатант выбрасывали. Фибриллы суспендировали в 500 мкл 5 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,1) и 300 мкл раствора авидина, приготовленного в том же самом буфере, содержащего 2 мг авидина (Sigma, А-9390). Эту смесь вращали при комнатной температуре еще в течение 1 ч. Фибриллы промывали 1 мл 5 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7,1) четыре раза и PBS-буфером дважды. Авидиновые фибриллы суспендировали в 200 мкл PBS-буфера для хранения. 2.25 mg of fibrils connected to NHS-ether was sonicated in 500 μl of 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.1) for 40 minutes and the supernatant was discarded. Fibrils were suspended in 500 μl of 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.1) and 300 μl of an avidin solution prepared in the same buffer containing 2 mg avidin (Sigma, A-9390). This mixture was rotated at room temperature for an additional 1 hour. The fibrils were washed with 1 ml of 5 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.1) four times and with PBS buffer twice. Avidin fibrils were suspended in 200 μl of PBS storage buffer.

Трипсин-фибриллы готовили смешиванием 1,1 мг NHS-эфирных фибрилл (обработанных, как в случае авидиновых фибрилл) и 200 мкл 1,06 мМ раствора трипсина, приготовленного в 5 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,1), и вращением при комнатной температуре в течение 6,5 часов. Затем трипсин-фибриллы промывали 1 мл 5 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,1) три раза и суспендировали в 400 мкл того же самого буфера для хранения. Trypsin fibrils were prepared by mixing 1.1 mg of NHS-ether fibrils (treated as in the case of avidin fibrils) and 200 μl of a 1.06 mM trypsin solution prepared in 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.1), and rotating at room temperature for 6.5 hours. Then trypsin fibrils were washed with 1 ml of 5 mm sodium phosphate buffer (pH 7.1) three times and suspended in 400 μl of the same storage buffer.

ПРИМЕР 22
Измерение ферментативной активности трипсина на фибриллах.EXAMPLE 22
Measurement of the enzymatic activity of trypsin on fibrils.

Трипсин может взаимодействовать с субстратом L-BAPNA (N_α-бензоил-L-аргинин-п-нитроанилид) и высвобождать окрашенное соединение, которое поглощает свет при 410 нм. Тест-буфером для этой реакции был 0,05 М Трис, 0,02 М CaCl₂, рН 8,2. Реакцию проводили в кювете на 1 мл смешиванием 5 мкл исходного раствора L-BAPNA (50 мМ в 37% ДМСО в H₂O) и 10-25 мкг трипсин-фибрилл в 1 мл тест-буфера. Увеличение поглощения при 410 нм подвергали мониторингу на протяжении 10 минут. Затем из начального наклона кривой реакции рассчитывали активность фермента (мкМ/мин).Trypsin can interact with the substrate L-BAPNA (N _α- benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide) and release a colored compound that absorbs light at 410 nm. The test buffer for this reaction was 0.05 M Tris, 0.02 M CaCl ₂ , pH 8.2. The reaction was carried out in a 1 ml cuvette by mixing 5 μl of a stock solution of L-BAPNA (50 mM in 37% DMSO in H ₂ O) and 10-25 μg trypsin-fibrils in 1 ml of test buffer. An increase in absorbance at 410 nm was monitored for 10 minutes. Then, the enzyme activity (μM / min) was calculated from the initial slope of the reaction curve.

Для фибрилл с ковалентно связанным трипсином эта активность была 5,24 мкМ/мин на 13 мкг фибрилл. Этот результат может быть преобразован в количество активного трипсина на фибриллах делением на него активности раствора трипсина известной концентрации, который при измерении показал 46 мкМ/мин на 1 мкМ трипсина при тех же самых условиях анализа. Таким образом количество активного трипсина на грамм фибрилл было 8,3 мкмоль (или 195 мг). For fibrils with covalently bound trypsin, this activity was 5.24 μM / min per 13 μg of fibrils. This result can be converted into the amount of active trypsin on fibrils by dividing the activity of a trypsin solution of known concentration on it, which when measured showed 46 μM / min per 1 μM trypsin under the same analysis conditions. Thus, the amount of active trypsin per gram of fibrils was 8.3 μmol (or 195 mg).

ПРИМЕР 23
Углеродные нанотрубки с поверхностными тиолами.EXAMPLE 23
Carbon nanotubes with surface thiols.

0,112 г амино-углеродных нанотрубок (CN), полученных модификацией этилендиамином, как описано в примере 27 (ниже), суспендировали в 20 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера с рН 8,0, содержащего 50 мМ ЭДТА. Эту суспензию обрабатывали ультразвуком при помощи ультразвукового дезинтегратора Branson 450 Watt probe sonicator в течение 5 минут для диспергирования CN. Полученная суспензия была очень густой. Через суспензию барботировали аргон в течение 30 минут при перемешивании. Добавляли 50 мг 2-иминотиолан-НСl и смеси давали реагировать в течение 70 минут при продолжающемся перемешивании в атмосфере аргона. Полученный материал фильтровали на поликарбонатный мембранный фильтр, промывали 2х буфером, 1х ДИ-водой и 2х абсолютным EtOH, все в атмосфере аргона. Модифицированные тиолом CN помещали в вакуумный эксикатор и откачивали в течение ночи. Конечный вес 0,118 г, 55% превращение в расчете на увеличение веса. 0.112 g of amino-carbon nanotubes (CNs) obtained by modification with ethylene diamine as described in Example 27 (below) were suspended in 20 ml of 0.05 M potassium phosphate buffer, pH 8.0, containing 50 mM EDTA. This suspension was sonicated using a Branson 450 Watt probe sonicator ultrasonic disintegrator for 5 minutes to disperse CN. The resulting suspension was very thick. Argon was bubbled through the suspension for 30 minutes with stirring. 50 mg of 2-iminothiolan-HCl was added and the mixture was allowed to react for 70 minutes while stirring under argon. The resulting material was filtered on a polycarbonate membrane filter, washed with 2x buffer, 1x DI-water and 2x absolute EtOH, all in an argon atmosphere. Thiol-modified CNs were placed in a vacuum desiccator and pumped overnight. Final weight 0.118 g, 55% conversion based on weight gain.

Пробу 10 мг тиолированных нанотрубок суспендировали в 10 мл ДИ-воды с обработкой ультразвуком и фильтровали на найлоновую мембрану 0,45 мкм с образованием подобного войлоку мата. Участок мата хранили в вакуумном эксикаторе до анализа при помощи ESCA, который показал 0,46% серы и 1,69% азота, что подтверждало успешное превращение в модифицированные тиолом CN. A sample of 10 mg of thiolated nanotubes was suspended in 10 ml of DI water sonicated and filtered on a 0.45 μm nylon membrane to form a felt-like mat. The mat site was stored in a vacuum desiccator until analysis using ESCA, which showed 0.46% sulfur and 1.69% nitrogen, which confirmed the successful conversion to CN modified with thiol.

ПРИМЕР 24
Присоединение модифицированных тиолом углеродных нанотрубок к золотым поверхностям.EXAMPLE 24
Attaching thiol-modified carbon nanotubes to gold surfaces.

Золотую фольгу (Alfa/Aesar), 2 см х 0,8 см, очищали раствором 1 части 30% Н₂O₂ и 3 частей концентрированной Н₂SO₄ в течение 10 минут и споласкивали ДИ-водой. Кусок фольги соединяли с соединительными проводами из Аu и подвергали электрохимическим циклам между -0,35 В против Аg/АgСl и 1,45 В против Ag/AgCl в 1 М H₂SO₄ при 50 мВ/сек, пока циклические вольтамперограммы не становились неизменяемыми, приблизительно в течение 10 минут. Большой кусок разрезали на 4 полоски (0,5 см х 0,8 см).Gold foil (Alfa / Aesar), 2 cm x 0.8 cm, was purified with a solution of 1 part 30% H ₂ O ₂ and 3 parts concentrated H ₂ SO ₄ for 10 minutes and rinsed with DI water. A piece of foil was connected to the connecting wires of Au and subjected to electrochemical cycles between -0.35 V against Ag / AgCl and 1.45 V against Ag / AgCl in 1 M H ₂ SO ₄ at 50 mV / s, until the cyclic voltammograms became unchanged for about 10 minutes. A large piece was cut into 4 strips (0.5 cm x 0.8 cm).

10 мл абсолютного EtOH, деокисленного продувкой аргоном в течение 30 минут, помещали в каждый из двух стеклянных флаконов. В одном флаконе суспендировали 16 мг модифицированных тиолом CN (CN/SH) и 2 куска Аu и в другом флаконе 1 кусок Аu и 20 мг модифицированных этилендиамином CN для получения производного тиола. Все манипуляции проводили в заполненном аргоном боксе с перчатками. Флаконы герметизировали в атмосфере аргона и помещали в охлажденную ультразвуковую баню на 1 час. Закрытые флаконы оставляли стоять при комнатной температуре в течение 72 часов. Пробы Аu удаляли из флаконов, промывали 3х EtOH, сушили на воздухе и помещали в предохраняющие флаконы. 10 ml of absolute EtOH deoxidized by purging with argon for 30 minutes was placed in each of two glass vials. In one bottle, 16 mg of thiol-modified CN (CN / SH) and 2 pieces of Au were suspended, and in another bottle, 1 piece of Au and 20 mg of ethylene-diamine CN modified to obtain a thiol derivative. All manipulations were carried out in an argon-filled box with gloves. The vials were sealed in an argon atmosphere and placed in a chilled ultrasonic bath for 1 hour. Sealed vials were allowed to stand at room temperature for 72 hours. Au samples were removed from the vials, washed with 3x EtOH, dried in air and placed in safety vials.

Пробы фольги Аu, экспонированные CN/этилендиамину и CN/SH, исследовали сканирующей электронной микроскопией (SEM) для детектирования присутствия или отсутствия CN на этой поверхности. Исследование при увеличении 40000х обнаружило присутствие CN, распределенных по поверхности, экспонированной CN/SH, и отсутствие CN на пробе Аu-фольги, экспонированной CN/этилендиамину. Au foil samples exposed to CN / ethylenediamine and CN / SH were examined by scanning electron microscopy (SEM) to detect the presence or absence of CN on this surface. A study at a magnification of 40,000x revealed the presence of CNs distributed over the surface exposed to CN / SH and the absence of CN on a sample of Au foil exposed to CN / ethylene diamine.

ПРИМЕР 25
Получение малеимид-фибрилл из амино-фибрилл.EXAMPLE 25
Obtaining maleimide fibrils from amino fibrils.

Амино-фибриллы получали в соответствии с примером 13. Затем амино-фибриллы (62,2 мг) обрабатывали ультразвуком в натрий-фосфатном буфере (5 мл, 5 мМ при рН 7,2). К суспензии фибрилл добавляли сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC; 28,8 мг, 0,66 ммоль; Pierce, Cat. No. 22360). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Фибриллы промывали водой и метанолом и полученные фибриллы сушили под вакуумом. Иммобилизация антител на этом продукте подтвердила присутствие малеимид-фибрилл. Другие малеимиды с различными линкерами (например, сульфо-SМСС, сукцинимидил-4-[п-малеимидофенил]бутират [SMPB], сульфо-SMPB, м-малеимидобензил-N-гидроксисукцинимидный эфир [MBS], сульфо-MBS и т.д.) могут быть получены согласно этому способу. Amino fibrils were prepared according to Example 13. Amino fibrils (62.2 mg) were then sonicated in sodium phosphate buffer (5 ml, 5 mM at pH 7.2). Sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC; 28.8 mg, 0.66 mmol; Pierce, Cat. No. 22360) was added to the fibril suspension. The reaction mixture was stirred overnight at room temperature. The fibrils were washed with water and methanol, and the obtained fibrils were dried under vacuum. The immobilization of antibodies on this product confirmed the presence of maleimide fibrils. Other maleimides with various linkers (for example, sulfo-SMCS, succinimidyl-4- [p-maleimidophenyl] butyrate [SMPB], sulfo-SMPB, m-maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimide ether [MBS], sulfo-MBS, etc. ) can be obtained according to this method.

Полученные малеимид-фибриллы могут быть использованы в качестве твердого носителя для ковалентной иммобилизации белков, например антител и ферментов. Антитела были ковалентно иммобилизованы на активированных малеимидом фибриллах. Емкость для антитела была 1,84 мг на 1 г фибрилл при использовании амино-фибрилл, полученных по способу нитрования/восстановления (пример 13), и 0,875 мг на 1 г фибрилл при использовании амино-фибрилл, произведенных из карбоксил-фибрилл. The resulting maleimide fibrils can be used as a solid support for covalent immobilization of proteins, such as antibodies and enzymes. Antibodies were covalently immobilized on maleimide-activated fibrils. The antibody capacity was 1.84 mg per 1 g of fibrils using amino fibrils obtained by the nitration / reduction method (Example 13), and 0.875 mg per 1 g of fibrils using amino fibrils made from carboxyl fibrils.

ПРИМЕР 26
Получение эфир/спирт-производных из функционализованных карбоновой кислотой фибрилл.EXAMPLE 26
Obtaining ether / alcohol derivatives from functionalized carboxylic acid fibrils.

Функционализованные карбоновой кислотой фибриллы получали, как в примере 14. Содержание карбоновой кислоты было 0,75 мэкв/г. Фибриллы взаимодействовали со стехиометрическим количеством CDI в инертной атмосфере с толуолом в качестве растворителя при комнатной температуре до тех пор, пока не прекращалось выделение CO₂. После этого суспензия взаимодействовала при 80^oС с 10-кратным молярным избытком полиэтиленгликоля (MB 600) и небольшим количеством NaOEt в качестве катализатора. После 2 часов реакции фибриллы отделяли фильтрованием, промывали толуолом и сушили при 100^oС.The carboxylic acid functionalized fibrils were obtained as in Example 14. The carboxylic acid content was 0.75 meq / g. The fibrils were reacted with a stoichiometric amount of CDI in an inert atmosphere with toluene as solvent at room temperature until the evolution of CO ₂ ceased. After that, the suspension was reacted at 80 ^{° C.} with a 10-fold molar excess of polyethylene glycol (MB 600) and a small amount of NaOEt as a catalyst. After 2 hours of reaction, the fibrils were separated by filtration, washed with toluene and dried at 100 ^o C.

ПРИМЕР 27
Получение амид/амин-производных из функционализованных карбоновой кислотой фибрилл (177-041-1).EXAMPLE 27
Obtaining amide / amine derivatives from carboxylic acid functionalized fibrils (177-041-1).

0,242 г окисленных хлоратом фибрилл (0,62 мэкв/г) суспендировали в 20 мл безводного диоксана с перемешиванием в круглодонной колбе на 100 мл с пробкой из серума (составной части латекса). Добавляли 20-кратный молярный избыток N-гидроксисукцинимида (0,299 г) и давали ему раствориться. Затем добавляли 20-кратный избыток 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDAC) (0,510 г) и перемешивание продолжали в течение 2 часов при комнатной температуре. В конце этого периода перемешивание останавливали и супернатант отсасывали и твердые вещества промывали безводным диоксаном и МеОН и фильтровали на полисульфоновой мембране 0,45 мкм. Твердые вещества промывали дополнительным количеством МеОН на фильтровальной мембране и сушили в вакууме, пока не переставали наблюдать дальнейшее уменьшение веса. Выход NHS-активированных окисленных фибрилл был 100% в расчете на 6% наблюдаемое увеличение веса. 0.242 g of chlorate oxidized fibrils (0.62 meq / g) was suspended in 20 ml of anhydrous dioxane with stirring in a 100 ml round bottom flask with a serum stopper (component of latex). A 20-fold molar excess of N-hydroxysuccinimide (0.299 g) was added and allowed to dissolve. Then, a 20-fold excess of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC) (0.510 g) was added and stirring was continued for 2 hours at room temperature. At the end of this period, stirring was stopped and the supernatant was suctioned off and the solids were washed with anhydrous dioxane and MeOH and filtered on a 0.45 μm polysulfone membrane. The solids were washed with additional MeOH on the filter membrane and dried in vacuo until no further weight loss was observed. The yield of NHS-activated oxidized fibrils was 100% based on the 6% observed weight gain.

К 10 мл 0,2 М NаНСО₃-буфера добавляли 100 мкл этилендиамина (en). Добавляли эквивалентный объем уксусной кислоты (НОАс) для поддержания рН около 8. NHS-активированные окисленные фибриллы (0,310 г) добавляли при интенсивном перемешивании и проводили реакцию в течение 1 часа. Добавляли дополнительно 300 мкл en и 300 мкл НОАс в течение дополнительных 10 минут. Раствор фильтровали на полисульфоновой мембране 0,45 мкм и промывали последовательно NаНСО₃-буфером, 1% НСl, DI-водой и EtOH. Твердые вещества сушили в вакууме в течение ночи. HCl-соль обратно превращали в свободный амин реакцией с NaOH (177-046-1) для последующего анализа и реакций.To 10 ml of 0.2 M NaHCO ₃ buffer was added 100 μl of ethylenediamine (en). An equivalent volume of acetic acid (HOAc) was added to maintain a pH of about 8. NHS-activated oxidized fibrils (0.310 g) were added with vigorous stirring and the reaction was carried out for 1 hour. An additional 300 μl en and 300 μl HOAc were added over an additional 10 minutes. The solution was filtered on a 0.45 μm polysulfone membrane and washed sequentially with NaHCO ₃ buffer, 1% HCl, DI water and EtOH. The solids were dried in vacuo overnight. The HCl salt was back converted to the free amine by reaction with NaOH (177-046-1) for subsequent analysis and reactions.

Проводили ESCA (ЭСХА) для определения количества N, присутствующего на аминированных фибриллах (GF/NH₂). Анализ ESCA 177-046-1 показал 0,90 ат.% N (177-059). Для дальнейшей оценки того, сколько из этого N присутствует как на доступных, так и на реакционноспособных аминогруппах, получали производное реакцией в газовой фазе с пентафторбензальдегидом для образования связей соответствующего основания Шиффа с доступными первичными аминогруппами. Анализ ESCA все еще показывал 0,91 ат.% N, как и ожидалось, и 1,68 ат.% F. Это соответствует 0,34 ат.% N, присутствующего в качестве реакционноспособного первичного амина на аминированной фибрилле (5F на молекулу пентафторбензальдегида). Уровень 0,45 ат.% мог ожидаться при предположении полной реакции со свободными концами каждого N. Наблюдаемый уровень свидетельствует об очень высоком выходе из реакции N с NHS-активированной фибриллой и подтверждает реакционную способность доступных свободных аминных групп.Conducted ESCA (ESCA) to determine the amount of N present on aminated fibrils (GF / NH ₂ ). ESCA analysis 177-046-1 showed 0.90 at.% N (177-059). To further evaluate how much of this N is present on both available and reactive amino groups, a derivative was obtained by reaction in the gas phase with pentafluorobenzaldehyde to form the bonds of the corresponding Schiff base with available primary amino groups. ESCA analysis still showed 0.91 at.% N, as expected, and 1.68 at.% F. This corresponds to 0.34 at.% N present as the reactive primary amine on the aminated fibril (5F per pentafluorobenzaldehyde molecule ) The level of 0.45 at.% Could be expected under the assumption of a complete reaction with the free ends of each N. The observed level indicates a very high yield from the reaction of N with NHS-activated fibril and confirms the reactivity of the available free amine groups.

При уровне 0,34 ат.% N, присутствующего в виде свободного амина, рассчитанном из данных ESCA, должно было бы быть почти полное покрытие фибрилл свободными аминными группами, позволяющее связывание других материалов. At a level of 0.34 at.% N present as a free amine calculated from ESCA data, there would have to be an almost complete coating of fibrils with free amine groups, allowing the binding of other materials.

Карбоксил-фибриллы превращали также в амино-фибриллы с использованием монозащищенного 1,6-диаминогексана (шестиуглеродного линкера), а не этилендиамина (двухуглеродного линкера). Carboxyl fibrils were also converted to amino fibrils using mono-protected 1,6-diaminohexane (a six-carbon linker) rather than ethylenediamine (a two-carbon linker).

ПРИМЕР 28
Получение аминопроизводных из функционализованных карбоновой кислотой фибрилл.EXAMPLE 28
Obtaining amino derivatives from fibrils functionalized by carboxylic acid.

Карбоксильные группы на фибриллах могут быть модифицированы реакцией этих карбоксильных групп с одной аминогруппой соединения, имеющего две или более аминогрупп (по меньшей мере одна из которых является не защищенной такими группами, как t-Boc или CBZ). Полученные таким образом фибриллы являются амидными производными, в которых карбонил амида произведен из карбоксильной группы фибриллы (такой как алкильная группа), содержащими один или более первичных аминов. После этого аминогруппы доступны для использования или дальнейших модификаций. Carboxyl groups on fibrils can be modified by reacting these carboxyl groups with one amino group of a compound having two or more amino groups (at least one of which is not protected by groups such as t-Boc or CBZ). The fibrils thus obtained are amide derivatives in which the amide carbonyl is derived from the carboxyl group of the fibril (such as an alkyl group) containing one or more primary amines. After that, amino groups are available for use or further modifications.

1 г углеродных фибрилл помещали в сухой стеклянный фильтр (из спекшегося стекла), выход которого плотно закрывали перегородкой из серума (составной части латекса) и добавляли безводный дихлорметан для закрывания. Добавляли N-метилморфолин (758 мкл, 7 ммоль), суспензию смешивали при помощи шпателя. Затем добавляли изобутилхлорформиат (915 мкл, 7 ммоль) и суспензию перемешивали периодически в течение 1 часа. Смесь защищали от атмосферного давления закрыванием Парафильмом настолько, насколько это было практичным. 1 g of carbon fibrils was placed in a dry glass filter (from sintered glass), the outlet of which was tightly closed with a septum (part of latex) septum and anhydrous dichloromethane was added to close. N-methylmorpholine (758 μl, 7 mmol) was added, the suspension was mixed with a spatula. Then isobutyl chloroformate (915 μl, 7 mmol) was added and the suspension was stirred periodically for 1 hour. The mixture was protected from atmospheric pressure by closing Parafilm as much as practical.

Между тем гидрохлорид N-boc-1,6-диаминогексана (1,94 г, 7,7 ммоль) распределяли между дихлорметаном (10 мл) и 1 М NaOH (10 мл). Нижнюю, органическую фазу сушили над безводным карбонатом калия и фильтровали через одноразовую пастеровскую пипетку, содержащую ватную пробку, и добавляли N-метилморфолин (758 мкл, 7 ммоль). Meanwhile, N-boc-1,6-diaminohexane hydrochloride (1.94 g, 7.7 mmol) was partitioned between dichloromethane (10 ml) and 1 M NaOH (10 ml). The lower organic phase was dried over anhydrous potassium carbonate and filtered through a disposable Pasteur pipette containing a cotton plug, and N-methylmorpholine (758 μl, 7 mmol) was added.

Перегородку из серума удаляли из фильтра, реагенты удаляли из фибрилл вакуум-фильтрованием и фибриллы промывали безводным дихлорметаном. Перегородку из серума заменяли и к фибриллам добавляли смесь N-метилморфолина и монозащищенного диаминогексана. Смесь перемешивали периодически в течение 1 часа. Затем реагенты удаляли фильтрованием и фибриллы промывали последовательно дихлорметаном, метанолом, водой, метанолом и дихлорметаном. The septum from the serum was removed from the filter, the reagents were removed from the fibrils by vacuum filtration, and the fibrils were washed with anhydrous dichloromethane. The serum septum was replaced and a mixture of N-methylmorpholine and mono-protected diaminohexane was added to the fibrils. The mixture was stirred periodically for 1 hour. Then the reagents were removed by filtration and the fibrils were washed successively with dichloromethane, methanol, water, methanol and dichloromethane.

50% смесь трифторуксусной кислоты и дихлорметана добавляли к фибриллам и смесь перемешивали периодически в течение 20 минут. Растворители удаляли фильтрованием и фибриллы промывали дихлорметаном, метанолом, водой, 0,1 М NaOH и водой. A 50% mixture of trifluoroacetic acid and dichloromethane was added to the fibrils and the mixture was stirred periodically for 20 minutes. The solvents were removed by filtration and the fibrils were washed with dichloromethane, methanol, water, 0.1 M NaOH and water.

Для определения эффективности этого способа небольшую пробу амино-фибрилл подвергали реакции с "активированной" пероксидазой хрена (HRP; 5 мг, Pierce), которая была модифицирована для специфического взаимодействия с аминогруппами. Фибриллы промывали периодически в течение нескольких дней (суспендированием, вращением и центрифугированием в эппендорфовской пробирке) с поддержанием на холоду. После приблизительно двух недель промывания фермент тестировали с H₂O₂/ABTS в глициновом буфере, рН 4,4. Зеленая окраска появлялась в растворе в пределах 10 минут, указывая на присутствие фермента. Контрольные фибриллы (СООН-фибриллы, обработанные активированной HRP и промытые в течение того же самого периода времени) показали низкую активность или отсутствие каталитической активности.To determine the effectiveness of this method, a small sample of amino fibrils was reacted with “activated” horseradish peroxidase (HRP; 5 mg, Pierce), which was modified to specifically interact with amino groups. Fibrils were washed periodically for several days (suspension, rotation and centrifugation in an Eppendorf tube), while maintaining in the cold. After approximately two weeks of washing, the enzyme was tested with H ₂ O ₂ / ABTS in glycine buffer, pH 4.4. A green color appeared in the solution within 10 minutes, indicating the presence of the enzyme. Control fibrils (COOH fibrils treated with activated HRP and washed for the same period of time) showed low activity or lack of catalytic activity.

ПРИМЕР 29
Получение силильного производного из функционализованных карбоновой кислотой фибрилл.EXAMPLE 29
Obtaining a silyl derivative from carboxylic acid functionalized fibrils.

Функционализованные кислотой фибриллы, полученные, как в примере 14, суспендировали в диоксане в инертной атмосфере. При перемешивании добавляли стехиометрическое количество хлортриэтилсилана и реакцию проводили в течение 0,5 часа, после чего добавляли несколько капель 5% раствора DABCO в диоксане. Система реагировала еще в течение 1 часа, после чего фибриллы собирали фильтрованием и промывали в диоксане. Фибриллы сушили при 100^oС в вакууме 5'' рт.ст. в течение ночи.The acid-functionalized fibrils obtained as in Example 14 were suspended in dioxane in an inert atmosphere. With stirring, a stoichiometric amount of chlorotriethylsilane was added and the reaction was carried out for 0.5 hours, after which several drops of a 5% solution of DABCO in dioxane were added. The system reacted for another 1 hour, after which the fibrils were collected by filtration and washed in dioxane. The fibrils were dried at 100 ^o C in vacuum 5 '' Hg during the night.

Таблица V суммирует получения вторичных производных. Продукты анализировали ESCA на содержание на поверхности С, О, N, Si и F. Table V summarizes the derivation of secondary derivatives. Products were analyzed by ESCA for surface content of C, O, N, Si, and F.

ПРИМЕР 30
Получение силильных производных из функционализованных карбоновой кислотой фибрилл
Функционализованные кислотой фибриллы, полученные, как в примере 14, суспендировали в диоксане в инертной атмосфере. При перемешивании добавляли стехиометрическое количество хлортриэтилсилана и реакцию проводили в течение 0,5 часа, после чего добавляли несколько капель 5% раствора DABCO в диоксане. Система реагировала еще в течение 1 часа, после чего фибриллы собирали фильтрованием и промывали в диоксане. Фибриллы сушили при 100^oС в вакууме 5'' рт.ст. в течение ночи.EXAMPLE 30
Preparation of silyl derivatives from carboxylic acid functionalized fibrils
The acid-functionalized fibrils obtained as in Example 14 were suspended in dioxane in an inert atmosphere. With stirring, a stoichiometric amount of chlorotriethylsilane was added and the reaction was carried out for 0.5 hours, after which several drops of a 5% solution of DABCO in dioxane were added. The system reacted for another 1 hour, after which the fibrils were collected by filtration and washed in dioxane. The fibrils were dried at 100 ^o C in vacuum 5 '' Hg during the night.

Таблица VI суммирует получения вторичных производных. Продукты анализировали ESCA. Анализ подтвердил включение желательных боковых групп. Продукты анализировали ESCA на содержание на поверхности С, О, N, Si и F. Table VI summarizes the production of secondary derivatives. Products were analyzed by ESCA. The analysis confirmed the inclusion of the desired side groups. Products were analyzed by ESCA for surface content of C, O, N, Si, and F.

ПРИМЕР 31
Получение производных третичных и четвертичных аминов из функционализованных карбоновой кислотой фибрилл.EXAMPLE 31
Derivation of tertiary and quaternary amines from carboxylic acid functionalized fibrils.

Функциональные группы третичных и четвертичных аминов могут быть присоединены к поверхности углеродных нанотрубок амидной или эфирной связью через карбоксильную группу на нанотрубке и либо аминогруппу, либо гидроксильную группу на предшественнике третичного или четвертичного амина. Functional groups of tertiary and quaternary amines can be attached to the surface of carbon nanotubes by an amide or ether bond via a carboxyl group on the nanotube and either an amino group or a hydroxyl group on the precursor of a tertiary or quaternary amine.

Получение предшественника в виде иодида. триэтилэтаноламина
В круглодонной колбе на 100 мл смешивали 10 г N,N-диэтилэтаноламина (85,3 ммоль) с 10 мл безводного метанола. Затем добавляли по каплям смесь 20 г этилиодида (127,95 ммоль) и 10 мл безводного метанола при помощи пипетки. Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 30 минут. При охлаждении реакционной смеси до комнатной температуры образовался белый кристаллический продукт. Белый кристаллический продукт собирали фильтрованием и промывали безводным метанолом. Продукт затем сушили в течение ночи в эксикаторе под вакуумом. Продукт (10,3 г, 37,7 ммоль) получали с выходом 33%.Obtaining the precursor in the form of iodide. triethylethanolamine
In a 100 ml round bottom flask, 10 g of N, N-diethylethanolamine (85.3 mmol) was mixed with 10 ml of anhydrous methanol. Then, a mixture of 20 g of ethyl iodide (127.95 mmol) and 10 ml of anhydrous methanol was added dropwise using a pipette. The reaction mixture was heated under reflux for 30 minutes. Upon cooling the reaction mixture to room temperature, a white crystalline product formed. A white crystalline product was collected by filtration and washed with anhydrous methanol. The product was then dried overnight in a desiccator under vacuum. The product (10.3 g, 37.7 mmol) was obtained in 33% yield.

Получение функционализованных четвертичным амином графитовых фибрилл. Preparation of graphite fibrils functionalized by quaternary amine.

В высушенном в вакууме одноразовом сцинтилляционном флаконе Wheaton смешивали 100 мг сухих карбоксил-фибрилл (~0,7 ммоль СООН на грамм фибрилл) с 2 мл безводного диметилформамида и смесь обрабатывали ультразвуком в течение 60 секунд. В реакционный флакон добавляли еще 2 мл диметилформамида, 39 мг диметиламинопиридина (0,316 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем добавляли 88 мг иодида триэтилэтаноламина и реакции давали протекать в течение ночи. Полученные фибриллы промывали три раза 20 мл диметилформамида, три раза 20 мл метанола и наконец три раза деионизованной водой. Продукт сушили под вакуумом. Результаты элементного анализа азота показали, что ~50% карбоксильных групп на фибрилле прореагировали с первичной аминогруппой в молекуле четвертичного амина. In a vacuum dried Wheaton disposable scintillation vial, 100 mg of dry carboxyl fibrils (~ 0.7 mmol COOH per gram of fibrils) were mixed with 2 ml of anhydrous dimethylformamide and the mixture was sonicated for 60 seconds. An additional 2 ml of dimethylformamide, 39 mg of dimethylaminopyridine (0.316 mmol) was added to the reaction vial. The reaction mixture was stirred for 1 hour at room temperature, then 88 mg of triethylethanolamine iodide was added and the reaction was allowed to proceed overnight. The resulting fibrils were washed three times with 20 ml of dimethylformamide, three times with 20 ml of methanol and finally three times with deionized water. The product was dried under vacuum. The results of elemental analysis of nitrogen showed that ~ 50% of the carboxyl groups on the fibril reacted with the primary amino group in the quaternary amine molecule.

ПРИМЕР 32
Хроматография бычьего сывороточного альбумина (БСА) на функционализованных третичным амином графитовых трубках.EXAMPLE 32
Chromatography of bovine serum albumin (BSA) on graphite tubes functionalized with tertiary amine.

Водной суспензии, содержащей 60 мг модифицированных 2-диэтиламиноэтиламином карбоксил-фибрилл и 180 мг смолы Sephadex G-25 superfine (Pharmacia, Uppsala, Sweden), давали стоять в течение ночи при комнатной температуре для гарантии полной гидратации твердого носителя. Суспензию упаковывали в колонку 1 см х 3,5 см. Эту колонку уравновешивали 5 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,3) при скорости тока 0,2 мл/мин. На эту колонку загружали БСА (0,6 мг в 0,1 мл деионизованной воды). Колонку элюировали 5 мМ натрий-фосфатным буфером при скорости тока 0,2 мл/мин и собирали фракции по 0,6 мл. Профиль элюции подвергали мониторингу с использованием детектора УФ-видимого света и этот профиль элюции показан на фиг.3. Как только детектор показывал, что белок больше не элюируется из колонки, связанный БСА элюировали добавлением 1 М КСl в 5 мМ фосфате натрия (рН 7,3). Присутствие белка в каждой фракции идентифицировали БСА-микротестом (Pierce, Rockford, Il). An aqueous suspension containing 60 mg of modified 2-diethylaminoethylamine carboxyl fibrils and 180 mg of Sephadex G-25 superfine resin (Pharmacia, Uppsala, Sweden) was allowed to stand overnight at room temperature to ensure complete hydration of the solid support. The suspension was packed in a 1 cm x 3.5 cm column. This column was equilibrated with 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.3) at a flow rate of 0.2 ml / min. BSA (0.6 mg in 0.1 ml of deionized water) was loaded onto this column. The column was eluted with 5 mM sodium phosphate buffer at a flow rate of 0.2 ml / min and 0.6 ml fractions were collected. The elution profile was monitored using a UV-visible light detector, and this elution profile is shown in FIG. Once the detector showed that the protein was no longer eluting from the column, bound BSA was eluted by adding 1 M KCl in 5 mM sodium phosphate (pH 7.3). The presence of protein in each fraction was identified by a BSA microtest (Pierce, Rockford, Il).

ПРИМЕР 33
Хроматография бычьего сывороточного альбумина на функционализованных четвертичным амином графитовых фибриллах.EXAMPLE 33
Chromatography of bovine serum albumin on quaternary amine functionalized graphite fibrils.

Водной суспензии, содержащей 100 мг модифицированных 2-(2-триэтиламиноэтокси)этанолом карбоксил-фибрилл и 300 мг смолы Sephadex G-25 superfine, давали стоять в течение ночи при комнатной температуре. Полученную суспензию использовали для упаковки колонки с диаметром 1 см. Эту колонку уравновешивали 5 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,3) при скорости тока 0,1-0,6 мл/мин. На эту колонку загружали БСА (2,7 мг в 0,2 мл деионизованной воды). Колонку элюировали 5 мМ натрий-фосфатным буфером при скорости тока 0,2 мл/мин и собирали фракции по 0,6 мл. Профиль элюции подвергали мониторингу с использованием детектора УФ-видимого света (фиг.4). Как только детектор показывал, что белок больше не элюируется из колонки, связанный БСА элюировали добавлением 1 М КСl в 5 мМ фосфате натрия (рН 7,3). Присутствие белка в каждой фракции идентифицировали БСА-микротестом (Pierce, Rockford, Il). An aqueous suspension containing 100 mg of modified 2- (2-triethylaminoethoxy) ethanol carboxyl fibrils and 300 mg of Sephadex G-25 superfine resin was allowed to stand overnight at room temperature. The resulting suspension was used to pack a column with a diameter of 1 cm. This column was equilibrated with 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.3) at a flow rate of 0.1-0.6 ml / min. BSA (2.7 mg in 0.2 ml of deionized water) was loaded onto this column. The column was eluted with 5 mM sodium phosphate buffer at a flow rate of 0.2 ml / min and 0.6 ml fractions were collected. The elution profile was monitored using a UV-visible light detector (FIG. 4). Once the detector showed that the protein was no longer eluting from the column, bound BSA was eluted by adding 1 M KCl in 5 mM sodium phosphate (pH 7.3). The presence of protein in each fraction was identified by a BSA microtest (Pierce, Rockford, Il).

9. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ ГРАФИТОВОГО УГЛЕРОДА
Для введения функциональных групп на поверхность графитового углерода, в частности углеродных нанотрубок, могут быть использованы биокатализаторы. До сих пор графитовый углерод модифицировали только химическими способами (см., например, US Application Serial, No. 08/352400, filed December 8, 1994). Эти химические способы имеют следующие недостатки: (1) жесткость условий (использование очень высоких температур, очень высокой кислотности или токсичных химикалиев) и (2) отсутствие специфичности (например, окисление может вводить группы СООН, СОН и СНО). Изготовлены водные суспензии твердого графитового углерода (такого как углеродные фибриллы; Hyperion, Inc.), содержащие один или несколько ферментов, которые способны использовать графитовый углерод в качестве субстрата и выполнять химическую реакцию, приводящую к химически модифицированному графитовому углероду. Водная суспензия поддерживается при условиях, приемлемых для такого фермента (ферментов) для проведения реакции (температуре, рН, концентрации соли и т.д.) в течение времени, достаточного для фермента (ферментов), чтобы каталитически модифицировать поверхность графитового углерода. Во время этой реакции суспензию непрерывно перемешивают для облегчения доступа фермента к поверхности графитового углерода. После времени реакции, достаточного для протекания реакции до удовлетворительной степени, фермент удаляют из угля при помощи промывания при фильтровании.9. ENZYMATIC FUNCTIONALIZATION OF GRAPHITE CARBON
Biocatalysts can be used to introduce functional groups onto the surface of graphite carbon, in particular carbon nanotubes. So far, graphite carbon has been modified only by chemical methods (see, for example, US Application Serial, No. 08/352400, filed December 8, 1994). These chemical methods have the following disadvantages: (1) the severity of the conditions (the use of very high temperatures, very high acidity or toxic chemicals) and (2) the lack of specificity (for example, oxidation may introduce COOH, COH and CHO groups). Aqueous suspensions of solid graphite carbon (such as carbon fibrils; Hyperion, Inc.) are prepared containing one or more enzymes that are able to use graphite carbon as a substrate and carry out a chemical reaction leading to chemically modified graphite carbon. The aqueous suspension is maintained under conditions acceptable for such an enzyme (s) for carrying out the reaction (temperature, pH, salt concentration, etc.) for a time sufficient for the enzyme (s) to catalytically modify the surface of graphite carbon. During this reaction, the suspension is continuously stirred to facilitate the access of the enzyme to the surface of carbon graphite. After a reaction time sufficient to allow the reaction to a satisfactory degree, the enzyme is removed from the coal by washing with filtration.

До настоящего времени использовали два типа ферментов: ферменты цитохрома р450 и пероксидазные ферменты. В обоих случаях типы ферментов были хорошо изученными, они используют субстраты ароматического типа и оптимальные условия реакции для них установлены. Оба типа ферментов вводят гидроксильные группы в их субстраты и могут вводить гидроксильные группы в графитовый уголь. Кроме ферментов, другие биокатализаторы, такие как рибозимы и каталитические антитела или небиологические миметики ферментов, могли бы использоваться для каталитической функционализации углеродных нанотрубок. To date, two types of enzymes have been used: cytochrome p450 enzymes and peroxidase enzymes. In both cases, the types of enzymes were well studied, they use aromatic type substrates, and the optimal reaction conditions for them are established. Both types of enzymes introduce hydroxyl groups into their substrates and can introduce hydroxyl groups into graphite coal. In addition to enzymes, other biocatalysts, such as ribozymes and catalytic antibodies or non-biological enzyme mimetics, could be used for catalytic functionalization of carbon nanotubes.

ПРИМЕР 34
Ферментативная функционализация с использованием микросом печени крыс.EXAMPLE 34
Enzymatic functionalization using rat liver microsomes.

Считается, что ферменты цитохрома р450 функционируют в печени в качестве агентов детоксикации (F. Peter Guengerich, American Scientist, 81, 440-447, и F. Peter Guengerich, J. Biol. Chem., 266, 10019-10022). Они гидроксилируют чужеродные соединения, такие как полиароматические токсичные соединения. Гидроксилирование позволяет этим соединениям становиться водорастворимыми, так что они могут удаляться из тела через мочу. В печени имеется много различных ферментов цитохрома р450, каждый из которых имеет отличающуюся субстратную специфичность. Считают, что этот широкий диапазон специфичности важен вследствие широкого диапазона токсинов окружающей среды, детоксикация которых требуется. Хотя отдельные цитохромы р450 коммерчески доступны, нет доступной информации в отношении того, могут ли они воспринимать углеродные нанотрубки в качестве субстрата. Вследствие этой неопределенности мы решили первоначально инкубировать углеродные нанотрубки с экстрактом печени крысы, содержащим много различных цитохромов р450. It is believed that p450 cytochrome enzymes function in the liver as detoxification agents (F. Peter Guengerich, American Scientist, 81, 440-447, and F. Peter Guengerich, J. Biol. Chem., 266, 10019-10022). They hydroxylate foreign compounds, such as polyaromatic toxic compounds. Hydroxylation allows these compounds to become water soluble, so that they can be removed from the body through urine. There are many different cytochrome p450 enzymes in the liver, each of which has a different substrate specificity. It is believed that this wide range of specificity is important due to the wide range of environmental toxins that require detoxification. Although individual p450 cytochromes are commercially available, there is no available information as to whether they can accept carbon nanotubes as a substrate. Due to this uncertainty, we decided to initially incubate the carbon nanotubes with rat liver extract containing many different p450 cytochromes.

Двум крысам ("экспериментальным" крысам) вводили фенобарбитал (1 г/л, рН 7,0) в воде для питья в течение одной недели для индукции экспрессии ферментов цитохрома р450. Двум другим крысам ("контрольным" крысам) давали воду без фенобарбитала. Затем крыс умерщвляли и из их печеней стандартными процедурами получали содержащие цитохром р450 микросомы (см., например, Methods in Enzymology, Vol. 206). Two rats ("experimental" rats) were injected with phenobarbital (1 g / L, pH 7.0) in drinking water for one week to induce the expression of cytochrome p450 enzymes. Two other rats ("control" rats) were given water without phenobarbital. Rats were then sacrificed and cytochrome p450-containing microsomes were prepared by standard procedures from their liver (see, for example, Methods in Enzymology, Vol. 206).

Микросомы смешивали с углеродными нанотрубками (фибриллами) для предоставления цитохромам р450 возможности реагировать с графитовым углеродом. В этих экспериментах 5 мг фибрилл (как "обыкновенных" или нефункционализованных, так и "СООН"-фибрилл или окисленных фибрилл) смешивали с микросомами (как с экспериментальными, так и с контрольными микросомами) в забуференном растворе, содержащем 0,1 М Трис, 1,0 мМ НАДФН, 0,01% NaH, 10 мМ глюкозо-6-фосфат, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (1 ед/мл), рН 7,4. НАДНФ включали в качестве косубстрата для цитохромов р450, а глюкозо-6-фосфат и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу добавляли для регенерации НАДФН из НАДФ⁺ (если НАДФ⁺ генерировался цитохромами р450). Смеси вращали при комнатной температуре в течение ~1,5 дней в микроцентрифужных пробирках. После инкубирования фибриллы интенсивно промывали в деионизованной воде, 1 М НСl, 1 М NaOH, 0,05% Тритоне Х-100, 0,05% Твине, метаноле и 1 М NaCl. После промывания микро-БСА-тест для белков (Pierce) показал, что фибриллы, по-видимому, все еще имели связанный с ними белок (хотя в промывном растворе не детектировался белок).Microsomes were mixed with carbon nanotubes (fibrils) to allow p450 cytochromes to react with graphite carbon. In these experiments, 5 mg of fibrils (both “ordinary” or non-functionalized and COOH-fibrils or oxidized fibrils) were mixed with microsomes (both experimental and control microsomes) in a buffered solution containing 0.1 M Tris, 1.0 mM NADPH, 0.01% NaH, 10 mM glucose-6-phosphate, glucose-6-phosphate dehydrogenase (1 unit / ml), pH 7.4. NADPH was included as a cosubstrate for p450 cytochromes, and glucose-6-phosphate and glucose-6-phosphate dehydrogenase were added to regenerate NADPH from NADP ⁺ (if NADP ^{+ was} generated by p450 cytochromes). The mixture was rotated at room temperature for ~ 1.5 days in microcentrifuge tubes. After incubation, the fibrils were intensively washed in deionized water, 1 M Hcl, 1 M NaOH, 0.05% Triton X-100, 0.05% Tween, methanol and 1 M NaCl. After washing, the micro-BSA protein test (Pierce) showed that the fibrils apparently still had a protein associated with them (although no protein was detected in the wash solution).

Для определения, были ли введены на поверхности фибрилл гидроксильные группы, фибриллы подвергали реакции с N-FMOC-изолейцином. Различные партии фибрилл (контрольные и экспериментальные) (по 1,5 мг каждая) взаимодействовали с 333 мкл раствора сухого ДМФ, содержащего 4,45 мг/мл FMOC-изолейцина, 1,54 мг/мл диметиламинопиридина (DMAP) и 2,6 мг/мл 1,3-дициклогексилкарбодиимида (DCC). После реакции в течение 2 дней (при непрерывном перемешивании) фибриллы промывали ДМФ, пиперидином, метанолом, водой, ДМФ, метанолом, метиленхлоридом (по 600 мкл каждого). Эту последовательность промывок повторяли три раза. Фибриллы отсылали в лаборатории Galbraith (Knoxville, TN) для аминокислотного анализа на присутствующий изолейцин. Результаты были сомнительными, поскольку, кроме изолейцина, можно было видеть много других аминокислот, что указывало на то, что белки, пептиды и аминокислоты, присутствующие в микросомных экстрактах печени крыс, не вымывались полностью из фибрилл. Таким образом, вследствие технических трудностей в промывании и анализе невозможно было определить, функционализировали цитохромы р450 эти фибриллы. To determine whether hydroxyl groups were introduced on the surface of the fibrils, the fibrils were reacted with N-FMOC-isoleucine. Different batches of fibrils (control and experimental) (1.5 mg each) interacted with 333 μl of dry DMF solution containing 4.45 mg / ml FMOC-isoleucine, 1.54 mg / ml dimethylaminopyridine (DMAP) and 2.6 mg / ml 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC). After the reaction, for 2 days (with continuous stirring), the fibrils were washed with DMF, piperidine, methanol, water, DMF, methanol, methylene chloride (600 μl each). This washing sequence was repeated three times. Fibrils were sent to the Galbraith laboratory (Knoxville, TN) for amino acid analysis for the isoleucine present. The results were doubtful, since, in addition to isoleucine, many other amino acids could be seen, indicating that the proteins, peptides and amino acids present in rat liver microsomal extracts were not completely washed out of fibrils. Thus, due to technical difficulties in washing and analysis, it was impossible to determine whether these fibrils functioned with p450 cytochromes.

ПРИМЕР 35
Функционализация фибрилл с использованием коммерчески доступных рекомбинантных ферментов цитохрома р450.EXAMPLE 35
Functionalization of fibrils using commercially available recombinant cytochrome p450 enzymes.

Во избежание примесей, связанных с использованием микросом печени в качестве источника цитохромов р450, были куплены индивидуальные ферменты цитохрома р450 (GENTEST, Woburn, МА). Поскольку ферменты цитохрома р450 активны только в связи с мембранами, эти ферменты предоставляли в виде микросомных препаратов. С применением процедуры реакции, сходной с вышеописанной, мы тестировали следующие цитохромы р450: CYP1A1 (cat. # M111b), CYP1A2 (cat. # М103с), CYP2B6 (cat. # 110a), CYP3A4 (с редуктазой, cat. # 107r). MgCl₂ (0,67 мг/мл) также включали в реакционный раствор. В этом эксперименте фибриллы промывали при помощи прибора Сокслета.In order to avoid impurities associated with the use of liver microsomes as a source of p450 cytochromes, individual cytochrome p450 enzymes were purchased (GENTEST, Woburn, MA). Since cytochrome p450 enzymes are active only in connection with membranes, these enzymes were provided in the form of microsomal preparations. Using a reaction procedure similar to the above, we tested the following p450 cytochromes: CYP1A1 (cat. # M111b), CYP1A2 (cat. # M103c), CYP2B6 (cat. # 110a), CYP3A4 (with reductase, cat. # 107r). MgCl ₂ (0.67 mg / ml) was also included in the reaction solution. In this experiment, the fibrils were washed with a Soxhlet instrument.

Анализ введенных гидроксильных групп проводили реакцией прореагировавших с цитохромом р450 промытых фибрилл с цветным реагентом 3,5-динитробензойной кислотой (DNBA). Связывание проводили, как описано выше для N-FMOC-изолейцина. После реакции с DNBA фибриллы промывали ДМФ и оставшуюся (ковалентно связанную) DNBA гидролизовали либо 6 М НСl, либо 46 ед/мл эстеразы печени свиньи (Sigma). Анализ высвобожденной DNBA проводили при помощи ВЖХ-анализа супернатанта, окружающего фибриллы, после гидролитической обработки. ВЖХ-анализ высвобожденной DNBA проводили в системе ВЖХ Waters, снабженной аналитической колонкой с обращенной фазой Vydac C18 (cat. # 218TP54) и линейным градиентом от деионизованной воды, содержащей 0,1% TFA (растворитель А), до ацетонитрила, содержащего 0,1% TFA (растворитель В). The analysis of the introduced hydroxyl groups was carried out by the reaction of washed fibrils with a colored reagent 3,5-dinitrobenzoic acid (DNBA) that reacted with cytochrome p450. Binding was carried out as described above for N-FMOC-isoleucine. After reaction with DNBA, the fibrils were washed with DMF and the remaining (covalently bound) DNBA was hydrolyzed with either 6 M Hcl or 46 u / ml pig liver esterase (Sigma). Analysis of the released DNBA was performed using an HPLC analysis of the supernatant surrounding the fibrils after hydrolytic treatment. An HPLC analysis of the released DNBA was performed on a Waters HPLC system equipped with a Vydac C18 reverse phase analytical column (cat. # 218TP54) and a linear gradient from deionized water containing 0.1% TFA (solvent A) to acetonitrile containing 0.1 % TFA (solvent B).

ПРИМЕР 36
Функционализация фибрилл при помощи пероксидазы.EXAMPLE 36
Functionalization of fibrils using peroxidase.

Описания в литературе субстратной специфичности пероксидазы указывали на то, что углеродные нанотрубки могут быть субстратами для этих ферментов (J. S. Dorick et al., Biochemistry (1986), 25, 2946-2951; D. R. Buhler et al., Arch. Biochem. Biophys. (1961), 92, 424-437; Н. S. Mason, Advances in Enzymology (1957), 19, 79; G.D. Nordblom et al., Arch. Biochem. Biophys. (1976), 175, 524-533). Для определения, может ли пероксидаза (hydrogen peroxidase, Type II, Sigma) вводить гидроксильные группы на поверхность фибрилл, фибриллы (11 мг) смешивали в растворе, содержащем 50 мМ ацетат натрия (1,25 мл, рН 5,0), пероксидазу хрена (200 нМ), и добавляли дигидроксифумаровую кислоту (15 мг) по 5 мг каждый раз в течение первых 3 часов реакции. Реакцию проводили в течение в целом 5 часов при 4^oС с периодическим барботированием газообразного кислорода. После реакции фибриллы промывали водой, 1 н. NaOH, метанолом и метиленхлоридом (по 200 мл каждого). Контрольную реакцию проводили с использованием пероксидазы, которая была инактивирована нагреванием (100^oС в течение 5 минут).The literature on the substrate specificity of peroxidase indicated that carbon nanotubes can be substrates for these enzymes (JS Dorick et al., Biochemistry (1986), 25, 2946-2951; DR Buhler et al., Arch. Biochem. Biophys. ( 1961), 92, 424-437; H. S. Mason, Advances in Enzymology (1957), 19, 79; GD Nordblom et al., Arch. Biochem. Biophys. (1976), 175, 524-533). To determine whether peroxidase (hydrogen peroxidase, Type II, Sigma) can introduce hydroxyl groups on the surface of fibrils, fibrils (11 mg) were mixed in a solution containing 50 mM sodium acetate (1.25 ml, pH 5.0), horseradish peroxidase (200 nM), and dihydroxyfumaric acid (15 mg) was added 5 mg each time during the first 3 hours of the reaction. The reaction was carried out for a total of 5 hours at 4 ^o With periodic sparging of gaseous oxygen. After the reaction, the fibrils were washed with water, 1 N. NaOH, methanol and methylene chloride (200 ml each). The control reaction was carried out using peroxidase, which was inactivated by heating (100 ^{° C.} for 5 minutes).

Для анализа степени катализируемого пероксидазой гидроксилирования фибриллы подвергали реакции с трет-бутилдиметилсилилхлоридом (Aldrich) в сухом ДМФ в присутствии имидазола. После промывания фибрилл их отсылали в Лаборатории Robertson Microlit Laboratories, Inc (Madison, NY) для элементного анализа кремния, включенного в фибриллы. Результаты анализа были сомнительными в отношении присутствия кремния на поверхности фибрилл. Считаем, что кремний из стеклянной посуды, используемой в этом эксперименте, присутствовал в виде небольших крошек в фибриллах, подвергнутых элементному анализу. Это привело к высокому уровню кремния как в экспериментальных, так и в контрольных образцах. Выводом из этого эксперимента является, что пероксидаза может быть вводила гидроксильные группы в фибриллы, но технические трудности помешали нам определить присутствие каких-либо введенных гидроксильных групп. To analyze the extent of peroxidase-catalyzed hydroxylation, the fibrils were reacted with tert-butyldimethylsilyl chloride (Aldrich) in dry DMF in the presence of imidazole. After washing the fibrils, they were sent to Robertson Microlit Laboratories, Inc. (Madison, NY) for elemental analysis of the silicon incorporated into the fibrils. The analysis results were doubtful regarding the presence of silicon on the surface of the fibrils. We believe that the silicon from the glassware used in this experiment was present in the form of small crumbs in fibrils subjected to elemental analysis. This led to a high level of silicon in both experimental and control samples. The conclusion from this experiment is that peroxidase may have introduced hydroxyl groups into fibrils, but technical difficulties prevented us from determining the presence of any introduced hydroxyl groups.

Фибриллы, функционализованные электрофильным присоединением к не содержащим кислорода поверхностям фибрилл или металлированием. Fibrils functionalized by electrophilic bonding to oxygen-free fibril surfaces or by metallization.

Первичные продукты, полученные присоединением активированных электрофилов к не содержащим кислорода поверхностям фибрилл, имеют боковые группы -СООН, -СОСl, -CN, -CH₂NH₂, -CH₂OH, -CH₂-галоген или НС=O. Они могут быть превращены во вторичные производные следующим образом.The primary products obtained by the addition of activated electrophiles to the oxygen-free surfaces of the fibrils have —COOH, —COCl, —CN, —CH ₂ NH ₂ , —CH ₂ OH, —CH ₂ -halogen or HC = O side groups. They can be converted into secondary derivatives as follows.

Фибрилла-СООН-->см. выше. Fibril-COOH -> see higher.

Фибрилла-СОСl (хлорангидрид)+HO-R-Y-->F-COO-R-Y (Sec. 4/5)
Фибрилла-COCl+NH₂-R-Y-->F-CONH-R-Y
Фибрилла-CN+H₂-->F-CH₂-NH₂
Фибрилла-CH₂NH₂+HOOC-R-Y-->F-CH₂NHCO-R-Y
Фибрилла-CH₂NH₂+O=CR-R'Y-->F-CH₂N=CR-R'-Y
Фибрилла-СН₂ОН+O(COR-Y)₂-->F-CH₂OCOR-Y
Фибрилла-СН₂ОН+HOOC-R-Y-->F-CH₂OCROR-Y
Фибрилла-СН₂-галоген+Y^--->F-CH₂-Y+X^-Y^-=NCO^-, -OR^-
Фибрилла-С=O+H₂N-R-Y-->F-C=N-R-Y
11. ДЕНДРИМЕРНЫЕ НАНОТРУБКИ
Концентрация функциональных групп на поверхности нанотрубок может быть увеличена модификацией нанотрубок рядом генерирований полифункциональным реагентом, что приводит к числу специфических функциональных групп, увеличивающемуся с каждым генерированием, с образованием дендримерподобной структуры. Полученные дендримерные нанотрубки применимы, в частности, в качестве твердого носителя, на котором могут ковалентно иммобилизоваться белки, поскольку они увеличивают плотность белка, иммобилизованного на поверхности нанотрубок. Данное изобретение демонстрирует, что высокие плотности специфической химической функциональной группы могут быть созданы на поверхности углерода с высокой площадью поверхности, что было трудным с прежними углеродами с высокой площадью поверхности.Fibril-COCOl (acid chloride) + HO-RY -> F-COO-RY (Sec. 4/5)
Fibrillar-COCl + NH ₂ -RY -> F-CONH-RY
Fibril-CN + H ₂ -> F-CH ₂ -NH ₂
Fibrillar-CH ₂ NH ₂ + HOOC-RY -> F-CH ₂ NHCO-RY
Fibrillar-CH ₂ NH ₂ + O = CR-R'Y -> F-CH ₂ N = CR-R'-Y
Fibril-CH ₂ OH + O (COR-Y) ₂ -> F-CH ₂ OCOR-Y
Fibrill-CH ₂ OH + HOOC-RY -> F-CH ₂ OCROR-Y
Fibrill-CH ₂ -halogen + Y ^- -> F-CH ₂ -Y + X ^- Y ^- = NCO ^- , -OR ^-
Fibril-C = O + H ₂ NRY -> FC = NRY
11. DENDERIMER NANOTUBES
The concentration of functional groups on the surface of nanotubes can be increased by modifying the nanotubes with a series of generations by a multifunctional reagent, which leads to the number of specific functional groups increasing with each generation, with the formation of a dendrimer-like structure. The obtained dendrimer nanotubes are applicable, in particular, as a solid support on which proteins can be covalently immobilized, since they increase the density of the protein immobilized on the surface of the nanotubes. The present invention demonstrates that high densities of a specific chemical functional group can be created on a carbon surface with a high surface area, which was difficult with previous high surface area carbon.

ПРИМЕР 37
Получение дендримеров на основе лизина.EXAMPLE 37
Obtaining dendrimers based on lysine.

Последовательность реакций показана на фиг.5. К суспензии амино-фибрилл (90 мг) в бикарбонате натрия (5 мл, 0,2 М, рН 8,6) добавляли раствор N-гидроксисукцинимидного эфира Ν_α,Ν_ε-ди-t-Вoc-L-лизина (120 мг, 0,27 ммоль) в диоксане (5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Фибриллы с защищенным трет-бутоксикарбонилом лизином тщательно промывали водой, метанолом и метиленхлоридом и сушили под вакуумом. Затем фибриллы с защищенным трет-бутоксикарбонилом лизином обрабатывали трифторуксусной кислотой (5 мл) в метиленхлориде (5 мл) в течение 2 часов при комнатной температуре. Полученные амино-лизин-фибриллы тщательно промывали метиленхлоридом, метанолом и водой и сушили под вакуумом. Получение лизин-фибрилл второго и третьего генерирований выполняли по той же самой процедуре. Результаты аминокислотного анализа показали, что лизин-фибриллы первого генерирования содержали 0,6 мкмоль лизина на грамм фибрилл, лизин-фибриллы второго генерирования содержали 1,8 мкмоль лизина на грамм фибрилл и лизин-фибриллы третьего генерирования имели 3,6 мкмоль лизина на грамм фибрилл.The sequence of reactions shown in Fig.5. To a suspension of amino-fibrils (90 mg) in sodium bicarbonate (5 ml, 0.2 M, pH 8.6) was added a solution of Ν _α , Ν _ε -di-t-Boc-L-lysine N-hydroxysuccinimide ester (120 mg 0.27 mmol) in dioxane (5 ml). The reaction mixture was stirred overnight at room temperature. Fibrils with protected tert-butoxycarbonyl lysine were thoroughly washed with water, methanol and methylene chloride and dried under vacuum. Then fibrils with protected tert-butoxycarbonyl lysine were treated with trifluoroacetic acid (5 ml) in methylene chloride (5 ml) for 2 hours at room temperature. The resulting amino-lysine fibrils were thoroughly washed with methylene chloride, methanol and water and dried under vacuum. Obtaining lysine fibrils of the second and third generations was performed according to the same procedure. The amino acid analysis showed that the first generation lysine fibrils contained 0.6 μmol of lysine per gram of fibrils, the second generation lysine fibrils contained 1.8 μm of lysine per gram of fibrils and the third generation lysine fibrils had 3.6 μmol of lysine per gram of fibrils .

Углеродные дендримерные фибриллы могут быть получены тем же самым способом с использованием аспарагиновой или глутаминовой кислоты с карбоксил-фибриллами. Carbon dendrimer fibrils can be obtained in the same way using aspartic or glutamic acid with carboxyl fibrils.

ПРИМЕР 38
Получение терминированных карбоксилатом дендримеров.EXAMPLE 38
Preparation of carboxylated terminated dendrimers.

Терминированные карбоксилатом дендримеры с состоящей из карбоновых нанотрубок (CN) центральной частью получали последовательными связываниями аминобутилнитрилотриуксусной кислоты (NTA), начиная с окисленных хлоратом углеродных нанотрубок, функционализованных NHS-эфиром. Carboxylate-terminated dendrimers with a carboxylic nanotube (CN) core were prepared by sequential binding of aminobutyl nitrilotriacetic acid (NTA), starting with chlorate-oxidized carbon nanotubes functionalized with NHS ether.

Получение NTA. Getting NTA.

NTA получали согласно способу Hochuli (E. Hochuli, Н. Dobeli and A. Schacher, J. Chromatography, 411, 177-184 (1987)), содержание которой включено здесь в качестве ссылки. NTA was obtained according to the method of Hochuli (E. Hochuli, H. Dobeli and A. Schacher, J. Chromatography, 411, 177-184 (1987)), the contents of which are incorporated herein by reference.

Получение CN/NHS. Getting CN / NHS.

CN/NHS получали согласно способу примера 20. CN / NHS was obtained according to the method of example 20.

Получение CN/NTA. Getting CN / NTA.

0,4 г NTA•HCl растворяли в 25 мл 0,2 М NaHCO₃, pH 8,1. Добавляли 1 М NaOH для возвращения pH опять до 7,8. Добавляли 0,5 г CN/NHS, смесь обрабатывали ультразвуком для диспергирования CN и полученную суспензию оставляли для прохождения реакции в течение 30 минут при перемешивании. Суспензию фильтровали на найлоновую мембрану 0,45 мкм и промывали 2х карбонатным буфером с pH 8,1 и 2х деионизованной водой на фильтре. Модифицированные CN дважды ресуспендировали в 25 мл МеОН с обработкой ультразвуком, фильтровали с получением твердого фильтровального осадка и наконец сушили в вакуумном эксикаторе.0.4 g of NTA • HCl was dissolved in 25 ml of 0.2 M NaHCO ₃ , pH 8.1. Added 1 M NaOH to return the pH again to 7.8. 0.5 g CN / NHS was added, the mixture was sonicated to disperse CN and the resulting suspension was allowed to react for 30 minutes with stirring. The suspension was filtered on a 0.45 μm nylon membrane and washed with 2x carbonate buffer at pH 8.1 and 2x deionized water on the filter. Modified CNs were resuspended twice in 25 ml MeOH with sonication, filtered to obtain a solid filter cake, and finally dried in a vacuum desiccator.

Получение CN/NTA/NTA. Getting CN / NTA / NTA.

CN/NTA сначала превращали в NHS активный эфир. 0,396 г CN/NTA сушили в термостате при 90^oС в течение 30 минут и затем помещали в круглодонную колбу на 100 мл с 30 мл безводного диоксана и продували аргоном. Добавляли 0,4 г N-гидроксисукцинимида при перемешивании с последующим добавлением 0,67 г EDC с продолжающимся перемешиванием еще в течение часа. CN стремились к агломерации в течение этого периода времени. Диоксан декантировали и твердые вещества промывали 2х20 мл безводного диоксана. Твердые вещества промывали 20 мл безводного МеОН, что разбивало агломераты. Твердые вещества фильтровали на найлоновую мембрану 0,45 мкм, ресуспендировали в МеОН, фильтровали и промывали на фильтре МеОН.CN / NTA was first converted to NHS active ester. 0.396 g of CN / NTA was dried in an oven at 90 ^{° C.} for 30 minutes and then placed in a 100 ml round bottom flask with 30 ml of anhydrous dioxane and purged with argon. 0.4 g of N-hydroxysuccinimide was added with stirring, followed by the addition of 0.67 g of EDC with continued stirring for another hour. CN sought agglomeration during this period of time. Dioxane was decanted and the solids were washed with 2 x 20 ml of anhydrous dioxane. The solids were washed with 20 ml of anhydrous MeOH, which broke agglomerates. The solids were filtered on a 0.45 μm nylon membrane, resuspended in MeOH, filtered and washed on a MeOH filter.

В колбу на 50 мл добавляли 0,2 г NTA и растворяли с 10 каплями 1 М NaOH. Добавляли 20 мл 0,2 М NаНСО₃ при рН 8,1 и затем добавляли все CN/NTA/NHS и раствор слегка обрабатывали ультразвуком с применением ультразвукового дезинтегратора (probe sonicator). Смесь оставляли для прохождения реакции на 2,5 часа при комнатной температуре. Модифицированные CN фильтровали на найлоновую мембрану 0,45 мкм, промывали 2х карбонатным буфером, ресуспендировали в ДИ-воде при обработке ультразвуком, фильтровали и промывали ДИ-водой. Затем их помещали в вакуумный эксикатор для высушивания.0.2 g of NTA was added to a 50 ml flask and dissolved with 10 drops of 1 M NaOH. 20 ml of 0.2 M NaHCO _{3 was} added at pH 8.1, and then all CN / NTA / NHS was added and the solution was slightly sonicated using an ultrasonic disintegrator (probe sonicator). The mixture was allowed to react for 2.5 hours at room temperature. Modified CNs were filtered on a 0.45 μm nylon membrane, washed with 2x carbonate buffer, resuspended in DI water by sonication, filtered and washed with DI water. Then they were placed in a vacuum desiccator for drying.

Получение CN/NTA/NTA/NTA. Getting CN / NTA / NTA / NTA.

Дополнительный уровень NTA добавляли согласно вышеописанной процедуре. An additional level of NTA was added according to the above procedure.

Получение CN/NTA/NTA/NTA/NTA. Getting CN / NTA / NTA / NTA / NTA.

Дополнительный уровень NTA добавляли согласно вышеописанной процедуре. An additional level of NTA was added according to the above procedure.

Пробы (приблизительно 10 мг) каждого из четырех генерирований NTA-присоединения суспендировали в 10 мл ДИ-воды при обработке ультразвуком и фильтровали на найлоновые мембраны 0,45 мкм с получением войлокоподобных матов. Отрезки матов хранили в вакуумном эксикаторе и анализировали при помощи ESCA на азот (N) для получения относительных количеств NTA. Результаты представлены в ниже. Samples (approximately 10 mg) of each of the four NTA-addition generations were suspended in 10 ml of DI water by sonication and filtered on 0.45 μm nylon membranes to obtain felt-like mats. Slices of mats were stored in a vacuum desiccator and analyzed using ESCA for nitrogen (N) to obtain relative amounts of NTA. The results are presented below.

Материал - %N согласно ESCA
CN/NTA - 0
CN/NTA/NTA - 1,45
CN/NTA/NTA/NTA - 1,87
CN/NTA/NTA/NTA/NTA - 2,20
Результаты ESCA подтвердили включение увеличивающихся количеств с каждым последующим генерированием.Material -% N according to ESCA
CN / NTA - 0
CN / NTA / NTA - 1.45
CN / NTA / NTA / NTA - 1.87
CN / NTA / NTA / NTA / NTA - 2.20
ESCA results confirmed the inclusion of increasing amounts with each subsequent generation.

ПРИМЕР 39
Углеродные нанотрубки-дендримеры в качестве носителей белка.EXAMPLE 39
Carbon nanotubes-dendrimers as protein carriers.

Плотность белка, иммобилизованного на углеродных нанотрубках, может быть значительно увеличена с использованием производных фибрилл, несущих дендримеры. Пероксидазу хрена (HRP) иммобилизовали на дендримерных нанотрубках согласно следующему способу. The density of a protein immobilized on carbon nanotubes can be significantly increased using derivatives of fibrils carrying dendrimers. Horseradish peroxidase (HRP) was immobilized on dendrimer nanotubes according to the following method.

Простые фибриллы (0,49 мг), амино-фибриллы (0,32 мг), лизин-фибриллы первого генерирования (0,82 мг), лизин-фибриллы второго генерирования и лизин-фибриллы третьего генерирования обрабатывали ультразвуком с натрий-бикарбонатным буфером для конъюгирования (600 мкл, 0,1 М, содержащим 0,9% NaCl) в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем их инкубировали с раствором HRP в натрий-бикарбонатном буфере для конъюгирования (490 мл, исходный раствор фермента 5,6 мг/мл) в течение 19 часов при комнатной температуре. Фибриллы с иммобилизованной HRP промывали следующим буфером (1 мл): 10 мМ NаНСО₃-буфером, содержащим 0,9% NaCl (1x-промывном буфере), семь раз, 0,1% Тритона Х-100 в 1x-промывном буфере пять раз, 50% этиленгликоле в 1x-промывном буфере три раза. Активность HRP определяли с раствором пероксида водорода (10 мкл, 10 мМ исходный раствор) и диаммониевой соли 2,2-азинобис(3-этилбензотиазолин)-6-сульфоновой кислоты (ABTS, 3 мкл, мМ исходнй раствор) в глициновом тест-буфере (50 мм, рН 4,4) при 414 нм. Результаты представлены ниже:
Фибриллы - нм HRP/г фибрилл
Простые Фиб - 3,82
Фиб-NH₂ - 8,58
Фиб-NH-Lys - 28,09
Фиб-NН-Lуs(Lуs)₂ - 28,30
Фиб-NН-Lуs(Lуs)₄ - 46,28
12. БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ФИБРИЛЛЫ
Было обнаружено, что более чем один тип функциональной группы (например, карбоксильная группа и аминогруппа) может быть введен на фибриллу одновременно путем взаимодействия функционализованной нанотрубки, например карбокси-нанотрубки, с аминокислотой. Такие бифункциональные фибриллы могут использоваться для иммобилизации многочисленных молекул, в частности, в стехиометрии 1:1, и в тесной близости.Simple fibrils (0.49 mg), amino fibrils (0.32 mg), first-generation lysine fibrils (0.82 mg), second-generation lysine fibrils and third-generation lysine fibrils were sonicated with sodium bicarbonate buffer to conjugation (600 μl, 0.1 M containing 0.9% NaCl) for 15 minutes at room temperature. Then they were incubated with a solution of HRP in sodium bicarbonate conjugation buffer (490 ml, the initial solution of the enzyme 5.6 mg / ml) for 19 hours at room temperature. Immobilized HRP fibrils were washed with the following buffer (1 ml): 10 mM NaHCO ₃ buffer containing 0.9% NaCl (1x wash buffer), seven times, 0.1% Triton X-100 in 1x wash buffer five times , 50% ethylene glycol in 1x wash buffer three times. HRP activity was determined with a solution of hydrogen peroxide (10 μl, 10 mm stock solution) and di-ammonium salt of 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline) -6-sulfonic acid (ABTS, 3 μl, mm stock solution) in glycine test buffer ( 50 mm, pH 4.4) at 414 nm. The results are presented below:
Fibrils - nm HRP / g fibrils
Simple Fib - 3.82
Fib-NH ₂ - 8.58
Fib-NH-Lys - 28.09
Fib-NH-Lus (Lus) ₂ - 28.30
Fib-NH-Lus (Lus) ₄ - 46.28
12. BIFUNCTIONAL FIBRILS
It has been found that more than one type of functional group (for example, a carboxyl group and an amino group) can be introduced onto the fibril simultaneously by reacting a functionalized nanotube, for example a carboxy nanotube, with an amino acid. Such bifunctional fibrils can be used to immobilize numerous molecules, in particular, in 1: 1 stoichiometry, and in close proximity.

ПРИМЕР 40
Получение бифункциональных фибрилл путем присоединения лизина.EXAMPLE 40
Obtaining bifunctional fibrils by attaching lysine.

Синтез бензилового эфира N_a-CBZ-L-лизина.Synthesis of N _a- CBZ-L-lysine benzyl ester.

Последовательность реакций показана на фиг.7. N_ε-(трет-Бутоксикарбонил)-L-лизин (2 г, 8,12 ммоль) растворяли в метаноле (40 мл) и воде (40 мл) и рН доводили до 8 триэтиламином. К этой смеси добавляли раствор N-(бензилоксикарбонилокси)сукцинимида в диоксане (2,4 г, 9,7 ммоль в 20 мл) и рН поддерживали при 8-9 триэтиламином. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Растворитель удаляли роторным испарением с получением неочищенного N_a-CBZ-N_ε-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина. N_ε-(трет-Бутоксикарбонил)-L-лизин обрабатывали 0,2 М карбонатом кальция (4 мл) и водный слой удаляли с получением белого твердого вещества. Твердое вещество ресуспендировали в N, N-диметилформамиде (40 мл) и бензилбромиде (1,16 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь обрабатывали этилацетатом и водой и органический слой сушили над сульфатом магния. Растворитель удаляли с получением неочищенного бензилового эфира N_α-CBZ-N_ε-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина, который очищали хроматографией на силикагеле с применением 25% гексана в этилацетате в качестве растворителя. К бензиловому эфиру N_α-CBZ-N_ε-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина (1 г, 2,2 ммоль) в метиленхлориде (10 мл) добавляли трифторуксусную кислоту при 0^oС. Реакционную смесь перемешивали в течение 10 минут при 0^oС, затем перемешивали еще в течение 2,5 часа при комнатной температуре. Растворитель удаляли с получением неочищенного продукта. Чистый бензиловый эфир N_α-CBZ-L-лизина получали хроматографией на силикагеле.The sequence of reactions shown in Fig.7. N _ε - (tert-Butoxycarbonyl) -L-lysine (2 g, 8.12 mmol) was dissolved in methanol (40 ml) and water (40 ml) and the pH was adjusted to 8 with triethylamine. To this mixture was added a solution of N- (benzyloxycarbonyloxy) succinimide in dioxane (2.4 g, 9.7 mmol in 20 ml) and the pH was maintained at 8-9 with triethylamine. The reaction mixture was stirred overnight. The solvent was removed by rotary evaporation to give crude N _a -CBZ-N _ε - (tert-butoxycarbonyl) -L-lysine. N _ε - (tert-Butoxycarbonyl) -L-lysine was treated with 0.2 M calcium carbonate (4 ml) and the aqueous layer was removed to give a white solid. The solid was resuspended in N, N-dimethylformamide (40 ml) and benzyl bromide (1.16 ml). The reaction mixture was stirred overnight at room temperature. The reaction mixture was treated with ethyl acetate and water, and the organic layer was dried over magnesium sulfate. The solvent was removed to obtain the crude N- _α- CBZ-N _ε - (tert-butoxycarbonyl) -L-lysine benzyl ester, which was purified by silica gel chromatography using 25% hexane in ethyl acetate as a solvent. Trifluoroacetic acid at 0 ^° C was added to N _α -CBZ-N _ε - (tert-butoxycarbonyl) -L-lysine benzyl ester (1 g, 2.2 mmol) in methylene chloride (10 ml). The reaction mixture was stirred for 10 minutes. at 0 ^{° C.} , then stirred for another 2.5 hours at room temperature. The solvent was removed to obtain a crude product. Pure N- _α- CBZ-L-lysine benzyl ester was obtained by silica gel chromatography.

Синтез модифицированных бензиловым эфиром N_α-CBZ-L-лизина фибрилл.Synthesis of modified with benzyl ether N _α- CBZ-L-lysine fibrils.

К суспензии карбоксил-фибрилл (300 мг) в метиленхлориде (18 мл) добавляли раствор бензилового эфира N_α-CBZ-L-лизина (148 мг, 0,32 ммоль в 20 мл метиленхлорида и 176 мкл триэтиламина). Затем добавляли НОВТ (43,3 мг, 0,32 ммоль) и TDC (61,3 мг, 0,32 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре с получением неочищенного продукта. Полученные фибриллы интенсивно промывали метанолом, метиленхлоридом и водой, затем сушили в вакууме.To a suspension of carboxyl fibrils (300 mg) in methylene chloride (18 ml) was added a solution of N _α -CBZ-L-lysine benzyl ester (148 mg, 0.32 mmol in 20 ml of methylene chloride and 176 μl of triethylamine). Then, HOBT (43.3 mg, 0.32 mmol) and TDC (61.3 mg, 0.32 mmol) were added. The reaction mixture was stirred overnight at room temperature to give a crude product. The obtained fibrils were intensively washed with methanol, methylene chloride and water, then dried in vacuum.

Синтез бифункциональных фибрилл Fib-Lys(СООН)NН₂.Synthesis of bifunctional fibrils Fib-Lys (COOH) NH ₂ .

К модифицированным бензиловым эфиром N_α-CBZ-L-лизина фибриллам (113 мг) в метаноле (4 мл) добавляли гидроксид натрия (1 н., 4 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Продукт, N_α-CBZ-L-лизин-фибриллы, интенсивно промывали водой и метанолом и эти фибриллы сушили под вакуумом. К суспензии N_α-CBZ-L-лизин-фибрилл (50 мг) в ацетонитриле (4 мл) добавляли триметилсилилиодид (1 мл). Смесь перемешивали в течение 3 часов при 40^oС. Конечные бифункциональные фибриллы интенсивно промывали водой, метанолом, 0,5 н. гидроксидом натрия, ацетонитрилом и метиленхлоридом. Аминокислотный анализ показал 0,3 мкмолей лизина на грамм фибрилл.Sodium hydroxide (1N, 4 ml) was added to the modified N _α -CBZ-L-lysine benzyl ester fibrils (113 mg) in methanol (4 ml) and the reaction mixture was stirred overnight. The product, N _α- CBZ-L-lysine fibrils, was washed extensively with water and methanol, and these fibrils were dried under vacuum. To a suspension of N _α- CBZ-L-lysine fibrils (50 mg) in acetonitrile (4 ml) was added trimethylsilyl iodide (1 ml). The mixture was stirred for 3 hours at 40 ^o C. The final bifunctional fibrils were intensively washed with water, methanol, 0.5 N. sodium hydroxide, acetonitrile and methylene chloride. Amino acid analysis showed 0.3 μmol of lysine per gram of fibrils.

Гидроксил- и карбоксил- (или амино-) бифункциональные фибриллы могут быть приготовлены способом, аналогичным описанному здесь, с применением серина, треонина или тирозина. Тиолированные и карбоксил- (или амино-) бифункциональные фибриллы могут быть приготовлены с применением цистеина. Карбоксил- и амино-бифункциональные фибриллы могут быть приготовлены с применением аспарагиновой или глутаминовой кислоты. Hydroxyl and carboxyl (or amino) bifunctional fibrils can be prepared in a similar manner to that described herein using serine, threonine or tyrosine. Thiolated and carboxyl (or amino) bifunctional fibrils can be prepared using cysteine. Carboxyl and amino bifunctional fibrils can be prepared using aspartic or glutamic acid.

ПРИМЕНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛИЗОВАННЫХ НАНОТРУБОК
Функционализованные графитовые нанотрубки применимы в качестве твердых носителей во многих биотехнологических приложениях вследствие их высокой пористости, химической стабильности и термостабильности и высокой площади поверхности. Было обнаружено, что они совместимы с жесткими химическими и термическими обработками и очень доступны для химической функционализации.APPLICATIONS OF FUNCTIONALIZED NANOTUBES
Functionalized graphite nanotubes are useful as solid supports in many biotechnological applications because of their high porosity, chemical stability and thermal stability, and high surface area. It was found that they are compatible with harsh chemical and thermal treatments and are very accessible for chemical functionalization.

Например, фермент может быть ковалентно иммобилизован на модифицированной нанотрубке с сохранением его биологической активности. Кроме того, нанотрубки пригодны также для применения в качестве носителей в аффинной хроматографии при разделении биомолекул. Например, ингибиторы ферментов на нанотрубках были получены в многостадийных синтезах, так что эти иммобилизованные ингибиторы были доступны для макромолекул и происходило обратимое специфическое узнавание между белками и модифицированными фибриллами. For example, an enzyme can be covalently immobilized on a modified nanotube while maintaining its biological activity. In addition, nanotubes are also suitable for use as carriers in affinity chromatography for the separation of biomolecules. For example, nanotube enzyme inhibitors were obtained in multistage syntheses, so that these immobilized inhibitors were available for macromolecules and specific reversible recognition occurred between proteins and modified fibrils.

Гидрофобность поверхности нанотрубок является недостаточной для иммобилизации высоких плотностей белков адсорбцией. Для увеличения гидрофобности поверхности нанотрубок и для расширения гидрофобного окружения от двух измерений до трех измерений алкильные цепи различной длины были связаны с поверхностью нанотрубок. Белки, которые были иммобилизованы на алкилированных нанотрубках, включают трипсин, щелочную фосфатазу, липазу и авидин. Ферментативные активности этих иммобилизованных белков сравнимы с активностями свободных ферментов, обнаруживаемыми по каталитической эффективности в отношении гидролиза их субстратов в водных растворах. The hydrophobicity of the surface of nanotubes is insufficient to immobilize high protein densities by adsorption. To increase the hydrophobicity of the surface of nanotubes and to expand the hydrophobic environment from two measurements to three measurements, alkyl chains of different lengths were connected to the surface of nanotubes. Proteins that have been immobilized on alkylated nanotubes include trypsin, alkaline phosphatase, lipase, and avidin. The enzymatic activity of these immobilized proteins is comparable to the activity of free enzymes, detected by catalytic efficiency in relation to the hydrolysis of their substrates in aqueous solutions.

Кроме того, были получены фенил-алкил-нанотрубки, которые являются алкил-нанотрубками с присоединенной фенильной группой на конце алкильной цепи. Эта модификация ввела ароматическую структуру, которая взаимодействует с аминокислотами - фенилаланином, тирозином и триптофаном в - белках через взаимодействия π-π. Адсорбция щелочной фосфатазы и липазы на фенил-алкил-нанотрубках сравнима с адсорбцией на С₈-алкил-нанотрубках.In addition, phenyl-alkyl-nanotubes were obtained which are alkyl-nanotubes with a phenyl group attached at the end of the alkyl chain. This modification introduced an aromatic structure that interacts with the amino acids phenylalanine, tyrosine and tryptophan in proteins through π-π interactions. Adsorption of alkaline phosphatase and lipase on phenyl-alkyl nanotubes is comparable to adsorption on C ₈ -alkyl nanotubes.

Было обнаружено также, что функционализованные фибриллы применимы в качестве твердых носителей для синтеза белка. It has also been discovered that functionalized fibrils are useful as solid carriers for protein synthesis.

1. ФУНКЦИОНАЛИЗОВАННЫЕ НАНОТРУБКИ В КАЧЕСТВЕ ТВЕРДЫХ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ФЕРМЕНТОВ
ПРИМЕР 41
Получение алкил-фибрилл.1. FUNCTIONALIZED NANOTUBES AS SOLID CARRIERS FOR ENZYMES
EXAMPLE 41
Obtaining alkyl fibrils.

Алкил-фибриллы получали реакцией 10 мг карбоксил-фибрилл, которые содержали приблизительно 0,007 ммолей -СООН-групп (10 мг фибрилл х 0,7 ммоль -СООН/мг фибрилл=0,007 ммоль), с 0,14 ммоль алкиламинов в 1,5 мл ДМФ (N,N-диметилформамиде) с использованием 0,14 ммоль EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида) и 0,14 ммоль DMAP (4-диметиламинопиридина). Химическая реакция была следующей:
Фибрилла-СООН+NH₂(CH₂)_nCH₂R (R=H или ОН)-->
Фибрилла-CONH(CH₂)_nCH₂R
При помощи этой процедуры получали несколько различных алкил-фибрилл с различной длиной алкильных цепей (n=5, 7, 9, 17; R=OH только для n=5). После перемешивания реакционной смеси при температуре окружающей среды в течение ночи фибриллы интенсивно промывали 3 х 25 мл CH₂Cl₂, 3 х 25 мл МеОН и 3 х 25 мл dН₂О. Элементный анализ содержания азота в фибриллах показал, что выходы реакции были 65-100%.Alkyl fibrils were prepared by reacting 10 mg of carboxyl fibrils, which contained approximately 0.007 mmol of —COOH groups (10 mg of fibril x 0.7 mmol —COOH / mg of fibril = 0.007 mmol), with 0.14 mmol of alkyl amines in 1.5 ml DMF (N, N-dimethylformamide) using 0.14 mmol EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) and 0.14 mmol DMAP (4-dimethylaminopyridine). The chemical reaction was as follows:
Fibril-COOH + NH ₂ (CH ₂ ) _n CH ₂ R (R = H or OH) ->
Fibril-CONH (CH ₂ ) _n CH ₂ R
Using this procedure, several different alkyl fibrils with different lengths of the alkyl chains were obtained (n = 5, 7, 9, 17; R = OH only for n = 5). After stirring the reaction mixture at ambient temperature overnight, the fibrils were intensively washed with 3 x 25 ml CH ₂ Cl ₂ , 3 x 25 ml MeOH and 3 x 25 ml dH ₂ O. An elemental analysis of the nitrogen content in the fibrils showed that the reaction yields were 65 -100%.

Адсорбция ферментов. Enzyme adsorption.

Ферменты - липаза, трипсин, щелочная фосфатаза и авидин - были иммобилизованы на алкил-фибриллах адсорбцией. Алкил-фибриллы и фермент смешивали при комнатной температуре в течение 3-4 часов с последующим промыванием 2-4 раза 5 мМ фосфатом натрия (рН 7,1). Щелочную фосфатазу иммобилизовали на С₈-фибриллах и на С₆ОН-фибриллах, трипсин на С₆-, С₈-, С₁₀- и на C₁₈-фибриллах, липазу на С₆ОНО, С₈-, С₁₀- и C₁₈-фибриллах и авидин на С₈-фибриллах. Результаты представлены в таблице 7.Enzymes — lipase, trypsin, alkaline phosphatase, and avidin — were immobilized on alkyl fibrils by adsorption. Alkyl fibrils and the enzyme were mixed at room temperature for 3-4 hours, followed by washing 2-4 times with 5 mM sodium phosphate (pH 7.1). Alkaline phosphatase was immobilized on C ₈ fibrils and on C ₆ OH fibrils, trypsin on C ₆ -, C ₈ -, C ₁₀ - and on C ₁₈ fibrils, lipase on C ₆ OH, C ₈ -, C ₁₀ - and C ₁₈ fibrils and avidin on C ₈ fibrils. The results are presented in table 7.

Было обнаружено, что кинетические свойства иммобилизованных ферментов сравнимы с кинетическими свойствами свободных ферментов, как показано в таблице 8. It was found that the kinetic properties of immobilized enzymes are comparable to the kinetic properties of free enzymes, as shown in table 8.

ПРИМЕР 42
Этерификация, катализируемая фибриллами с липазой.EXAMPLE 42
Etherification catalyzed by lipase fibrils.

Синтез этилбутирата. Synthesis of ethyl butyrate.

Липазу иммобилизовали на С₈-алкил-фибриллах согласно процедуре примера 41. Липаза-фибриллы промывали сначала диоксаном, затем смесью диоксана и гептана и наконец гептаном для диспергирования фибрилл в гептане. Для синтеза этилбутирата (пищевой добавки, которая дает ананасно-банановый вкус) этанол (0,4 М) и масляную кислоту (0,25 М) смешивали в гептане с 6,2 мкМ иммобилизованной на фибриллах липазой. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. Выход был 60% после 7 часов, его определяли измерением концентрации этанола в реакционной смеси при помощи общепринятого способа. Эта реакция и ее результаты показаны на фиг.8.The lipase was immobilized on C ₈ -alkyl fibrils according to the procedure of Example 41. The lipase-fibrils were washed first with dioxane, then with a mixture of dioxane and heptane and finally with heptane to disperse the fibrils in heptane. To synthesize ethyl butyrate (a food supplement that gives a pineapple-banana flavor), ethanol (0.4 M) and butyric acid (0.25 M) were mixed in heptane with 6.2 μM fibril immobilized lipase. The reaction mixture was stirred at room temperature. The yield was 60% after 7 hours, it was determined by measuring the concentration of ethanol in the reaction mixture using a conventional method. This reaction and its results are shown in Fig. 8.

ПРИМЕР 43
Иммобилизация щелочной фосфатазы на фенил-алкил-фибриллах.EXAMPLE 43
Immobilization of alkaline phosphatase on phenyl-alkyl fibrils.

Получение фенил-алкил-фибрилл. Obtaining phenyl-alkyl fibrils.

Фенил-алкил-фибриллы получали двумя различными реакциями. В реакции 1 смешивали 20 мг карбоксил-фибрилл (содержащих приблизительно 0,014 ммоль -СООН-групп) с 0,28 ммоль 4-фенил-бутиламина, 0,28 ммоль EDC и 0,28 ммоль DMAP (4-диметиламинопиридина) в 1,5 мл ДМФ (N,N-диметилформамиде). В реакции 2 смешивали 20 мг карбоксил-фибрилл с 0,28 ммоль 6-фенил-1-гексанола, 0,28 ммоль DCC (1,3-дициклогексилкарбодиимида) и 0,28 ммоль DMAP в 1,5 мл ДМФ. Реакции проводили при комнатной температуре с перемешиванием в течение ночи. Затем фибриллы промывали интенсивно 3 х 25 мл CH₂Cl₂, 3 х 25 мл МеОН и 3 х 25 мл dH₂O.Phenyl-alkyl fibrils were obtained in two different reactions. In reaction 1, 20 mg of carboxyl fibrils (containing approximately 0.014 mmol of —COOH groups) were mixed with 0.28 mmol of 4-phenyl-butylamine, 0.28 mmol of EDC and 0.28 mmol of DMAP (4-dimethylaminopyridine) in 1.5 ml DMF (N, N-dimethylformamide). In reaction 2, 20 mg of carboxyl fibrils were mixed with 0.28 mmol of 6-phenyl-1-hexanol, 0.28 mmol of DCC (1,3-dicyclohexylcarbodiimide) and 0.28 mmol of DMAP in 1.5 ml of DMF. The reactions were carried out at room temperature with stirring overnight. Then the fibrils were washed intensively with 3 x 25 ml of CH ₂ Cl ₂ , 3 x 25 ml of MeOH and 3 x 25 ml of dH ₂ O.

Получение фибрилл с иммобилизованной щелочной фосфатазой. Obtaining fibrils with immobilized alkaline phosphatase.

0,5 мг фенил-алкил-фибрилл суспендировали в 400 мкл 0,05 М Триса (рН 8,6) и обрабатывали ультразвуком в течение 20 минут. К этим фибриллам добавляли 150 мкл раствора щелочной фосфатазы (1,67 мг/мл в 5 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,0), смесь вращали при комнатной температуре в течение 2 часов и выдерживали при 4^oС в течение ночи. Затем фибриллы промывали 600 мкл 5 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,1) дважды и суспендировали в 200 мкл того же самого буфера.0.5 mg of phenyl-alkyl fibrils was suspended in 400 μl of 0.05 M Tris (pH 8.6) and sonicated for 20 minutes. To these fibrils were added 150 μl of a solution of alkaline phosphatase (1.67 mg / ml in 5 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0), the mixture was rotated at room temperature for 2 hours and kept at 4 ^{° C.} overnight. The fibrils were then washed with 600 μl of 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.1) twice and suspended in 200 μl of the same buffer.

Количественное определение специфически иммобилизованной щелочной фосфатазы путем измерения каталитической активности. Quantification of specifically immobilized alkaline phosphatase by measuring catalytic activity.

Щелочная фосфатаза реагирует с субстратом п-нитрофенилфосфатом и высвобождает цветное соединение, которое поглощает свет при 405 нм с коэффициентом экстинкции 18200 M^-1см^-1. Для этой реакции использовали в качестве тест-буфера 10 мМ Трис, 1 мМ MgCl₂ и 0,1 мМ ZnCl₂, рН 8,4. Реакцию проводили в кювете на 1 мл смешиванием 5 мкл исходного раствора п-нитрофенилфосфата (0,5 М в 33% ДМСО в тест-буфере) и 13 мкг фибрилл с иммобилизованной щелочной фосфатазой в 1 мл тест-буфера. Увеличение поглощения при 405 нм подвергали мониторингу с временным сканированием на протяжении 10 минут. Затем рассчитывали ферментативную активность из начального наклона кривой с использованием коэффициента экстинкции 18200 М^-1см^-1.Alkaline phosphatase reacts with p-nitrophenylphosphate substrate and releases a colored compound that absorbs light at 405 nm with an extinction coefficient of 18,200 M ^-1 cm ^-1 . For this reaction, 10 mM Tris, 1 mM MgCl ₂ and 0.1 mM ZnCl ₂ , pH 8.4, were used as test buffer. The reaction was carried out in a 1 ml cuvette by mixing 5 μl of the initial solution of p-nitrophenyl phosphate (0.5 M in 33% DMSO in the test buffer) and 13 μg of fibrils with immobilized alkaline phosphatase in 1 ml of the test buffer. The increase in absorbance at 405 nm was monitored with a temporary scan for 10 minutes. The enzymatic activity was then calculated from the initial slope of the curve using an extinction coefficient of 18,200 M ^-1 cm ^-1 .

Для щелочной фосфатазы, адсорбированной на фенил-фибриллах из реакции 1, активность была 6,95 мкМ/мин на 13 мкг фибрилл. Для щелочной фосфатазы, адсорбированной на фенил-фибриллах из реакции 2, активность была 2,58 мкМ/мин на 13 мкг фибрилл. Эти результаты соответствовали 0,63 мкмоль (или 54 мг) и 0,23 мкмоль (или 20 мг) активной щелочной фосфатазы на грамм фибрилл соответственно, как было рассчитано делением активности раствора щелочной фосфатазы известной концентрации, которая была 879,8 мкМ/мин на 1 мкМ щелочной фофатазы при тех же самых условиях теста. For alkaline phosphatase adsorbed on phenyl fibrils from reaction 1, the activity was 6.95 μM / min per 13 μg of fibrils. For alkaline phosphatase adsorbed on phenyl fibrils from reaction 2, the activity was 2.58 μM / min per 13 μg of fibrils. These results corresponded to 0.63 μmol (or 54 mg) and 0.23 μmol (or 20 mg) of active alkaline phosphatase per gram of fibrils, respectively, as was calculated by dividing the activity of an alkaline phosphatase solution of known concentration, which was 879.8 μM / min per 1 μM alkaline fofatase under the same test conditions.

ПРИМЕР 44
Иммобилизация липазы на фенил-алкил-фибриллах.EXAMPLE 44
Immobilization of lipase on phenyl-alkyl fibrils.

Получение фибрилл с иммобилизованной липазой
0,5 мг фенил-алкил-фибрилл суспендировали в 50 мкл 5 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,1), обрабатывали ультразвуком в течение 20 минут. К этим фибриллам добавляли 350 мкл раствора липазы (0,2 мМ в 5 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,1), смесь вращали при комнатной температуре в течение 5 часов и выдерживали при 4^oС в течение ночи. Затем фибриллы промывали 600 мкл 5 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,1) дважды и суспендировали в 200 мкл того же самого буфера.Obtaining fibrils with immobilized lipase
0.5 mg of phenyl-alkyl fibrils was suspended in 50 μl of 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.1), sonicated for 20 minutes. To these fibrils were added 350 μl of a lipase solution (0.2 mM in 5 mM sodium phosphate buffer, pH 7.1), the mixture was rotated at room temperature for 5 hours and kept at 4 ^{° C.} overnight. The fibrils were then washed with 600 μl of 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.1) twice and suspended in 200 μl of the same buffer.

Количественное определение специфически иммобилизованной липазы путем измерения каталитической активности. Quantification of specifically immobilized lipase by measuring catalytic activity.

Липаза реагирует с субстратом резоруфиновым эфиром 1,2-о-дилаурил-rас-глицеро-3-глутаровой кислоты и высвобождает цветное соединение, которое поглощает свет при 572 нм с коэффициентом экстинкции 60000 М^-1см^-1. Для этой реакции использовали в качестве тест-буфера 0,1 М КН₂РO₄, рН 6,8. Реакцию проводили в кювете на 1 мл смешиванием 5 мкл исходного раствора (7,6 мМ в 50% диоксане в Thesit) и 13 мкг фибрилл с иммобилизованной липазой в 1 мл тест-буфера. Увеличение поглощения при 572 нм подвергали мониторингу с временным сканированием на протяжении 10 минут. Затем рассчитывали ферментативную активность (мкМ/мин) из начального наклона кривой с использованием коэффициента экстинкции 60000 М^-1см^-1.Lipase reacts with a substrate of 1,2-o-dilauryl-rac-glycero-3-glutaric acid resorufinic ester and releases a colored compound that absorbs light at 572 nm with an extinction coefficient of 60,000 M ^-1 cm ^-1 . For this reaction, 0.1 M KH ₂ PO ₄ , pH 6.8, was used as a test buffer. The reaction was carried out in a 1 ml cuvette by mixing 5 μl of the stock solution (7.6 mm in 50% dioxane in Thesit) and 13 μg of fibrils with immobilized lipase in 1 ml of test buffer. The increase in absorbance at 572 nm was monitored with a temporary scan for 10 minutes. The enzymatic activity (μM / min) was then calculated from the initial slope of the curve using an extinction coefficient of 60,000 M ^-1 cm ^-1 .

Для липазы, адсорбированной на фенилалкил-фибриллах из реакции 1 примера 43, активность была 0,078 мкМ/мин на 13 мкг фибрилл. Для липазы, адсорбированной на фенилалкил-фибриллах из реакции 2 примера 43, активность была 0,054 мкМ/мин на 13 мкг фибрилл. Эти результаты соответствовали 4,7 мкмоль (или 564 мг) и 3,3 мкмоль (или 396 мг) активной липазы на грамм фибрилл соответственно, как было рассчитано делением активности раствора липазы известной концентрации, которая была 1,3 мкМ/мин на 1 мкМ щелочной фосфатазы при тех же самых условиях теста. For the lipase adsorbed on phenylalkyl fibrils from reaction 1 of Example 43, the activity was 0.078 μM / min per 13 μg of fibrils. For the lipase adsorbed on the phenylalkyl fibrils from reaction 2 of Example 43, the activity was 0.054 μM / min per 13 μg of fibrils. These results corresponded to 4.7 μmol (or 564 mg) and 3.3 μmol (or 396 mg) of active lipase per gram of fibrils, respectively, as calculated by dividing the activity of a known concentration of lipase solution, which was 1.3 μM / min per 1 μM alkaline phosphatase under the same test conditions.

ПРИМЕР 45
Иммобилизация пероксидазы хрена (HRP) на модифицированных амино-алкилом фибриллах.EXAMPLE 45
Immobilization of horseradish peroxidase (HRP) on amino-alkyl modified fibrils.

Получение функционализованных карбоновой кислотой фибрилл (карбоксил-фибрилл). Obtaining functionalized carboxylic acid fibrils (carboxyl fibrils).

Пробу 10,0 г графитовых фибрилл суспендировали в 450 мл концентрированной Н₂SO₄ смешиванием шпателем и затем переносили в реакторную колбу, снабженную входным/выходным отверстиями и верхней мешалкой. При перемешивании и медленном токе аргона добавляли загрузку 8,68 г NаСlО₃ порциями при комнатной температуре на протяжении периода 24 часов. Пары хлора, которые генерировались во время всего протекания этого опыта, выгонялись из реактора в улавливатель с водным раствором NaOH. В конце реакции суспензию фибрилл выливали на раздробленный лед и вакуум-фильтровали. Затем фильтровальный осадок переносили в муфту Сокслета и промывали в экстракторе Сокслета деионизованной водой, с заменой воды свежей деионизованной водой каждые несколько часов. Промывание продолжали, пока проба фибрилл при добавлении свежей деионизованной воды не переставала изменять рН этой воды. Затем карбоксилированные фибриллы извлекали фильтрованием и сушили в течение ночи при 100^oС и вакууме 5'' рт. ст. Выход был 10,0 г.A sample of 10.0 g of graphite fibrils was suspended in 450 ml of concentrated H ₂ SO _{4 by} mixing with a spatula and then transferred to a reactor flask equipped with an inlet / outlet and an overhead stirrer. With stirring and a slow flow of argon, a charge of 8.68 g of NaCl _{3 was} added in portions at room temperature over a period of 24 hours. The chlorine vapors that were generated during the entire course of this experiment were expelled from the reactor to a trap with an aqueous solution of NaOH. At the end of the reaction, the fibril suspension was poured onto crushed ice and vacuum filtered. The filter cake was then transferred to a Soxhlet coupling and washed in a Soxhlet extractor with deionized water, with the water replaced with fresh deionized water every few hours. Washing was continued until the fibril sample when adding fresh deionized water ceased to change the pH of this water. Then, the carboxylated fibrils were recovered by filtration and dried overnight at 100 ^{° C.} and 5 'mercury vacuum. Art. The yield was 10.0 g.

Получение фибрилл с иммобилизованной HRP. Getting fibrils with immobilized HRP.

Амино-фибриллы, полученные из 1,6-диаминогексана согласно способу примера 27 (1,2 мг), добавляли к буферу для конъюгирования (0,1 М NаНСО₃, 0,9% NaCl, pH 9,5) и суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 20 минут. Затем фибриллы промывали дважды буфером для конъюгирования в пробирке Эппендорфа и суспендировали в 430 мкл буфера для конъюгирования. Аликвоту 50 мкл этой суспензии (0,14 мг фибрилл) смешивали с 4,0 мг активированной HRP (Pierce, Rockford, IL), растворенной в 50 мкл деионизованной воды, и полученную суспензию вращали в течение ночи при 4^oС. HRP-конъюгированные фибриллы промывали интенсивно в центрифужной пробирке Эппендорфа комбинированием следующих растворов: буфера для конъюгирования, промывного буфера (20 мМ КН₂РO₄, 0,45% NaCl, pH 6,2), промывного буфера, содержащего 0,03-0,1% Тритон Х-100, и промывного буфера, содержащего 50% этиленгликоль. В качестве контроля идентичные манипуляции проводили с активированной HRP с обычными (немодифицированными) фибриллами, которые показали, что присоединение HRP к амино-фибриллам происходило действительно посредством ковалентного связывания.Amino fibrils obtained from 1,6-diaminohexane according to the method of Example 27 (1.2 mg) were added to conjugation buffer (0.1 M NaHCO ₃ , 0.9% NaCl, pH 9.5) and the suspension was sonicated for 20 minutes. The fibrils were then washed twice with conjugation buffer in an Eppendorf tube and suspended in 430 μl of conjugation buffer. An aliquot of 50 μl of this suspension (0.14 mg of fibrils) was mixed with 4.0 mg of activated HRP (Pierce, Rockford, IL) dissolved in 50 μl of deionized water, and the resulting suspension was rotated overnight at 4 ^° C. HRP-conjugated the fibrils were washed intensively in an Eppendorf centrifuge tube by combining the following solutions: conjugation buffer, washing buffer (20 mM KH ₂ PO ₄ , 0.45% NaCl, pH 6.2), washing buffer containing 0.03-0.1% Triton X-100, and wash buffer containing 50% ethylene glycol. As a control, identical manipulations were performed with activated HRP with conventional (unmodified) fibrils, which showed that the attachment of HRP to amino fibrils actually occurred through covalent binding.

Количественное определение специфически иммобилизованной HRP путем измерения каталитической активности. Quantification of specifically immobilized HRP by measuring catalytic activity.

Интенсивное промывание удаляло большую часть неспецифически связанного фермента. Иммобилизованную активную HRP количественно определяли по превращению субстрата с использованием H₂O₂ и хромогенного субстрата диаммониевой соли 2,2'-азинобис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) (ABTS). Каталитическую активность HRP подвергали спектрофотометрическому мониторингу при 414 нм с использованием 100 мкМ Н₂O₂ и 30 мкМ ABTS в качестве субстратов. Общее количество фермента, связанного с амино-фибриллами, в этих предварительных исследованиях было 0,0230 мкмоль HRP/г фибрилл. В сравнении с этим контроль (обычные фибриллы) не специфически связывал 0,0048 мкмоль HRP/г фибрилл. Путем вычитания получали количество ковалентно (специфически) связанной HRP 0,0182 мкмоль/г фибрилл.Intensive washing removed most of the non-specifically bound enzyme. Immobilized active HRP was quantified by substrate conversion using H ₂ O ₂ and a chromogenic substrate of 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS). The catalytic activity of HRP was spectrophotometrically monitored at 414 nm using 100 μM H ₂ O ₂ and 30 μM ABTS as substrates. The total amount of enzyme bound to amino fibrils in these preliminary studies was 0.0230 µmol HRP / g fibrils. In comparison, the control (conventional fibrils) did not specifically bind 0.0048 μmol HRP / g fibrils. By subtraction, the amount of covalently (specifically) bound HRP was 0.0182 μmol / g fibrils.

ПРИМЕР 46
Разделение аффинной хроматографией щелочной фосфатазы (АР) и β-галактозидазы (βG) на фибриллах, несущих иммобилизованные ингибиторы ферментов.EXAMPLE 46
Separation by alkaline phosphatase (AR) and β-galactosidase (βG) affinity chromatography on fibrils carrying immobilized enzyme inhibitors.

Получение фибрилл с ингибитором щелочной фосфатазы. Obtaining fibrils with an alkaline phosphatase inhibitor.

Получение модифицированных АР-ингибитором фибрилл было основано на способе Brenna et al. (1975), Biochem. J., 151:291-296. The preparation of AP-modified fibril inhibitors was based on the method of Brenna et al. (1975), Biochem. J., 151: 291-296.

Карбоксилированные фибриллы использовали для получения NHS-эфир-фибрилл, как описано в примере 50. NHS-Эфир-фибриллы (114 мг) суспендировали в 4 мл ацетона и добавляли 10 эквивалентов (на основании оценки 0,7 мэкв NHS-эфира на грамм фибрилл) тирамина. Добавляли сухой триэтиламин (10 экв.) и смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Тираминилированные фибриллы промывали под вакуумом на стеклянном фильтре (из спекшегося стекла) сначала ацетоном, затем интенсивно деионизованной водой. Carboxylated fibrils were used to prepare NHS-ether-fibrils as described in Example 50. NHS-Ether-fibrils (114 mg) were suspended in 4 ml of acetone and 10 equivalents were added (based on an estimate of 0.7 meq of NHS-ether per gram of fibrils) tyramine. Dry triethylamine (10 equiv.) Was added and the mixture was stirred for 3 hours at room temperature. Tyraminylated fibrils were washed in vacuo on a glass filter (sintered glass), first with acetone, then with intensively deionized water.

4-(п-Аминофенилазо)фениларсоновую кислоту (66 мг) суспендировали в 4 мл 1 н. НСl. Суспензию охлаждали до 4^oС и смешивали медленно с 0,36 мл 0,5 М NaNO₂. После 15 минут смесь арсоновая кислота/NаNО₂ добавляли к тираминилированным фибриллам, которые суспендировали в 10 мл 0,1 М NаСО₃ (рН 10,0). Реакционную смесь (рН~10) перемешивали в течение ночи при 4^oС. Затем фибриллы обрабатывали последовательными промывками 0,1 М Nа₂СО₃ (рН 10,0), 8 М гуанидин-HCl, 25 мМ NaOH и водой, пока эффлюент не становился прозрачным. Атомный абсорбционный анализ мышьяка в АР-ингибитор-фибриллах был проведен Galbraith Laboratories (Knoxville, TN). Было обнаружено атомным абсорбционным анализом, что АР-ингибитор-фибриллы имеют содержание мышьяка 0,4%. Это указывает на то, что при грубой оценке 10% оцененных первоначальных групп СООН были превращены в АР-ингибиторы в этом многостадийном синтезе. При расчете на площадь поверхности фибрилл это означает, что одна молекула ингибитора (сайта связывания фермента) приходится на каждые 500 ангстрем площади поверхности.4- (p-Aminophenylazo) phenylarsonic acid (66 mg) was suspended in 4 ml of 1 N. Hcl. The suspension was cooled to 4 ^{° C.} and mixed slowly with 0.36 ml of 0.5 M NaNO ₂ . After 15 minutes, a mixture of arsonic acid / NaNO _{2 was} added to tyraminylated fibrils, which were suspended in 10 ml of 0.1 M NaCO ₃ (pH 10.0). The reaction mixture (pH ~ 10) was stirred overnight at 4 ^° C. Then the fibrils were treated with successive washes with 0.1 M Na ₂ CO ₃ (pH 10.0), 8 M guanidine-HCl, 25 mM NaOH and water, until the effluent did not become transparent. Atomic absorption analysis of arsenic in AP inhibitor fibrils was performed by Galbraith Laboratories (Knoxville, TN). It was discovered by atomic absorption analysis that AP inhibitor fibrils have an arsenic content of 0.4%. This indicates that, with a rough estimate, 10% of the estimated initial COOH groups were converted to AR inhibitors in this multistage synthesis. When calculating the surface area of fibrils, this means that one molecule of the inhibitor (enzyme binding site) occurs for every 500 angstroms of surface area.

Получение фибрилл с ингибитором β-галактозидазы. Obtaining fibrils with a β-galactosidase inhibitor.

Модифицированные п-амино-фенил-β-D-тиогалактозидом (TPEG) фибриллы получали на основе способа Ullman (1984), Gene, 29:27-31. К 8 мг карбоксилированных фибрилл в 0,2 мл деионизованной воды добавляли 2,24 мг TPEG. рН суспензии доводили до 4,0 0,1 М НС1 и добавляли 15 мг EDAC. Смесь перемешивали в течение 3 часов при рН 4,0 и при комнатной температуре. Реакцию останавливали быстрым центрифугированием в пробирке Эппендорфа и удалением жидкости, β-галактозидаза-фибриллы промывали пять раз повторяющимся ресуспендированием в деионизованной воде и центрифугированием. Modified p-amino-phenyl-β-D-thiogalactoside (TPEG) fibrils were obtained based on the method of Ullman (1984), Gene, 29: 27-31. To 8 mg of carboxylated fibrils in 0.2 ml of deionized water was added 2.24 mg of TPEG. The pH of the suspension was adjusted to 4.0 with 0.1 M HCl and 15 mg of EDAC was added. The mixture was stirred for 3 hours at pH 4.0 and at room temperature. The reaction was stopped by rapid centrifugation in an Eppendorf tube and removing the liquid, β-galactosidase-fibrils were washed five times with repeated resuspension in deionized water and centrifugation.

Афинные разделения. Athenian divisions.

Смеси щелочной фосфатазы (АР) (из E.coli, Type III; Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) и β-галактозидазы (βG) (из E.coli; Calbiochem. La Jolla, CA) разделяли сериями на АР-ингибитор-фибриллах или на βG-ингибитор-фибриллах в микроцентрифужных пробирках Эппендорфа. Для аффинных разделений к 0,8-1,0 мг либо АР-, либо βG-ингибитор-фибрилл добавляли 1,0 мл растворов загрузочного буфера (200 мМ Трис, 10 мМ MgCl₂, 1,6 М NaCl, 10 мМ цистеин, рН 7,4), содержащих как АР (обычно приблизительно 10 единиц), так и βG (обычно приблизительно 280 единиц). Полученные суспензии осторожно перемешивали на вортексе, затем вращали при комнатной температуре в течение 2 часов. После связывания ферментов фибриллы осаждали непродолжительным центрифугированием в настольной центрифуге и жидкую фазу, содержащую несвязанный фермент, оттягивали и сохраняли для определения активности фермента. Промывки (7 х 1,0 мл) загрузочным буфером проводили путем повторяющегося добавления буфера, осторожного перемешивания на вортексе, 15-минутного вращения, непродолжительного центрифугирования и оттягивания растворителя пастеровской пипеткой. После седьмой промывки те же самые манипуляции повторяемо проводили (5 х 1,0 мл) с соответствующим буфером для элюции либо для βG-ингибитор-фибрилл (100 мМ борат натрия, 10 мМ цистеин, рН 10,0), либо для АР-ингибитор-фибрилл (40 мМ NaHPO₄, 10 мМ Трис, 1,0 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ZnCl₂, pH 8,4).Mixtures of alkaline phosphatase (AP) (from E. coli, Type III; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) and β-galactosidase (βG) (from E. coli; Calbiochem. La Jolla, CA) were serialized into AP -inhibitor fibrils or on βG-inhibitor fibrils in Eppendorf microcentrifuge tubes. For affinity separations, 0.8 ml of loading buffer solutions (200 mM Tris, 10 mM MgCl ₂ , 1.6 M NaCl, 10 mM cysteine, were added to 0.8-1.0 mg of either AP or βG inhibitor fibrils) pH 7.4) containing both AR (usually about 10 units) and βG (usually about 280 units). The resulting suspensions were carefully mixed on a vortex, then rotated at room temperature for 2 hours. After enzyme binding, the fibrils were besieged by brief centrifugation in a benchtop centrifuge and the liquid phase containing the unbound enzyme was drawn off and stored to determine the enzyme activity. Washings (7 x 1.0 ml) with loading buffer were carried out by repeated addition of the buffer, gentle vortexing, 15 minutes rotation, short centrifugation and drawing off the solvent with a Pasteur pipette. After the seventh wash, the same manipulations were repeated (5 x 1.0 ml) with the appropriate elution buffer for either βG-inhibitor-fibrils (100 mM sodium borate, 10 mM cysteine, pH 10.0), or for the AR inhibitor -fibrils (40 mM NaHPO ₄ , 10 mM Tris, 1.0 mM MgCl ₂ , 0.1 mM ZnCl ₂ , pH 8.4).

Все фракции (несвязанный фермент, промывки и элюции) оценивали как на АР-, так и на βG-активность. Активность щелочной фосфатазы определяли спектрофотометрическим мониторингом скорости гидролиза 500 мкМ п-нитрофенилфосфата (PNPP) при 410 нм (Δε=18000 М^-1см^-1). Измерения активности щелочной фосфатазы проводили в 10 мМ Трис, 1,0 мМ MgCl₂ и 0,1 мМ ZnCl₂ при рН 8,4. β-Галактозидазу тестировали спектрофотометрическим мониторингом способности фермента гидролизовать 2-нитро-галакто-β-D-пиранозид (ONPG). Начальные скорости катализируемого β-галактозидазой гидролиза 5,0 мМ ONPG измеряли при 405 нм (Δε=3500 M^-1см^-1) в 10 мм Трис, 10 мМ MgCl₂, 1,6 М NaCl, 10 мМ цистеине, рН 7,4.All fractions (unbound enzyme, washing and elution) were evaluated for both AP and βG activity. Alkaline phosphatase activity was determined by spectrophotometric monitoring of the hydrolysis rate of 500 μM p-nitrophenyl phosphate (PNPP) at 410 nm (Δε = 18000 M ^-1 cm ^-1 ). Alkaline phosphatase activity was measured in 10 mM Tris, 1.0 mM MgCl ₂ and 0.1 mM ZnCl ₂ at pH 8.4. β-Galactosidase was tested by spectrophotometric monitoring of the enzyme's ability to hydrolyze 2-nitro-galacto-β-D-pyranoside (ONPG). Initial rates of β-galactosidase-catalyzed hydrolysis of 5.0 mM ONPG were measured at 405 nm (Δε = 3500 M ⁻¹ cm ⁻¹ ) in 10 mm Tris, 10 mM MgCl ₂ , 1.6 M NaCl, 10 mM cysteine, pH 7, 4.

Как для АР-ингибитор-фибрилл, так и для βG-ингибитор-фибрилл добавляли смесь АР и βG. Для облегчения определений способности специфического связывания концентрации добавленных ферментов были в большом избытке относительно концентраций иммобилизованного ингибитора. Для АР-ингибитор-фибрилл было связано 0,550 мкмоль АР/г фибрилл (в противоположность неспецифическому связыванию 0,020 мкмоль βG/г фибрилл). Для βG-ингибитор-фибрилл эта способность была 0,093 мкмоль βG/г фибрилл (в противоположность неспецифическому связыванию 0,012 АР/г фибрилл). Результаты экспериментов с аффинной хроматографией показаны на фиг. 9 и 10. АР-ингибитор-фибриллы не связывали ощутимо βG, но связывали АР, которая специфически элюировалась при добавлении к буферу 40 мМ фосфата, конкурентного ингибитора (фиг.9). Фибриллы, модифицированные βG-ингибитором, не связывали значительных количеств АР, но связывали βG, которая специфически элюировалась при повышении рН для ослабления связи фермент-ингибитор (фиг.10). Эти результаты показывают, что ингибиторы были успешно ковалентно присоединены к этим фибриллам, что иммобилизованные ингибиторы были доступны для больших молекул, что ингибиторы были приемлемы для специфического связывания ферментов и что, при специфическом связывании, ферменты оставались активными. На фиг.10 видно, что, по-видимому, продолжалось вымывание βG из βG-ингибитор-фибрилл. Это может быть скорее результатом природной слабой аффинности фермента-ингибитора, чем дефектом фибрилл, поскольку такое явление не наблюдается на фиг.9 с АР-ингибитор-фибриллами. For both AP inhibitor fibrils and βG inhibitor fibrils, a mixture of AP and βG was added. To facilitate determination of the specific binding ability, the concentrations of the added enzymes were in large excess relative to the concentrations of the immobilized inhibitor. For AR inhibitor fibrils, 0.550 μmol of AP / g of fibrils was bound (as opposed to nonspecific binding of 0.020 μmol of βG / g of fibrils). For βG-inhibitor fibrils, this ability was 0.093 μmol βG / g of fibrils (as opposed to non-specific binding of 0.012 AP / g of fibrils). The results of affinity chromatography experiments are shown in FIG. 9 and 10. AP inhibitor fibrils did not significantly bind βG, but they bound AP, which specifically eluted when 40 mM phosphate, a competitive inhibitor, was added to the buffer (Fig. 9). The fibrils modified with the βG inhibitor did not bind significant amounts of AP, but bound βG, which specifically eluted with increasing pH to weaken the enzyme-inhibitor bond (Fig. 10). These results show that inhibitors were successfully covalently attached to these fibrils, that immobilized inhibitors were available for large molecules, that inhibitors were acceptable for specific binding of enzymes, and that, with specific binding, enzymes remained active. Figure 10 shows that, apparently, the washing out of βG from βG-inhibitor fibrils continued. This may be the result of the natural weak affinity of the inhibitor enzyme rather than a defect in fibrils, since this phenomenon is not observed in FIG. 9 with AP inhibitor fibrils.

2. ФУНКЦИОНАЛИЗОВАННЫЕ НАНОТРУБКИ В КАЧЕСТВЕ ТВЕРДЫХ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ АНТИТЕЛ
Было обнаружено, что антитела могут быть иммобилизованы на функционализованных нанотрубках и что такие антитела-нанотрубки имеют уникальные преимущества для многих приложений благодаря их высокой площади поверхности на вес, электропроводимости и химической и физической стабильности. Например, антитела-нанотрубки могут использоваться в качестве аффинных реагентов для молекулярных разделений. Антитела-нанотрубки применимы также для аналитических приложений, в том числе для диагностических иммуноанализов, таких как иммуноанализы на основе ECL.2. FUNCTIONALIZED NANOTUBES AS SOLID CARRIERS FOR ANTIBODIES
It has been found that antibodies can be immobilized on functionalized nanotubes and that such nanotube antibodies have unique advantages for many applications due to their high surface area by weight, electrical conductivity and chemical and physical stability. For example, antibody nanotubes can be used as affinity reagents for molecular separation. Nanotube antibodies are also useful for analytical applications, including diagnostic immunoassays, such as ECL-based immunoassays.

Антитела могут быть иммобилизованы либо ковалентным связыванием, либо нековалентной адсорбцией. Ковалентную иммобилизацию выполняют различными способами, в том числе восстановительным аминированием углеводных групп антител, NHS-эфирной активацией карбоксилированных фибрилл (см. пример 27, выше) и реакцией тиолированных или малеимидо-фибрилл с восстановленными или малеимидо-модифицированными антителами (см. примеры 23 и 25 выше). Antibodies can be immobilized either by covalent binding or non-covalent adsorption. Covalent immobilization is performed in various ways, including reductive amination of the carbohydrate groups of antibodies, NHS-ether activation of carboxylated fibrils (see example 27 above) and the reaction of thiolated or maleimido fibrils with reduced or maleimido-modified antibodies (see examples 23 and 25 higher).

Наилучший способ присоединения антител к нанотрубкам будет зависеть от приложения, в котором они должны использоваться. Для разделений предпочтительным способом может быть нековалентная адсорбция, так как способность связывания белка является, по-видимому, наивысшей для этого способа. Для способов с участием ECL, где может быть важной электропроводимость фибрилл, могут быть предпочтительными ковалентные способы (алкильные придатки являются слабыми электрическими проводниками и можно ожидать, что они изолируют фибриллы). Восстановительное аминирование может быть наилучшим способом ковалентного присоединения антител к фибриллам, поскольку при использовании этого способа антитела правильно ориентированы, так что их сайты связывания направлены кнаружи (прочь от фибрилл). The best way to attach antibodies to nanotubes will depend on the application in which they are to be used. For separations, non-covalent adsorption may be the preferred method, since the protein binding capacity is apparently the highest for this method. For ECL methods, where the conductivity of fibrils may be important, covalent methods may be preferred (alkyl appendages are weak electrical conductors and can be expected to isolate fibrils). Reductive amination may be the best way to covalently attach antibodies to fibrils, because when using this method, the antibodies are correctly oriented so that their binding sites are directed outward (away from the fibrils).

3. ПРИСОЕДИНЕНИЕ НАД⁺ К ФУНКЦИОНАЛИЗОВАННЫМ НАНОТРУБКАМ
Было обнаружено, что кофакторы, такие как НАД⁺, могут быть присоединены и использованы в качестве твердого носителя для биоспецифической аффинной хроматографии белков, которые связываются с кофакторами ферментов. Например, НАД⁺-фибриллы использовали в качестве твердого носителя для очистки дегидрогеназы. Основным преимуществом использования фибрилл является большой размер доступной площади поверхности. Аффинный матрикс с высокой площадью поверхности является желательным вследствие высокой потенциальной емкости. Фибриллы могут быть дисперсией или могут быть фиксированы помещением в колонку или в мат.3. JOINING OVER ⁺ TO FUNCTIONALIZED NANOTUBES
It has been found that cofactors, such as NAD ⁺ , can be attached and used as a solid support for biospecific affinity chromatography of proteins that bind to cofactors of enzymes. For example, NAD ⁺ fibrils were used as a solid support for the purification of dehydrogenase. The main advantage of using fibrils is the large size of the available surface area. A high surface area affinity matrix is desirable due to its high potential capacity. Fibrils may be dispersion or may be fixed by placement in a column or mat.

ПРИМЕР 47
Аффинно-хроматографическое разделение дегидрогеназ на НАД⁺-фибриллах.EXAMPLE 47
Affinity chromatographic separation of dehydrogenases on NAD ⁺ fibrils.

Получение НАД⁺-фибрилл.Obtaining NAD ⁺ -fibrils.

Фибриллы окисляли для введения карбоксильных групп в соответствии с примерами 14 и 15. К суспензии фибрилл (31 мг) в растворе бикарбоната натрия (3 мл, 0,2 М, рН 8,6) добавляли раствор литиевой соли N⁶-[аминогексил]карбамоилметил)никотин-амидадениндинуклеотида (25 мг из Sigma в 5 мл раствора бикарбоната натрия). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Полученные фибриллы интенсивно промывали водой, N,N-диметилформамидом и метанолом. Результаты элементного анализа показали, что полученные фибриллы содержали 130 ммолей молекул НАД на грамм фибрилл согласно анализу азота и 147 ммолей молекул НАД на грамм фибрилл согласно анализу фосфора. Другие аналоги НАД⁺, имеющие линкеры, заканчивающиеся в аминогруппе, могут быть использованы для получения НАД⁺-фибрилл.The fibrils were oxidized to introduce carboxyl groups in accordance with Examples 14 and 15. To a suspension of fibrils (31 mg) in a solution of sodium bicarbonate (3 ml, 0.2 M, pH 8.6) was added a solution of lithium salt N ⁶ - [aminohexyl] carbamoylmethyl ) nicotine amide adenine dinucleotide (25 mg from Sigma in 5 ml of sodium bicarbonate solution). The reaction mixture was stirred overnight at room temperature. The resulting fibrils were washed extensively with water, N, N-dimethylformamide and methanol. The results of elemental analysis showed that the obtained fibrils contained 130 mmol of NAD molecules per gram of fibrils according to the analysis of nitrogen and 147 mmoles of NAD molecules per gram of fibrils according to the analysis of phosphorus. Other NAD ⁺ analogues having linkers terminating in the amino group can be used to produce NAD ⁺ fibrils.

Аффинное разделение. Affinity separation.

Фибриллы с иммобилизованным НАД⁺ (0,26 мг) и простые фибриллы (0,37 мг) обрабатывали ультразвуком с 0,1% полиэтиленгликолем (PEG, мол. масса 1000) в фосфате натрия (1 мл, 0,1 М, при рН 7,1) в течение 30 минут при 40^oС, затем инкубировали в течение 30 минут при 40^oС. Суспензию фибрилл центрифугировали и супернатант удаляли. Фибриллы инкубировали со смесью L-лактатдегидрогеназы (LDH) в 0,1% PEG (1000)-натрий-фосфатном буфере (250 мкл, отношение раствора LDH и 0,1% PEG-буфера было 1:1) в течение 90 минут при 4^oС. Затем эти смеси уравновешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубирования фибрилл с LDH фибриллы промывали 0,1% PEG (1000) в натрий-фосфатном буфере (5 х 1000 мкл) и каждое промывание занимало 15 минут с вращением. LDH элюировали 5 мМ раствором НАДН в 0,1% PEG (1000) в натрий-фосфатном буфере (5 мМ 3 х 100 мкл). Во время каждой элюционной промывки фибриллы вращали в течение 15 минут. LDH-активность в элюентах определяли измерением изменения поглощения при 340 нм во время восстановления пирувата. Тест-смесь содержала 0,1% PEG (1000) в натрий-фосфатном буфере (980 мкл), пируват (3,3 мкл, 100 мМ исходный раствор) и каждую фракцию элюции (16,7 мкл). Эта ферментативная реакция показана ниже

Результаты показали, что емкость (адсорбционная способность) для LDH на фибриллах с иммобилизованным НАД⁺ была 484 нмолей на грамм фибрилл, а емкость для LDH на простых фибриллах (контроль) была 3,68 нмолей на грамм фибрилл. Неспецифическое связывание LDH составляло 5,6%.Fibrils with immobilized NAD ⁺ (0.26 mg) and simple fibrils (0.37 mg) were sonicated with 0.1% polyethylene glycol (PEG, mol. Mass 1000) in sodium phosphate (1 ml, 0.1 M, at pH 7.1) for 30 minutes at 40 ^° C, then incubated for 30 minutes at 40 ^° C. The fibril suspension was centrifuged and the supernatant was removed. Fibrils were incubated with a mixture of L-lactate dehydrogenase (LDH) in 0.1% PEG (1000) sodium phosphate buffer (250 μl, the ratio of LDH solution and 0.1% PEG buffer was 1: 1) for 90 minutes at 4 ^o C. Then these mixtures were balanced for 30 minutes at room temperature. After incubating the fibrils with LDH, the fibrils were washed with 0.1% PEG (1000) in sodium phosphate buffer (5 x 1000 μl) and each washing took 15 minutes with rotation. LDH was suirable 5 mm solution of NADH in 0.1% PEG (1000) in sodium phosphate buffer (5 mm 3 x 100 μl). During each elution wash, the fibrils were rotated for 15 minutes. LDH activity in eluents was determined by measuring the change in absorbance at 340 nm during pyruvate reduction. The test mixture contained 0.1% PEG (1000) in sodium phosphate buffer (980 μl), pyruvate (3.3 μl, 100 mm stock solution) and each elution fraction (16.7 μl). This enzymatic reaction is shown below.

The results showed that the capacity (adsorption capacity) for LDH on fibrils with immobilized NAD ⁺ was 484 nmoles per gram of fibrils, and the capacity for LDH on simple fibrils (control) was 3.68 nmoles per gram of fibrils. Non-specific binding of LDH was 5.6%.

4. ФУНКЦИОНАЛИЗОВАННЫЕ НАНОТРУБКИ В КАЧЕСТВЕ ТВЕРДЫХ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ СИНТЕЗА БЕЛКА
ПРИМЕР 48
Применение функционализованных фибрилл в качестве твердого носителя для синтеза пептидов.4. FUNCTIONALIZED NANOTUBES AS SOLID CARRIERS FOR PROTEIN SYNTHESIS
EXAMPLE 48
The use of functionalized fibrils as a solid carrier for the synthesis of peptides.

К смеси амино-фибрилл (400 мг) и суспензии 4-(гидроксиметил)феноксиуксусной кислоты (255 мг, 1,4 ммоль) в метиленхлориде (20 мл) добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC, 268 мг, 1,40 ммоль) и гидрат 1-гидроксибензотриазола (НОВТ, 189 мг, 1,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Полученные фибриллы интенсивно промывали метиленхлоридом, метанолом и водой, затем сушили под вакуумом с получением фибрилл. К этой суспензии фибрилл в N,N-диметилформамиде (ДМФ, 2 мл) и метиленхлориде (8 мл) добавляли N-(9-флуоренилметоксикарбонил)-О-бутил-L-серин (215 мг, 0,56 ммоль), 1,3-дициклогексилкарбодиимид (DCC, 115 мг, 0,56 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (DMAP, 3,4 мг, 0,028 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и полученные фибриллы обрабатывали 20% пиперидином в ДМФ (5 х 40 мл, каждый раз с пропитыванием в течение 1 минуты). Затем
полученные фибриллы интенсивно промывали ДМФ, водой, гидроксидом натрия (1 н. ), метанолом и метиленхлоридом. Полученные фибриллы Fib-Handle-Ser (О⁺)-СООН (нингидриновый тест был положительным) сушили под вакуумом. Для синтеза дипептида ту же самую процедуру использовали для присоединения аргинина. Результаты аминокислотного анализа Fib-Handle-Ser(O⁺)-Arg(Т_ε-2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил) показывают, что этот продукт содержит 6,5 мкмоль серина на грамм фибрилл и 7,6 ммоль аргинина на грамм фибрилл. Любой другой пептид может быть получен при помощи этого способа.To a mixture of amino fibrils (400 mg) and a suspension of 4- (hydroxymethyl) phenoxyacetic acid (255 mg, 1.4 mmol) in methylene chloride (20 ml) was added 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC, 268 mg, 1.40 mmol) and 1-hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT, 189 mg, 1.4 mmol). The reaction mixture was stirred overnight at room temperature under argon. The obtained fibrils were intensively washed with methylene chloride, methanol and water, then dried under vacuum to obtain fibrils. To this suspension of fibrils in N, N-dimethylformamide (DMF, 2 ml) and methylene chloride (8 ml) was added N- (9-fluorenylmethoxycarbonyl) -O-butyl-L-serine (215 mg, 0.56 mmol), 1, 3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 115 mg, 0.56 mmol) and 4-dimethylaminopyridine (DMAP, 3.4 mg, 0.028 mmol). The reaction mixture was stirred overnight at room temperature and the resulting fibrils were treated with 20% piperidine in DMF (5 x 40 ml, each time soaked for 1 minute). Then
the obtained fibrils were intensively washed with DMF, water, sodium hydroxide (1 N), methanol and methylene chloride. The obtained Fib-Handle-Ser (O ⁺ ) -COOH fibrils (ninhydrin test was positive) were dried under vacuum. For the synthesis of a dipeptide, the same procedure was used for the addition of arginine. The results of the amino acid analysis of Fib-Handle-Ser (O ⁺ ) -Arg (T _ε -2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl) show that this product contains 6.5 μmol of serine per gram of fibrils and 7 , 6 mmol of arginine per gram of fibrils. Any other peptide can be obtained using this method.

5. БИОТИНИЛИРОВАННЫЕ ФИБРИЛЛЫ И БИОТИНИЛИРОВАННЫЕ АЛКИЛ-ФИБРИЛЛЫ
Было обнаружено, что поверхности фибрилл могут быть функционализованы биотинилированием или как алкилированием, так и биотинилированием. Затем фибриллы, содержащие такие модификации, могут связывать любые конъюгированные со стрептавидином вещества, такие как стрептавидиновые гранулы и связанные со стрептавидином ферменты.5. Biotinylated Fibrils and Biotinylated Alkyl Fibrils
It has been found that fibril surfaces can be functionalized by biotinylation, or both by alkylation and biotinylation. Fibrils containing such modifications can then bind any streptavidin-conjugated substances, such as streptavidin granules and streptavidin-related enzymes.

Фибриллы предоставляют большие преимущества, чем твердые носители, вследствие их высокой площади поверхности. Гранулы, которые могут быть сделаны сильно магнитными, очень применимы в разделительных анализах. Биотинилированные фибриллы, описанные здесь, объединяют преимущества как фибрилл, так и гранул. Биотинилированные алкил-фибриллы являются расширением той же самой идеи, но обнаруживают дополнительное свойство адсорбции белков алкил-фибрилл. Fibrils provide greater advantages than solid carriers due to their high surface area. Granules that can be made highly magnetic are very useful in separation analyzes. The biotinylated fibrils described herein combine the advantages of both fibrils and granules. Biotinylated alkyl fibrils are an extension of the same idea, but exhibit an additional property of adsorption of alkyl fibril proteins.

Покрытые стрептавидином и биотином фибриллы могут быть использованы в диагностике и могут быть использованы в качестве улавливающих агентов для электрохемилюминесцентных анализов. Fibrils coated with streptavidin and biotin can be used in diagnostics and can be used as trapping agents for electrochemiluminescent analyzes.

Новым признаком данного изобретения является сочетание двух твердых носителей на одной фибрилле с образованием бифункциональной фибриллы. Кроме того, описанный способ увеличивает площадь поверхности для гранул и значительно увеличивает намагниченность фибрилл. A new feature of this invention is the combination of two solid carriers on one fibril with the formation of bifunctional fibrils. In addition, the described method increases the surface area for granules and significantly increases the magnetization of fibrils.

ПРИМЕР 49
Получение биотинилированных фибрилл.EXAMPLE 49
Obtaining biotinylated fibrils.

Биотинилированные фибриллы получали смешиванием 2,4 мг амино-фибрилл, полученных в основном, как описано в примере 16, и 9 мг биотина с длинной NHS-эфирной цепью в буфере 0,2 М NаНСО₃ при рН 8,15. Эту смесь вращали при комнатной температуре в течение 4 часов и промывали тем же самым буфером дважды.Biotinylated fibrils were obtained by mixing 2.4 mg of amino fibrils, obtained mainly as described in example 16, and 9 mg of long NHS-ether biotin in 0.2 M NaHCO ₃ buffer at pH 8.15. This mixture was rotated at room temperature for 4 hours and washed with the same buffer twice.

ПРИМЕР 50
Получение биотинилированных алкил-фибрилл
Биотинилированные алкил-фибриллы получали в двухстадийной реакции. Сначала смешивали 4,25 мг бифункциональных фибрилл (содержащих как амино, так и карбоксил) и 25 мг биотина с длинной NHS-эфирной цепью. Фибриллы промывали и сушили в вакууме.EXAMPLE 50
Obtaining biotinylated alkyl fibrils
Biotinylated alkyl fibrils were obtained in a two-step reaction. First, 4.25 mg of bifunctional fibrils (containing both amino and carboxyl) and 25 mg of long-chain NHS biotin were mixed. The fibrils were washed and dried in vacuo.

Вторую реакцию проводили путем смешивания 4 мг биотинилированных бифункциональных фибрилл с 11 мг EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида), 7,5 мг DMAP (4-диметиламинопиридина) и 10 мкл NH₂(CH₂)₇CH₃ в 0,5 мл ДМФ. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Конечные биотинилированные алкил-фибриллы промывали CH₂Cl₂, MeOH и dH₂O.The second reaction was carried out by mixing 4 mg of biotinylated bifunctional fibrils with 11 mg of EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), 7.5 mg of DMAP (4-dimethylaminopyridine) and 10 μl of NH ₂ (CH ₂ ) ₇ CH ₃ in 0.5 ml of DMF. The mixture was stirred at room temperature overnight. The final biotinylated alkyl fibrils were washed with CH ₂ Cl ₂ , MeOH and dH ₂ O.

ПРИМЕР 51
Биотинилированные фибриллы в качестве твердого носителя в анализах.EXAMPLE 51
Biotinylated fibrils as a solid support in assays.

Биотинилированные фибриллы могут использоваться в анализах, включающих формы проведения анализов, которые требуют взаимодействий стрептавидин-биотин или авидин-биотин. Биотинилированные фибриллы могли бы быть дополнительно дериватизованы стрептавидином. Биотин, ковалентно связанный с фибриллами (см. пример 50), мог бы образовать сильные нековалентные связывающие взаимодействия со стрептавидином. Поскольку стрептавидин представляет собой тетрамерный белок с четырьмя равноценными сайтами связывания, стрептавидин, связанный с биотинилированными фибриллами, мог бы почти наверняка иметь незанятые сайты связывания, с которыми могли бы связываться дополнительные биотинилированные реагенты. Таким образом, биотинилированные фибриллы могли бы быть превращены в покрытые стрептавидином фибриллы. Biotinylated fibrils can be used in assays that include assays that require streptavidin-biotin or avidin-biotin interactions. Biotinylated fibrils could be further derivatized with streptavidin. Biotin covalently bonded to fibrils (see Example 50) could form strong non-covalent binding interactions with streptavidin. Since streptavidin is a tetrameric protein with four equivalent binding sites, streptavidin bound to biotinylated fibrils could almost certainly have unoccupied binding sites to which additional biotinylated reagents could bind. Thus, biotinylated fibrils could be converted into streptavidin-coated fibrils.

Имеется ряд аналитических тестов, которые могли бы выпоняться с такими фибрилла-биотин-стрептавидиновыми (FBS) носителями. Например, биотинилированное антитело против аналита могло бы улавливаться на FBS-носителе (либо перед образованием комплекса антитела с аналитом, либо после этого). Анализы с использованием биотинилированных антител против аналитов хорошо разработаны. Такие анализы включают конкурентные анализы, в которых представляющий интерес аналит конкурирует с меченым аналитом за связывание с антителом против аналита. Свободный (несвязанный) аналит и свободный (несвязанный) меченый аналит можно вымыть из иммобилизованных фибриллой антител. Стадия промывания зависит от фибрилл, физически отделенных от фазы раствора общепринятыми способами, включающими центрифугирование, фильтрование или притягивание к магниту. There are a number of analytical tests that could be performed with such fibril-biotin-streptavidin (FBS) carriers. For example, a biotinylated anti-analyte antibody could be captured on an FBS vehicle (either before or after complexing the antibody with the analyte). Assays using biotinylated anti-analyte antibodies are well established. Such assays include competitive assays in which the analyte of interest competes with the labeled analyte for binding to the anti-analyte antibody. Free (unbound) analyte and free (unbound) labeled analyte can be washed out of immobilized fibril antibodies. The washing step depends on the fibrils physically separated from the solution phase by conventional methods, including centrifugation, filtration or attraction to a magnet.

Кроме конкурентного анализа, иммуноанализ типа сэндвич-иммуноанализа мог бы проводиться на FBS-носителях. Сэндвич-иммуноанализы хорошо известны в области диагностики. Такие анализы включают связывание аналита одновременно с двумя антителами: первым "первичным" антителом, которое прикреплено на твердом носителе, например, будучи меченным посредством биотина, и "вторичным" антителом, которое не прикреплено к твердой поверхности, но помечено репортерной группой. Такой сэндвич-анализ мог бы проводиться с использованием фибрилл в качестве твердого захватывающего носителя, посредством которого фибриллы улавливаются, как описано в предшествующем параграфе. Следовательно, в таком анализе фибриллы могли бы иметь ковалентно связанный с ними биотин, который мог бы связываться со стрептавидином, который, в свою очередь, связан с биотинилированным первичным антителом, которое могло бы связываться с аналитом (если он присутствует), который мог бы быть связан с меченым вторичным антителом. In addition to competitive analysis, immunoassays such as sandwich immunoassays could be carried out on FBS media. Sandwich immunoassays are well known in the field of diagnostics. Such assays include binding the analyte to two antibodies simultaneously: the first “primary” antibody that is attached to a solid support, for example, being labeled with biotin, and the “secondary” antibody that is not attached to a solid surface, but is labeled by a reporter group. Such a sandwich analysis could be carried out using fibrils as a solid capture medium by which the fibrils are captured as described in the previous paragraph. Therefore, in such an analysis, the fibrils could have biotin covalently linked to them, which could bind to streptavidin, which, in turn, would be bound to a biotinylated primary antibody, which could bind to the analyte (if present), which could be bound to a labeled secondary antibody.

Аналогично, анализы с ДНК-зондом могли бы проводиться с использованием FBS-носителей. Биотинилированная одноцепочечная ДНК может быть связана с FBS-носителями и может происходить конкурентная гибридизация между комплементарными одноцепочечными молекулами ДНК (аналитом) и комплементарными мечеными олигонуклеотидами. Similarly, DNA probe assays could be performed using FBS carriers. Biotinylated single-stranded DNA can bind to FBS carriers and competitive hybridization can occur between complementary single-stranded DNA molecules (analyte) and complementary labeled oligonucleotides.

Другой тип биотинилированных фибрилл, биотинилированные алкил-фибриллы, могут использоваться в иммуноанализах и анализах с ДНК-зондами. Как описано в примере 51, биотинилированные фибриллы могут быть модифицированы ковалентным присоединением биотина к одному типу функциональной группы, а цепи алкила к другому типу функциональной группы. Полученные алкилированные биотинилированные фибриллы могут быть использованы в специфической ассоциации как со стептавидином, так и с авидином (через биотин), а также для адсорбции белков (через алкильные цепи). Another type of biotinylated fibril, biotinylated alkyl fibrils, can be used in immunoassays and DNA probe assays. As described in Example 51, biotinylated fibrils can be modified by covalently attaching biotin to one type of functional group, and the alkyl chain to another type of functional group. The resulting alkylated biotinylated fibrils can be used in specific association with both steptavidin and avidin (via biotin), as well as for protein adsorption (via alkyl chains).

Алкил-фибриллы могли бы использоваться в соединении с другими твердыми носителями, такими как покрытые стрептавидином магнитные гранулы. Одним из преимуществ фибрилл над такими гранулами является то, что они имеют гораздо большую площадь поверхности (на единицу веса). Следовательно, если фибриллы могли бы быть присоединены к наружной поверхности магнитных гранул, это существенно улучшило бы площадь поверхности и, следовательно, связывающую емкость этих гранул. Предполагается, что алкилированные, биотинилированные фибриллы могли бы смешиваться с покрытыми стрептавидином гранулами, приводя к высоким афинным взаимодействиям стрептавидина (гранула)-биотина (фибрилла) и, следовательно, получению покрытых фибриллами гранул с чрезвычайно высокой площадью поверхности. Поскольку алкил-фибриллы могут связывать белки посредством адсорбции, покрытые этими фибриллами гранулы могли бы образовать дальнейшие производные с адсорбированными белками, в том числе со стрептавидином и антителами. Как описано выше, покрытые стрептавидином или антителами фибриллы могут использоваться в иммуноанализах и анализах с ДНК-зондами. Таким образом, покрытые фибриллами гранулы могли бы улучшить свойства этих гранул значительным увеличением площади их поверхности, так что будет требоваться меньшее количество гранул в конкретном анализе для получения того же самого результата. Alkyl fibrils could be used in conjunction with other solid carriers, such as streptavidin-coated magnetic beads. One of the advantages of fibrils over such granules is that they have a much larger surface area (per unit weight). Therefore, if fibrils could be attached to the outer surface of the magnetic granules, this would significantly improve the surface area and, therefore, the binding capacity of these granules. It is contemplated that alkylated, biotinylated fibrils could be mixed with streptavidin-coated granules, leading to high affinity interactions of streptavidin (granule) -biotin (fibril) and, therefore, fibril-coated granules with an extremely high surface area. Since alkyl fibrils can bind proteins through adsorption, the granules coated with these fibrils could form further derivatives with adsorbed proteins, including streptavidin and antibodies. As described above, streptavidin or antibody coated fibrils can be used in immunoassays and DNA probe assays. Thus, fibril-coated granules could improve the properties of these granules by significantly increasing their surface area, so that fewer granules in a particular analysis would be required to obtain the same result.

6. ТРЕХМЕРНЫЕ СТРУКТУРЫ
Окисленные фибриллы более легко диспергируются в водных средах, чем неокисленные фибриллы. Стабильные пористые 3-мерные структуры с мезо- и макропорами (порами >2 нм) очень применимы в качестве катализаторов или хроматографических носителей. Поскольку фибриллы могут быть диспергированы на индивидуализированной основе, хорошо диспергированная проба, которая стабилизирована поперечными (мостиковыми) связями, позволяет сконструировать такой носитель. Фунционализованные фибриллы являются идеальными для такого применения, так как они легко диспергируются в водных и полярных средах и функциональность обеспечивает точки поперечных связей. Кроме того, функциональная группа обеспечивает точки для несения каталитических или хроматографических сайтов. Конечным результатом является жесткая 3-мерная структура с ее доступной общей площадью поверхности с функциональными сайтами, которые могут служить носителем для активного агента.6. THREE-DIMENSIONAL STRUCTURES
Oxidized fibrils are more easily dispersed in aqueous media than unoxidized fibrils. Stable porous 3-dimensional structures with meso- and macropores (pores> 2 nm) are very useful as catalysts or chromatographic supports. Since fibrils can be dispersed on an individualized basis, a well-dispersed sample, which is stabilized by transverse (bridge) bonds, allows the construction of such a carrier. Functionalized fibrils are ideal for this application, as they are readily dispersible in aqueous and polar media and functionality provides cross-linking points. In addition, the functional group provides points for carrying catalytic or chromatographic sites. The end result is a rigid 3-dimensional structure with its available total surface area with functional sites that can serve as a carrier for the active agent.

Типичные применения этих носителей в катализе включают их использование в качестве высокопористого носителя для металлических пропитанных катализаторов, например катализаторов гидрирования из драгоценных металлов. Кроме того, способность анкерных молекулярных катализаторов связываться с носителем через функциональную группу в сочетании с высокой пористостью этой структуры позволяет проводить гомогенные реакции по типу гетерогенных. Такой привязанный молекулярный катализатор по существу болтается в непрерывной жидкой фазе, подобно гомогенному реактору, в котором он может использовать преимущества в селективности и скоростях, которыми отличаются гомогенные реакции. Однако, поскольку он привязан к твердому носителю, он может быть легко отделен и извлечен с получением активного, во многих случаях очень дорогостоящего катализатора. Typical uses of these supports in catalysis include their use as a highly porous support for impregnated metal catalysts, for example, precious metal hydrogenation catalysts. In addition, the ability of anchor molecular catalysts to bind to the carrier through a functional group in combination with the high porosity of this structure allows for homogeneous reactions of the heterogeneous type. Such an attached molecular catalyst essentially dangles in a continuous liquid phase, like a homogeneous reactor in which it can take advantage of the selectivity and rates that homogeneous reactions differ in. However, since it is attached to a solid support, it can be easily separated and removed to obtain an active, in many cases very expensive catalyst.

Эти стабильные жесткие структуры позволяют проводить до сих пор бывшие очень трудными реакции, такие как асимметричные синтезы или аффинную хроматографию, путем присоединения подходящего энантиомерного катализатора или селективного субстрата к такому носителю. Получение производных через Metallo-Pc или металл-порфириновые комплексы также позволяет восстановить лиганд, связанный с ионом металла, и, кроме того, любую молекулу, которая связана с этим лигандом, через вторичные производные. Например, в случае, когда 3-мерной структурой функционализованных фибрилл является электрод или часть электрода, и функционализация произошла в результате адсорбции Со(II)Рс, электрохимическое окисление Со(II) до Со(III) в присутствии никотиновой кислоты будет производить нелабильный Со(III)-пиридильный комплекс с карбоновой кислотой в качестве боковой группы. Присоединение подходящего антигена, антитела, каталитического антитела или другого сайт-специфического улавливающего агента сделает возможным селективное разделение молекул (аффинную хроматографию), которое в ином случае очень трудно получить. После промывания электрода для удаления прилипшего материала комплекс Со(III), содержащий целевую молекулу, может быть электрохимически восстановлен извлечением лабильного комплекса Со(II). Затем лиганд на Со(II), содержащий целевую молекулу, может быть извлечен mass action-замещением лабильного лиганда Со(II) с разделением и извлечением тем самым молекул, которые иным образом очень трудно или дорого разделить и извлечь (например, хиральных лекарственных средств). These stable rigid structures make it possible to carry out previously very difficult reactions, such as asymmetric syntheses or affinity chromatography, by attaching a suitable enantiomeric catalyst or selective substrate to such a carrier. Derivation through Metallo-Pc or metal-porphyrin complexes also allows the reduction of the ligand bound to the metal ion, and, in addition, any molecule that is bound to this ligand via secondary derivatives. For example, in the case where the 3-dimensional structure of functionalized fibrils is an electrode or part of an electrode, and functionalization occurred as a result of adsorption of Co (II) Pc, electrochemical oxidation of Co (II) to Co (III) in the presence of nicotinic acid will produce unstable Co ( III) -pyridyl complex with carboxylic acid as a side group. The addition of a suitable antigen, antibody, catalytic antibody or other site-specific capture agent will allow selective molecular separation (affinity chromatography), which is otherwise very difficult to obtain. After washing the electrode to remove adherent material, the Co (III) complex containing the target molecule can be electrochemically reduced by extracting the labile Co (II) complex. Then the Co (II) ligand containing the target molecule can be extracted by mass action substitution of the labile Co (II) ligand with the separation and extraction of molecules that are otherwise very difficult or expensive to separate and extract (for example, chiral drugs) .

Ранее считали, что поры внутри матов из функционализованных углеродных фибрилл являются слишком малыми, чтобы позволить значительное протекание, и, следовательно, не могут быть применимы в качестве проточных электродов. Существовали также проблемы, связанные с использованием материалов из углеродных частиц или других материалов на основе углерода (таких как Reticulated Vitreous Carbon (RVC)) в качестве материалов для электродов. Например, пористые электродные материалы было невозможно образовывать in situ, упаковывать слишком плотно и формовать полости или каналы, они обнаруживали двумерную нестабильность во время изменений условий растворителя и потока и из них нельзя было изготовлять очень тонкие электроды. Использование функционализованных углеродных фибрилл в качестве электродов в проточной ячейке решило эти проблемы. Previously it was believed that the pores inside the mats of functionalized carbon fibrils are too small to allow significant leakage, and, therefore, cannot be used as flow electrodes. There were also problems with using carbon particles or other carbon-based materials (such as Reticulated Vitreous Carbon (RVC)) as electrode materials. For example, it was impossible to form porous electrode materials in situ, to pack too tightly and to form cavities or channels, they showed two-dimensional instability during changes in solvent and flow conditions, and very thin electrodes could not be made from them. The use of functionalized carbon fibrils as electrodes in a flow cell solved these problems.

Функционализованные углеродные фибриллы, используемые в качестве электродов в проточной ячейке, могут быть модифицированы обработкой поверхности электроактивными агентами. Эти фибриллы могут быть также модифицированы неэлектроактивными материалами, которые могут выполнять каталитическую или электрокаталитическую функцию или выполнять ингибирование нежелательных реакций или адсорбции материалов из протекающего потока. Functionalized carbon fibrils used as electrodes in a flow cell can be modified by surface treatment with electroactive agents. These fibrils can also be modified with non-electroactive materials that can perform a catalytic or electrocatalytic function or inhibit unwanted reactions or adsorption of materials from a flowing stream.

Такие проточные электроды применимы в разделительных способах, таких как электрохроматография, электрохимически модулируемая аффинная хроматография, электросинтез или электрохимически модулируемая ионообменная хроматография. Они могут быть также использованы в диагностических устройствах, разделяющих и/или анализирующих материал, улавливаемый на мате из углеродных фибрилл. Such flow electrodes are useful in separation methods such as electrochromatography, electrochemically modulated affinity chromatography, electrosynthesis or electrochemically modulated ion exchange chromatography. They can also be used in diagnostic devices that separate and / or analyze material trapped on a carbon fiber mat.

Могут быть использованы также композиционные маты, состоящие из функционализованных углеродных фибрилл и других волокон или состоящих из частиц материалов. Эти волокна или состоящие из частиц материалы могут добавляться к суспензии для изменения конечной пористости или проводимости мата из углеродных частиц. Composite mats consisting of functionalized carbon fibrils and other fibers or particulate materials may also be used. These fibers or particulate materials can be added to the suspension to alter the final porosity or conductivity of the carbon particle mat.

ПРИМЕР 52
Применение фибрилл, функционализованных железо-фталоцианином, в качестве электродов в проточной ячейке.EXAMPLE 52
The use of fibrils functionalized with iron phthalocyanine as electrodes in a flow cell.

Графитовые фибриллы модифицировали адсорбцией железо(III)фталоцианин-бис-пиридина (FePc-2Py) (Aldrich 41,016-0). 0,403 г фибрилл и 0,130 г FePc-2Py добавляли к 150 мл абсолютного EtOH и обрабатывали ультразвуком при помощи ультразвукового дезинтегратора 450 Watt Branson probe sonicator в течение 5 минут. Полученную суспензию фильтровали на найлоновый фильтр MSI 0,45 мкм в вакуум-фильтрующем сборнике с мембраной Millipore 47 мм, промывали водой и сушили в вакуумном термостате в течение ночи при 35^oС. Конечный вес был 0,428 г, что свидетельствовало о значительной адсорбции. Спектрофотометрический анализ фильтрата учитывал оставшийся FePc-2Py.Graphite fibrils were modified by adsorption of iron (III) phthalocyanine-bis-pyridine (FePc-2Py) (Aldrich 41.016-0). 0.403 g of fibrils and 0.130 g of FePc-2Py were added to 150 ml of absolute EtOH and sonicated with a 450 Watt Branson probe sonicator for 5 minutes. The resulting suspension was filtered on a 0.45 μm MSI nylon filter in a vacuum filter with a 47 mm Millipore membrane, washed with water and dried in a vacuum thermostat overnight at 35 ^° C. The final weight was 0.428 g, indicating significant adsorption. Spectrophotometric analysis of the filtrate took into account the remaining FePc-2Py.

5 мг модифицированных FePc-2Py фибрилл диспергировали в 10 мл ДИ-воды при обработке ультразвуком. Дисперсию помещали на кусочек плетеной сетки из нержавеющей стали (SS) 200 меш, удерживаемый в фильтрующем сборнике с мембраной 25 см, и давали ей высохнуть при комнатной температуре. Диск с диаметром 0,5 дюйма из мата из фибрилл, удерживаемого на SS-сетке, вырезали при помощи пробойника в форме арки. 5 mg of modified FePc-2Py fibrils were dispersed in 10 ml of DI water by sonication. The dispersion was placed on a 200 mesh stainless steel (SS) braided mesh piece held in a filter pan with a 25 cm membrane and allowed to dry at room temperature. A disk with a diameter of 0.5 inches from a mat of fibrils held on an SS mesh was cut using an arch-shaped punch.

Электрохимическую проточную ячейку конструировали из пластикового держателя для мембранного фильтра 13 мм типа Swinney путем помещения диска из золотой сетки (400 меш, Ladd Industries) с диаметром 13 мм на верхнюю часть мембранного держателя и образования электрического контакта с этой сеткой при помощи платиновой проволоки, изолированной трубкой с усадкой при нагреве из тефлона (Teflon^®), которая проходила через стенку держателя для фильтра для наружного соединения в качестве рабочего электрода стабилизирующей трехэлектродной цепи. Золотую сетку фиксировали на месте минимальным количеством эпоксида вокруг наружного края. Полоску золотой фольги выкраивали в виде кольца и помещали в нижней части, расположенной по потоку секции держателя фильтра, и соединяли с изолированным выводом из Pt-проволоки для соединения в качестве противоэлектрода регулирующей напряжение (стабилизирующей) трехэлектродной цепи. Кольцо с диаметром 0,5 мм из серебряной проволоки, электрохимически окисленной в 1 М НСl, помещали в верхней части держателя фильтра с изолированным выводом для соединения в качестве электрода сравнения.The electrochemical flow cell was constructed from a plastic holder for a 13 mm Swinney type membrane filter by placing a gold mesh disk (400 mesh, Ladd Industries) with a diameter of 13 mm on top of the membrane holder and forming electrical contact with this mesh using a platinum wire insulated tube shrink when heated from Teflon (Teflon ^® ), which passed through the wall of the filter holder for external connection as a working electrode of a stabilizing three-electrode circuit. The gold mesh was fixed in place with a minimum amount of epoxide around the outer edge. A strip of gold foil was cut out in the form of a ring and placed in the lower part, located downstream of the filter holder section, and connected to an insulated terminal from a Pt wire for connecting a voltage-regulating (stabilizing) three-electrode circuit as a counter electrode. A ring with a diameter of 0.5 mm from a silver wire electrochemically oxidized in 1 M Hcl was placed in the upper part of the filter holder with an insulated terminal for connection as a reference electrode.

Диск с диаметром 0,5 дюйма модифицированных FePc-2Py CN помещали в проточную ячейку, которую затем соединяли с подходящими проводами регулятора напряжения (стабилизатора) EG and G PAR 273. Проточную ячейку соединяли с насосом со шприцем (Sаgе), наполненным 0,1 М КСl в 0,1 М калий-фосфатном буфере при рН 7,0. Циклические вольтамперограммы (CV) записывались при отсутствии потока (статические) и при потоке (0,4 мл/мин) при потенциальной скорости сканирования 20 мВ/сек (см.фиг.6). CV были почти одинаковыми с потоком и без потока и показали две стойкие волны обратимого окисления и восстановления, совпадающие с поверхностью, находящейся в пределах FePc-2Py. Устойчивость этих редокс-пиков в условиях тока жидкости демонстрирует, что FePc-2Py сильно связан с углеродными фибриллами и что модифицированные железо-фталоцианином фибриллы функционируют хорошо в качестве материала проточного электрода. A 0.5 inch diameter disk of modified FePc-2Py CN was placed in a flow cell, which was then connected to suitable wires of a voltage regulator (stabilizer) EG and G PAR 273. The flow cell was connected to a pump with a syringe (Sage) filled with 0.1 M KCl in 0.1 M potassium phosphate buffer at pH 7.0. Cyclic voltammograms (CV) were recorded in the absence of flow (static) and in flow (0.4 ml / min) at a potential scanning speed of 20 mV / s (see Fig. 6). The CVs were almost identical with and without flow and showed two stable waves of reversible oxidation and reduction, coinciding with the surface within FePc-2Py. The stability of these redox peaks under liquid flow conditions demonstrates that FePc-2Py is strongly bonded to carbon fibrils and that iron-phthalocyanine-modified fibrils function well as the material of the flow electrode.

Другим примером 3-мерных структур являются фибрилльно-керамические композиционные материалы. Another example of 3-dimensional structures are fibril-ceramic composite materials.

ПРИМЕР 53
Получение состоящих из модифицированных оксидом алюминия фибрилл (оксид алюминия-фибрилл) композиционных материалов (185-02-01).EXAMPLE 53
Preparation of composite materials consisting of alumina-modified fibrils (alumina-fibrils) composite materials (185-02-01).

Один грамм окисленных азотной кислотой фибрилл (185-01-02) хорошо диспергировали в 100 мл деионизованной воды при помощи дезинтегратора U/S (ультразвукового). Суспензию фибрилл нагревали до 90^oС и медленно добавляли раствор 0,04 моль трибутоксида алюминия в 20 мл пропанола. Нагревание с обратным холодильником продолжали в течение 4 часов, после чего холодильник удаляли для удаления спирта. После 30 минут холодильник помещали обратно и суспензию нагревали с обратным холодильником при 100^oС в течение ночи. Получали черный коллоидный раствор однородного вида. Этот коллоидный раствор охлаждали до комнатной температуры и после одной недели образовался черный гель с гладкой поверхностью. Гель нагревали при 300^oС на воздухе в течение 12 часов.One gram of nitril oxidized fibrils (185-01-02) was well dispersed in 100 ml of deionized water using a U / S disintegrator (ultrasonic). The fibril suspension was heated to 90 ^{° C.} and a solution of 0.04 mol of aluminum tributoxide in 20 ml of propanol was slowly added. Reflux was continued for 4 hours, after which the refrigerator was removed to remove alcohol. After 30 minutes, the refrigerator was placed back and the suspension was refluxed at 100 ^{° C.} overnight. A uniform black colloidal solution was obtained. This colloidal solution was cooled to room temperature and after one week a black gel with a smooth surface formed. The gel was heated at 300 ^{° C.} in air for 12 hours.

Оксид алюминия-фибрилльные композиционные материалы испытывали сканирующей электронной микроскопией (SEM). Микрофотографии треснутых поверхностей обнаружили гомогенное диспергирование фибрилл в геле. Alumina-fibril composite materials were tested by scanning electron microscopy (SEM). Microphotographs of cracked surfaces revealed a homogeneous dispersion of fibrils in the gel.

ПРИМЕР 54
Получение состоящих из диоксид кремния-фибрилл композиционных материалов (173-85-03).EXAMPLE 54
Obtaining composite materials consisting of silicon dioxide-fibrils (173-85-03).

2 г окисленных азотной кислотой фибрилл (173-83-03) хорошо диспергировали в 200 мл этанола при помощи обработки ультразвуком. К суспензии медленно добавляли раствор 0,1 моль тетраэтоксисилана, растворенного в 50 мл этанола, при комнатной температуре с последующим добавлением 3 мл концентрированной НС1. Смесь нагревали до 85^oС и поддерживали при этой температуре, пока объем не уменьшался до 100 мл. Смесь охлаждали и оставляли стоять, пока не образовался черный твердый гель. Этот гель нагревали при 300^oС на воздухе.2 g of fibrils oxidized by nitric acid (173-83-03) were well dispersed in 200 ml of ethanol by sonication. A solution of 0.1 mol of tetraethoxysilane dissolved in 50 ml of ethanol was slowly added to the suspension at room temperature, followed by 3 ml of concentrated HCl. The mixture was heated to 85 ^{° C.} and maintained at this temperature until the volume decreased to 100 ml. The mixture was cooled and allowed to stand until a black solid gel formed. This gel was heated at 300 ^{° C.} in air.

Состоящие из диоксид кремния-фибрилл композиционные материалы испытывали при помощи SEM. Микрофотографии растреснутых поверхностей обнаружили гомогенное диспергирование фибрилл в этом геле. Compositions of silicon dioxide-fibrils were tested using SEM. Microphotographs of cracked surfaces revealed a homogeneous dispersion of fibrils in this gel.

Могут быть приготовлены подобные препараты с другими керамиками, такими как диоксид циркония, диоксид титания, оксиды редкоземельных металлов, а также третичные оксиды. Similar preparations can be prepared with other ceramics such as zirconia, titania, rare earth oxides, and also tertiary oxides.

7. ВКЛЮЧЕНИЕ ГРАФИТОВЫХ НАНОТРУБОК НА ПОЛИМЕРНЫЕ ГРАНУЛЫ
Полимерные гранулы, в частности магнитные полимерные гранулы, такие как изготовляемые Dynal и другие, имеют много применений в диагностике. Однако эти гранулы имеют низкую площадь поверхности по сравнению с площадью поверхности, доступной в случае нанотрубок. Функционализованные фибриллы могут быть включены на поверхность гранул, что позволяет использовать композиционный материал полимер/фибрилла в качестве твердых носителей для разделений или аналитического применения (например, для электрохемилюминесцентных анализов, для иммобилизации ферментов).7. INCLUSION OF GRAPHITE NANOTUBES ON POLYMERIC GRANULES
Polymer granules, in particular magnetic polymer granules, such as those manufactured by Dynal and others, have many diagnostic applications. However, these granules have a low surface area compared to the surface area available in the case of nanotubes. Functionalized fibrils can be incorporated onto the surface of the granules, which allows the use of a polymer / fibril composite material as solid carriers for separations or analytical applications (for example, for electrochemiluminescent assays, for immobilizing enzymes).

ПРИМЕР 55
Присоединение функционализованных фибрилл к функционализованным гранулам.EXAMPLE 55
Attaching functionalized fibrils to functionalized granules.

7,5 мг магнитных активированных тозилом гранул (Dynabeads М-450, Dynal, Oslo, Norway) (30 мг/мл) промывали три раза 0,1 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,5. Затем к этим гранулам добавляли 0,9 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 8,4, и добавляли 0,1 мл амино-фибрилл. Смеси давали вращаться в течение 16-24 часов при комнатной температуре. 7.5 mg of magnetic tosyl-activated granules (Dynabeads M-450, Dynal, Oslo, Norway) (30 mg / ml) were washed three times with 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.5. Then, 0.9 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 8.4, was added to these granules, and 0.1 ml of amino fibrils was added. The mixture was allowed to rotate for 16-24 hours at room temperature.

При наблюдении под микроскопом были видны комки фибрилл с гранулами на поверхности фибрилл. When observed under a microscope, lumps of fibrils with granules on the surface of the fibrils were visible.

Как показано предшествующим описанием и примерами, данное изобретение имеет приложение в приготовлении большого разнообразия функционализованных нанотрубок и в способах их применения. As shown by the preceding description and examples, this invention has applications in the preparation of a wide variety of functionalized nanotubes and in methods for their use.

Термины и выражения, которые были применены, используются как термины описания, а не ограничений, и нет намерения использования таких терминов или выражений для исключения каких-либо эквивалентов показанных и описанных признаков в виде их частей, причем признается, что возможны разнообразные модификации в пределах данного изобретения. The terms and expressions that have been used are used as description terms and not limitations, and there is no intention to use such terms or expressions to exclude any equivalents of the features shown and described in the form of parts thereof, and it is recognized that various modifications are possible within this inventions.

Claims (55)

1. Продукт функционализации углеродной структуры, имеющий общую формулу

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода;
Н обозначает водород;
fg обозначает функциональную группу, представленную R, А, [R'-А] или [Х'-А_а] ;
n обозначает целое число;
L обозначает число меньше 0,1n,
m обозначает число меньше 0,5n,
и а обозначает целое число меньше 10; каждый из R является одним и тем же или различным и выбран из SО₃Н, СООН, NH₂, ОН, R'CHOH, CHO, CN, COCl, галогена, COSH, SH, COOR', SR', SiR'₃,

R'', Li, AlR'₂, Hg-X, TlZ₂, и Mg-X; каждый R' обозначает водород, алкил, арил, циклоалкил, аралкил, циклоарил или поли(алкиловый эфир); А выбран из

-CR'₂-OY, N= Y,

Y обозначает подходящую функциональную группу белка, пептида, аминокислоты, фермента, антитела, нуклеотида, олигонуклеотида, антигена или субстрата фермента, ингибитора фермента или аналога переходного состояния субстрата фермента или выбран из R'-OH, R'-N(R')₂, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'N⁺(R')₃Х^-, R'SiR'₃,

R'-R'', R'-N-CO,

где y обозначает целое число, равное или меньше 3; R'' обозначает фторалкил, фторарил, фторциклоалкил или фтораралкил; Х обозначает галоген; Z обозначает карбоксилат или трифторацетат; и w обозначает целое число больше 1 и меньше 200; X' обозначает полициклическую ароматическую, полигетероциклическую ароматическую или металлополигетероциклическую ароматическую часть молекулы,
при условии, что, если fg не является R, то значение R' - водород исключено.1. The product of the functionalization of the carbon structure having the General formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms;
H is hydrogen;
fg is a functional group represented by R, A, [R'-A] or [X'-A _a ];
n is an integer;
L denotes a number less than 0.1n,
m denotes a number less than 0.5n,
and a is an integer less than 10; each R is the same or different and is selected from SO ₃ H, COOH, NH ₂ , OH, R'CHOH, CHO, CN, COCl, halogen, COSH, SH, COOR ', SR', SiR ' ₃ ,

R ', Li, AlR _{2 2} , Hg-X, TlZ ₂ , and Mg-X; each R ′ is hydrogen, alkyl, aryl, cycloalkyl, aralkyl, cycloaryl or poly (alkyl ether); A is selected from

-CR ' ₂ -OY, N = Y,

Y denotes a suitable functional group of a protein, peptide, amino acid, enzyme, antibody, nucleotide, oligonucleotide, antigen or substrate of an enzyme, an enzyme inhibitor or an analogue of a transition state of an enzyme substrate, or is selected from R'-OH, R'-N (R ') ₂ , R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'N ⁺ (R ') ₃ X ^- , R'SiR' ₃ ,

R'-R '', R'-N-CO,

where y is an integer equal to or less than 3; R ″ is fluoroalkyl, fluoroaryl, fluorocycloalkyl or fluororalkyl; X is halogen; Z is carboxylate or trifluoroacetate; and w is an integer greater than 1 and less than 200; X 'denotes a polycyclic aromatic, polyheterocyclic aromatic or metallopolyheterocyclic aromatic part of the molecule,
provided that if fg is not R, then the value of R 'is hydrogen is excluded. 2. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, имеющей отношение длины к диаметру больше 5 и диаметр меньше 0,5 мкм и все R одинаковы.2. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube having a length to diameter ratio of greater than 5 and a diameter of less than 0.5 μm and all R are the same. 3. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой фибриллы, которая по существу не содержит пиролитически отложенного углерода, причем проекция графитовых слоев на указанных фибриллах простирается на расстояние по меньшей мере двух диаметров фибриллы, и все R одинаковы.3. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are the surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite fibril, which essentially does not contain pyrolytically deposited carbon, wherein the projection of the graphite layers on said fibrils extends to a distance of at least two fibril diameters, and all R are the same. 4. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы фибриллы типа рыбьего скелета, и все R одинаковы.4. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface fibril atoms such as a fish skeleton, and all R are the same. 5. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, имеющей отношение длины к диаметру больше 5 и диаметр меньше 0,5 мкм, и когда каждый из R представляет собой кислородсодержащую группу, то СООН не присутствует.5. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are the surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube having a length to diameter ratio of greater than 5 and a diameter of less than 0.5 μm, and when each of R is an oxygen-containing group, COOH is not present. 6. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой фибриллы, которая по существу не содержит пиролитически отложенного углерода, причем проекция графитовых слоев на указанных фибриллах простирается на расстояние по меньшей мере двух диаметров фибриллы, и когда каждый из R представляет собой кислородсодержащую группу, то СООН не присутствует.6. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are the surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite fibril, which essentially does not contain pyrolytically deposited carbon, wherein the projection of the graphite layers on said fibrils extends to a distance of at least two fibril diameters, and when each of R represents is an oxygen-containing group, then COOH is not present. 7. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы фибриллы типа рыбьего скелета, и когда каждый из R представляет собой кислородсодержащую группу, то СООН не присутствует.7. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface fibril atoms such as a fish skeleton, and when each of R represents an oxygen-containing group, COOH is not present. 8. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, имеющей отношение длины к диаметру больше 5 и диаметр меньше 0,1 мкм.8. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube having a length to diameter ratio of greater than 5 and a diameter of less than 0.1 μm. 9. Продукт по п. 8, где А обозначает

R' обозначает Н и Y обозначает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из лизина, серина, треонина, тирозина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.9. The product of claim 8, wherein A is

R ′ is H and Y is an amino acid selected from the group consisting of lysine, serine, threonine, tyrosine, aspartic acid and glutamic acid. 10. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой фибриллы, которая по существу не содержит пиролитически отложенного углерода, причем проекция графитовых слоев на указанных фибриллах простирается на расстояние по меньшей мере двух диаметров фибриллы.10. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are the surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite fibril, which essentially does not contain pyrolytically deposited carbon, wherein the projection of the graphite layers on said fibrils extends to a distance of at least two fibril diameters. 11. Продукт по п. 10, где А обозначает

R' обозначает Н и Y обозначает то же, что и в п. 9.11. The product of claim 10, wherein A is

R 'denotes H and Y denotes the same as in paragraph 9. 12. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы фибриллы типа рыбьего скелета.12. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface atoms of a fibril like a fish skeleton. 13. Продукт по п. 12, где А обозначает

R' обозначает Н и Y обозначает то же, что и в п. 9.13. The product of claim 12, wherein A is

R 'denotes H and Y denotes the same as in paragraph 9. 14. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, имеющей отношение длины к диаметру больше 5 и диаметр меньше 0,5 мкм.14. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube having a length to diameter ratio of greater than 5 and a diameter of less than 0.5 microns. 15. Продукт по п. 14, где А обозначает

R' обозначает Н и Y обозначает то же, что и в п. 9.15. The product according to p. 14, where a denotes

R 'denotes H and Y denotes the same as in paragraph 9. 16. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, которая по существу не содержит пиролитически отложенного углерода, причем проекция графитовых слоев на указанных фибриллах простирается на расстояние по меньшей мере двух диаметров фибриллы.16. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube, which essentially does not contain pyrolytically deposited carbon, wherein the projection of the graphite layers on said fibrils extends to a distance of at least two fibril diameters. 17. Продукт по п. 16, где А обозначает

R' обозначает Н и Y обозначает то же, что и в п. 9.17. The product of claim 16, wherein A is

R 'denotes H and Y denotes the same as in paragraph 9. 18. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы фибриллы типа рыбьего скелета.18. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface atoms of a fibril like a fish skeleton. 19. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, имеющей отношение длины к диаметру больше 5 и диаметр меньше 0,5 мкм.19. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube having a length to diameter ratio of greater than 5 and a diameter of less than 0.5 microns. 20. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, которая по существу не содержит пиролитически отложенного углерода, причем проекция графитовых слоев на указанных фибриллах простирается на расстояние по меньшей мере двух диаметров фибриллы.20. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube, which essentially does not contain pyrolytically deposited carbon, wherein the projection of the graphite layers on said fibrils extends to a distance of at least two fibril diameters. 21. Продукт по п. 1, представленный формулой

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы фибриллы типа рыбьего скелета.21. The product according to claim 1, represented by the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface atoms of a fibril like a fish skeleton. 22. Способ получения продукта, определенного в п. 1, путем однородного замещения поверхности углеродных нанотрубок функциональной группой, включающий контактирование углеродных нанотрубок с эффективным количеством реагента, способного к однородному введению функциональной группы на поверхность указанных углеродных нанотрубок. 22. A method of obtaining a product as defined in paragraph 1, by uniformly replacing the surface of carbon nanotubes with a functional group, comprising contacting the carbon nanotubes with an effective amount of a reagent capable of uniformly introducing a functional group onto the surface of said carbon nanotubes. 23. Способ по п. 22, где реагентом является фталоцианин. 23. The method according to p. 22, where the reagent is phthalocyanine. 24. Способ по п. 23, где реагентом является никель (II)-фталоцианинтетрасульфоновая кислота (тетранатриевая соль) или 1,4,8,11,15,18,22,25-октабутокси-29Н, 31Н-фталоцианин. 24. The method according to p. 23, where the reagent is Nickel (II) -phthalocyanine tetrasulfonic acid (tetrasodium salt) or 1,4,8,11,15,18,22,25-octabutoxy-29H, 31H-phthalocyanine. 25. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, являются поверхностными углеродами по существу цилиндрической графитовой нанотрубки и n, L, m и R' указаны в п. 1, включающий стадию взаимодействия поверхностных углеродов с соединением, имеющим формулу R'CH₂OH, в присутствии свободно-радикального инициатора в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок, имеющих формулу

26. Способ по п. 25, где упомянутый свободно-радикальный инициатор представляет собой бензоилпероксид.25. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are the surface carbons of a substantially cylindrical graphite nanotube and n, L, m and R 'are indicated in claim 1, comprising the step of reacting the surface carbons with a compound having the formula R'CH ₂ OH in the presence of free radical initiator under conditions sufficient for the formation of functionalized nanotubes having the formula

26. The method of claim 25, wherein said free radical initiator is benzoyl peroxide. 27. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, являются поверхностными углеродами по существу цилиндрической графитовой нанотрубки,
и n, L, m и А указаны в п. 1,
включающий стадии:
(а) взаимодействия поверхностных углеродов по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования замещенных нанотрубок, имеющих формулу

где каждый R выбран из SО₃Н, СООН, NH₂, ОН, R'CHOH, CHO, CN, COC1, галогена, COSH, SH, COOR', SR', SiR'₃,

R'', Li, AlR'₂, Hg-X, TlZ₂ и Mg-X, и y обозначает целое число, равное или меньше 3; и
(b) взаимодействия замещенных нанотрубок [С_nН_L] -R_m, по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок, имеющих формулу

28. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, имеющей отношение длины к диаметру больше 5 и диаметр меньше 0,5 мкм;
и n, L, m и А указаны в п. 1,
включающий стадии:
(а) взаимодействия поверхностных углеродов по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования замещенных нанотрубок, имеющих формулу

где каждый R обозначает то же, что и в п. 27, и y обозначает целое число, равное или меньше 3; и
(b) взаимодействие замещенных нанотрубок

по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок, имеющих формулу

29. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, по существу не содержащей пиролитически отложенного углерода,
и n, L, m и А указаны в п. 1,
включающий стадии:
(a) взаимодействия поверхностных углеродов по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования замещенных нанотрубок, имеющих формулу

где каждый R обозначает то же, что и в п. 27, и y обозначает целое число, равное или меньше 3; и
(b) взаимодействия замещенных нанотрубок

по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок, имеющих формулу

30. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки,
и n, L, m и А указаны в п. 1,
включающий стадию взаимодействия замещенных нанотрубок

по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок, имеющих формулу

где каждый R обозначает то же, что и в п. 27; и y обозначает целое число, равное или меньше 3.27. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbons of a substantially cylindrical graphite nanotube,
and n, L, m and A are indicated in paragraph 1,
comprising stages:
(a) the interaction of surface carbon with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form substituted nanotubes having the formula

where each R is selected from SO ₃ H, COOH, NH ₂ , OH, R'CHOH, CHO, CN, COC1, halogen, COSH, SH, COOR ', SR', SiR ' ₃ ,

R ″, Li, AlR ′ ₂ , Hg-X, TlZ ₂ and Mg-X, and y is an integer equal to or less than 3; and
(b) reacting substituted [C _n H _L ] -R _m nanotubes with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form functionalized nanotubes having the formula

28. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube having a length to diameter ratio of greater than 5 and a diameter of less than 0.5 microns;
and n, L, m and A are indicated in paragraph 1,
comprising stages:
(a) the interaction of surface carbon with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form substituted nanotubes having the formula

where each R denotes the same as in paragraph 27, and y denotes an integer equal to or less than 3; and
(b) the interaction of substituted nanotubes

with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form functionalized nanotubes having the formula

29. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube substantially free of pyrolytically deposited carbon,
and n, L, m and A are indicated in paragraph 1,
comprising stages:
(a) the interaction of surface carbon with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form substituted nanotubes having the formula

where each R denotes the same as in paragraph 27, and y denotes an integer equal to or less than 3; and
(b) interactions of substituted nanotubes

with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form functionalized nanotubes having the formula

30. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube,
and n, L, m and A are indicated in paragraph 1,
including the stage of interaction of substituted nanotubes

with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form functionalized nanotubes having the formula

where each R denotes the same as in paragraph 27; and y is an integer equal to or less than 3. 31. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, имеющей отношение длины к диаметру больше 5 и диаметр меньше 0,1 мкм;
и n, L, m и А указаны в п. 1,
включающий стадию взаимодействия замещенных нанотрубок

по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок, имеющих формулу

где каждый R обозначает то же, что и в п. 27; и y обозначает целое число, равное или меньше 3.31. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube having a length to diameter ratio of greater than 5 and a diameter of less than 0.1 μm;
and n, L, m and A are indicated in paragraph 1,
including the stage of interaction of substituted nanotubes

with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form functionalized nanotubes having the formula

where each R denotes the same as in paragraph 27; and y is an integer equal to or less than 3. 32. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки, по существу не содержащей пиролитически отложенного углерода,
и n, L, m и А указаны в п. 1,
включающий стадию взаимодействия замещенных нанотрубок

по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок, имеющих формулу

где каждый R обозначает то же, что и в п. 27, и y обозначает целое число, равное или меньше 3.32. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube substantially free of pyrolytically deposited carbon,
and n, L, m and A are indicated in paragraph 1,
including the stage of interaction of substituted nanotubes

with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form functionalized nanotubes having the formula

where each R denotes the same as in paragraph 27, and y denotes an integer equal to or less than 3. 33. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки,
и n, L, m, R' и А указаны в п. 1,
включающий стадию взаимодействия замещенных нанотрубок

по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок, имеющих формулу

где каждый R обозначает то же, что и в п. 27; и y обозначает целое число, равное или меньше 3.33. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube,
and n, L, m, R 'and A are indicated in paragraph 1,
including the stage of interaction of substituted nanotubes

with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form functionalized nanotubes having the formula

where each R denotes the same as in paragraph 27; and y is an integer equal to or less than 3. 34. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки,
и n, L, a, m, R и X' указаны в п. 1,
включающий стадию адсорбции по меньшей мере одного подходящего макроциклического соединения на поверхность графитовой нанотрубки в условиях, достаточных для образования функционализованной нанотрубки формулы

35. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки;
и n, L, а, m, X' и А указаны в п. 1,
включающий стадии:
(а) адсорбции по меньшей мере одного подходящего макроциклического соединения на поверхность графитовой нанотрубки в условиях, достаточных для образования функционализованной нанотрубки формулы

где каждый R обозначает то же, что и в п. 27, и y обозначает целое число, равное или меньше 3; и
(b) взаимодействия замещенных нанотрубок

по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованной нанотрубки, имеющей формулу

36. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки;
и n, L, а, m, X' и А указаны в п. 1,
включающий стадию взаимодействия замещенных нанотрубок

по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованной нанотрубки, имеющей формулу

где каждый R обозначает то же, что и в п. 27, и y обозначает целое число, равное или меньше 3.34. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube,
and n, L, a, m, R and X 'are indicated in paragraph 1,
comprising the step of adsorbing at least one suitable macrocyclic compound onto the surface of a graphite nanotube under conditions sufficient to form a functionalized nanotube of the formula

35. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube;
and n, L, a, m, X 'and A are indicated in paragraph 1,
comprising stages:
(a) adsorption of at least one suitable macrocyclic compound on the surface of a graphite nanotube under conditions sufficient to form a functionalized nanotube of the formula

where each R denotes the same as in paragraph 27, and y denotes an integer equal to or less than 3; and
(b) interactions of substituted nanotubes

with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form a functionalized nanotube having the formula

36. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube;
and n, L, a, m, X 'and A are indicated in paragraph 1,
including the stage of interaction of substituted nanotubes

with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form a functionalized nanotube having the formula

where each R denotes the same as in paragraph 27, and y denotes an integer equal to or less than 3. 37. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки;
и n, L и m указаны в п. 1,
включающий стадии:
взаимодействия поверхностных атомов углерода по меньшей мере с одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок, имеющих формулу

и
взаимодействия функционализованных нанотрубок с соединением, имеющим две или больше аминогрупп, в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок, имеющих формулу

38. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки;
и n, L, m и R указаны в п. 1,
включающий стадию взаимодействия поверхностных углеродов по меньшей мере с одним ферментом, способным воспринимать нанотрубку в качестве субстрата и осуществлять химическую реакцию, приводящую к образованию композиции

в водной суспензии в условиях, приемлемых для проведения этой реакции по меньшей мере одним ферментом.37. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube;
and n, L and m are indicated in paragraph 1,
comprising stages:
the interaction of surface carbon atoms with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form functionalized nanotubes having the formula

and
the interaction of functionalized nanotubes with a compound having two or more amino groups, under conditions sufficient to form functionalized nanotubes having the formula

38. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube;
and n, L, m and R are indicated in paragraph 1,
comprising the step of reacting surface carbon with at least one enzyme capable of perceiving a nanotube as a substrate and carrying out a chemical reaction leading to the formation of a composition

in an aqueous suspension under conditions acceptable for carrying out this reaction with at least one enzyme. 39. Способ по п. 38, где R_m представляет собой -ОН и фермент представляет собой фермент цитохрома р450 или пероксидазу.39. The method of claim 38, wherein R _m is —OH and the enzyme is a cytochrome p450 enzyme or peroxidase. 40. Способ по п. 22 получения продукта формулы

где атомы углерода, С_n, представляют собой поверхностные атомы углерода по существу цилиндрической графитовой нанотрубки,
и n, L и m указаны в п. 1,
включающий стадии:
взаимодействия поверхностных углеродов с азотной кислотой и серной кислотой с образованием нитрованных нанотрубок; и
восстановления нитрованных нанотрубок с образованием

41. Углеродная нанотрубка с модифицированной поверхностью, которая включает цилиндрическую графитовую нанотрубку, имеющую отношение длины к диаметру более 5 и диаметр менее 0,5 мкм, которая содержит на поверхности указанной углеродной нанотрубки функциональные группы, образованные за счет контакта с эффективным количеством реагента для введения функциональной группы на поверхность углеродной нанотрубки.40. The method according to p. 22 to obtain a product of the formula

where the carbon atoms, C _n , are surface carbon atoms of a substantially cylindrical graphite nanotube,
and n, L and m are indicated in paragraph 1,
comprising stages:
the interaction of surface carbons with nitric acid and sulfuric acid with the formation of nitrated nanotubes; and
reduction of nitrated nanotubes with the formation

41. A surface-modified carbon nanotube that includes a cylindrical graphite nanotube having a length to diameter ratio of more than 5 and a diameter of less than 0.5 μm, which contains functional groups on the surface of said carbon nanotube formed by contact with an effective amount of a reagent to introduce functional groups on the surface of a carbon nanotube. 42. Углеродная трубка с модифицированной поверхностью по п. 41, где реагентом является фталоцианин. 42. A carbon tube with a modified surface according to claim 41, where the reagent is phthalocyanine. 43. Углеродная трубка с модифицированной поверхностью по п. 42, где реагентом является никель (II)-фталоцианинтетрасульфоновая кислота (тетранатриевая соль) или 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22, 25-октабутокси-29Н, 31Н-фталоцианин. 43. The surface-modified carbon tube of claim 42, wherein the reagent is nickel (II) -phthalocyanine tetrasulfonic acid (tetrasodium salt) or 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22, 25-octabutoxy-29H, 31H-phthalocyanine . 44. Способ связывания белка с нанотрубкой, включающий стадию контактирования нанотрубки, несущей NHS-эфирную группу, с белком в условиях, достаточных для образования ковалентной связи между NHS-эфиром и аминогруппой этого белка. 44. A method of binding a protein to a nanotube, comprising the step of contacting a nanotube carrying an NHS ester group with a protein under conditions sufficient to form a covalent bond between the NHS ester and the amino group of the protein. 45. Электрод, содержащий функционализованные нанотрубки по п. 1. 45. An electrode containing functionalized nanotubes according to claim 1. 46. Электрод по п. 45, где этот электрод представляет собой пористый проточный электрод. 46. The electrode according to claim 45, where this electrode is a porous flow electrode. 47. Электрод по п. 46, где функционализованные нанотрубки представляют собой замещенные фталоцианином нанотрубки. 47. The electrode of claim 46, wherein the functionalized nanotubes are phthalocyanine-substituted nanotubes. 48. Пористый материал, содержащий множество сеток из функционализованных нанотрубок, причем такая сетка из функционализованных нанотрубок содержит по меньшей мере две функциональные фибриллы, соединенные при функциональных группах по меньшей мере одной линкерной частью молекулы, причем эта линкерная часть молекулы является либо бифункциональной, либо полифункциональной. 48. A porous material containing many networks of functionalized nanotubes, such a network of functionalized nanotubes containing at least two functional fibrils connected at least one functional linker part of the molecule, and this linker part of the molecule is either bifunctional or multifunctional. 49. Способ отделения представляющего интерес растворенного вещества из пробы, включающий стадии: физической или химической модификации поверхностных углеродов графитовой нанотрубки по меньшей мере одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок; иммобилизации вещества, способного связывать представляющее интерес растворенное вещество, на функционализованных нанотрубках; экспонирования замещенных нанотрубок с фракцией, содержащей представляющее интерес растворенное вещество, для связывания этого вещества на функционализованных нанотрубках. 49. A method for separating a solute of interest from a sample, comprising the steps of: physically or chemically modifying the surface carbon of a graphite nanotube with at least one suitable reagent under conditions sufficient to form functionalized nanotubes; immobilizing a substance capable of binding the solute of interest on functionalized nanotubes; exposing the substituted nanotubes to a fraction containing a solute of interest to bind the substance on functionalized nanotubes. 50. Способ по п. 49, где представляющим интерес растворенным веществом является белок. 50. The method of claim 49, wherein the solute of interest is protein. 51. Способ по п. 50, дополнительно включающий стадию извлечения функционализованных нанотрубок. 51. The method according to p. 50, further comprising the step of extracting functionalized nanotubes. 52. Способ по п. 49, где функционализованные нанотрубки находятся в форме пористого мата (подстилки). 52. The method of claim 49, wherein the functionalized nanotubes are in the form of a porous mat (litter). 53. Способ по п. 49, где функционализованные нанотрубки находятся в форме упакованной колонки. 53. The method of claim 49, wherein the functionalized nanotubes are in the form of a packed column. 54. Способ по п. 49, где связывание является обратимым. 54. The method of claim 49, wherein the binding is reversible. 55. Способ по п. 49, где связывание является ионным взаимодействием. 55. The method according to p. 49, where the binding is an ionic interaction. 56. Способ по п. 49, где связывание является гидрофобным взаимодействием. 56. The method of claim 49, wherein the binding is a hydrophobic interaction. 57. Способ по п. 49, где связывание осуществляется посредством специфического молекулярного узнавания. 57. The method of claim 49, wherein the binding is via specific molecular recognition. 58. Способ катализа реакции, в которой по меньшей мере один реагент превращается по меньшей мере в один продукт, включающий стадии: физической или химической модификации графитовой нанотрубки по меньшей мере одним подходящим реагентом в условиях, достаточных для образования функционализованных нанотрубок; иммобилизации биокатализатора, способного катализировать реакцию на этих функционализованных нанотрубках; и контактирования функциональных нанотрубок с реагентом (реагентами) в условиях, достаточных для превращения реагента (реагентов) в продукт (продукты). 58. A method for catalyzing a reaction in which at least one reactant is converted into at least one product, the process comprising the steps of: physically or chemically modifying a graphite nanotube with at least one suitable reactant under conditions sufficient to form functionalized nanotubes; immobilization of a biocatalyst capable of catalyzing a reaction on these functionalized nanotubes; and contacting the functional nanotubes with the reagent (s) under conditions sufficient to convert the reagent (s) into the product (s). 59. Способ по п. 58, дополнительно включающий стадию извлечения функционализованных нанотрубок после завершения реакции. 59. The method of claim 58, further comprising the step of extracting functionalized nanotubes after completion of the reaction. 60. Способ по п. 58, где функционализованные нанотрубки находятся в форме пористого мата (подстилки). 60. The method according to p. 58, where the functionalized nanotubes are in the form of a porous mat (litter). 61. Способ по п. 58, где функционализованные нанотрубки находятся в форме упакованной колонки. 61. The method of claim 58, wherein the functionalized nanotubes are in the form of a packed column. 62. Способ синтеза пептида, предусматривающий стадию присоединения концевой аминокислоты пептида к нанотрубке через обратимый линкер. 62. A method for synthesizing a peptide, comprising the step of attaching the terminal amino acid of the peptide to the nanotube via a reversible linker. 63. Способ по п. 62, где линкер представляет собой 4-(гидроксиметил)-феноксиуксусную кислоту. 63. The method of claim 62, wherein the linker is 4- (hydroxymethyl) phenoxyacetic acid.

Images