JP2006308463A - Nano-carbon sensor - Google Patents

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Masao Goto
正男 後藤
Fumiyo Kurusu
史代 来栖
Satoru Koide
哲 小出
Hideaki Nakamura
秀明 中村
Masao Karube
征夫 輕部
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a sensor suitably used as a biosensor which has a high catalytic property, an excellent selectivity to measurement interfering substances, and an excellent practicality. <P>SOLUTION: In the sensor, a frame is disposed partly or wholly on at least one of electrodes formed on a substrate, and the frame is filled up with paste which is obtained by mixing nano-carbon with viscous binder, such that the paste is in contact with the electrode. When the frame is disposed on either a work electrode or a counter electrode, the frame is filled up with the paste, and when the frame is disposed on both the work electrode and the counter electrode so as to be separate or to bridge them, at least one side portion of the frame is filled up with the paste. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、センサーに関する。さらに詳しくは、触媒活性が高く、測定妨害物質に対する選択性にすぐれたカーボンナノチューブを用いたセンサー、特にバイオセンサーとして好適に用いられるセンサーに関する。   The present invention relates to a sensor. More specifically, the present invention relates to a sensor using carbon nanotubes having high catalytic activity and excellent selectivity to a measurement interfering substance, particularly a sensor suitably used as a biosensor.

カーボンナノチューブはそれの発見以来、その特異な構造により、それの応用が注目されている材料である。カーボンナノチューブは、電気化学的特性として、触媒活性が他の電極材料より高いことが挙げられ、これを電極として用いた場合、同一電位において、酸化電流、還元電流が大きく、感度向上につながることや、測定妨害物質に対する選択性があるといった特徴がある。
Nature, 354, 56 (1991) Since its discovery, carbon nanotubes have been attracting attention for their unique structure. Carbon nanotubes have higher catalytic activity than other electrode materials as electrochemical characteristics. When this is used as an electrode, oxidation current and reduction current are large at the same potential, leading to improved sensitivity. , There is a feature that it has selectivity for measurement interfering substances.
Nature, 354, 56 (1991)

このようなセンサーとしては、例えばミネラルオイルにカーボンナノチューブやグラファイトを配合し、得られたペーストを金属製電極端子の先端に付着させて、電極を製作する方法が提案されている。
Bioelectrochem. Bioenerg. 41, 121 (1996) Electroanalysis 14, 1609 (2002) J. Am. Chem. Soc. 125, 2408 (2003) Ana. Chem. 75, 2075 (2003) Electrochem. Commun. 5, 689 (2003) As such a sensor, for example, a method has been proposed in which an electrode is manufactured by blending carbon nanotubes or graphite into mineral oil and attaching the obtained paste to the tip of a metal electrode terminal.
Bioelectrochem. Bioenerg. 41, 121 (1996) Electroanalysis 14, 1609 (2002) J. Am. Chem. Soc. 125, 2408 (2003) Ana. Chem. 75, 2075 (2003) Electrochem. Commun. 5, 689 (2003)

しかるに、このような電極の場合、ペーストが電極端子表面から剥離しやすく、実用に耐え得ないという問題があった。   However, in the case of such an electrode, there is a problem that the paste is easily peeled off from the electrode terminal surface and cannot be practically used.

本発明の目的は、触媒活性が高く、測定妨害物質に対する選択性にすぐれるとともに、実用性にすぐれたバイオセンサーとして好適に用いられるセンサーを提供することにある。   An object of the present invention is to provide a sensor suitably used as a biosensor having high catalytic activity, excellent selectivity to a measurement interfering substance, and excellent practicality.

かかる本発明の目的は、基板上に形成された電極の少なくとも一方の電極上に部分的または全体的に枠体を設け、該枠体内にナノカーボンおよび粘性バインダーを混合したペーストを電極に接触するように充填したセンサーによって達成される。枠体が作用極および対極のいずれか一方の電極上に設置された場合には、その枠体内にペーストが充填され、また枠体が作用極および対極の両方の電極上に別々にあるいは跨って設置された場合には、少くとも一方の枠体内にペーストが充填される。   An object of the present invention is to provide a frame partly or entirely on at least one of the electrodes formed on the substrate, and contact the paste with the nanocarbon and the viscous binder mixed in the frame. This is achieved by a sensor filled as such. When the frame is installed on either the working electrode or the counter electrode, the frame is filled with paste, and the frame is separately or straddled on both the working electrode and the counter electrode. When installed, at least one frame is filled with paste.

本発明にかかるセンサーは、電極上に配置されるナノカーボンが、粘性バインダーとともに固定枠体内に充填された状態で配されているので、電極上から剥離するといった問題がみられず、特に測定システムとしてFIA(Flow Injection Analysis)法を採用し、送液溶液が流れる際や、バッチ法を採用して、撹拌状態となった場合においても、ナノカーボンの特性である高い触媒活性および測定妨害物質に対する優れた選択性を損なうことがないといった効果を奏する。   In the sensor according to the present invention, since the nanocarbon disposed on the electrode is arranged in a state of being filled in the fixed frame together with the viscous binder, there is no problem of peeling from the electrode, and in particular the measurement system. FIA (Flow Injection Analysis) method is adopted, and even when the solution is flowing, or when the batch method is used and the mixture is stirred, the high catalytic activity and measurement interference substances that are the characteristics of nanocarbon There is an effect that excellent selectivity is not impaired.

本発明のセンサーの一例を図６に示す。基板２上には、作用極および対極の２極よりなる電極３が形成されており、さらに基板上には一方の電極を部分的に囲う状態で枠体４が設けられ、この枠体内には、電極と接触するようにペースト５が充填されている。また、図７に示された態様は、作用極および対極の両方の電極上に跨った状態で枠体４が設置され、その一方の枠体内にのみペースト５が充填されている。以下、かかるセンサーについて詳細に説明する。   An example of the sensor of the present invention is shown in FIG. An electrode 3 comprising two working and counter electrodes is formed on the substrate 2, and a frame 4 is provided on the substrate so as to partially surround one of the electrodes. The paste 5 is filled so as to come into contact with the electrodes. In the embodiment shown in FIG. 7, the frame body 4 is installed on both the working electrode and the counter electrode, and the paste 5 is filled only in one of the frames. Hereinafter, such a sensor will be described in detail.

基板としては、好ましくは平面状のものが用いられる。その材質としては、絶縁性のもの、例えばポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック、ポリ乳酸などの生分解性材料、紙、セラミック、ガラスなどが用いられる。   As the substrate, a planar substrate is preferably used. As the material, an insulating material such as a plastic such as polyethylene terephthalate, a biodegradable material such as polylactic acid, paper, ceramic, glass, or the like is used.

基板上には、電極が形成される。電極材料としては、白金、パラジウム、銀、銅などの単体またはこれらを樹脂などに分散されたものが用いられ、蒸着、スパッタリング、スクリーン印刷、箔貼り付けなどの方法で基板上に形成される。電極は、作用極および対極を設置した２電極またはこれに参照極を加えた３電極のものが用いられ、センサーを小型化する観点からは２電極のものが、測定精度の信頼性を高める観点からは、銀塩化銀などの参照極を加えた３電極のものが用いられる。   An electrode is formed on the substrate. As the electrode material, a simple substance such as platinum, palladium, silver, or copper or a material in which these are dispersed in a resin or the like is used, and the electrode material is formed on the substrate by a method such as vapor deposition, sputtering, screen printing, or foil bonding. The electrode is a two-electrode with a working electrode and a counter electrode or a three-electrode with a reference electrode added to it. From the viewpoint of downsizing the sensor, the two-electrode is used to improve the reliability of measurement accuracy. Is a three-electrode type to which a reference electrode such as silver-silver chloride is added.

電極が形成された基板上には、枠体が設けられる。枠体の形状は任意であるが、少なくとも一方の電極の一部分を囲うように、高さが約100〜2000μm、好ましくは約500〜1500μmとなるように設けられる。枠体の成形材料としては、シリコーンゴムなどのゴムまたはポリテトラフルオロエチレン樹脂などのプラスチックが用いられ、好ましくはシリコーンゴムが用いられる。このような材料は、例えば測定システムとしてFIA法を用い、キャリヤー(送液溶液)が流れた際に、シール機能(漏れ防止、粘弾性機能)を発揮する。かかる枠体は、例えば測定システムがFIA法で送液溶液が流れた際や、バッチ法で撹拌状態の場合に、ペーストが電極から剥がれるといった不具合を防止することができる。ここで、枠体はセラミック平面基板上に静置されれば足り、作製されたセンサーは、測定システムがFIA法の場合には一般のセンサー測定用セルに格納される。これにより上部、下部の２体に分かれるセルの下部にセンサーが設置され、その上から上部をねじ止めすることで、その圧力によりセンサーとシリコーンゴム枠が固定され、同時にシール機能も付与されることとなる。   A frame is provided on the substrate on which the electrodes are formed. Although the shape of the frame is arbitrary, it is provided so as to have a height of about 100 to 2000 μm, preferably about 500 to 1500 μm so as to surround a part of at least one of the electrodes. As a molding material for the frame, rubber such as silicone rubber or plastic such as polytetrafluoroethylene resin is used, and preferably silicone rubber is used. Such a material uses a FIA method as a measurement system, for example, and exhibits a sealing function (leakage prevention, viscoelasticity function) when a carrier (liquid feeding solution) flows. Such a frame can prevent a problem that the paste is peeled off from the electrode when the liquid feeding solution flows by the FIA method in the measurement system or when the measurement system is in the stirred state by the batch method. Here, it is sufficient that the frame body is allowed to stand on the ceramic flat substrate, and the manufactured sensor is stored in a general sensor measurement cell when the measurement system is the FIA method. As a result, the sensor is installed in the lower part of the cell, which is divided into two parts, the upper part and the lower part. By screwing the upper part from above, the sensor and the silicone rubber frame are fixed by the pressure, and at the same time a sealing function is also given. It becomes.

ペーストの主成分として用いられる中空型、カーボンナノホーン、コクーンなどのカーボンナノチューブ、カーボンナノコイル、フラーレンおよびこれらの誘導体などのいわゆるナノカーボンは、グラファイトやダイヤモンドなどと同様に炭素の同素体である。この内、カーボンナノチューブはアーク放電法、気相成長法またはレーザー蒸発法などにより製造されたものが用いられ、構造的には多層または単層のいずれのものも用いられる。   Hollow carbon, carbon nanotubes such as carbon nanohorns and cocoons, so-called nanocarbons such as carbon nanocoils, fullerenes and derivatives thereof used as the main component of the paste are allotropes of carbon, as are graphite and diamond. Among these, carbon nanotubes manufactured by an arc discharge method, a vapor phase growth method, a laser evaporation method, or the like are used, and structurally, either multi-layered or single-walled are used.

カーボンナノチューブなどのナノカーボンは、ミネラルオイル、ブロモホルム、ヌジョール、ポリテトラフルオロエチレン樹脂またはナフィオンなどの粘性バインダーと混合されてペースト状とされる。ここで粘性バインダーとは、ナノカーボンに対して分散、保持、加工性に優れるという性状を示すものをいう。ナノカーボンは、ペースト中5〜90重量％、好ましくは10〜60重量％の割合で用いられる。ナノカーボンがこれより少ない割合で用いられると、ナノカーボンに起因する特性が発現しないことがあり、一方これより多い割合で用いられると、ペースト製作の段階でもろくなり、ペースト作製が困難となる。   Nanocarbons such as carbon nanotubes are mixed with a viscous binder such as mineral oil, bromoform, Nujol, polytetrafluoroethylene resin or Nafion to form a paste. Here, the viscous binder means a material exhibiting properties such as excellent dispersion, retention, and workability with respect to nanocarbon. Nanocarbon is used in the paste in a proportion of 5 to 90% by weight, preferably 10 to 60% by weight. If nanocarbon is used in a smaller proportion, the characteristics due to nanocarbon may not be exhibited. On the other hand, if it is used in a proportion higher than this, it becomes brittle at the stage of paste production, making paste production difficult.

以上の必須成分に加えて導電性のさらなる改善を目的として、導電性配合剤を添加することもできる。導電性配合剤としては、グラファイトやケッチェンブラック、アセチレンブラックなどの粉体、ITO（インジウム・スズ酸化物）、酸化チタン、酸化亜鉛、ニッケル、銅、銀、コバルトなどの金属粉が用いられる。これらの配合は導電性を改善し、また金属粉、例えばニッケル、銅、銀、コバルトなどはタンパク質、アミノ酸、アルコールなどに対して反応するので、これらの添加により、タンパク質、アミノ酸、アルコールセンサーへの応用が可能となる。   In addition to the above essential components, a conductive compounding agent may be added for the purpose of further improving the conductivity. As the conductive compounding agent, powders such as graphite, ketjen black, and acetylene black, and metal powders such as ITO (indium tin oxide), titanium oxide, zinc oxide, nickel, copper, silver, and cobalt are used. These formulations improve conductivity, and metal powders such as nickel, copper, silver, cobalt react to proteins, amino acids, alcohols, etc., so their addition to proteins, amino acids, alcohol sensors Application becomes possible.

このような導電性配合剤は、ペースト中50重量％以下、好ましくは1〜20重量％の割合で用いられる。導電性配合剤がこれより多い割合で用いられると、電極がもろくなり好ましくない。   Such a conductive compounding agent is used in a proportion of 50% by weight or less, preferably 1 to 20% by weight in the paste. If the conductive compounding agent is used in a proportion higher than this, the electrode becomes brittle, which is not preferable.

以上述べたセンサーをバイオセンサーとして用いる場合には、分子識別素子をペースト中に混合してまたはペースト上に配置して用いることができる。分子識別素子の配置する方法としては、例えば分子識別素子を水溶液として、ペーストの表面にピペットなどにより滴下して配置し、好ましくはその後に乾燥処理をするという方法が挙げられる。   When the sensor described above is used as a biosensor, the molecular identification element can be mixed in the paste or disposed on the paste. As a method for arranging the molecular identification element, for example, a method of arranging the molecular identification element in the form of an aqueous solution by dropping it on the surface of the paste with a pipette or the like, and preferably performing a drying treatment thereafter.

分子識別素子としては、酵素、酵素のミュータント、抗体、核酸、プライマー、ペプチド核酸、核酸プローブ、アプタマー、微生物、オルガネラ、シャペロン、レセプター、細胞組織、クラウンエーテル、フェリシアン化カリウムなどのメデイエーター、挿入剤、補酵素、抗体標識物質、基質、界面活性剤、脂質、アルブミン、ナフィオン、チオール基導入試薬および共有結合試薬の少なくとも一種が用いられ、これらは、吸着法、共有結合法などを用いてペーストへ結合される。   Molecular identification elements include enzymes, enzyme mutants, antibodies, nucleic acids, primers, peptide nucleic acids, nucleic acid probes, aptamers, microorganisms, organelles, chaperones, receptors, cell tissues, crown ethers, potassium ferricyanide and other mediators, intercalators, At least one of coenzyme, antibody labeling substance, substrate, surfactant, lipid, albumin, Nafion, thiol group introduction reagent and covalent bond reagent is used, and these are bound to the paste using adsorption method, covalent bond method, etc. Is done.

上記酵素としては、例えばグルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼおよびこれらのミュータントなどが挙げられる。   Examples of the enzyme include glucose oxidase, glucose dehydrogenase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, pyruvate oxidase, hydroxybutyrate dehydrogenase, fructosylamine oxidase, cholesterol esterase, cholesterol oxidase, sarcosine oxidase, creatininase, creatinase and mutants thereof. Etc.

以上の各成分よりなるペーストは、各成分を任意の配合順序により乳鉢やボールミルなどを用いて粉砕、混合することにより作製される。得られたペーストは、基板上に設けられた枠内に電極と接触するように充填される。   The paste composed of the above components is prepared by pulverizing and mixing the components using a mortar, ball mill, or the like in an arbitrary blending order. The obtained paste is filled in a frame provided on the substrate so as to be in contact with the electrode.

このように、ナノカーボンが粘性バインダー中に分散しているペーストは、ナノカーボンの導電性などの諸特性を発現する。ナノカーボンの特性の発現は、ナノカーボン同志の接触、導電性配合剤同士の接触、異種配合成分同士の接触、トンネル効果などにより得られる。   Thus, the paste in which nanocarbon is dispersed in a viscous binder exhibits various properties such as nanocarbon conductivity. The expression of the characteristics of nanocarbon is obtained by contact between nanocarbons, contact between conductive compounding agents, contact between different compounding components, tunnel effect, and the like.

また、分子識別素子が混合されたペースト表面上またはペースト上に配置された分子識別素子上には、さらに分子識別素子の保護などを目的として有機物質層を形成することができる。有機物質層としては、例えばアルブミンまたはアルブミンのグルタルアルデヒド架橋膜、ナフィオン膜、ナイロンなど一般材料の網状体または布状体などを挙げることができる。   In addition, an organic material layer can be formed on the paste surface mixed with the molecular identification element or on the molecular identification element arranged on the paste for the purpose of protecting the molecular identification element. Examples of the organic material layer include albumin or a glutaraldehyde cross-linked membrane of albumin, a Nafion membrane, a net-like or cloth-like material of a general material such as nylon.

有機物質層は、有機物質を水溶液として、分子識別素子が混合されたペースト表面上またはペースト上に配置された分子識別素子上にピペットなどにより滴下することにより形成され、好ましくはその後乾燥処理が行われる。   The organic substance layer is formed by dropping an organic substance as an aqueous solution onto the surface of the paste in which the molecular identification element is mixed or onto the molecular identification element disposed on the paste with a pipette or the like. Is called.

本発明のセンサーを用いての測定法としては、酸化電流もしくは還元電流を測定するポテンシャルステップクロノアンペロメトリーまたはクーロメトリー、サイクリックボルタンメトリー法などが用いられ、例えば電極間電圧を特定電圧に設定することにより、測定妨害物質の影響を避け、目的物質を選択的に測定することを可能とする。また、測定システムとしては、FIA法またはバッチ法などが用いられる。   As a measuring method using the sensor of the present invention, potential step chronoamperometry, coulometry, cyclic voltammetry, or the like for measuring an oxidation current or a reduction current is used. For example, a voltage between electrodes is set to a specific voltage. Therefore, it is possible to selectively measure the target substance while avoiding the influence of the measurement interfering substance. As a measurement system, FIA method or batch method is used.

ここで、電極のみから構成されるセンサーを用いた場合には、過酸化水素、NADH、尿酸、ドーパミン、モノアミン、アルコール、金属イオン、遺伝子損傷マーカーである8-ヒドロキシデオキシグアノシンなどの核酸(特許文献１参照）、たんぱく質(特許文献２参照）、脂質、炭水化物またはそれらの誘導体などの検出が可能である。
特開２００１−２５８５９７号公報 ＵＳ ５６５３８６４ Here, when a sensor composed only of electrodes is used, nucleic acids such as hydrogen peroxide, NADH, uric acid, dopamine, monoamine, alcohol, metal ions, and a gene damage marker such as 8-hydroxydeoxyguanosine (patent document) 1), proteins (see Patent Document 2), lipids, carbohydrates, or derivatives thereof can be detected.
JP 2001-258597 A US 5563864

例えば、過酸化水素は、次式の電極反応に従って酸化または還元された電流を測定することにより、その濃度が電気化学的に測定される。
電極による酸化の場合：H2O2 → O2 + 2H+ + 2e-
電極による還元の場合：H2O2 + 2H+ + 2e- → 2H2O For example, the concentration of hydrogen peroxide is measured electrochemically by measuring the current oxidized or reduced according to the electrode reaction of the following formula.
For oxidation by the electrode: H 2 O 2 → O 2 + 2H + + 2e -
For reduction with electrodes: H 2 O 2 + 2H + + 2e - → 2H 2 O

また、電極と共に酵素などの分子識別素子をセンサーの構成要素とした場合は、バイオセンサーとして用いることができ、グルコース、エタノール、アミノ酸またはこれらの誘導体などが検出される。   In addition, when a molecular identification element such as an enzyme is used as a sensor component together with an electrode, it can be used as a biosensor, and glucose, ethanol, amino acids, or derivatives thereof are detected.

特許文献４〜６に示される如く、酵素センサーでは、検体の測定対象によって分子識別素子としての酵素の種類を変えることが必要である。例えば、測定対象がグルコースの場合にはグルコースオキシターゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼが、エタノールの場合にはアルコールオキシターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼが、乳酸の場合には乳酸オキシターゼが、総コレステロールなどの場合にはコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼの混合物などが用いられる。
ＵＳ ６０７１３９１ ＵＳ ６１５６１７３ ＵＳ ６５０３３８１ As shown in Patent Documents 4 to 6, in an enzyme sensor, it is necessary to change the type of enzyme as a molecular identification element depending on the measurement target of the specimen. For example, when glucose is measured, glucose oxidase or glucose dehydrogenase is used. When ethanol is used, alcohol oxidase or alcohol dehydrogenase is used. When lactic acid is used, lactate oxidase is used. A mixture of these is used.
US 6071391 US 6156173 US 6503181

例えば、下記式に示す如く、グルコースオキシダーゼ(GOD)が触媒する反応を用いてグルコースを測定する場合には、発生した過酸化水素を、電極のみから構成されるセンサーを用いた場合と同様に酸化または還元された電流を測定することにより、その濃度が電気化学的に測定可能となり、これにより間接的にグルコース濃度を測定することができる。

グルコース ＋ 酸素 → グルコノラクトン ＋ Ｈ2Ｏ2
For example, as shown in the following formula, when measuring glucose using a reaction catalyzed by glucose oxidase (GOD), the generated hydrogen peroxide is oxidized in the same way as when using a sensor composed only of electrodes. Alternatively, by measuring the reduced current, the concentration can be measured electrochemically, thereby indirectly measuring the glucose concentration.

Glucose + oxygen → gluconolactone + H 2 O 2

このようなセンサーにおいて、反応が溶存酸素濃度に律速され、低濃度の試料しか測定できない場合、検出範囲の拡大を目的として酵素とともに電子伝達体(メディエーター)が使用される。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体などが用いられる。例えばグルコースを測定する場合、グルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼなどの酵素のいずれかと、フェリシアン化カリウムが用いられる。フェリシアンイオンは酵素により還元されてフェロシアンイオンとなり以下の式のように更に電極によりフェリシアンイオンに酸化され、このときの電流値を測定することにより、間接的にグルコースが測定される。

2[Fe(CN)6]4- → 2[Fe(CN)6]3- + 2e-
In such a sensor, when the reaction is limited by the dissolved oxygen concentration and only a low concentration sample can be measured, an electron carrier (mediator) is used together with an enzyme for the purpose of expanding the detection range. As the mediator, potassium ferricyanide, ferrocene, ferrocene derivatives, benzoquinone, quinone derivatives, osmium complexes and the like are used. For example, when measuring glucose, either an enzyme such as glucose oxidase or glucose dehydrogenase and potassium ferricyanide are used. The ferricyan ion is reduced by the enzyme to become ferrocyanic ion and further oxidized to ferricyan ion by the electrode as in the following formula, and glucose is indirectly measured by measuring the current value at this time.

2 [Fe (CN) 6] 4- → 2 [Fe (CN) 6] 3- + 2e -

次に、実施例について本発明を説明する。   Next, the present invention will be described with reference to examples.

実施例１
グラファイトパウダー(フィシャー社製品グレード♯38)30mgをめのう乳鉢に入れ、乳棒を用いて20分間粉砕処理を行った後、多層カーボンナノチューブ(ナノラボ社製品、直径15〜45nm、長さ1〜5μm)30mgを添加して、乳棒を用いてさらに20分間粉砕処理を行い、グラファイトパウダーと混合した。これにミネラルオイル(アルドリッチ社製品、比重0.94)42.6μl(40mg)を添加し、乳棒を用いて20分間混合を行い、ペーストを得た。得られたペーストをセラミック平面基板(15×20mm)にスクリーン印刷法により形成された白金電極(作用極および対極)(2×16mm)の一部分上に設けられたシリコーンゴム枠(15×12×1mm)の中に充填し、図７に示されるようにセンサーを作製した。ここで、シリコーンゴム枠はセラミック平面基板上に静置され、センサーは、測定用セルに格納され、上部、下部の２体に分かれたFIAシステム用のセルの下部に設置され、その上から上部をねじ止めすることで、固定された。 Example 1
Graphite powder (Fischer product grade # 38) 30 mg is put in an agate mortar and pulverized using a pestle for 20 minutes, then multi-walled carbon nanotubes (Nanolab product, diameter 15-45 nm, length 1-5 μm) 30 mg Was added and pulverized for another 20 minutes using a pestle and mixed with graphite powder. To this, 42.6 μl (40 mg) of mineral oil (Aldrich product, specific gravity 0.94) was added and mixed for 20 minutes using a pestle to obtain a paste. Silicone rubber frame (15 × 12 × 1mm) provided on a part of platinum electrode (working electrode and counter electrode) (2 × 16mm) formed by screen printing method on ceramic flat substrate (15 × 20mm) ) To prepare a sensor as shown in FIG. Here, the silicone rubber frame is placed on the ceramic flat substrate, and the sensor is stored in the measurement cell, and is installed in the lower part of the cell for the FIA system divided into two parts, the upper part and the lower part. It was fixed by screwing.

FIAシステムは、キャリア(送液溶液)溜のビン、送液チューブ、送液ポンプ、サンプル打ち込み用インジェクター、センサー測定用セル、電気化学検出器、廃液溜のビンから構成されており、かかる測定装置のセルにセンサーが格納された。   The FIA system consists of a carrier (liquid feed solution) reservoir bottle, a liquid feed tube, a liquid feed pump, a sample injection injector, a sensor measurement cell, an electrochemical detector, and a waste liquid reservoir bottle. The sensor was stored in the cell.

サンプルとしては、pH6.86リン酸緩衝液を用いて所定濃度とした過酸化水素が用いられ、サンプル注入にはインジェクターが用いられた。インジェクターとセンサー間距離は21cm、チューブ径は内径：0.75mm、外径：1.60mmであり、サンプル注入量は137μl、キャリヤとしては、50mMKCl、8.2mM安息香酸を含むpH5.0緩衝液が用いられ、キャリア流速を0.92ml/分としたところ、１サンプル測定に要した時間は95秒であった。   As a sample, hydrogen peroxide having a predetermined concentration using pH 6.86 phosphate buffer was used, and an injector was used for sample injection. The distance between the injector and the sensor is 21 cm, the tube diameter is 0.75 mm inside diameter, 1.60 mm outside diameter, the sample injection volume is 137 μl, and the carrier is pH 5.0 buffer containing 50 mM KCl, 8.2 mM benzoic acid. When the carrier flow rate was 0.92 ml / min, the time required for one sample measurement was 95 seconds.

測定は、室温下において、電極の印加電圧を400mV(酸化電流測定)、-50mV（還元電流測定）の条件下で行われた。測定の間、平面基板からのペーストの剥離はみられなかった。   The measurement was performed at room temperature under conditions of 400 mV (oxidation current measurement) and -50 mV (reduction current measurement). During the measurement, no peeling of the paste from the flat substrate was observed.

比較例１
実施例１において、カーボンナノチューブが用いられず、グラファイトパウダー量が60mgに変更されて用いられた。 Comparative Example 1
In Example 1, carbon nanotubes were not used, and the amount of graphite powder was changed to 60 mg.

実施例１(○)および比較例１(●)で得られた結果は、図１(測定電圧400mV)および２(測定電圧-50mV)に示される。カーボンナノチューブが用いられた実施例１の出力(感度)は、比較例１のそれよりも高いことが確認された。   The results obtained in Example 1 (◯) and Comparative Example 1 (●) are shown in FIGS. 1 (measurement voltage 400 mV) and 2 (measurement voltage −50 mV). It was confirmed that the output (sensitivity) of Example 1 in which carbon nanotubes were used was higher than that of Comparative Example 1.

比較例２
実施例１において、シリコーンゴム枠が設けられなかったところ、キャリアの送液により、ペーストは電極端子から剥がれてしまい、測定には至らなかった。 Comparative Example 2
In Example 1, when the silicone rubber frame was not provided, the paste was peeled off from the electrode terminal due to the feeding of the carrier, and measurement was not achieved.

実施例２
実施例１において、ペーストとしてさらにグルコースオキシダーゼ(シグマ社製品G7016、タイプ VII−S、166500U/g)39.6mg(66000ユニット)を混合したものが用いられ、サンプルとして過酸化水素の代わりにリン酸緩衝液(pH6.86)を用いて所定濃度としたグルコースが用いられた。なお、測定の間、平面基板からのペーストの剥離はみられなかった。 Example 2
In Example 1, a paste further mixed with 39.6 mg (66000 units) of glucose oxidase (Sigma G7016, type VII-S, 166500 U / g) was used as a paste, and phosphate buffer was used instead of hydrogen peroxide as a sample. Glucose having a predetermined concentration using a liquid (pH 6.86) was used. During the measurement, no peeling of the paste from the flat substrate was observed.

比較例３
比較例１において、ペーストとしてさらにグルコースオキシダーゼ(シグマ社製品G7016、タイプ VII−S、166500U/g)39.6mg(66000ユニット)を混合したものが用いられ、サンプルとして過酸化水素の代わりにリン酸緩衝液(pH6.86)を用いて所定濃度としたグルコースが用いられた。なお、測定の間、平面基板からのペーストの剥離はみられなかった。 Comparative Example 3
In Comparative Example 1, a paste further mixed with 39.6 mg (66000 units) of glucose oxidase (Sigma G7016, type VII-S, 166500 U / g) was used as a paste, and phosphate buffer was used instead of hydrogen peroxide as a sample. Glucose having a predetermined concentration using a liquid (pH 6.86) was used. During the measurement, no peeling of the paste from the flat substrate was observed.

実施例２(○)および比較例３(●)で得られた結果は、図３(測定電圧400mV)および４(測定電圧-50mV)に示される。カーボンナノチューブが用いられた実施例２の出力(感度)は、比較例３のそれよりも高いことが確認された。   The results obtained in Example 2 (◯) and Comparative Example 3 (●) are shown in FIGS. 3 (measurement voltage 400 mV) and 4 (measurement voltage −50 mV). It was confirmed that the output (sensitivity) of Example 2 in which carbon nanotubes were used was higher than that of Comparative Example 3.

比較例４
実施例２において、シリコーンゴム枠が設けられなかったところ、キャリアの送液により、ペーストは電極端子から剥がれてしまい、測定には至らなかった。 Comparative Example 4
In Example 2, when the silicone rubber frame was not provided, the paste was peeled off from the electrode terminal due to the feeding of the carrier, and measurement was not achieved.

実施例３
実施例２において、サンプルとしてリン酸緩衝液(pH6.86)緩衝液を用いて0.2mMとしたアスコルビン酸および100mg/dlグルコースが用いられ、所定の測定電圧における出力を測定した。 Example 3
In Example 2, ascorbic acid and 100 mg / dl glucose adjusted to 0.2 mM using a phosphate buffer (pH 6.86) buffer as a sample were used, and the output at a predetermined measurement voltage was measured.

比較例５
比較例３において、サンプルとしてリン酸緩衝液(pH6.86)を用いて0.2mMとしたアスコルビン酸および100mg/dlグルコースが用いられ、所定の測定電圧における出力を測定した。 Comparative Example 5
In Comparative Example 3, ascorbic acid and 100 mg / dl glucose adjusted to 0.2 mM using a phosphate buffer (pH 6.86) were used as samples, and the output at a predetermined measurement voltage was measured.

実施例３および比較例５で得られた測定結果より、選択比＝(100mg/dlグルコースの出力）/(0.2mMアスコルビン酸の出力）を算出し、グルコース測定の妨害物質となるアスコルビン酸のセンサー応答に対する影響を検討した。実施例３(○)および比較例５(●)における算出値は、図５に示される。還元側（マイナス側電圧）および酸化側（プラス側電圧）のいずれにおいても、特に還元側では明らかにカーボンナノチューブ配合電極の方が選択性に優れていることが確認された。   From the measurement results obtained in Example 3 and Comparative Example 5, a selection ratio = (output of 100 mg / dl glucose) / (output of 0.2 mM ascorbic acid) was calculated, and a sensor for ascorbic acid serving as an interfering substance for glucose measurement The effect on response was examined. The calculated values in Example 3 (◯) and Comparative Example 5 (●) are shown in FIG. In both the reduction side (minus side voltage) and the oxidation side (plus side voltage), it was confirmed that the carbon nanotube-containing electrode was clearly superior in selectivity, particularly on the reduction side.

本発明に係るバイオセンサーは、各種測定システム、殊にFIAシステムに用いられた場合にあっても、優れた選択性を発揮するものであり、各種溶液中の成分濃度を電気化学的に測定するセンサー、例えば酵素などを利用して目的物質を電気化学的に測定する、家庭内自己診断用の血糖センサー、尿糖センサー、タンパク質や核酸の機能、構造解明に用いるプロテインチップ、DNAチップ、環境管理のための水質検査などに用いられるセンサーなどとして有効に用いられる。   The biosensor according to the present invention exhibits excellent selectivity even when used in various measurement systems, particularly FIA systems, and electrochemically measures component concentrations in various solutions. Sensor, for example, an enzyme to measure the target substance electrochemically, blood glucose sensor for home self-diagnosis, urine sugar sensor, protein and nucleic acid function, protein chip used for structure elucidation, DNA chip, environmental management It is effectively used as a sensor used for water quality inspections.

実施例１(○)および比較例１(●)の測定電圧400mV(酸化電流測定)における過酸化水素に対する出力値を示すグラフである。It is a graph which shows the output value with respect to hydrogen peroxide in the measurement voltage of 400mV (oxidation current measurement) of Example 1 ((circle)) and Comparative Example 1 (-). 実施例１(○)および比較例１(●)の測定電圧-50mV(還元電流測定)における過酸化水素に対する出力値を示すグラフである。It is a graph which shows the output value with respect to hydrogen peroxide in the measurement voltage -50mV (reduction current measurement) of Example 1 ((circle)) and Comparative Example 1 (-). 実施例２(○)および比較例３(●)の測定電圧400mV(酸化電流測定)におけるグルコースに対する出力値を示すグラフである。It is a graph which shows the output value with respect to glucose in the measurement voltage 400mV (oxidation current measurement) of Example 2 ((circle)) and Comparative Example 3 (-). 実施例２(○)および比較例３(●)の測定電圧-50mV(還元電流測定)におけるグルコースに対する出力値を示すグラフである。It is a graph which shows the output value with respect to glucose in the measurement voltage -50mV (reduction current measurement) of Example 2 ((circle)) and Comparative Example 3 (-). 実施例３(○)および比較例５(●)のグルコースのアスコルビン酸に対する選択比の電圧依存性を示すグラフである。It is a graph which shows the voltage dependence of the selection ratio with respect to ascorbic acid of glucose of Example 3 ((circle)) and Comparative Example 5 (-). 本発明に係るバイオセンサーの一実施態様である。It is one embodiment of the biosensor which concerns on this invention. 本発明に係るバイオセンサーの他の実施態様である。It is another embodiment of the biosensor according to the present invention.

符号の説明Explanation of symbols

１ センサー本体
２ 基板
３ 電極
４ 枠
５ ペースト
1 Sensor body 2 Substrate 3 Electrode 4 Frame 5 Paste

Claims (12)

基板上に形成された電極の少なくとも一方の電極上に部分的または全体的に枠体を設け、該枠体内にナノカーボンおよび粘性バインダーを混合したペーストを電極に接触するように充填してなるナノカーボンセンサー。   Nano that is formed by providing a frame partly or entirely on at least one of the electrodes formed on the substrate and filling the frame with a paste in which nanocarbon and a viscous binder are mixed so as to contact the electrode. Carbon sensor. 作用極および対極のいずれか一方の電極上に枠体が設置され、枠体内にペーストを充填した請求項１記載のナノカーボンセンサー。   The nanocarbon sensor according to claim 1, wherein a frame is installed on one of the working electrode and the counter electrode, and the paste is filled in the frame. 作用極および対極の両方の電極上に枠体が設置され、少くとも一方の枠体内にペーストを充填した請求項１記載のナノカーボンセンサー。   The nanocarbon sensor according to claim 1, wherein a frame is installed on both the working electrode and the counter electrode, and at least one of the frames is filled with paste. ナノカーボン混合割合が5〜90重量％であるペーストが用いられた請求項１記載のナノカーボンセンサー。   The nanocarbon sensor according to claim 1, wherein a paste having a nanocarbon mixing ratio of 5 to 90% by weight is used. 粘性バインダーがミネラルオイル、ブロモホルム、ヌジョール、ポリテトラフルオロエチレン樹脂またはナフィオンである請求項１記載のナノカーボンセンサー。   The nanocarbon sensor according to claim 1, wherein the viscous binder is mineral oil, bromoform, nujol, polytetrafluoroethylene resin or Nafion. 枠体がゴム製またはプラスチック製枠体である請求項１記載のナノカーボンセンサー。   The nanocarbon sensor according to claim 1, wherein the frame is a rubber or plastic frame. さらに導電性配合剤が50重量％以下混合されたペーストが用いられた請求項１記載のナノカーボンセンサー。   The nanocarbon sensor according to claim 1, further comprising a paste mixed with 50% by weight or less of a conductive compounding agent. 導電性配合剤がグラファイト、ケッチェンブラック、アセチレンブラック、インジウム・スズ酸化物、酸化チタン、酸化亜鉛、ニッケル、銅、銀およびコバルトの少くとも一種である請求項７記載のナノカーボンセンサー。   The nanocarbon sensor according to claim 7, wherein the conductive compounding agent is at least one of graphite, ketjen black, acetylene black, indium tin oxide, titanium oxide, zinc oxide, nickel, copper, silver and cobalt. 分子識別素子が、ペースト中に配合されまたはペースト上に配置された請求項１または５記載のナノカーボンセンサー。   The nanocarbon sensor according to claim 1 or 5, wherein the molecular identification element is blended in or disposed on the paste. 分子識別素子が酵素、酵素のミュータント、抗体、核酸、プライマー、ペプチド核酸、核酸プローブ、アプタマー、微生物、オルガネラ、シャペロン、レセプター、細胞組織、クラウンエーテル、メデイエーター、挿入剤、補酵素、抗体標識物質、基質、界面活性剤、脂質、アルブミン、ナフィオン、チオール基導入試薬および共有結合試薬の少なくとも一種である請求項９記載のナノカーボンセンサー。   Molecular identification element is enzyme, enzyme mutant, antibody, nucleic acid, primer, peptide nucleic acid, nucleic acid probe, aptamer, microorganism, organelle, chaperone, receptor, cell tissue, crown ether, mediator, intercalator, coenzyme, antibody labeling substance The nanocarbon sensor according to claim 9, which is at least one of a substrate, a surfactant, a lipid, albumin, Nafion, a thiol group introduction reagent, and a covalent bond reagent. 分子識別素子が混合されたペースト表面上またはペースト上に配置された分子識別素子上に、さらに有機物質層が形成された請求項９記載のナノカーボンセンサー。   The nanocarbon sensor according to claim 9, wherein an organic material layer is further formed on the surface of the paste mixed with the molecular identification element or on the molecular identification element arranged on the paste. 測定システムとしてフローインジェクションアナリシス(FIA)法またはバッチ法に用いられる請求項１記載のナノカーボンセンサー。
The nanocarbon sensor according to claim 1, which is used as a measurement system in a flow injection analysis (FIA) method or a batch method.
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