NO347079B1 - Forbedrede protofibrilselektive antistoffer og anvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår forebygging, behandling og diagnose av neurodegenerative sykdommer, særlig Alzheimers sykdom og andre liknende sykdommer. Mer presist angår den høyaffinitet 10 <-7 >M, fortrinnsvis 10<-8 >M, enda mindre enn 10<-10 >M eller 10<-11 >M antistoffer, selektive for amyloid betaprotein (A β) i dets protofibrille konformasjon og av IgG-klasse og IgG1- eller IgG4-underklasse eller kombinasjoner derav eller mutasjoner derav, som bibeholder høy Fcreseptorbinding og lav C1(C1q)-binding, som er effektive ved klarering av A βprotofibriller og som reduserer risikoen for inflammasjon.

Alzheimers sykdom (AD) er en progressiv irreversibel neurodegenerativ sykdom som forårsaker kognitive, hukommelses- og atferdsmessige innskrenkninger. Det er den vanligste årsak til demens i den eldre befolkning og påvirker grovt 5 % av populasjonen over 65 år og 20 % over 80 år. AD er karakterisert ved en snikende igangsettelse og progressiv nedbrytning av et flertall kognitive funksjoner.

Neuropatologien involverer både ekstracellulære og intracellulære argyrofile proteindeponeringer. De ekstracellulære deponeringer referert til som neurittiske plakk består hovedsakelig av amyloid betaprotein (A β) omgitt av dystrofe neuritter (hovne, forvrengte neuronale utløpere). A β i disse ekstracellulære deponeringer er fibrillære i sin karakter med en β-plate lagstruktur. A β i disse deponeringer kan farges med visse fargestoffer, f.eks. kongorødt, og viser en fibrillær ultrastruktur. Disse egenskaper, tatt opp av A β i sin fibrillære struktur i neurittiske plakk er definisjonen av den generiske betegnelsen amyloid. Den klassiske intracellulære AD patologiske lesjonen er neurofibrillær fase (NFT) som består av filamentstrukturer kalt parede heliske filamenter (PHF’er), sammensatt av vridde tråder av hyperfosforylerte mikrotubul-assosierte protein tau. Høye neurittiske plakk og neurofibrillære floker avsatt i hjernen er diagnostiske kriterier for AD, utført post mortem. AD-hjerne viser også makroskopisk hjerneatrofi, nervecelletap, lokal inflammasjon (mikrogliose og astrocytose) og ofte cerebral amyloid angiopati (CAA) i cerebrale karvegger.

To former av A β-peptider, A β40 og A β42 er de dominante typene i AD neurittiske plakk mens A β40 er den prominente typen i serebrovaskulær amyloid assosiert med AD. Enzymatiske aktiviteter tillater A β å dannes kontinuerlig fra et større protein kalt amyloid forløperprotein (APP) i både friske og AD-påvirkede individer i alle celler i kroppen. To viktige APP-prosesserende hendelser gjennom β- og γsekretaseaktiviteter gjør A β-produksjon mulig, mens et tredje enzym som kalles αsekretase, forhindrer A β-dannelse ved spalting inne i A β-sekvensen (Selkoe, 1994, Ester 2001, US 5604 102). A β42 er et 42 aminosyrer langt peptid, dvs. to aminosyrer lenger enn C-terminus, sammenlignet med A β40. A β42 er mer hydrofob og aggregerer lettere i større strukturer av A β-peptider (Jarret 1993), så som A βdimerer, A β-trimerer, A β-tetramerer, A β-oligomerer, A β-protofibriller eller A βfibriller. A β-fibriller er hydrofobiske og uløselige, mens de andre strukturene er mindre hydrofobe og løselige. Alle disse høyere molekylære strukturer av A βpeptider er individuelt definert basert på deres biofysiske og strukturelle utseende, f.eks. i elektronmikroskopi, og deres biokjemiske egenskaper, f.eks. ved analyse med størrelseseksklusjonskromatografi/western blot. Disse A β-peptider, særlig A β42, vil gradvis samle seg til forskjellige høyere molekylære strukturer av A β i løpet av livstiden. AD som er en sterkt aldersavhengig lidelse vil skje tidligere i livet hvis denne samlingsprosessen skjer hurtigere. Dette er kjernen av ”amyloid kaskade hypotesen” til AD som hevder at APP-prosessering, A β42-nivåer og deres sammensetning i høyere molekylære strukturer er en sentral årsak til AD. All annen neuropatologi i AD-hjernen og symptomene på AD så som demens blir på én eller annen måte forårsaket av A β eller sammensatte former derav.

A β kan eksistere i forskjellige lengder, dvs. 1-39, 1-40, 1-42 og 1-43 og fragmentstørrelser, dvs. 1-28 og 25-35. Trunkeringer kan foregå i N-terminus av peptidet. Alle disse peptidene kan aggregere og danne løselige mellomprodukter og uløselige fibriller, hvor hver molekylær form har en unik strukturell konformasjon og biofysiske egenskaper. Monomere A β1-42 er f.eks. et 42 aminosyrer langt løselig ikke-toksisk peptid som er foreslått å være involvert i normale synapsefunksjoner. Under visse betingelser kan A β1-42 aggregere til dimerer, trimerer, tetramerer, pentamerer opptil 12-merer og høyere oligomere former, alle med atskilte fysisk-kjemiske egenskaper så som molekylstørrelse, EM-struktur og AFM (atomkraftmikroskopi) molekylær fasong. Et eksempel på et høyere molekylvekt løselig oligomer A β-form er protofibrillen (Walsh 1997), som har en tilsynelatende molekylvekt større enn 100 kDa og en kurvelineær struktur på 4-11 nm i diameter og < 200 nm i lengde. Det har nylig blitt vist at løselige oligomere A β-peptider så som A β-protofibriller forhindrer langtids potensiering (LTP) som er et mål for synaptisk plastisitet som er ment å reflektere hukommelsesdannelse i hippocampus (Walsh 2002). Videre viser oligomere arktisk (Arctic) A β-peptider en kraftigere inhibitorisk effekt enn wtA β på LTP i hjernen, noe som sannsynligvis skyldes deres sterke tilbøyelighet til å danne A β-protofibriller (Klyubin 2003).

Det er også andre løselige oligomere former beskrevet i litteraturen som er klart forskjellig fra protofibriller. En slik oligomer form er ADDL (amyloid avledet diffunderbar ligand) (Lambert 1998). AFM-analyse av ADDL viste hovedsakelig små globulære enheter på 4,7-6,2 nm langs z-aksen med molekylvekter på 17-42 kDa (Stine 1996). En annen form er kalt ASPD (amyloidsfæroider) (Hoshi 2003). ASPD er runde oligomere av A β1-40. Toksisitetsundersøkelser viste at kuleformede ASPD > 10 nm var mer toksisk enn lavere molekylære former (Hoshi 2003). Denne idé har oppnådd støtte fra den nylige oppdagelsen av arktisk (E693) APP-mutasjon, som forårsaker tidlig igangsettende AD (US 2002/0162129 A1, Nilsberth et al., 2001). Mutasjonen er lokalisert inne i A β peptidsekvensen. Mutasjonsbærere vil derved danne varianter av A β-peptider, f.eks. arktisk A β40 og arktisk A β42. Både arktisk A β40 og arktisk A β42 vil mye lettere samle seg til høyere molekylære strukturer, dvs. protofibriller. Således foreslår den patogene mekanismen til arktisk mutasjonen at de løselige høymolekylære protofibriller forårsaker AD og inneholder en spesifikk unik epitop, dvs. ”AD sykdomsepitopen”.

I en hjerne med Alzheimers sykdom (AD) er ekstracellulære amyloide plakk typisk funnet i parenchyma og karveggene. Plakkene er sammensatt av amyloid (A β38-43 aminosyrer lange hydrofobe og selvaggregerende peptider, som gradvis polymeriseres før plakkdeponering. De løselige A β-oligomere forbindelsene er blitt foreslått å være bedre korrelert til sykdommen enn de amyloide plakkene i seg selv (McLean et al., 1999, Näslund et al., 2000). Blant disse prefibrillære mellomprodukt A β-forbindelsene har oligomere former blitt vist å utløse negative biologiske virkninger både in vitro og in vivo (Walsh et al., 2002) og kan således spille en sentral rolle i sykdomspatogenese. Flere oligomere A β-forbindelser med forskjellige molekylstørrelser er kjent. Av viktighet er konformasjonen av monomere, oligomere og fibrillære former av A β forskjellige og kan målrettes med konformasjonelle selektive antistoffer. Identiteten til det viktigste A β-patogen er uklar, skjønt noen resultater antyder at høy molekylvekt A β-oligomerer er spesielt neurotoksiske (Hoshi et al., 2003).

Patogene mutasjoner i amyloid forløperprotein (APP) genet, som forårsaker tidlig igangsettende AD er blitt beskrevet. En av dem, den svenske APP-mutasjon (Mullan et al., 1992), forårsaker økede nivåer av A β. Den andre arktisk APP-mutasjon (E693G) lokalisert i A β-domenet ble funnet å forsterke dannelsen av protofibriller, store A β-oligomerer, noe som antyder at disse A β mellomproduktene er spesielle patogener ((US 2002/0162129 A1, Nilsberth et al., 2001). Identifikasjon av den Arctic APP-mutasjon og klargjøring av de toksiske virkningene for A βprotofibriller har øket fokus på A β-oligomerer i AD-patogenese.

Aktiv immunisering som en terapeutisk strategi for Alzheimers sykdom ble først rapportert av (Schenk et al. 1999). Målet for immuniseringsstrategien var den fibrillære formen til A β funnet i Alzheimers plakk. En nylig klinisk fase I/II utprøvning av aktiv A β-vaksinering ved å bruke fibrillisert A β som en vaksine (AN-1792) måtte stoppes fordi det ble utviklet meningoenkefalitt i et lite antall pasienter (Bayer et al., 2005). Bivirkningene sett i denne undersøkelsen ble sannsynligvis forårsaket av anti-A β-antistoffer som reagerte mot fibrillær amyloid i karvegger. Det fibrillære amyloid i CAA er i tett nærhet til blod-hjernebarrieren (BBB) og antigen-antistoffreaksjonen kunne således danne skade på BBB som førte til infiltrasjon av T-lymfocytter i sentralnervesystemet (CNS) (Pfeifer et al., 2002, Racke et al., 2005). Videre viste bare et mindretall av de deltagende pasientene en immunrespons på A β-vaksinen. Skjønt undersøkelsen ble avsluttet prematurt synes den å implisere at aktiv A β-immunisering kan være gunstig bare for en undergruppe av AD-pasienter.

Monoklonale antistoffer selektive for humane A β-protofibriller er blitt beskrevet (US 2002/0162129 A1). Fremgangsmåten til å danne meget rene og stabile humane A β-protofibriller involverer anvendelse av syntetiske A β42-peptider med den Arctic mutasjon (Glu22Gly). Mutasjonen fasiliterer immunisering og hybridomscreening for A β-protofibrille selektive antistoffer. Av viktighet, disse antistoffene binder både villtype A β-protofibriller og A β-Arc protofibriller (WO 2005/123775).

WO 2002/003911 beskriver en patogen AD-mutasjon referert til som "arktisk mutasjon" og foreslår å bruke et peptidfragment som inneholder denne mutasjonen som en del av en immuniseringsstrategi med sikte på å behandle AD. WO 2004/024090 beskriver produksjonen av molekylære etterligninger av amyloidpeptidaggregater og generering av polyklonale kaninantistoffer som binder seg til nevnte molekylære etterligninger.Antistoffer som er selektive mot andre konformasjoner av A β så som A β-fibriller (O’Nuallain 2002), micellær A β (Kayed 2003), ADDL (Lambert 2001), er blitt beskrevet. Ingen av disse er imidlertid A βprotofibrillselektive.

Den foreliggende oppfinnelse angår forbedrede antistoffer, dvs. høy affinitet (mindre enn 10<-7 >M) A β-protofibrille selektive antistoffer av klasse IgG og underklasse IgG1 eller IgG4 eller kombinasjon derav, eller mutasjoner derav, med redusert risiko for inflammasjon, for forbedret forebygging, behandling og diagnose av Alzheimers sykdom, Downs syndrom eller andre neurodegenerative lidelser. Nevnte antistoffer er blitt utviklet ved klassisk hybridomateknikker og antistoffkonstruksjon.

Oppfinnelsen beskriver konsensus aminosyresekvens til CDR1-3-regioner på VL-og VH-kjeder fra antistoffene som selektivt binder oligomere A β-former, dvs. A βprotofibriller som utgjør ”Alzheimer sykdom epitopen”, kombinert med modifikasjoner av Fc-regionen for å redusere komplementfaktor C1q-binding, redusere risikoen for komplementaktivering og inflammasjon.

Den konstante region til et antistoff har mange viktige funksjoner, nemlig å binde Fc-reseptorer og komplementfaktor C1q. Den siste funksjonen er blitt inaktivert for å unngå inflammatoriske reaksjoner.

I oppsummering har denne type av høyaffinitets protofibrillselektive antistoffer følgende klare fordeler sammenlignet med andre kjente immunoterapeutiske behandlingsmodaliteter:

1) målretter sykdom forårsaket av A β-protofibriller med høy affinitet, 2) reduserer risikoen for inflammatoriske bivirkninger, dvs. meningoenkefalitt, ved lav eller ingen binding til komplementfaktor C1q,

3) høy affinitet antistoff reduserer den kliniske dosen som er nødvendig for en effektiv behandling,

4) tilveiebringer en modalitet med nøyaktig dosering,

5) mindre binding til A β-fibriller i blodkarveggen, dvs. CAA, noe som reduserer risikoen for inflammatoriske bivirkninger,

6) mindre antistoff er funnet i periferien, således vil mer krysse blodhjernebarrieren og være tilgjengelig for binding og eliminering av A β oligomere former i hjernen.

En side av oppfinnelsen er oppdagelsen av antistoff konsensus aminosyresekvensen til CDR-regioner som binder human villtype A β-protofibriller (eksempel 1). Denne oppdagelsen definerer bindingssetene (CDR-regioner) som gir høy affinitet og høy selektivitet for villtype humane A β-protofibriller for anvendelse som terapeutika eller diagnostika. Den basiske struktur til et immunoglobulin til (IgG) molekyl omfatter to identiske lette kjeder og to identiske tunge kjeder koblet sammen av disulfidbroer (fig. 1). Den lette kjeden som enten er lambda eller kappa har variabel region (VL) og en konstant region (CL) på ca. 110 aminosyreresiduer hver. Den tunge kjeden har en variabel region (VH) på ca. 110 aminosyreresiduer, men en mye større konstantregion (CH) på 300-400 aminosyreresiduer, som omfatter CH γ1-, CH γ2- og CH γ3-regioner eller domener.

Den konstante region (Fc) aktiverer komplementsystemet og bindes til en Fcreseptor på makrofager, mikroglia og neutrofiler, som fordøyer og ødelegger infiserende mikroorganismer av fremmede/ fremmedlegeme antigener. Denne funksjonen er spesielt viktig siden den er del av det terapeutiske prinsippet til antistoffet, dvs. Fc-reseptormediert mikroglial fagocytose og klarering av A βprotofibriller. Andre antistoffmedierte klareringsmekanismer er også virksomme, dvs. anti-aggregeringsegenskaper til A β-antistoffer og klarering av A β-protofibriller i periferien, i henhold til utslagshypotesen. Den variable region til tung og lett kjede som inneholder tre hypervariable regioner kalt komplementært bestemmende regioner eller CDR’er. CDR-regionene er korte områder på ca. 13-23 aminosyrer lange, lokalisert i VL- og VH-regionene. De seks CDR’er regioner på én ”arm” av antistoffet danner ”lommen” som binder antigenet. Fig. 1 viser den basiske struktur til et IgG immunglobulin og dens underdomener.

En annen side av oppfinnelsen angår protofibrillselektive antistoffer med høy affinitet. Affiniteter i området på 10<-7 >M, fortrinnsvis 10<-8 >M, til og med mindre enn 10<-9 >M, mindre enn 10<-10 >M, eller mindre enn 10<-11 >M for protofibriller er beskrevet (eksempel 2). Disse antistoffene har den fordelen at de kan administreres i lavere doser sammenlignet med antistoffer med affiniteter i 10<-6 >M området. Dette har signifikant klinisk fordel ved at disse høyaffinitetsantistoffene, som blir administrert ved injeksjon, kan gis subkutant siden bare en lav mengde av antistoffet er nødvendig for å gi effekt. Administrasjonsmodaliteter er ikke begrenset til subkutane injeksjoner. Ytterligere vil de lavere dosene som er nødvendig for effekt redusere omkostningene til materialer for produksjon av antistoffet. En annen side av oppfinnelsen er at antistoffene er av IgG-klasse, egnet for terapeutisk anvendelse siden den kan passere over blod-hjernebarrieren.

Klarering av A β-protofibriller i hjerneparenchymet blir oppnådd ved Fcreseptormediert fagocytose av mikrogliaceller. Andre anti-A βklareringsmekanismer er sannsynligvis også virksomme. Denne klareringen av løselig A β-protofibriller er en sentral mekanisme ved behandlingen. A βprotofibriller er betraktet som meget neurotoksiske, som initierer og driver sykdomsprosessen. Klarering av A β-protofibriller i hjernen er av signifikant klinisk verdi. I tillegg til klarering av A β-protofibriller vil andre A β-oligomere former inkluder A β-fibriller reduseres indirekte via fjerning av A β-protofibriller siden forskjellige A β-aggregerte former, dvs. dimerer, trimerer, tetramerer og høyere oligomere former inkludert protofibriller og fibriller, er i likevekt. Eksempel på reduksjon av plakk som inneholder A β-fibriller er vist i en Alzheimer transgen på musemodell (APPswe) etter 72 timers behandling med et høyaffinitets protofibrill selektivt antistoff (mAb 158) (eksempel 3). Følgelig vil klarering av A βprotofibriller av nevnte antistoff også ha den fordelen at den indirekte reduserer andre A β-aggregater eller oligomere former.

Enda en annen side av oppfinnelsen er et høyaffinitets humant A β-protofibrilt selektivt antistoff av underklasse IgG1, som har en høy affinitet for humane Fc γRI-reseptorer tilstede på mikrogliale celler i hjernen. Et høyaffinitets antistoff vil føre til effektiv klarering av A β-protofibriller som vil være av signifikant terapeutisk verdi. Følgelig vil antistoffene utvise klarering av A β-protofibriller, både i CNS og periferien sammenlignet med andre immunoterapeutiske strategier, så som aktiv vaksinering eller monoklonale antistoffbehandlinger med andre monoklonale antistoffer av IgG1-underklasse som målretter andre A β-former. Av viktighet, behandlingen vil være effektiv tidlig i sykdomsprosessen når toksiske løselige A βelementer så som A β-protofibriller er tilstede med forhøyede nivåer men også senere i sykdomsprosessen. Forhøyede nivåer av oligomere A β-former er blitt beskrevet i en transgen musemodell som utviser de svenske og Arctic mutasjoner APP swearc (Lord A. et al. 2006). Enda en annen side av oppfinnelsen er at de høyaffinitets A β-protofibrillselektive antistoffene kan redusere eller inhibere A βaggregering for derved å redusere nivået av løselige oligomere A β-former i hjernen.

Enda en annen side av oppfinnelsen er at de høyaffinitets A β-protofibrillselektive antistoffer kan i tillegg binde oligomere former av A β, dvs. A β-protofibriller utenfor CNS, for derved å forskyve likevekten av nevnte A β-former over blodhjernebarrieren på en slik måte at CNS-nivåene av nevnte A β-former senkes (dreneres).

Som diskutert ovenfor resulterte den kliniske undersøkelsen Elan som benyttet en A β-vaksine (AN-1792) som var selektiv for A β-fibriller til å behandle Alzheimer pasienter i en bivirkning, dvs. meningoenkefalitt, i 6 % av tilfellene. Strategien å målrette A β-fibriller som er kjernen til de amyloide plakkene tilstede i hjerneparenchymet men viktig også i blodkarveggene resulterte i alvorlige bivirkninger. Bivirkningene var mest sannsynlig forårsaket av binding av antistoffer til CAA (cerebral amyloid angiopati) i blodkarveggene i hjernen, noe som startet en inflammatorisk prosess. Dette signifikante kliniske problem blir unngått ved de forbedrede høyaffinitets protofibrillselektive antistoffer med redusert komplementaktiveringsaktivitet. Disse antistoffene vil bibeholde høy klareringseffektivitet for A β-protofibriller med redusert risiko for bivirkninger, dvs. meningoenkefalitt.

En annen side av oppfinnelsen er at de høyaffinitets protofibrillselektive antistoffer har lav A β-fibrillbinding (se eksempel 2), noe som reduserer risikoen for bivirkninger ved mindre binding til A β-fibriller som er tilstede i CAA.

Enda en annen side av oppfinnelsen er at de høyaffinitets A β-protofibrillselektive IgG-antistoffer er konstruert slik at komplement faktor C1q-binding til CH2-domenet i IgG1 reduseres og komplementaktivering og risiko for inflammasjon reduseres. Denne modifikasjon kan gjøres på flere forskjellige måter. En måte er å fremstille et kimerisk antistoff hvor CH γ2-domenet i IgG1 konstant region er blitt fjernet og utvekslet for det tilsvarende domenet fra IgG4 eller del av domenet som gir C1q-binding. Det er vel etablert at IgG4 ikke binder C1q og følgelig ikke aktiverer komplementkaskaden. For å oppnå dette blir den konstante region i den tunge kjede (CH) konstruert slik at høyaffinitets Fc-reseptordomenet (CH γ3) på IgG1 kombineres med IgG4-domenet (CH γ2) som ikke har noe binding for komplementfaktor C1q. Dette nye antistoffet som inneholder den kimeriske konstante tunge kjede (IgG1:CH γ1, CH γ2:IgG4, CH γ3:IgG1) vil ha de viktige egenskapene så som både effektivt klarering av A β-protofibriller gjennom Fcreseptormediert fagocytose og redusert risiko for bivirkninger, dvs. inflammasjon så som meningoenkefalitt.

Enda en annen måte til å redusere risikoen for inflammasjon er å forandre oligosakkaridstrukturen til antistoffet som vil redusere komplement faktor C1qbinding og komplementaktivering. 30 forskjellige strukturer av komplekse dobbeltantenne oligosakkarider på Asn-297 i humant IgG1 er blitt beskrevet. Fravær av CH2-assosierte karbohydrater er trodde å forårsake en konformasjonell forandring i sin ”hengsel” regionen til antistoffet, noe som reduserer interaksjonseffektiviteten med effektormolekyler og tap av komplementaktiveringsfunksjon og C1q-binding.

Modifikasjon av et høyaffinitets humant A β-protofibrillselektivt antistoff ved setestyrt mutagenese av Asn-297 til enhver annen aminosyre vil danne et antistoff av bibeholdt Fc-reseptorbinding med mindre C1q-binding og følgelig redusert risiko for inflammasjon særlig på blod-hjernebarrieren. Et alternativ til å modifisere glykosyleringen på antistoffet er å uttrykke antistoffet i en celletype hvor enzymet N-acetylglukosaminyl-transferase I er blitt inaktivert. Dette vil gi et antistoff med endret karbohydratstruktur på Asn-297. En struktur som Man5GlcNAc2, men ikke begrenset til denne strukturen, blir dannet. Denne karbohydratmodifikasjonen vil redusere komplementfaktor C1q-binding og inhibere inflammasjon (Wright et al. 1998). Alternativt kan glykosylerte protofibrillselektive antistoffer oppnås ved å dyrke celler som uttrykker antistoffer i nærvær av tunikamycin, som inhiberer glykosylering. Disse antistoffer vil ha endret komplementaktiveringsaktivitet så vel som endret Fc-reseptorfunksjon (Leatherbarrow et al. 1985). Screening av kloner som uttrykker antistoffer med lav komplementaktivering og høy Fc-reseptorbinding vil danne protofibrillselektive antistoffer som utviser høy Fc-mediert klarering av A β-protofibriller og lav C1q-binding.

Enda en annen side av oppfinnelsen er et høyaffinitets humant A βprotofibrillselektivt antistoff, i IgG1-underklassen, hvor komplementfaktoren C1qbindingssetet er blitt modifisert, dvs. Pro331>Ser331 (Xu et al. 1994), på en slik måte at binding av komplementfaktor C1q reduseres eller inhiberes, for behandling eller forebygging av AD. Prolinresiduet i posisjon 331 i humant IgG1 kan også forandres til et treonin eller glysin eller enhver annen polar aminosyre. Denne modifikasjonen kan oppnås ved standard molekylær biologiteknikk så som setestyrt mutagenese eller DNA-delesjoner.

Enda en annen side av oppfinnelsen er anvendelse av høyaffinitets humant A βprotofibrillselektive IgG-antistoffer til spesifikt å bestemme protofibrillnivåer i humant vev, særlig i ryggmargsvæske (RYGGMARGSVÆSKE ), blod, urin eller spytt som et diagnostisk verktøy eller biomarkør for Alzheimers sykdom. Nivåer av A β-protofibriller i ryggmargsvæske eller blod er sannsynligvis forskjellig sammenlignet med en tilpasset eldre kontrollgruppe som ikke har Alzheimers sykdom. En person som utvikler Alzheimers sykdom har sannsynligvis økte nivåer av A β-protofibrillnivåer i ryggmargsvæske eller blod. Følgelig, ved å bestemme A β-protofibrillnivåer i ryggmargsvæske eller blod kan en tidlig diagnose av sykdommen foretas. Dette er mulig å oppnå med de nye høyaffinitets A βprotofibrillselektive antistoffer i kombinasjon med en sandwich ELISA-metode (eksempel 2A), hvor A β-protofibriller er blitt bestemt ned til 10 pM nivå.

Interferering av andre A β-former så som A β-fibriller, A β-monomerer og A βfragmenter (1-16; 17-40) i assayet er 10 % eller mindre.

Oppfinnelsen angår ytterligere anvendelse av høyaffinitets protofibrill spesifikke antistoffer til bestemmelse av A β-protofibriller i humant og dyrevev, f.eks.

ryggmargsvæske, blod, serum, urin og hjernevev, men ikke begrenset til disse vevene for å tilveiebringe en mulig diagnostisk metode for Alzheimers sykdom. Egnede metoder for å assaye A β-protofibriller i disse vevene så vel som i cellekulturer ved å bruke et anti-A β-protofibrillantistoff er immunoassayer så som ELISA, RIA, Western blotting eller dot blotting. Fremgangsmåten ville være egnet til å følge behandlingseffektivitet (protofibrillreduksjon) i kliniske utprøvninger og egnet som en diagnostisk test for Alzheimers sykdom eller Downs syndrom.

Siden A β-protofibrillnivåer er meget lave i ryggmargsvæske og blod er det behov for høyaffinitets A β-protofibrillselektivt antistoff i en diagnostisk test basert på en ELISA-metode for å være i stand til å måle lave nivåer av A β-protofibriller. Andre supersensitive metoder så som nærhetsligasjon (eksempel 4) (Gullberg 2004) eller lignende amplifikasjonssystemer, eller Biacore, eller lignende teknikker kan anvendes for å øke sensitiviteten. Nærhetsligasjonsteknikk er basert på den oppdagelsen at forskjellige antistoffer, produsert mot forskjellige epitoper på en analytt (i dette tilfellet et protein), kan binde nær hverandre på nevnte analytt. Hvis nevnte forskjellige antistoffer blir konjugert til oligonukleotider vil avstanden mellom oligonukleotider være kort nok for et koblingsoligonukleotid som ved hjelp av ligasjonskomponenter danner en bro mellom oligonukleotidene.

Amplifikasjonskomponenter blir også tilført hvoretter RT-PCR kan utføres. Ved dette prinsipp blir en amplifiserbar DNA-sekvens som reflekterer identiteten og mengden til målproteinet dannet. Denne teknikken gjør det mulig å oppnå en forsterket signalrespons og således detektere lavere konsentrasjoner av analytten.

De foreliggende oppfinnere oppdaget overraskende at en modifisert nærhetsligasjonsteknikk også kan anvendes med deres A β-protofibrill spesifikke antistoffer til å detektere lave konsentrasjoner av større A β-peptidstrukturer, dvs. A β-protofibriller men ikke A β-monomerer. De oppdaget at A β-peptidene i protofibrillkonformasjonen utviser en struktur (repeterende enheter) som gjør det mulig for to antistoffer i henhold til foreliggende oppfinnelse å bindes tilstrekkelig nær hverandre på protofibrillen. Hvis nevnte antistoffer blir konjugert til oligonukleotider kan nevnte oligonukleotider forbindes med en bro ved å bruke et koblingsoligonukleotid. PCR blir utført ved å bruke amplifikasjonskomponenter. Ved dette prinsipp blir en amplifiserbar DNA-sekvens som reflekterer identitet og mengde av målprotofibrill dannet (se fig. 4A).

Nærhetsligasjon eller en versjon av teknikken kalt ”rullende sirkel” er en meget sensitiv teknikk og spesielt godt egnet for deteksjon av polymere strukturer med repeterende sekvenser så som A β-protofibriller som skal anvendes for diagnoser av Alzheimers sykdom og andre neurodegenerative lidelser.

Oppfinnelsen angår ytterligere anvendelse av høyaffinitets protofibrill spesifikke antistoffer til bildedannelse for deteksjon, lokalisering og kvantifisering av A βprotofibriller i humant og dyrevev. Antistoffet kunne merkes med en radioaktiv ligand så som I<131>, C<14>, H<3 >eller Gallium<69>, men ikke begrenset til disse radioisotopene for deteksjonshensikter. Metoden vil være egnet som et diagnostisk verktøy for Alzheimers sykdom eller Downs syndrom.

Enda en annen side av oppfinnelsen er å gjøre antistoffenhetene spesifikke for anvendelse i veterinær medisin. De diagnostiske metodene beskrevet er også egnet for veterinær anvendelse.

En annen side av oppfinnelsen er humanisering av nevnte antis toffer for å unngå bivirkning, dvs. for å unngå en immunrespons mot nevnte antistoffer hos mennesker når de benyttes som et terapeutisk eller diagnostisk middel.

Enda en annen side er en formulering av antistoffet i en fysiologisk buffer, f.eks. PBS, men ikke begrenset til PBS, som er egnet for administrering til mennesker og dyr. Antistoffproduktet kan frysetørkes for bedre stabilitet. Den frysetørkede formulering kan inneholde en eksipient så som mannitol men er ikke begrenset til mannitol for å stabilisere produktet etter frysetørking.

Antistoffproduktet kan inneholde et antibakterielt middel.

Antistoffene eller fragmenter i henhold til oppfinnelsen kan utvise aminosyredelesjoner, substitusjoner og innskudd innenfor nevnte CDR-regioner og/eller dets rammeverk. Innskutte eller substituerte aminosyrer kan også være aminosyrederivater med det forbehold at affiniteten og spesifisiteten til antistoffet fremdeles er intakt.

EKSEMPLER

De følgende eksempler er tilveiebrakt for illustrasjon og er ikke ment å begrense oppfinnelsen til disse spesifikke eksempler.

Eksempel 1.

Humane villtype A β-protofibrillselektive monoklonale antistoffer ble klonet og sekvensert. Aminosyresekvensen til den variable tungkjederegion (VH) og den variable lettkjederegion (VL) er vist i tabell 1. Posisjonene i CDR-regionene 1-3 er understreket og vist så vel i tabell 2 og 3. Aminosyresekvensene til CDR-regionene danner den strukturelle basis for binding av human villtype A β-protofibriller som utgjør ”Alzheimer sykdomsepitopen”.

Aminosyresekvensen til CDR-regioner 1-3 i VL- og VH-kjedene for et høyaffinitets protofibrilt spesifikt antistoff BA9/158 er vist i tabell 1, 2 og 3. Sekvenseringsdata for andre protofibrillselektive antistoffer (BA2, BA3, BA4 og BA7) tilveiebringer alternative aminosyresekvenser for CDR-regioner men ikke begrenset til disse. De kombinerte aminosyresekvensene til CDR1-3-regioner i VH- og VL-kjeder danner den molekylære ”lomme” som binder human A β villtypeprotofibriller med høy affinitet og spesifisitet. Denne ”lommen” danner den strukturelle basis for ”Alzheimers sykdom epitopen”. Variasjoner i CDR aminosyresekvenslengden er observert i både VH-kjeden og VL og er kompatibel for binding til humant A βprotofibriller (tabell 2 og 3). En kortere CDR-region tilveiebringer en mer begrenset tredimensjonal struktur av bindingslommen til antistoffet, mens en lengre er mer fleksibel.

Vi krever CDR-sekvensene som vist i tabell 1, 2 og 3 så vel som aminosyresekvenser i ”muserammeverk” regioner til VH- og VL-kjeder, dvs. utenfor CDR-regionen så vel som de humane VL- og VH-rammeverksregionene for protofibrill spesifikke antistoffer som vist i tabell 4 og 5, men ikke begrenset til disse.

Aminosyresekvensen til rammeverkregion i VL- og VH-regioner 1-3 i VL- og VH-kjeder fra et høyaffinitets protofibrilt spesifikt antistoff BA9/158 er vist i tabell 4 og 5.

En annen aminosyresubstitusjon i CDR-regioner enn den som er vist i tabell 1, 2 og 3 er kompatibel med høy affinitet og høy spesifisitetsbinding til human villtype A βprotofibriller. Der hvor en polar aminosyre er tilstede i en spesiell posisjon i en CDR-region kan den spesielle aminosyre substitueres med en annen polar aminosyre med bibeholdt eller forbedret høy affinitet og spesifisitet for binding til A β-protofibriller. Likeledes hvis en ikke-polar eller negativt eller positivt ladede aminosyre er tilstede i en viss posisjon kan den aminosyren substitueres med en liknende aminosyre fra samme gruppe.

I tillegg blir en spesiell aminosyre eller aminosyrer utvekslet i enhver posisjon i CDR-regionene med funksjonelle ekvivalenter som gir en lignende funksjon og struktur til antistoffet.

Eksempel 2. Karakterisering av et høyaffinitets humant A β-villtype protofibrill selektivt monoklonalt antistoff ved ELISA

Eksempel 2 viser et høyaffinitets protofibrilt selektivt antistoff som kryssreagerer 200-1000 ganger mindre med A β-monomerer og mindre enn 40 ganger med A βfibriller, som målt ved et sandwich ELISA (fig. 2A). Fra konkurrerende ELISA-eksperimenter har antistoffet en sterk affinitet for humane A β42 villtype protofibriller, men bare meget svak affinitet for den N-terminale del av A β-peptidet og A β-monomerer. Ingen binding ble observert på det C-terminale fragment av A β (fig. 2B). Videre kryssreagerer ikke antistoffet med andre typer av amyloider, så som medin eller transtyretin. Videre gjenkjenner ikke antistoffet humant APP, den rikelige forløper til A β.

I fig. 2A er et sandwich ELISA vist. Antistoff 158 ble belagt i brønnene og forskjellige A β-former ble deretter tilsatt brønnene i økende konsentrasjoner.

Måling av bundet A β-former ble gjort ved å tilsette biotinylert mAb 158 og HRP-merket streptavidin. Fargeutvikling ble målt i henhold til fremgangsmåten anbefalt av produsenten.

I fig. 2B er et konkurrerende ELISA vist. En ELISA-plate ble belagt med humane A β-protofibriller. Antistoff 158 ble deretter inkubert med økende mengder av forskjellige A β-former (konkurranse). Inkubasjonsblandingen ble tilsatt mikrotiterplatebrønnene og fritt antistoff ble tillatt å bindes til immobiliserte protofibriller i brønnene. Bundet 158 antistoff ble målt av et annet antistoff ved å bruke standard prosedyrer.

Eksempel 3.

Effektiviteten til høyaffinitets A β-protofibrillselektivt antistoff ble bestemt i en Alzheimer transgen musemodell (APPswe) ved en akutt intrakraniell injeksjon. transgene mus brukt for effektivitetsevaluering uttrykker humant APP, med den svenske mutasjon (APPSwe). I dette paradigmet blir antistoffene injisert direkte inn i plakkrike regioner i hjerneparenchymet og effekter på neuropatologien blir vurdert etter 72 timer (Wilcock et al., 2003). Andre undersøkelser har vist at den direkte anvendelse av anti-A β-antistoffet resulterer i en hurtig klarering av amyloiddeponeringer in vivo (Bacskai et al., 2001, Brendza et al., 2005). Injeksjon av høyaffinitets A β-protofibrillselektivt antistoff fører til en signifikant plakkreduksjon i APPSwe musemodellen (fig. 3).

I fig. 3 ble den terapeutiske effektivitet til et høyaffinitets protofibrillselektivt antistoff i transgen musemodell (APPswe) testet. A: En 14 måneder gammel APPSwe transgen mus ble injisert intrakraniell med PBS og B: høyaffinitets protofibrillselektivt antistoff (158) i 1 μg/ μl, og undersøkt 72 timer etter injeksjon. Markert klarering av A β-byrden er merkbar i subiculum tett ved injeksjonsstedet (B; pil) sammenlignet med kontrollstedet (A; pil).

Eksempel 4.

Nærhetsligasjon i kombinasjon med høyaffinitets protofibrill selektivt antistoff for måling av A β-protofibriller. Humane villtype A β-protofibriller ble detektert ned til 10 pM-området mens A β-monomerpreparater ikke ble detektert i det hele tatt.

Kombinasjonen av den hypersensitive nærhetsligasjonsmetoden og et høyaffinitets antistoff er spesielt fordelaktig siden det tilveiebringer et system for å bestemme bare oligomere former av analytten, som er spesielt egnet ved diagnostisering av Alzheimers sykdom og andre protein”aggregerings”sykdommer så som prionsykdom, Creutzfelt-Jakob, amyloidose og Parkinsons sykdom.

I fig. 4 blir humane A β-protofibriller målt på pM-nivåer ved nærhetsligasjonsteknikk. Nærhetsligasjonsteknikk: Fremgangsmåtebeskrivelse (fra Gullberg et al., 2004): Trinn 1, inkubering av prøve med nærhets probepar ( ≈1 t); trinn 2, tilsetting av alle komponenter nødvendig for ligasjon og deteksjon ved kvantitativ PCR ( ≈ 5 min. ligasjonstid). Et høyaffinitets protofibrill selektivt monoklonalt antistoff ble brukt i assayet; trinn 3, kvantitativ PCR ( ≈ 2 t). Syntetiske A β-monomerer og A β-protofibrillpreparater ble fortynnet og testet for sin reaktivitet i nærhetsligasjonsassayet beskrevet ovenfor.

Eksempel 5.

mAb 158 gjenkjenner ikke en generisk amyloid epitop.

Tidligere rapporterte A β-konformasjonsavhengige antistoffer er blitt vist å binde oligomerer og fibriller av andre amyloidogene proteiner, for derved å foreslå en felles epitop tilstede på alle amyloide aggregater. På grunn av tekniske vanskeligheter ved å danne protofibriller fra andre amyloidogene proteiner enn A β, ble mAb158 isteden testet mot forskjellige amyloide fibriller. Punktblottassayer ble brukt i disse eksperimentene siden inhibisjons ELISA, hvor antistoffantigenreaksjon finner sted i løsning, ikke er egnet for uløselige antigener så som fibriller. Punktblottassayet er imidlertid ikke egnet for evaluering av antistoffspesifisitet for forskjellige A β-former, dvs. for å måle forskjeller i selektivitet for protofibriller og fibriller. Fibriller av medin, øyamiloid polypepti d (IAPP) og α-synuklein ble immobilisert på en nitrocellulosemembran for å opprettholde deres native konformasjoner. mAb158 utviste ingen reaktivitet med noe amyloid utover A β-fibrill (fig. 5A). Binding av mAb158 til A β-fibriler antyder at del av A β-protofibrillepitopen er tilstede også i A β-fibrillstrukturen. Som positive kontroller ble antistoffene 6E10 (A β), pAb179 (medin), pAbA110 (IAPP) og mAb211 ( α-synuklein) anvendt (fig. 5B). Representative blott fra gjentatte eksperimenter (n=3).

mAb158 binder ikke APP

Nivåer av APP og løselige APP-fragmenter overstiger vanligvis nivåene av A β i biologiske prøver så som ryggmargsvæske og hjernehomogenat, og derfor kunne et A β-antistoffs kryssreaktivitet til APP inhibere en behandling ved binding til APP, noe som resulterer i mindre fritt antistoff for binding og eliminering av A βprotofibriller. I tillegg kunne det forstyrre målinger av A β-protofibriller i biologiske prøver med et sandwich ELISA-assay for A β. For å belyse om mAb158 binder til nativ APP ble immunoutfellingseksperimenter utført. HEK-cellekulturmedia (falsk, APPSwe og APPArc-Swe) og musehjernehomogenater (ikke-transene, APPSwe og APPArc-Swe) ble immunoutfelt med mAb158 eller 6E10, etterfulgt av et denaturerende Western blot med 6E10 som detekterende antistoff (fig. 5C). Som det kan ses i fig. 5C, immunoutfelt mAb158 ikke αAPP’er fra cellekulturmedia eller full lengde APP fra musehjernehomogenater, mens dette gjorde som forventet 6E10. De syntetiske A β-protofibriller brukt som kontroll ble immunoutfelt like godt med antistoffer (fig. 5C). Representative blott fra gjentatte eksperimenter (n=3).

Eksempel 6.

Etablering av en A β-protofebrillspesifikk sandwich ELISA. For å gjøre mulig målinger av A β-protofibriller i biologiske prøver ble en sandwich ELISA med mAb158 som både innfangende og detekterende antistoff etablert. Dette assay måler A β-protofibriller med en deteksjonsgrense på 1 pM og med et lineært område opptil 250 pM (fig. 6A, linjene angir lineær regresjon av standardkurver). På grunn av usikkerheter med hensyn på størrelse av A β-protofibriller anvendt i standardkurven er konsentrasjonen 1 pM basert på molekylvekten til én A β-monomer (4514 g/mol). Skjønt siden molekylvekten til et protofibrill er blitt estimert å være minst 100 kDa kunne grensen for deteksjon beregnet som molare A β-protofibriller være så lav som 50 fM. En standardkurve av A βArc-protofibriller ga et lavere signal enn villtype A β-protofibriller, sannsynligvis på grunn av forskjellen i A β-protofibrillstørrelse (fig. 6A, 6B). Titrert syntetisk LMW-A β (lavmolekylvekt A β). Med betegnelsen ”lavmolekylvekt A β” er det ment monomerer, dimerer og trimerer av A β som har en molekylvekt på ca. 4-12 kDa. A β-protofibriller og A β1-16 ble brukt for å validere konformasjonsspesifisiteten til ELISA (fig. 6B), hvor det hydrofile A β1-16-peptid ble brukt siden det ikke er forventet å aggregere. En ELISA sammensatt av to identiske antistoffer krever minst én dimer av et protein for å produsere et signal og som prediktert, ble A β1-16 ikke detektert med mAb158 sandwich-ELISA selv ved μM-konsentrasjoner (fig. 6B). Ved forbehandling av LMW-A β og A β-protofibriller med 70 % maursyre (FA), som er kjent for å dissosiere aggregert A β til monomerer, ble sandwich-ELISA-signaler tapt (data ikke vist). Følgelig er deteksjon av LMW-A β i høye nM konsentrasjoner (fig. 6B) sannsynligvis forårsaket av et lite aggregatinnhold av peptidpreparatet.

Et stort overskudd av monomere A β, holoAPP og APP-fragmenter, som er naturlig forekommende i biologiske prøver, kunne interferere med A β-protofibrillanalysen ved å okkupere bindingssteder til innfangningsantistoffbelegget, og således inhibere protofibriller fra binding. Dette problem ble undersøkt ved å tilsette et økende overskudd av A β1-16 til en fiksert konsentrasjon av A β-protofibriller (50 pM, uttrykt som monomere enheter) og analysert ved både mAb158 ELISA og 6E10-6E10 sandwich-ELISA (fig. 6C). Et 500000 ganger molart overskudd av A β1-16 sammenlignet med A β-protofibriller forstyrret ikke målingene med A β158 sandwich-ELISA som forventet siden A β1-16 binder dårlig til innfangningsantistoffet. I kontrast var et 500 gangers overskudd av A β1-16 nok til å redusere signalet i 6E10-6E10 ELISA, hvor A β1-16 binder med høy affinitet til innfangningsantistoffet (fig. 6C). Videre, når syntetisk A β-protofibriller ble tilsatt til falske HEK-cellekulturmedia eller ikke-transgene musehjernehomogenater ble 90 % av signalet gjenvunnet (data ikke vist).

Eksempel 7.

Målinger av A β-protofibriller i biologiske prøver.

Nærvær av A β-protofibriller i celle- og musemodeller som bærer den Arctic mutasjonen er blitt foreslått, skjønt inntil nå har det ikke vært noen metode for direkte å assaye A β-protofibriller i biologiske prøver. mAb158 sandwich-ELISA tilveiebringer derfor den første muligheten til å måle A β-protofibrillnivåer i slike celle- og musemodeller og å sammenligne dem med modeller uten denne intra-A βmutasjonen. Prøver fra celler og mus som bærer bare den svenske mutasjonen ble sammenlignet med villtype A β-protofibrill standardkurve mens prøver fra celler og mus som uttrykker A β med den Arctic mutasjon ble sammenlignet med A βArcprotofibrill standardkurve (fig. 6A). For å sikre at alle A β målt i dette assayet var i løselig tilstand, og for å ekskludere enhver mulig interferens fra A β-fibriller, ble alle prøver sentrifugert i 5 min. ved 17900 x g før analyse. Grupper av cellemedia fra forbigående transfektert APPSwe og APPArc-Swe HEK-celler analysert og sammenlignet med falske HEK-cellekulturmedia. A β-protofibrillnivåer ble beregnet fra standardkurver (fig. 6A) om gjennomsnittsverdi av triplikater og ble deretter normalisert til APP-nivåer for å kompensere for forskjeller i transfeksjonsnivåer (i henhold til Stenh et al.). A β-protofibrillkonsentrasjonen i APPArc-Swe HEK-cellekulturmedia var 28 pM (+2), signifikant høyere (p<0,0001) enn 8,2 pM (+0,3) sett i APPSwe (fig. 7A). Ingen A β-protofibriller kunne detekteres i falske media. Nivåer av A β-protofibriller ble også målt i hjerner fra 10 måneder gamle APPArc-Swe og APPSwe transgene mus med både plakker og intraneuronal A β-patologi (i henhold til Lord et al.). Hjerner ble homogenisert i TBS og sentrifugert før analyse for å gjenvinne den løselige A β-fraksjonen. Lik analysene ved å bruke cellekulturmedia, avvek A β-protofibrillnivået signifikant (p=0,005) mellom gruppene, med 397 pM (+ 59) i APPArc-Swe og 108 pM (+14) i APPSwe transgene musehjerner (fig. 7B).

I overnevnte figurer (fig. 6 og 7) var antallet prøver; falske celler (n=3) og forbigående transfektert med APPSwe (n=8) og APPArc-Swe (n=11). Nivåer av A βprotofibriller i APPArc-Swe media var ca. ni ganger høyere enn i APPSwe media mens falske media ikke ga noe signal (A). Målinger av A β-protofibrillnivåer i TBS-løselig fraksjon av ikke-transgene musehjernehomogenater (n=6) ble sammenlignet med transgene mus (APPSwe, n=3, og APPArc-Swe n=6) (B). Lik cellekulturmedia var A β-protofibrillnivåer for APPArc-Swe mus 7 ganger høyere enn for APPSwe mus. Feilsøyler viser SEM.

Eksempel 8.

mAb158 senker signifikant A β-protofibriller og total A β i APPswearc transgene mus etter i.p. administrering

mAb158 (12 mg/kg) ble injisert i.p. én gang ukentlig i 18 uker i 9-10 måneder gamle APPswearc mus. Etter undersøkelsen ble hjernene isolert og homogenisert i TBS og deretter sentrifugert for å sedimentere uløselige materiale. Det uløselige materialet ble oppløst i maursyre. Følgelig ble det oppnådd to fraksjoner fra musehjerner, dvs. en TBS-fraksjon og en maursyrefraksjon. A β-protofibrillnivåer i TBS-fraksjonen ble bestemt ved et ELISA. En signifikant reduksjon av A βprotofibriller ble funnet i mAb158 behandlingsgruppen sammenlignet med placebogruppen (fig. 8). Fig. 8 viser A β-protofibrillnivåer i APPswearc transgen musehjerne TBS-ekstrakter etter 4 måneders behandling med enten mAb158 eller placebo.

Total A β i maursyrefraksjonen ble bestemt ved et ELISA (maursyren ble brukt til å oppløse alle A β-former for å gjøre alle A β-former detekterbare). En signifikant reduksjon av totalt A β ble observert i behandlingsgruppen sammenlignet med placebogruppen (fig. 9). Fig. 9 viser de totale A β-nivåer i APPswearc transgen musehjerne maursyreekstrakter etter 4 måneders behandling med enten mAb158 eller placebo.

Eksempler 9-11

Forkortelser

A Adenin

Ab-protokoll AERES biomedisinsk protokoll

BHK Babyhamsternyre

bp Basepar

C Celsius

C Cytosin

CHO Kinesisk hamsterovarie

CMF Kalsium- og magnesiumfri

COS 7 Afrikansk grønn apenyre fibroblast cellelinje

dhfr Dihydrofolat-reduktase

DMEM Dulbeccos modifisert Eagles medium

DMSO Dimetylsulfoksid

DNA Deoksyribonukleinsyre

ELISA Enzymkoblet immunoadsorbent assay

FCS føtalt kalveserum

g Gram

G Guanin

hr time

HRP pepperrotperoksidase

IgG Immunoglobulin

K G eller T (IUPAC-konvensjon)

LSAP Stort løselig amyloidprodukt

mAb Monoklonalt antistoff

sec Sekund

min Minutt

M A eller C (IUPAC-konvensjon)

MTX Metotreksat

NIMR National Institute for Medical Research (UK) nm Nanometer

OD Optisk tetthet

PBS Fosfatbufret saltløsning

PCR Polymerasekjedereaksjon

R A eller G (IUPAC-konvensjon)

RT Romtemperatur

S C eller G (IUPAC-konvensjon)

T Tymin

UV Ultrafiolett

V Variabel

V A eller C eller G (IUPAC-konvensjon) VH Immunoglobulin tungkjede variabel region VK Immunoglobulin kappa lettkjede variabel region W A eller T (IUPAC-konvensjon)

Y C eller T (IUPAC-konvensjon)

Materialer

Utstyr

Brukervare

Immunologiske og molekylærbiologiske reagenser

Løsninger fra National Institute of Medical Research

Kulturreagenser

Eksempel 9 – DNA-sekvens til 158 antistoff

9.1 – RNA-preparat

Hurtigfrosne cellepelleter fra musehybridom 158 (merkede ampulelr 060825#158 5x10<6 >celler) ble mottatt av TAG på 3. oktober 2006. Disse cellene ble lagret frosne inntil prosessering ved å bruke Qiagen RNeasy midi sett for å isolere RNA ifølge produsentens protokoll.

9.2 – Førstetrådsyntese

ca. 5 μg av 158 RNA ble utsatt for revers transkripsjon for å fremstille 158 cDNA ved å bruke Amersham Biosciences 1. tråds syntesesett og å følge produsentens protokoll. Dette ble gjentatt for å danne 3 uavhengige cDNA-produkter (runder 1, 2 og 3) for å forebygge DNA-mutasjoner på grunn av RT-reaksjonen.

9.3 Kloning av 158 immunoglobulin cDNA

Hybridom 158 cDNA ble amplifisert med PCR i 23 separate reaksjoner.

Immunoglobulin kappa kjedevariabel reaksjon (VK) cDNA ble amplifisert ved å bruke 11 VK-primere (MKV1-11) i kombinasjon med kappa konstant regionprimer MKC (tabell 6). På samme måte ble immunoglobulin tungkjede variabel region (VH) cDNA amplifisert med PCR ved å bruke 12 forskjellige VH-primere (MHV112) i kombinasjon med en blanding av fire IgG konstant region primer (MHCG1/2a/2b/3: tabell 7).

Resultatet av det initielle settet av IgH PCR-reaksjoner var det enkle amplifikasjonsprodukt ved å bruke MHV5-primer. Ingen av de andre 11 primerparene ga et PCR-produkt. Produktet av PCR-reaksjonen primet ved oligonukleotidprimere: MHV5 (MHCG1/2a/2b/3 blanding) ble ligert inn i pCR2.1 <®>-TOPO <® >vektor ved å bruke TOPO-TA cloning <® >sett. Resultatet av de initielle sett av IgK PCR-reaksjoner var to enkle amplifikasjonsprodukter ved å bruke primere MKV1 og MKV2 med MKC. De andre 9 primerpar dannet ingen produkt. Produktene fra PCR-reaksjonen primet med oligonukleotidprimere: MKV1 eller MKV2 MKC ble ligert inn i pCR2.1 <®>-TOPO <® >vektor ved å bruke TOPO-TA cloning <® >sett.

E. coli TOP10 bakterie transformert med den ligerte vektor ble klonet på LB/ampicillin/X-gal agarplater, ved å plukkes på agarnettet og inn i PCR-screeningsblandingen. De klonede plasmidinnskuddene ble screenet med PCR-amplifikasjon. PCR-produktene ble gelelektroforert og kloner som produserte PCR-amplifikasjonsprodukt (ca. 500 bp) med korrekt størrelse ble identifisert. Natten over kulturer (5 ml) av hver klon ble prosessert ved å bruke QIAprep Spin Miniprep settprotokollen, for å produsere DNA plasmid minipreps.

9.4 – cDNA-sekvensbestemmelse

Den fullstendige syklus til RT-PCR, kloning og DNA-sekvensanalyse ble gjentatt for å oppnå tre fullstendig uavhengige sett av sekvensinformasjon for hver immunoglobulinkjede. Plasmidkloner fra hvert uavhengig sett av RT-PCR-reaksjoner ble sekvensert i begge retninger ved bruke 1212 og 1233 primere (tabell 10). Plasmider ble sekvensert ved å bruke BigDye <® >terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI), syklisert på en GeneAmp9600 PCR-maskin analysert på en ABI 310 kapillærsekvenseringsanordning.

9.5 – 158 VK DNA-sekvens

Sekvenser hos VK-kloner dannet ved å bruke PCR-primere MKV2 og MKC på 1. tråd cDNA’er runder 1 og 2, var identiske til et sterilt kappatranskript med opprinnelse fra den myelome fusjonspartner, så som MOPC-21, SP2 og Ag8. Dette er et sterilt transkript. Konsensussekvensen (158 VK) til VK-kloner dannet ved å bruke PCR-primere MKV1 og MKC på 1. tråd cDNA-runder 1-3 er vist i tabell 11. Dette er et funksjonelt rearrangement. Tabell 11 viser noen forskjeller fra sekvensen vist i tabell 1, 4 og 5. Disse forskjellene er i FW1-regionen hvor PCR-primeren var lokalisert. Mus VK styresekvensen mest identisk til fragmentene til styreren i 158 VK, ikke kodet med våre primere, var K5.1# (tabell 12). Prediktering for signalpeptidet å spalte korrekt #K5.1 signalsekvensen ble gjort ved et prediksjonsprogram. Mest sannsynlig prediktert spaltesete var korrekt mellom aminosyreresidu 19 og 20 (tabell 13). Det kimeriske 158VK-protein og DNA-sekvens er vist i tabell 14.

9.6 – 158 VH DNA-sekvens

Konsensussekvensen (158 VH) til VH-kloner dannet ved å bruke PCR-primere MHV5 og MHCG1/2a/2b/3 blanding på 1. tråd cDNA-runder 1-3 er vist i tabell 15. Som med 158 VK er det noen forskjeller fra FW1-sekvensen vist i tabell 1, 4 og 5. Mest identiske mus VH-styresekvens til fragmentet for styring, ikke kodet med våre primere, var NL-1 (tabell 16).

Eksempel 10 – konstruksjon av kimeriske ekspresjonsvektorer Konstruksjon av kimeriske ekspresjonsvektorer innbefatter å tilsette en egnet styresekvens til VH og VK, forutgått av en Hin dIII restriksjonssete og en Kozaksekvens. Kozak-sekvensen (tabell 8) sikrer effektiv translasjon av den variable regionsekvensen. Den definerer det korrekte AUG-kodon fra hvilke et ribosom kan igangsette translasjon, og den mest kritiske base er Adenin i posisjon -3, oppstrøms for AUG-starten. Styresekvensen blir valgt som den mest like musestyresekvens i Kabat databasen. Disse tilsetninger blir kodet innenfor foroverprimere ( tabell 9). Videre innbefatter konstruksjon av de kimeriske ekspresjonsvektorer innføring av 5’-fragment av human γ1 konstant region, opptil et naturlig Apa I restriksjonssete, tilstøtende med 3’-enden av J.regionen i 158. CH er kodet inn i ekspresjonsvektoren nedstrøms for den innskutte VH-sekvens men mangler V-C-intronet. For den lette kjede blir det naturlige spleisedonorsetet (tabell 8) og et Bam HI sete tilsatt nedstrøms for V-regionen. Spleisedonorsekvensen fasiliterer spleise ut kappa V:C-intronet som er nødvendig for i ramme tilfesting av VK til den konstante region. Mus VH- og VK-gener ble analysert for å identifisere alle uønskede spleisedonorseter, spleiseakseptorseter, Kozaksekvenser og for nærvær av alle ekstra subkloningsrestriksjonsseter som senere ville interferere med subkloning og/eller ekspresjon av funksjonelt helt antistoff. I dette tilfellet ble ingen funnet.

10.1 – ekspresjonsvektorer

Plasmid DNA-preparater av ekspresjonsvektorer pKN100, og pG1D200 ble renset ved å bruke Qiagen Maxi sett ved å følge produsentens protokoll. Plasmid DNA-rensing ved å bruke QIAGEN Plasmid Midi og Maxi sett, fra 500 ml kulturer av TOP10-bakterie transfektert med hver vektor. Vektorkartene er vist i fig. 10 og 11.

10.2 – Lettkjede kimeriseringsprimere

Mus styresekvens K5.1# ble inkorporert i konstruksjonen av det kimeriske 158 VK. Primere ble konstruert til å danne et PCR-produkt som inneholder denne fullstendige styrer, og 158 VK, med terminale restriksjonsseter Hind III og Bam HI for kloning inn i pKN100 ekspresjonsvektor (tabell 9). Foroverprimer 158vl innfører et Hind III restriksjonssete; et Kozaksete og K5.1# styresekvens.

Tilbakeprimer 158vlrev innfører: et spleisedonorsete og et Bam HI restriksjonssete.

10.3 – Tungkjede kimeriseringsprimere

Styresekvensen NL-1 ble inkorporert i konstruksjonen av det kimeriske 158 VH. Primere ble konstruert til å danne et PCR-produkt som inneholder denne styrer, og 158 VH-regionen, med terminale restriksjonsseter Hin dIII og Apa I for kloning inn i pG1D200 ekspresjonsvektor. Disse er vist i tabell 9. Foroverprimer, 159vh, innfører et Hin dIII restriksjonssete; et Kozak translasjonsinitieringssete og NL-1 styresekvens. Tilbakeprimer, 158vhrev, innfører 5’-ende av γ1 C-region og et naturlig Apa I restriksjonssete. Signalpeptidspalteseteprediksjonen for K5.1 styresekvens i VK er vist i tabell 17.

10.4 – Dannelse av kimerisk 158 VH-konstrukt: pG1D200158VH

158 VH DNA-fragmentet ble amplifisert med primere: 158vh og 158vhrev (tabell 9). 450 bp (ca.) PCR-produkt ble T-A-ligert inn i vektor pCR2.1 og brukt til å transformere kjemisk kompetente TOP10 bakterier. Kloner ble selektert med egnet innskuddsstørrelse og sekvensert ved å bruke 1212 primer (tabell 10). Det korrekte ekspresjonsinnskudd ble subklonet inn i pG1D200 ekspresjonsvektor og den korrekte subklonen ble selektert ved DNA-sekvensering ved å bruke primer BDSH61R (tabell 10). Denne klon ble dyrket i 200 ml kultur for å produsere plasmid DNA ved å bruke Qiagen Maxi sett og ved å bruke produsentens protokoll. Det kimeriske 158VH-proteion og DNA-sekvens er vist i tabell 18.

10.5 – Dannelse av det kimeriske 158 VK-konstrukt: pKN100158VK

158 VK DNA-fragmentet ble amplifisert med primere 158vl og 158vlrev (tabell 9).

450 bp (ca.) CPR-produkt ble T-A-ligert inn i vektor pCR2.1 og brukt til å tranformere kjemisk kompetente TOP10-bakterier. Kloner ble selektert ved innskuddsstørrelse og sekvensert ved å bruke 1212 primer (tabell 10). Den korrekte klon ble subklonet inn i pKN100 ekspresjonsvektor. Den korrekte subklon ble selektert ved screening for innskuddsstørrelse og DNA-sekvensering ved å bruke primer Hu-K2 (tabell 10). Denne klon ble dyrket i 200 ml kultur for å produsere plasmid DNA ved å bruke Qiagen Maxi sett og ved å bruke produsentens protokoll.

Eksempel 11 – Produksjon og bindingsegenskaper til kimerisk 158 antistoff

11.1 – COS 7 celletransformasjon og cellekultur

En ampulle med COS 7 celler ble tint og dyrket i DMEM supplementert med 10 % føtalt klon I serum og antibiotika. En uke senere ble cellene (0,8 ml ved 10<7>/ml) elektroporert med pG1D200158VH pluss pKN100158VK (10 μg DNA hver).

Cellene ble dyrket i 8 ml vekstmedium i petriskåler i tre dager.

11.2 – Kimerisk antistoffproduksjon

Et sandwich ELISA ble brukt til å måle antistoffkonsentrasjonen i COS 7 supernatanter. Kimerisk 158 VH x 158 VK antistoff ble uttrykt på 0,3 μg/ml og deretter på 3,7 μg/ml (tabell 19) i forbigående kotransfekterte COS-cellebetinget media.

11.3 – Kimerisk antistoffaktivitet

To ELISA’er ble brukt for å analysere antigenbindingen til kimerisk 158. Ved å bruke 3,7 μg/ml kimerisk antistoff betinget medium, ble binding til A β-monomer målt med en direkte ELISA-protokoll (fig. 12) og sammenlignet med mus 158 IgG. Deretter ble et konkurranse ELISA anvendt ved å bruke begge monomer eller protofibrill blandet i væskefase med antistoff, som deretter bandt seg til A βmonomer i fast fase (fig. 13). Disse viste at det kimeriske 158 antistoff bindes til amyloid A β-monomer og protofibrill på samme måte som det opprinnelige 158 museantistoffet.

Kommentar

Senere sekvensering har vist at mus antistoffsekvensdata, som vist i tabell 1 og 4 inneholder feil i både VH- og VK-kjeden på 5’-enden. Vi foreslår at dette skyldes anvendelse av primere lokalisert i V-regionen. I senere sekvensering ble primere lokalisert i styresekvensene, som ikke kan innføre mutasjoner i V-regionen, anvendt. Den senere sekvensering viste sekvensforskjeller (se tabell 15 og 11). Nevnte forskjeller er imidlertid ikke lokalisert innenfor CDR-regionene.

Det kimeriske antistoffet binder amyloid A β-monomer og protofibriller som vist henholdsvis med det direkte bindings ELISA og konkurranse ELISA. Denne kunnskap konfirmerer at kombinasjon av 158 VH- og 158 VK-kjeder koder anti-LSAP-antistoff 158 og angir at disse sekvensene er egnet for humaniseringsprosedyren for å danne et humanisert 158 antistoff.

Eksempel 12 – Humanisert antistoffkonstruksjon og diskusjon Forkortelser og definisjoner

Utstyr

12.1 – Humane V-gendatabaser

Proteinsekvensene til humane og mus immunoglobuliner fra den internasjonale immunogenetikkdatabase 2006 og Kabat database frigjøring 5 av sekvenser for proteiner av immunologisk interesse (siste oppdatering 17. november 1999) ble brukt for å kompillere en database av immunoglobulinproteinsekvenser i Kabat opplinjering. Vår database inneholder 9322 humane VH- og 2689 humane VK-sekvenser. Sekvensanalyseprogrammet, SR 7.6, ble brukt til å spørre de humane VH- og VK-databasene med 158 VH- og 158 VK-proteinsekvenser (tabell 20).

12.2 – Seleksjon av human rammeverk for 158RHA

12.2.1 – Sammenligning av 158 VH med humane VH-sekvenser

Humane VH-sekvenser med høyest identitet til 159 VH ved nomius (Vernier) (Foot, J. og G. Winter, 1992. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J Mol. Biol. 224:487-499), kanonisk (Canonical) (Morea, V., A.M. Lesk og A. Tramontano, 2000. Antibody modeling: implications for engineering and design. Methods 20:267-279) og VH-VL-grensesnitt (Interface) (Chothia, C., J. Novotny, R. Bruccoleri og M. Karplus, 1985. Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains. J Mol. Biol. 186:651-663) (VCI) residuer, lokalisert innenfor V-regionrammeverket (FW) er vist I tabell 21. Antall VCI-residuer (VCI-skår) og FW-residuer (FW-skår) identisk til 158 er også vist. Alle disse VH-sekvensene deler identiske VCI-residuer, og CDR-lengder, som vist i tabell 22. AJ556669 har en uvanlig Pro74 som ikke er sett i andre humane sekvenser i dette datasettet, noe som fører oss til å ikke ta den i betraktning i den initielle analyse. Pro74 er imidlertid tilstede i 158VH-sekvensen slik at AJ556669 bør vurderes som et alternativt FW for humanisering, hvis VH-konstruktet basert på AF062243 ikke binder antigenet. Opplinjering av disse sekvensene (tabell 23) understreker deres forskjeller. AF062243 er unikt innenfor dette datasettet og har den konservative forandringen T(82a)S og konservering av F79. De andre trekkene til AF062243 er de konservative forandringene D1E, K19R, A23S, T77S, S118T. Alle andre FW-forandringer var felles med alle rammeverkene i tabell 23.

AF062243 ble selektert som rammeverket på hvilket å basere 158RHA.

12.3 – Dannelse av 158RHA

Konstruksjonen av 158RHA er ganske enkelt å pode CDR 1, 2 og 3 fra 158 VH inn i akseptor FW i AF062243. Den humane kimlinje V-gen mest identisk til AF063343 er VH M99649 (VH3-07), (tabell 24) fra hvilke styrepeptidet ble ekstrahert (tabell 25). SignalP-algoritmen (Nielsen, H., J. Engelbrecht, S. Brunak og G. von Heijne, 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10:1-6) predikterte at den ville passende kuttes med signalpeptidase (tabell 26). Tabell 27 viser skjema for poding 158 VH CDR 1, 2 og 3 inn i AF062243 FW for å danne 158RHA-proteinsekvens. Tabell 28 viser dannelsen av DNA-sekvens 158RHAss fra de naturlige DNA-sekvensene til 158 VH og AF062243. Analyse av 158RHAss DNA-sekvens predikterte nærvær av spleisedonorseter, hvor predikteringsskårene er vist i tabell 29. Ikke-kodende mutasjoner ble innført for å inaktivere disse predikterte spleisesetene, som vist i tabell 30 for å danne den endelige 158RHA DNA-sekvens (tabell 31).

12.4 – Seleksjon av humant rammeverk for 158RKA

12.4.1 – Sammenligning av 158 KV med humane VK-sekvenser

De humane VK-sekvensene med høyest identitet til 158 VK ved VCI-residuer er vist i tabell 32 sammen med antallet av VCI-residuer (VCI-skår) og FW-residuer (FW-skår) identisk til 158 VK. Elleve sekvenser har alle VCI-residuer identisk til 158 VK. Tabell 33 viser at alle disse sekvensene har CDR-lengder identisk til 158 VK. Tabell 34 understreker deres forskjeller, og viser at K45 er bibeholdt bare i AB064054, som også bibeholder I86. G100P-forandringen er ikke kommenterbar fordi P100 er vanlig, og har en innsidens på 15 % i vår humane VK-database. De to substitusjoner T7S og K74R er konservative og alle andre substitusjoner er felles med alle sekvensene i tabell 34. Av disse grunner ble AB064054 selektert til å danne 158RKA.

12.5 – Dannelse av en 258RKA

Konstruksjon av 158RKA er den enkle poding av CDR’er 1, 2 og 3 fra 158 VK inn i akseptor FW til humant AB064054. Den nærmest kimlinje V-gen til AB064054 er A19 (tabell 35), fra hvilke styrepeptidet ble ekstrahert (tabell 36). SignalP-algoritmen predikterte egnet kutting (tabell 37) av dette styrepeptidet. Tabell 38 viser dannelsen av proteinsekvensen til 158RKA ved innskudd av 158 VK CDR’er i FW til AB064054. Tabell 39 viser dannelsen av DNA-sekvensen til 158RKAss fra den naturlige DNA-sekvensen til 158 VK og AB064054. Analyse av 158RKAss predikterte nærvær av spleisedonorseter, hvor skårene er vist i tabell 40. Ikkekodende mutasjoner (41) ble innført for å inaktivere disse setene og danne det endelige 158RKA DNA-konstrukt (tabell 42).

12.6 Humanisert antistoff (BAN2401) bindingsaktivitet

158RKA- og 158RHA-genene ble innskutt i en ekspresjonsvektor som inneholdt IgG1 konstant region. Dette konstruktet ble uttrykt i COS-celler for å danne det humaniserte 158 antistoff. Det humaniserte 158 antistoff ble testet for bindingsaktivitet og spesifisitet i et konkurrerende ELISA. Det humaniserte antistoffet utviste identiske bindingsegenskaper så som mAb158 og 158 kimerisk antistoff (se fig. 14).

12.7 Ytterligere mutasjoner i 158RHA- og 158RKA-kjedene

Ved å sammenligne muskimlinje V-gener VH AAK71612 med 158 VH ble en enkel somatisk mutasjon A60G i CDR2 identifisert. Videre, den molekylære modellen til antistoff 158 som inneholder tre VHF FW-residuer innenfor 5Å i CDR-residuene som ikke er konservert i 158RHA. Disse substitusjoner er D1E, P74A og T82S (tabell 43). På samme måte er det to VK FW-residuer innenfor 5Å i CDR-residuer som er ukonservert i 158RKA. Denne substitusjonen er L3V og G100P (tabell 44). Innføring av tilbakemutasjoner i posisjoner VH-1, VH-74, VH-82, VK-3 og VK-100 i 158RHA og 158RKA, i humaniserte versjoner 158RHB, 158RHC, 158RHD, 158RKB og 158RKC er vist i tabell 43 og 44.

REFERANSER

Sacskai et al., NatMed. 7:369-372, 2001.

Bard et al, Nat, Med. 6:916-919, 2000,

Bayer et al., Neurology 64:94-101, 2005.

Brendza et al.. J. Clin. Invest. 115:428-33, 2005.

Chen et al, Nature, 408:975-9, 2000.

Ghothia,C. et al, J MoLBiol, 186:651-663, 1985.

Ester W.P. Science 293, 1449-1459, 2001.

Gullberg et ai, Proc, Natl Acad Sci, 101 : 8420-4, 2004.

Foote, J. et al., J Mol Biol, 224:487-499, 1992.

Hoshi et al. Proc, Natl Acad. Sci, 100:6370-6375, 2003. Jarret J.T. , Biochemistry, 32, 4693-4697,1993.

Leatherbarrow R. J. et al., Mol. Immunol. 22, 407, 1985. Lord et al., Neurobiol. Aging, 27:67-77, 2006.

McLean et al., Ann. Neurol. 46:860-866, 1999.

Morea.V- et al. , Methods 20:267-279, 2000.

Mullan et aL Nat Genet 1:345-347, 1992.

Nielsen, H. et al. Protein Eng 10: 1-6, 1997.

Nilsberth et al., Nat Neurosci. 4:887-893, 2001.

Naslund et al., JAMA, 283:1571-1577, 2000.

Pfeifer et ai, Science 298:1379, 2002.

Racke et ai, J.Neurosci 25 :629-36, 2005.

Schenk D. et al. Nature, 400, 173-177, 1999.

Stenh et al, Ann, Neurol 58:147-50, 2005.

Walsh D. M. et al., 272, 22364-22372,1997

Walsh D. M.et al-, Nature, 416, 535-9, 2002.

Wilcock et al, J. Neurosci., 23:3745-51, 2003.

Wright A. et al., J. of Immunology, 3393-3402, 1998.

Xu Y. et al. J.Biol Chem, 269, 3469-3474,1994.

Claims (27)

PATENTKRAV

1. Antistoff eller fragment derav som er selektivt og som har høy affinitet for humane Aβ-protofibriler, der antistoffet eller fragmentet i sine seks CDR-regioner har de følgende konsensussekvensene:

VH-CDR1 SFGMH

VH-CDR2 YISSGSSTIYYGDTVKG

VH-CDR3 EGGYYYGRSYYTMDY

VL-CDR1 RSSQSIVHSNGNTYLE

VL-CDR2 KVSNRFS

VL-CDR3 FQGSHVPPT.

2. Antistoff ifølge krav 1,

der nevnte antistoff er monoklonalt.

3. Antistoff ifølge krav 1 eller 2,

der aminosyre prolin på posisjon 331 i humant IgG1 blir endret til serin eller en annen polar aminosyre.

4. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 3,

der nevnte antistoff er av IgG-klassen.

5. Antistoff ifølge krav 4,

der nevnte antistoff er av IgG1- eller IgG4-underklasse.

6. Antistoff ifølge krav 5,

der nevnte antistoff er en kimær av IgG1- og IgG4-underklasse, der tungkjedekonstantregionen CH2 eller del av CH2 er fra IgG4 og regionene CH1 og CH3 er fra IgG1.

7. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6,

der nevnte antistoff omfatter den komplette tungkjede-aminosyresekvens ifølge Tabell 31 og den komplette lettkjede-aminosyresekvensen ifølge Tabell 42.

8. Antistoff som binder til humane Aβ-protofibriler, der antistoffet omfatter en tungkjede og en lettkjede, der tungkjeden omfatter aminosyresekvensen 158RHA i Tabell 27 og lettkjeden omfatter aminosyresekvensen 158RKA i Tabell 38.

9. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6,

der nevnte antistoff omfatter mutasjoner i tungkjeden (VH) ifølge Tabell 43, der nevnte mutasjoner er valgt fra E til D i Kabat-posisjon 1, A til P i Kabat-posisjon 74 og S til T i Kabat-posisjon 82A, og/eller mutasjoner i lettkjeden (VK) ifølge Tabell 44, der nevnte mutasjoner er valgt fra V til L i Kabat-posisjon 3 og P til G i Kabatposisjon 100, eller kombinasjoner av disse VH- og VK-mutasjonene.

10. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6,

der nevnte antistoff omfatter den komplette tungkjedesekvensen ifølge Tabell 31 og den komplette lettkjedesekvensen ifølge Tabell 42, med unntaket av at mutasjonen S23A har blitt introdusert i tungkjeden.

11. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 10,

der nevnte antistoff er humant eller humanisert eller mutert for å redusere antigenisitet hos mennesker.

12. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1, 2, 4, 5 eller 6,

der nevnte antistoff er et muse-antistoff.

13. Antistoff ifølge krav 12,

der nevnte antistoff omfatter den komplette lettkjedesekvensen som er kodet for av DNA-sekvensen 158 VK ifølge Tabell 11 og den komplette tungkjedesekvensen som er kodet for av DNA-sekvensen 158 VH ifølge Tabell 15.

14. Sammensetning som omfatter antistoffet ifølge ethvert av kravene 1 til 13 og en farmasøytisk akseptabel buffer.

15. Sammensetning ifølge krav 14,

videre omfattende et antibakterielt middel.

16. Sammensetning ifølge krav 14 eller 15,

der sammensetningen er frysetørket.

17. Sammensetning ifølge krav 16,

der sammensetningen er frysetørket sammen med en eksipiens for å øke stabilitet for antistoffet under og etter frysetørring.

18. Sammensetning ifølge krav 17,

der eksipiensen er mannitol eller trehalose.

19. Fremgangsmåte for å detektere Aβ-protofibriler in vitro,

som omfatter trinnene med å:

- tilsette antistoffet ifølge ethvert av kravene 1-13 til en biologisk prøve som omfatter eller som er mistenkt å omfatte Aβ-protofibriler,

- måle konsentrasjonen av komplekset som dannes mellom nevnte Aβprotofibril og nevnte antistoff.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19,

der nevnte deteksjonsfremgangsmåte er en immunanalyse.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 19,

der nevnte deteksjonsfremgangsmåte er en proksimitetsligeringsanalyse.

22. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1-13 for anvendelse i en fremgangsmåte for diagnostisering av Alzheimers sykdom,

der fremgangsmåten omfatter:

- tilsette antistoffet som er definert i ethvert av kravene 1-13 til en prøve som er tatt fra et individ, og

- måle konsentrasjonen av komplekset som er dannet mellom nevnte antistoff og enhver Aβ-protofibril i nevnte prøve.

23. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1-13 for anvendelse i en fremgangsmåte for diagnostisering av Downs syndrom, Lewybody-demens eller vaskulær demens, der fremgangsmåten omfatter:

- tilsette antistoffet som er definert i ethvert av kravene 1-13 i en prøve som er tatt fra et individ, og

- måle konsentrasjonen av komplekset som er dannet mellom nevnte antistoff og enhver Aβ-protofibril i nevnte prøve.

24. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-13 eller sammensetning ifølge ethvert av kravene 14-18 for fremstillingen av et medikament for behandling av Alzheimers sykdom.

25. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-13 eller sammensetning ifølge ethvert av kravene 14-18 for fremstillingen av et medikament for behandling av Downs syndrom, Lewybody-demens eller vaskulær demens.

26. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1-13 eller sammensetning ifølge ethvert av kravene 14-18 for anvendelse i behandlingen av Alzheimers sykdom.

27. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1-13 eller sammensetning ifølge ethvert av kravene 14-18 for anvendelse i behandlingen av Downs syndrom, Lewybodydemens eller vaskulær demens.