JP2013159596A

JP2013159596A - β−アミロイド前駆体タンパク質のマイクロ凝集体に特異的なモノクローナル抗体

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Publication number: JP2013159596A
Application number: JP2012025103A
Authority: JP
Inventors: Hideki Jinno; 英毅神野; Kazuaki Yoshimune; 一晃吉宗; Tomoe Komoriya; 友絵小森谷
Original assignee: Nihon University
Current assignee: Nihon University
Priority date: 2012-02-08
Filing date: 2012-02-08
Publication date: 2013-08-19

Abstract

【課題】大きなサイズの非晶質のＡβ凝集体のみを特異的に検討するための材料を提供する。
【解決手段】粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体に特異的に結合し、アミロイドβタンパク及び繊維状アミロイドβタンパク凝集体に結合しない抗体。及び該非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体を免疫原とする細胞融合法により得られ抗体を産生するハイブリドーマ。
【選択図】なし

Description

本発明は、アミロイドβタンパク（Ａβ）の凝集体のうち粒子径が大きなマイクロ凝集体に特異的に結合する抗体及びその利用に関する。

アルツハイマー病の主要な病理変化には老人斑と神経原線維変化があるが、この老人斑は発症の早期から認められ、その主要構成成分がアミロイドβタンパク（Ａβ）である。当該Ａβは、アルツハイマー病の発症と進展に深く関与していることから注目され広く研究されている。
Ａβは、β−アミロイド前駆体からβ−セクレターゼ及びγ−セクレターゼが作用したときに切り出されて産生される。４０−４２アミノ酸からなるペプチドであり、Ａβ_1-40及びＡβ_1-42との２種が同定されている（非特許文献１）。

アルツハイマー病の発症は、Ａβが凝集して脳組織に沈着することにより発症するとの説が有力であることから、その治療薬としてＡβワクチン療法や抗Ａβモノクローナル抗体療法が開発されている（特許文献１、２）。

一方、脳内に沈着するのは、単量体のＡβではなく、繊維状や非晶質のＡβ凝集体であり、32量体以下の小さな非晶質のＡβ凝集体については神経毒性が強いことなどから、研究が進められている（非特許文献２、３）。そしてこの小さな非晶質のＡβ凝集体（非特許文献３）や繊維状のＡβ凝集体（非特許文献４）に対する抗体も作製されている。

国際公開第２００８／１５６６２２号パンフレット特開２０１０−２１５６５１号公報

Human Molecular Genetics, 13, 159-170(2004) Neurol Sci. 2009 December; 30(6): 471-477 J. Biol. Chem. (2011) Vol. 286, No.13, pp11555-11562 J. Biol. Chem. (2009) Vol. 284, No.47, pp32895-32905

しかしながら、Ａβの凝集体のうち、大きなサイズの非晶質の凝集体については脳組織内にあることは確認されているが、その作用はほとんど解明されていない。また当該大きなサイズの凝集体は抗Ａβ抗体等を使用して検出されているのが実状であり、その検出法及び機能解明については全く検討されていない。
従って、本発明の課題は、大きなサイズの非晶質のＡβ凝集体のみを特異的に検出するための材料を提供することにある。

そこで本発明者は、今まで注目されていなかった、大きなサイズの非晶質のＡβ凝集体に着目し、これに特異的な抗体を作製することとし、種々検討したところ、粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体を抗原として用いることにより、大きなサイズの非晶質のＡβ凝集体に特異的に結合する抗体を得ることに成功した。

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［８］に係るものである。
［１］粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体に特異的に結合し、単量体のアミロイドβタンパク及び繊維状アミロイドβタンパク凝集体に結合しない抗体。
［２］粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体が、粒子径０．２２μｍ〜５００μｍである［１］記載の抗体。
［３］モノクローナル抗体である［１］又は［２］記載の抗体。
［４］ＮＩＴＥＡＰ−１２２９として寄託されたハイブリドーマが産生するものである［３］記載の抗体。
［５］検体に［１］〜［４］のいずれか１項記載の抗体を反応させることを特徴とする、当該検体中の粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のアミロイドβタンパク凝集体の検出法。
［６］粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体を免疫原とする細胞融合法により得られ、粒子径０．２２μｍ以上のアミロイドβタンパクの凝集体に特異的に結合し、アミロイドβタンパク及び繊維状アミロイドβタンパク凝集体に結合しない抗体を産生するハイブリドーマ。
［７］ＮＩＴＥＡＰ−１２２９として寄託されたものである［６］記載のハイブリドーマ。

本発明の抗体は、従来着目されず、その機能も知られていなかった０．２２μｍ以上の大きなサイズの非晶質のＡβ凝集体に特異的であり、単量体のＡβ及び繊維状Ａβ凝集体に反応しない。従って、本発明の抗体を用いれば、脳内に沈着していることは知られていたが、その機能が解明されていなかった大きなサイズの非晶質のＡβ凝集体を特異的に検出できるので、本発明の抗体は大きなサイズの非晶質のＡβ凝集体の機能解明、アルツハイマー病の進展原因究明、臨床検査薬等として有用である。

本発明抗体を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す図である。市販の抗Ａβ_1-42モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

本発明の抗体は、粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のＡβの凝集体（マイクロ凝集体ともいう）に特異的に結合し、Ａβ及び繊維状Ａβ凝集体には結合しない。ここで粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体は、従来注目されているＡβ、繊維状Ａβ凝集体やナノサイズのＡβ凝集体とも相違する。より好ましい大きなＡβ凝集体としては、粒子径０．２２μｍ〜５００μｍ程度の非晶質のＡβ凝集体である。

本発明の抗体は、前記の特性を有している限り、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、特異性の高いものが得られやすい点でモノクローナル抗体が好ましい。

本発明のポリクローナル抗体は、粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体を抗原として哺乳動物を免疫し、その抗血清を採取し、特異性を確認すればよい。

本発明のモノクローナル抗体は、通常の細胞融合により得られるハイブリドーマを培養して作製することができる。ここでハイブリドーマは、０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体で免疫した哺乳動物の免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞から、０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体と結合し、Ａβ及び繊維状Ａβ凝集体と結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られる。

ハイブリドーマを作製するための抗原としては、０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体を用いる。特に０．２２μｍ〜５００μｍのサイズの非晶質のＡβ凝集体を用いるのが好ましい。

ハイブリドーマの作製に使用する動物としては、マウス、ウサギ等が挙げられるが、ハイブリドーマの作製のために最も広く使用されているマウスを用いるのが好ましい。マウスの免疫感作は、前記の０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体を、必要に応じてFreundのアジュバントと共にマウスに注射することにより行う。次に免疫されたマウスから脾細胞を採取し、マウスミエローマセルライン例えば、Ｐ３Ｕ１との細胞融合を常法に従って行う。

ＨＡＴ培地に増殖したハイブリドーマの培養上清を常用のサンドイッチ法により０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体と結合するモノクローナル抗体の存在について試験する。この検定においては、抗原として用いた０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体、Ａβ_1-42、Ａβ_1-40、Ａβ_16-20、Ａβ繊維状凝集体をサンドイッチ法の抗原として使用して、特異性を確認できる。

この中に、０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体と結合し、繊維状Ａβ凝集体と結合しないモノクローナル抗体を産生する７個のクローンが見出された。このうち、１クローンをＡｎｔｉ−ＬＯＡ３１−２と命名し、ＮＩＴＥＡＰ−１２２９として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物受託センターに寄託した。

本発明のモノクローナル抗体を製造するには、例えば上記のハイブリドーマのいずれかを常用の培地中で培養し、培養上清から目的とするモノクローナル抗体を採取すればよい。あるいは、前記ハイブリドーマのいずれかをマウスの腹腔内に接種し、該マウスから腹水を採取し、そして該腹水から目的とするモノクローナル抗体を採取すればよい。培養上清又は腹水からのモノクローナル抗体の採取、すなわち単離・精製は、常法に従って行うことができる。例えば、硫酸アンモニウムにより塩析、０．２２μｍ以上のＡβ凝集体を固定した支持体を用いるアフィニティークロマトグラフィー等を組合せて用いることができる。

本発明の抗体は、その目的に応じてキメラ抗体、ヒト化抗体とすることができる。さらに、蛍光、発光、放射性同位元素、金属コロイド等の標識体とすることもできる。

得られる本発明の抗体は、０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体に結合し、単量体Ａβ及び繊維状Ａβ凝集体に結合しないので、０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体を特異的に検出するのに有用である。

本発明の抗体を用いて０．２２μｍ以上の非晶質のＡβ凝集体を検出するには、検体に本発明の抗体を反応させ、当該検体中の粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のアミロイドβタンパク凝集体を検出することができる。
検出手段としては、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、ウエスタンブロッティング、免疫組織染色、蛍光免疫染色、免疫沈降等が挙げられる。
また検体としては、摘出組織、脳切片等の組織切片、培養細胞等が挙げられる。

次に実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。

実施例１
［モノクローナル抗体の作成方法］
（１）抗原の作製
（マイクロ凝集体）
リン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco's ＰＢＳ）中に０．２２ｍＭＡβ_1-42（AnyGen Co.Ltd, Korea）と繊維状凝集体の形成を抑制する２．２ｍＭＡβ_16-20（ＫＬＶＦＦ）を加え３７℃、３ｒｐｍで１６時間攪拌した。この溶液を０．２２μｍのフィルターでろ過した残渣をマイクロ凝集体とした。

（繊維状Ａβ凝集体）
マイクロ凝集体の作成においてＡβ_16-20を加えずに調整し、繊維状Ａβ凝集体を作製した。

（モノマー）
Ａβ_1-42を５０μＭになるように１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールに加え、超音波処理で懸濁後、３０℃で１６時間放置し完全に溶解させた。減圧乾燥により溶媒を除いたものをモノマーとして用いた。

（２）抗体の作製
上記により作製したマイクロ凝集体（０．１ｍｇ）を完全もしくは非完全フロイントアジュバントと混合し、マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ、８週目、雌）に免疫した。免疫は、２週おきに３回行った。免疫したマウスの脾臓を摘出し、その細胞数の２割のマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を混合後、この混合細胞にＰＥＧ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）１ｍｌを１分間かけて攪拌しながらゆっくり加えた。１分間攪拌後、無血清培地ＦＣＳ３ｍｌを３分間かけて攪拌しながらゆっくり加えた。続けて無血清培地１０ｍｌを３分間かけて攪拌しながらゆっくりと加えた。その後、５分間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ₂）を行い、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により上清を捨てた。ＨＡＴ培地で希釈することで細胞を解して培養した。

この培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法によりマイクロ凝集体に反応する抗体を生産する細胞のスクリーニングを行った。陽性が得られた細胞を限界希釈しハイブリドーマの単一化を行った。

ＥＬＩＳＡ法はＮｕｎｃイムノプレートマキシソープ（Thermo scientific Inc.）を用いて４℃、１６時間インキュベートして各抗原を非共有結合で固定した。Dulbecco's ＰＢＳに０．０５％ Tween２０を加えた溶液（ＰＢＳ−Ｔ）により洗浄を行った後、ブロッキングバッファー（イムノブロック、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）添加し、３７℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、２次抗体としてＨＲＰを標識した抗マウスＩｇＧヤギ由来（Sigma-Aldrich）を加え、３７℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴＯＰＤ（Sigma-Aldrich）の説明に従って発色させ、４９２ｎｍで測定した。

各濃度のマイクロ凝集体（黒丸）、繊維状Ａβ_1-42（白丸）、モノマーＡβ_1-42（白四角）及び、Ａβ_16-20（黒四角）を抗原として本発明抗体（図１）、もしくは市販の抗Ａβ_1-42モノクローナル抗体８２Ｅ１（図２）を用いてＥＬＩＳＡを行った。
図１及び図２に、ＥＬＩＳＡの結果を示す。

図１及び図２に示す様に本発明のモノクローナル抗体は繊維状及びモノマーＡβ_1-42及び、Ａβ_16-20とはほとんど反応せずマイクロ凝集体にのみ高い反応性を示した。一方、市販の抗Ａβ_1-42モノクローナル抗体８２Ｅ１（Immuno-Biological Laboratories, Inc., Minneapolis, MN）は全ての状態のＡβ_1-42に反応した。なおどちらの抗体も繊維状態への形成を抑制するＡβ_16-20とはほとんど反応しなかった。
得られたハイブリドーマ７個のうち、１個をＡｎｔｉ−ＬＯＡ３１−２と命名した。

Claims

粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体に特異的に結合し、単量体のアミロイドβタンパク及び繊維状アミロイドβタンパク凝集体に結合しない抗体。
粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体が、粒子径０．２２μｍ〜５００μｍである請求項１記載の抗原に対する抗体。
モノクローナル抗体である請求項１又は２記載の抗体。
ＮＩＴＥＡＰ−１２２９として寄託されたハイブリドーマが産生するものである請求項３記載の抗体。
検体に請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体を反応させることを特徴とする、当該検体中の粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のアミロイドβタンパク凝集体の検出法。
粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体を免疫原とする細胞融合法により得られ、粒子径０．２２μｍ以上の非晶質のアミロイドβタンパクの凝集体に特異的に結合し、アミロイドβタンパク及び繊維状アミロイドβタンパク凝集体に結合しない抗体を産生するハイブリドーマ。
ＮＩＴＥＡＰ−１２２９として寄託されたものである請求項６記載のハイブリドーマ。