JP5747414B2 - α−シヌクレイン関連疾患についての治療および診断方法における使用のための抗体およびワクチン - Google Patents
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Description
本発明によれば、安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルから作製され、かつ、安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに結合することが可能である抗体であって、
(i)該安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルが、α−シヌクレインの非安定化プロトフィブリルよりも非可溶性凝集形態への形成率が低く、
(ii)該安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルが、4−ヒドロキシ−2−ノネナール、マロンジアルデヒド、4−オキソ−2−ノネナールおよびアクロレイン、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択されるアルデヒドで修飾されたα−シヌクレインを含み、かつ、
(iii)該抗体が、α−シヌクレインモノマーに対する結合強度に比較して、可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに対する結合強度が高い、
抗体が提供される。
1つの実施形態では、本発明は、個体においてα−シヌクレイン関連疾患の発症を遅延させるためまたはα−シヌクレイン関連疾患を治療するためのワクチンであって、α−シヌクレインの非安定化オリゴマーよりも非可溶性凝集形態への形成率が低い、単離された安定化可溶性α−シヌクレインオリゴマーの治療有効量を含有するワクチンを対象とする。もう1つの実施形態では、本発明は、本発明によるワクチンを個体に投与することを含む、個体においてα−シヌクレイン関連疾患の発症を遅延させるためまたはα−シヌクレイン関連疾患を治療するための方法を対象とする。さらなる実施形態では、本発明は、可溶性α−シヌクレインに対する抗体を作製するための、本発明によるワクチンの使用を対象とする。
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種々のα−シヌクレイン突然変異の影響をインビトロで検討する。野生型α−シヌクレインに加えて、以下の突然変異体:A30P、E46K、A53TおよびA30P/A53T、A30P/E46K、E46K/A53TおよびA30P/E46K/A53Tを試験する。IMPACT〔親和性キチン結合タグによるインテイン媒介精製(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)、New England Biolabs社、Ipswich、マサチューセッツ州、米国)〕システムを製造者の指示に従って使用することにより、組換えα−シヌクレインを発現させる。すべての組換えタンパク質を、0.05M〜0.3Mの濃度範囲のNaClを含むまたは含まない、10mM〜50mMにわたる濃度のTris緩衝液またはリン酸緩衝液に溶解する。すべての組換えα−シヌクレインタンパク質を使用時まで−80℃で保存する。
α−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマー抗原(すなわちプロトフィブリルおよび他のオリゴマーを含む抗原)を作製するため、前述したように、それぞれの野生型、突然変異型または断片化α−シヌクレインを35〜750μMの濃度で使用する。α−シヌクレインがHNEおよび/またはONE(Cayman Chemical社、Ann Arbor、ミシガン州、米国)に結合している試料では、これらの化合物を0.01〜65mMの濃度で使用する。典型的な実験では、HNEおよび/またはONEとα−シヌクレインのモル比は、1:1〜100:1の範囲にわたるが、それぞれの化合物の割合はこの化学量論に限定されない。一部の実験では、HNE修飾および/またはONE修飾試料を還元するために水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)を0.1〜100mMの濃度で使用する。一部の場合には、α−シヌクレインアミノ酸は、HNE修飾の間に、HNEと結合する不安定で可逆性のシッフ塩基を形成するアミノ酸(リシンなど)を含み得る。また別の場合には、α−シヌクレインアミノ酸は、ONE修飾の間に、ONEと結合する不安定で可逆性のシッフ塩基を形成するアミノ酸(リシンなど)を含み得る。水素化ホウ素ナトリウム還元はシッフ塩基結合を安定化する。試料を、撹拌しながらまたは撹拌せずに37℃で30分間から30日間インキュベートする。試料の分子組成を確認するため、いくつかの方法を利用する。非修飾α−シヌクレインまたはHNE修飾および/もしくはONE修飾α−シヌクレインまたは他の反応性アルデヒドで修飾されたα−シヌクレインを、任意の不溶性フィブリルを除去するために21℃にて16,900×gで5分間遠心分離する。その後、α−シヌクレインプロトフィブリルオリゴマーおよびモノマーを単離するために214nm〜280nmのUV検出を伴うSEC−HPLCシステムを用いて上清を分画する(以下で詳細に述べる)。もう1つの実験では、5〜1000kDaの分子量カットオフ値を有する遠心ろ過装置を使用してα−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマーおよびモノマーを分離する。典型的実験では、試料であるHNEおよび/またはONE修飾α−シヌクレイン500μlを、100kDaのカットオフ値を有するMicrocon遠心ろ過装置(Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州)またはVivaspin500遠心分離装置(Sartorius社、Goettingen、ドイツ)のいずれかを用いて遠心する。試料を1000〜15000×gにわたる速度で5〜30分間遠心して、保持液を収集し、この保持液はα−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマーの大部分を含有する。
典型的な実験では、140μMのヒト野生型α−シヌクレインを5.6mMのHNEと共に(すなわちHNEとα−シヌクレインは40:1の比率)37℃で20時間インキュベートし、その後過剰の非結合HNEを、Zeba脱塩スピンカラム(Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国)、Vivaspin500遠心分離装置(Sartorius社、Goettingen、ドイツ)またはMicrocon遠心ろ過装置(Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州)のいずれかを製造者の指示に従って使用して除去する。この初期HNE修飾工程後、試料を直接分析する。SEC−HPLC分析の前に、すべての試料を22℃にて16,900×gで5分間の遠心分離に供し、可溶性分画だけを、Superose 6 PC3.2/30カラムを使用したSEC−HPLCによって分析する。α−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマーは19分でピーク中に溶出し、一方α−シヌクレインモノマーは37分で溶出する(図4)。
典型的な実験では、ヒト野生型α−シヌクレイン(140μM)を4.2mMのONEと共に(すなわちONEとα−シヌクレインは40:1の比率)37℃で20時間インキュベートし、過剰の非結合ONEを、Zeba脱塩スピンカラム(Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国)、Vivaspin500遠心分離装置(Sartorius社、Goettingen、ドイツ)またはMicrocon遠心ろ過装置(Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州)を製造者の指示に従って使用して除去する。SEC−HPLC分析の前に、すべての試料を22℃にて16,900×gで5分間の遠心分離に供し、可溶性分画だけを、Superose 6 PC3.2/30カラムを使用したSEC−HPLCによって分析する。α−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマーは20分で主要ピークとして溶出し、一方少量のα−シヌクレインモノマーは37分で溶出する(図5)。
典型的な実験では、ヒト野生型α−シヌクレイン(140μM)を4.2mMのHNEおよび4.2mMのONEと共に37℃で20時間インキュベートし、過剰の非結合HNEおよびONEを、Zeba脱塩スピンカラム(Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国)、Vivaspin500遠心分離装置(Sartorius社、Goettingen、ドイツ)またはMicrocon遠心ろ過装置(Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州)を製造者の指示に従って使用して除去する。すべての試料を22℃にて16,900×gで5分間の遠心分離に供し、可溶性分画だけを、Superose 6 PC3.2/30カラムを使用したSEC−HPLCによって分析する。
α−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマー、モノマーおよびフィブリルを単離するため、α−シヌクレインを前述したようにインキュベートする。Superdex 75 PC3.2/30、Superdex 200 PC3.2/30またはSuperose 6 PC3.2/30カラム(GE Healthcare社、Uppsala、スウェーデン)に連結した、ダイオードアレイ検出器L−7455型、L−7200型オートサンプラーおよびL−7100型ポンプを有するMerck Hitachi D−7000 LaChrom HPLCシステムをクロマトグラフィ分離および純度分析のために使用する。試料を、20〜50mMのTris(pH6.0〜8.0)、0.15MのNaClまたは20〜50mMのリン酸ナトリウム(pH6.0〜8.0)、0.15MのNaClのいずれかを使用して0.02ml/分〜0.08ml/分にわたる流速で溶出する。あるいは、Superose 6 10/300 GL、Superdex 200 100/300 GLまたはSuperdex 75 100/300 GLに連結した、L−2130型ポンプ、ダイオードアレイ検出器L−7450型、L−2200型オートサンプラーを有するHitachi LaChrome Elite HPLCシステムを使用する。試料を、20〜50mMのTris(pH6.0〜8.0)、0.15MのNaClまたは20〜50mMのリン酸ナトリウム(pH6.0〜8.0)、0.15MのNaClのいずれかを使用して0.1ml/分〜0.5ml/分にわたる流速で溶出する。さらに、試料は、0.15MのNaClを含むpH3〜6の酢酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液で溶出することができる。一部のSEC−HPLC分析では、α−シヌクレインプロトフィブリルオリゴマーのカラムマトリックスへの非特異的付着を低減するため、0.1%〜2.0%Tween−20またはTween−80を溶出緩衝液に添加する。214nm〜280nmのUV吸収を測定することによってクロマトグラムを得る。20〜100μlの分画をAdvantec SF−3120(Advantec社、柏、日本)フラクションコレクターで収集する。50〜500μlの分画もBio−Rad 2128型(Bio-Rad社、Hercules、カリフォルニア州)フラクションコレクターで収集できる。球状分子量標準品(Globular molecular weight standards)を使用して標準曲線を得、その標準曲線から様々なα−シヌクレイン種の保持時間を分子量に相関させる。
単離したα−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマーの形態をさらに特徴づけるため、低温電子顕微鏡検査および原子間力顕微鏡検査(AFM)を実施する。1〜100μlのタンパク質アリコートを10μM〜350μMにわたる最終濃度に希釈し、雲母表面またはHOPG表面(Veeco instruments SAS社、Dourdan cedex、フランス)に添加して、標準プロトコールに従って分析する。HNE修飾α−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマーのAFM分析は、直径50〜300nmにわたるリング様構造およびより線状で丸い構造の両方の不均質な集団を明らかにする。例えば、50〜300nmの直径を有するリング様構造の環状分子種が観測できる(図6)。ONE修飾α−シヌクレインのAFM分析は、幅で約30〜150nmの直径を有する不定形構造を明らかにする(図7)。
インビトロで凝集した非修飾α−シヌクレインならびにHNEおよび/もしくはONE修飾α−シヌクレインオリゴマーの作用を、一般に使用されるMTT(Sigma-Aldrich社、St. Louis、ミズーリ州、米国)生存能アッセイを使用して細胞培養モデルで分析する。試験で使用される細胞型は、HEK−293、SH−SY5Y細胞およびH4細胞を含む。試験で使用される細胞死およびアポトーシスマーカを測定する他のアッセイは、ToxiLight(Lonza社、Basel、スイス)および乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ(Cayman Chemical社、Ann Arbor、ミシガン州、米国)を含む。野生型α−シヌクレインを以下の突然変異体:A30P、E46K、A53T、A30P/E46K、A30P/A53T、A30P/E46KおよびA30P/E46K/A53Tと比較する。細胞を、10%胎仔ウシ血清(Cambrex社、Charles City、アイオワ州、米国)を添加したDMEM(Invitrogen社、La Jolla、カリフォルニア州、米国)中で増殖させる。1つのタイプの実験では、細胞を37℃、5%CO2でインキュベータに保持する。毒性アッセイを開始する前日、HEK−293細胞を96穴ポリスチレン被覆プレート(Sarstedt社、ノースカロライナ州、米国)に10000細胞/穴の密度で接種する。次に、細胞培地を取り出し、3μM〜6μMの範囲の最終濃度で新鮮馴化培地に希釈した凝集形態の非修飾α−シヌクレインで細胞を処理する。もうひと組の実験では、ONEおよび/またはHNE修飾α−シヌクレインオリゴマーを3μM〜6μMの範囲の最終濃度で新鮮馴化培地に希釈する。48時間のインキュベーション後、リン酸緩衝食塩水(Invitrogen社、La Jolla、カリフォルニア州、米国)に希釈したMTTを35μMの最終濃度で細胞に添加する。4時間半のインキュベーション後、細胞を50%DMFと20%SDSの混合物(Sigma-Aldrich社、St Louis、ミズーリ州、米国)で処理し、この混合物をさらに24時間インキュベートする。最後に、代謝された基質の測定のために、Spectra Max 190分光光度計(Molecular Devices Corporation社、カリフォルニア州、米国)を使用し、570nmで検出を実施する。
免疫スキームにおいてBalb/Cマウスを使用する。初回免疫のために、フロイント完全アジュバント50μlならびにHNE修飾および/またはONE修飾α−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマー製剤(最終濃度35μM)50μlをマウスに注射する。初期免疫(例えば3〜6回)のために、フロイント不完全アジュバント50μlならびにHNE修飾および/またはONE修飾α−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマー製剤(最終濃度35μM)50μlをマウスに注射する。その後の免疫(例えば1〜3回)のために、Tris緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水、pH7.4に希釈したHNE修飾および/またはONE修飾α−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマー製剤(最終濃度35μM)50μlをマウスに注射する。HNE修飾および/またはONE修飾α−シヌクレインプロトフィブリル/オリゴマー製剤(最終濃度70μM)50μlを含有する2回のブースター注射を実施した後、マウスを犠死させる。
脾細胞を単離し、滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS)中で摩砕して、1200×gで10分間遠心分離し、細胞に富むペレットを収集する。細胞をPBSでさらに洗浄し、1200×gで10分間遠心分離する。細胞ペレットを、1%抗生物質を添加したダルベッコ最小必須培地(DMEM、Invitrogen社、La Jolla、カリフォルニア州、米国)に再懸濁する。脾細胞をDMEM中でSp2/0細胞(マウス骨髄腫細胞株)と1:1の比率で混合する。細胞融合を促進するため、ポリエチレングリコール(Sigma-Aldrich社、St. Louis、ミズーリ州、米国)1mlを細胞混合物に添加し、DMEMを添加して反応を停止させる。細胞を採集し、10%(v/v)胎仔ウシ血清(Cambrex社、Charles City、アイオワ州、米国)を添加した、同時に1%(v/v)ピルビン酸ナトリウム(Cambrex社、Charles City、アイオワ州、米国)、1%(v/v)抗生物質(Sigma-Aldrich社、St. Louis、ミズーリ州、米国)および1%(v/v)L−グルタミン(Cambrex社、Charles City、アイオワ州、米国)を含有する、DMEM中にペレットを再懸濁する。遠心分離後、最終細胞ペレットを再懸濁する。生成されたハイブリドーマによって産生される抗体を検討するため、ELISAプロトコールを使用する。典型的な実験では、平底高結合96穴ポリスチレンマイクロタイタープレートを、モノマーα−シヌクレイン(非修飾、またはHNEおよび/もしくはONEまたは他のアルデヒドで修飾)、オリゴマー/プロトフィブリルα−シヌクレイン(非修飾、またはHNEおよび/もしくはONEまたは他のアルデヒドで修飾)、またはフィブリルα−シヌクレインにより400ng/穴の最終濃度で被覆する。穴を2%BSAでブロックし、0.05%Tween−20/PBSで洗浄して、検討するハイブリドーマからの細胞培地上清(未希釈またはリン酸緩衝食塩水で1:1希釈)を一次抗体として穴に添加する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG/IgM抗体(Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国)を1/5000の希釈で二次抗体として使用する。強化K−Blue(登録商標)基質(TMB)を使用して免疫反応性を視覚化し、2MのH2SO4で反応を停止させる。10%ウシ胎仔血清を添加した、同時に5%(v/v)BM馴化培地(Roche Diagnostics Scandinavia社、Bromma、スウェーデン)および2%(v/v)HAT培地添加物(Sigma-Aldrich社、St. Louis、ミズーリ州、米国)を含有するDMEMと細胞を96穴細胞培養プレートに塗布する。
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Claims (28)
- 安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルから作製され、かつ、安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに結合することが可能である抗体であって、
(i)該安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルが、α−シヌクレインの非安定化プロトフィブリルよりも非可溶性凝集形態への形成率が低く、
(ii)該安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルが、4−ヒドロキシ−2−ノネナール、マロンジアルデヒド、4−オキソ−2−ノネナールおよびアクロレイン、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択されるアルデヒドで修飾されたα−シヌクレインを含み、かつ、
(iii)該抗体が、α−シヌクレインモノマーに対する結合強度に比較して、可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに対する結合強度が高い、
抗体。 - 前記α−シヌクレインが野生型α−シヌクレイン(配列番号1)を含む請求項1に記載の抗体。
- 前記α−シヌクレインが、A30P(配列番号2)、E46K(配列番号3)およびA53T(配列番号4)、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される突然変異体を含む請求項1に記載の抗体。
- 前記α−シヌクレインが、1またはそれ以上のSerおよび/またはAlaアミノ酸が部位指定突然変異誘発によってCysで置換された野生型α−シヌクレインを含む請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、α−シヌクレインプロトフィブリルへのモノクローナル抗体である請求項1乃至4のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒト、ヒト化である、またはヒトにおける抗原性を低減するように修飾されている請求項1乃至5のいずれか1項に記記載の抗体。
- 前記抗原性の低減が、抗体のT細胞エピトープを修飾するまたは排除することによって為された請求項6記載の抗体。
- 前記抗体が、IgGクラスである請求項1乃至7のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体が、IgG1またはIgG4サブクラスである請求項8記載の抗体。
- 前記抗体が、低い補体活性を有する請求項9記載の抗体。
- 前記の低い補体活性が、重鎖のアミノ酸配列の297位または331位で抗体のFc部分を突然変異させることによって達成された請求項10記載の抗体。
- 前記の低い補体活性が、抗体を酵素的に脱グリコシル化することによって達成された請求項10記載の抗体。
- 前記抗体がFabフラグメントである請求項5記載の抗体。
- 前記抗体が、F(ab)、F(ab)2およびダイアボディから選択される請求項13記載の抗体。
- 前記抗体が、ポリクローナルである請求項1乃至4のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体が、一本鎖抗体である請求項15記載の抗体。
- 前記一本鎖抗体が、scFv−FcおよびscFabから選択される請求項16記載の抗体。
- 前記抗体が、Fabフラグメントである請求項15記載の抗体。
- 前記Fabフラグメントが、F(ab)、F(ab)2およびダイアボディから選択される請求項18記載の抗体。
- α−シヌクレインモノマーに対する抗体のIC50結合強度と可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに対する抗体のIC50結合強度との比は、1:50〜1:2000の範囲にある請求項1乃至19のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体が、不溶性α−シヌクレインフィブリルに対する結合強度に比較して可溶性α−シヌクレインオリゴマーに対する結合強度が高い請求項1乃至20のいずれか1項に記載の抗体。
- 不溶性α−シヌクレインフィブリルに対する抗体のIC50結合強度と可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに対する抗体のIC50結合強度との比は、1:2〜1:2000の範囲にある請求項1乃至21のいずれか1項に記載の抗体。
- 抗体を作製する方法であって、該抗体またはそのフラグメントが可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに結合し、該方法が、抗原を非ヒト動物に投与すること、および抗原に対して形成された抗体を収集することを含み、該抗原が、α−シヌクレインの非安定化プロトフィブリルよりも非可溶性凝集形態への形成率が低い、安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルを含み、該安定化可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルが、4−ヒドロキシ−2−ノネナール、マロンジアルデヒド、4−オキソ−2−ノネナールおよびアクロレイン、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択されるアルデヒドで修飾されたα−シヌクレインを含み、かつ、該抗体が、α−シヌクレインモノマーに対する結合強度に比較して、可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルに対する結合強度が高い
方法。 - 請求項1乃至22のいずれか1項に記載の抗体、ならびにヒトまたは動物での使用のために医薬的に許容される抗菌剤、アジュバント、緩衝剤、塩、pH調整剤、界面活性剤およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される1またはそれ以上の賦形剤を含有する抗体組成物。
- 前記組成物が凍結乾燥されている請求項24記載の組成物。
- 前記組成物が、凍結乾燥の間および/または凍結乾燥後の抗体の安定性を高めるために賦形剤と共に凍結乾燥されている請求項25記載の組成物。
- 前記賦形剤が、マンニトールおよび/またはトレハロースである請求項26記載の組成物。
- 請求項1乃至22のいずれか1項に記載の抗体を、可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルを含有するまたは含有することが疑われる生物学的試料に添加すること、および該抗体と可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルとの間で形成された任意の複合体を検出し、その濃度を測定することを含む、インビトロでα−シヌクレインプロトフィブリルを検出する方法。
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