NO180593B

NO180593B - Fremgangsmåte for fremstilling, i Saccharomyces cerevisiae, av et heterologt protein i homogen form

Info

Publication number: NO180593B
Application number: NO891837A
Authority: NO
Inventors: Hansjoerg Treichler; Kenji Takabayashi; Dieter Heinrich Wolf; Jutta Heim
Original assignee: Ciba Geigy Ag; Ucp Gen Pharma Ag
Priority date: 1988-05-04
Filing date: 1989-05-03
Publication date: 1997-02-03
Also published as: IE891451L; NZ228955A; MX169508B; JPH0824565B2; IL90170A; FI103129B1; PT90436B; AU3382889A; NO891837L; ATE124086T1; IL90170A0; EP0341215B1; NO891837D0; AU614121B2; HUT54210A; DE68923123T2; EP0341215A2; DK217589D0; PT90436A; NO180593C

Description

Oppfinnelsen er innenfor området rekombinant DNA teknologi og vedrører en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider ved hjelp av genetisk omkonstruerte gjærceller.

Et ganske stort antall heterologe proteiner har nylig blitt uttrykt i gjær etter transformering av gjærceller med hensiktsmessige ekspresjonsvektorer som omfatter DNA-sekvenser som koder for nevnte proteiner, for eksempel oc-interferon (IFNa, Hitzeman et al. (1981) Nature 294. 717-722), lysozym (Oberto et al. (1985) Gene 40, 57-65), a-amylase (Sato et al. (1986) Gene .50, 247-257), vevs-type plasminogenaktivator (t-PA, Europeisk Patentsøknad nr. 143 081) eller desulfatohirudin (Europeisk Patentsøknad nr. 225 633). Men i mange tilfeller blir de heterologe proteinene ikke syntetisert i ren form, men som en blanding som inneholder delvis degraderte proteiner slik som C-terminalt forkortede proteiner. Ekspresjonen av humant atrial natriuretisk peptid (hANP) i gjær resulterer for eksempel i sekre-sjonen av to former av moden hANP som adskiller seg fra hverandre i deres C-terminaler (Vlasuk et al. (1986) J. Biol. Chem. 261. 4798-4796). Hovedformen mangler de to siste aminosyrene i proteinet (Arg 150 og Tyr 151) mens den mindre forekomne formen hadde materiale med full lengde. Lignende resultater er blitt oppnådd etter ekspresjon av epidermisk vekstfaktor (EGF) i gjær (George-Nascimento et al. (1988) Biochemistry 27, 797-802) der de sekrerte ekspresjonsproduktene var heterogene på den måten at enten manglet den siste (Arg 53) eller de to siste aminosyrene (Leu 52 og Arg 53) og det ble ikke fremstilt noen EGF med full lengde.

Et polypeptid som ganske nylig har vunnet betydelig oppmerk-somhet hos molekylærbiologer er hirudin, et antikoagulerings-middel som forekommer naturlig i igler ( Hirudo medicinalis). Hirudin er ikke en enkelt polypeptid-type, men en klasse med likt reagerende polypeptider som består av minst fire representanter betegnet hirudinvariant 1 (HVI), hirudinvariant 2 (HV2) (kfr. Europeisk Patentsøknad nr. 158 564), hirudinvariant PA (kfr. PCT-søknad nr. 86/03493) og "des-(Val^-hirudin" (kfr. Europeisk Patentsøknad nr. 158 986). Variantene adskiller seg i struktur fra hverandre ved et antall aminosyrer (spesielt er N-terminalsekvensen til HVI Val-Val-Tyr, den til HV2 og PA er Ile-Thr-Tyr og den til "des-(Val)2-hirudin" er Thr-Tyr), men har en akkumulering av hydrofobiske aminosyrer ved N-terminal og med polare aminosyrer ved C-terminal, et tyrosin-residie (Tyr^<3>) er tilstede som sulfatmonoester, tre disulfid-broer og antikoagulerings-aktiviteten til felles.

cDNA og syntetiske gener som koder for hirudinvarianter er nylig blitt klonet og uttrykt i mikrobiologiske verter. Selv om ekspresjonsproduktene mangler sulfatmonoester-gruppen ved Tyr<63> _ 0g derfor ble betegnet "desulfatohirudiner" - viste de seg å utføre tilnærmet samme biologiske aktivitet som naturlig sulfathirudiner. Desulfatohirudin-variant HVI er blitt uttrykt i Escherichia coli (Europeisk Patentsøknad nr. 158 564 og 168 342) og i Saccharomyces cerevisiae (Europeisk

Patentsøknad nr. 168 342, 200 655, 225 633 og 252 854 ). På samme måte har desulfatohirudin HV2 blitt uttrykt i Escherichia coli (Europeisk Patentsøknad nr. 158 564) og i Saccharomyces cerevisiae (Europeisk Patentsøknad nr. 200 655, PCT-søknad nr. 86/01224) og des-(Val^-desulfatohirudin er blitt uttrykt i Escherichia coli (Europeisk Patent søknad nr. 158 986).

Vanligvis er ekspresjonseffektivitet og utbytte i hirudin-forbindelser høyere når S. cerevisiae blir valgt som verts-mikroorganismen. Men uten hensyn til den spesifikke gjærvert-stammen som blir anvendt, viser ekspresjonsproduktet seg å være en heterogen blanding av desulfatohirudin-arter som adskiller seg fra hverandre i C-terminalsekvensen. For eksempel var kulturblandinger tilveiebragt fra kulturgjær-stammer som omfatter hirudinvariant HVI genet funnet å inneholde desulfatohirudin HVI kontaminert med betydelige mengder av analoger som mangler C-terminal aminosyren Gln^<5 >eller C-terminal aminosyrene Leu^<4> og Gln^<S>.

Separeringen av blandinger som inneholder full-lengde proteiner slik som desulfatohirudin, hANP eller EGF såvel som C-terminalt forkortede derivater derav til individuelle bestanddeler og rensing av disse komponentene til homogenitet er arbeids- og tidskrevende. Ved å betrakte de påløpende kostnadene er det et behov for forbedrede metoder som gjør det mulig for økonomisk fremstilling av homogene proteiner slik som desulf atohirudin i gjær. Det er et mål for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe metoder for fremstilling av homogene heterologe proteiner i gjær.

Selv om det er tydelig at isoleringen av C-terminal forkortede derivater av heterologe proteiner fra kulturblandinger av transformerte gjærstammer inneholder korresponderende DNA-sekvenser som koder for nevnte proteiner på grunn av post-translasjonsaktivitet fra endogene gjærproteaser på det primære ekspresjonsproduktet, for eksempel integral desulfatohirudin, der spesifikt protease(ene) er ansvarlig for C-terminaldegraderingen har ikke blitt identifisert til nå. De mest viktige gjærproteasene som er involvert i proteindegradering er vanligvis endopeptidasene yscA og yscB og karboksyexopeptidaser yscY og yscS. Anvendelsen av gjærstammer som er defekte i protease A, B, Y og/eller S aktivitet kan delvis redusere tilfeldig proteolyse av fremmede genprodukter slik som desulfatohirudin. Men betydelige mengder proteiner som mangler en eller to aminosyrer i C-terminalene er fremdeles observert.

Det er overraskende blitt funnet at gjærmutant-stammer som mangler karboksypeptidase ysca aktivitet er ute av stand til å fjerne aminosyrer fra C-terminalene til heterologe proteiner og dermed gir opphav til integrale (autentiske) proteiner. Karboksypeptidase ysca er en membran-tilknyttet exopeptidase og det er vel kjent at den spiller en viktig rolle i modningen av killer-faktor og mating-faktor a (kfr. J.C. Wagner og D.H. Wolf (1987) FEBS Letters 221, 423). Det er ekspresjonsproduktet av KEXl-genet. I henhold til publiserte data (kfr. P.S. Rendueles og D.H. Wolf (1988) FEMS Microbiol. Rev. 54, 17), er aktiviteten til ysca sterkt begrenset til C-terminale aminosyre-residier (Arg, Lys). I lys av disse data og faktum at C-terminal-aminosyrene til desulfatohirudin ikke er basiske (for eksempel Gin og Leu i desulfatohirudin variant HVI), er det meget overraskende og et uventet resultat at anvendelsen av gjærmutantstammer som mangler karboksypeptidase ysca-aktivitet gjør det mulig å fremstille homogen desulfatohirudin uten noen triviell separering av C-terminalforkortede desulfatohirudin-analoger som er nødvendige.

Det samme stemmer for andre heterologe proteiner som for eksempel hANP, EGF eller bindevevsaktiverende peptid-III (CTAP-III, Mullenbach et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 719-722) som kan bli fremstilt i full-lengde form når en gjær-mutantstamme som mangler karboksypeptidase ysca-aktivitet blir anvendt til transformering med en hensiktsmessig vektor.

Ifølge foreliggende oppfinnelse vedrører den en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av et protein heterologt til gjær i en homogen form som omfatter dyrking av en gjærstamme som mangler karboksypeptidase ysca-aktivitet og som er blitt transformert med en hybridvektor som omfatter en gjærpromoter som er opererbart knyttet til en DNA-sekvens som koder for nevnte heterologe protein og isolering av nevnte heterologe protein.

Særlig vedrører oppfinnelsen en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av et protein heterologt til gjær i en homogen form som omfatter dyrking av nevnte gjærstamme som er blitt transformert med en hybridvektor som omfatter en gjærpromoter opererbart knyttet til en første DNA-sekvens som koder for et signalpeptid knyttet til den riktige leseramme til en andre DNA-sekvens som kode for nevnte heterologe protein og en DNA-sekvens som inneholder gjærtranskripsjonsterminerings-signalene og isolering av nevnte heterologe protein.

Heterologe proteiner som kan bli fremstilt ved den forbedrede metoden i henhold til oppfinnelsen er slike proteiner som er utsatt for posttranslasjon av C-terminaldegradering ved karboksypeptidase ysca etter ekspresjon i gjær. Slike heterologe proteiner er karakterisert ved to C-terminal-aminosyrer valgt fra gruppen som består av Lys, Arg, Tyr, Ala, Leu, Gin, Glu, Asp, Asn og Ser. De foretrukne heterologe proteinene er de proteiner som er nevnt ovenfor, særlig desulfatohirudin.

Det mest foretrukne trekk ved oppfinnelsen vedrører en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av desulfatohirudin som omfatter dyrking av en gjærstamme som mangler karboksypeptidase ysca-aktivitet og har blitt transformert med en hybridvektor som omfatter en desulfatohirudin-ekspresjons-kassett som består av en gjærpromoter opererbart knyttet til en første DNA-sekvens som koder for et signalpeptid knyttet til den riktige leseramme til en andre DNA-sekvens som koder for desulfatohirudin, og en DNA-sekvens som inneholder gjærtranskripsjonstermineringssignaler, og isolering av desulfatohirudin.

Begrepet "desulfatohirudin" har til hensikt å omfatte desulfatohirudin-forbindelsene som er beskrevet i litteraturen eller oppnåelige fra en transformert mikroorganisme-stamme som inneholder DNA som kode for et desulfatohirudin. Slike desulfatohirudiner er, for eksempel, desulfatohirudin-variant HVI, HVI (modifisert a, b), HV2, HV2 (modifisert a, b, c), PA, varianter av PA og des(Val2)-desulfatohirudin.

Foretrukne desulfatohirudiner er de som har formelen

der

a) representerer dipeptid residie Val-Val og X2, X3 og X4 er hver Lys, X5 er His og X^, er de peptid residie Glu-Tyr-Leu-Gln (HVI), eller b) X2 er Ile eller Glu og X-^ og X3 - X6 er definert i a) (HVI modifisert a), eller c) X3 er Ile eller Glu og X±, Xg og X4 - X^ er definert i a) (HVI modifisert a), eller d) X4 er Ile eller Glu og X± - X3 og X5 og X5 er definert i

a) (HVI modifisert a), eller

e) X5 er Leu eller Asp og X^ - X4 og X5 er definert i a) (HVI modifisert a), eller f) Xfc blir valgt fra gruppen som består av Glu-Tyr, Glu-Tyr-Leu, Glu-Asp-Leu-Gln, Glu-Glu-Leu-Gln, Glu-Tyr-Lys-Arg,

Glu-Asp-Lys-Arg, Glu-Lys-Leu-Gln, Ser-Phe-Arg-Tyr, Trp-Glu-Leu-Arg, Glu-Tyr-Leu-Gln-Pro og Glu-Tyr-Leu-Gln-Arg og X-l - X5 er definert i a) (HVI modifisert b), eller

g) der Xi representerer Thr og X2 - X^, er definert i a)

(des(Val2)-desulfatohirudin),

eller har formelen

der

a) Y± representerer N-terminaldipeptidresidie Ile-Thr, Y2 er Asn og Y3 er Tyr (EV2), eller b) Y2 er Lys, Arg eller His og Y^ og Y3 er definert i a) (HV2 modifisert a), eller c) Y3 er Glu eller Asp og Y^ og Y2 er definert i a) (HV2 modifisert b), eller d) der Y^ representer N-terminaldipeptidresidie Val-Val og Y2 og Y3 er definert i a) (HV2 modifisert c),

eller har formelen

(PA) og varianter av nevnte PA som er kjennetegnet ved en forkorting av den primære struktur med 1 eller 2 aminosyrer ved N-terminalene eller ved 18, 10, 9, 6, 4 eller 2 aminosyrer ved C-terminalene.

Den mest foretrukne desulfatohirudin-forbindelsen er den i formel I der X^ - X^ er definert i a).

Gjærvertsstammene og de nødvendige bestanddelene av hybridvektorene er de som er spesifisert under.

De transformerte gjærstammene blir dyrket ved å anvende metoder som er kjent innenfor fagområdet.

Således blir de transformerte gjærstammene i henhold til oppfinnelsen dyrket i et væskemedium som inneholder assimilerbare karbonkilder, nitrogen og uorganiske salter.

Forskjellige karbonkilder kan benyttes. Eksempel på foretrukne karbonkilder er assimilerbare karbohydrater, slik som glukose, maltose, mannitol, fruktose eller laktose, eller et acetat slik som natriumacetat, som kan bli anvendt enten alene eller i hensiktsmessige blandinger. Hensiktsmessige nitrogenkilder omfatter, for eksempel, aminosyrer, slik som casaminosyrer, peptider og proteiner og deres degraderings-produkter, slik som trypton, pepton eller kjøttekstrakter, dessuten gjærekstrakt, maltekstrakt, kornuttrukket væske, så vel som ammoniumsalter, slik som ammoniumklorid, sulfat eller nitrat som kan bli anvendt enten alene eller i hensiktsmessige blandinger. Uorganiske salter som kan bli anvendt omfatter, for eksempel, sulfater, klorider, fosfater og karbonater med natrium, kalium, magnesium og kalsium. I tillegg kan næringsmediet også inneholde vekstøkende substanser. Substanser som øker vekst omfatter, for eksempel, sporelementer, slik som jern, zink, mangan og lignende, eller individuelle aminosyrer.

På grunn av uforlikelighet mellom den endogene to-pm DNA og hybridvektorene som bærer dens replikon, har gjærceller som er transformert med slike hybridvektorer tendens til å tape den sistnevnte. Slike gjærceller må vokse under selektive betingelser, det vil si betingelser som krever ekspresjon av et plasmidkodet gen for vekst. De mest selektive markører som nå er i anvendelse og tilstede i hybridvektorene i henhold til oppfinnelsen (nedenfor) er gener som kode for enzymer av aminosyrer eller purinbiosyntese. Dette gjør det nødvendig å anvende syntetisk minimumsmedia som mangler den korresponderende aminosyre eller purinbase. Men gener som innehar resistens til et passende biocid kan likeså bli anvendt (for eksempel et gen som innehar resistens til amino-glykosid G418). Gjærceller som er transformert med vektorer som inneholder antibiotiske resistensgener blir dyrket i kom-plekse media som inneholder det korresponderende antibiotika hvorved raskere veksthastigheter og høyere celletetthet blir nådd.

Hybridvektorer som omfatter den fullstendige to-jjm DNA (inkludert et funksjonelt startsted med replikasjon) blir stabilt opprettholdt i stammer med Saccharomyces cerevisiae som er fri for endogene to-jjm plasmider (såkalt eir<0> stammer) slik at dyrkingen kan bli utført under ikke-selektive vekstbetingelser, det vil si i et kompieksmedium.

Gjærceller som inneholder hybridplasmider med en grunnleggende promoter (for eksempel ADHI. GAPDH) uttrykker DNA-kodingen et heterologt protein regulert av nevnte promoter uten induksjon. Men hvis nevnte DNA er under regulering av en reguleringspromoter (for eksempel PGK eller PH05) må sammen-setningen av vekstmediet bli tilpasset for å oppnå maksimale nivå av mENA-transkripter, det vil si ved å anvende PH05-promoteren må vekstmediet inneholde en lav konsentrasjon av uorganisk fosfat for derepresjon av denne promoter.

Dyrkingen blir utført ved å benytte konvensjonelle teknikker. Dyrkningsbetingelsene, slik som temperatur, pH i mediet og fermenteringstid blir valgt på en slik måte at maksimale nivåer av det heterologe protein blir produsert. En utvalgt gjærstamme blir fortrinnsvis dyrket under aerobiske betingelser i undervannskultur med rysting og omrøring ved en temperatur på ca. 25 til 35°C, fortrinnsvis ca. 28°C, ved en pH-verdi fra 4 til 7, for eksempel tilnærmet pH 5, og i minst 1 til 3 dager, fortrinnsvis så lenge at man oppnår tilfreds-stillende utbytte av protein.

Heterologe proteiner uttrykt i gjær kan bli akkumulert inne i cellene eller kan bli sekrert inn i dyrkningsmediet. Når det gjelder desulfatohirudin, uavhengig av gjærstammen, promoter og signalpeptid som blir anvendt, blir mesteparten av det fremstilte protein sekrert inn i vevsmediet der bare en mindre del forblir celle-tilknyttet. Det nøyaktige forhold

(sekrerte forbindelser/celle-tilknyttede forbindelser)

avhenger av fermenteringsbetingelsene og utvinningsprosessen som blir anvendt. Vanligvis kan forholdet måles til ca. 8:1 eller mer. Følgelig er sekrert desulfatohirudin alltid sterkt dominerende.

Heterologt protein kan bli isolert fra dyrkningsmediet ved konvensjonelle anordninger. For eksempel, første trinn består vanligvis i separering av cellene fra dyrkningsfluidet ved hjelp av sentrifugering. Den resulterende supernatant kan bli beriket for heterologt protein ved behandling med polyetylen-imin for å fjerne mesteparten av ikke-proteinholdig materiale, og utfelling av proteinene ved metning med oppløsning med ammoniumsulfat. Vertproteiner, hvis de er tilstede, kan også bli utfelt ved hjelp av surgjøring med eddiksyre (for eksempel 0,1$, pH 4-5). En videre anrikning av det heterologe protein kan bli oppnådd ved ekstrahering av eddiksyre-supernatanten med n-butanol. Andre rensningstrinn omfatter, for eksempel, avsalting, kromatografiske prosesser, slik som ionebytte-kromatografi, gelfiltreringskromatografi, fordelingskromatografi, HPLC, omvendt fase HPLC og lignende. Separeringen av bestanddelene i proteinblandingen kan også utføres ved dialyse, i henhold til ladning ved hjelp av gel-elektroforese eller bærer-fri elektroforese, i henhold til molekylstørrelse ved hjelp av en hensiktsmessig Sephadex-kolonne, ved affinitetskromatografi, for eksempel med antistoffer, særlig monoklonale antistoffer, eller med trombin koblet til en hensiktsmessig bærer for affinitetskromatografi, eller ved andre prosesser, særlig de som er kjent fra litteraturen.

Evis det heterologe protein ikke blir sekrert eller hvis det er ønskelig å isolere et hvilket som helst ytterligere heterologt protein som er celletilknyttet, det vil si som er akkumulert intracellulært eller i det periplasmiske rom, er noen tilleggsrensningstrinn nødvendige. Således i det tilfelle der heterologt protein har akkumulert i cellene, består det første trinnet i gjenvinning derav i å frigjøre den fra det indre av cellen. I de fleste fremgangsmåter blir celleveggen først fjernet ved enzymatisk spalting med glukosidaser (nedenfor). Deretter blir de resulterende sferoplastene behandlet med detergenter, slik som Triton. Alternativt er mekaniske krefter, slik som skjærekrefter (for eksempel X-presse, French-presse) eller rysting i glass-kanner, hensiktsmessig for å bryte cellene. I det tilfelle der det heterologe protein blir sekrert av vertcellene inn i det periplasmiske rom, kan en enklere protokoll bli anvendt: Det heterologe protein blir utvunnet uten lysering av cellene ved enzymatisk fjerning av celleveggen eller ved behandling med kjemiske midler, for eksempel tiolreagenser eller EDTA, som gir opphav til cellevegg-ødeleggelser og muliggjør at produktet blir frigitt.

I det tilfelle med desulfatohirudin kan testen med anti-hirudin eller anti-desulfatohirudin-antistoffer (for eksempel monoklonale antistoffer oppnådd fra hybridoma-celler), trombintesten (M.U. Bergmeyer (red.), Methods in Enzymatic Analysis, Vol. II, s. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim (FRG) 1983) eller blodkoaguleringstesten (F. Markwardt et al.

(1982) Thromb. Haemost. 47, 226) bli anvendt for å påvise hirudinaktivitet i fraksjoner oppnådd i løpet av rensings-prosedyren. Analoge analyser kjent fra litteraturen kan bli anvendt for å påvise andre heterologe proteiner. De transformerte gjærvertcellene i henhold til oppfinnelsen kan bli fremstilt ved rekombinante DNA-teknikker som omfatter trinnene med

fremstilling av en hybridvektor som omfatter en gjærpromoter som er opererbart knyttet til en DNA-sekvens som koder for et heterologt protein, særlig en hybridvektor som omfatter en gjærpromoter opererbart knyttet til en første DNA-sekvens som koder for et signalpeptid som er knyttet til riktig leseramme til en andre DNA-sekvens som kode for et heterologt protein og en DNA-sekvens som

inneholder gjærtranskripsjons-termineringssignaler,

hvis nødvendig, tilveiebringe en mutant gjærstamme som

mangler karboksypeptidase ysca-aktivitet,

transformering av mutant gjærstammen som er oppnådd med

nevnte hybridvektor,

og utvelge transformerte gjærceller fra utransformerte

gjærceller.

Ekspres. i onsvektorer

Gjærhybridvektorene i henhold til oppfinnelsen omfatter en gjærpromoter opererbart knyttet til en DNA-sekvens som koder for et heterologt protein. Foretrukne hybridvektorer omfatter en gjærpromoter opererbart knyttet til en første DNA-sekvens som koder for et signalpeptid knyttet til riktig leseramme til en andre DNA-sekvens som koder for et heterologt protein slik som desulfatohirudin og en DNA-sekvens som inneholder gjærtranskripsjons-termineringssignaler.

Gjærpromoteren er en reguleringspromoter slik som PH05, MFal eller GALI promoter, eller en konstitutiv promoter. I det tilfelle med ekspresjon av desulfatohirudin, er en konstitutiv promoter foretrukket. Den konstitutive gjærpromoter er fortrinnsvis avledet fra et høyt uttrykt gjærgen, slik som et gen som koder for et glykolytisk enzym, slik som promoteren til enolasen, glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH), 3-fosfoglyceratkinase (PGK), heksokinase, pyruvatdekarboksy-lase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyceratmutase, pyruvatklnase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glucokinase-gen, videre ADHI eller TRPI promoter og en forkortet sur fosfatase PH05 promoter som er blitt fratatt sine oppstrøms-aktiveringsseter. Særlig foretrukket er GAPDH promoteren og funksjonelle fragmenter derav som starter ved nukleotid mellom -550 og -180, særlig ved nukleotid -540, -263 eller -198, og slutter ved nukleotid —5 til GAPDH genet, og forkortede konstitutive PH05 promotere som starter ved nukleotid mellom -200 og -150, særlig ved -173, og slutter ved nukleotid -9 til PH05 genet.

DNA-sekvensen som koder for et signalpeptid ("signalsekvens") er fortrinnsvis avledet fra et gjærgen som koder for et polypeptid som er ordinært sekrert. Hirudin-signalsekvensen som er oppnåelig fra iglegenomisk DNA eller andre signal-sekvenser med heterologe proteiner, som er ordinært sekrert kan også bli valgt. Gjærsignalsekvenser er for eksempel, signal og preprosekvensene til gjærinvertase, a-faktor, feromonpeptidase (KEX1), "killer toxin" og represserbar sur fosfatase (PH05_) gener og glukoamylase-signalsekvensen fra Aspergillus awamori. Alternativt kan sammensatte signal-sekvenser bli konstruert ved ligering av deler av signalsekvensen (hvis den er tilstede) til genet som naturlig er knyttet til promoteren som blir anvendt (for eksempel PH05), med deler av signalsekvensen til hirudin eller til et annet heterologt protein. De kombinasjonene som er gunstige muliggjør en presis kløyving mellom signalsekvensen og for eksempel desulfatohirudinaminosyresekvensen. Ytterligere sekvenser slik som pro- eller spacer-sekvenser som kan eller ikke kan bære spesifikke prosesseringssignaler kan også bli innbefattet i konstruksjonene for å forenkle nøyaktig prosessering av forløpermolekyler. Alternativt kan sammensatte proteiner bli generert som inneholder interne prosesseringssignaler som muliggjør riktig modning in vivo eller in vitro. For eksempel inneholder prosesseringssignalene et Lys-Arg residie som blir gjenkjent av en gjær-endopeptidase som er lokalisert i Golgi-membranene. De foretrukne signal-sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse er de til gjær PH05 genet som koder for et signalpeptid som har formelen

Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala,

og til gjærinvertasegenet som koder for et signalpeptid som har formelen

Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys Ile Ser Ala.

Genomiske DNA-sekvenser som koder for et heterologt protein kan bli isolert fra naturlige kilder eller en kopi-DNA (cDNA) kan bli fremstilt fra den korresponderende komplementære mRNA eller ved hjelp av kjemiske eller enzymatiske fremgangsmåter, på måter som er kjent i seg selv.

For eksempel er DNA-sekvensen som koder for desulfatohirudin kjent eller kan bli isolert fra genomisk igle-DNA eller en komplementær dobbelt-trådet desulfatohirudin DNA (desulfatohirudin ds cDNA) blir produsert fra desulfatohirudin mRNA, eller et gen som koder for aminosyresekvensen til desulfatohirudin blir produsert ved hjelp av kjemiske eller enzymatiske fremgangsmåter.

En DNA-sekvens som inneholder gjærtranskripsjonstermineringssignaler er fortrinnsvis 3' sidesekvensen til gjærgenet som inneholder riktige signaler for transkripsjonsterminering og polyadenylering. Hensiktsmessige 3' sidesekvenser er for eksempel de til gjærgenet som er naturlig knyttet til den promoteren som blir anvendt. Den foretrukne sidesekvensen er den til gjær PH05 genet.

Gjærpromoteren, den valgfrie DNA-sekvensen som koder for signalpeptidet, DNA-sekvensen som koder for et heterologt protein og DNA-sekvensen som inneholder gjærtranskripsjons-termineringssignalene er opererbart knyttet til hverandre, det vil si de er ved siden av hverandre på en slik måte at deres normale funksjoner er opprettholdt. Oppstillingen er slik at promoteren sørger for riktig uttrykking av det heterologe genet (valgfritt forutgått av en signalsekvens), transkripsjons-termineringssignalene sørger for riktig terminering av transkripsjon og polyadenylering og den valgfrie signalsekvensen er knyttet i riktig leseramme til det heterologe genet på en slik måte at det siste kodon til signalsekvensen er direkte knyttet til det første kodon til genet som koder for det heterologe proteinet og sekresjon av proteinet forekommer. Hvis promoteren og signalsekvensen er avledet fra forskjellige gener, er promoteren fortrinnsvis knyttet til signalsekvensen mellom hoved mRNA starten og ATG til genet som er naturlig knyttet til promoteren. Signalsekvensen bør ha sin egen ATG for translasjonsinitiering. Forbindelsen til disse sekvensene kan bli påvirket ved hjelp av syntetiske oligodeoksynukleotid-linkere som bærer gj en-kj enningssekvensen til en endonuklease.

Utenom ekspresjonskassetten omfatter hybridvektorene ifølge oppfinnelsen en gjær-replikasjonsopprinnelse. Således omfatter hybridvektorene et DNA-segment som har opprinnelse i et to-pm DNA som inneholder starten på replikasjonen eller hvis en to-pm DNA fri stamme med gjær blir anvendt, totalt to->jm DNA. Den sistnevnte type av vektorer er foretrukket. De foretrukne hybridvektorene ifølge oppfinnelsen inneholder den fullstendige to-ym DNA i en uavbrutt form, det vil si to-jjm DNA blir kløyvet en gang med en restriksjonsendonuklease, den lineariserte DNA blir knyttet til de andre bestanddelene av vektoren før resirkularisering. Restriksjonssetet blir valgt slik at normal funksjon til REP1, REP2 og FLP genene og til ORI, STB, IRI og IR2 setene til to-jjm DNA blir opprettholdt. Det er valgtfritt om restriksjonssetet blir valgt slik at D-genet av to-pm DNA også blir bevart intakt. Foretrukne restriksjonsseter er det entydige Pstl-setet som er lokalisert i D-genet og det entydige Hpal og SnaBI-setet som er lokalisert på utsiden av alle nevnte gener og seter.

Hybridvektorene ifølge oppfinnelsen inkluderer fortrinnsvis en eller flere, særlig en eller to, selektive genetiske markører for gjær og en slik markør og et slikt startpunkt for replikasjon for en bakteriell vert, særlig Escherichia coli .

Når det gjelder de selektive genmarkører for gjær, kan et hvilket som helst markør-gen bli anvendt som forenkler utvelgelsen av transformanter på grunn av fenotypisk ekspresjon av markør-genet. Hensiktsmessige markører for gjær er, for eksempel, de som uttrykker antibiotisk resistens eller, i tilfellet med auxotrofiske gjærmutanter, gener som utfyller skader på verten. Korresponderende gener innehar for eksempel, resistens til antibiotikum G418, hygromycin eller bleomycin eller tilveiebringer prototrofi i en auxotrofisk gjærmutant, for eksempel URA3. LEU2. LYS2 eller TRP1.

Så lenge som amplifiseringen av hybridvektorene blir konven-sjonelt gjort i E. coli. er en E. coli genetisk markør og et E. coli replikasjonsstartpunkt fordelaktig inkludert. Disse kan bli oppnådd fra E. coli plasmider, slik som pBR322 eller et pUC plasmid, for eksempel pUC18 eller pUC19, som inneholder både E. coli replikasjonsstartpunkt og E. coli genetisk markør som innehar resistens til antibiotika, slik som ampicillin.

Hybridvektorene ifølge oppfinnelsen blir fremstilt ved metoder kjent innenfor fagområdet, for eksempel ved knytting av ekspresjonskassetten som omfatter en gjærpromoter opererbart knyttet til en DNA-sekvens som koder for et heterologt protein, og DNA-fragmentene som inneholder selektive genetiske markører for gjær og for en bakteriell vert og startpunkter for replikasjon for gjær og for en bakteriell vert i forhåndsbestemt rekkefølge.

Giærstammer som mangler karboksypeptidase ysca- aktivitet

Gjærstammene som blir fremstilt ifølge oppfinnelsen mangler karboksypeptidase ysca-aktivitet. Gjærstammene er fortrinnsvis doble, tredoble eller firedoble mutanter, det vil si er defekte i videre gjærpeptidase-aktivitet.

En lang rekke proteinaser lik de som er nevnt, er blitt karakterisert i gjær Saccharomyces cerevisiae (se T. Achstetter og D.H. Wolf (1985) Yeast 1, 139-157). Mutanter som mangler aktivitet av de fleste av disse proteaser har blitt isolert og studert biokjemisk. Konsekvensene av fraværet av visse proteaser er utledet og noen egenskaper viste seg å være nyttige for de novo isolering av protease-manglende mutanter. Siden spontanmutasjonsfrekvenser er lav, blir gjær vanligvis behandlet med mutagener slik som røntgen eller UV-stråling eller kjemiske mutagener som er betydelig effektive og kan indusere mutasjoner i en størrelse på 1'10-<4 >til 10~<3> pr. gen uten en stor del dreping. Proteasene som mangler i gjærstammer ifølge oppfinnelsen utfører ikke uunværlige funksjoner i cellemetabolismen; derfor er mutasjoner som fullstendig ødelegger aktiviteten til disse proteinene ikke letale. Hver mutanttype av de nevnte proteasene (ysca, yscB, yscA, yscY og yscS) kan bli isolert separat etter mutagenese. Isolering og utvelging er basert på koloniscreening-analyser som er velkjent innenfor fagområdet.

En annen og mer effektiv metode for å introdusere en ønsket enkel eller multippel proteasemangel inn i gjærgenomet er seterettet mutagenese eller gen-avbrudd eller gen-erstatning (kfr. H. Rudolph et al., Gene, 36 (1985 ) 87-95). Når den genetiske sekvensen er kjent, som den er for eksempel i tilfellet med protease yscB, karboksypeptidase yscY og karboksypeptidase ysca, kan det genomiske protease-gen bli gjort defekt ved innføring, substitusjon eller delesjon ved å ta i bruk den velkjente seterettede mutagenese-fremgangsmåte (se for eksempel M.J. Zoller og M. Smith (1983) Methods Enzymol. 100. 468) som innbefatter fremstillingen av en hensiktsmessig mutagenisk oligodeoksyribonukleotid primer. Alternativt kan det genomiske proteasegen bli erstattet av fremmed DNA eller nevnte fremmede DNA kan bli innført i et hensiktsmessig restriksjonssete til proteasegenet. For eksempel for å fremstille en gjærmutant som mangler peptidase ysca-aktivitet (kex- mutant) blir fremmed DNA innført i et hensiktsmessig restriksjonssete som forekommer i det genomiske KEXl-genet. I de tilfeller der gjærstammen som blir anvendt har en defekt i et kromosomalt gen som koder for et enzym med aminosyre eller purin-biosyntese kan et korresponderende intakt gen bli innført i det kromosomale KEX1 genet og således tilveiebringe prototrofi i den auxsotrofiske gjaerstammen og endre genotypen for samme tid fra KEX1 til kexl. Gen-erstatningen eller direkte mutageneseprosedyrer blir vanligvis benyttet innenfor fagområdet og er absolutt reproduserbare.

Nåværende metode for å komponere multippel protease-defekte stammer, slike stammer som mangler i ysca og yscB aktivitet, består i meiotisk kryssing og etterfølgende tetrade-analyse. Tetradene som avledes fra diploide celler blir dissekert ifølge standard genetiske teknikker. Tilfelding sortering blant de fire sporene av tetrader muliggjør konstruering av doble og multipple i etterfølgende krysninger. Tilfeldig sporanalyse kan også bli anvendt som et alternativt system.

Siden mutanter som mangler individuelle proteaser og til og med doble mutanter er tilgjengelige fra gjærgenetiske stammesentre (stokksenter), kan tredoble eller firedoble mutanter bli kombinert reproduserbart ved kjente etter-følgende meiotiske krysningsteknikker.

Hensiktsmessige begynnerstammer med Saccharomyces cerevisiae omfatter for eksempel, kexl stamme 96 som er oppnåelig fra Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, gjærpeptidase A (yscA) negative stammer AB103 (ATCC20673) og AB110 (ATCC20796), gjærpeptidase B (yscB) negative stammer HT246, H426 og H449

(den siste er i tillegg eir0 ) deponert i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, FRG, under aksesjons-tallene 4084, 4231 og 4413, henholdsvis gjærpeptidase B, Y og S (yscB, yscY og yscS) negativ stamme BYS232-31-42 og gjærpeptidase A, B, Y og S (yscA, yscB, yscY og yscS) negativ stamme ABYS.

Som nevnt over er foretrukne gjærstammer ifølge oppfinnelsen de som mangler endogent to-pm DNA. Det to-pm plasmidet er et høyt kopitall, selvreplikerende, ekstrakromosomalt DNA-element, som er inneholdt i de fleste stammer med Saccharomyces cerevisiae. Det mest slående strukturelle trekk av to-pm plasmidene er to inverterte gjentagelser (IRI og IR2) av 559 bp som hver deler plasmidet i to DNA-regioner med ulik lengde. Den homologe rekombinasjon mellom disse to identiske IR-sekvensene resulterer i dannelse av to molekylære isomerer (form A og form B). Stabiliteten til to-jjm plasmidet er gitt ved tre plasmidkodede funksjoner. REP1 og REP2 genproduktene er trans-fungerende proteiner som er nødvendige for stabil deling av to-jjm plasmidet. Av disse to er REP1 sannsynligvis den viktigste, ved at effektiviteten i oppdelingen er avhengig av gen-dosen av REP1 genproduktet (A. Cashmore et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 203. 154 ). Disse to proteinene fungerer gjennom og på STB (REP3) setet, et viktig cis-fungerende element på plasmidet (M. Jayaram et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 2466-2475; B. Viet et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 2190-2196).

Slike eir<0->stammer av Saccharom<y>ces cerevisiae er kjent eller kan bli fremstilt ved metoder kjent innenfor fagområdet (se for eksempel CP. Hollenberg (1982) Curr. Top. Microbiol. Immun. 96, 119). Den følgende alternative fremgangsmåten for fremstilling av eir<0->stammer er basert på antagelsen at herding (curing) av to-pm plasmidet med et annet plasmid omfatter økende dose av STB-setet for å titrere ut REP1 og REP2 proteiner. Denne relative reduksjon av REP1 og REP2 proteiner kan føre til en ustabilitet av det endogene to-pm plasmidet.

Fortrinnsvis har det andre plasmidet som blir anvendt en defekt i eller mangler REPl-genet. Et eksempel på et slikt plasmid er pDP38 som bortsett fra REPl-genet mangler en invertert gjentagelse (IR2). Dette gjør dens høye kopitall ekspresjon avhengig av komplementariteten til REPl-proteinet ved det endogene to-pm plasmidet. Den inneholder to gjærselektive markører: URA3, anvendt i både høy og lavkopitall situasjoner, og dLEU2, som bare kan benyttes i høykopitall situasjoner (E. Erhart et al. (1968) J. Bacteriol. 625).

En gjærstamme som er Ura" og Leu" blir transformert med plasmid pDP38 og selektert for Ura<+> kolonier. Seleksjonen på urasilhøye skåler (Ura-seleksjon) gir en mye bedre trans-formasjonsfrekvens enn seleksjon på leusinfrie plater (Leu-seleksjon), ved at URA3 genet blir mye bedre uttrykt enn det defekte dLEU2 genet. En enkel koloni blir selektert og strøket på en Leu seleksjonsskål som gir kolonier med varierende størrelse og form. Noen av de minste koloniene blir på ny utstrøket på Ura seleksjonsskåler og replika-platet på Leu seleksjonsskåler. De koloniene blir selektert som kan vokse under Ura seleksjon, men bare veldig langsomt under Leu seleksjon. Vekst på Ura seleksjonsskåler viser at plasmid pDP38 fremdeles er tilstede og at den utelukkende langsomme vekst under Leu seleksjonen ikke er forårsaket av tap av dette plasmid, og svikten i vekst under Leu seleksjon medfører at pDP38 ikke har evne til å komplementere denne markør. Det siste faktum kan forklares på to måter: A. LEU2 genet på pDP38 er mutert, eller B: Plasmidet kan ikke komplementere leu2 fordi det ikke kan heve sitt kopitall, og dette medfører at to-pm plasmidet ikke er tilgjengelig (det vil si talt) til å komplementere REP1 genproduktet.

Disse to muligheter kan bli adskilt meget enkelt. I det første tilfelle viser den minimale veksten som kan sees av nevnte kolonier (som mot absolutt nullvekst fra celler uten pDP38) at noe LEU2 ekspresjon er tilstede. Det andre tilfelle kan bli direkte undersøkt, ved at i fravær av to-pm plasmidet vil pDP38 reagere bare som en ARS type plasmid, det vil si den vil være veldig ustabil slik at det meste av koloniene vil miste den etter noen få generasjoner. Således, når en enkel koloni blir strøket på en YPD-skål, og enkle kolonier blir tatt og replika-platet på uracilfrie skåler, vil bare få vokse under Ura seleksjon. Ikke-voksende kolonier blir sjekket ved hybridisering for pUC og to-pm sekvenser. Kolonier som ikke viser hybridiseringssignaler mangler plasmid pDP38 og endogene to-jjm plasmider (eir<0> stammer), eir" stammene som er oppnådd kan bli behandlet som beskrevet over for å gi som utbytte gjærmutantstammer som mangler peptidase, særlig ysca, aktivitet og i tillegg er fri for to-pm DNA.

I tillegg til mangel på ysca aktivitet mangler de foretrukne gjærstammene ifølge oppfinnelsen også peptidaser selektert fra gruppen som består av yscA, yscB, yscY og yscS og er fri for to-jjm DNA. De mest foretrukne gjærstammene mangler ysca og yscY aktivitet og kan også valgfritt være fri for yscB og yscS eller av yscA og yscB aktivitet, og er fri for to-jjm

DNA.

Gjærstammene kan fordelaktig bli anvendt for fremstilling av heterologe proteiner. Det er overraskende blitt funnet at kexl stammene bærer en hybridvektor som inneholder et gen som koder for et protein som er heterologt til det gjærfremstilte nevnte protein i en homogen form, det vil si mangler et hvilket som helst C-terminalforkortet biprodukt.

Transformerte g. iærstammer

Oppfinnelsen vedrører videre en gjærstamme som mangler karboksypeptidase ysca aktivitet og er blitt transformert med en hybridvektor som omfatter en gjærpromoter opererbart knyttet til en DNA-sekvens som koder for et heterologt protein, og til en metode for fremstilling derav.

Hensiktsmessige gjærvertstammer omfatter stammer med Saccharomyces cerevisiae som mangler karboksypeptidase ysca aktivitet og valgfritt ytterligere peptidaseaktivitet og som er valgfritt blitt behandlet med endogent to-pm plasmider (se over).

Fremgangsmåten for fremstilling av nevnte transformerte gjærstammer omfatter transformering av en gjærstamme som mangler karboksypeptidase ysca aktivitet med nevnte hybridvektor .

Transformeringen av gjær med hybridvektorene kan bli gjennomført ifølge fremgangsmåten beskrevet av Hinnen et al.

(Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)). Denne metoden kan bli oppdelt i tre trinn:

1. Fjerning av gjærcelleveggen eller deler derav ved å anvende forskjellige fremstillinger av glukosidaser, slik som snegletarmsaft (for eksempel Glusulase® eller Heli-case®) eller enzymblandinger som er oppnådd fra mikroorganismer (for eksempel Zymolyase®) i osmotisk stabili-serte oppløsninger (for eksempel 1 M sorbitol). 2. Behandling av "nakne" gjærceller (sferoplaster) med DNA-vektor i nærvær av PEG (polyetylenglykol) og Ca^<+> ioner. 3. Regenerering av celleveggen og seleksjon av de transformerte cellene i et fast stofflag med agar. Denne regenereringen blir hensiktsmessig gjort ved å plassere sferoplastene ned i agar. For eksempel smeltet agar (ca. 50°C) blir blandet med sferoplastene. Ved avkjøling av oppløsningen til gjærvekst-temperaturer (ca. 30°C), er et fast stofflag oppnådd. Dette agarlaget er for å forhindre rask diffusjon og tap av essensielle makromolekyler fra sferoplastene og med det forenkle regenereringen av celleveggen. Men cellevegg-regenerering kan også bli oppnådd (selv om det er med lavere effektivitet) ved å så ut sferoplastene på overflaten av forhåndslagede agarskåler.

Regenereringsagaren blir fortrinnsvis fremstilt på en måte som tillater regenerering og seleksjon av transformerte celler på samme tid. Siden gjærgener koder for enzymer med aminosyre eller nukleotid, blir biosyntetiske veier vanligvis anvendt som selektive markører (ovenfor), og genereringen blir fortrinnsvis utført i gjaerminimal mediumagar. Hvis det er nødvendig med veldig høye effektiviteter i regenereringen, er følgende to-trinns fremgangsmåte fordelaktig: 1. regenerering av celleveggen i et rikt komplekst medium, og 2. seleksjon av de transformerte cellene ved replika-plating av cellelaget på selektive agarskåler.

En annen utførelse av oppfinnelsen er en desulfatohirudin med formelen

der representerer dipeptid-residie Val-Val, X2, X3 og X4 er Lys, X5 er His og X5 er valgt fra gruppen som består av Glu-Tyr-Lys-Arg, Ser-Phe-Arg-Tyr og Trp-Glu-Leu-Arg.

De kjente heterologe proteinene som er oppnåelige fra fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt på en måte som er i seg selv kjent, for eksempel i terapien og profyl-aksen mot humane og animalske sykdommer. For eksempel kan humant ANP utvise natriuretisk, diuretisk og vascorelak-serende aktiviteter og kan bli anvendt i regulering av kardiovasculær homeostase.

Desulfatohirudin-forbindelsene kan bli anvendt, analogt til naturlig hirudin, i terapi og profylakse mot trombose, i akutt sjokkterapi, i terapi mot konsumpsjons-coagulopatier, og lignende som beskrevet i Europeisk Patent Søknad nr. 168 342.

Kort beskrivelse av tegningene

I den følgende eksperimentelle delen er forskjellige ut-førelser av foreliggende oppfinnelse beskrevet med referanse til vedlagte figurer der: Fig. 1 viser kromatogram av desulfatohirudiner høstet fra transformer KEX1 og kexl stammer av S. cerevisiae. Fig. 2 er et skjematisk diagram som viser in vitro syntese av hirudin HVI genet som omfatter PH05 signalsekvensen med de foretrukne gjærkodon. De 21 oligodeoksynukleotidene som er benyttet er angitt ved henholdsvis nummererte linjer og stiplede linjer. Fig. 3 illustrerer skjematisk konstrueringen av plasmid pDP33. Fig. 4 illustrerer skjematisk konstrueringen av plasmidene pDP34 og pDP 38. Fig. 5 illustrerer skjematisk konstrueringen av ekspresjons-plasmid pDP34/GAPFL-YHIR. Fig. 6 illustrerer skjematisk konstrueringen av ekspresjons-plasmid pDP34/PH05(-173)-YHIR. Fig. 7 illustrerer skjematisk konstrueringen av plasmid pDP92. Fig. 8 viser kromatogram av vill-type hirudin og hirudin-mutanter HV1-KR, HV1-WQLR og HV1-SFRY fra kulturer med cerevisiae BYSKEX1 og BYSkexl.

Eksempel 1

Kryssing av S. cerevisiae kexl mutantstamme 96 med S. cerevisiae stamme BYS og analyse av sporene på a-faktor sekretorisk kapasitet og karboksypeptidase ysca (KEX1 gen) aktivitet

S. cerevisiae kexl mutantstamme 96 (a, kexl, ade2, thrl), som er skaffet fra gjær Genetic Stock Center, Berkeley, USA, blir krysset med S. cerevisiae stamme BYS232-31-42 (a, prbl-1, prcl-1, cpsl-3, lys2, leu2, his7) (Achstetter, T. og Wolf, D.H. (1985) EMBO J. 4, 173-177; Wolf, D.H. og Ehmann, C.

(1981) J. Bacteriol. 147, 418-426) som bærer vill-type KEX1 allele. Diploide heterozygote celler med genotypen kexl/KEXl blir isolert fra denne krysning. Tetradene som blir avledet fra de diploide cellene blir dissekert i henhold til standard genetiske teknikker (Hawthorne, D.C. og Mortimer, R.K. (1960) Genetics 45» 1085-1110; Methods in Yeast Genetics 1986 (Sherman, F. et al., eds.) Cold Spring Harbor Laboratory,

N.Y.).

De fire sporene fra hver tetrade blir testet for deres evne til å sekrere a-faktor. For å skille mellom KEX1 vill-type og kexl mutant kolonier, blir feromon-supersensitiv testerstamme S. cerevisiae RC629 (a, sst-2, ade2-l, ural, his6, metl, canl, cyh2, rme) anvendt (Chan, R.K. og Otte, C.K. (1982 ) Mol. Cell. Biol. 2, 11-20; Chan, R.K. og Otte, C.K. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 21-29). Som forventet fra trekkene som er kodet av enkle nukleære gener, fra alle analyserte tetrader, sekrerte to sporer fra hver tetrade a-faktor, mens de to andre sporene sekrerte a-faktor. Vill-type KEX1 kolonier av a—formerende type inhiberer i stor grad veksten til teststammen og således produserer en stor ring rundt seg selv, siden de har evne til å foredle a-faktor-forløperen fullstendig og fremstille fire aktive a-faktormolekyler fra ett forløpermolekyl. I motsetning inhiberer kexl mutantkoloniene veksten i teststammen bare i liten grad, og således produserer en liten ring rundt seg selv, siden de bare har evne til å fremstille ett modent a-faktormolekyl fra ett forløper-molekyl.

Sporene til flere fullstendige tetrader som er identifisert som defekte i kexl genet ved den ovenfor nevnte beskrevne feromon-analyse, ble til slutt testet for spesifikk aktivitet av karboksypeptidase ysca. Cellene blir dyrket, membranene derav blir fremstilt og testet for karboksypeptidase ysca aktivitet ved å anvende Cbz-Tyr-Lys-Arg som substrat som beskrevet (Wagner, J.C. og Wolf, D.H. (1987) FEBS Lett. 221, 2, 423-426). Det faktum at aktiviteten av karboksypeptidase ysca mangler i kexl mutantceller, indikerer at KEX1 er et strukturelt gen av dette enzym. Dette medfører at karboksypeptidase ysca virkelig er involvert i karboksyterminal-prosessering av a-faktor.

Eksempel 2

Klassifisering av bekreftede kexl mutanter på ytterligere mangel av proteaser yscB, yscY og yscS

S. Cerevisiae kexl mutanter blir klassifisert med hensyn på mangel av andre proteaser (proteinase yscB, karboksypeptidase yscY og karboksypeptidase yscS) og ytterligere vekstfaktor-krav.

Cellemateriale til kexl mutanter som blir fremstilt fra stasjonær fase i YPD (Difco) medium blir suspendert i 200 pl 20 mM Tris-Hcl buffer, pH 7,2 i Eppendorf mikrosentrifuge og glassperler (0,4 mm i diameter) blir tilsatt opp til to tredjedeler av volumet. Suspensjonen blir kraftig rystet tre ganger 1 min. med en vortex-blander med kjøling på is imellom.

Sentrifugering i 5 min. muliggjør utvinning av råekstraktene i supernatanten. Disse ekstraktene blir dialysert mot 0,1 M imidazol-HCl buffer pH 5,2 med 0,1 mM ZnClg for å aktivisere proteaser og for å fjerne frie aminosyrer fra ekstraktene.

Proteinase yscB aktiviteter blir målt i henhold til Azocoll-testen (R.E. Ulane et al. (1976) J. Biol. Chem. 251. 3367; E. Cabib et al. (1973) Biochem. Biophys. Res. Commun. J50, 186; T. Saheki et al. (1974) Eur. J. Biochem. 42, 621 ). Etter protein-konsentrasjonsmålingene blir en aliquot av hver prøve fylt med 0,1 M natriumfosfat (NaPi) buffer pH 7,0 opp til 100 pl for å justere for nødvendig like proteinmengder. Til proteinoppløsningen blir en suspensjon av 500 pl Azocoll (240 mg i 10n ml 0,1 M NaPi buffer, pH 7,0) tilsatt. Disse blandingene blir inkubert ved 30°C i en time med omrøring. Etter tilsetning av 500 pl 10$ triklor-eddiksyre som stopper reaksjonen, blir blandingene sentrifugert to ganger og absorpsjonsspektra av supernatantene ved 520 nm blir målt.

Aktivitetene av karboksypeptidase yscY og yscS blir målt ved å anvende det kromogeniske substrat Cbz-Gln-Leu (kfr. D.H. Wolf et al. (1978) FEBS Lett. 91, 59; D.H. Wolf et al. (1977) Eur. J. Biochem. 73, 553). De dialyserte ekstraktene blir fordelt i tre porsjoner og til to av dem blir det tilsatt fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) til en sluttkonsentrasjon på 1 mM eller EDTA til en sluttkonsentras j on på 5 mM for å blokkere de to proteaseaktivitetene selektivt. PMSF inhiberer nemlig karboksypeptidase yscY aktiviteten og EDTA inhiberer den til karboksypeptidase yscS. Blandingene med inhibitorer blir hver inkubert ved 25"C i en time for å fullstendiggjøre inhiberingen. Etter bestemmelsen av proteinkonsentrasjonen blir to aliquoter med inhibitor og en aliquot uten inhibitor som kontroll på hver prøve fylt med 0,1 M NaPi buffer pH 7,4 opp til 50 pl for å oppnå like proteinmengder. Til disse proteinoppløsningene blir følgende testoppløsninger tilsatt.

500 pl testoppløsning I:

L-aminosyreoksidase 0,24 mg/ml

pepperrot-peroksidase 0,40 mg/ml

0,01 mM MnCl2

i 0,1 M NaPi buffer, pH 7,4

50 pl testoppløsning II:

o-dianisidin 2 mg/ml

i vann

500 pl testoppløsning III:

20 mM Cbz-Gly-Leu

i 0,2 M natriumfosfatbuffer, pH 7,4

Blandingene blir inkubert ved 28° C i en time og etter tilsetning av 100 pl 20% Triton X-100 for å stoppe reaksjonen blir absorbansene ved 405 nm målt.

Med hensikt for den etterfølgende transformasjonen blir en aminosyre-auxotrofisk markør for leucin merket med replika-teknikken på minimal-skåler som var tilført adenin, treonin, lysin og histidin, og med eller uten leucin.

Ved hjelp av de ovenfor nevnte beskrevne analysene, blir mutantene isolert og betegnet S. cerevisiae BYSkexl, som utøver en kvadruppel protease-mangel (a, prb-1, prc-1, cps-3, kexl) og et ytterligere krav om leucin.

Eksempel 3:

Transformasjon av Saccharomyces cerevisiae kvadruppel proteasemanglende mutant

Plasmidet pJDB207/PH05-EIR (Europeisk Patent Søknad nr. 225 633) blir introdusert inn i den kvadruple protease-manglende mutant BYSkexl (a, prb-1, prc-1, cps-3, kex-1, leu2) og inn i KEX1 vill-type stamme BYS232-31-42 (cx, prb-1, prc-1, cps-3, lys2, leu2, his7) som en kontroll ved å anvende transformasjonsprotokollen beskrevet av Hinnen et al (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)).

De to forskjellige gjærstammene blir høstet fra tidlig logaritmisk stadium i 100 ml YPD medium (OD500 = °>2)' vasket med 25 ml 0,8 M sorbitol og resuspendert i 5 ml av den samme sorbitoloppløsning. Til disse 5 ml cellesuspensjonene blir 30 pl zymolyase tilsatt (ZYMOLYASE-100 T fra Arthrobacter luteus, Seikagaku Kogyo Co., LTD; 10 mg/ml i 0,8 M sorbitol). Disse blandingene blir hver forsiktig rystet i 100 ml rysteflasker på rysteren (110 revs/min) ved 30"C i ca. 30 min. Etter 5 min. intervaller blir 100 pl aliquoter tatt ut, fortynnet i 10 ml destillert vann og absorbansene av for-tynningene ved 600 nm blir målt for å regulere den økende grad av sferoplasting. For å få god sferoplastdannelse, må forskjellen i absorbans før og etter behandling med zymolyase være større enn en faktor på 10. De sferoplasterte cellene blir vasket med 0,8 M sorbitol to ganger, resuspendert i 25 ml medium HE 30 (2 M sorbitol i YPD medium) og inkubert i en 100 ml rysteflaske med forsiktig rysting på rystere (110 turer/min.) ved 30°C i en time. Cellene blir sentrifugert (3000 rpm, 5 min.) og resuspendert i 1 ml HE 31 oppløsning (10 mM Tris-Hcl, pH 7,5, 10 mM CaCl2, 0,9 M sorbitol) med forsiktighet. Til disse 100 pl cellesuspensjonene blir 4 pg plasmid-DNA tilsatt. Blandingen blir inkubert i 15 min. ved romtemperatur. 1 ml 20$ polyetylenglycol (PEG) 4000 blir tilsatt til hvert rør og inkubert i ytterligere 30 min. ved romtemperatur, sentrifugert (3000 rpm, 3 min.) og resuspendert i 500 pl 0,8 M sorbitol. Sferoplastene med DNA blir blandet med 10 ml regenereringsagar (1 M mannitol, 6,8 g/l gjærnitrogenbase w/o AA (Difco), 10 g/l L-aspargin, 1,0 g/l L-histidin, 1,0 g/l adenin, 1,0 g/l treonin, 1,0 g/l lysin og 3$ agar) og helt som et overlag på skåler som inneholder et basis agarlag med samme sammensetning. Skålene blir inkubert i 30° C i 96 timer inntil de transformerte koloniene kommer til syne.

En enkelt transformert gjærkoloni blir tatt opp og dyrket i gjærsyntetisk minimalmedium (8,4 g/l gjærnitrogenbase w/o AA,

10 g/l L-aspargin og 1,0 g/l L-histldin) tilført adenin, treonin, lysin og histldin, men uten leucin. Kolonien fra den kvadruple proteasemanglende mutant BYSkexl og den fra den triple proteasemanglende kontrollstamme BYSKEX1 blir referert til som henholdsvis

Saccharomvces cerevisiae BYSkexl/pJDB207/PH05-HIR og Saccharomvces cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/PH05-HIR.

Eksempel 4:

Kultivering av Saccharomvces cerevisiae transformanter med pJDB207/PH05-EIR

Celler fra Saccharomvces cerevisiae transformanter BYSkexl/- pJDB207/PHO-HIR og BYSKEXl/pJDB207/PH05-HIR blir rystet som forkultur i 10 ml med komplett gjærmedium HE 41 (4,5 g/l casaminosyrer, 4 g/l gjærekstrakt, 20 g/l sakkarose, 20 g/l glukose, 3,6 g/l (NH4)2S04, 0,2 g/l MgS04-7H20, 0,013 g/l Cacl2-H20 og 1 ml/l sporelementblanding (10 g/l FeS04-7H20, 50 g/l ZnS04-7H20, 3,3 g/l CuS04'5H20, 3 g/l MnS04'H20, 2 g/l CoCl2*6H20 og 1 g/l (NH4)6]VIO7024-4H20)) ved 28° C og dyrket i ca. 48 timer inntil de nådde stasjonær fase. De høstede cellene ble vasket i 0,9$ NaCl. 50 ml av det ovenfor beskrevne gjærsyntetiske medium blir inpodet med et 5% podestoff. Kulturene blir innpodet opptil en celletetthet på 0D600 = °'3 °S rystet ved 28° C i opptil 72 timer ved 250 turer/min. ;Komplett gjærmedium HE 41 blir anvendt for å fjerne bak-grunnsabsorpsjon i HPLC-analyse. ;Eksempel 5: ;Analyse av hiridun-65 og dens karboksy-terminal degraderings-produkter hirudin-64 og hirudin-63 fra fermenteringskulturer av Saccharomvces cerevisiae transf ormanter ;BYSkexl/pJDB207/PH05-HIR og BYSKEXl/pJDB207/PH05-HIR ved å anvende omvendt fase HPLC ;Prøver fra flytende gjærkulturer blir fremstilt ved sentrifugering for å frembringe en klar oppløsning som blir fortynnet 1:10 (v/v) med eddiksyre (IM) og utsatt for HPLC-analyse under følgende betingelser. ;En HI BAR (MERCK) kolonne (4 x 125 mm) blir fylt med revers fase, vid poresilisiumoksid-materiale (type 71252, 300-5-C18, MACHEREY-NAGEL), en sfærisk stasjonærfase med en partikkeldiameter på 5 pm og en porøsitet på 300 A. Kolonne-endene blir utstyrt med rustfrie stålfritter. Mobilfase A er laget av vann (Nanopure®, BARNSTEAD) som inneholder 0,1$ (v/v) trifluoreddiksyre. Mobilfase B er laget av 2056 av mobilfase A og 80$ (v/v) av acetonitril (HPLC-kvalitet, FLUKA) som inneholder 0,08% (v/v) av trifluoreddiksyre. ;Kromatografisk separasjon blir utført med en strømnings-hastighet på 1,5 ml/min. ved å kjøre følgende gradient og eluatene blir målt ved absorbans ved 216 nm. ;En standard oppløsning for kalibrering av systemet blir laget ved å løse opp 1 mg av ren desulfatohirudin i 1 ml vann. 50 pl av denne standard oppløsningen bl'ir injisert inn i kolonnen og kromatografert som beskrevet for å kalibrere systemet. ;I figur 1 er det vist analyttisk revers fase væskekromato-gram av hirudiner høstet fra S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/- PH05-HIR og S. cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/PH05-HIR kulturer. De kromatografiske betingelsene er de samme som beskrevet over. Det er tydelig at i motsetning til stammen BYSKEX1/- pJDB207/ PH05-HIR, produserer peptidase ysca negativ stamme BYSkexl/pJDB207/PH05-HIR et desulfatohirudin-produkt ("HIR-65") som er vesentlig fritt for C-terminalt forkortede biprodukter desulfatohirudin HIR-64 som mangler C-terminal aminosyre Gin og HIR-63 mangler C-terminal aminosyrene Leu og Gin. ;Eksempel 6: ;In vitro syntese av hirudin HVI genet med foretrukne gjærkodon ;Den kodende sekvensen til hirudin-ekspresjonskassetten er angitt med foretrukne gjærkodon (B. Hall (1982) J. Biol. Chem. 257. 3026) for å garantere optimal translasjon av hirudin mRNA. Den kodende sekvensen inneholder PH05 signalsekvensen sammensatt i ramme for å kode sekvensen til desulfatohirudin HVI. 5' enden til det syntetiske DNA inneholder de klebrige endene til EcoRI restriksjonssetet. ;Ved 3' enden er stopp-kodon TAG umiddelbart etterfulgt av de klebrige endene til BamHI setet. Sekvensen av den 257 bp EcoRI-BamHI DNA-fragmentet er vist i fig. 2. ;Fig. 2 angir også strategien for in vitro syntese av det dobbelt-trådede DNA-fragmentet. 21 oligo-deoksynukleotider blir syntetisert ved å anvende fosfor-amidit metoden (M.H. Caruthers, i: Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments (H.G. Gassen og A. Lang, Eds.), Verlag Chemie, weinheim, FRG (1982)) på en Applied Biosystems Model 380B syntetiserer. Sekvensen til de individuelle oligonukleotidene er vist i fig. 2. Overlappingene er entydige. De lyofiliserte oligonukleotidene blir gjenoppløst i 50 mM Tris-HCl pH 8,0 i en konsentrasjon på 10 pmol/pl. De 21 oligonukleotidene blir allokert til to grupper; (A) nr. 1-11 representerer 5' halvdelen av DNA-fragmentet, (B) nr. 12-21 til 3' halvdelen. De to gruppene blir behandlet adskilt. 10 pmol hver av oligonukleotider fra en gruppe blir blandet. Oligoene blir fosforylert i 20 pl 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 3 mM DTT, 0,4 mM ATP og 8 enheter med polynukleotid-kinase (Boehringer) i 1 time ved 37°C. Etter 30 min. ved romtemperatur blir begge blandinger (A og B) hver varmet i 5 min. ved 95°C i vannbad. Prøvene får anledning til å avkjøles langsomt til romtemperatur i vannbad over natten. De kondenserte oligonukleotid-blandingene A og B blir deretter lagret på is. ;Plasmid pBR322 blir kuttet fullstendig med EcoRI og BamHI. Det store 4 kb fragmentet blir isolert på en forbedrende 0,6$ agarose-gel. DNA blir utvunnet med elektroeluering, renset med DE52 ionebytte-kromatografi og etanolutfelling som beskrevet i eksempel 7. DNA-et blir igjen oppløst i H20 ved en konsentrasjon på 0,4 pmol/pl. 10 pl av den kondenserte ol igonukleot id-blandingen A (5 pmol hver av oligoene 1-11), 9,5 pl av blanding B (5 pmol hver av oligoene 12-21), 0,4 pmol av 4 kb EcoRI-BamHI fragmentet til pBR322 og 400 enheter med T4 DNA-ligase (Biolabs) blir inkubert i 16 timer med 15°C. 10 pl aliquoter blir anvendt til å transformere kompetente E. coli HB 101 Ca<++> celler. 12 transformerte, ampicillin-resistente kolonier blir dyrket individuelt i LB-mediet som inneholder 100 pg/ml med ampicillin. Plasmid DNA blir fremstilt ved fremgangsmåten til Holmes et al. (Anal. Biochem. 114. 193 (1981 )) og analysert med EcoRI og BamHI restriksjonsspaltninger. Plasmid DNA'ene med 257 bp EcoRI-BamHI innsatt blir videre analysert med DNA-sekvensering på begge trådene. Oligonukleotider 3, 11, 12, 14 og 20 (se fig. 2) blir anvendt som sekvenser ingsprimere. En klon med en korrekt sekvens på begge DNA-trådene blir valgt og referert til som pBR322/YHIR. ;Eksempel 7: ;Konstruering av plasmid pJDB207/GAPFL-YHIR pJDB207/GAPFL-YHIR er et gjærplasmid for uttrykking av desulfatohirudin-variant HVI under regulering av en kort, grunnleggende promoter til gjær glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (GAPDH) genet. Den kodende sekvensen til desulfatohirudin består av foretrukne gjærkodon. 10 pg av plasmid pBR322/YHIR blir spaltet med restriksjons endonukleasene BamHI og EcoRI. Det 257 bp EcoRI-BamHI fragmentet blir adskilt fra andre DNA-fragmenter på en 1,2% forberedende agarosegel. DNA-båndene blir farget med etidiumbromid og synliggjort under IJV-lys ved 360 nm. Det 257 bp DNA-båndet blir kuttet fra gelen og elektroeluert i 0,2 x TBE-buffer (TBE: 90 mM Tris-base, 90 mM borsyre, 2,5 mM EDTA, ph 8,3) i 45 min. ved 100 mA. Etter bytting av polaritet i 45 sekunder, blir DNA-oppløsningen oppsamlet og justert til 0,15 M NaCl. DNA blir absorbert til en 100 pl mengde med DE52 ionebytte (Whatman) og eluert i 400 pl med høy saltbuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl). DNA blir etanol-utfelt og suspendert på nytt i H2O til en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl. ;Plasmid pJDB207/GAPFL-HIR (Europeisk Patent Søknad nr. 225 633) inneholder det syntetiske gen for desulfatohirudin (basert på JU coli kodonbehandlingen) satt sammen i ramme til signalsekvensen til gjærsur fosfatase (PH05). Genet blir uttrykt under regulering av et kort grunnleggende glycer-aldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPFL) promoter til gjær på en skyttelvektor pJDB207. 10 pg av plasmid pJDB207/GAPFL-HIR blir spaltet med Sali og EcoRI. Det 478 bp Sall-EcoRI fragmentet inneholder Sal-Bam pBR322 delen og GAPFL promoteren. DNA-fragmentet blir isolert på en 0,8% forberedende agarosegel, elektroeluert og renset med DE52 kromatografi og etanol-utfelt. DNA blir igjen suspendert i HgO til en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl. 5 pg av pJDB207/GAPFL-HIR blir spaltet med Sali og BamH. Det største 6,7 kb vektorfragmentet blir isolert som beskrevet over. ;0,2 pmol av 478 bp Sall-EcoRI promoterfragmentet, 0,2 pmol av 257 bp EcoRI-BamHI fragmentet som inneholder PH05 signalsekvensen og det syntetiske hirudingenet (gjærkodon) og 0,1 pmol av 6,7 kb vektorfragmentet blir ligert i 10 pl 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 200 enheter av T4 DNA-ligase (Biolabs) i 6 timer ved 15"C. En en-pl-aliquot av 1igeringsblandinger blir anvendt til å transformere kompetente E^. coli HB 101 celler. 12 transformerte ampicillin-resistente kolonier blir dyrket individuelt i LB medium som inneholder 100 pg/ml med ampicillin. Plasmid-DNA blir fremstilt ved fremgangsmåten til Holmes et al. (ovenfor) og analysert med Sall/Hindlll doble spaltinger. Et enkelt klon med det forventede restriksjons-mønster er referert til som pJDB207/GAPFL-YHIR. ;På en tilsvarende måte kan man utføre konstrueringen med et 543 bp Sall-EcoRI promoterfragment til plasmid pJDB207/GAPEL-HIR (Europeisk Patentsøknad nr. 225 633). Det resulterende nye plasmid er referert til som pJDB207/GAPEL-YHIR. ;Eksempel 8: ;Konst ruering av plasmid pJDB207/ PH05(-1731-HIR ;pJDB207/PH05(-173)-HIR er et gjærplasmid for ekspresjonen av desulfatohirudin-variant HVI under reguleringen av en kort PH05 promoter. PH05(-173) promoterelementet omfatter nukleotidsekvensen til gjær PH05 promoteren fra posisjon —9 til -173 (BstEII restriksjonssete), men har ingen oppstrøms reguleringssekvenser (UAS). PH05(-173) promoteren oppfører seg derfor som en grunnleggende promoter. ;Plasmid pJDB207/PH05(Eco)-HIR (EP 225 633) inneholder full-lengde, regulert PH05 promoter med et EcoRI sete introdusert i posisjon —8 med hensyn på ATG til PH05 signalsekvensen og den kodende sekvensen til desulfatohirudin som er etterfulgt av PH05 transkripsjons-termineringsfragmentet. Dette eksemp-let beskriver erstatningen av den regulerte PH05 promoter av det korte PH05(—173 ) promoter-elementet. 20 pg av plasmid pJDB207/PH05(Eco )-Hir blir spaltet med BstEII. De klebrige endene til restriksjonsfragmentene blir fylt i en reaksjon med Klenow DNA-polymerase (1 del/pg DNA) i 200 pl 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 0,1 mM hver av dATP, dCTP, dGTP, TTP i 30 min. ved romtemperatur. Etter fenolekstrahering blir DNA utfelt i etanol. ;4,16 pg av BamHI linker (5'-CGGATCCG-3', Biolabs) blir fosforylert i 100 pl 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP og 18 enheter av T4 polynukleotid-kinase (Boehringer) i 45 min. ved 37°C. Etter 10 min. ved 75°C blir reaksjonsblandingen langsomt avkjølt til romtemperatur. De kondenserte oligonukleotid-linkerne blir lagret ved —20°C. ;4 pmol av (BstEII)/kortende-fragmentene til plasmid pJDB207/- PH05(Eco )-HIR blir inkubert i 16 timer ved 15° C med et 100 ganger overskudd av den fosforylerte og kondenserte BamHI linkeren i 208 pl av 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM ;DTT, 3,5 mM ATP og 800 enheter av T4 DNA-ligase (Biolabs). Etter inaktivering av ligasen i 10 min. ved 85° C ble overskudd av linkere fjernet ved utfelling av DNA i nærvær av 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat pH 6,0 og 0,54 volumer med isopropanol. DNA blir spaltet med BamHI og EcoRI. DNA-fragmentene blir adskilt på en 0,8% forberedende agarosegel. Det 172 bp BamHI-EcoRI promoter-fragmentet blir utvunnet fra gelen ved elektroeluering og etanolutfelling. DNA blir igjen suspendert til en konsentrasjon på 0,1 pmol/pl. ;Plasmid pJDB207/PH05(Eco)-HIR blir spaltet med EcoRI og Hindlll. Det 643 bp EcoRI-Hindlll fragmentet blir isolert som beskrevet over. DNA-fragmentet inneholder PH05 signalsekvensen sammensatt i ramme til den kodende sekvensen for desulfatohirudin og PH05 transkripsjonstermineringsfragmentet . Plasmidet blir også kuttet med Hindlll og BamHI. Det 6,6 kb vektorfragmentet blir isolert. ;0,2 pmol hver av 172 bp BamHI-EcoRI fragmentet og 643 bp EcoRI-Hindlll fragmentet og 0,1 pmol av 6,6 kb vektorfragmentet blir ligert i 10 pl med 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enheter av T4 DNA-ligase (Biolabs) i 6 timer ved 15°C. En en-pl-aliquot av ligeringsblandingen blir tilsatt til 100 pl av kalsium-behandlet, transformasjons-kompetent E^. coli HB101 celler. 12 transformerte, ampicillin-resistente kolonier blir dyrket i LB medium som inneholder 100 pg/ml med ampicillin. Plasmid DNA blir fremstilt og analysert med BamHI og Sall/Hindlll spaltninger. En klon med de forventede restriksjonsfragmentene blir utvalgt og referert til som pJDB207/PH05(-173)-HIR. ;Eksempel 9: ;Konstruering av plasmid pDP34 ;Gjær 2 pm kovalent lukket sirkulær DNA blir isolert fra Saccharomvces cerevisiae stamme S288C. Celler blir inkubert med 5 pg/ml med Zymolyase (100.000 enheter/pg) i 20 min. ved 37°C for å spalte celleveggene. Sferoplastene blir lysert med 2% SDS. EDTA blir deretter tilsatt til 25 mM, etidiumbromid til 1 mg/ml og cesiumklorid til en slutt-tetthet på 1,55 g/ml. Plasmid DNA blir adskilt fra kromosomalt DNA med ultrasentrifugering i 42 timer ved 42.000 rpm ved 15°C. De 2 pm plasmid DNA'ene blir kuttet fra gradienten med en nål. Etidiumbromidet blir fjernet ved ekstrahering med NaCl-mettet isopropanol og plasmid-DNA blir tilslutt etanol-utfelt. Det rensede to-pm plasmid DNA blir deretter linearisert med Pstl og klonet inn i Pstl-setet til pUC19 (J. Norrander et al., Gene 26 (1983), 101) for å gi plasmid pDP31. ;Plasmid pJDB207 blir spaltet med restriksjonsenzymene Kpnl og Epal. Det resulterende 0,55 kb Hpal-Kpnl fragmentet inneholder forbindelse mellom den 2 pm sekvensen og den defekte promoteren til dLEU2 genet. ;Plasmid pUC7/LEU2 inneholder gjærgenomisk 2,2 kb Xhol-Sall fragmentet til LEU2 genet (A. Andreadis et al. (1982) Cell 31, 319) klonet inn i Sali setet til plasmid pUC7 (J. Vieira et al. (1982) Gene 19, 259). Plasmid pUC7/LEU2 blir kuttet med Kpnl og Hpal. Det 4,25 kb Kpnl-Epal fragmentet blir ligert til det 0,55 kb Hpal-Kpnl fragmentet til pJDB207. Dette resulterer i plasmid pDP30 der den originale 2 pm/dLEU2 sammensmeltningen som i plasmid pJDB207 er plassert i front av LEU2 genet med dens fullstendige terminator. pDP30 blir spaltet med Epal og Sali og det 1,85 kb fragmentet som inneholder det fullstendige LEU2 genet blir renset og klonet inn i 8,7 kb Sall-Epal fragmentet til plasmid pDP31. Det resulterende plasmid, pDP33 (se fig. 3), blir linearisert ved delvis spalting med Hindlll i nærvær av 50 pg/ml etidiumbromid (M. Oesterlund et al. (1982) Gene 20, 121) og ligert med 1,17 kb Hindlll fragmentet som inneholder URA3 genet (M. Rose et al. (1984) Gene 29, 113). Innføring av URA3 genet blir selektert ved transformasjon inn i E. coli stammen pyrF (M. Rose et al., over). Et positivt klon blir referert til som plasmid pDP34 (se fig. 4). ;pDP34 er en g.iær- E. coli skyttelvektor med ampicillin-resistens markør for E. coli og URA3 og dLEU2 gjærselektive markører. Den inneholder den fullstendige 2 pm sekvensen i A formen og er REP1, REP2 og FLP perfeksjonert. ;Eksempel 10: ;Kloning av hirudin-ekspresjonskassetter inn i pDP34 ;Plasmid pDP34 blir spaltet med BamHI. De klebrige endene til restriksjonssetet blir fylt i en reaksjon med Klenow DNA-polymerase (T. Maniatis et al., i: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). DNA blir videre kuttet med Sali og 11,8 kb vektorfragmentet blir isolert på en forberedende 0,6% agarosegel. DNA blir utvunnet ved elektroeluering og etanolutfelling. Forskjellige ekspresjonskassetter blir klonet inn i pDP34 vektorfragmentet mellom Sali og (BamHI)/kortende-setene. ;Plasmid pJDB207/GAPFL-YHIR blir spaltet med Hindlll. De klebrige endene blir overført til korte ender ved Klenow DNA-polymerase. DNA blir etanolutfelt og videre spaltet med Sali. Den 1,1 kb SalI-(HindIII)/kortende-fragmentet inneholder den fullstendige ekspresjonskassetten med pBR322 sekvenser, GAPFL promoteren, PH05 sigalsekvensen sammensatt i ramme til den kodende sekvensen (foretrukne gjærkodon) til desulfatohirudin og PH05 transkripsjonstermineringsfragmentet. Det 1,1 kb fragmentet blir isolert på en forberedende 0,8% agarosegel, utvunnet fra gelen ved elektroeluering og renset med DE52 ionebytte-kromatografi og etanolutfelling. 0,2 pmol av 1,1 kb fragmentet og 0,1 pmol av 11,8 kb vektorf ragmentet blir ligert i 10 pl av 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og 400 enheter med T4 DNA-ligase (Biolabs) i 16 timer ved 15°C. En en-pl-aliquot blir anvendt til å transformere E. coli HB101 Ca<2+> celler. 5 transformerte ampicillin-resistente kolonier blir analysert. Plasmid DNA blir spaltet med BamHI og Sall/BamHI. Et klon med de korrekte restriksjonsfragmentene blir valgt og referert til som pDP34/GAPFL-YHIR (se fig. 5). ;På en analog måte blir 1,2 kb SalI-(HindIII)/kortende-fragmentet til pJDB207/GAPEL-YHIR (se eksempel 7) klonet inn i pDP34 vektoren, som resulterer i plasmid pDP34/GAPEL-YHIR. ;Plasmid pJDB207/PH05(-173)-HIR blir spaltet med Sali og EcoRI. Det 448 bp Sall-EcoRI fragmentet blir isolert som beskrevet. DNA-fragmentet inneholder Sall-BamHI delen av pBR322 og den korte grunnleggende PH05(-173 )-promoteren (se eksempel 8). Plasmid pJDB207/GAPFL-YHIR blir spaltet med Hindlll. De klebrige endene blir omdannet til korte ender med Klenow DNA-polymerase. DNA blir videre spaltet med EcoRI. Den 642 bp EcoRI-(HindIII)/kortende-fragmentet blir isolert. Det inneholder PH05 signalsekvensen, den kodende sekvensen for desulfatohirudin (med foretrukne gjærkodon) og PH05 transkripsjons-termineringsfragmentet. 0,2 pmol hver av 448 bp Sall-EcoRI fragmentet og 642 bp EcoRI-kortende-fragmentet og 0,1 pmol av 11,8 kb SalI-(BamHI)/kortende-vektorfragmentet blir ligert. Aliquoter av ligeringsblandingen blir anvendt til å transformere E. coli HB 101 Ca<++> celler. Plasmid DNA til 12 transformanter blir analysert ved BamHI og Sall/BamHI spaltninger. En klon med korrekt plasmid blir valgt og referert til som pDP34/PH05(-173)-YHIR (se fig. 6). ;Eksempel 11: ;Ytterligere ekspresjonsplasmider for hirudin-genet med E. coli kodon ;Ekspresjonsplasmider som inneholder det syntetiske gen for desulfatohirudin-variant HVI basert på E. coli kodon behand-lingen blir konstruert på en måte som er tilsvarende beskrivelsen i eksempel 10. Den 1,1 kb SalI-(HindIII)/kortende-fragmentet til pJDB207/GAPFL-HIR (Europeisk Patentsøknad nr. 225 633) blir isolert og klonet inn i vektor pDP34. Det resulterende ekspresjonsplasmidet er pDP34/GAPFL-HIR som omfatter det syntetiske gen for desulfatohirudin basert på foretrukne E. coli kodon uttrykt under regulering av den grunnleggende GAPFL promoteren. ;For en lignende konstruksjon blir 1,1 kb SalI-(HindiII)/kort-endefragmentet til pJDB207/PH05(-173)-HIR (se eksempel 8) klonet inn i pDP34. Det resulterende plasmid pDP34/PH05-(-173)-HIR inneholder det syntetiske gen for desulfatohirudin ( E. coli kodon) under regulering av den korte grunnleggende PH05(-173) promoter. ;Eksempel 12: ;Hirudin-ekspresjonskassetter klonet inn i plasmid pDP92 ;Vektorer som inneholder den fullstendige to-pm sekvensen trenger ikke nødvendigvis å uttrykke alle funksjoner til den ekte gjær to-pm sirkelen. Åpne leserammer kan bli ødelagt ved kloning. Siden ingen funksjon er blitt kjent så langt for genproduktet til "D" leserammen, ble det entydige Pstl setet inne i dette genet anvendt for kloning av dLEU2 genet (Beggs, J.D. (1978) Nature 275, 104-109) eller innsetting av pUC19 vektordelen som i plasmid pDP31 (se eksempel 9). Det er nylig foreslått at D-genproduktet regulerer ekspresjon av FLP-genproduktet (J.A.H. Murray et al. (1987) EMBO J. 6, 4205)). For å ha størst mulig fordel av to-pm sirkelen, blir en vektor konstruert som er perfeksjonert for alle de kjente to—pm funksjonene inkludert D-genproduktet. ;a) Konstruering av plasmid pDP92 (se fig. 7) ;Plasmid pDP31 (eksempel 9) blir spaltet med Pstl og Epal og ;det resulterer i tre fragmenter. Plasmid pK19 (som innehar kanamycin-resistans; Pridmore, R.D. (1987) Gene .56, 309-312) blir linearisert med Smal. DNA-fragmentene fra begge spalt-ningene blir fenol-ekstrahert og utfylt med etanol. DNA-fragmentene blir blandet og ligert. Ligeringsblandingen blir transformert (Eanahan, D.J. (1983) Mol. Biol. 166, 557-580) til kompetent E. coli JM109 celler (Yanisch-Perron, C. et al. ;(1985) Gene 33» 103-119) uttrykt i 2 timer ved 37° C i LB-medium og deretter utsådd på LB-agarskåler som har fått tilført 50 jig/ml med kanamycin, 30 pg/ml med XGal og 7 pg/ml med IPTG. 12 hvite, kanamycin-resistente kolonier blir dyrket. Plasmid DNA blir analysert med Xbal og BamEI/Kpnl spaltninger. Et enkelt klon som har tapt pUC19 vektordelen av pDP31, gjen-innsatt to-pm D leserammen ved gjenligering av Pstl setet og som har pK19 plasmid-kortenden innsatt i Epal er referert til som pDP91. Plasmidet inneholder det store Epal-Pstl og de små Pstl-Epal fragmentene til to-pm plasmidet klonet inn i Smal setet til pK19. Ved gjenligering av Pstl setene er leserammen rekonstituert. ;URA 3 genet blir isolert på 1,17 kb Hindlll fragment fra plasmid pDP34 (se eksempel 9) og klonet inn i det entydige Hindlll setet til plasmid pUC12. Et klon med URA3 gen innsatt i samme orientering som ampicillin-resistens genet blir referert til som pUC12/URA3. Plasmid pDP91 og pUC12/URA3 blir begge spaltet med SacI og BamHI og dette resulterer i to fragmenter hver. DNA-fragmentene blir blandingsligert og anvendt til å transformere kompetent E. coli JM109 celler. Cellene blir sådd ut på LB-agarskåler som har fått tilført 100 pg/ml med ampicillin, 30 pg/ml med XGal og 7 pg/ml med ;IPTG. ;12 hvite, ampicillin-resistente kolonier blir dyrket. Plasmid DNA blir analysert med Hindlll og PvuII spaltninger. En enkelt klon blir referert til som pDP92, og omfatter den fullstendige to-pm sekvensen som er perfeksjonert for alle dens kjente funksjoner og URA 3 genet klonet inn i pUC vektoren. ;b) Kloning av hirudin-ekspresjonskassetter inn i pDP92 ;I analogi til eksempel 10 blir pDP92 spaltet med BamHI. De ;klebrige endene blir fylt i en reaksjon med Klenow DNA-polymerase. DNA blir videre kuttet med Sali. Det 10,2 kb vektorfragmentet blir isolert. Det 1,1 kb SalI-(HindIII)/- kortende-fragmentet til plasmid pJDB207/GAPFL-YHIR blir isolert og ligert til vektorfragmentet. 6 transformerte, ampicillin-resistente kolonier blir analysert. Plasmid DNA blir spaltet med BamHI, Pstl og Sall/BamHI. Et klon med de forventede restriksjonsfragmentene blir selektert og referert til som pDP92/GAPFL-YHIR. På samme måte blir plasmid pDP92/GAPEL-YHIR oppnådd ved å anvende 1,2 kb SalI-(HindIII)/kortende-fragmenter av pJDB207/GAPEL-YHIR (se eksempel 7). ;Plasmid pDP92/PH05(-173)-YHIR blir konstruert som beskrevet i eksempel 10 ved å anvende 10,2 kb SalI-(BamHI)/kortende pDP92 vektorfragmentet (se over). ;Eksempel 13: ;Konstruering av to-pm DNA frie Saccharomvces cerevisiae vertstammer ;For å flytte det endogene to-pm plasmidet, blir det i et første trinn introdusert en delesjon i URA3 genet til stammen HT246 (DSM 4084; a, leu 2-3, leu 2-112, prb) for å gjøre stammen auxotrofisk for uracil. HT246 blir transformert med 1 pg av plasmid YeP13 (Broach, J.R., Strathern, J.N., Hicks, J.B. (1979) Gene 8, 121-123) ved å anvende transformasjonsprotokollen beskrevet av Hinnen et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)). 10 jjg av plasmid pUC12ura3A som inneholder en delusjon i URA3 genet (Sengstag, Ch., Hinnen, A. (1987) Nucleic Acids Research 15, 233-246) blir tilsatt sammen med plasmid YEP13. Ca. 3000 leucin prototrofiske transf ormanter blir på nytt suspendert i 5 ml minimalmedium (Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer som det ble tilsatt 2% glukose, 0,1% leucin, 0,1% uracil og 0,25% fluoreddiksyre) i en liten rysteflaske og inkubert i 60 timer ved 30°C og 180 r.p.m. Transformanter som vokser er resistente mot den toksiske analoge fluoreddiksyre og bærer derfor en erstatning i det kromosomale URA3 genet ved ura3A. De dyrkede cellene blir sådd ut på fullmedium som inneholder (g/l): Pepton 20, gjærekstrakt 10, glukose 20, og etter vekst i 48 timer ved 30°C replika-platet på minimalmedium (Difco) gjærnitrogenbase uten aminosyrer. Supplert med 2% glukose og 0,1% leucin) for å påvise uracil-auxotrofer. Flere auxotrofer blir plukket opp og testet for plasmid YEP13-tap som innehar leucin-auxotrofi. En individuell koloni (betegnet Tr889) som krever leucin og uracil blir plukket opp og anvendt til videre undersøkelser. ;Tr889 blir transformert med plasmid pDP38 (oppnådd fra plasmid pDP34 ved spaltning med SphI og gjenligering av det resulterende 8,4 kb fragment; se fig. 4), som bærer både markør-gener LEU2 og URA3 (transformasjonsprotokoll, ovenfor). Transformerte gjærceller blir først selektert på gjærminimal mediumskåler som mangler uracil, supplert med leucin og deretter replika-platet på minimalmedium som mangler leucin og supplementert med uracil. 10 sakte voksende kolonier blir plukket opp og individuelt dyrket i fullt væskemedium (ovenfor) i ca. hundre generasjoner. Ved å gjøre det slik vil cellene tape pDP38 plasmidet og - til en viss prosent - samtidig også det endogene to-pm plasmidet. ;10 uracil og leucin-krevende kolonier blir plukket opp, DNA blir fremstilt, DNA blir spaltet fullstendig med Pstl og probet med <32>P-merket gjær to-pm DNA på Southern blot. En isolering uten noe hybridiseringssignal blir referert til som H449 (a, leu2-3. Ieu2-112, ura3A. prb, eir1 ), et isogenisk to-pm fritt (eir') derivat av gjærstammen HT246. ;Eksempel 14: ;Fremstilling av en kexl variant av S. cerevisiae H449 ved brudd i det genomiske KEX1 genet ;Karboksypeptidase ysca aktivitet blir eliminert fra S. cerevisiae stamme H449 (prb, leu2, ura3, eir") gjennom brudd i det genomiske KEX1 genet. Av denne hensikt blir KEX1 genet identifisert i et gjærgenomisk bibliotek og klonet i en passende vektor. URA3 genet som tjener som en selektiv markør, blir innsatt i det strukturelle genet til KEX1 for å bryte dens leseramme. Hybridplasmid DNA som omfatter TJRA3 genet flankert på hver side med KEX1 sekvensene blir introdusert inn i Ura" gjærstamme H449. Sekvens-homologiteten til KEX1 genet på plasmidet og på kromosomet muliggjør in vivo rekombinasjon, som transformerer gjærceller fra Ura" til Ura<+ >og samtidig fra KEX1 til kexl. Stammer med et oppbrutt kexl gen syntetiserer ikke et funksjonelt ysca protein. ;Genet som koder for KEX1 blir klonet fra et gjærgenomisk bibliotek (i sentromer-skyttelvektoren pCS19; Sengstag, C. et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15., 233) med koloni-hybridisering med en KEX1 spesifikk oligonukleotid probe. Sekvensen til det følgende oligonukleotid ;;er avledet fra den publiserte KEX1 sekvensen (kfr. Dmocho-wska, A., et al. (1987) Cell !50, 573) og selektert fra hele sekvensen ved sin særlig lave homologitet til sekvensen for yscY. Den hybridiserer til KEX1 DNA oppstrøms til EcoRV restriksjonssetet, som blir anvendt for innsetting av URA3 genet. Det samme oligonukleotid kan bli anvendt som en ;sekvenseringsprimer for bekreftelsen av URA3 fragment-innsetningen. Dette syntetiske oligonukleotid blir radio-merket og anvendt til å screene genebiblioteket. ;Ca. 10.000 kloner (5 x 2000 kloner/skål (ø = 140 mm)) blir screenet ved koloni-hybridisering (kfr. woods, D.E., et al. ;(1982) Proe. Nati. Acad. Sei USA 79, 5661 og Whitehead A.S., et al. (1983) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 5387). Fra to gjentatte screenings-prosedyrer, er 5 uavhengige positive kloner isolert. En av dem er betegnet pKEXl. For å kutte ut et KEX1 spesifikt Hindlll-BamHI fragment (1380 bp), blir pKEXl plasmid DNA spaltet med de korresponderende to endonukleasene. Det respektive fragment blir overført til Bluescript vektor M13+ med SK polylinker og dette klon blir sekvensert ved å anvende en universal primer for M13 vektoren for å bekrefte KEX1 fragmentet og navngitt pKEXlM13. ;Plasmidet pUC12/URA3 (se eksempel 12a), som inneholder URA3 genet klonet som Hindlll fragment, blir spaltet med Hindlll for å isolere det 1170bp Hindlll fragmentet (kfr. Rose, M. et al. (1984) Gene 29<_>, 115). De klebrige endene av fragmentet blir fylt med Klenow polymerase for å skape korte ender. På den annen side blir plasmid pKEXlM13 linearisert ved endonuklease EcoRV spaltning, hvorved KEX1 HindiII-BamHI fragmentet blir kuttet, og defosforylert med alkalisk fosfatase for å unngå selv-ligering. Deretter blir disse to DNA fragmentene blandet, ligert og transferert i E. coli stamme JM103. Transformantene blir analysert i dobbeltspalting med Hindlll og BamHI, der størrelsen av de betraktede Hindlll-BamHI fragmentene øker fra 1380bp til 2550bp. DNA fra et korrekt klon blir sekvensert ved å anvende det ovenfor beskrevne oligonukleotid som en sekvenseringsprimer for å bekrefte innsetting av URA 3 fragmentet i KEX1 genet ved posisjonen til EcoRV spaltingssetet. Plasmidet har navnet PKEX1M13-URA3. ;pKEXIMI3-URA3 DNA blir spaltet med Hindlll og BamHI for å kutte ut KEX1-URA3 hybridfragmentet og uten adskillelse fra vektoren som er introdusert inn i S. cerevisiae stamme H449 i henhold til ovenfornevnte metode (se eksempel 3). Etter isoleringen av membranfraksjonen fra Ura3<+> transformantene, blir aktiviteten til ysca målt ved å anvende et kromogenisk substrat (se eksempel 1). En enkelt transformant som ikke viser noe proteaseaktivitet av ysca blir betegnet S. cerevisiae H449kexl. ;Eksempel 15 ;Transformasjon av S. cerevisiae stamme H449kexl ;Saccharomvces cerevisiae stamme H449kexl blir transformert med plasmidene ;pDP34/PH05(-173)-HIR ;pDP34/GAPFL-HIR ;pDP34/GAPEL-HIR ;pDP34/PH05(-173)-YHIR ;pDP34/GAPFL-YHIR ;pDP34/GAPEL-YHIR ;pDP92/PH05(-173)-YHIR ;pDP92/GAPFL-YHIR ;pDP92/GAPEL-YHIR ;ved å anvende transformasjonsprotokollen beskrevet av Hinnen et al. (ovenfor). Transformerte gjærceller blir selektert på gjærminimal mediumskåler supplert med leucin, men mangler uracil. Enkle transformerte gjærceller blir isolert og blir referert til som ;Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP34/PH05(-173)-HIR Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPFL-HIR Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPEL-HIR Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP34/PH05(-173)-YHIR Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPFL-YHIR Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPEL-YHIR Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP92/PH05(-173 )-YHIR Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP92/GAPFL-YHIR Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP92/GAPEL-YEIR ;Eksempel 16 ;Fermentering av transformerte gjærstammer i laboratorieskala ;Celler fra Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP34/ PH05-(-173)-YHIR og Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPFL-YHIR blir hver dyrket i to etterfølgende forkulturer med 10 ml minimal medium som består av (g/l): ;Den første forkultur blir dyrket i 60 timer ved 28° C og 180 r.p.m. Den andre forkultur blir innokulert med 2% av den første forkultur og inkubert i 24 timer ved 28° C og 180 r.p.m. ;Hovedkultur-mediet består av (g/l): ;;Hovedkulturen blir inokulert med 2 x 10^ celler/ml og inkubert opp til 72 timer ved 28°C og 180 r.p.m. Tilnærmet 1 x IO<9> celler/ml blir oppnådd på slutten av fermenteringen. Ved flere tidspunkt under fermenteringen blir aliquoter av kulturell tatt, cellene fjernet med sentrifuger ing og supernatanten analysert for desulfatohirudin med HPLC (nedenfor). ;Eksempel 17 ;Fremstilling av desulfatohirudin-variant HVI i en 50 1 skala ;En arbeidscelle-bank av to-pm fri stamme Saccharomvces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPFL-YHIR, er blitt anvendt som en kilde til inokulum for fremstilling av desulfatohirudin i en 50 1 skala. ;Ampuller med arbeidscellebanken blir oppbevart i dampfase i en flytende nitrogenbeholder. Innholdet i en ampulle blir anvendt for å inokulere en rysteflaske-kultur som omfatter et selektivt medium som består av (g/l) ;;500 ml flaskene inneholder 100 ml medium og blir inkubert i 48 timer ved 28°C på en orbital-ryster med en rystehastighet på 180 turer/min. ;Den andre rysteflaske forkultur inneholder det samme medium der 600 ml er inneholdt i en 2 1 flaske som har fire plater, (baffles). Inoculum-nivået fra den første forkultur er 5% ;(30 ml) og flaskene blir inkubert i 48 timer ved 28° C på en orbital-ryster i en hastighet av 120 turer/min. ;En tredje forkultur blir fermentert i en 50 1 rustfri stål-bioreaktor utstyrt med 4 plater og en enkel diskturbinryster med en diameter på 115 mm. Det ovenfornevnte medium blir også anvendt i denne kultur, og startvolumet er 30 1. En enkelt 2 1 flaske som inneholder 600 ml kultur blir anvendt til å inokulere 50 1 reaktoren ( 2%). Fermenteringen varer i ca. 42 timer ved en temperatur på 28°C. Røringshastigheten er 600 turer/min., "beluf tningshastigheten 1 vvm og reaktoren opererer med et overtrykk på 0,3 bar. ;En lignende 50 1 bioreaktor, ytterligere utstyrt for fed-batch prosesser, blir anvendt til desulfatohirudin-frem-stillingstrinnet. Et medium som består av (g/l) ;;blir anvendt i dette trinnet (30 1). Inokuleringsnivået fra det tredje forkulturtrinnet er valgfritt 2%. Fermenteringen varer i 48 timer ved en temperatur på 28° C og rørerhastig-heten blir satt til 750 turer/min. Overtrykket er til å begynne med satt til 0,3 bar, men dette kan bli hevet til 1,0 bar i løpet av fermenteringen for å opprettholde oppløst oksygenspenning over 20% metning. Begynnerstrøm-hastigheten er 0,25 vvm, men denne blir øket til 1 vvm etter ni timer for å forsikre en tilstrekkelig oksygen-tilførsel. ;pH-verdien faller under den tidlige delen av fermenteringen til en verdi på 5,0 som den blir opprettholdt på ved auto-matisk tilsetning av ammoniumhydroksid. ;I enkel satskultur er biomasse-nivået som blir oppnådd, og dermed desulfatohirudin-titren, avhengig av mengden til karbonkilden som blir tilsatt i fermentereren ved begyn-nelsen. Dette i sin tur blir diktert av oksygenoverførings-kapasiteten til bioreaktoren og behovet for å unngå uvanlig stor fremstilling av etanol av den voksende gjæren. Disse begrensningene kan forbigåes ved å anvende satstilførings-teknologi. Således blir ganske lite glukose inkludert i startmediet, men en tilføring av glukose blir utført for å sørge for en betydelig høyere slutt-biomassekonsentrasjon og en desulfatohirudin-titer tilnærmet tre ganger den som blir oppnådd i satskultur. I praksis øker tilføringen ved intervaller på en trinnvis måte til en slutt-tilføringshastighet på 175 g/h av glukose-monohydrat. ;Små tilsetninger av silikon-basert antiskum blir anvendt for å regulere skumming når det er nødvendig. En del av utløps-gassen fra fermentereren blir analysert for å sørge for informasjon om oksygenopptak og karbondioksid-evolusjons-hastighet. Den oppløste oksygenspenningen blir målt on-line ved å anvende en steriliserbar elektrode. ;Prøver blir tatt ut ved 6 timers intervaller gjennom prosessen for å muliggjøre måling av glukose- og etanol-konsentrasjonene, desulfatohirudin-titer ved bioanalyse og HPLC, og også for å sjekke steriliteten. HPLC viser tydelig at det fremstilte desulfatohirudin er i det vesentlige fri for C-terminalforkortede analoger. På slutten av fermen-teringsprosessen kan desulfatohirudin blir utvunnet fra kultursupernatanten. ;Eksempel 18 ;Utvinning av desulfatohirudin fra S. cerevisiae dyrket i en 50 1 skala ;Dyrkningskulturen (se eksempel 17) blir blandet med Amberlite XAD-7 og blir utsatt for absorpsjon i ca. 4 timer ved 25° C. Cellene blir adskilt fra harpiksen i en kolonne. Etter vasking med IM NaCl blir harpiksen eluert med Tris buffer (50 mM, pH 7,0 - 8,5). Hovedfraksjonen (30 1) blir justert til pH 2,9 og applisert på en S-Sepharose kolonne (Amicon PA, ekvilibrert med ammoniumformiat-buffer 25 mM, ph 2,9) og har et volum på 2 1. Etter vasking med ammoniumformiat-buffer ;(40 mM, ph 3,6) blir elueringen utført med ammoniumformiat-buf f er (50 mM, pH 3,8). Eoved eluatfraksjonen (10 1) blir konsentrert ved hjelp av en Filtron Minisette ultra-f iltreringssystem utstyrt med en fi 3k membran. En 0,5 1 aliquot av den resulterende klare proteinoppløsningen blir applisert på en Bio-Gel P-6 finkolonne (Amicon GF ekvilibrert med 0,5% eddiksyre) som har et volum på 1,5 1. Eluering blir utført med 0,5% eddiksyre. Eoved eluatfraksjonen (1 1) blir konsentrert ved hjelp av ultrafiltrering og deretter applisert på en Q-Sepharose hurtigstrøms-kolonne (Amicon PA, ekvilibrert med ammoniumformiat-buffer 25 mM, pE 2,9) som har et volum på 2 1. Elueringen blir utført med ammoniumformiat-buf f er (50 mM, pE 4,2). Eoved eluatfraksjonen blir konsentrert ved hjelp av ultrafiltrering og blir deretter dia-fUtrert mot vann. Den resulterende klare vandige oppløs-ningen blir lyofilisert. Det faste stoffet består av ren desulfatohirudin som er fri for målbare mengder av C-terminalt forkortede analoger. ;Eksempel 19 ;Brudd i PRAI genet i S. cerevisiae E 44 9 ;S. cerevisiae stamme E 449 (DSM 4413; prb, leu2, ura3, cir°) blir gjort multippel-proteasemanglende ved hjelp av genbrudd. Genbrudd sammenlignet med meiotisk krysning har den fordel at den stabilt introduserer en mutasjon og beholder den genetiske bakgrunn til en gitt stamme identisk. ;I et første trinn, blir proteinase yscA aktiviteten eliminert via brudd i PRAI genet (Ammerer, G. et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6, 2490). PRAI blir isolert fra total genomisk gjær-DNA, spaltet med SacI og Pstl. 2 kb fragmenter blir isolert fra en forberedende 0,6% agarosegel, elektroeluert og ligert inn i Pstl-SacI setene til polylinker-regionen av pUC19. Vektoren blir transformert inn i E. coli JM 109 og 280 individuelle kolonier blir plukket opp. Koloniene blir individuelt dyrket i brønner i mikrotiter-skåler som inneholder LB+amp medium. Kolonihybridisering blir utført i det vesentlige som beskrevet (Woods, D.E. et al. (1982) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 7_9, 5651 ) med følgende <32>P-merket oligonukleotid-probe ;5'- AAGCCTAGTGACCTAGT - 3' ;som er avledet fra den publiserte PRAI sekvensen (Ammerer et al. ovenfor). 3 positive kloner blir plukket opp, DNA i en-pUC19/PRAl - blir kuttet med SacI og Xhol og 1,9 kb fragmentet som inneholder hele PRAI genet blir subklonet inn i KS polylinker-regionen til Bluescript-vektor M13+ (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA). Et 1,2 kb Hindlll fragment som inneholder hele URA3 genet (Rose, M. et al. ;(1984) Gene 29, 113) blir innsatt i det entydige Hindlll setet inne i kodingsregionen til PRAl-innsetningen. Det resulterende plasmid blir betegnet M13+/pral::URA3. M13+/pral: :URA3 blir spaltet med Sacl/Xhol og 3,1 kb fragmentet uten adskillelse fra vektoren blir anvendt til å transformere S. cerevisiae H 449 som beskrevet (se eksempel 3). Uracil-uavhengige transformanter blir plukket ut, DNA fremstilt og Sacl/Xhol spaltet og sjekket for korrekt PRAI genbrudd med Southern blotting. En transformant med det korrekte skifte av Sacl/Xhol fragment-hybridisering med PRAI fra 1,9 kb til 3,1 kb blir betegnet Tr 1186. ;I det neste trinnet blir Tr 1186 - med brudd i dets PRAI gen ved pral::URA3 - igjen gjort uracil-avhengig ved å innføre en delusjon i pral::URA3 geninnsetningen. Tr 1186 blir transformert med 1 pg med plasmid YEpl3 (Broach, J.R. et al. ;(1979) Gene 8, 121) sammen med 10 pg av plasmid pUC12ura3-delta som inneholder en 20 bp delusjon i URA3 genet (Sengstag, C. et al. (1978) Nucleic Acids Research 15, 233). 3000 leucin-prototrofiske gjærtransformanter blir på nytt suspendert i 5 ml minimalmedium (Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer til hvilken 2% glukose, 0,1% leucin, 0,1% uracil og 0,25% fluoreddiksyre blir tilsatt) i en liten rysteflaske og inkubert i 60 timer ved 30 °C og 180 rpm. Transf ormanter som vokser er resistente til den toksiske analoge fluoreddik-syren og bærer derfor en erstatning i pral::URA3 regionen ved ura3delta. De dyrkede cellene blir sådd ut på en fullmedium sammensetning som består av (g/l): Pepton 20, gjærekstrakt 10, glukose 20 og etter dyrking i 48 timer ved 30°C replika-platet på minimalmedium (Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer, suplert med 2% glukose og 0,1% leucin) for å påvise uracil-auxotrofer. Flere auxotrofer blir plukket ut og testet for plasmid YEpl3 tap som innehar leucin auxotrofi. En individuell koloni - betegnet Tr 1195 - som krever leucin og uracil blir plukket og ut anvendt i videre undersøkelser. ;Eksempel 20 ;Brudd i PRC1 genet i Tr 1195 ;Deretter blir karboksypeptidase yscY aktivitet i Tr 1195 eliminert. PRC1 som koder for yscY (Rothman, J.H. et al. ;(1986) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 3248) blir isolert fra det gjærgenomiske biblioteket i centromer-vektoren pCS19 (Sengstag, C. et al. (1978) Nucleic Acids Research .15, 233) ved kolonihybridisering med 2 syntetiske oligonukleotider ;;som korresponderer til 5' og 3' ende av PRC1 kodende sekvens. Et positivt klon blir betegnet som pCS19/cpy8. pCS19/cpy8 DNA blir spaltet med Clal/PvuII, ladet på en 0,6% forberedende agarosegel og et 2,6 kb fragment blir isolert og elektroeluert. Dette Clal/PvuII fragment, som inneholder hele PRC1 genet, blir videre subklonet inn i Narl/Smal setene til pUC19. Det resulterende plasmid pUC19/PRCl blir kuttet ved det entydige Stul setet, inn i hvilket det 1,2 kb URA3 fragmentet (se eksempel 19) blir ligert. Av denne hensikt blir de klebrige Hindlll endene til URA 3 som inneholder ;fragmentet fylt i en reaksjon med Klenow DNA polymerase for å passe inn i det kortendede Stul-setet til pUC/PRCl. ;Det resulterende plasmid pUC19/prc::URA3 blir spaltet med Aatll og Aatll fragmentet uten adskillelse fra vektoren som blir anvendt for å transformere S. cerevisiae Tr 1195 som beskrevet. En uracil-uavhengig transformant - Tr 1206 - blir testet for korrekt PRC1 genbrudd ved Southern blotting og etterpå igjen gjort uracil-avhengig som beskrevet (se eksempel 19). Den resulterende S. cerevisiae stamme blir betegnet Tr 1210 (pral, prbl, prcl, ura3, leu2, eir"). ;Eksempel 21 ;Fremstilling av kexl variant av S. cerevisiae Tr 1210 ;Karboksypeptidase ysca aktivitet blir eliminert fra S. cerevisiae stammen Tr 1210 ved brudd i det genomiske KEX1 genet som beskrevet (se eksempel 14). Den resulterende S. cerevisiae stammen, som ikke viser noe protease-aktivitet av ysca er betegnet Tr 1302 (pral, prbl, prcl, ura3, leu2, eir", kexl). ;Eksempel 22 ;Konstruering av hirudinmutantene HV1-KR, HV1-SFRY, HV1-WQLR ;For å videre evaluere ysca-mediert C-terminaldegradering av heterologe proteiner med forskjellige C-terminal aminosyrer, blir hirudinmutanter skapt ulikt i deres C-terminal amino-syresammensetning. Som en generell metode, blir sete-rettet in vitro mutagenese anvendt, i prinsipp som beskrevet (Bio-Rad Muta-Gene M13 kit, Bio-Rad, Richmond, Ca. USA). ;De følgende mutantene er konstruert: ;1. HVI-KR, korresponderer til [Lys^<4->Arg^^]hirudin variant 1 2. HV1-SFRY, korresponderer til [Ser<62->Phe<63->Arg<64->Tyr65]HVl 3. HVl-wQLR, korresponderer til [Trp<62->Glu<63->Leu<6>4-Arg65]HVl. ;Aminosyre-sekvensene til alle hirudinmutantene korresponderer til hirudinvariant 1 opp til henholdsvis amonosyre 61 eller 63. ;I HV1-SFRY er C-terminalen identisk med atriell natriuretisk peptid (Vlasuk et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 4789-4796) og i HV1-WQLR korresponderer C-terminalen med epidermisk vekstfaktor (George-Nascimento, C. et al. (1988) Biochemistry 27, 797-802), og begge er kjent for å bli C-terminalt degradert ved protease-innholdende vill-type gjaerstammer. ;I et første trinn blir plasmid pJDB207/GAPFL-EIR (som angitt i Europeisk Patentsøknad nr. 225633) spaltet med Sall-Hindlll, og det gir et 1,2 kb fragment som inneholder full-lengde hirudin-ekspresjonskassetten. 1,2 kb Sall-Hindlll fragmentet blir subklonet inn i Sall-Hindlll kuttet Bluescript M13+ med SK polylinker. Det resulterende plasmid M13+/HV1 blir transferert inn i E. coli CJ 236 for å inkor-porere uracil som beskrevet (Bio-Rad Muta-Gen M13 settet, ovenfor). Enkelt-trådet DNA fra transferert E. coli CJ 236 blir isolert ved å anvende M13 hjelpefag (Stratagene ovenfor). ;For å konstruere HV1-KR blir den mutageniske primer 5 *-CCGGAAGAATACAAGAGGTAGGATCCT-3' anvendt.

For HV1-SFRY blir den mutageniske primer

5'-GAAGAAATCCCGGAATCTTTCAGATACTAGGATCCTGGTACG-3' anvendt. For HV1-WQLR blir den mutageniske primer

5'-GAAGAAATCCCGGAATGGGAACTGAGATAGGATCCTGGTACG-3' anvendt.

200 pmol av hver primer blir først fosforylert i et totalvolum på 30 pl som inneholder 3 pl 1 M Tris-HCl pH 8,0, 0,3 pl IM MgCl2, 0,75 pl 0,2 M DTT, 0,6 pl 20 mM ATP. 4,5 enheter T4 polynukleotid kinase blir tilsatt og blandingen inkubert ved 37°C i 45 min. og ved 65°C i 10 min.

De fosforylerte oligonukleotidene blir deretter kondensert til templat DNA under følgende betingelser: 0,1 pmol uracil som inneholder DNA avledet fra M13+/HV1 blir inkubert med 2 pmol fosforylert primer hver i et totalvolum på 10 pl kondenseringsbuffer (20 mM Tris-HCl ph 7,4, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl). Blandingene blir oppvarmet i vannbad til 80° C og får deretter anledning til å avkjøles langsomt til omgivelses-temperatur er oppnådd.

Komplementære tråder blir deretter dannet under følgende betingelser: 10 pl av hver av kondenseringsblandingene blir inkubert med 4 pl 2 mM dNTP'ene, 0,75 pl 20 mM ATP, 0,75 pl 0,5 M Tris-HCl pH 7,4, 0,75 pl 0,1 M MgCl2, 2,15 pl 0,2 M DTT, 1 enhet T4 DNA polymerase og 2 enheter T4 DNA ligase. Reaksjonsblandingene blir først inkubert på is i 5 min., deretter ved 25°C i 5 min. og til slutt ved 37°C i 90 min. De resulterende dobbel-trådede DNA'ene blir transformert inn i E. coli JM 101, en stamme som effektivt fjerner det uracil-inneholdende templatet, og lar den mutageniserte komplementære tråden replikere (Bio-Rad ovenfor). Plasmider blir fremstilt og sjekket for fravær av Pstl setet som bare bør være tilstede i de siste 2 kodon i ikke-mutagenisert vill-type HVI DNA.

Korrekt mutagenese blir videre bekreftet ved sekvensering av nye hirudin-mutanter ved å anvende følgende primer: 5'-GAAGGTACCCCGAAACCGCA-3' som korresponderer til den hirudin-kodende sekvensen ca. 20 bp oppstrøms av de mutageniske primere.

Til slutt blir de tre mutageniserte Sall-Hindlll fragmentene fjernet fra Bluescript M13+ og på nytt ligert inn i Sall-Hindlll setene på pJDB207.

De tre nye plasmidene er betegnet

1. pJDB207/GAPFL-HVl-KR

2. pJDB207/GAPFL-HVl-SFRY

3. pJDB207/GAPFL-HVl-WQLR

For alternativt å ha mulighet til å transformere eir" stammer slik som Tr 1302 (ovenfor, se eksempel 21) blir hirudinmutantene subklonet inn i den fulle 2 pm vektoren pDP34 (se eksempel 9, ovenfor). pDP34 blir kuttet ved det entydige BamHI setet og de klebrige endene fylt med Klenow DNA polymerase for å skape korte ender. Sall-Hindlll fragmentene fra Bluescript M13+ som koder for de muterte hirudin-sekvensene (ovenfor) blir også gjort kort-endede og ligert inn i det kort-endede (BamHI) setet til pDP34. De resulterende plasmidene er betegnet

1. pDP34/GAPFL-HVl-KR

2. pDP34/GAPFL-HV1-SFRY

3. pDP34/GAPFL-HV1-WQLR

Eksempel 23

Transformasjon av S. cerevisiae stammer BYSKEX1 og BYSkexl med pJDB207/GAPFL-HIR, pJDB207/GAPFL-HVl-KR, pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY og pJDB207/GAPFL-HVl-WQLR og av S. cerevisiae stammer Trl210 og Trl302 med pDP34/GAPFL-HVl-KR, pDP34/GAPFL-HV1-SFRY og pDP34/GAPFL-HV1-WQLR

pJDB207/GAPFL-HVl-KR, pJDB207/GAPFL-HVl-SFRY, pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR og pJDB207/GAPFL-HIR blir transformert inn i S^ cerevisae BYSKEX1 (=DSM 4583) og BYSkexl ved å anvende standard protokoll og leucin-seleksjon (se eksempel 3). På samme måte blir pDP34/GAPFL-HVl-KR, pDP34/GAPFL-HVl-SFRY og pDP34/GAPFL-HV1-WQLR transformert inn i S. cerevisiae stammene Trl210 og Trl302.

De resulterende stammene er betegnet

S. cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/GAPFL-HIR

S. cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/GAPFL-HVl-KR

S. cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/GAPFL-HVl-SFRY

S. cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/GAPFL-HVl-WQLR

S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPFL-HIR

S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPFL-HVl-KR

S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPFL-HVl-SFRY

S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPFL-HVl-WQLR

S. cerevisiae Trl210/pDP34/GAPFL-HVl-KR

S. cerevisiae Trl210/pDP34/GAPFL-HVl-SFRY

S. cerevisiae Trl210/pDP34/GAPFL-HVl-WQLR

S. cerevisiae Trl302/pDP34/GAPFL-HVl-KR

S. cerevisiae Trl302/pDP34/GAPFL-HVl-SFRY

S. cerevisiae Trl302/pDP34/GAPFL-HVl-WQLR

Fermentering av S. cerevisiae stammene blir utført i minimalmedium (for- og hovedkultur) som beskrevet (se eksempel 17).

Eksempel 24

Analyse av hirudinvariant HVI og dens mutanter fra fermenteringskulturer av Saccharomvces cerevisiae transformanter BYSkexl og BYSKEX1 ved å anvende omvendt fase HPLC

Etter 72 timers fermentering blir prøver fra flytende gjærkulturer fremstilt i sentrifugering for å fremstille en klar oppløsning som blir fortynnet 1:10 (v/v) med eddiksyre (IM) og utsatt for HPLC analyse under følgende betingelser.

En HIBAR (MERCK) kolonne (4 x 125 mm) blir fylt med revers-fase, sfærisk silisiumoksid-materiale (MACHEREY-NAGEL), en sfærisk stasjonær fase med en partikkeldiameter på 5 pm og en porositet på 100 A. Kolonne-endene er utstyrt med rustfrie stålfritter. Mobilfase A er laget av vann (Nanopure®, BARNSTEAD) som inneholder 0,1% (v/v) trifluoreddiksyre. Mobilfase B er laget av 20% mobilfase A og 80% (v/v) av acetonitril (HPLC-grad, FLUKA) som inneholder 0,075% (v/v) med trifluoreddiksyre.

Kromatografisk separering blir utført ved en strømnings-hastighet på 1,5 ml/min. ved å kjøre følgende gradient og eluatene blir målt ved absorbans ved 216 nm.

En standardoppløsning for kalibrering av systemet er laget ved å oppløse 1 mg av ren desulfatohirudin i 1 ml vann. 50 yil av denne standardoppløsningen blir injisert på kolonnen og kromatografert som beskrevet for å kalibrere systemet.

Fig. 8 viser resultatene som angir at S. cerevisiae BYSkexl fremstiller full-lengde hirudiner (enten hirudin HVI vill-type eller mutantene HV1-KR, HV1-SFRY, HV1-WQLR) med forskjellige retensjonstider i forhold til hirudin nedbrytnings-produkter fremstilt av S. cerevisiae BYSKEXl. Vill-type hirudin HV-1 viser den typiske blandingen av full-lengde HV-1 (retensjonstid 17,05 min.) og de to nedbrytningsproduktene "HIR-64" (retensjonstid 17,8 min.) og "HIR-63" (retensjonstid 15,33 min.) i BYSKEXl. BYSkexl fremstiller bare "HIR-65"

(retensjonstid 17,05 min.).

I det tilfelle der mutant HV1-KR BYSKEXl utelukkende fremstiller nedbrytningsproduktet med to C-terminale aminosyrer som mangler (= "HIR-63", retensjonstid 15,9 min.), mens BYSkexl fremstiller full-lengde HV1-KR (retensjonstid 14,4 min.).

I det tilfelle der mutant HVI-WQLR BYSKEXl viser degraderingsproduktet med en retensjonstid på 18,6 min. , fremstiller BYSkexl i hovedsak full-lengde HV1-WQLR (retensjonstid 17,3 min.) og bare spor av nedbrytningsproduktet. HV1-SFRY i full-lengde er funnet bare i spor-mengder (retensjonstid 17,1 min.) i BYSkexl viser bare intakt HV1-SFRY (retensjonstid 17,1 min.). Den store toppen (retensjonstid 15,7 min.) er ikke tilknyttet HV1-SFRY.

Analoge resultater er oppnådd når KEX1 S. cerevisiae stammene Trl210/pDP34/GAPFL-HVl-KR, Trl210/pDP34/GAPFL-HV1-SFRY og Trl210/pDP34/GAPFL-HVl-WQLR blir sammenlignet med korresponderende kexl stammer Trl302/pDP34/GAPFL-HVl-KR, Trl302/pDP34/GAPFL-HVl-SFRY og Trl302/pDP34/GAPFL-HVl-WQLR.

Deponering av mikroorganismer

De følgende mikroorganisme-stammene ble deponert Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg lb, D—3300 Braunschweig (deponeringsdatoer og aksesjonstall er): Saccharomvces cerevisiae H449: 18. februar 1988, DSM 4413; Escherichia coli JM109/pDP38: 19. februar 1988, DSM 4414; Escherichia coli JM109/pDP34: 14. mars 1988, DSM 4473. Saccharomvces cerevisiae BYS232-31-42: 6. mai 1988, DSM 4583.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein i homogen form som er heterologt til S. cerevisiae, karakterisert ved at den omfatter at man dyrker en S. cerevisiae stamme som mangler karboksypeptidase ysca-aktivitet og som i tillegg mangler peptidaseaktivitet valgt fra gruppen som består av yscA-, yscB-, YscY- og yscS-aktivitet og som har blitt transformert med en hybridvektor som omfatter en gjærpromoter opererbart bundet til en DNA-sekvens som koder for nevnte heterologe protein, og isolerer nevnte heterologe protein, forutsatt at proteinets C-terminale ende ikke består av -lys-Arg.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein som er heterologt til gjær ifølge krav 1, karakterisert ved at hybridvektoren består av en gjærpromoter opererbart bundet til en første DNA-sekvens som koder for et signalpeptid bundet i riktig leseramme til en annen DNA-sekvens som koder for nevnte heterologe protein og en DNA-sekvens som inneholder gjær-transkripsjons termineringssignaler.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det heterologe proteinet er påvirkelig av posttranslasjonell C-terminal nedbrytning av karboksypeptidase ysca.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et protein i homolog form som er heterologt til S. cerevisiae, karakterisert ved at de to C-terminale aminosyrene til det heterologe proteinet blir valgt fra gruppen som består av Tyr, Ala, Leu, Gin, Glu, Asp, Asn og Ser.

5 . Fremgangsmåte for fremstilling av et heterologt protein til gjær ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte heterologe protein er desulfatohirudin.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5 for fremstilling av en desulfatohirudin-forbindelse, karakterisert ved at man velger den fra gruppen som består av desulfatohirudin-variant EVI, HVI (modifisert a, b), EV2, EV2 (modifisert a, b, c), PA, varianter av PA og des(Val2)-desulfatohirudin.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det fremstilles desulfatohirudin-variant EVI.