DK175701B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider - Google Patents

Description

I DK 175701 B1

Opfindelsen vedrører rekombinant DNA teknologiområdet og angår en fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider ved hjælp af gærceller fremstillet ved rekombinant DNA 5 teknologi, disse gærceller samt fremgangsmåder til fremstilling af gærcellerne.

For nylig er et ret stort antal heterologe proteiner blevet udtrykt i gær efter transformation af gærceller med egnede ekstraktionsvektorer indeholdende DNA sekvenser, 10 som koder for proteinerne, f.eks. a-interferon [iFNa,

Hitzeman et al. (1981) Nature 294, 717-722 ], lysozym [ Oberto et al. (1985) Gene 40, 57-65 ], α-amylase [Sato et al. (1986) Gene 50, 247-257], vævstypepiasminogenaktivator [t-PA, europæisk patentansøgning nr. 143.081] eller 15 desulphatohirudin [europæisk patentansøgning nr. 225.633], I mange tilfælde syntetiseres de heterologe proteiner imidlertid ikke i ren form, men som en blanding, der indeholder delvis spaltede proteiner, f.eks. proteiner afkortet ved C-terminalen. Eksempelvis resulterer ekspres-20 sionen af human atrial natriuretisk peptid (hANP) i udskillelsen af to former af modent hANP med forskellige C-terminaler [ Vlasuk et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 4798-4796 ]. Den største part mangler de sidste to aminosyrer i proteinet (Arg 150 og Tyr 151), medens den mindre 25 part er fuldlængdemateriale. Lignende resultater er opnået efter ekspression af epidermal vækstfaktor (EGF) i gær [George-Naschimento et al. (1988) Biochemistry 27, 797-802 ], hvor de udskilte ekspressionsprodukter er heterogene i den forstand, at enten mangler den sidste 30 (Arg 53) eller de to sidste aminosyrer (Leu 52 og Arg 53), og der dannes ikke fuldlængde EGF.

Et polypeptid, som på det seneste har vakt molekylbio- j logers opmærksomhed, er hirudin, som er et antikoagule- j ringsmiddel, der forekommer naturligt i igler (Hirudo 35 medicinalis). Hirudin er ikke et enkelt polypeptid, men en klasse ensvirkende polypeptider, som består af mindst fire --:--—

I DK 175701 B1 I

I I

I repræsentanter, der betegnes hirudin variant 1 (HVl), I

I hirudin variant 2 (HV2) [jf. europæisk patentansøgning nr.

I 158.564], hirudin variant PA [jf. PCT-ansøgning nr. I

I 5 86/03493] og "des-(Val)2-hirudin" [jf. europæisk patent- I

I ansøgning nr. 158.986], Varianterne afviger indbyrdes i I

I struktur med hensyn til en række aminosyrer (nærmere I

I betegnet er N-terminalsekvensen i HVl Val-Val-Tyr, i HV2 I

I og i PA Ile-Thr-Tyr, og i "des-(Val)2-hirudin" Thr-Tyr), I

10 men fælles for dem er, at de har en akkumulering af I

I hydrofobe aminosyrer ved N-terminalen og af polære I

I aminosyrer ved C-terminaien, en tyrosinrest (Tyr^3)/ der I

foreligger som sulfatmonoester, tre disulfidbroer og I

I antikoaguleringsvirkning. I

I 15 For nylig er cDNA’er og syntetiske gener, som koder for I

H hirudin varianter, klonet og udtrykt i mikroorganismevær- I

ter. Selv om ekspressionsprodukteme mangler sulfatmono- I

estergruppen ved Tyr^3 ©g derfor betegnes "desulphato- I

hirudiner", viser de sig at have omtrentlig samme biolo- I

H 20 giske virkning som de naturlige sulfaterede hirudiner. I

Desulphatohirudinvariant HVl er blevet udtrykt i I

Escherichia coli [europæisk patentansøgning nr. 158.564 og I

H nr. 168.342] og i Saccharomyces cerevisiae [europæisk I

patentansøgning nr. 168.342, nr. 200.655, nr. 225.633 og I

25 nr. 252.854]. Ligeledes er desulphatohirudin HV2 udtrykt i I

Escherichia coli [europæisk patentansøgning nr. 158.564] I

og i Saccharomyces cerivisiae [ europæisk patentansøgning I

nr. 200.655, PCT-ansøgning nr. 86/01224], og des-(Val)2~ I

-desulphatohirudin er udtrykt i Escherichia coli [euro- I

30 pæisk patentansøgning nr. 158.986]. I

Generelt er ekspressionseffektiviteten og udbytter af I

hirudinforbindelser større, når S. cerevisiae vælges som I

værtsmikroorganismen. Uanset den anvendte specifikke I I

H gærværtsstamme, viser ekspressionsproduktet sig imidlertid I

35 at være en heterogen blanding af desulphatohirudiner,. som I

H er indbyrdes forskellige med hensyn til C-terminalsekven- I

I DK 175701 B1 sen. Dyrkningsvæsker fremkommet ved dyrkning af gærstammer indeholdende hirudin variant HV1 genet viser sig eksempelvis at indeholde desulphatohirudin HV1 kontamine-5 ret med betydelige mængder analoger, som mangler den C-terminale aminosyre Gln^S eller de C-terminale aminosyrer Leu^4 og Gln^S.

Adskillelsen af blandinger, som indeholder fuld længde proteiner, såsom desulphatohirudin, hANP eller EGF, samt 10 C-terminalt afkortede derivater deraf i de enkelte komponenter og rensning af disse komponenter til homogenitet er i I

en arbejdsom og tidsrøvende proces. X betragtning af de I

dermed forbundne omkostninger er der et behov for bedre I

fremgangsmåder, som gør det muligt på økonomisk måde at I

15 fremstille homogene proteiner som desulphatohirudin i gær. I

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at tilve- I

jebringe fremgangsmåder til fremstilling af homogene I

heterologe proteiner i gær. I

Selv om det er klart, at isoleringen af de C-terminalt I

20 afkortede derivater af heterologe proteiner fra dyrknings- I

væsker fra dyrkningen af transformerede gærceller, som I

indeholder den tilsvarende DNA sekvens, der koder for I

proteinerne, skyldes den post-translationale indvirkning I

af endogene gærproteaser på det primære ekspressions- I

25 produkt, f.eks. integral desulphatohirudin, er den eller I

de specifikke proteaser, som er ansvarlige for C-terminal-’ I

nedbrydningen, endnu ikke blevet identificerede. De I

vigtigste gærproteaser, som medvirker ved proteinnedbryd- I

ning i almindelighed, er endopeptidaser yscA og yscB og I

30 carboxyeksopeptidaser yscY og yscS. Anvendelsen af gær- I

stammer, som mangler protease A, B, Y og/eller S aktivi- I

tet, kan delvis nedsætte tilfældig proteolyse af fremmede I

genprodukter, såsom desulphatohirudin. Imidlertid kon- I

stateres stadig væsentlige mængder proteiner, som mangler I

35 en eller to aminosyrer ved C-terminaien. I

H

I DK 175701 B1 I

I 4 I

I Det har overraskende vist sig, at gærmutantstammer, som I

I mangler carboxypeptidase ysca aktivitet, ikke er i stand I

I til at fjerne aminosyrer fra C-terminalen i heterologe I

I ! 5 proteiner og derfor frembringer integrale (autentiske) I

proteiner. Carboxypeptidase ysca er en membranbundet I

B eksopeptidase og spiller som bekendt en vigtig rolle ved I

I modningen af "killer factor" og "mating factor a" [jf. J.C I

B Wagner og D.H. Wolf (1987) FEBS Letters 221, 423]. Den er I

B 10 ekspressionproduktet af KEXl-genet. Ifølge de offentlig- I

I gjorte data [P.S. Rendueles og D.H. Wolf (1988) FEMS I

I Microbiol. Rev. 54, 17] er virkningen af ysc a stærkt I

B begrænset til C-terminale basiske aminosyrerester (Arg, I

B Lys). På baggrund af disse data og den kendsgerning, at de I

B 15 C-terminale aminosyrer i desulphatohirudin ikke er basi- I

B ske, f.eks. Gin og Leu i desulphatohirudinvariant HV1, er I

B det yderst overraskende Og et uventet resultat, at anven- I

B delsen af gærmutantstammer, som mangler carboxypeptidase I

B : ysca-aktivitét gør det muligt at fremstille homogent de- I

B 20 sulphatohirudin, uden at der er behov for nogen møjsom- I

B melig adskillelse af C-terminalt afkortede desulphato- I

hirudinanaloger. I

Det samme gælder også for andre heterologe proteiner som I

f.eks. hANP, EGF eller "connective tissue activating I

I 25 peptide-III" [CTAP-III, Mullenbach et al. (1986) J. Biol. I

H Chem. 261, 719-722 ] der kan fremstilles i deres fulde I

længde form, når en gærmutantstamme, som mangler carboxy- I

peptidase ysca aktivitet, anvendes til transformation med I

H en egnet vektor. I

30 I overensstemmelse hermed angår opfindelsen en fremgangs- I

måde til fremstilling af et protein heterologt til gær i I

en homogen form, ved hvilken fremgangsmåde man dyrker en I

H gærstamme, som mangler carboxypeptidase ycsa aktivitet, og I

som er transformeret med en hybridvektor omfattende en I

H 35 gærprorootor operabelt bundet til en DNA sekvens, der ko- I

H der for det heterologe protein, og isolerer det hetero- I

5 DK 175701 B1 loge protein.

Opfindelsen angår især en fremgangsmåde til fremstilling af et protein heterologt til gær i en homogen form, ved 5 hvilken gærstammen, som er transformeret med en hybridvektor, der indeholder en gærpromotor operabelt bundet til en første DNA sekvens, som koder for et signalpeptid, bundet i rigtig aflæsningsstruktur til en anden DNA sekvens, som koder for det heterologe protein, og en DNA 10 sekvens, der indeholder gærtranscriptionsstopsignaler, og isolerer det heterologe protein.

Heterologe proteiner, som kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er sådanne proteiner, som er følsomme for posttranslational C-terminal nedbrydning med 15 carboxypeptidase ysca efter ekspression i gær. Sådanne heterologe proteiner er karakteriseret ved to C-terminale aminosyrer valgt blandt Lys, Arg, Tyr, Ala, Leu, Gin,

Glu, Asp, Asn og Ser. De foretrukne heterologe proteiner er de proteiner, som er omtalt ovenfor, især desulphato-20 hirudin.

Et særligt foretrukket aspekt af opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af desulphathirudin, ved hvilken man dyrker en gær stamme, som mangler carboxypeptidase ysca aktivitet, og som er transformeret med en 25 hybridvektor, der indeholder en desulphatohirudineks-pressionskassette bestående af en gærpromotor operabelt bundet til en første DNA sekvens, som koder for et signalpeptid, bundet i rigtig aflæsningsstruktur til en anden DNA sekvens, der koder for desulphatohirudin, og en 30 DNA sekvens, som indeholder gærtranscriptionsstopsignaler, og isolerer desulphatohirudin.

Udtrykket "desulphatohirudin" omfatter de desulphatohiru-dinforbindelser, som er beskrevet i litteraturen, eller som kan fremstilles ved hjælp af en transformeret mikroor-

I DK 175701 B1 I

I

ganismestamme, der indeholder DNA, som koder for et de- I

I sulphatohirudin. Som eksempler på sådanne desulphatohi- I

I rudiner kan nævnes desulphatohirudin variant HV1, HV1 I

I 5 (modificeret a, b), HV2, HV2 (modificeret a, b, c), PA, I

I varianter af PA og des(Val2J-desulphatohirudin. I

Foretrukne desulphatohirudiner har formlen I

H Xj Tyr The Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys I

Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn Xz Cys I

H Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Xj Asn Gin Cys Val Thr Gly I

Glu Gly Thr Pro Xt. Pro Gin Ser Xs Asn Asp Gly Asp Phe I

Glu Glu Ile Pro Glu Xs I

I I

hvori I

10 a) Xj betyder dipeptidresten Val-Val og X2, X3 og X4 hver . I

for sig er Lys, X5 er His, og Xg er peptidresten I

Glu-Tyr-Leu-Gln (HV1), eller I

b) X2 er Ile eller Glu, og Χχ og X3-X5 har de ovenfor I

under a) angivne betydninger (HV1 modificeret a), eller I

H 15 c) X3 er Ile eller Glu, og Χχ, X2 og X4-X6 har den ovenfor I

under a) angivne betydninger (HV1 modificeret a), eller I

d) X4 er Ile eller Glu, og X1-X3 og X5 og Xg har de I

H ovenfor under a) angivne betydninger (HV1 modificeret a), I

H eller I

20 e) X5 er Leu eller Asp, og X1-X4 og Xg har de ovenfor I

under a) angivne betydninger (HV1 modificeret a) eller I

f) Xg er valgt blandt Glu-Tyr, Glu-Tyr-Leu, Glu-Asp-Leu- I

H -Gin, Glu-Glu-Leu-Gln, Glu-Tyr-Lys-Arg, Glu-Asp-Lys-Arg, I

H Glu-.Lys-Leu-Gln, Sér-Phe-Arg-Tyr, Trp-Glu-Leu-Arg, Glu- I

H 25 -Tyr-Leu-Gln-Pro og Glu-Tyr-Leu-Gln-Arg, og X1-X5 har de I

ovenfor under a) angivne betydninger (HV1 modificeret b), I

eller I

H g) hvori Xj betyder Thr, og X2-X6 har ovenfor under a) I

angivne betydninger (des(Val2)-desulphatohirudin), I

7 DK 175701 B1 eller formlen

Yi Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys

Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys

Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Val Thr Gly

Glu Gly Thr Pro Y2 Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe

Glu Glu Ile Pro Glu Glu Yj Leu Gin (II) hvori 5 a) Y]_ betyder den N-terminale dipeptidrest Ile-Thr, Y2 er Asn, og Y3 er Tyr (HV2), eller b) Y2 er Lys, Arg eller His, og Yi og Y3 har de ovenfor under a) angivne betydninger (HV2 modificeret a), eller c) Y3 er Glu eller Asp, og Υχ og Y2 har de ovenfor under 10 a) angivne betydninger (HV2 modificeret b), eller d) hvori Y betyder den N-terminale dipeptidrest Val-Val, og Y2 og Y3 har de ovenfor under a) angivne betydninger (HV2 modificeret c), eller formlen

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys

Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys

Ile Leu Gly Ser Gin Gly Lys Asp Asn Gin Cys Val Thr Gly

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Gin Gly Asp Phe

Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu 15 (III) (PA) og varianter af PA, som er karakteriseret ved en afkortning af primærstrukturen med 1 eller 2 aminosyrer ved N-terminalen eller 18, 10, 9, 6, 4 eller 2 aminosyrer ved C-terminalen.

20 Den mest foretrukne desulphatohirudinforbindelse er forbindelsen med formlen I, hvori Xj-Xg har de ovenfor ; i ^____

I DK 175701 B1 I

I I

I under a) angivne betydninger. I

I Gærværtsstanunerne og bestanddelene i hybridvektorerne er I

I beskrevet i det følgende. I

5 De transformerede gærstanuner dyrkes under anvendelse af I

I kendte fremgangsmåder. I

I De transformerede gærstammer ifølge opfindelsen dyrkes

således i et flydende medium indeholdende assimilerbare I

I carbonkilder, nitrogenkilder og uorganiske salte. H

I 10 Forskellige carbonkilder kan anvendes. Som eksempler på I

foretrukne carbonkilder kan nævnes assimilerbare I

kulhydrater, såsom glucose, maltose, mannitol, fructose I

eller lactose, eller et acetat, såsom natriumacetat, der I

kan anvendes enten alene eller i egnede blandinger. Egnede I

15 nitrogenkilder er f.eks. aminosyrer, såsom casaminosyrer,

I ! peptider og proteiner samt deres nedbrydningsprodukter, I

I såsom trypton, pepton eller kødekstrakter, endvidere I

gærekstrakt, maltekstrakt, majsstøbevand samt ammonium- I

salte, såsom ammoniumchlorid, ammoniumsulfat eller I

20 ammoniumnitrat, som kan anvendes enkeltvis eller i egnede I

blandinger. Uorganiske anvendelige salte omfatter f.eks. I

sulfater, chiprider, phosphater og carbonater af natrium, I

kalium, magnesium og calcium. Endvidere kan dyrknings- I

mediet også indeholde vækstfremmende stoffer. Som eksemp- I

25 ler på vækstfremmende stoffer kan nævnes sporstoffer, I

såsom jern, zink, mangan og lignende, eller enkelte I

aminosyrer. I

På grund af uforligeligheden mellem det endogene 2-mikron

DNA og hybridvektorer, som bærer dets replikon, har I

30 gærceller transformeret med sådanne hybridvektorer tendens

til at miste sidstnævnte. Sådanne gærceller skal dyrkes I

under selektive betingelser, dvs. betingelser, som kræver I

ekspression af et plasmidindkodet gen for vækst. De fleste I

I DK 175701 B1 i selektive markører, der anvendes for tiden, og som findes i hybridvektorerne ifølge opfindelsen (se nedenfor) er gener, der koder for enzymer i aminosyrebiosyntesen eller 5 purinbiosyntesen. Dette gør det nødvendigt at anvende syntetiske miriimalmedier, som mangler den tilsvarende aminosyre eller purinbase. Gener, som bibringer resistens mod et passende biocid, kan imidlertid også anvendes, f.eks. et gen, der bibringer reisistens mod aminoglycosidet 10 G418. Gærceller transformeret med vektorer, som indeholder antibiotikaresistensgener, dyrkes i komplekse medier, dér indeholder det tilsvarende antibiotikum, hvorved der opnås hurtige vækstrater og større celletaetheder.

Hybridvektorer indeholdende det komplette 2-mikron DNA I

15 (omfattende et funktionelt startpunkt for replikation), I

opretholdes stabilt i Saccharomyces cerivisiae stammer, I

som mangler endogene 2-mikron plasmider (såkaldte cire I

stammer), således at dyrkningen kan gennemføres under I

ikke-selektive vækstbetingelser, dvs, i et komplekst I

20 medium. I

Gærceller, som indeholder hybridpiasmider med en konsti- I

tutiv promotor, f.eks. ADHI, GAPDH udtrykket DNA'et, som I

koder for et heterologt protein kontrolleret af promotoren I

uden induktion. Hvis DNA'et imidlertid er under kontrol af I

25 en reguleret promotor, f.eks. PGK eller PH05, skal dyrk- ' I

ningsmediets sammensætning tilpasses med henblik på op- ' I

nåelse af maksimale mængder af mRNA transcripter, dvs., at I

når man anvender PH05 promotoren, skal vækstmediet inde- I

holde uorganisk phosphat i lav koncentration for at ophæ- I

30 ve hæmningen af denne promotor. I

m I

Dyrkningen gennemføres under anvendelse af konventionel teknik. Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, mediets pH-værdi og fermenteringstiden, vælges på en sådan måde, at der opnås maksimale koncentrationer af det producerede 35 heterologe protein. En valgt gærstamme dyrkes fortrinsvis

I DK 175701 B1 I

I I

I under aerobe betingelser i submers kultur med rystning I

I eller omrøring ved temperaturer fra ca. 25 til ca. 35°C, I

I fortrinsvis ved ca. 28°C, ved en pH-værdi på 4-7, f.eks. I

I 5 ved ca. pH 5, og i mindst 1-3 dage, fortrinsvis så længe I

der opnås tilfredsstillende proteinudbytter. I

De heterologe proteiner udtrykt i gær kan akkumuleres I

I inden i cellerne, eller de kan udskilles til dyrknings- I

mediet. Uanset den anvendte gærstamme, promotor og I

10 signalpeptid udskilles størsteparten af det producerede I

protein i tilfælde af desulphatohirudin til dyrknings- I

mediet, medens kun en mindre del forbliver bundet i I

cellerne. Det nøjagtige forhold (udskilte forbindel- I

H ser/cellebundne forbindelser) afhænger af fermente- I

15 ringsbetingelserne og den anvendte udvindingsproces. I

Almindeligvis er forholdet ca. 8:1 eller større. Udskilt I

desulphatohirudin er derfor altid stærkt dominerende. I

Det heterologe protein kan isoleres fra dyrkningsmediet I

ved anvendelse af konventionelle fremgangsmåder. Eksem- I

20 pelvis består det første trin sædvanligvis i isolering af I

H cellerne fra dyrkningsvæsken ved centrifugering. Den dan- I

nede supernatant kan opkoncentreres med hensyn til hetero- I

logt protein ved behandling med polyethylenimin til fjer- I

nelse af størsteparten af ikke-proteinholdigt materiale og I

25 fældning af proteinerne ved mætning af opløsning med ammo- I

niumsulfat. Værtsproteiner kan, hvis disse forekommer, I

også fældes ved syrning med eddikesyre (f.eks. 0,1%, pH I

4-5). Yderligere opkoncentrering af det heterologe protein I

H kan opnås ved ekstraktion af eddikesyresupernatanten med I

H 30 n-butanol. Andre rensningstrin indbefatter eksempelvis I

H afsaltning, chromatografiske fremgangsmåder, såsom ion- I

H bytterchromatografi, gelfiltreringschromatografi, forde- I

lingschromatografi, HPLC, omvendt fase HPLC og lignende. I

H Adskillelsen af bestanddelene i proteinblandingen gennem- I

H 35 føres også ved dialyse, efter ladning ved hjælp af gel- I

elektroforese eller bærerfri elektroforese, efter molekyl- I

DK 175701 B1 il størrelse ved hjælp af en egnet "Sephadex"® søjle, ved affinitetschromatograf1, f.eks. med antistoffer, især monoklonale antistoffer, eller med thrombin koblet til en 5 egnet bærer til affinitetschromatografi, eller ved anvendelse af andre fremgangsmåder, især fremgangsmåder, som er kendt fra litteraturen.

Hvis det heterologe' protein ikke udskilles, eller hvis man ønsker at isolere et yderligere heterologt protein, som er 10 cellebundet, dvs. som er akkumuleret intracellulært eller i det periplasmatiske rum, kræves der nogle supple- rende , rensningstrin. Hvis det heterologe protein er akkumuleret inden i cellerne, består det første trin til udvinding deraf således i frigøring af det heterologe protein fra 15 cellens indre. Ved de fleste metoder fjernes cellevæggen først ved enzymatisk nedbrydning med glyco- sidaser (se nedenfor). Derefter behandles de dannede sphæroplaster med detergenter, såsom "Triton". Alternativt er mekaniske kræfter, som forskydningskræfter, f.eks. X-presse, fransk 20 presse, eller rystning med glasperler, egnede til i oplukning af cellerne. I tilfælde hvor det heterologe protein er udskilt af værtscellerne til det periplasmatiske rum, kan der anvendes en simplificeret fremgangsmåde. Det heterologe protein udvindes uden cel-25 lelysering ved hjælp af enzymatisk fjernelse af celle væggen eller ved behand- ling med kemiske midler, f.eks. thiolreagenser eller EDTA, som fremkalder beskadigelse af cellevæggen, hvilket tillader frigørelse af produktet.

I tilfælde af desulphatohirudin kan testen med anti-hi-30 rudin- eller anti-desulphatohirudin-antistoffer (f.eks. monoklonale antistoffer udvundet fra hybridomaceller), thrombintesten [M.U. Bergmeyer (red.), Methods in Enzymatic Analysis, vol. II, side 314-316, Verlag Chemie, Weinheim (DE) 1983] eller blodkoagulationstesten [F. Mark-35 wardt et al. (1982) Thromb. Haemost. 47, 226] anvendes til påvisning af hirudinaktivitet i fraktioner opnået i løbet

I DK 175701 B1 I

I 12 I

I af rensningsprocessen. Analoge analyser kendt fra I

litteraturen kan anvendes til påvisning af andre "hetero- I

I loge proteiner. I

I 5 De transformerede gærværtsceller ifølge opfindelsen kan I

I fremstilles ved rekombinant DNA teknik, ved hvilken H

I - man fremstiller en hybridvektor indeholdende en gær-

I promotor operabelt bundet til en DNA sekvens, som ko- H

der for et heterologt protein, især en hybridvektor

I . 10 indeholdende en gærpromotor operabelt bundet til en I

første DNA sekvens, som koder for et signalpeptid,

bundet i den rigtige aflæsningsstruktur til en anden I

I DNA sekvens, som koder for et heterologt protein, og I

I en DNA sekvens, der indeholder gærtranscriptions- I

I 15 stopsignaler, I

I - om nødvendigt, tilvejebringer en gærmutantstamme, som H

mangler carboxypeptidase ysca aktivitet, I

I - transformerer mutant gærstammen opnået med hybridvek- I

toren og I

I 20 - selekterer transformerede gærceller fra ikke-trans- I

I formerede gærceller. I

Ekspressionsvektorer I

H I

Gærhybridvektorerne ifølge opfindelsen omfatter en gærpro- I

motor operabelt bundet til en DNA sekvens, som koder for I

25 et heterologt protein. Foretrukne hybridvektorer inde- I

holder en gærpromotor operabelt bundet til en første DNA I

sekvens, som koder for et signalpeptid, bundet i den I

rigtige aflæsningsstruktur til en anden DNA sekvens, som I

koder for et heterologt protein, såsom desulphatohirudin, I

30 og en DNA sekvens, som indeholder gærtranscriptionsstop- I

signaler. I

Gærpromotoren er en reguleret promotor, såsom PH05-, MGal- I

H eller GAL1-promotoren eller en konstitutiv promotor. I I

tilfælde af ekspression af desulphatohirudin foretrækkes I

13 DK 175701 B1 en konstitutlv promotor. Den konstitutive gærpromotor er fortrinsvis afledt af et stærkt udtrykt gærgen, s'åsom et gen, der koder for et glycolytisk enzym, f.eks. promotoren 5 til enolase-, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH)-, 3-phosphoglycerat-kinase (PGK)-, hexokinase, pyruvat-decarboxylase-, phosphofructokinase-, glucose- 6-phosphat-isomerase-, 3-phosphoglycerat-mutase-, pyruvat-kinase-, triosephosphat-isomerase-, phospho-10 glucose-isomerase- og glucokinase-genet, endvidere ADHI-eller TRPI-promotoren og en afkortet sur phosphatase PH05-promotor, som mangler de foranstående aktiveringssteder. Især foretrækkes GAPDH-promotoren og funktionelle fragmenter deraf startende ved nucleotid mellem -550 og 15 -180, især ved nucleotid -540, -263 eller -198, og slut tende ved nucleotid -5 i GAPDK-genet, og afkortede konstitutive PH05-promotorer, som starter ved nucleotid mellem -200 og -150, især ved -173, og som slutter ved nucleotid -9 i PH05-genet· 20 DNA sekvensen, som koder for et signalpeptid ("signalsekvens" ) er fortrinsvis afledt af et gærgen, som koder for et polypeptid, som sædvanligvis udskilles. Hirudin-signalsekvensen, som kan fås fra iglegenom DNA, eller andre signalsekvenser for heterologe proteiner, der al-25 mindeligvis udskilles, kan også anvendes. Gærsignalsekven-ser er f.eks. signal- og præpro-sekvenserne til gærinver-tase-, a-faktor-, færomon-peptidase (KEXl)-, "killer toxin"- og represserbar sur phosphatase (PH05)-generne, og glucoamylasesignalsekvensen fra Aspergillus awamori.

30 Alternativt kan fusionerede signalsekvenser konstrueres ved at ligere en del af signal sekvensen (hvis den findes) af genet, der naturligt er bundet til den anvendte promotor (f.eks. PH05), med en del af signal sekvensen for hirudin eller for et andet heterologt protein. Man fore-35 trækker de kombinationer, som tillader en præcis spaltning mellem signalsekvensen og f.eks. desulphatohirudin-aminosyresekvensen. Andre sekvenser, såsom pro- eller

I DK 175701 B1 I

I 14 I

I spacer-sekvenser, som eventuelt bærer specifikke pro- I

I cessingsignaler, kan også indgå i konstruktionerne for at I

I lette nøjagtig processing af precursormolekyler. Alter- I

I 5 nativt kan der dannes fusionerede proteiner indeholdende I

interprocessingsignaler, der tillader rigtig modning in I

I vivo eller in vitro. Eksempelvis indeholder processing- I

I signalerne en Lys-Arg-rest, som genkendes af en gærendo- I

I peptidase, der findes i Golgi-membranerne. De foretrukne I

I 10 signalsekvenser ifølge den foreliggende opfindelse er I

I signalsekvenserne for gær PH05-genet, der koder for et I

I signalpeptid med formlen I

I Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu I

Ala Asn Ala, I

15 og for gærinvertasegenet, som koder for et signalpeptid I

I med formlen I

I Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala I

I Ala Lys ile Ser Ala. I

I Genomiske DNA sekvenser, som koder for et heterologt I

I 20 protein, kan isoleres fra naturlige kilder, eller der kan I

I fremstilles et kopi DNA (cDNA) ud fra det tilsvarende I

komplementære mRNA eller ved hjælp af kemiske eller enzy- I

matiske fremgangsmåder på i og for sig kendt måde. I

I Eksempelvis er DNA sekvensen, som koder for desulphato- I

I 25 hirudin, kendt eller kan isoleres fra genomisk igle DNA, I

I eller et komplementært dobbeltstrenget desulphatohirudin I

I DNA (desulphatohirudin ds cDNA) fremstilles ud fra desul- I

I phatohirudin mRNA, eller et gen, som koder for aminosyre- I

I sekvensen i desulphatohirudin, fremstilles ved hjælp af I

30 kemiske eller enzymatiske fremgangsmåder. I

En DNA sekvens, som indeholder gærtranscriptionsstop- I

signaler, er fortrinsvis 3'-flankeringssekvensen af et I

15 DK 175701 B1 gærgen, som indeholder rigtige signaler for transcrip-tionsstop og polyadenylering. Egnede 3'-flanfcerings-sekvenser er f.eks. flankeringssekvenserne i gærgenet 5 naturligt bundet til den anvendte promotor. Den foretrukne .flankeringssekvens er flankeringssekvensen i gær PH05--genet.

Gærpromotoren, den eventuelle DNA sekvens, som koder for signalpeptidet, DNA sekvensen, der koder for et heterologt 10 protein, og DNA sekvensen, som indeholder gærtrånscrip-tionsstopsignaler, er operabelt bundet til hinanden, dvs. at de er sat sammen på en sådan måde, at deres normale funktioner er bevaret. Rækkefølgen er sådan, at promotoren bevirker rigtig ekspression af det heterologe gen (even-15 tuelt med en foranstående signalsekvens), transcriptions-stopsignalerne bevirker rigtig afslutning af transcription og polyadenylering, og den eventuelle signalsekvens er bundet i rigtig aflæsningsstruktur til det heterologe gen på en sådan måde, at det sidste kodon i signalsekven-20 sen er direkte bundet til det første kodon i genet, som koder for det heterologe protein, og der sker udskillelse af proteiner. Hvis promotoren og signalsekvensen er afledt af forskellige gener, er promotoren fortrinsvis bundet til signalsekvensen mellem hoved mRNA starten og 25 ATG’en for genet, som er naturligt bundet til promotoren. Signalsekvensen bør have sin egen ATG til translationsinitiering. Forbindelsen af disse sekvenser kan gennemføres ved hjælp af syntetiske oligodeoxynucleotidlinkere, som bærer genkendelsessekvensen for en endonuclease.

30 Bortset fra ekspressionskassetten omfatter hybridvektorerne ifølge opfindelsen et gærreplikationsstartpunkt. Hybridvektorer indeholder således et DNA sekvens, som stammer fra 2-mikron DNA indeholdende replikationsstart-punktet eller, hvis man anvender gærstammer, som ikke 35 indeholder et 2-mikron DNA, total 2-mikron DNA. Sidstnævnte type" vektorer foretrækkes. De foretrukne hybridvektorer

I DK 175701 B1 I

I I

I ifølge opfindelsen indeholder det komplette 2-mikron DNA i I

I en ikke-afbrudt form, dvs. 2-mikron DNA spaltes en gang I

med en restriktionsendonuclease, det lineariserede DNA I

I 5 bindes til de andre bestanddele i vektoren inden recirku- I

I lariseringen. Restriktionsstedet vælges således, at den I

normale funktion af REP1-, REP2- og FLP-genérne og af I

I ORI-, STB-, IR1- og IR2-stederne i 2-mikron DNA bevares. I

Eventuelt vælges restriktionsstedet således, at D-genet i I

10 2-mikron DNA også bevares intakt. Foretrukne restriktions- I

steder er det entydige PstI sted anbragt i D-genet og de I

I . entydige Hpal- og SnaBI-steder anbragt uden for alle disse I

I gener og steder. I

I Fortrinsvis indeholder hybridvektorerne ifølge opfindelsen I

I 15 en eller flere, især en eller to, selektive genetiske I

I markører for gær og en sådan markør og et replikations- I

I startpunkt for en bakterievært, især Escherichia coli. I

Med hensyn til de selektive genmarkører for gær kan der I

I anvendes et vilkårligt markørgen, som letter selektionen I

I 20 for transformanter på grund af den phænotypiske ekspres- I

I sion af markørgenet. Egnede markører for gær er f.eks. I

sådanne, som udtrykker antibiotikumresistens eller, i I

tilfælde af auxotrofe gærmutanter, gener, som kompletterer I

værtslæsioner. Tilsvarende gener tilvejebringer eksempel- I

I 25 vis resistens mod antibiotikaene G418, hygromycin eller I

I bleomycin, eller tilvejebringer prototrofi i en auxotrof I

I gærmutant, f.eks. URA3-, LEU2-, LYS2- eller TRPl-genet. I

I Da forstærkningen af hybridvektorerne hensigtsmæssigt I

I gennemføres i E. coli, indbefattes med fordel en E. coli I

30 genmarkør og et E. coli replikationsstartpunkt. Disse kan I

I fås fra E. coli plasmider, såsom pBR322, eller et pUC I

I plasmid, f.eks. pUC18 eller pUCl9, som indeholder både E. I

I coli replikationsstartpunkt og E. coli genmarkør, der I

I tilvejebringer antibiotikumresistens, f.eks. mod ampicil- I

I 35 lin. I

.17 DK 175701 B1

Hybridvektorerne ifølge opfindelsen fremstilles ved anvendelse af kendte fremgangsmåder, f.eks. ved at sammenbxn-| de ekspressionskassetten indeholdende en gærpromotor ope- 5 rabelt bundet til en DNA sekvens, der koder for et heterologt protein, og DNA fragmenter, som indeholder selektive genetiske markører for gær og for en bakterievært og re-plikationsstartpunkter for gær og for en bakterievært i den forud bestemte orden.

10 Gærstammer, som mangler carboxypeptidase ysc« aktivitet Gærstammerne ifølge opfindelsen mangler carboxypeptidase ysca ativitet. Gærstammerne er fortrinsvis dobbelte, tredobbelte eller firedobbelte mutanter, dvs. de mangler andre gærpeptidaseaktiviteter.

15 Mange forskellige proteaser som de ovenfor omtalte er karakteriseret i gæren Saccharomyces cerevisiae [se T.

Achstetter og D.H. Wolf (1985) Yeast JL, 139-157 ].

Muntanter, som mangler aktivitet for størsteparten af disse proteaser, er blevet isoleret og undersøgt bioke-20 misk. Konsekvenserne af fravær af visse proteaser er belyst, og nogle egenskaber har vist sig at være nyttige for de novo isoleringen af mutanter, som mangler proteaser. Da spontanmutationsfrekvenser er lave, underkastes gær sædvanligvis mutagenbehandling, f.eks. med røntgen-25 stråler eller ultraviolet bestråling eller ved behandling med kemiske mutagener, som er bemærkelsesværdigt effektive og kan fremkalde mutationer med en rate på 1*10“^ til 10-3 pr. gen uden stor grad af udryddelse. Protea-serne, som mangler i gærstammerne ifølge opfindelsen, 30 udøver ikke uundværlige funktioner i cellemetabolismen.

Derfor er mutationer, som ødelægger aktiviteten af disse proteiner fuldstændigt, ikke dødelige. Hver mutanttype af de omtalte proteaser (ysca, yscB, yscA, yscY og yscS) kan isoleres separat efter mutagenese. Isolering og selekte-35 ring er baseret på velkendte koloniscreeningsanalyser. I

I DK 175701 B1 I

I 18 I

En anden og mere effektiv metode til indføring af den I

ønskede enkelte eller flerdobbelte proteasemangel i I

gærgenomet er den stedrettede mutagenese eller genafbry- I

5 delse eller genombytning [jf· H. Rudolph et al., Gene, 36, I

I (1985) 87-95]." Når gensekvensen er kendt, som det I

I eksempelvis er tilfældet i protease yscB, carboxypeptidase I

yscY og carboxypeptidase ysca, kan det genomiske protease- I

gen gøres defekt ved indsætning, substitution eller slet- I

10 ning under anvendelse af den velkendte stedrettede mutage- I

nesefremgangsmåde [se f.eks. M.J. Zoller og M. Smith I

I (1983) Methods Enzymol. 100, 468] som omfatter fremstil- I

lingen af en hensigtsmæssigt udformet mutagen oligodeoxy- I

H nucleotidprimer. Alternativt kan gen genomiske protease I

I 15 erstattes med fremmed DNA, eller fremmed DNA'et kan I

I indsættes i et egnet restriktionssted i proteasegenet. Til I

fremstilling af en gærmutant, som eksempelvis mangler I

peptidase ysca aktivitet (kex"-mutant), indsættes fremmed I

DNA i et egnet restriktionssted, som forekommer i det I

I 20 genomiske KEXl-gen. Hvis den anvendte gærstamme har en I

I defekt i et chromosomalgen, som koder for et enzym i I

aminosyre- eller purinbiosyntesen, kan et tilsvarende I

intakt gen indsættes i det chromosomale KEXl-gen, hvorved I

I der tilvejebringes prototrofi i den auxotrofe gærstamme, I

I 25 og samtidig ændres genotypen fra KEX1 til kexl. Genombyt- I

I ningsmetoderne eller den direkte mutagenese er alminde- I

I ligt anvendt og er absolut reproducerbar. I

I Den gængse metode til dannelse af stammer med flere I

I proteasedefekter, såsom stammer, der mangler ysca og yscB I

30 aktivitet, består i meiotisk krydsning og efterfølgende I

I tetrade analyse. Tetraderne, som stammer fra de diploide I

I celler, dissekeres i overensstemmelse med standardgen- I

teknik. Tilfældig sortering blandt de fire sporer fra en I

I tetrade tillader konstruktionen af dobbeltmutanter og I

I 35 multiple mutanter i efterfølgende krydsninger. Tilfældig I

I sporeanalyse kan også anvendes som et alternativt sy- I

I stem. I

19 DK 175701 B1

Da mutanter, der mangler enkelte proteaser, og endog dobbeltmutanter kan fås fra gærgenstamcentre, kan tredobbelte og firedobbelte mutanter kombineres på 5 reproducerbar måde ved kendt successiv meiotisk krydsningsteknik.

Egnede starterstammer af Saccharomyces cerivisiae indbefatter f.eks. kexl stamme 96, som fås fra Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, gærpeptidaser A (yscA) 10 negative stammer AB103 (ATCC20673) og AB110 (ATCC20796), gærpeptidase B (yscB) negative stammer HT246, H426 og H449 (sidstnævnte er desuden cire) deponeret ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, DE, under deponeringsnumrene henholdsvis 4084, 4231 og 4413, 15 gærpeptidaser B, Y og S (yscB, yscY og yscS) negativ stamme BYS232-31-42 og gærpeptidaser A, B, Y og S (yscA, yscB, yscY og yscS) negativ stamme ABYS.

/

Som anført ovenfor mangler de foretrukne gærstammer ifølge opfindelsen endogent 2-mikron DNA. 2-Mikron plasmidet er 20 et selvkopierende, ekstrachromosomal DNA element med højt kopital, som er indeholdt i de fleste Saccharomyces cerevisiae stammer. De mest slående strukturtræk ved 2-mikron plasmidet er to spejlvendte gentagelser (IR1 og IR2) på 559 bp, som hver opdeler plasmidet i to DNA 25 områder med forskellig længde. Den homologe rekombination mellem disse to identiske IR sekvenser resulterer i dannelsen af to molekyl isomer er (form A og form B). Stabiliteten af 2-mikron plasmidet er givet af tre plasmid-indkodede funktioner. REP1- og REP2-genprodukterne er 30 transvirkende proteiner, som er nødvendige for den stabile afdeling eller fraskillelse af 2-mikron plasmidet. Af disse to er REP1 formentlig det vigtigste, da effektiviteten af afdelingen er afhængig af gendoseringen af REP1 genproduktet [A. Cashmore et al. (1986) Mol. Gen. Genet.

35 203, 154 ]. Disse to proteiner virker gennem og på STB (REP3)-stedet, som er et vigtigt cis-virkende element på

I DK 175701 B1 I

I 20 I

I plasmidet [M. Jayaram et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, I

I 2466-2475, B. Viet et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, I

I 2190-2196 ]. I

H 5 Sådanne cir°-ståmmer af Saccharomyces cerevisiae er kendt I

I eller kan fremstilles ved anvendelse af kendte fremgangs- I

I måder [se f.eks. C.P. Hollenberg (1982) Curr. Top. I

I Microbiol. Immun. 96, 119], Den efterfølgende alternative I

I fremgangsmåde til fremstilling af cire-stammer er baseret I

I 10 på antagelsen, at "helbredelse" (curing) af 2-mikron I

I plasmidet ved hjælp af et andet plasmid indbefatter forø- I

I gelse af dosen af STB stedet til udtitrering af REP1- og I

I REP2-proteinerne. Denne relative reduktion af REP1- og I

I REP2-proteinerne ville føre til en instabilitet i det I

I 15 endogene 2-mikron plasmid. I

Det andet anvendte plasmid har fortrinsvis en defekt i I

I eller mangler REPl-genet. Et eksempel på et sådant plasmid I

I er pDP38, som bortset fra REPl-genet mangler en spejlvendt I

gentagelse (IR2). Dette gør dets høje kopitalekspression I

I 20 afhængig af kompletteringen af REPl-protein med det endo- I

H gene 2-mikron plasmid. Det indeholder to gærselektive I

I i markører: URA3, anvendt i situationer med såvel høje som I

lave kopital, og dLEU2, som kun vil anvendes i situationer I

H med høje kopital [E. Erhart et al. (1968) J. Bacteriol. I

I 25 625 ]. I

I En gærstamme, som er URa“ og Leu~, transformeres med I

I plasmid pDP38 og selekteres for Ura+ kolonier. Selektionen I

I på uracilfri plader (Ura selektion) giver en langt bedre I

I transformationsfrekvens end selektionen på leucinfri pla- I

I 30 der (Leu selektion), da URA3-genet er langt bedre udtrykt I

I end det defekte dLEU2-gen. En enkelt koloni udvælges og I

I udstryges på en Leu selektionsplade, som giver kolonier I

I med varierende størrelser og form. Nogle af de mindste I

I kolonier genudstryges på Ura selektionsplader og kopiud- I

I 35 plades på Leu selektionsplader. Der udvælges de kolonier, I

21 DK 175701 B1 som kan vokse under Ura selektion, men kun meget langsomt under Leu selektion. Vækst på Ura selektionsplader viser, at plasmidet pDP38 stadig findes, og den kun langsomme f 5 vækst under Leu selektion ikke skyldes tab af dette plasmid, og mahgelen på vækst under Leu selektion visér, at pDP38 ikke er i stand til at komplettere denne markør.

Sidstnævnte kendsgerning kan forklares på to måder: A.

LEU2 genet på pDP38 er muteret eller B: Plasmidet kan ikke 10 komplettere leu2, da det ikke kan hæve dets kopital, hvilket medfører at 2-mikron plasmidet ikke er tilgængeligt · (dvs. tabt) til komplettering af REP1-genproduktet.

Der kan meget let skelnes mellem disse to muligheder. I det første tilfælde viser den minimale vækst, der kon-15 stateres med disse kolonier (i modsætning til den absolutte nulvækst af celler uden pDP38), at nogen LEU2 ekspression er til stede. Det andet punkt kan testes direkte, da pDP38 i fravær af 2-mikron plasmidet kun vil virke som et I ARS type plasmid, dvs. at det vil være meget ustabilt, 20 således at størsteparten af kolonierne vil miste det efter nogle få generationer. Når derfor en enkelt koloni udstry-ges på en YPD plate, og enkelte kolonier udtages og kopier udplades på uracilfri plader, vil kun nogle få vokse under Ur a selektion. Kolonier, som ikke vokser, kontrolleres 25 ved hybridisering for pUC og 2-mikron sekvenser. Kolonier, som ikke viser hybridiseringssignaler, indeholder ikke plasmid pDP38 og endogene 2-mikron plasmider (cire stammer). De opnåede cir® stammer kan behandles som beskrevet ovenfor til opnåelse af gærmutantstammer, som mangler 30 peptidaseaktivitet, især ysca aktivitet, og som desuden

mangler 2-mikron DNA. I

Foruden manglen på ysca aktivitet mangler de foretrukne gærstammer ifølge opfindelsen også andre peptidaser valgt blandt yscA, yscB, yscY og yscS og mangler 2-mikron DNA.

35 De mest foretrukne gærstammer mangler ysca og yscY aktivitet og kan eventuelt også mangle yscB og yscS eller yscA

I DK 175701 B1 I

I I

og yscB aktivitet og mangler 2-mikron DNA. I

Gærstammerne ifølge opfindelsen kan med fordel anvendes I

til produktionen af heterologe proteiner. Det har overra- I

; 5 skende vist sig, at kexl stammer ifølge opfindelsen, som I

I bærer en hybridvektor indeholdende et gen, der koder for I

H et protein heterologt til gær, producerer proteinet i en I

homogen form, dvs. uden indhold af nogen som helst C-ter- I

H minalt afkortede biprodukter. I

10 Transformerede gærstammer I

Opfindelsen angår endvidere en gærstamme, som mangler I

carboxypeptidase ysca aktivitet, og som er transformeret I

med en hybridvektor omfattende en gærpromotor operabelt I

H bundet til en DNA sekvens, der koder for et heterologt I

I 15 protein, og en fremgangsmåde til fremstilling deraf. I

I Egnede gærværtsstammer indbefatter stammer af Saccharo- I

myces cerevisiae, som mangler carboxypeptidase ysca I

H aktivitet og eventuelt anden peptidaseaktivitet, og som I

eventuelt er blevet befriet for endogene 2-mikron plasmi- ^ I

I 20 der (se ovenfor). I

Fremgangsmåden til fremstilling af den transformerede I

I gærstamme omfatter transformering af en gærstamme, som I

I mangler carboxypeptidase ysca aktivitet med hybridvek- I

toren. ^ I

I 25 Transformationen af gær med hybridvektorerne ifølge I

I opfindelsen kan gennemføres under anvendelse af frem- I

I gangsmåden beskrevet af Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad. I

I Sci. USA 75, 1929 (1978)]. Denne fremgangsmåde kan opdeles I

I i tre trin: I

30 (1) Fjernelse af cellevæggen eller dele deraf under anven- I

I delse af forskellige glycosidasepræparater, såsom snegle- , I

23 DK 175701 B1 tarmsaft, f.eks. "Glusulase"® eller "Helicase"®, eller enzymblandinger udvundet fra mikroorganismer, ' f.eks. "Zymolyase"®, i osmotisk stabiliserede opløsninger, f.eks.

’ 5 1 M sorbitol.

(2) Behandling af "nøgne" gærceller (sphæroplaster) med DNA vektoren i nærværelse af polyethylenglycol (PEG) og Ca2+ ioner.

(3) Regenerering af cellevæggen og selektion af de transit) formerede celler i et lag fast agar. Denne regenerering gennemføres hensigtsmæssigt ved at indlejre sphæropla-sterne i agar. Eksempelvis blandes smeltet agar (ca. 50°C) med sphæroplasterne. Efter afkøling af opløsningen til gærvæksttemperaturer (ca. 30°C) fås et fast lag. Dette 15 agarlag skal tjene til at undgå hurtig diffusion og tab af essentielle makromolekyler fra sphæroplasterne og derved lette regenereringen af cellevæggen. Imidlertid kan regenerering af cellevæggen også opnås (dog med lavere effektivitet) ved at udplade sphæroplasterne på overfladen 20 af præfremstillede agarlag.

Regenereringsagar fremstilles fortrinsvis på en måde, der tillader regenerering og selektion af transformerede celler på samme tid. Da gærgener, som koder for enzymer i biosyntetiske aminosyrekredsløb eller nucleutidkredsløb, 25 sædvanlig anvendes som selektive markører (se ovenfor), gennemføres regenereringen fortrinsvis i gærminimalme-diumagar. Hvis der kræves stor regenereringseffektivitet er følgende totrinsproces fordelagtig: (1) Regenerering af cellevæggen i et fuldstændigt komplekst medium og (2) 30 selektion af de transformerede celler ved kopiudpladning , af cellelaget på selektive agarplader.

Et desulphatohirudin, der kan fremstilles ifølge opfindelsen, har f.eks. formlen:

I DK 175701 B1 I

I I

I Xl Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys I

Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn X3 Cys I

I Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Xj Asn Gin Cys Val Thr Gly - I

Glu Gly Thr Pro X<» Pro Gin Ser X5 Asn Asp Gly Asp Phe I

I Glu Glu Ile Pro Glu X& I

I (iv> I

I hvori Χχ betyder dipeptidresten Val-Val, X2, X3 og X4 er I

I Lys, X5 er His, og X5 er valgt blandt Glu-Tyr-Lys-Arg, I

5 Ser-Phe-Arg-Tyr og Trp-Glu-Leu-Arg. I

I De kendte heterologe proteiner, som kan fremstilles ved I

I fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan anvendes på kendt I

måde, f.eks. til behandling og forebyggelse af sygdomme I

H hos mennesker og dyr. Eksempelvis kan human ANP udvise I

10 natriuretiske, diuretiske og vaskorelakserende virkninger I

I og kan anvendes ved reguleringen af kardiovaskulær I

homeostase. I

Desulphatohirudinforbindelserne kan anvendes analogt med I

naturligt hirudin til behandling og forebyggelse af I

I 15 thrombose, til behandling af akut chok, til behandling af I

H konsumptionskoagulopatier og lignende som beskrevet i I

beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 168.342. I

Opfindelsen angår især de transformerede gærstammer, frem- gangsmåderne til deres fremstilling og fremgangsmåden til 20 fremstilling af heterologe proteiner som beskrevet i I eksemplerne.

H Opfindelsen forklares nærmere i det følgende med henvis- I ning til tegningen, hvor I fig. 1 viser chromatogrammer af desulphatohirudiner høstet I 25 fra transformerede KEX1- og kexl-stammer af S. cerevisiae, 25 DK 175701 B1 fig. 2 er et skematisk diagram, som viser in vitro * ! syntesen af hirudin HV1 genet indeholdende PH05 sig-nalsekvensen med de foretrukne gærkodons, hvor de an- 5 vendte 21 oligodeoxynucleotider er angivet ved henholdsvis nummererede linier og punkterede linier, fig. 3 skematisk illustrerer konstruktionen af plasmid PDP33, fig. 4 skematisk illustrerer konstruktionen af plasmider 10 pDP34 og pDP38, fig. 5 skematisk illustrerer konstruktionen af ekspres-sionsplasmid pDP34/GAPFL-YHIR, fig. 6 skematisk illustrerer konstruktionen af plasmid pDP34/PH05(-173)-YHIR, 15 fig. 7 skematisk illustrerer konstruktionen af plasmid pDP92 og fig. 8 viser chromatogrammer af vildtype hirudin og hirudinmutanter HV1-KR, HV1-WQLR og HVl-SFRY fra kulturer af S. cerevisiae BYSKEXl og BYSkexl.

20 Eksempel 1

Krydsning af S. cerevisiae kexl mutant stamme 96 med S. cerevisiae stamme BYS og analyse af sporerne for or-faktorudskillelsesevne og carboxypeptidase ysca (KEXl-gen) aktivitet 25 S. cerevisiae kexl mutant stamemn 96 (a, kexl, ade2, thrl), som er leveret af Yeast Genetic Stock Center,

Berkeley, USA, krydses i S. cerevisiae stamme BYS232-31-42 (a, prbl-1, prcl-1, cpsl-3, lys2, leu2, his7) [Achstetter,

I DK 175701 B1 I

I I

I T. og Wolf, D.H. (1985) EMBO J. 4, 173-177, Wolf, D.H. og I

B Ehmann, C. (1981) J. Bacteriol. 147, 418-426 ], so'm bærer I

B vildtype KEX1 allelen. Diploide heterozygote celler af I

5 genotypen kexl/KEXl isoleres fra denne krydsning. Tetra- I

B derne, som fås fra de diploide celler, dissekeres i I

B overensstemmelse med standardgenteknikker [Hawthorne, D.C. I

I og Mortimer, R.K. (1960) Genetics 45, 1085-1110, Methods I

B in Yeast Gentics 1986 (Sherman, F. et al-, udg.) Cold I

I 10 Spring Harbor Laboratory, N.Y. ]. I

B De fire sporer fra hver tetrade testes for deres evne til I

B at udskille or-faktor. For at skelne mellem KEX1 vildtype- I

B og kexl mutant kolonier anvendes den pheromonsuper- I

B sensitive tester stamme S. cerevisiae RC629 (a, sst-2, I

B 15 ade2-l, ural, his6, metl, canl, cyh2, rme) [Chan, R.K. og I

B Otte, C.K. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 11-20, Chan, R.K. og I

B Otte, C.K. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 21-29]. Som forven- I

B tet ud fra egenskaberne, som indkodes af enkeltkernege- I

B ner, udskiller af alle de analyserede tetrader to sporer I

B 20 af hver tetrade a-faktor, medens de to andre sporer ud- I

B skiller α-faktoren. Vildtype KEXl-kolonier af α-modnings- I

B typen inhiberer vækst af testerstammen i vid udstrækning I

B og danner således en stor ring omkring sig, da de er i I

B stand til at behandle a-faktorprecursoren fuldstændigt og I

B 25 danne fire aktive a-faktormolekyler ud fra et precursor- I

B molekyle. I modsætning hertil haammer kexl-mutantkolonier I

B væksten af testerstammen i så ringe omfang og danner såle- I

B des en lille ring omkring sig, da de kun kan producere et I

B modent α-faktormolekyle ud fra et precursormolekyle. I

B 30 Sporerne fra flere fuldstændige tetrader, som identifi- I

B ceres som defektive ved kexl genet ved hjælp af den I

B ovenfor beskrevne pheromonanalyse, testes til sidst for I

B specifik carboxypeptidase ysca aktivitet. Celler dyrkes, I

B membraner af cellerne fremstilles og testes for carb- i I

B 35 oxypeptidase ysca aktivitet under anvendelse af j I

B Cbz-Tyr-Lys-Arg som substrat som beskrevet [Wagner, J.C. I

I DK 175701 B1 og Wolf, D.H. (1987) FEBS Lett. 221, 2, 423-426 ]. Det faktum, at carboxypeptidase ysca aktivitet mangler i kexl mutantceller, indicerer, at KEX1 er strukturgenet for 5 dette enzym. Dette betyder, at carboxypeptidase ysca faktisk indgår' i carboxyterminal bearbejdning eller behandling af a-faktor.

Eksempel 2

Klassifikation af bekræftede kexl mutanter på baggrund 10 af yderligere mangel af proteaser yscB, yscY og yscS

S. cerevisiae kexl mutanter klassificeres med hensyn til manglen af andre proteaser (proteinase yscB, carboxypeptidase yscY og carboxypeptidase yscS) og yderligere vækstfaktorbetingelser.

15 Cellemateriale fra kexl mutanter, som er fremstillet af stationær fase i YPD (Difco) medium, suspenderes i 200 μΐ 20 mM Tris-HCl puffer, pH 7,2 i en Eppendorf mikrocentri-fuge, og der tilsættes glasperler med en diameter på 0,4 mm op til to tredjedele af rumfanget. Suspensionen rystes 20 kraftigt tre gange i 1 minut på et hvirvelblandeapparatur med mellemliggende afkøling på is.

Ved centrifugering i 5 minutter udvindes supernatantrå-ekstrakterne. Disse ekstrakter dialyseres mod 0,1 M imidazol-HCl puffer pH 5,2 med 0,1 mM ZnCl2 til aktivering 25 af proteaser og til fjernelse af frie aminosyrer fra ekstrakterne.

Proteinase yscB aktiviteter måles i overensstemmelse med Azocoll-testen [R.E. Ulane et al. (1976) J. Biol. Chem.

251, 3367, E. Cabib et al. (1973) Biochem. Biophys. Res.

30 Commun. 50, 186 og T. Saheki et al. ( 1974) Eur. J.

Biochem. 42, 621 ]. Efter målinger af proteinkoncentrationen sættes 0,1 M natriumphosphat (NaPi) puffer pH 7,0 ‘

I.. DK 175701 B1 I

I I

I til en aliquot af hver prøve op til et rumfang på 100 μΐ I

I til regulering af de nødvendige ens proteinmængder. Til I

I proteinopløsningen sættes en suspension af 500 μΐ Azocoll

I 5 (240 mg i 10 ml 0,1 M NaPi puffer, pH 7,0). Disse blandin- I

I ger inkuberes ved 30eC i en time ved omrøring. Efter til- I

I sætningen af 500 μΐ 10%'s trichloreddikesyre, som stopper I

reaktionen, centrifugeres blandingerne to gange, og der I

I optages absorptionsspektre af supernatanterne ved 520 nm. I

I 10 Aktiviteterne af carboxypeptidase yscY og yscS måles under I

I avendelse af det chromogene substrat Cbz-Gln-Leu [jf. D.H. I

i Wolf et al. (1978) FEBS Lett. 91, 59 og D.H. Wolf et al. I

I (1977) Eur. J. Biochem. 73, 553]. De dialyserede ekstrak- I

H ter opdeles i tre portioner, og til to af disse sættes I

15 phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) til en slutkoncen- I

tration på 1 mM eller EDTA til en s lutkoncentration på 5 I

mM til selektiv blokering af de to proteaseaktiviteter. I

PMSF inhiberer nemlig carboxypeptidase yscY aktivitet, og I

EDTA inhiberer aktiviteten af carboxypeptidase yscS. Bian- I

20 dingerne med inhibitorer inkuberes hver for sig ved 25®C i I

en time til opnåelse af fuldstændig inhibering. Efter I

bestemmelsen af proteinkoncentrationen sættes til to I

aliquoter med inhibitor og en aliquot uden inhibitor som I

kontrol af hver prøve 0,1 M NaPi puffer 7,4 til et rumfang I

25 på 50 μΐ til opnåelse af ens proteinmængder. Til disse : I

proteinopløsninger sættes følgende testopløsninger: I

500 μΐ testopløsning I: I

L-aminosyreoxidase 0,24 mg/ml I

peberrodsperoxidase 0,40 mg/ml I

30 0,01 mM MnCl2 I

i 0,1 M NaPi puffer, pH 7,4 I

H 50 μ1 téstopløsning II I

o-dianisidin 2 mg/ml I

H i vand I

35 500 μΐ testopløsning III I

20 mM Cbz-Gly-Leu I

H i 0,2 M kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 I

I DK 175701 B1 29

Blandingerne inkuberes ved 28°C i en time, og efter tilsætning af 100 μΐ 20% "Triton" X-100 til afbrydelse af reaktionen måles absorbanserne ved 405 nm.

5 Med henblik på"den efterfølgende transformation mærkes en aminosyreauxotrof markør for leucin ved kopiteknikken på minimalplader tilsat adenin, threonin, lysin og histidin og med eller uden leucin.

Ved hjælp af de ovenfor beskrevne analyser isoleres 10 mutanter, som betegnes S. cerevisiae BYSkexl, som udviser en firdobbelt proteasemangel (or, prb-l, prc-1, cps-3, kexl), og som yderligere kræver leucin.

Eksempel 3

Transformation af Saccharomyces cerevisiae mutant med 15 firdobbelt proteasemangel ; Plasmidet pJDB207/PH05-Hir [europæisk patentansøgning nr.

225.633] indføres i den firdobbelte proteasedeficiente mutant BYSkexl (a, prb-l, prc-1, cps-3, kex-1, leu2) og i KEX1 vildtype stamme BYS232-31-42 (a, prb-l, prc-1, cps-3, 20 lys2, leu2, his7) som kontrol under anvendelse af transformationsmetoden beskrevet af Hinnen et al. [Proc. Natl.

Acad. Sci USA 75, 1929 (1978)].

De to forskellige gærstammer høstes på det tidlige logaritmiske stadium i 100 ml YPD mediet (ODgQQ * 0,2), 25 vaskes med 25 ml 0,8 M sorbitol og resuspenderes i 5 ml af samme sorbitolopløsning. Til disse 5 ml cellesuspensioner sættes 30 μΐ zymolyase (ZYM0LYASE-100 T fra Arthrobacter luteus, Seikagaku Kogyo Co., LTD, 10 mg/ml i 0,8 M sorbitol). Blandingerne omrøres forsigtigt hver for sig i 30 100 ml rystekolber på rysteapparatet (110 opm) ved 30°C i

I DK 175701 B1 I

I 30 I

I ca. 30 minutter. Med 5 minutters mellemrum udtages prøver I

B på 100 μΐ, som fortyndes i 10 ml destilleret vand, og I

absorbanserne af fortyndingerne måles ved 600 nm måles til I

B 5 kontrollering af den forløbende sphæroplastdannelsespro- I

I ces. Til opnåelse af god sphæroplastdannelse skal for- I

I skellen i absorbans før og efter behandlingen med zymo- I

B lyase være større end en faktor 10. De "sphæroplastede" I

B celler vaskes to gange med 0,8 M sorbitol, resuspenderes i I

B 10 25 ml medium HE 30 (2 M sorbitol i YPD medium) og inkube- I

B res i 100 ml rystekolbe med en forsigtig omrøring på I

B rysteapparatet (110 opm) ved 30°C i 1 time. Cellerne I

B centrifugeres (3000 opm, 5 min.) og resuspenderes i 1 ml I

B HE 31 opløsning (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl2, 0,9 I

B 15 M sorbitol) med forsigtighed. Til disse 100 μΐ cellesus- I

B pensioner sættes 4 μς plasmid DNA’er. Blandingen inkube- I

res i 15 minutter ved stuetemperatur. Til hvert rør sættes I

I 1 ml 20%'% polyethylenglycol (PEG) 4000, og der inkuberes I

Η I i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur, hvorpå der I

20 centrifugeres (3000 opm, 3 min.) og resuspenderes i 500 μΐ I

0,8 M sorbitol. Sphæroplasterne med DNA blandes med 10 ml I

regenereringsagar (l M mannitol, 6,8 g/1 yeast nitrogen I

base w/o AA (Difco), 10 g/1 L-asparagin, 1,0 g/1 I

L-histidin, 1,0 g/1 adenin, 1,0 g/1 threonin, 1,0 g/1 I

25 lysin og 3% agar) og hældes som et toplag på plader, der I

indeholder et grundagarlag af den samme sammensætning. I

H Pladerne inkuberes ved 30eC i 96 timer, indtil de trans- ( I

formante kolonier fremkommer. I

En enkelt transformeret gærkoloni udtages og dyrkes i I

30 gærsyntetisk minimalmedium (8,4 g/1 yeast nitrogen base I

w/o AA, 10 g/1 L-asparagin og 1,0 g/1 L-histidin) tilsat I

adenin, threonin, lysin og histidin men uden leucin. I

Kolonien fra den firdobbelt proteasedeficiente mutant I

H BYSkexl og kolonien fra den tredobbelt proteasedeficiente I

35 kontrolstamme BYSKEX1 betegnes som henholdsvis Saccharo- I

H myces cerevisiae BYSkexl/pJDB207/PH05-HIR og Saccharo- I

31 DK 175701 B1 ! myces cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/PH05-HIR.

Eksempel 4

Dyrkning af Saccharomyces cerevisiae transformanter med 5 PJPB207/PH05-HIR

Celler af Saccharomyces cerevisiae transformanter BYSkex1/pJDB207/PHO-HIR og BYSKEXl/pJDB207/PH05-HIR omrøres som forkultur i 10 ml gær komplet medium HE 41 [4,5 g/l cas aminosyrer, 4 g/l gærekstrakt, 20 g/1 10 saccharose, 20 g/l glucose, 3,6 g/l (NH4)2S04, 0,2 g/l MgS04*7H20, 0,013 g/l CaCl2’H20 og 1 ml/1 sporstofblanding (10 g/l FeS04*7H20, 50 g/l ZnS04*7H20, 3,3 g/l

CuS04* 5H20, 3 g/l MnS04‘H20, 2 g/l CoC12*6H20 og 1 g/l (NH4)5M07Q24·4H20) ] ved 28°C og dyrkes i ca. 48 timer, 15 indtil de når den stationære fase. De høstede celler vaskes i 0,9%'s NaCl. 50 ml af det ovenfor beskrevne gærsyntetiske medium inokuleres med 5% podemateriale. Kulturerne inokuleres op til en celletæthed på OD6oo=0'3 og omrøres ved 28eC i op til 72 timer ved 250 opm.

20 Gærkompletmedium HE 41 anvendes til at fjerne baggrundsabsorptionen i HPLC analyse.

Eksempel 5

Analyse af hirudin-65 og dets carboxyterminale nedbrydningsprodukter hirudin-64 og hirudin-63 fra fermenterings-25 kulturer af Saccharomyces cerevisiae transformanter

BYSkexl/pJDB207/PH05-HIR og BYSKEXl/pJDB207/PH05-HIR under anvendelse af omvendtfase HPLC

Prøver af flydende gærkulturer fremstilles ved centrifugering til dannelse af en klar opløsning, som fortyndes 30 i forholdet 1:10 (r/r) med eddikesyre (1M) og underkastes

I DK 175701 B1 I

I I

I HPLC analyse under følgende betingelser: I

I En HIBAR (MERCK) kolonne (4 x 125 mm) fyldes med omvendt I

I fase, storporet silica materiale (type 71252, 300-5-C18, I

I 5 MACHEREY-NAGEL), en kugleformet stationær fase med en I

partikeldiameter på 5 μΐη og en porøsitet på 300 Å. Kolon- I

nens ender er forsynet med fritter af rustfrit stål. Mobil I

fase A udgøres af vand ("Nanopure"®, BARNSTEAD) indehol- I

dende 0,1% (r/r) trifluoreddikesyre. Mobil fase B frem-

10 stilles af 20% mobil fase A og 80% (r/r) acetonitril I

I (HPLC-kvalitet, FLUKA) indeholdende 0,08% (r/r) trifluor- I

I eddikesyre. I

Der foretages chromatografiske separationer med en flow- I

rate på 1,5 ml/min. med følgende gradient, og eluenterne I

15 overvåges ved måling af absorbansen ved 216 nm. I

I t (min)_% A_% B I

I 0 90 10 I

1 79 21 I

9 79 21 I

17 67 33 I

20 0 100 I

22 0 100 I

24 90 10 I

32/0 90 10 I

Der fremstilles en standardopløsning til kalibrering af I

systemet ved at opløse 1 mg rent desulphatohirudin i 1 ml I

vand. 50 μλ af denne standardopløsning sprøjtes på kolon- I

nen og chromatograferes som beskrevet til kalibrering af I

20 systemet. I

I fig. 1 er vist analytiske omvendtfase væskechromatogram- ; I

mer af hirudiner høstet fra kulturer af S. cerevisiae | I

H BYSkexl/pJDB207/PH05-HIR og S. cerevisiae BYSKEXl/- I

PJDB207/PH05-HIR. Chromatograferingsbetingelserne er de I

25 samme som beskrevet ovenfor. Det er klart, at i modsætning I

til stamme BYSKEXl/pJDB207/PH05-HIR producerer den pepti- I

33 DK 175701 B1 dase yscor negative stamme BYSkexl/pJDB207/PHO5-HIR et desulphatohirudinprodukt ("HIR-65"), som er praktisk taget frit for C-terminalt afkortede biprodukter desulphatohi-5 rudin HIR-64, som mangler den C-terminale aminosyre Gin, og HOR-63, som mangler de C-terminale aminosyrer Leu og Gin.

Eksempel 6

In vitro syntese af hirudin HV1 genet med foretrukne gær-10 kodons

Kodningssekvensen for hirudinekspressionskassetten indeholder foretrukne gærkodons [B. Hall (1982) J. Biol. Chem.

257, 3026 ] for at sikre optimal translation af hirudin mRNA'et. Kodningssekvensen indeholder PH05 signal-15 sekvensen fusioneret i struktur til kodningssékvensen for desulphatohirudin HV1. 5’-Enden af det syntetiske DNA indeholder de klæbrige ender af EcoRl restriktionsstedet.

i

Ved 3'-enden efterfølges stopkodonet TAG umiddelbart af de klæbrige ender af BamHl stedet. Sekvensen af 257 bp EcoRl-20 -BamHl DNA fragmentet er vist i fig 2.

Fig. 2 angiver også fremgangsmåden ved in vitro syntesen af det dobbeltstrengede DNA fragment. 21 oligodeoxynucleo-tider fremstilles under anvendelse af phosphoramidit--metoden [M.H. Caruthers, i: Chemical and Enzymatic 25 Synthesis of Gene Fragments (H.G. Gassen og A. Lang, red.). Verlag Chemie, Weinheim, DE (1982] på et synteseapparat model 380B fra Applied Biosystems. Sekvensen af de enkelte oligonucleotider er vist i fig. 2. Overlapningerne er entydige. De lyophiliserede oligonucleotider genop-30 løses i 50 mM Tris-HCl pH 8,0 ved en koncentration på 10 pmol//xl. De 21 oligonucleotider opdeles i to grupper: [A] nr. 1-11, som repræsenterer 5'-halvdelen af DNA fragmentet, og [B] nr. 12-21 for 3’-halvdelen. De 2 grupper be-

I DK 175701 B1 I

I I

I handles hver for sig. 10 pmol af hvert af oligonucleoti- derne fra en gruppe blandes. Oligonucleotiderne phdsphory-

leres i 20 μΐ 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 mM

I 5 NaCl, 3 mM DTT, 0,4 mM ATP og 8 enheder polynucleotid- I

I kinase (Boehringer) i 1 time ved 37eC. Efter 30 minutter ved stuetemperatur opvarmes de to blandinger (A og B) hver for sig i 5 minutter ved 95°C i et vandbad. Prøverne hen-

I står til langsom afkøling til stuetemperatur i vandbadet I

I 10 natten over. De annellerede oligonucleotidblåndinger A og I

B opbevares derefter på is. I

I Plasmid pBR322 skæres fuldstændigt med EcoRI og BamHI. Det I

I store 4 kb fragment isoleres på en præparativ 0,6% I

agarosegel. DNA'et udvindes ved elektroeluering, renses I

I 15 ved hjælp af DE52 ionbytterchromatografi og fældes med I

ethanol som beskrevet i eksempel 7. DNA'et genopløses i I

I vand ved en koncentration på 0,4 pmøl/μΐ. I

10 /il af den annellerede oligonucleotidblanding A (5 pmol I

I af hvert af oligonucleotiderne 1-11), 9,5 μΐ af blanding B I

20 (5 pmol af hvert af oligonucleotiderne 12-21), 0,4 pmol I

I af 4 kb EcoRI-BamHI fragmentet af pBR322 og 400 enheder T4 I

I DNA ligase (Biolabs) inkuberes i 16 timer ved 15eC. I

I Der anvendes 10 μΐ aliquoter til transformation af I

kompetente E. coli HB 101 Ca++ celler. 12 Transformerede, I

25 ampicillinresistente kolonier dyrkes hver for sig i LB I

I medium, som indeholder 100 μg/ml ampicillin. Plasmid DNA I

fremstilles ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Holmes I

et al. [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)] og analyseres ved I

I EcoRI og BamHI-restriktionsspaltninger. Plasmid DNA'er med I

30 257 bp EcoRI-BamHI-insertet analyseres yderligere ved DNA I

sekvensering på begge strenge. Oligonucleotider 3, 11, I

I 12, 14 og 20 (se fig. 2) anvendes som sekvenseringspri- I

mere. En klon med den korrekte sekvens på begge DNA I

strenge udvælges og betegnes pBR322/YHlR. I

35 DK 175701 B1

Eksempel 7

Konstruktion af plasmid pJDB207/GAPFL-YHIR

pJDB207/GAPFL-YHIR er et gærpiasmid til ekspressionen af 5 desulphatohirudin variant HV1 under kontrol af en kort konstitutiv promotor for gær glyceraldehyd-3-phosphat-de-hydrogenase (GAPDH)-genet. Kodningssekvensen for desulphatohirudin består af foretrukne gærkodons.

10 μg plasmid pBR322/YHIR spaltes med restriktionsendo-10 nucleaser BamHI og EooRI. 257 bp EcoRI-BamHI-fragmentet isoleres fra andre DNA fragmenter på 1,2% præparativ agarosegel. DNA båndene farves med ethidiumbromid og gøres synlige under UV lys ved 360 nm. 257 bp DNA båndet udskæres fra gelen og elektroelueres i 0,2 x TBE puffer (TBE: 15 90 mM Tris-base, 90 mM borsyre, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) i 45 minutter ved 100 mA. Efter ændring af polariteten i 45 sekunder samles DNA opløsningen og indstilles på 0,15 M NaCl. DNA’et absorberes på et DE52 ionbytterlag (Whatman) på 100 μΐ og elueres i 400 μΐ puffer med højt saltkoncen-20 tration (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl).

DNA*et fældes med ethanol og resuspenderes i vand til en koncentration på 0,1 pmol/μΐ.

Plasmid pJDB207/GAPFL-HlR [europæisk patentansøgning nr.

225.633] indeholder det syntetiske gen for desulphato-25 hirudin (baseret på E. coli kodon anvendelse) fusioneret i struktur til signalsekvensen for gærsur phosphatase (PH05). Genet udtrykkes under kontrol af en kort konstitutiv giyceraidehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPFL) promotor for gær på shuttle vektor pJDB207. 10 μg plasmid 30 pJDB207/GAPFL-HIR spaltes med Sall og EcoRI. 478 bp Sall-EcoRI.fragmentet indeholder Sal-Bam pBR322 delen og GAPFL promotoren. DNA fragmentet isoleres på en 0,8% præparativ agarosegel, elektroelueres og renses ved DE52 chromatografi og fældning med ethanol. DNA'et resuspende- i

I DK 175701 B1 I

I I

I res i vand ved en koncentration på 0,1 pmol/μΐ. 5 μ! I

I pJDB207/GAPFL-HIR spaltes med Sall og BamH. Det sifore 6,7 I

I kb vektorfragment isoleres som beskrevet ovenfor. H

I 5 0,2 pmol af 478 bp Sall-EcoRI promotor fragmentet, 0,2 I

I pmol af 257 bp EcoRI-BamHI fragmentet indeholdende PH05 I

I signalsekvensen og det syntetiske hirudingen (gærkodons) I

I og 0,1 pmol af 6,7 kb vektorfragmentet ligeres i 10 μΐ 60 I

I mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 200 I

I 10 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) i 6 timer ved 15eC. En 1 I

I μΐ aliquot af ligeringsblandingen anvendes til transfor- I

I mation af kompetente E. coli HB 101 celler. I

I 12 Transformerede, ampicillinresistente kolonier dyrkes I

I hver for sig i LB medium indeholdende 100 μg/ml ampicil- I

I 15 lin. Plasmid DNA fremstilles ved metoden ifølge Holmes et I

I al. (ovenfor) og analyseres ved Sall/Hindlll-dobbelt- I

I spaltninger. En enkelt klon med det forventede restrik- I

tionsmønster betegnes pJDB207/GAPFL-YHlR. I

På tilsvarende måde kan konstruktionen gennemføres med et I

20 543 bp Sall-EcoRI promotorfragment af plasmid pJDB207/- I

I GAPEL-HIR [europæisk patentansøgning nr.. 225.633 ]. Det I

I dannede nye plasmid betegnes pJDB207/GAPEL-YHIR. I

Eksempel 8 I

I Konstruktion af plasmid pJDB207/PH05(-173)-HIR I

I 25 pJDB207/PH05( -173)-HIR er et gærplasmid til ekspressionen I

H af desulphatohirudinvariant HV1 under kontrol af en kort I

I PH05 promotor. PH05(-173) promotorelementet indeholdende I

nucleotidsekvensen af gær PH05 promotoren fra position -9 I

til -173 (BstEII restriktionsstedet), men har ingen foran I

30 stående regulatoriske sekvenser (UAS). PH05(-173) promo- I

toren opfører sig derfor som en konstitutiv promotor. I

37 DK 175701 B1

Plasmid pJDB207/PH05(Eco)-HIR (EP 225.633) indeholder fuld længde, reguleret PH05 promotor med et EcoRI sted indført ved position -8 med hensyn til ATG’en i PH05 signalsekven-5 sen og kodningssekvensen for desulphatohirudin, som efterfølges af PH05 transcriptionsstopfragmentet♦ Dette eksempel beskriver ombytningen af den regulerede PH05 promotor med det korte PH05(-173) promotorelement.

20 μg plasmid pJDB207/PH05(Eco)-HIR spaltes med BstEII. De 10 klæbrige ender a£ restriktionsfragmenterne udfyldes ved reaktion med Kienow DNA polymerase (1 enh./jtg DNA) i 200 μΐ 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 0,1 mM af henholdsvis dATP, dCTP, dGTP og TTP i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter ekstraktion med phenol fældes DNA'et med 15 ethanol. 4,16 μg BamHI linker (5*-CGGATCCG-3', Biolabs) phosphoryleres i 100 μΐ 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP og 18 enheder T4 polynucleo-tidkinase (Boehringer) i 45 minutter ved 37°C. Efter 10 minutter ved 75®C afkøles reaktionsblandingen langsomt til 20 stuetemperatur. - De annellerede oligonucleotidlinkere opbevares ved -20°C.

4 pmol af [ BstEII ]/kortendefragmenterne af plasmid pJDB207/PH05(Eco)-HiR inkuberes i 16 timer ved 15°C med et 100 gange så stort overskud af den phosphorylerede og 25 annellerede BamHI linker i 208 μΐ 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2/ 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og 800 enheder T4 DNA ligase (Biolabs). Efter inaktivering af ligasen i 10 minutter ved 85eC fjernes overskud af linkerne ved fældning af DNA'et i nærværelse af 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat 30 pH 6,0 og 0,54 rumfang isopropanol. DNA'et spaltes med BamHI og EcoRI. DNA fragmenterne adskilles på en 0,8% præparativ agarosegel. 172 bp BamHI-EcoRI promotor fragmentet udvindes fra gelen ved elektroeluering og fældning med ethanol. DNA*et resuspenderes ved en koncentration på 35 0,1 pmol/μΐ.

I DK 175701 B1 I

I I

I Plasmid pJDB207/PH05(Eco)-HIR spaltes med EcoRI og I

I Hindlll. 643 bp EcoRI-Hindlll-fragmentet isoleres som I

I beskrevet ovenfor. DNA fragmentet indeholder PH05 I

I 5 signalsekvensen fusioneret i struktur til kodnings- I

I sekvensen for desulphatohirudin og PH05 transcrip- I

I tionsstopfragmentet. Plasmidet skæres endvidere med I

I Hindlll og BamHI. 6,6 kb vektorfragmentet isoleres. I

I 0,2 pmol af henholdsvis 172 bp BamHI-EcoRI fragmentet og I

I 10 643 bp EcoRI-Hindlll fragmentet og 0,1 pmol 6,6 kb vektor- I

I fragmentet ligeres i 10 μΐ 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM I

I MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enheder T4 DNA ligase I

I (Biolabs) i 6 timer ved 15“C. En aliquot på 1 μΐ . af

I ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ calciumbehandlede, I

I 15 transformationskompetente E. coli HB101 celler. I

I 12 Transformerede, ampicillinresistente kolonier dyrkes i I

H LB medium, som indeholder 100 Mg/ml ampicillin. Plasmid I

H DNA fremstilles og analyseres ved hjælp af BamHI- og I

I Sall/Hindlll-spaltninger. En klon med de forventede I

H 20 restriktionsfragmenter udvælges og betegnes pJDB207/- I

I PH05(-173)-HIR. I

Eksempel 9 I

'I

Konstruktion af plasmid pDP34 I

I Gær 2-mikron kovalent lukket cirkel DNA isoleres fra I

25 Saccharomyces cerevisiae stamme S288C. Celler inkuberes I

med 5 μg/τRl Zymolyase (100.000 enheder/^g) i 20 minutter I

ved 37®C til nedbrydning af cellevæggene. Spheroplasterne I

lyseres med 2% SDS. Derpå tilsættes EDTA til 25 mM, ethi- I

diumbromid til 1 mg/ml og cæsiumchlorid til en slutvægt- I

30 fylde på 1,55 g/ml. Plasmid DNA adskilles fra det chromo- I

somale DNA ved ultracentrifugering i 42 timer ved 42.000 I

opm ved 15®C. 2-Mikron plasmid DNA’et udtages fra gradien- I

39 DK 175701 B1 ten ved hjælp af en sprøjte. Ethidiumbromidet fjernes ved ekstraktion med NaCl-mættet isopropanol, og plasmid DNA'et fældes til sidst med ethanol. Det rensede 2-mikron plasmid 5 DNA lineariseres derpå med Pst I og klones i Pstl stedet i pUC19 [J. Norrånder et al., Gene 26 (1983), 101], hvorved man får plasmid pDP31.

Plasmid pJDB207 spaltes med restriktionsenzymerne Kpnl og Hpal. Det dannede 0,55 kb Hpal-Kpnl fragment indeholder 10 samlingen mellem 2-mikron sekvensen og den defektive promotor for dLEU2 genet.

Plasmid pUC7/LEU2 indeholder det gær genomiske 2,2 kb Xhol-Sall fragment af LEU2 genet [A. Andreadis et al.

(1982) Cell 31, 319] klonet i Sall stedet i plasmidet pUC7 15 [J. Vieira et al. (1982) Gene 19, 259 ]. Plasmid pUC7/LEU2 skæres med Kpnl og Hpal. 4,25 kb KpnI-Hpal fragmentet li-geres til 0,55 kb Hpal-Kpnl fragmentet af pJDB207. Dette resulterer i plasmid pDP30, hvor den oprindelige 2-mi-kron/dLeu2 fusion som i plasmid pJDB207 er anbragt foran 20 LEU2 genet med dens fuldstændige terminator. pDP30 spaltes med Hpal og Sall, og 1,85 kb fragmentet indeholdende det fuldstændige LEU2 gen renses og klones i 8,7 kb Sall-Hpal fragmentet af plasmid pDP31. Det dannede plasmid, pDP33 (se fig. 3), lineariseres ved partiel spaltning med 25 Hindlll i nærværelse af 50 /tg/ml ethidiumbromid [M. Oesterlund et al. (1982) Gene 20, 121] og ligeres med 1,17 kb Hindlll fragmentet indeholdende URA3 genet [M. Rose et al. (1984) Gene 29, 113]. Der selekteres for indsætning af URA3 genet ved transformation i E. coli stamme pyrF [M.

30 Rose et al., ovenfor]. En positiv klon betegnes plasmid pDP34 (se fig. 4).

pDP34 er en gær-E. coli shuttle vektor med ampicillinre-sistensmarkøren for E. coli og de URA3 og dLEU2 gærselektive markører. Den indeholder den fuldstændige 2-mikron 35 sekvens i A formen og er REP1-, REP2- og FLP-funktions-

I DK 175701 B1 I

I 40 I

dygtig (proficient). I

I Eksempel 10 I

Kloning af hirudinekspressionskassetter i pDP34 I

5 Plasmid pDP34 spaltes med BamHI. De klæbrige ender i I

restriktionsstedet udfyldes ved reaktion med Klenow DNA I

polymerase (T. Maniatis et al., "Molecular Cloning. A I

I Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). I

H DNA'et skæres yderligere med Sall, og 11,8 kb vektorfrag- I

10 mentet isoleres på en præparativ 0,6% agarosegel. DNA'et I

udvindes ved elektroeluering og fældning med ethanol. I

I Forskellige ekspressionskassetter klones i pDP34 vektor- I

I fragmentet mellem Sall- og [BamHIJ/kortendestederne. I

I Plasmid pJDB207/GAPFL-YHIR spaltes med Hindlll. De I

15 klæbrige ender omdannes til korte ender ved anvendelse af I

Klenow DNA polymerase. DNA'et fældes med ethanol og spal- I

I tes yderligere med Sall. 1,1 kb SalI-[ Hindlll ]/kortende- I

fragmentet indeholder den fuldstændige ekspressionskas- I

sette med pBR322 sekvenser, GAPFL promotoren, PH05 sig- I

20 nalsekvensen fusioneres i struktur til kodningssekvensen . I

(foretrukne gærkodons) for desulphatohirudin og PH05 I

transcriptionsstopfragmentet. 1,1 kb fragmentet isoleres I

på en præparativ 0,8% agarosegel, udvindes fra gelen ved I

elektroeluering og renses ved ionbytterchromatografi på I

25 DE52 og fældning med ethanol. 0,2 pmol af 1,1 kb frag- I

H mentet og 0,1 pmol af 11,8 kb vektorfragmentet ligeres i I

I 10 ftl 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM I

I ATP og 400 enh. T4 DNA ligase (Biolabs) i 16 timer ved I

15eC. En aliquot på 1 μΐ anvendes til transformation af E. I

I 30 coli HB101 Ca2+ celler. 5 transformerede, ampicillinre- I

I sistente kolonier analyseres. Plasmid DNA spaltes med I

BamHI og Sall/BamHI. En klon med de korrekte restriktions- I

I fragmenter udvælges og betegnes pDP34/GAPFL-YHIR (se fig. I

5). I

41 DK 175701 B1 På en tilsvarende måde klones 1,2 kb SalI-[ HindiII ]/kort-endefragmentet af pJDB207/GAPEL-YHIR (se eksempel 7) i pDP34 vektoren, hvilket resulterer i plasmid pDP34/GAPEL-5 -YHIR.

Plasmid pJDB207/PHQ5(-173)-HIR spaltes med Sall og EcoRl.

448bp Sall-EcoRI fragmentet isoleres som beskrevet. DNA fragmentet indholder Sall-BamHI-delen af pBR322 og den korte konstitutive PH05(-173)-promotor (se eksempel 8).

10 Plasmid pJDB207/GAPFL-YHIR spaltes med Hindlll. De klæbrige ender omdannes til kortender med Klenow DNA polymerase. DNA'et spaltes yderligere med EcoRl. 642 bp EcoRI-[Hindlll ]/kortendefragmentet isoleres. Det indeholder PH05 signalsekvensen, kodningssekvensen for 15 desulphatohirudin (med foretrukne gærkodons) og PH05 transcriptionsstopfragmentet. 0,2 pmol af henholdsvis 448 bp Sall-EcoRI fragmentet og 642 bp EcoRI-kortendefrag-mentet og 0,1 pmol af 11,8 kb SalI-[ BamHI ]/kortende-fragmentet ligeres. Aliquoter af ligeringsblandingen 20 anvendes til transformation af E. coli HB 101 Ca++ celler.

Plasmid DNA fra 12 tranformanter analyseres ved spaltninger med BamHI og Sall/BamHI. En klon med det korrekte plasmid udvælges og betegnes pDP34/PH05( -173)-YHlR (se fig. 6).

25 Eksempel 11

Andre ekspressionsplasmider for hirudingenet med E. coli kodons

Ekspresionsplasmider indeholdende det syntetiske gen for desulphatohirudin variant HV1 baseret på E. coli kodon 30 anvendelse konstrueres analogt med den i eksempel 10 beskrevne fremgangsmåde. 1,1 kb SalI-[ Hindlll ]/kortende-fragmentet af pJDB207/GAAPFL-HIR (europæisk patentansøgning nr. 225.633) isoleres og klones i vektor pDP34. Det dannede ekspressionsplasmid er pDP34/GAPFL-H!R indehol-

I DK 175701 B1 I

I I

dende det syntetiske gen for desulphatohirudin baseret på I

foretrukne E. coli kodons udtrykt under kontrol af den I

H konstitutive GAPFL promotor. I

5 Til en lignende konstruktion klones 1,1 kb I

I SalI-[ Hindlll ]/kortendefragmentet af pJDB207/PH05(173)- I

-HIR (se eksempel 8) i pDP34. Det dannede plasmid I

pDP34/PH05(-173)-HIR indeholder det syntetiske gen for I

desulphatohirudin (E. coli kodons) under kontrol af den ' I

10 korte konstitutive PH05(-173) promotor. I

Eksempel 12 I

Hirudinekspressionskassetten klonet i plasmid pDP92 I

Vektorer indeholdende den komplette 2-mikron sekvens I

H udtrykker ikke nødvendigvis alle funktionerne i den ægte I

I 15 gær 2-mikron cirkel. Åbne aflæsningsstrukturer kan blive I

ødelagt ved kloning. Da man hidtil ikke har kendt nogen I

I funktion for genproduktet af "D" aflæsningsstrukturen I

anvendes det entydige PstI sted i dette gen til kloning af I

I dLEU2 genet [Beggs, J.D. (1978) Nature 275, 104-109] eller I

I 20 indsætning af pUC19 vektordelen som i plasmid pDP31 (se I

i eksempel 9). For nylig er det blevet foreslået, at D gen- I

I I produktet regulerer ekspressionen af FLP genproduktet I

I [J.A.H. Murray et al. (1987) EMBO J. 6, 4205 ]. For at I

I udnytte 2-mikron cirklen fuldstændigt konstrueres en I

25 vektor, som er funktionsdygtig for alle de kendte 2-mikron I

I funktioner, inklusive D genproduktet. I

I a) Konstruktion af plasmid pDP92 (se fig. 7) I

I Plasmid pDP31 (eksempel 9) spaltes med PstI og Hpal, I

I hvorved der dannes tre fragmenter. Plasmid pK19 [til- I

I 30 vejebringer kanamycinresistens, Pridmore, R.D. (1987) Gene I

I 56, 309-312] lineariseres med Smal. DNA fragmenterne fra I

I begge spaltninger ekstraheres med phenol og fældes med I

43 DK 175701 B1 ethanol. DNA fragmenterne blandes og ligeres. Ligeringsblandingen transformeres [Hanahan, D.J. (1983) Moi. Biol.

166, 557-580 ] til kompetente E. coli JM109 celler 5 [ Yanisch-Perron, C. et al. (1985) Gene 33, 103-119 ] ud trykt i 2 timer ved 37“C i LB medium, hvorpå de udplades på LB agarplader tilsat 50 μg/ml kanamycin, 30 μg/ml XGal og 7 Mg/mi iptg.

12 Hvide, kanamycinresistente kolonier dyrkes. Plasmid DNA 10 analyseres ved spaltninger med Xbal og BamHI/Kpnl. En enkelt koloni, som har mistet pUC19 vektordelen af pDP31, men bevaret 2-mikron D aflæsningsstrukturen ved relige-ring af PstI stedet, og som har pK19 plasmidet kortendeindsat i Hpal stedet, betegnes pDP91. Plasmidet indehol-15 der det store Hpal-PstI fragment og det lille Pstl-Hpal fragment af 2-mikron plasmid klonet i Smal stedet i pK19.

Ved religering af PstI stederne gendannes D aflæsningsstrukturen .

URA3 genet isoleres på et 1,17 kb Hindlll fragment fra 20 plasmid pDP34 (se eksempel 9) og klones i det entydige Hindlll sted i plasmid pUC12. En klon med URA3 genet indsat i den samme orientering som ampicillinresistens-genet betegnes pUC12/URA3. Plasmid pDP91 og pUC12/URA3 spaltes begge med SacI og BamHI, hvorved begge danner to 25 fragmenter. DNA fragmenterne blandingsligeres og anvendes til transformation af kompetente E. coli JM109 celler.

Celler udplades på LB agar plader tilsat 100 ^g/ml ampicillin, 30 μg/ml XGal og 7 μg/ml IPTG.

12 Hvide, ampicillinresistente kolonier dyrkes. Plasmid 30 DNA analyseres ved spaltninger med Hindlll og PvuII. En enkelt klon betegnes pDP92, og den indeholder den fuldstændige 2-mikron sekvens funktionsdygtig for alle dens kendte funktioner og URA3 genet klonet i pUC vektoren.

I DK 175701 B1 I

I I

b) Kloning af hirudinekspressionskassetter i pDP92 I

H Analogt med den ovenfor i eksempel 10 beskrevne frem- I

H gangsmåde spaltes pDP92 med BamHI. De klæbrige ender I

H 5 udfyldes ved eir reaktion med Klenow DNA polymerase. DNA'et I

H skæres yderligere med Sall. 10,2 kb vektorfragmentet I

isoleres. 1,1 kb SalI-[ Hindlll ]/kortendefragmentet af I

plasmid pJDB207/GAPFL-YHXR isoleres og ligeres til I

vektorfragmentet. I

10 6 Transformerede, arapicillinresistente kolonier I

analyseres. Plasmid DNA spaltes med BamHI, PstI og I

Sall/BamHI. En klon med de forventede restriktions- I

fragmenter udvælges og betegnes pDP92/GAPFL-YHIR. På I

I i tilsvarende måde fremstilles plasmid pDP92/GAPEL-YHIR I

15 under anvendelse af 1,2 kb SalI-[ Hindlll ]/kortende- I

I fragmentet af pJDB207/GAPEL-YHIR (se eksempel 7). I

I Plasmid pDP92/PH05(-173)-YHIR konstrueres som beskrevet i I

I eksempel 10 under anvendelse af 10,2 kb SalI-[BamHI ]/kort- I

ende pDP92 vektorfragmentet (se ovenfor). I

I 20 Eksempel 13 I

I Konstruktion af 2-mikron DNA-frie Saccharomyces cerevisiae I

I værtsstammer I

I i Til fjernelse af det endogene 2-mikron plasmid indføres i I

et første trin en sletning i URA3 genet fra stamme HT246 I

I ' 25 (DMS 4084, a, leu 2-3, leu 2-112, prb) for at gøre stammen I

I åuxotrof for uracil. HT246 transformeres med 1 /ig plasmid I

I YeP12 [Broach, J.R. Strathern, J.N., Hicks, J.B. (1979) I

I Gene 8, 121-123 ] under anvendelse af transformations- I

I metoden beskrevet af Hinnen et al. [ Proc. Natl. Acad. I

I 30 Sci. USA 75, 1929 (1978)]. 10 μg plasmid pUC12ura3A

I indeholdende en sletning i URA3 genet [Sengstag, Ch., I

45 DK 175701 B1

Hinnen, A. (1987) Nucleic Acids Research lj>, 233-246 ] tilsættes sammen med plasmid YEP13. Omkring 3000 leucin prototrofe transformanter resuspenderes i 5 ml minimal 5 medium (Difco Yeast Nitrogen Base uden aminosyrer tilsat 2% glucose, 0,1% leucin, 0,1% uracil og 0,25% fluororot-syre) i en lille rystekolbe og inkuberes i 60 timer ved 30°C og 180 opm. Transformanter, som vokser, er resistente mod den toksiske analoge fluororotsyre og bærer derfor 10 en ombytning i det chromosomale URA3 gen med ura3A. De dyrkede celler udplades på et fuldstændigt medium med følgende sammensætning (g/1): Pepton 20, gærekstrakt 10, glucose 20, og efter vækst i 48 timer ved 30°C foretages kopiudpladning på minimal medium (Difco) yeast nitrogen 15 base uden aminosyrer. Tilsat 2% glucose og 0,1% leucin) til påvisning af uracil auxotrofer. Flere auxotrofer udtages og testes for plasmid YEP13 tab, som tilvejebringer leucin auxotrofi. En enkelt koloni (betegnet Tr889), som kræver leucin og uracil, udtages og anvendes til 20 yderligere forsøg.

Tr899 transformeres med plasmid pDP38 (udvundet fra plasmid pDP34 ved spaltning med Sphl og religering af det dannede 8,4 kb fragment, se fig. 4), som bærer begge markørgener LEU2 og URA3 (transformationsraetode, oven-25 for). Transformerede gærceller selekteres først på gær-minimalmedieplader, som mangler uracil, tilsat leucin, hvorpå der fremstilles kopiplader på minimalmedium, som mangler leucin, men som er tilsat uracil. 10 kolonier, som vokser svagt, udtages og dyrkes hver for sig i fuldstæn-30 digt flydende medium (supra) over ca. ethundrede generationer. På denne måde mister cellerne pDP38 plasmidet og i et vist omfang samtidig også det endogene 2-mikron plasmid.

10 uracil- og leucin-krævende kolonier udtages, der 35 fremstilles DNA, DNA'et spaltes fuldstændigt med PstI og testes med 32p_mærjce-{; gær 2-mikron DNA ved Southern blots.

I DK 175701 B1 I

I I

I Et isolat uden noget hybridiseringssignal betegnes H449 I

I (a, leu2-3, Ieu2-ll2, ura3A, prb, cire), et isogenisk I

I 2-mikron frit (cire) derivat af gærstamme HT246.

I 5 Eksempel 14

I Fremstilling af en kexl variant af S. cerivisiae H449 ved I

I afbrydelse af det genomiske KEXl-gen

I Carboxypeptidase ysca aktivitet fjernes fra S. cerevisiae I

stamme H449 (prb, Leu2, ura3, cir°) ved afbrydelse af det I

I 10 genomiske KEX1 gen. Til dette formål identificeres KEXl I

genet i et genomisk gærbibliotek og klones i en egnet I

I vektor. URA3 genet, der tjener som selektiv markør, ind- I

I sættes i strukturgenet for KEX1 for at afbryde dets aflæs- I

I ningsstruktur. Hybridplasmid DNA'et indeholdende URA3 I

I 15 genet flankeret på begge sider med KEXl sekvenser indføres I

I i Ura~ gærstammen H449. Sekvenshomologien af KEX1 genet I

I på plasmidet og på chromosomet tillader in vivo rekombina- I

I tion,· hvilket omdanner gærceller fra Ura- til Ura+ og I

I samtidig fra KEX1 til kexl. Stammer med et afbrudt kexl I

I 20 gen syntetiserer ikke et funktionelt ysca protein. I

I Genet, som koder for KEXl, klones fra et genomisk I

gærbibliotek [i den centromere shuttle vektor pCS19, I

I Sengstag, C. et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15, 233] ved I

I kolonihybridisering méd en KEX1 specifik oligonucleo- I

I 25 tidprobe. Sekvensen af oligonucleotidet I

I 5' -GTCGAATCCGGCCCTTTTAGGGTGAATTCA- 3' I

I er afledt ud fra den publicerede KEXl sekvens [jf· I

I Dmochowska, A. et al. (1987) Cell 50, 573] og udvalgt af I

I hele sekvensen på grund af dens særlig lave homologi til I

I 30 sekvensen af yscY. Det hybridiserer til KEX1 DNA ovenfor i I

I EcoRV restriktionsstedet, som anvendes til indsætning af I

I URA3 genet. Det samme nucleotid kan anvendes som en I

47 DK 175701 B1 sekvenseringsprimer til bekræftelse af URA3 fragmentindsættelsen. Dette syntetiske oligonucleotid mærkes radioaktivt og anvendes til screening af genbiblioteket.

5 Ca. 10.000 kloner [5 x 2000 kloner/plade = 140 mm) ] screenes ved kolonihybridisering [jf. Woods, D.E. et al.

(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5661 og Whitehead A.S. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5387].

Fra to gentagne screenings isoleres 5 uafhængige positive 10 kloner. En af disse betegnes pKEXl. Til udskæring af et KEXl specifikt Hindlll-BamHI fragment (1380bp) spaltes pKEXl plasmid DNA’et med de tilsvarende to endonucleaser.

Det respektive fragment overføres til Bluescript vektoren M13+ med SK poly linker, og denne klon sekvenseres under 15 anvendelse af . en universal primer for M13 vektoren til bekræftelse af KEXl fragmentet og betegnes pKEXlMl3.

Plasmidet pUC12/URA3 (se eksempel 12a) indeholdende URA3 genet klonet som Hindlll fragment spaltes med Hindlll til i isolering af 1170bp Hindlll fragmentet [jf. Rose, M. et 20 al. (1984) Gene 29, 115]. Fragmentets klæbrige ender udfyldes med Klenow polymerase til dannelse af korte ender. Samtidig lineariseres plasmid ρΚΕΧ1Μ13 ved spaltning med endonucleasen EcoRV, hvorved KEXl Hindlll--BamHl fragmentet skæres og dephosphoryleres med 25 alkaliphosphatase for at undgå selv-ligering. Derefter blandes disse to DNA fragmenter, hvorpå de ligeres og overføres i E. coli stamme JN1103. Transformanterne analyseres ved dobbeltspaltninger med Hindlll og BamHl, hvor størrelsen af det pågældende Hindlll-BamHI fragment 30 stiger fra 1380bp til 2550bp. DNA fra én korrekt klon sekvenseres under anvendelse af det ovenfor beskrevne oligonucleotid som sekvenseringsprimer til bekræftelse af indsættelsen af URA3 fragmentet i KEXl genet ved positionen for EcoRV skæringsstedet. Plasmidet betegnes 35 pKEXlM13-URA3.

I DK 175701 B1 I

I 48 I

H

I PKEX1M13-URA3 DNA1 et spaltes med Hindlll og BamHI til I

I udskæring af KEX1-URA3. hybridfragmentet, og uden adskil- I

I lelse fra vektoren indføres det i S. cerevisiae stamme I

5 H449 i overensstemmelse med den ovenfor beskrevne frem- I

I gangsmåde (se eksempel 3). Efter isolering af membran- I

I fraktionen fra Ura3+ transformanterne måles aktiviteten af I

I ysca under anvendelse af et chromogensubstrat (se eksempel I

Η 1). En enkelt transformant, som ikke udviser proteaseak- I

10 tivitet for ysca, betegnes S. cerevisiae H449kexl. I

Eksempel 15 I

I Transformation af S. cerevisiae stamme H449kexl I

Saccharomyces cerevisiae stamme H449kexl transformeres med I

H plasmider I

I pDP34/PH05(-173)-HIR I

I pDP34/GAPFL-HIR I

I pDP34/GAPEL-HIR I

I pDP34/PH05(-173)-YHIR I

I PDP34/GAPPL-YHIR I

I pDP 34/GAPEL-YHIR I

I pDP92/PH05(-173)-YHIR I

pDP92/GAPFL-YH1R I

I PDP92/GAPEL-YHIR I

15 under anvendelse af transformationsmetoden beskrevet af I

I Hinnen' et al. (ovenfor). Transformerede gærceller selek- I

teres på gærminimal mediumplader tilsat leucin, men uden I

I uracil. Enkelte transformerede gærceller isoleres og- I

H betegnes I

49 DK 175701 B1

Saccharomyces cerevisiae H449kexl /pDP34/PH05(-1 73)-HIR -1·

Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPFL-HIR Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPEL-HIR Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/PH05(-l73)-YHIR Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPFL-YHIR Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPEL-YHIR Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP92/PH05(-173)-YHIR Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP92/GAPFL-YHIR Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP92/GAPEL-YHIR

Eksempel 16

Fermentering af transformerede gærstammer i laboratorie-I målestok 5 Celler af Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/PH05 -(-173)-YHIR og af Saccharomyces cerevisiae H449kexl/-pDP34/GAPFL-YHIR dyrkes hver for sig i to på hinanden følgende forkulturer af 10 ml minimal medium med følgende sammensætning (g/1): 10 Difco Yeast Nitrogen Base 6,7 asparagin 10 leucin 1 glucose 20

Den første forkultur dyrkes i 60 timer ved 28®C og 180 15 opm. Den anden forkultur inokuleres med 2% af den første forkultur og inkuberes i 24 timer ved 28®C og 180 opm.

Hoveddyrkningsmediet har følgende sammensætning (g/i):

I.. DK 175701 B1 I

Η

I 50 I

I gærekstrakt 49 I

glucose 5 I

I fructose 57 I

I 5 NH4NO3 0,5 I

I MgS04 * 7H20 1,0 I

I CaC03 5,0 I

I Ca3(P04)2 2,0 I

I Hovedkulturen inokuleres med ca. 2 x 10^ celler/ml og I

I 10 inkuberes i op til 72 timer ved 28°C og 180 opm. Ved I

I fermenteringens afslutning er der opnået ca. 1 x 10^ I

I celler/ml. Til forskellige tidspunkter under fermente- I

I ringen udtages aliquoter af kulturerne, cellerne fjernes I

I ved centrifugering, og kultursupernatanterne analyseres I

I 15 fra desulphatohirudin ved hjælp af HPLC (se nedenfor). I

I Eksempel 17 I

I Produktion af desulphatohirudin variant HV1 i 50 1 måle- I

I stok I

I En arbejdende cellebank af den 2-mikron fri stamme I

20 Saccharomyces cerevisiae H449kexl/pDP34/GAPFL-YHIR I

i anvendes som podekilde ved produktionen af desulphato- I

I ! hirudin i 50 1 målestok. I

Ampuller af den arbejdende cellebank konserveres i damp- I

I fasen i en beholder med flydende nitrogen. Indholdet af I

I 25 én ampul anvendes til at pode en rystekolbekultur, som I

I indeholder et selektivt medium med følgende sammensætning I

I (g/1): I

yeast nitrogen base 8,4 I

I L-asparagin-monohydrat 11,4 I

I 30 L-histidin 1,0 I

L-leucin 0,1 I

D-glucose-monohydrat 20,0 I

* . . DK 175701 B1 51

500 ml kolben indeholder 100 ml medium og inkuberes i 48 timer ved 28eC på et rysteapparat med en rystehastighed på 180 opm. . I

5 Den anden rysteflaskeforkultur indeholder det samme medium, hvoraf 600 ml er indeholdt i en 2 1 kolbe, som har I

fire prelplader. Podemængden fra den første forkultur er I

5% (30 ml), og kolberne inkuberes i 48 timer ved 28°C på I

et rysteapparat med en hastighed på 120 opm.

10 En tredje forkultur fermenteres i en 50 1 bioreaktor af I

rustfrit stål forsynet med fire prelplader og en enkelt I

skiveturbineomrører med en diameter på 115 mm. Det oven- I

for anførte medium anvendes også til denne kultur, og I

startrumfanget er 30 1. En enkelt 2 1 kolbe indeholdende 1

15 600 ml kultur anvendes til podning af 50 1 reaktoren (2%). I

Fermenteringen varer ca. 42 timer ved en temperatur på I

28*C. Der anvendes en omrørerhastighed på 600 omdr/min., I

en beluftningsrate på 1 wm, og reaktoren drives ved et I

overtryk på 0,3 bar. I

20 Til desulphatohirudinproduktionstrinnet anvendes en I

lignende 50 1 bioreaktor, som desuden er udstyret til I

fed-batch processer. Til dette trin (30 1) anvendes et I

medium med følgende sammensætning (g/1): I

kødpepton (Merck) 5,0 I

25 gærekstrakt 30,0 I

ammoniumsulfat 6,0 , I

magnesiumsulfat-heptahydrat 1,0 I

natriumchlorid 0,1 I

kaliumdihydrogenphosphat 1,0 I

30 D-glucose-monohydrat 10,0 I

Mængden af podematerialet fra det tredje forkulturtrin er I

eventuelt 2%. Fermenteringen varer i 48 timer ved en I

temperatur på 28°C, og omrørerhastigheden er 750 opm. I

I DK 175701 B1 I

I I

I Overtrykket indstilles i begyndelsen på 0,3 bar, men det I

I kan hæves til 1,0 bar under fermenteringen for at opret- I

I holde koncentrationen af opløst oxygen over 20%'s mæt- I

I 5 ning. Begyndelsesbeluftningen er 0,25 wm, men hæves til 1 I

I wm efter 9 timer for at sikre passende oxygentilfør- H

I sei. I

I pH-Værdien falder under den indledende del af fermente- I

I ringen til pH 5,0, og denne pH-værdi opretholdes ved I

10 automatisk tilsætning af ammoniumhydroxid. H

I Ved simpel batch dyrkning afhænger den opnåede .mængde I

biomasse og dermed desulphatohirudinindholdet af mængden I

af carbonkilden, som er tilsat fermenteringsbeholderen ved I

I begyndelsen. Denne er igen bestemt af bioreaktorens I

I 15 oxygenoverførselskapacitet og nødvendigheden er at undgå I

I overdreven produktion af ethanol af den voksende gær. I

I Disse begrænsninger kan undgås ved at anvende fed-batch I

I teknik. Begyndelsesmediet indeholder således temmelig lidt I

glucose, men der tilsættes glucose for at understøtte en I

20 væsentlig højere biomasseslutkoncentration og et desul- I

H phatohirudinindhold, som er ca. tre gange så stort som I

I det, der opnås ved batch dyrkning. I praksis forøges H

I tilsætningen af glucosemonohydrat trinvis til en sluttil- I

førselsrate på 175 g/time. I

25 Der anvendes tilsætning af små mængder siliconebaseret . I

H antiskummiddel for om nødvendigt at regulere skumning. En I

del af afgangsgassen fra fermenteringsreaktoren analyseres I

til opnåelse af oplysning om oxygenoptagelsen og carbon- I

dioxiddannelsesraten. Koncentrationen af opløst oxygen I

30 måles on-line under anvendelse af en steriliserbar elek- I

I trode. I

Der udtages prøver med 5 timers mellemrum under hele I

procesforløbet for at sikre måling af glucose- og I

ethanolkoncentrationerne, desulphatohirudinindholdet ved I

DK 175701 B1 i 53 .

hjælp af bioanalyse og HPLC og tillige for at kontrollere steriliteten. Ved hjælp af HPLC konstateres det,’ at det dannede desulphatohirudin er praktisk taget frit for 5 C-terminalt afkortede analoger. Ved afslutningen af fermenteringsprocessen kan desulphatohirudin udvindes fra kultursupernatanten.

Eksempel 18

Udvinding af desulphatohirudin fra S. cerevisiae dyrket i 10 50 1 målestok

Dyrkningsvæsken (se eksempel 17) blandes med "Amberlite"®

XAD-7, og adsorptionen gennemføres i ca. 4 timer ved 25eC. Cellerne isoleres fra harpiksen i en kolonne. Efter vask-ning med 1 M NaCl elueres harpiksen med Tris puffer (50 15 mM, pH 7,0-8,5). Hovedfraktionen (30 1) indstilles på pH

2,9 og sættes på en S-Sepharose kolonne (Amicon PA, ækvi- I libreret med ammoniuraformiatpuffer 25 mM, pH 2,9) med et lagrumfang på 2 1. Efter vaskning med ammoniumformiat- puffer (40 mM, pH 3,6) foretages eluering med ammonium-20 formiatpuffer (50 mM, pH 3,8). Hovedeluatfraktionen (10 1) koncentreres ved hjælp af et Filtron Minisette ultrafiltreringssystem forsynet med en Ω 3k membran. En 0,5 1 aliquot af den dannede klare proteinopløsning sættes på en Bio-Gel P-6 fine kolonne (Amcon GF ækvilibreret med 0,5%'s 25 eddikesyre) med et lagrumfang på 1,5 1. Der foretages eluering med 0,5%’s eddikesyre. Hovedeluatfraktionen (1 1) koncentreres ved ultrafiltrering, hvorefter den sættes på en Q-Sepharose fast flow kolonne (Amicon PA, ækvilibreret med ammoniumformiatpuffer 25 mM, pH 2,9) med et lagrumfang 30 på 2 1. Elueringen gennemføres med ammoniumformiatpuffer (50 mM, pH 4,2). Hovedeluatfraktionen koncentreres ved ultrafiltrering, hvorpå der diafiltreres mod vand. Den dannede klare vandige opløsning lyofiliseres. Det faste stof består af rent desulphatohirudin, som ikke indeholder 35 påviselige mængder C-terminalt afkortede analoger.

I DK 175701 B1 I

I I

I Eksempel 19 I

I Afbrydelse af PRA1 genet 1 S. cerevisiae H 449 I

S. cerevisiae stamme H 449 (DSM 4413, prb, leu2, ura3, I

I 5 cir°) gøres deficients med hensyn til flere proteaser ved I

I hjælp af genafbrydelse. Genafbrydelse har sammenlignet med I

I meiotiske krydsninger den fordel, at der stabilt indføres

I en mutation, medens den genetiske baggrund holdes identisk I

I for en given stamme.

I 10 I et første trin elimineres proteinase yscA aktivitet ved I

afbrydelse af PRA1 genet [Ammerer, G. et al. (1986) Mol. I

I Cell. Biol. 6, 2490]. PRA1 isoleres fra total genomisk gær I

I DNA spaltet med SacI og Pstl. 2 kb fragmenter isoleres fra I

I en præparativ 0,6% agarosegel, elektroelueres og ligeres I

I 15 t.il Pstl-SacI stederne på polylinkerområdet af pUC19. I

I Vektoren transformeres til E. coli JM 109, og der udtages I

280 enkelte kolonier. Kolonierne dyrkes hver for sig i I

huller i mikrotiterplader indeholdende LB +amp medium. Der I

H gennemføres kolonihybridisering i alt væsentligt som I

I 20 beskrevet [Woods, D.E. et al. (1982) Proc. Natl. Acad. I

Sci. USA 79, 5651 ] med følgende 32p-mærkede' oligonucleo- I

tidprobe I

I 5'- AAGCCTAGTGACCTAGT - 3' I

som er afledt af den publicerede PRA1 sekvens [Ammerer et I

I 25 al., se ovenfor]. 3 positive kloner udtages, DNA fra den I

I ene - pUC19/PRAl - skæres med SacI og Xhol, og 1,9 kb I

fragmentet indeholdende hele PRA1 genet underklones i KS I

I polylinkerområdet af Bluescript vektoren M13+ (Stratagene I

I Cloning Systems, San Diego, CA, USA). Et 1,2 kb Hindlll I

I 30 fragment indeholdende hele URA3 genet [Rose, M. et al. I

I (1984) Gene 29, 113] indsættes i det entydige Hindlll I

I sted i kodningsområdet af PRAl-insertet. Det dannede I

I plasmid betegnes M13+/pral::URA. M13+/pral::URA3 spaltes I

55 DK 175701 B1 med Saci/Xhol, og 3,1 kb fragmentet anvendes uden adskillelse fra vektoren til transformation af S. cerevisiae H 449 som beskrevet (se eksempel 3). Uracil uafhængige 5 transformanter udtages, DNA fremstilles og spaltes med Saci/Xhol og kontrolleres for den korrekte PRA1 genafbrydelse ved Southern blotting. En transformant med den korrekte forskydning af Saci/Xhol fragmentet som hybridi-serer med PRA1 fra 1,9 kb til 3,1 kb, betegnes Tr 1186.

10 I det efterfølgende trin gøres Tr 1186 - med afbrydelsen i dets PRA1 gen ved hjælp af pral::URA3 - igen uracilaf-hængigt ved indføring af en sletning i pral::URA3 genin-sertet. Tr 1186 transformeres med 1 μg plasmid YEpl3 [Broach, J.R. et al. (1979) Gene 8, 121) sammen med 10 ^g 15. plasmid pUCl2ura3delta indeholdende en 200 bp sletning i URA3 genet [Sengstag, C. et al. (1978) Nucleic Acids Research 3J5, 233 ]. 3000 leucinprototrofe gærtransfor- manter resuspenderes i 5 ml minimalmedium (Difco yeast nitrogen base uden aminosyrer tilsat 2% glucose, 0,1% 20 leucin, 0,1% uracil og 0,25% fluororotsyre) i små rystekolber, og der inkuberes i 60 timer ved 30°C og 180 opm.

Voksende transformanter er resistente mod den toksiske analoge fluororotsyre og bærer derfor en erstatning i pral::URA3 området med ura3delta. De voksende celler 25 udplades på fuldstændig medium med følgende sammensætning (g/1): Pepton 20, gærekstrakt 10,. glucose 20, og efter vækst i 48 timer ved 30eC foretages kopiudpladning på minimalmedium (Difco yeast nitrogen base uden aminosyrer, men tilsat 2% glucose og 0,1% leucin) til påvisning af 30 uracil auxotrofer. Flere auxotrofer udtages og testes for plasmid YEpl3 tab, der tilvejebringer leucin auxotrofi. En enkelt koloni, som betegnes Tr 1195, og som kræver leucin og uracil, udtages og anvendes til de fortsatte forsøg.

I DK 175701 B1 I

I I

I Eksempel 20 I

I Afbrydelse af PRC1 genet i Tr 1195 I

I Derefter elimineres carboxypeptidase yscY aktivitet i Tr I

5 1195. PRC12, som koder for yscY [Rothman, J.H. et al. I

I (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA B3, 3248], isoleres fra I

det genomiske gærbibliotek i den centromere vektor pCS19 I

I [Sengstag, C. et al. (1978) Nucleic Acids Research 15, I

I 233 ] ved kolonihybridisering med 2 syntetiske oligonucleo- I

I 10 tider I

I I 5' -GAAAGCATTCACCAGTTTACTATGTGG -3' og I

I 5 ’-CGAATGGATCCCAACGGGTTTCTCC -3’ I

i I

I svarende til 5'- og 3’-enden af PRC1 kodningssekvensen. En I

I positiv klon betegnes pCS19/cpy8. pCS19/cpy8 DNA spaltes I

I 15 med Clal/Pvull, sættes på 0,6% præparativ agarosegel, og I

I et 2,6 kb fragment isoleres og elektroelueres. Dette I

I Clal/Pvull fragment, som indeholder hele PRC1 genet, I

I underklones yderligere i Narl/Smal stederne i pUC19. Det I

I dannede plasmid pUC19/PRCl skæres ved det entydige Stul I

I . 20 sted, hvortil 1,2 kb URA fragmentet (se eksempel 19) I

I ligeres. Til dette formål udfyldes de klæbrige Hindlll I

I ender af det URA3 holdige fragment i en reaktion med . I

I Klenow DNA polymerase for at opnå tilpasning til det I

I kortendede Stul-sted i pUC/PRCl. I

I 25 Det dannede plasmid pUC19/prc::URA3 spaltes med Aatll, og I

I Aatll fragmentet anvendes uden adskillelse fra vektoren I

I til transformation af S. cerevisiae Tr 1195 som beskrevet. I

I En uraciluafhængig transformant - Tr 1206 - testes for I

I korrekt PRC1 genafbrydelse ved Southern blotting, hvorpå I

I 30 den atter gøres uracilafhængig som beskrevet (se eksempel I

I 19). Den dannede S. cerevisiae stamme betegnes Tr 1210 I

I (pral, prbi, prel, ura3, leu2, cire). I

57 DK 175701 B1

Eksempel 21

Fremstilling af en kexl variant af S. cerevisiae Tr 1210

Carboxypeptidase yscor aktivitet elimineres fra S. cerevi-5 siae stamme 1210 ved afbrydelse af det genomiske KEX1 gen som beskrevet (se eksempel 14). Den dannede S. cerevisiae stamme, som ikke udviser nogen ysca proteaseaktivitet, betegnes Tr 1302 (pral, prbi, prel, ura3, leu2, cir°, kexl).

10 Eksempel 22

Konstruktion af hirudin mutanter HV1-KR, HV1-SFRY,

HVl-WQLR

Til yderligere bedømmelse af ysca formidlet C-terminal nedbrydning af heterologe proteiner med forskellige 15 C-terminale aminosyrer dannes hirudinmutanter, som har forskellig C-terminal aminosyresammensætning. Som almen metode anvendes sted-rettet in vitro mutagenese, der i princippet er beskrevet [Bio-Rad Muta-Gene M13 kit,

Bio-Rad, Richmond, Ca. USA].

20 Følgende mutanter konstrueres: 1. HV1-KR, svarende til [Lys64-Arg65jhirudin variant 1 2. HV1-SFRY, svarende til [Ser^2_phe63-Arg^4-Tyr^5 ]HV1 < 3. HVl-WQLR, svarende til [Trp62-Glu63-Leu64-Arg65 ]nvi.

Aminosyresekvenserne for alle hirudinmutanterne svarer til 25 aminosyresekvensen for hirudinvarinat 1 op til henholdsvis aminosyre 61 og 63.

I HV1-SFRY er C-terminalen identisk med atrial natriu-retisk peptid [Vlasuk et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 4789-4796 ], og i HV1-WQLR svarer C-terminalen til 30 epidermal vækstfaktor Γ George-Nascimento, C. et al. (1988) ^ i

I DK 175701 B1 I

I I

Biochemistry 27, 797-802 ], der begge er kendt for at være I

I nedbrudt C-termimalt af proteaseholdige vildtype gærstam- I

I mer. I

I 5 I et første trin spaltes plasmid pJDB207/GAPFL-HIR (som I

I beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 225.633) med I

I Sall-Hindlll, hvorved der fås et 1,2 kb fragment, der I

I indholder fuld længde hirudinekspressionskassetten. 1,2 kb I

I Sall-Hindlll fragmentet underklones i Sall-Hindlll skåret I

I 10 Bluescript M13+ med SK polylinkeren. Det dannede plasmid I

I M13+/HV1 overføres til E. coli CJ 236 for at inkorporere I

I uracil som beskrevet (Bio-Rad Muta-Gene M13 kit, se I

I ovenfor). Enkelt-strenget DNA fra transformeret E. coli CJ I

I 236 isoleres under anvendelse af M13 hjælperfag I

15 (Stratagene, se ovenfor). I

Til konstruktion af HV1-KR anvendes mutageniserings- I

primeren I

I 5'-CCGGAAGAATACAAGAGGTAGGATCCT-3’. I

I Til HVl-SFRY anvendes mutageniseringsprimeren I

I 20 5’ -GAAGAAATCCCGGAATCTTTCAGATACTAGGATCCTGGTACG-3 ’ . I

I Til HV1-WQLR anvendes mutageniseringsprimeren I

I 5’-GAAGAAATCCCGGAATGGGAACTGAGATAGGATCCTGGTACG-3’. I

I 200 pmol af hver primer phosphoryleres først i et samlet I

rumfang på 30 μΐ indeholdende 3 μΐ 1 M Tris-HCl pH 8,0, I

I 25 0,3 μΐ 1 M MgCl2, 0,75 μΐ 0,2 M DTT, 0,6 μΐ 20 mM ATP. 4,5 I

I enhder T4 polynucleotidkinase tilsættes, og blandingen I

I inkuberes ved 37°C i 45 minutter og ved 65eC i 10 minut- I

I ter. I

I De phosphorylerede oligonucleotider annelleres derefter I

I 30 til skabelon DNA’et under følgende betingelser: 0,1 pmol I

I uracilholdig DNA afledt af M13+/HV1 inkuberes med 2 pmol I

I phosphoryleret primer i et samlet rumfang på 10 μΐ annel- I

I leringspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 2 mM MgCl2/ 50 mM I

I NaCl). Blandingerne opvarmes i et vandbad til 80*C, hvor- I

59 DK 175701 B1 efter de henstår til langsom afkøling til stuetemperatur .

Derefter fremstilles komplementære strenge under følgende 5 betingelser: 10 μΐ af hver annelleringsblanding inkuberes med 4 μΐ 2 mM dNTP'er, 0,75 /ti 20 mM ATP, 0,75 μΐ 0,5 M Tris-HCl pH 7,4, 0,75 /ti 0,1 M MgCl2, 2,15 μΐ 0,2 M DTT, 1 enhed T4 DNA polymer ase og 2 enheder T4 DNA ligase. Reaktionsblandingen inkuberes først på is i 5 minutter, 10 derefter ved 25°C i 5 minutter og til slut ved 37®C i 90 minutter. De dannede dobbeltstrengede DNA'er transformeres til E. coli JM 101, som er en stamme, der effektivt fjerner den uracilholdige skabelon, hvorved den mutagenise-rede komplementære streng bliver tilbage til kopiering 15 (Bio-Rad ovenfor). Der fremstilles plasmider, som kontrolleres for fravær af PstI stedet, som kun bør forekomme i de sidste to codons i ikke-mutageniseret vildtype HV1 DNA.

Korrekt mutagenese bekræftes endvidere ved sekvensering af 20 de nye hirudinmutanter under anvendelse af følgende primer: 5’-GAAGGTACCCCGAAACCGCA-3* som svarer til hirudinkodningssekvensen ca. 20 bp foran mutageniseringspriraerne.

25 Til sidst udskæres de tre mutageniserede Sall-Hindlll fragmenter fra Bluescript M13+, hvorpå de religeres i Sall-Hindlll stederne på pJDB207.

De tre nye plasmider betegnes 1. pJDB207/GAPFL-HV1-KR j

30 2. pJDB207/GAPFL-HVl-SFRY

3. pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR

For at kunne transformere cir® stammer, såsom Tr 1302 (se eksempel 21 ovenfor) subklones hirudinmutanterne even-

I DK 175701 B1 I

I 60 I

tuelt i den fuldstændige 2 mikron-vektor pDP34 (se eksem- I

H pel 9 ovenfor). pDP34 skæres ved det entydige BamHl sted, I

og de klæbrige ender udfyldes med Klenow DNA polymerase I

5 til dannelse af korte ender. Sall-Hindlll fragmenterne fra I

Bluescript M13+, som koder for de muterede hirudinsekven- I

ser (ovenfor), gøres også kortendede og ligeres i det I

H kortendede (BamHl) sted i pDP34. De dannede piasmider I

betegnes I

10 1. pDP34/GAPFL-HVl-KR I

I 2. pDP34/GAPFL-HVl-SFRY I

I ,3. pDP34/GAPFL-HVl-WQLR I

I Eksempel 23 I

Transformation af S. cerevisiae stammer BYSKEX1 og BYSkexl I

I 15 nted PJDB207/GAPFL-HIR, PJDB207/GAPFL-HV1-KR, I

I PJDB207/GAPFL-HV1-SFRY og PJDB207/GAPFL-HV1-WQLR og af S. I

I cerevisiae stamme Trl210 og Trl302 med pDP34/GAPFL-HVl-KR, I

I PDP34/GAPFL-HV1-SFRY og pDP34/GAPFL-HVl-WQL'R I

I pJDB207/GAPFL-HVl-KR, pJDB207/GAPFL-HVl-SFRY, pJDB207/- I

I 20 GAPFL-HV1-WQLR og pJDB207/GAPFL-HIR transformeres S. I

I cerevisae BYSKEX1 (=DSM 4583) og BYSkexl under anvendelse I

I af standardmetoden og leucinselektion (se eksempel 3). På I

I samme måde transformeres pDP34/GAPFL-HVl-KR, pDP34/GAPFL- I

I -HV1-SFRY og pDP34/GAPFL-HVl-WQLR til S. cerevisiae I

I 25 stammer Trl2l0 og Trl302. I

I De dannede stammer betegnes som følger: I

DK 175701 B1 I

S. cerevisiae BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HIR I

S. cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/GAPFL-HVl-KR - I

S. cerevisiae BYSKEXl/pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY

S. cerevisiae BYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HVl-WQLR I

S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPFL-HIR I

S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPFL-HVl-KR I

S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPFL-HVl-SFRY I

S. cerevisiae BYSkexl/pJDB207/GAPFL-HVl-WQLR I

S. cerevisiae Trl210/pDP34/GAPFL-HVl-KR I

S. cerevisiae Trl210/pDP34/GAPFL-HVl-SFRY I

IS. cerevisiae Trl210/pDP34/GAPFL-HVl-WQLR

S. cerevisiae Trl302/pDP34/GAPFL-HVl-KR

S. cerevisiae Trl302/pDP34/GAPFL-HVl-SFRY

S. cerevisiae Trl302/pDP34/GAPFL-HVl-WQLR

Fermentering af S. cerevisiae stammerne gennemføres 1' minimal medium (for- og hovedkultur) som beskrevet (se eksempel 17).

5 Eksempel 24

Analyse af hirudlnvariant HV1 og dets mutanter fra fermenteringskulturer af Saccharomyces cerevisiae transformanter BYSkexl og BYSKEX1 under anvendelse af omvendt fase HPLC.

Efter 72 timers fermentering præpareres prøver af flydende 10 gærkulturer ved centrifugering ved dannelse af en klar opløsning, som fortyndes i forholdet 1:10 (r/r) med eddikesyre (1 M), hvorpå de underkastes HPLC analyse under følgende betingelser.

En HIBAR (MERCK) kolonne (4 x 125 mm) fyldes med omvendt 15 fase, kugleformet silicamateriale (MACHEREY-NAGEL), en kugleformet stationær fase med en partikeldiameter på 5 /tin · og en porøsitet på 100 Å. Kolonneenderne forsynes med fritter af rustfrit stål. Mobilfase A fremstilles af vand ("Nanopure"®, BARNSTEAD) indeholdende 0,1% (r/r) I DK 175701 B1 trifluoreddikesyre. Mobil fase B fremstilles ud fra 20% mobil fase A og 80% (r/r) acetonitril (HPLC-kvalitet, FLUKA) indeholdende 0,075% (r/r) trifluoreddikesyre.

5 Der foretages chromatografiske separationer ved en flow H rate på 1,5 ml/min med følgende gradient, og eluenterne H måles ved absorbans ved 216 nm.

t(min)_ % A_,_% B

0 90 10 1 79 21 9 79 21 ]7 60 36 H . 20 o 100 22 o 100 24 90 10 32/0 90 10

En standardopløsning til kalibrering af systemet fremstil- les ved at opløse 1 mg ren desulphatohirudin i l ml vand.

10 50 μ1 af denne standardopløsning indsprøjtes i kolonnen og chromatograferes som beskrevet til kalibrering af syste- met.

I Fig. 8 viser de opnåede resultater, som indicerer, at S.

cerevisiae BYSkexl producerer fuld længde hirudiner (enten I 15 hirudin HV1 vildtype eller mutanterne HV1-KR, HV1-DFRY, HV1-WQLR) med retentionstider, som er forskellige fra I retentionstiderne for hirudinnedbrydningsprodukterne produceret af S. cerevisiae BYSKEX1. Vildtype hirudin HV-1 viser en typisk blanding af fuld-længde HV-1 (retentions- I 20 tid 17,05 min.) og de to nedbrydningsprodukter "HIR-64" I (retentionstid 17,8 min.) og "HIR-63" (retentionstid 15,33 I min.) i BYSKEX1. BYSkexl danner kun "HIR-65" (retentions- I tid 17,05 min.). I tilfælde af mutanten HV1-KR BYSKEX1 I producerer udelukkende spaltningsproduktet, som mangler to

63 I

DK 175701 B1 I

C-terminale aminosyrer (= "HIR-63", retentionstid 15,9 I

min.)/ hvorimod BYSkexl producerer fuld-længde HV1-KR I

(retentionstid 14,4 min.). I

5 I tilfælde af mutanten HV1-WQLR viser BYSKEX1 spaltnings- I

produktet med en retentionstid på 18,6 min., BYSkexl pro-

ducerer hovedsagelig fuld-længde HVl-WQLR (retentionstid I

17,3 min.) og kun spor af spaltningsproduktet. HV1-SFRY i I

fuld-længde findes kun i spormængder (retentionstid 17,1 I

10 min.) i BYSkexl viser kun intakt HV1-SFRY (retentionstid I

17,1 min.). Den store top (retentionstid 15,7 min.) har ikke relation til HV1-SFRY.

Analoge resultater opnås ved sammenligning af KEX1 S. ce-revisiae stammerne Trl2lO/pDP34/GAPFL-HVl-KR, Trl210/-15 pDP34/GAPFL-HVl-SFRY og Trl210/pDP34/GAPFL-HVl-WQLR med de tilsvarende kexl stammer Trl302/pDP34/GAPFL-HVl-KR,

Trl302/pDP34/GAPFL-HVl-SFRY og Trl302/pDP34/GAPFL-HVl--WQLR.

Deponering af mikroorganismer i 20 De nedenfor anførte mikroorganisme stammer er deponeret ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Masche-roder Weg lb, D-38124 Braunschweig, DE med de anførte deponeringsdatoer og deponeringsnumre:

Saccharomyces cerevisiae H449: 18. februar 1988, 25 DSM 4413,

Escherichia coli JM109/pDP38: 19. februar 1988, DSM 4414,

Escherichia coli JM109/pDP34: 14. marts 1988, DSM 4473, 30 Saccharomyces cerevisiae BYS232-31-42: 6. maj 1988, DSM 4583.

Claims (18)

1. Gærstamme, kendetegnet ved, at den mangler j carboxypeptidase ysca aktivitet og er blevet transfor- 5 meret med en hybridvektor, som indeholder en gærpromotor operabelt bundet til en DNA sekvens, der koder for et heterologt protein.

2. Gærstamme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hybridvektoren indeholder en gærpromotor operabelt bundet 10 til en første DNA sekvens, som koder for et signalpeptid, bundet i den rigtige aflæsningsstruktur til en anden DNA sekvens, som koder for et heterologt protein, og en DNA sekvens, som indeholder gærtranscriptionsstopsignaler.

3. Gærstamme ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det 15 heterologe protein er desulphatohirudin.

4. Gærstamme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den desuden mangler peptidaseaktivitet valgt blandt yscA-, yscB-, yscY- og yscS-aktivitet.

5. Gærstamme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 20 den ikke indeholder endogent 2-mikron DNA og er blevet transformeret med en hybridvektor, som indeholder det komplette 2-mikron DNA indeholdende intakte REP1-, REP2-og FLP-gener samt intakte ORI-, STB-, IR1- og IR2-steder.

6. Gærstamme ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den 25 desuden mangler peptidaseaktivitet valgt blandt yscA-, yscB-, yscY- og yscS-aktivitet.

7. Gærstamme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hybridvektoren indeholder en gærpromotor valgt blandt MFtrl promotoren, GAL1 promotoren, en promotor for et gen, der i 30 koder for et glycolytisk enzym, ADHI promotoren, TRPI promotoren og PH05 promotoren, hvis opstrøms aktiverings-

65 I DK 175701 B1 I steder eventuelt er blevet fjernet. B

8. Gærstamme ifølge krav 2, kendetegnet ved, at B hybridvektoren indeholder en første DNA sekvens valgt fl 5 blandt hirudinsignalsekvensen, signal- og præpro-se- I kvenserne for gær invert ase, or-faktor, phæromonpept idase I (KEXl), "killer toxin" og undertrykkelig sur phosphatase I (PH05)-generne og glucoamylasesignalsekvensen fra I Aspergillus awamori. I I 10 9. Gærstamme ifølge krav 2, kendetegnet ved, at I hybridvektoren indeholder en anden DNA sekvens, der koder for en desulphatohirudinforbindelse valgt blandt desulpha-tohirudinvariant HV1, HV1 (modificeret a, b), HV2, HV2 (modificeret a, b, c), PA, varianter af PA og des(Val2>-15 desulphatohirudin.

10. Saccharomyces cerevisiae-stamme ifølge krav 1.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af en trans formeret gærstamme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en gærstamme, som mangler carboxypeptidase ysca-aktivitet, 20 transformeres med hybridvektoren.

12. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein heterologt til gær, kendetegnet ved, at man dyrker en gærstamme, som mangler carboxypeptidase ysca-aktivitet, og som er transformeret med en hybridvektor indeholdende en 25 gærpromotor operabeit bundet til en DNA sekvens, der koder for det heterologe protein, og isolerer det heterologe protein.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein heterologt til gær ifølge krav 12, kendetegnet ved, at 30 hybridvektoren består af en gærpromotor operabeit bundet til en første DNA sekvens, der koder for et signalpeptid, bundet i den rigtige aflæsningsstruktur til en anden DNA i DK 175701 B1 Η sekvens, som koder for det heterologe protein, og en DNA i sekvens, som indeholder gærtranscriptionsstopsignaler.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, 5 at det heterologe protein er følsomt for posttranslationel I C-terminal nedbrydning med carboxypeptidase ysca. '

15. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at II de to Oterminale aminosyrer i det heterologe protein er valgt blandt Lys, Arg, Tyr, Ala, Leu, Gin, Glu, Asp, Asn 10 og Ser.

16. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein heterologt til gær ifølge krav 13, kendetegnet ved, at J H det heterologe protein er desulphatohirudin. I

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, 15 at man fremstiller en desulphathirudinforbindelse valgt blandt desulphatohirudin variant HV1, HV1 (modificeret a, b), HV2, HV2 (modificeret a, b, c), PA, varianter af PA og des(Val2)-desulphatohirudin.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at 20 man fremstiller desulphatohirudin variant HV1.