JPS62224284A - 微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は微生物に間する。詳しくはプロテアーゼ活性の
少ない新規な変異微生物に関する。

（０明の構成） 酵母は、細胞の構造や闘能が高等生物の特徴を備え、ま
た食品、医薬品、飼料等の原料として、人間の日常生活
と深い係わり合いを持つ有用な微生物であり、遺伝子工
学における宿主としての開発が間待されている。

しかし、通常酵母を宿主として遺伝子組換え技術により
異種蛋白質を生産する場合、生産された蛋白質の一部が
プロテアーゼによって分解されて実際にＪ＠現された蛋
白質が変化し、完全な形の目的物が得られなかったり、
目的物の収量が大幅に減少することがある。

本発明者等は、酵母サツカロマイセス　セレビシェ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を
宿主として遺伝子組換え技術により蛋白質を生産する際
、生成蛋白質の分解の少ない宿主を得ることを目的とし
て研究の結果達成されたものである。

本発明の詳細な説明するに、本発明の変異微生物サツカ
ロマイセス　セレビシェＸＭＦ１１−４４は微工研菌寄
第８６００号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８６００）として寄託さ
れており、例えば下記（＋）及び（２）の工程により調
製される。

（＋）サツカロマイセス　セレビシェＸＭＦＩ−４の調
製 まず周知のサツカロマイセス　セレビシェ２０Ｂ−１２
（α、　肚ｄ」、　比■）を周知のサツ力口マイセスセ
レビシェＳ　ｌ　４４　（ａ　ｌ　旺ｌｌ　Ｗ　Ｉ　１
１ＬＬ　＋註Ｈ）と接合してサツカロマイセス　セレビ
シェＸ　Ｍ　Ｆ　Ｉ　−４（ａ　、　ｋ皿。

四−囮）を選択調製する。

即ち、上記２０Ｂ−１２株及び５１４４株を適当な培地
上で混合して培養し、二倍体く接合体）細胞のみを選択
採取し、これをｉα体培地を用いて増殖させ、集菌後、
胞子形成培地中で培養する。生成した分生胞子をマイク
ロマニピュレーターを用しＡで分離し、夫／？の胞子の
持つ遺伝子型（接合型、栄養要求性、■」変異）を常法
により解析し、目的の遺伝子型を持つＸＭＦＩ−４（ａ
、■ＬＬ　、　坦韮」）株を取隣する。

なお、上記２０Ｂ−１２株及び５１４４株は何れも、イ
ースト　ゼネテイツク　ストック　センター（ＹＥＡＳ
ＴＧＥＮＥＴＩＣ５ＴＯＣにＣＥＮＴＥＲ１略称ＶＧＳ
Ｃ１米国カリフォルニア大学バークレイ校内）から分譲
を受けたもので、夫々同センター発行のカタログ、第５
版（１９８４年）３０頁及び２１頁に記載されている。

（２）サツカロマイセス　セレビシェＸＭＦ１１−４４
（α。

■皿、Ｌｕ囮、Ｌ主虹、Ｌ社９匹）の調製周知のサツカ
ロマイセス　セレビシェＵ　Ｋ　３５　（α。

Ｉ侶ｈｉｓ４Ｃ，５ｋｉ５）　［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ　７巻、４４９〜４５６頁（１９８３年）
］と上記Ｘ　Ｍ　Ｆ　ｌ　−４（ａ　、　ＬＬＬｌ、　
ｐｅｐ　４−３　）とを、上記（１）と同様の方法によ
り接合させ、胞子を分離する。夫々の胞子の持つ遺伝子
型の解析は、接合ｇ（α、ａ）、栄養要求性ＣＬｒ１ｌ
ｌ　ａ　ｄ　ｅ　！　１μｓ２■）、囮」変異について
は常法により行い、また誌」変異（スーパーキラー変異
）については、サツカロマイセス　イタリカス（汀邸ｌ
圧鯰旺邸は１−１ｊ−ζす］。

）　ｌ　ＦＯ０２５３ヲ二ｍ　１１　ＲＮＡ　キ５−感
受性菌トシテ用い、生育阻止円の大きさにより検定した
。以上の方法ニヨリＸ　Ｍ　Ｆ　Ｉ　Ｉ　−４４（α＋
　ＩｃＪＬＬ　＋　肚…」Ｉ　Ｉ盈扛１０＋旺ｊ〉が弄
られる。

（発明の効果） 本発明の微生物サツカロマイセス　セレビシェＸＭＦ１
１−４４は、液胞中に存在する主要なプロテアーゼ（Ｌ
１４産物）を欠失しているため、プロテアーゼのレヘル
が低く、また筒体外のフェニル　メチルスルフォニル　
フルオライド（ＰＭＳＦ）感受性プロテアーゼ（ＳＪＬ
Ｌ！産物）を欠失していることに基ずき、これを宿主と
して遺伝子組換え技術により異種蛋白質を生産する場合
、類似の酵母菌体に比較して、生産された蛋白質がプロ
テアーゼによって分解されることが少なく、目的とする
蛋白質を収量よく生産することができる。

（実施例） 以下本発明を実施例について更に詳細に説明する。

実施例 （＋）サツカロマイセス　セレビシェＸＭＦｉ４の調製
ＹＥＰＤ固体培地（酵母エキス１０　ｇ、ブト′つ糖２
０　ｇ、バクト・ペプトン２０　ｇ及び水１０００　ｍ
ｌからなる）上で、サツカロマイセス　セレビシェ２０
Ｂ−１２（α。

上皿コ、　ｋ口口、）とサツカロマイセス　セレビシェ
Ｓ　Ｉ　４４　（ａ　＋　Ｌ口＋　−ｄ＋　ｇｘユ、註
且）を混合し、３０℃で３０分間保持して接合させた。

次いてこれをＳＤ培地［０，６７！の酵母ナイトロジエ
ンヘース（除アミノ酸）　、２　：Ｅブドウ糖からなろ
］上に塗布し３０℃で培養して二倍体（接合体）のみを
選択採取した。

二倍体細胞をＹＥＰＤｉα体培地上で培憂して増殖させ
、集菌後胞子形成培地（１！酢酸カリウム、０．１２酵
母エキス、ｏ、ｏｓ　Ｘグルコースからなる）中に＃１
！濁し、３０℃で３〜４日間培養した。次いて生成した
分生胞子をマイクロマニピュレーターを用いて分離し、
夫々の胞子の持つ遺伝子型（接合型、栄ｒ６要求性、跋
６変異）を常法により解析し、目的の遺伝子型を持つＸ
ＭＦＩ−４（ａ、江ム、坦己」）株を取得した。

（２）サツカロマイセス　セレビシェＸＭＦ１１−４４
（α。

江■、凹上１］、Ｌ工旺、出、ヨ）の調製上記で得たＸ
　Ｍ　Ｆ　１−４　（ａ　、江■、担Ｈ」）株とす’７
カロマイセス　セレビシェＵに３５（α＋　出＋　出玉
Ｔ　Ｓ　ｋ　！　５　）とを、上記（１）と全く同様の
方法により接合させ、胞子を分離した。

夫々の胞子の持つ遺伝子型を解析して目的とする遺伝子
型を有するＸＭＦ１１−４４（α、■ｐｌ　＋　鵠ｕコ
ｒ厄盈扛、出２誌」）株を得た。

（３）ＸＭＦ１１−４４株を宿主とする蛋白質の生産ヒ
トのβ−エンドルフィン（βＥ）の遺伝子ｆｔ１ｉ当な
ベクターに挿入し、これを用いてＸＭＦｌｌ−ノ１４株
を形質転換することによって得られた形質転換株ＸＭＦ
１１−４４−　βＥ−１を培養し、分泌さｈルｆ３　　
Ｘンドルフィンの収量を測定した。

なお、以下の実施例においＣは、β−Ｊ、ントルフィン
の遺伝子（βＥ　ＤＮＡ）を挿入したプラスミドとして
後述するｐＲＥ　Ｉ　０５９を使用した。

（イ）形質転換株の調製 サツカロマイセス　セレビシェＸＭＦＩ＋−４４株の培
養菌体を、集菌洗浄後２Ｘ　ＩＱ８ｃｅｌｌｓ／　ｍｌ
となるように、ＴＥ緩衝液［１０ｍＭのトリス塩酸（ｐ
Ｈ８，０）及びｌ１１ＩＭのＥＤＴＡからなる］に懸濁
し、その５００μｍに０．２Ｍの酢酸リチウムを５００
７１１加えて３０℃で１時間保持した。

その後、上記懸濁液１００μｍを採取して氷冷し、これ
にプラスミドｐＲＥ　Ｉ　０５９を加え、氷水中で３０
分１■保持した後、７０χポリエチレングリコール４０
００を含むＴＥ緩衝液１００μｍを添加混合して３０℃
で１時１石保持した。

次いて４２゛Ｃで５分間保持して集菌し、水で洗浄し、
滅菌水に懸濁した後選択培地上に塗布し、３０℃てｔｇ
養して形質転換株Ｘ１１Ｆ１１−４４−βＥ−１株を調
製した。

（０）β−エンドルフィンの調製 ［培地の組成コ 酵母窒素ベース（ｆＡ安を含む）　　０．６７ｇデキス
トロース　　　　　　　２ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０
　　ｍｌアミノ酸、核酸、　　　　　　２０　ｍｌ塩基
混合物　　（※） （※）硫酸アデニン１２　ｍｇ、ウラシル１２　ｍｇ、
１．−ヒスチジン−ＨＣ１１２ｗａｇ、　Ｌ−アルギニ
ン−ＨＣ１１２ｍｇ、　Ｌ−メチオニン１２　Ｂ、Ｌ−
チロシン１Ｂ　ｌｌ１ｇ、し−ロイシン１８　ｒａｇ、
　Ｌ−イソロイシン１８　ｔａｇ、、ｔ、−リジン１８
　ｍｇ、１゜−フェニルアラニン３０１８、Ｌ−グルタ
ミン酸６０　ｍｇ、し−アスパラギン酸６０　ｌＩｇ、
　Ｌ−バリン９０　ｍｇ、１、−スレオニン１２０　ｍ
ｇ、　Ｌ−セリン２２５　ｍｇ、水１２０　ｍｌ。

［培養方法］ 上記組成の培１ｔｋ２５ｍｌを用い、細胞密度（１０？
ｃｅｌｌｓ／１１１ｔ）で３７℃、４８時間上記の形質
転換株を樟養した結果β−エンドルフィンの収量は６８
．８ｎｇ／　＋０？　ｃｅｌｌｓてあった。

なお、細胞数はＡａｓｏ（Ａａｓｏ＝Ｉｘ　＋ｏｖ　ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌ）の値から計算した。また、β−エンド
ルフィン量の測定は、β−エンドルフィン［１？ＩＡコ
キツト　ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社、カ
タログ番号ＮＥに−００３を使用し、同カタログ記載の
方法に従ってラジオイムノアッセイを行った。

なお参考までに、周知のサツカロマイセス　セレビシェ
ＹＮＮ２７　［ｉ１２胞中に存在するプロテアーゼ（ｌ
産物）と菌体外のフェニルメチルスルフォニル　フルオ
ライド（ＰＭＳＦ）感受性プロテアーゼ（ｌ産物）を有
する］を宿主とし、上記と全く同様の方法によりｐＲＥ
＋０５９を用いて形質転換して得られたＹＮＮ２２−β
Ｅ−１株のβ−エンドルフィンの収量は４７．６　ｎｇ
／　ＩＯＴ　ｃｅｌｌｓであった。

本実施例に用いたプラスミドｐＲＥ　Ｉ　０５９は、サ
ツカロマイセス　セレビシェのαフェロモン遺伝子（Ｍ
ＦαＩ）のプロモーターとリーダー配列を含む領域の間
にヒトのβ−エンドルフィン前駆体遺伝子を挿入してあ
り、その他マーカーとして、サツカロマイセス　セレビ
シェの一目ヨ、遺伝子、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマー
ゼ遺伝子（Ａｐ「）、更にｆ：、ｃｏｌｉの複製起点（
ｏｒｉ）及び２μ市プラスミドのＡＲ５等を含むシャト
ルベクターであって、その詳細は、例えば、特願昭６０
−１１２２８７号に記載されているが、以下にその構築
の概要を示す。

［β−エンドルフィン遺伝子を含む分泌ヘクタ←プラス
ミドｐＲＥ　Ｉ　０５９の構築コク１）サツカロマイセ
ス・セレビシェα因子ＤＮＡを含むプラスミドｐＬｓＯ
Ｉ（４，４ｋｂ）の調製サツカロミセス・セレビシェ（
＋Ｆｏ　１１３６）の染色体ＤＮＡ５００　／ｌＺｇを
５００μ＋の緩衝ｉｆｆ　［１００ｍＭのトリス塩Ｍ（
ｐＨ７，５）、５０　ｍＭのＮａＣｌ、１０　ａ＋Ｍの
塩化マグネシウム及び１　ｍＭのジチオスレイトールか
らなる］中で１５単位のＥｃｏＲＩで３７℃、１夜間処
理して切断した後凛縮し、蔗糖密度勾配遠心にかけ、２
ｋｂ萌後のＤＮＡ断片を集めた。これをプラスミドｐＬ
Ｉｃ１３（１’ｈａｒｍａｃｉａ社カタログ、Ｐ−Ｌ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、２７頁、２７−４９７３記
載）のＥｃｏＲＴにより切断した断片ｌμｇとＴ４リガ
ーゼ２単位を用いて連結し、得られたプラスミドで大腸
菌ＪＭ８３株を形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｐ’
）株を選択した。

合成オリゴヌクレオチド ５’　ＧＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＴ　３’をプロ
ーブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行ない、
陽性のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを分離し、
制限酵素による解析と塩基配列の決定により、Ｃｅ１ｌ
、３０巻、９３７頁（１９８２）の記載と一致する塩基
配列を有する酵母のα因子ＤＮＡを含むプラスミドｐＬ
ｓＯ＋（４，４ｋｂ）を選択採取した。

（２）プラスミドｐＲＥ１０３２（５，８ｋｂ）の調製
プラスミドＹＲｐ７　［５，７ｋｂ、酵母のＴＲＰＩを
含む断片とｐＢＲ３２２を結合したプラスミド、Ｎａｔ
ｕｒｅ、２８２巻、３９〜４３頁（＋９７４）記Ｒ］を
ＥｃｏＲｆで部分切断し、粘着末端を充填した後、Ｔ４
リガーゼで連結してＶＲｐ７の一方のＥｃｏＲＩサイト
が除去されたｐＲＥ＋０３２（５，８１へｂ）を調製し
た。

（３）プラスミドｐＬＪｃ８−βＥ（２，９ｋｂ）の調
製プラスミドｐＹＴ３−２４（特開昭５８−り２６９（
３号公報、２頁記載）を）Ｉａｅｌｌｌで切断すること
によってβＥ　［ＩＮＡ（９３ｂｐ）を含む１６０　ｌ
ａｐのＨａｅｍ　〜Ｈａｅｍ断片を採取した。

一方、ファージ旧３ｍｐ７　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅ　−５ｅａｒｃｈ　９巻、３０９〜３２１頁
記載）のＲＦ　Ｉ　ＤＮＡ　（二本鎖ＤＮＡ）を１ｌｉ
ｎｅ■で切断し、エタノールを添加してエタノールに溶
解する断片５’　ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣ３’（Ｈｉ
ｎｃ１１　〜１ｌｉｎｃ１１　）を除去した後、Ｈｉｎ
ｃ１１部位に、上記βＥ　［）ＮＡを含む１６０　ｂｐ
のＩｌａｅｍ　〜Ｈａｅｍ断片をＴ４リガーゼて連結し
た。これを大腸菌８８１０１株に導入し、得られた形質
転換株からＲＦ　Ｉ　［）ＮＡを調製しこれをＢａｍＨ
１で切断して、得られたＢａ５ｌ１１〜Ｂａｍ＋）Ｉ　
ｌ断片をプラスミドｐＵｃ８［８ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、発
行のＢＲＬカタログ（Ａｕｇｕｓｔ　Ｌ１９８３）、Ｃ
ａｔ／　Ｎｏ、５３５９ＳＡ記載］のＢａｍＨＩサイト
に挿入してｐＬＩｃ８−βＥ（２，９ｋｂ）を得た。

（４）プラスミドρＲＥ１０４６（７，４ｋｈ）の調製
（イ）ｐＬｓＯＩ（４，４ｋｂ）をＥｃｏＲＩ及び１Ｉ
ｉｎｄＩ［Ｉで切断してプロモーター配列及びリーダー
配列を含むεＣθＲ■〜Ｈ１０ｄＩ［ｌ断片（１，４ｋ
ｂ）を得た。

（ロ）ｐＵｃ８−βＥ（２，９ｋｂ）を）Ｉｉｎｄ１１
Ｉ及びＥｃｏＲＩで切断してＨｉｎｄｍ　〜ＥｃｏＲｌ
断片（０，２ｋｂ）を得た。

（ハ）ｐＲＥ１０３２（５，８ｋｂ）をＥｃｏＲＩで切
断し、これを上記（イ）及び（ロ）で得たＤＮＡ断片と
Ｔ４リガーゼを用いて連結してｐＲＥ１０４＋１（７，
４ｋｂ）を得たく第１図）。

（５）プラスミドｐＲＥ＋０５２（５，２ｋｂ）の調製
（イ）ｐＲＥ１０３２　（５，８ｋｂ）をＥｃｏＲＥ及
びＰｓｔ　ｒで切断してＴＲＰＩを含むＥｃｏＲＩ　〜
Ｐｓｔ　ｌ断片（０，８ｋｂ）を得た。

（０）２ＩＬＩＲプラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、そ
の粘着末端を充填して平滑末端とした後、Ｐｓｔｌで切
断して複製開始点を含むＰｓｔ　Ｔ〜ＥｃｏＲｌ断片（
２ｋｂ）を得た。

（ハ）上記（イ）及び（ロ）で得たＤＮＡ断片を、ｐＢ
Ｒ３２２をＥｃｏＲＩ及びＰｖｕ■で切断したＰｖｕ　
１１　〜ＥｃｏＲｌ断片（２，３ｋｂ　）と共にＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結してｐＲＥＩ０５１（５，１ｋ
ｂ）を作製し、ＥｃｏＲ［で部分切断した後、粘着末端
を充填して平滑末端としてＴ４リガーゼで連結し、一方
のＥｃｏＲＩ切断部位を欠失したｐＲＥＩ０５２（５，
２ｋｂ）を得た（第２図）。

（：６）プラスミドρＲＥ１０５９（Ｓ、８　ｋｂ）の
調製（イ）ｐＲＥＩ０４６（７，４ｋｂ）をＥｃｏＲＩ
及びＳｎ＋ａ　Ｉて切断し、得られたプロモーター配列
、リーダー配列及びβＥ　ＤＮＡ配列を含むＥｃｏＲＩ
　〜Ｓａ＋ａ　ｌ断片（１，（ｉｋｂ）を採取した。

（ロ）ｐＬｓＯＩ（４，４ｋｂ）をＨｉ　ｎｃ　１１及
びＥｃｏＲＩで切断しターミネータ−配列を含む旧ｎｃ
ｌｌ〜ＥｃｏＲｌ断片（０，３ｋｂ）を１采取した。

（ハ）ｐＲＥＩ０５２（５，２ｋｂ）をＥｃｏＲ１で切
断し、バクチリアルアルカリンフォスファターゼ（ＲＡ
Ｐ）を加えて末端のリン酸基を外した後、上記（イ）及
び（ロ）で得たＤＮＡ断片とＴ４リガーゼを用いて連結
してプラスミド１）ＲＥ１０５９（６，８ｋｂ）を得た
（第３図）。

【図面の簡単な説明】

第１〜第３図は本発明に使用したプラスミドρｌ１ｔＥ
Ｉ０５９の構成ルートを示す模式図であって、図中、Ｅ
はＥｃｏＲ１を、１（はｌｌｉｎｄｍを、Ｓは５ａｌｌ
を、ＰはＰｓｔｌを、ＢはＢａｍＨｌを、ＰｖはＰｖｕ
　ｎを、ＳｍはＳｍａ　Ｉを、１ｌｃｃ、ｔ　１１　ｉ
　ｎｃ　１１を、ＸはＸｂａ　Ｉを夫々示す。 出願人　工業技術院長　　等　々　力　　達吊１目 第２　口

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）サッカロマイセス　セレビシエ２０Ｂ−１２をサ
   ッカロマイセス　セレビシエＳ１４４と接合して得られ
   るサッカロマイセス　セレビシエＸＭＦ１−４と、サッ
   カロマイセス　セレビシエＵＫ３５とを接合して得られ
   る、プロテアーゼ活性の少ないサッカロマイセス　セレ
   ビシエＸＭＦ１１−４４。