JPS62224284A - 微生物 - Google Patents
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- JPS62224284A JPS62224284A JP61064808A JP6480886A JPS62224284A JP S62224284 A JPS62224284 A JP S62224284A JP 61064808 A JP61064808 A JP 61064808A JP 6480886 A JP6480886 A JP 6480886A JP S62224284 A JPS62224284 A JP S62224284A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は微生物に間する。詳しくはプロテアーゼ活性の
少ない新規な変異微生物に関する。
少ない新規な変異微生物に関する。
(0明の構成)
酵母は、細胞の構造や闘能が高等生物の特徴を備え、ま
た食品、医薬品、飼料等の原料として、人間の日常生活
と深い係わり合いを持つ有用な微生物であり、遺伝子工
学における宿主としての開発が間待されている。
た食品、医薬品、飼料等の原料として、人間の日常生活
と深い係わり合いを持つ有用な微生物であり、遺伝子工
学における宿主としての開発が間待されている。
しかし、通常酵母を宿主として遺伝子組換え技術により
異種蛋白質を生産する場合、生産された蛋白質の一部が
プロテアーゼによって分解されて実際にJ@現された蛋
白質が変化し、完全な形の目的物が得られなかったり、
目的物の収量が大幅に減少することがある。
異種蛋白質を生産する場合、生産された蛋白質の一部が
プロテアーゼによって分解されて実際にJ@現された蛋
白質が変化し、完全な形の目的物が得られなかったり、
目的物の収量が大幅に減少することがある。
本発明者等は、酵母サツカロマイセス セレビシェ(S
accharomyces cerevisiae)を
宿主として遺伝子組換え技術により蛋白質を生産する際
、生成蛋白質の分解の少ない宿主を得ることを目的とし
て研究の結果達成されたものである。
accharomyces cerevisiae)を
宿主として遺伝子組換え技術により蛋白質を生産する際
、生成蛋白質の分解の少ない宿主を得ることを目的とし
て研究の結果達成されたものである。
本発明の詳細な説明するに、本発明の変異微生物サツカ
ロマイセス セレビシェXMF11−44は微工研菌寄
第8600号(FERM P−8600)として寄託さ
れており、例えば下記(+)及び(2)の工程により調
製される。
ロマイセス セレビシェXMF11−44は微工研菌寄
第8600号(FERM P−8600)として寄託さ
れており、例えば下記(+)及び(2)の工程により調
製される。
(+)サツカロマイセス セレビシェXMFI−4の調
製 まず周知のサツカロマイセス セレビシェ20B−12
(α、 肚d」、 比■)を周知のサツ力口マイセスセ
レビシェS l 44 (a l 旺ll W I 1
1LL +註H)と接合してサツカロマイセス セレビ
シェX M F I −4(a 、 k皿。
製 まず周知のサツカロマイセス セレビシェ20B−12
(α、 肚d」、 比■)を周知のサツ力口マイセスセ
レビシェS l 44 (a l 旺ll W I 1
1LL +註H)と接合してサツカロマイセス セレビ
シェX M F I −4(a 、 k皿。
四−囮)を選択調製する。
即ち、上記20B−12株及び5144株を適当な培地
上で混合して培養し、二倍体く接合体)細胞のみを選択
採取し、これをiα体培地を用いて増殖させ、集菌後、
胞子形成培地中で培養する。生成した分生胞子をマイク
ロマニピュレーターを用しAで分離し、夫/?の胞子の
持つ遺伝子型(接合型、栄養要求性、■」変異)を常法
により解析し、目的の遺伝子型を持つXMFI−4(a
、■LL 、 坦韮」)株を取隣する。
上で混合して培養し、二倍体く接合体)細胞のみを選択
採取し、これをiα体培地を用いて増殖させ、集菌後、
胞子形成培地中で培養する。生成した分生胞子をマイク
ロマニピュレーターを用しAで分離し、夫/?の胞子の
持つ遺伝子型(接合型、栄養要求性、■」変異)を常法
により解析し、目的の遺伝子型を持つXMFI−4(a
、■LL 、 坦韮」)株を取隣する。
なお、上記20B−12株及び5144株は何れも、イ
ースト ゼネテイツク ストック センター(YEAS
TGENETIC5TOCにCENTER1略称VGS
C1米国カリフォルニア大学バークレイ校内)から分譲
を受けたもので、夫々同センター発行のカタログ、第5
版(1984年)30頁及び21頁に記載されている。
ースト ゼネテイツク ストック センター(YEAS
TGENETIC5TOCにCENTER1略称VGS
C1米国カリフォルニア大学バークレイ校内)から分譲
を受けたもので、夫々同センター発行のカタログ、第5
版(1984年)30頁及び21頁に記載されている。
(2)サツカロマイセス セレビシェXMF11−44
(α。
(α。
■皿、Lu囮、L主虹、L社9匹)の調製周知のサツカ
ロマイセス セレビシェU K 35 (α。
ロマイセス セレビシェU K 35 (α。
I侶his4C,5ki5) [Current Ge
netics 7巻、449〜456頁(1983年)
]と上記X M F l −4(a 、 LLLl、
pep 4−3 )とを、上記(1)と同様の方法によ
り接合させ、胞子を分離する。夫々の胞子の持つ遺伝子
型の解析は、接合g(α、a)、栄養要求性CLr1l
l a d e ! 1μs2■)、囮」変異について
は常法により行い、また誌」変異(スーパーキラー変異
)については、サツカロマイセス イタリカス(汀邸l
圧鯰旺邸は1−1j−ζす]。
netics 7巻、449〜456頁(1983年)
]と上記X M F l −4(a 、 LLLl、
pep 4−3 )とを、上記(1)と同様の方法によ
り接合させ、胞子を分離する。夫々の胞子の持つ遺伝子
型の解析は、接合g(α、a)、栄養要求性CLr1l
l a d e ! 1μs2■)、囮」変異について
は常法により行い、また誌」変異(スーパーキラー変異
)については、サツカロマイセス イタリカス(汀邸l
圧鯰旺邸は1−1j−ζす]。
) l FO0253ヲ二m 11 RNA キ5−感
受性菌トシテ用い、生育阻止円の大きさにより検定した
。以上の方法ニヨリX M F I I −44(α+
IcJLL + 肚…」I I盈扛10+旺j〉が弄
られる。
受性菌トシテ用い、生育阻止円の大きさにより検定した
。以上の方法ニヨリX M F I I −44(α+
IcJLL + 肚…」I I盈扛10+旺j〉が弄
られる。
(発明の効果)
本発明の微生物サツカロマイセス セレビシェXMF1
1−44は、液胞中に存在する主要なプロテアーゼ(L
14産物)を欠失しているため、プロテアーゼのレヘル
が低く、また筒体外のフェニル メチルスルフォニル
フルオライド(PMSF)感受性プロテアーゼ(SJL
L!産物)を欠失していることに基ずき、これを宿主と
して遺伝子組換え技術により異種蛋白質を生産する場合
、類似の酵母菌体に比較して、生産された蛋白質がプロ
テアーゼによって分解されることが少なく、目的とする
蛋白質を収量よく生産することができる。
1−44は、液胞中に存在する主要なプロテアーゼ(L
14産物)を欠失しているため、プロテアーゼのレヘル
が低く、また筒体外のフェニル メチルスルフォニル
フルオライド(PMSF)感受性プロテアーゼ(SJL
L!産物)を欠失していることに基ずき、これを宿主と
して遺伝子組換え技術により異種蛋白質を生産する場合
、類似の酵母菌体に比較して、生産された蛋白質がプロ
テアーゼによって分解されることが少なく、目的とする
蛋白質を収量よく生産することができる。
(実施例)
以下本発明を実施例について更に詳細に説明する。
実施例
(+)サツカロマイセス セレビシェXMFi4の調製
YEPD固体培地(酵母エキス10 g、ブト′つ糖2
0 g、バクト・ペプトン20 g及び水1000 m
lからなる)上で、サツカロマイセス セレビシェ20
B−12(α。
YEPD固体培地(酵母エキス10 g、ブト′つ糖2
0 g、バクト・ペプトン20 g及び水1000 m
lからなる)上で、サツカロマイセス セレビシェ20
B−12(α。
上皿コ、 k口口、)とサツカロマイセス セレビシェ
S I 44 (a + L口+ −d+ gxユ、註
且)を混合し、30℃で30分間保持して接合させた。
S I 44 (a + L口+ −d+ gxユ、註
且)を混合し、30℃で30分間保持して接合させた。
次いてこれをSD培地[0,67!の酵母ナイトロジエ
ンヘース(除アミノ酸) 、2 :Eブドウ糖からなろ
]上に塗布し30℃で培養して二倍体(接合体)のみを
選択採取した。
ンヘース(除アミノ酸) 、2 :Eブドウ糖からなろ
]上に塗布し30℃で培養して二倍体(接合体)のみを
選択採取した。
二倍体細胞をYEPDiα体培地上で培憂して増殖させ
、集菌後胞子形成培地(1!酢酸カリウム、0.12酵
母エキス、o、os Xグルコースからなる)中に#1
!濁し、30℃で3〜4日間培養した。次いて生成した
分生胞子をマイクロマニピュレーターを用いて分離し、
夫々の胞子の持つ遺伝子型(接合型、栄r6要求性、跋
6変異)を常法により解析し、目的の遺伝子型を持つX
MFI−4(a、江ム、坦己」)株を取得した。
、集菌後胞子形成培地(1!酢酸カリウム、0.12酵
母エキス、o、os Xグルコースからなる)中に#1
!濁し、30℃で3〜4日間培養した。次いて生成した
分生胞子をマイクロマニピュレーターを用いて分離し、
夫々の胞子の持つ遺伝子型(接合型、栄r6要求性、跋
6変異)を常法により解析し、目的の遺伝子型を持つX
MFI−4(a、江ム、坦己」)株を取得した。
(2)サツカロマイセス セレビシェXMF11−44
(α。
(α。
江■、凹上1]、L工旺、出、ヨ)の調製上記で得たX
M F 1−4 (a 、江■、担H」)株とす’7
カロマイセス セレビシェUに35(α+ 出+ 出玉
T S k ! 5 )とを、上記(1)と全く同様の
方法により接合させ、胞子を分離した。
M F 1−4 (a 、江■、担H」)株とす’7
カロマイセス セレビシェUに35(α+ 出+ 出玉
T S k ! 5 )とを、上記(1)と全く同様の
方法により接合させ、胞子を分離した。
夫々の胞子の持つ遺伝子型を解析して目的とする遺伝子
型を有するXMF11−44(α、■pl + 鵠uコ
r厄盈扛、出2誌」)株を得た。
型を有するXMF11−44(α、■pl + 鵠uコ
r厄盈扛、出2誌」)株を得た。
(3)XMF11−44株を宿主とする蛋白質の生産ヒ
トのβ−エンドルフィン(βE)の遺伝子ft1i当な
ベクターに挿入し、これを用いてXMFll−ノ14株
を形質転換することによって得られた形質転換株XMF
11−44− βE−1を培養し、分泌さhルf3
Xンドルフィンの収量を測定した。
トのβ−エンドルフィン(βE)の遺伝子ft1i当な
ベクターに挿入し、これを用いてXMFll−ノ14株
を形質転換することによって得られた形質転換株XMF
11−44− βE−1を培養し、分泌さhルf3
Xンドルフィンの収量を測定した。
なお、以下の実施例においCは、β−J、ントルフィン
の遺伝子(βE DNA)を挿入したプラスミドとして
後述するpRE I 059を使用した。
の遺伝子(βE DNA)を挿入したプラスミドとして
後述するpRE I 059を使用した。
(イ)形質転換株の調製
サツカロマイセス セレビシェXMFI+−44株の培
養菌体を、集菌洗浄後2X IQ8cells/ ml
となるように、TE緩衝液[10mMのトリス塩酸(p
H8,0)及びl11IMのEDTAからなる]に懸濁
し、その500μmに0.2Mの酢酸リチウムを500
711加えて30℃で1時間保持した。
養菌体を、集菌洗浄後2X IQ8cells/ ml
となるように、TE緩衝液[10mMのトリス塩酸(p
H8,0)及びl11IMのEDTAからなる]に懸濁
し、その500μmに0.2Mの酢酸リチウムを500
711加えて30℃で1時間保持した。
その後、上記懸濁液100μmを採取して氷冷し、これ
にプラスミドpRE I 059を加え、氷水中で30
分1■保持した後、70χポリエチレングリコール40
00を含むTE緩衝液100μmを添加混合して30℃
で1時1石保持した。
にプラスミドpRE I 059を加え、氷水中で30
分1■保持した後、70χポリエチレングリコール40
00を含むTE緩衝液100μmを添加混合して30℃
で1時1石保持した。
次いて42゛Cで5分間保持して集菌し、水で洗浄し、
滅菌水に懸濁した後選択培地上に塗布し、30℃てtg
養して形質転換株X11F11−44−βE−1株を調
製した。
滅菌水に懸濁した後選択培地上に塗布し、30℃てtg
養して形質転換株X11F11−44−βE−1株を調
製した。
(0)β−エンドルフィンの調製
[培地の組成コ
酵母窒素ベース(fA安を含む) 0.67gデキス
トロース 2g 水 80
mlアミノ酸、核酸、 20 ml塩基
混合物 (※) (※)硫酸アデニン12 mg、ウラシル12 mg、
1.−ヒスチジン−HC112wag、 L−アルギニ
ン−HC112mg、 L−メチオニン12 B、L−
チロシン1B ll1g、し−ロイシン18 rag、
L−イソロイシン18 tag、、t、−リジン18
mg、1゜−フェニルアラニン3018、L−グルタ
ミン酸60 mg、し−アスパラギン酸60 lIg、
L−バリン90 mg、1、−スレオニン120 m
g、 L−セリン225 mg、水120 ml。
トロース 2g 水 80
mlアミノ酸、核酸、 20 ml塩基
混合物 (※) (※)硫酸アデニン12 mg、ウラシル12 mg、
1.−ヒスチジン−HC112wag、 L−アルギニ
ン−HC112mg、 L−メチオニン12 B、L−
チロシン1B ll1g、し−ロイシン18 rag、
L−イソロイシン18 tag、、t、−リジン18
mg、1゜−フェニルアラニン3018、L−グルタ
ミン酸60 mg、し−アスパラギン酸60 lIg、
L−バリン90 mg、1、−スレオニン120 m
g、 L−セリン225 mg、水120 ml。
[培養方法]
上記組成の培1tk25mlを用い、細胞密度(10?
cells/111t)で37℃、48時間上記の形質
転換株を樟養した結果β−エンドルフィンの収量は68
.8ng/ +0? cellsてあった。
cells/111t)で37℃、48時間上記の形質
転換株を樟養した結果β−エンドルフィンの収量は68
.8ng/ +0? cellsてあった。
なお、細胞数はAaso(Aaso=Ix +ov c
ells/ml)の値から計算した。また、β−エンド
ルフィン量の測定は、β−エンドルフィン[1?IAコ
キツト NewEngland Nuclear社、カ
タログ番号NEに−003を使用し、同カタログ記載の
方法に従ってラジオイムノアッセイを行った。
ells/ml)の値から計算した。また、β−エンド
ルフィン量の測定は、β−エンドルフィン[1?IAコ
キツト NewEngland Nuclear社、カ
タログ番号NEに−003を使用し、同カタログ記載の
方法に従ってラジオイムノアッセイを行った。
なお参考までに、周知のサツカロマイセス セレビシェ
YNN27 [i12胞中に存在するプロテアーゼ(l
産物)と菌体外のフェニルメチルスルフォニル フルオ
ライド(PMSF)感受性プロテアーゼ(l産物)を有
する]を宿主とし、上記と全く同様の方法によりpRE
+059を用いて形質転換して得られたYNN22−β
E−1株のβ−エンドルフィンの収量は47.6 ng
/ IOT cellsであった。
YNN27 [i12胞中に存在するプロテアーゼ(l
産物)と菌体外のフェニルメチルスルフォニル フルオ
ライド(PMSF)感受性プロテアーゼ(l産物)を有
する]を宿主とし、上記と全く同様の方法によりpRE
+059を用いて形質転換して得られたYNN22−β
E−1株のβ−エンドルフィンの収量は47.6 ng
/ IOT cellsであった。
本実施例に用いたプラスミドpRE I 059は、サ
ツカロマイセス セレビシェのαフェロモン遺伝子(M
FαI)のプロモーターとリーダー配列を含む領域の間
にヒトのβ−エンドルフィン前駆体遺伝子を挿入してあ
り、その他マーカーとして、サツカロマイセス セレビ
シェの一目ヨ、遺伝子、pBR322のβ−ラクタマー
ゼ遺伝子(Ap「)、更にf:、coliの複製起点(
ori)及び2μ市プラスミドのAR5等を含むシャト
ルベクターであって、その詳細は、例えば、特願昭60
−112287号に記載されているが、以下にその構築
の概要を示す。
ツカロマイセス セレビシェのαフェロモン遺伝子(M
FαI)のプロモーターとリーダー配列を含む領域の間
にヒトのβ−エンドルフィン前駆体遺伝子を挿入してあ
り、その他マーカーとして、サツカロマイセス セレビ
シェの一目ヨ、遺伝子、pBR322のβ−ラクタマー
ゼ遺伝子(Ap「)、更にf:、coliの複製起点(
ori)及び2μ市プラスミドのAR5等を含むシャト
ルベクターであって、その詳細は、例えば、特願昭60
−112287号に記載されているが、以下にその構築
の概要を示す。
[β−エンドルフィン遺伝子を含む分泌ヘクタ←プラス
ミドpRE I 059の構築コク1)サツカロマイセ
ス・セレビシェα因子DNAを含むプラスミドpLsO
I(4,4kb)の調製サツカロミセス・セレビシェ(
+Fo 1136)の染色体DNA500 /lZgを
500μ+の緩衝iff [100mMのトリス塩M(
pH7,5)、50 mMのNaCl、10 a+Mの
塩化マグネシウム及び1 mMのジチオスレイトールか
らなる]中で15単位のEcoRIで37℃、1夜間処
理して切断した後凛縮し、蔗糖密度勾配遠心にかけ、2
kb萌後のDNA断片を集めた。これをプラスミドpL
Ic13(1’harmacia社カタログ、P−L
Biochemicals、27頁、27−4973記
載)のEcoRTにより切断した断片lμgとT4リガ
ーゼ2単位を用いて連結し、得られたプラスミドで大腸
菌JM83株を形質転換し、アンピシリン耐性(Ap’
)株を選択した。
ミドpRE I 059の構築コク1)サツカロマイセ
ス・セレビシェα因子DNAを含むプラスミドpLsO
I(4,4kb)の調製サツカロミセス・セレビシェ(
+Fo 1136)の染色体DNA500 /lZgを
500μ+の緩衝iff [100mMのトリス塩M(
pH7,5)、50 mMのNaCl、10 a+Mの
塩化マグネシウム及び1 mMのジチオスレイトールか
らなる]中で15単位のEcoRIで37℃、1夜間処
理して切断した後凛縮し、蔗糖密度勾配遠心にかけ、2
kb萌後のDNA断片を集めた。これをプラスミドpL
Ic13(1’harmacia社カタログ、P−L
Biochemicals、27頁、27−4973記
載)のEcoRTにより切断した断片lμgとT4リガ
ーゼ2単位を用いて連結し、得られたプラスミドで大腸
菌JM83株を形質転換し、アンピシリン耐性(Ap’
)株を選択した。
合成オリゴヌクレオチド
5’ GGCCAACCAATGTACT 3’をプロ
ーブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行ない、
陽性のコロニーを選択し、プラスミドDNAを分離し、
制限酵素による解析と塩基配列の決定により、Ce1l
、30巻、937頁(1982)の記載と一致する塩基
配列を有する酵母のα因子DNAを含むプラスミドpL
sO+(4,4kb)を選択採取した。
ーブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行ない、
陽性のコロニーを選択し、プラスミドDNAを分離し、
制限酵素による解析と塩基配列の決定により、Ce1l
、30巻、937頁(1982)の記載と一致する塩基
配列を有する酵母のα因子DNAを含むプラスミドpL
sO+(4,4kb)を選択採取した。
(2)プラスミドpRE1032(5,8kb)の調製
プラスミドYRp7 [5,7kb、酵母のTRPIを
含む断片とpBR322を結合したプラスミド、Nat
ure、282巻、39〜43頁(+974)記R]を
EcoRfで部分切断し、粘着末端を充填した後、T4
リガーゼで連結してVRp7の一方のEcoRIサイト
が除去されたpRE+032(5,81へb)を調製し
た。
プラスミドYRp7 [5,7kb、酵母のTRPIを
含む断片とpBR322を結合したプラスミド、Nat
ure、282巻、39〜43頁(+974)記R]を
EcoRfで部分切断し、粘着末端を充填した後、T4
リガーゼで連結してVRp7の一方のEcoRIサイト
が除去されたpRE+032(5,81へb)を調製し
た。
(3)プラスミドpLJc8−βE(2,9kb)の調
製プラスミドpYT3−24(特開昭58−り269(
3号公報、2頁記載)を)Iaelllで切断すること
によってβE [INA(93bp)を含む160 l
apのHaem 〜Haem断片を採取した。
製プラスミドpYT3−24(特開昭58−り269(
3号公報、2頁記載)を)Iaelllで切断すること
によってβE [INA(93bp)を含む160 l
apのHaem 〜Haem断片を採取した。
一方、ファージ旧3mp7 (Nucleic Ac1
ds Re −5earch 9巻、309〜321頁
記載)のRF I DNA (二本鎖DNA)を1li
ne■で切断し、エタノールを添加してエタノールに溶
解する断片5’ GACCTGCAGGTC3’(Hi
nc11 〜1linc11 )を除去した後、Hin
c11部位に、上記βE [)NAを含む160 bp
のIlaem 〜Haem断片をT4リガーゼて連結し
た。これを大腸菌88101株に導入し、得られた形質
転換株からRF I [)NAを調製しこれをBamH
1で切断して、得られたBa5l11〜Bam+)I
l断片をプラスミドpUc8[8ethesda Re
5earchLaboratories、 Inc、発
行のBRLカタログ(August L1983)、C
at/ No、5359SA記載]のBamHIサイト
に挿入してpLIc8−βE(2,9kb)を得た。
ds Re −5earch 9巻、309〜321頁
記載)のRF I DNA (二本鎖DNA)を1li
ne■で切断し、エタノールを添加してエタノールに溶
解する断片5’ GACCTGCAGGTC3’(Hi
nc11 〜1linc11 )を除去した後、Hin
c11部位に、上記βE [)NAを含む160 bp
のIlaem 〜Haem断片をT4リガーゼて連結し
た。これを大腸菌88101株に導入し、得られた形質
転換株からRF I [)NAを調製しこれをBamH
1で切断して、得られたBa5l11〜Bam+)I
l断片をプラスミドpUc8[8ethesda Re
5earchLaboratories、 Inc、発
行のBRLカタログ(August L1983)、C
at/ No、5359SA記載]のBamHIサイト
に挿入してpLIc8−βE(2,9kb)を得た。
(4)プラスミドρRE1046(7,4kh)の調製
(イ)pLsOI(4,4kb)をEcoRI及び1I
indI[Iで切断してプロモーター配列及びリーダー
配列を含むεCθR■〜H10dI[l断片(1,4k
b)を得た。
(イ)pLsOI(4,4kb)をEcoRI及び1I
indI[Iで切断してプロモーター配列及びリーダー
配列を含むεCθR■〜H10dI[l断片(1,4k
b)を得た。
(ロ)pUc8−βE(2,9kb)を)Iind11
I及びEcoRIで切断してHindm 〜EcoRl
断片(0,2kb)を得た。
I及びEcoRIで切断してHindm 〜EcoRl
断片(0,2kb)を得た。
(ハ)pRE1032(5,8kb)をEcoRIで切
断し、これを上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片と
T4リガーゼを用いて連結してpRE104+1(7,
4kb)を得たく第1図)。
断し、これを上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片と
T4リガーゼを用いて連結してpRE104+1(7,
4kb)を得たく第1図)。
(5)プラスミドpRE+052(5,2kb)の調製
(イ)pRE1032 (5,8kb)をEcoRE及
びPst rで切断してTRPIを含むEcoRI 〜
Pst l断片(0,8kb)を得た。
(イ)pRE1032 (5,8kb)をEcoRE及
びPst rで切断してTRPIを含むEcoRI 〜
Pst l断片(0,8kb)を得た。
(0)2ILIRプラスミドをEcoRIで切断し、そ
の粘着末端を充填して平滑末端とした後、Pstlで切
断して複製開始点を含むPst T〜EcoRl断片(
2kb)を得た。
の粘着末端を充填して平滑末端とした後、Pstlで切
断して複製開始点を含むPst T〜EcoRl断片(
2kb)を得た。
(ハ)上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片を、pB
R322をEcoRI及びPvu■で切断したPvu
11 〜EcoRl断片(2,3kb )と共にT4D
NAリガーゼにより連結してpREI051(5,1k
b)を作製し、EcoR[で部分切断した後、粘着末端
を充填して平滑末端としてT4リガーゼで連結し、一方
のEcoRI切断部位を欠失したpREI052(5,
2kb)を得た(第2図)。
R322をEcoRI及びPvu■で切断したPvu
11 〜EcoRl断片(2,3kb )と共にT4D
NAリガーゼにより連結してpREI051(5,1k
b)を作製し、EcoR[で部分切断した後、粘着末端
を充填して平滑末端としてT4リガーゼで連結し、一方
のEcoRI切断部位を欠失したpREI052(5,
2kb)を得た(第2図)。
(:6)プラスミドρRE1059(S、8 kb)の
調製(イ)pREI046(7,4kb)をEcoRI
及びSn+a Iて切断し、得られたプロモーター配列
、リーダー配列及びβE DNA配列を含むEcoRI
〜Sa+a l断片(1,(ikb)を採取した。
調製(イ)pREI046(7,4kb)をEcoRI
及びSn+a Iて切断し、得られたプロモーター配列
、リーダー配列及びβE DNA配列を含むEcoRI
〜Sa+a l断片(1,(ikb)を採取した。
(ロ)pLsOI(4,4kb)をHi nc 11及
びEcoRIで切断しターミネータ−配列を含む旧nc
ll〜EcoRl断片(0,3kb)を1采取した。
びEcoRIで切断しターミネータ−配列を含む旧nc
ll〜EcoRl断片(0,3kb)を1采取した。
(ハ)pREI052(5,2kb)をEcoR1で切
断し、バクチリアルアルカリンフォスファターゼ(RA
P)を加えて末端のリン酸基を外した後、上記(イ)及
び(ロ)で得たDNA断片とT4リガーゼを用いて連結
してプラスミド1)RE1059(6,8kb)を得た
(第3図)。
断し、バクチリアルアルカリンフォスファターゼ(RA
P)を加えて末端のリン酸基を外した後、上記(イ)及
び(ロ)で得たDNA断片とT4リガーゼを用いて連結
してプラスミド1)RE1059(6,8kb)を得た
(第3図)。
第1〜第3図は本発明に使用したプラスミドρl1tE
I059の構成ルートを示す模式図であって、図中、E
はEcoR1を、1(はllindmを、Sは5all
を、PはPstlを、BはBamHlを、PvはPvu
nを、SmはSma Iを、1lcc、t 11 i
nc 11を、XはXba Iを夫々示す。 出願人 工業技術院長 等 々 力 達吊1目 第2 口
I059の構成ルートを示す模式図であって、図中、E
はEcoR1を、1(はllindmを、Sは5all
を、PはPstlを、BはBamHlを、PvはPvu
nを、SmはSma Iを、1lcc、t 11 i
nc 11を、XはXba Iを夫々示す。 出願人 工業技術院長 等 々 力 達吊1目 第2 口
Claims (1)
- (1)サッカロマイセス セレビシエ20B−12をサ
ッカロマイセス セレビシエS144と接合して得られ
るサッカロマイセス セレビシエXMF1−4と、サッ
カロマイセス セレビシエUK35とを接合して得られ
る、プロテアーゼ活性の少ないサッカロマイセス セレ
ビシエXMF11−44。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61064808A JPS62224284A (ja) | 1986-03-25 | 1986-03-25 | 微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61064808A JPS62224284A (ja) | 1986-03-25 | 1986-03-25 | 微生物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62224284A true JPS62224284A (ja) | 1987-10-02 |
JPH0158948B2 JPH0158948B2 (ja) | 1989-12-14 |
Family
ID=13268913
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61064808A Granted JPS62224284A (ja) | 1986-03-25 | 1986-03-25 | 微生物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62224284A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH022385A (ja) * | 1988-01-05 | 1990-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | 蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物の製法 |
JPH02104279A (ja) * | 1988-05-04 | 1990-04-17 | Ciba Geigy Ag | ポリペプチドの製造における改良 |
JPH03103188A (ja) * | 1989-09-18 | 1991-04-30 | Green Cross Corp:The | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
-
1986
- 1986-03-25 JP JP61064808A patent/JPS62224284A/ja active Granted
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH022385A (ja) * | 1988-01-05 | 1990-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | 蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物の製法 |
JPH02104279A (ja) * | 1988-05-04 | 1990-04-17 | Ciba Geigy Ag | ポリペプチドの製造における改良 |
JPH03103188A (ja) * | 1989-09-18 | 1991-04-30 | Green Cross Corp:The | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0158948B2 (ja) | 1989-12-14 |
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