JP3085973B2 - 組換え酵母による成熟タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドについてコードする配列として新規ｄｎａ断片の適用、発現カセット、形質転換酵母及びそれに対応するタンパク質の製造方法 - Google Patents
組換え酵母による成熟タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドについてコードする配列として新規ｄｎａ断片の適用、発現カセット、形質転換酵母及びそれに対応するタンパク質の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、新規DNA断片、及び真核（動物又は植物）
又は原核（細菌）細胞、更に詳しくはサッカロミセス
（Saccharomyces）株のような酵母による異種タンパク
質の分泌に関して有用なシグナルペプチドについてコー
ドするDNA断片としてのそれらの用途に関する。
又は原核（細菌）細胞、更に詳しくはサッカロミセス
（Saccharomyces）株のような酵母による異種タンパク
質の分泌に関して有用なシグナルペプチドについてコー
ドするDNA断片としてのそれらの用途に関する。
組換えDNA技術による異種タンパク質の製造に際して
通常追求される目的の１つは、異種タンパク質を合成す
る細胞の培地中に分泌される産物の産生である。実際
上、特に大量産生用として産業上重要なタンパク質の製
造の場合において、それが成熟形として産生されるタン
パク質について望ましい性質を留めていること、即ちタ
ンパク質に融合されて留まっているいずれのアミノ酸又
は付加ペプチド配列もないことが望ましい。更に、回収
及び精製操作を容易化させるためにはそれが培地中に分
泌されることが有利である。
通常追求される目的の１つは、異種タンパク質を合成す
る細胞の培地中に分泌される産物の産生である。実際
上、特に大量産生用として産業上重要なタンパク質の製
造の場合において、それが成熟形として産生されるタン
パク質について望ましい性質を留めていること、即ちタ
ンパク質に融合されて留まっているいずれのアミノ酸又
は付加ペプチド配列もないことが望ましい。更に、回収
及び精製操作を容易化させるためにはそれが培地中に分
泌されることが有利である。
細胞、特に真核細胞から分泌されるタンパク質は、成
熟タンパク質に相当する断片（活性形）と、“pre"断片
として知られ、シグナルペプチドとも称され、細胞によ
るタンパク質の分泌メカニズムに関与するＮ末端断片と
を含むポリペプチド前駆体の形で極めて一般的に合成さ
れる。加えて、このポリペプチド前駆体は“pro"断片と
称される１以上の付加断片も含むことができる。後者の
場合において、ポリペプチド前駆体は“prepro"前駆体
又は第一前駆体とも称される。“pro"断片は大多数の場
合においてシグナルペプチドと成熟タンパク質に相当す
る断片との間に挿入されるが、但しこれは絶対的ルール
ではない。
熟タンパク質に相当する断片（活性形）と、“pre"断片
として知られ、シグナルペプチドとも称され、細胞によ
るタンパク質の分泌メカニズムに関与するＮ末端断片と
を含むポリペプチド前駆体の形で極めて一般的に合成さ
れる。加えて、このポリペプチド前駆体は“pro"断片と
称される１以上の付加断片も含むことができる。後者の
場合において、ポリペプチド前駆体は“prepro"前駆体
又は第一前駆体とも称される。“pro"断片は大多数の場
合においてシグナルペプチドと成熟タンパク質に相当す
る断片との間に挿入されるが、但しこれは絶対的ルール
ではない。
シグナルペプチドは（１）細胞膜中へのタンパク質の
挿入、（２）細胞膜を介するタンパク質の移動又は
（３）小胞体を介するタンパク質の分泌目的のため細胞
の小胞体中へのタンパク質の侵入を開始させる。シグナ
ルペプチドがその機能を果たすと、通常タンパク質加水
分解開裂により分断されて、第一前駆体と同様に生物活
性を有しないか又は成熟タンパク質の完全生物活性を有
しない“pro"前駆体と称される第二前駆体あるいは成熟
タンパク質を遊離する。
挿入、（２）細胞膜を介するタンパク質の移動又は
（３）小胞体を介するタンパク質の分泌目的のため細胞
の小胞体中へのタンパク質の侵入を開始させる。シグナ
ルペプチドがその機能を果たすと、通常タンパク質加水
分解開裂により分断されて、第一前駆体と同様に生物活
性を有しないか又は成熟タンパク質の完全生物活性を有
しない“pro"前駆体と称される第二前駆体あるいは成熟
タンパク質を遊離する。
“pro"断片はそれがタンパク質の活性を阻止又は修正
しているかぎり有用であり、それによってタンパク質で
生じうる毒性作用から細胞を保護できるか又は生じうる
修正もしくは分解からタンパク質を保護できる。それは
分泌メカニズムにもある程度関与しうる。分泌プロセス
の最後において、第二前駆体の“pro"断片はタンパク質
分解開裂により分断されて成熟タンパク質（活性形）を
遊離する。
しているかぎり有用であり、それによってタンパク質で
生じうる毒性作用から細胞を保護できるか又は生じうる
修正もしくは分解からタンパク質を保護できる。それは
分泌メカニズムにもある程度関与しうる。分泌プロセス
の最後において、第二前駆体の“pro"断片はタンパク質
分解開裂により分断されて成熟タンパク質（活性形）を
遊離する。
“pre"断片と“pro"断片との結合部並びに“pro"断片
と成熟タンパク質に相当する断片との結合部に、タンパ
ク質が合成される細胞のプロテアーゼの１つによって認
識されるタンパク質分解開裂部位が存在する。このタン
パク質分解開裂部位は、“pro"前駆体においてプロテア
ーゼに接近可能であるが、但しそれが成熟タンパク質に
相当する断片中に存在する場合には接近不可能な２、３
又はそれ以上のアミノ酸の配列（以下、タンパク質分解
配列と称される）から通常なる。明らかに３つのケース
が可能であり、“pre"及び“pro"断片の結合に関し以下
で説明されている： −プロテアーゼは配列の開始部で切断し、したがってタ
ンパク質分解配列は“pro"断片で読取られねばならな
い； −プロテアーゼは配列の末端で切断し、したがってタン
パク質分解配列は“pre"断片で読取られねばならない；
又は −プロテアーゼは配列の中間で切断し、したがってタン
パク質分解配列は“pre"及び“pro"双方の断片で読取ら
れねばならない。
と成熟タンパク質に相当する断片との結合部に、タンパ
ク質が合成される細胞のプロテアーゼの１つによって認
識されるタンパク質分解開裂部位が存在する。このタン
パク質分解開裂部位は、“pro"前駆体においてプロテア
ーゼに接近可能であるが、但しそれが成熟タンパク質に
相当する断片中に存在する場合には接近不可能な２、３
又はそれ以上のアミノ酸の配列（以下、タンパク質分解
配列と称される）から通常なる。明らかに３つのケース
が可能であり、“pre"及び“pro"断片の結合に関し以下
で説明されている： −プロテアーゼは配列の開始部で切断し、したがってタ
ンパク質分解配列は“pro"断片で読取られねばならな
い； −プロテアーゼは配列の末端で切断し、したがってタン
パク質分解配列は“pre"断片で読取られねばならない；
又は −プロテアーゼは配列の中間で切断し、したがってタン
パク質分解配列は“pre"及び“pro"双方の断片で読取ら
れねばならない。
これらの考慮事項は、“pro"断片と成熟タンパク質に
相当する断片との結合部に位置する開裂部位にも当然同
様に該当する。
相当する断片との結合部に位置する開裂部位にも当然同
様に該当する。
遺伝子工学法による合成前駆体の組立てのために可能
なアプローチは、天然断片（即ち自然界に存在する）を
用いること、断片と組合せて新しいタンパク質分解開裂
部位を再形成させるようにあるアミノ酸又は新しいタン
パク質分解開裂部位を適切な箇所に挿入することである
が、この新しい開裂部位は合成前駆体が発現される細胞
のプロテアーゼの１つにより当然認識される。
なアプローチは、天然断片（即ち自然界に存在する）を
用いること、断片と組合せて新しいタンパク質分解開裂
部位を再形成させるようにあるアミノ酸又は新しいタン
パク質分解開裂部位を適切な箇所に挿入することである
が、この新しい開裂部位は合成前駆体が発現される細胞
のプロテアーゼの１つにより当然認識される。
合成タイプ及び前記分泌方法に関する例は、α因子
（MFα１又はMFα２遺伝子でコードされる）とも称され
るα性フェロモンS.セレビシアエ（S.cerevisiae）酵母
のケースで説明される。α因子はKurjan及びHerskowit
z,Cell（1982）30:933で記載されるように実際上“prep
ro"前駆体の形で合成される。α因子の前駆体の“pre"
断片のアミノ酸配列はMet−Arg−Phe−Pro−Ser−Ile−
Phe−Thr−Ala−Val−Leu−Phe−Ala−Ala−Ser−Ser−
Ala−Leu−Alaであり、一方α因子の前駆体の“pro"断
片の場合はAla−Pro−Val−Asn−Thr−Thr−Thr−Glu−
Asp−Glu−Thr−Ala−Gln−Ile−Pro−Ala−Glu−Ala−
Val−Ile−Gly−Tyr−Ser−Asp−Leu−Glu−Gly−Asp−
Phe−Asp−Val−Ala−Val−Leu−Pro−Phe−Ser−Asn−
Ser−Thr−Asn−Asn−Gly−Leu−Leu−Phe−Ile−Asn−
Thr−Thr−Ile−Ala−Ser−Ile−Ala−Ala−Lys−Glu−
Glu−Gly−Val−Ser−Leu−Aspである。
（MFα１又はMFα２遺伝子でコードされる）とも称され
るα性フェロモンS.セレビシアエ（S.cerevisiae）酵母
のケースで説明される。α因子はKurjan及びHerskowit
z,Cell（1982）30:933で記載されるように実際上“prep
ro"前駆体の形で合成される。α因子の前駆体の“pre"
断片のアミノ酸配列はMet−Arg−Phe−Pro−Ser−Ile−
Phe−Thr−Ala−Val−Leu−Phe−Ala−Ala−Ser−Ser−
Ala−Leu−Alaであり、一方α因子の前駆体の“pro"断
片の場合はAla−Pro−Val−Asn−Thr−Thr−Thr−Glu−
Asp−Glu−Thr−Ala−Gln−Ile−Pro−Ala−Glu−Ala−
Val−Ile−Gly−Tyr−Ser−Asp−Leu−Glu−Gly−Asp−
Phe−Asp−Val−Ala−Val−Leu−Pro−Phe−Ser−Asn−
Ser−Thr−Asn−Asn−Gly−Leu−Leu−Phe−Ile−Asn−
Thr−Thr−Ile−Ala−Ser−Ile−Ala−Ala−Lys−Glu−
Glu−Gly−Val−Ser−Leu−Aspである。
意外にも、Ｎ末端がアミノ酸配列:Arg−Phe−Ser−Th
r−Thr−Leu−Ala−Thr−Ala−Ala−Thr−Ala−Leu−Ph
e−Phe−Thr−Ala−Ser−Gln−Val−Ser−Alaを有する
酵母酵素の前駆体のＮ末端及びこのＮ末端の異なる変異
体は異種タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドと
して用いうることがここに判明した。“異種タンパク
質”とは、宿主細胞で自然に産生されないか又は宿主細
胞に由来しない配列でコードされたタンパク質を意味す
る。
r−Thr−Leu−Ala−Thr−Ala−Ala−Thr−Ala−Leu−Ph
e−Phe−Thr−Ala−Ser−Gln−Val−Ser−Alaを有する
酵母酵素の前駆体のＮ末端及びこのＮ末端の異なる変異
体は異種タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドと
して用いうることがここに判明した。“異種タンパク
質”とは、宿主細胞で自然に産生されないか又は宿主細
胞に由来しない配列でコードされたタンパク質を意味す
る。
これによれば、本発明の主題は、アミノ酸配列がアミ
ノ酸配列（Ｉ）又は（II）、好ましくは配列（II）と少
なくとも60％、好ましくは少なくとも80％の相同度を示
すペプチドについてコードする単離されたDNA断片であ
る。配列（Ｉ）及び（II）は下記のとおりである： （Ｉ）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Leu−Ala−Thr−Ala
−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gl
n; （II）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Leu−Ala−Thr−Ala
−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gln
−Val−Ser−Ala。
ノ酸配列（Ｉ）又は（II）、好ましくは配列（II）と少
なくとも60％、好ましくは少なくとも80％の相同度を示
すペプチドについてコードする単離されたDNA断片であ
る。配列（Ｉ）及び（II）は下記のとおりである： （Ｉ）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Leu−Ala−Thr−Ala
−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gl
n; （II）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Leu−Ala−Thr−Ala
−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gln
−Val−Ser−Ala。
“単離されたDNA断片”とは、特にKlebl ＆ Tanner,
J.Bact.,Nov 1989,171:6259で記載されるように、３′
末端がβ−1,3−グルカナーゼ活性を有する酵素につい
てコードするDNA断片と共有結合で結合されていないDNA
断片を意味する。
J.Bact.,Nov 1989,171:6259で記載されるように、３′
末端がβ−1,3−グルカナーゼ活性を有する酵素につい
てコードするDNA断片と共有結合で結合されていないDNA
断片を意味する。
更に詳しくは、本発明のDNA断片は下記アミノ酸配列
（III）： 〔上記式中R1はArg及びLysから選択されるアミノ酸であ
る;R2及びR6は各々独立してAla、Asn、Cys、Gln、Gly、
His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及
びValから選択されるアミノ酸である;R3及びR5は各々独
立してAsp、Gly、Asn、Pro及びSerから選択されるアミ
ノ酸である;R4はVal、Leu、Ala、Cys、Phe、Ile及びMet
から選択されるアミノ酸である〕 を含むペプチドについてコードする。
（III）： 〔上記式中R1はArg及びLysから選択されるアミノ酸であ
る;R2及びR6は各々独立してAla、Asn、Cys、Gln、Gly、
His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及
びValから選択されるアミノ酸である;R3及びR5は各々独
立してAsp、Gly、Asn、Pro及びSerから選択されるアミ
ノ酸である;R4はVal、Leu、Ala、Cys、Phe、Ile及びMet
から選択されるアミノ酸である〕 を含むペプチドについてコードする。
好ましくは、本発明のDNA断片は下記アミノ酸配列（I
V）： （IV）R1−R2−R3−Thr−Thr−R4−Ala−Thr−Ala−Ala
−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−R5−R6−R7 〔上記式中R1はArg及びLysから選択されるアミノ酸であ
る;R2及びR6は各々独立してAla、Asn、Cys、Gln、Gly、
His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及
びValから選択されるアミノ酸である;R3及びR5は各々独
立してAsp、Gly、Asn、Pro及びSerから選択されるアミ
ノ酸である;R4はVal、Leu、Ala、Cys、Phe、Ile及びMet
から選択されるアミノ酸である;R7はタンパク質分解配
列である。R7は好ましくはタンパク質分解配列R8−R9−
R10である（式中R8はAla、Val、Ser、Cys、Gly、Ile、L
eu及びThrから選択されるアミノ酸である;R9はAla、Ar
g、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Se
r、Thr、Trp、Tyr及びValから選択されるアミノ酸であ
る;R10はAla、Cys、Gly、Leu、Pro、Gln、Ser及びThrか
ら選択されるアミノ酸である）〕 を含むペプチドについてコードする。
V）： （IV）R1−R2−R3−Thr−Thr−R4−Ala−Thr−Ala−Ala
−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−R5−R6−R7 〔上記式中R1はArg及びLysから選択されるアミノ酸であ
る;R2及びR6は各々独立してAla、Asn、Cys、Gln、Gly、
His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及
びValから選択されるアミノ酸である;R3及びR5は各々独
立してAsp、Gly、Asn、Pro及びSerから選択されるアミ
ノ酸である;R4はVal、Leu、Ala、Cys、Phe、Ile及びMet
から選択されるアミノ酸である;R7はタンパク質分解配
列である。R7は好ましくはタンパク質分解配列R8−R9−
R10である（式中R8はAla、Val、Ser、Cys、Gly、Ile、L
eu及びThrから選択されるアミノ酸である;R9はAla、Ar
g、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Se
r、Thr、Trp、Tyr及びValから選択されるアミノ酸であ
る;R10はAla、Cys、Gly、Leu、Pro、Gln、Ser及びThrか
ら選択されるアミノ酸である）〕 を含むペプチドについてコードする。
本発明によると、好ましいDNA断片は下記アミノ酸配
列（Ｖ）、（VI）、（VII）及び（VIII）から選択され
るアミノ酸配列を含むペプチドについてコードする： （Ｖ）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Leu−Ala−Thr−Ala
−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gl
n; （VI）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Val−Ala−Thr−Ala
−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gl
n; （VII）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Leu−Ala−Thr−Ala
−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gln
−R7（式中R7は前記と同義である）；及び （VIII）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Val−Ala−Thr−Al
a−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gl
n−R7（式中R7は前記と同義である）。
列（Ｖ）、（VI）、（VII）及び（VIII）から選択され
るアミノ酸配列を含むペプチドについてコードする： （Ｖ）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Leu−Ala−Thr−Ala
−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gl
n; （VI）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Val−Ala−Thr−Ala
−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gl
n; （VII）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Leu−Ala−Thr−Ala
−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gln
−R7（式中R7は前記と同義である）；及び （VIII）Arg−Phe−Ser−Thr−Thr−Val−Ala−Thr−Al
a−Ala−Thr−Ala−Leu−Phe−Phe−Thr−Ala−Ser−Gl
n−R7（式中R7は前記と同義である）。
絶対的に好ましくは、R7はR8がVal、R9がSer及びR10
がAlaの配列である。
がAlaの配列である。
非常に特に好ましくは、本発明のDNA断片はそのヌク
レオチド配列として下記配列（IX）、（Ｘ）、（XI）及
び（XII）のうち１つを有している： （IX） CGT TTC TCT ACT ACA GTC GCT ACT GCA GCT AC
T GCG CTA TTT TTC ACA GCC TCC CAA （Ｘ） CGT TTC TCT ACT ACA CTC GCT ACT GCA GCT AC
T GCG CTA TTT TTC ACA GCC TCC CAA （XI） CGT TTC TCT ACT ACA GTC GCT ACT GCA GCT AC
T GCG CTA TTT TTC ACA GCC TCC CAA GTT TCA GCT （XII） CGT TTC TCT ACT ACA CTC GCT ACT GCA GCT A
CT GCG CTA TTT TTC ACA GCC TCC CAA GTT TCA GCT 本発明のDNA断片でコードされるペプチドは、３位の
アミノ酸と18位のアミノ酸との間にα−ヘリックス構造
を有する疎水性領域を含んでいる。この構造はシグナル
ペプチドとしてそれらを使用に適したものにさせる上で
役立つ。シグナル配列の疎水性部分は、主にアミノ酸Al
a、Cys、Phe、Ile、Leu、Met及びValから構成されるこ
とが知られている。したがって、アミノ酸の一部修正で
シグナルペプチドがその役割を果たしうる能力に修正を
起こさないことを予測することも可能になる。
レオチド配列として下記配列（IX）、（Ｘ）、（XI）及
び（XII）のうち１つを有している： （IX） CGT TTC TCT ACT ACA GTC GCT ACT GCA GCT AC
T GCG CTA TTT TTC ACA GCC TCC CAA （Ｘ） CGT TTC TCT ACT ACA CTC GCT ACT GCA GCT AC
T GCG CTA TTT TTC ACA GCC TCC CAA （XI） CGT TTC TCT ACT ACA GTC GCT ACT GCA GCT AC
T GCG CTA TTT TTC ACA GCC TCC CAA GTT TCA GCT （XII） CGT TTC TCT ACT ACA CTC GCT ACT GCA GCT A
CT GCG CTA TTT TTC ACA GCC TCC CAA GTT TCA GCT 本発明のDNA断片でコードされるペプチドは、３位の
アミノ酸と18位のアミノ酸との間にα−ヘリックス構造
を有する疎水性領域を含んでいる。この構造はシグナル
ペプチドとしてそれらを使用に適したものにさせる上で
役立つ。シグナル配列の疎水性部分は、主にアミノ酸Al
a、Cys、Phe、Ile、Leu、Met及びValから構成されるこ
とが知られている。したがって、アミノ酸の一部修正で
シグナルペプチドがその役割を果たしうる能力に修正を
起こさないことを予測することも可能になる。
したがってもう１面において、本発明は異種タンパク
質が合成される宿主細胞での異種タンパク質の分泌に関
して有用なシグナルペプチドについてコードするDNA断
片として本発明のDNA断片の適用を提案している。一般
的に言えば、本発明は原核又は真核細胞、好ましくは後
者で実施される。真核細胞とは、例えば哺乳動物又は酵
母細胞である。絶対的に好ましくは、本発明の断片でコ
ードされるシグナルペプチドを用いた異種タンパク質の
分泌は、例えばサッカロミセス属、更に詳しくはS.セレ
ビシアエ種の酵母細胞で実施される。
質が合成される宿主細胞での異種タンパク質の分泌に関
して有用なシグナルペプチドについてコードするDNA断
片として本発明のDNA断片の適用を提案している。一般
的に言えば、本発明は原核又は真核細胞、好ましくは後
者で実施される。真核細胞とは、例えば哺乳動物又は酵
母細胞である。絶対的に好ましくは、本発明の断片でコ
ードされるシグナルペプチドを用いた異種タンパク質の
分泌は、例えばサッカロミセス属、更に詳しくはS.セレ
ビシアエ種の酵母細胞で実施される。
当然ながら、シグナルペプチドについてコードするDN
A断片として本発明のDNA断片は翻訳開始コドン、通常メ
チオニンについてコードするコドン、特にATGによって
前置される。
A断片として本発明のDNA断片は翻訳開始コドン、通常メ
チオニンについてコードするコドン、特にATGによって
前置される。
本発明のDNA断片はタンパク質発現用カセットの組立
てに用いてもよいが、その断片は開始コドンで前置され
ており、単独であるか又は他の成分、例えば“pro"断片
と組合されている。これらのDNA断片は当業者に公知の
技術によるオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いた
化学合成で製造してもよい。
てに用いてもよいが、その断片は開始コドンで前置され
ており、単独であるか又は他の成分、例えば“pro"断片
と組合されている。これらのDNA断片は当業者に公知の
技術によるオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いた
化学合成で製造してもよい。
本発明は、異種タンパク質のシグナルペプチドについ
てコードするDNA断片として本発明のDNA断片を含む異種
タンパク質発現用カセットにも関する。詳しくは、成熟
異種タンパク質の分泌に必要な情報を含んだ本発明の発
現カセットは、少なくとも： ａ）転写及び翻訳開始シグナルを含むDNA断片 ｂ）本発明のDNA断片及び ｃ）成熟異種タンパク質についてコードするDNA断片
（翻訳終結コドン含有）を順次含んでいる。
てコードするDNA断片として本発明のDNA断片を含む異種
タンパク質発現用カセットにも関する。詳しくは、成熟
異種タンパク質の分泌に必要な情報を含んだ本発明の発
現カセットは、少なくとも： ａ）転写及び翻訳開始シグナルを含むDNA断片 ｂ）本発明のDNA断片及び ｃ）成熟異種タンパク質についてコードするDNA断片
（翻訳終結コドン含有）を順次含んでいる。
第一変異体において、断片ｂ）と断片ｃ）との結合部
に、発現及び分泌プロセスの最後に成熟タンパク質を遊
離させるようなタンパク質分解開裂部位についてコード
するDNA配列が存在するかぎり、断片ｂ）は断片ｃ）と
枠内で直接融合させてよい。好ましくは、タンパク質分
解開裂部位についてコードするDNA配列は断片ｂ）上で
読取られる。
に、発現及び分泌プロセスの最後に成熟タンパク質を遊
離させるようなタンパク質分解開裂部位についてコード
するDNA配列が存在するかぎり、断片ｂ）は断片ｃ）と
枠内で直接融合させてよい。好ましくは、タンパク質分
解開裂部位についてコードするDNA配列は断片ｂ）上で
読取られる。
第二変異体において、本発明の発現カセットは“pro"
ペプチド断片についてコードするDNA断片ｂ′）を更に
含んでいる。一方で断片ｂ）及びｂ′）と他方で断片
ｂ′）及びｃ）との結合部にタンパク質分解開裂部位に
ついてコードするDNA配列が存在するかぎり、この断片
ｂ′）は断片ｂ）及び断片ｃ）と枠内で融合される。
ペプチド断片についてコードするDNA断片ｂ′）を更に
含んでいる。一方で断片ｂ）及びｂ′）と他方で断片
ｂ′）及びｃ）との結合部にタンパク質分解開裂部位に
ついてコードするDNA配列が存在するかぎり、この断片
ｂ′）は断片ｂ）及び断片ｃ）と枠内で融合される。
多数の断片ｂ′）が本発明のカセットで使用可能であ
る。特に、様々な断片ｂ′）が合成で組立てられる。例
えば、α因子の前駆体の“pro"断片についてコードする
DNA断片からの合成断片ｂ′）の組立ては以下で記載さ
れている。この配列は全体でも又は一部として用いても
よい。具体例において、この配列は“pro"断片中３〜42
位のアミノ酸についてコードする部分、即ちAla−Pro−
Gly−Leu−Leu−Phe−Ile−Asn−Thr−Thr−Ile−Ala−
Ser−Ile−Ala−Ala−Lys−Glu−Glu−Gly−Val−Ser−
Leu−Aspについてコードする配列の欠失後に用いられ
る。断片ｂ′）を形成させるため、後者のDNA配列の後
に（１）タンパク質分解開裂部位を含むペプチド又は
（２）タンパク質分解開裂部位についてコードする配列
を続けるが、後者の態様が好ましい。最も詳しくは、後
者の開裂部位はLys−Arg又はArg−Argであるが、これは
KEX2遺伝子でコードされかつジペプチドLys−Arg又はAr
g−ArgのＣ末端で切断する酵母yscFエンドペプチダーゼ
で認識される。要するに、具体的断片ｂ′）はAla−Pro
−Gly−Leu−Leu−Phe−Ile−Asn−Thr−Thr−Ile−Ala
−Ser−Ile−Ala−Ala−Lys−Glu−Glu−Gly−Val−Ser
−Leu−Asp−Lys−Argについてコードする。
る。特に、様々な断片ｂ′）が合成で組立てられる。例
えば、α因子の前駆体の“pro"断片についてコードする
DNA断片からの合成断片ｂ′）の組立ては以下で記載さ
れている。この配列は全体でも又は一部として用いても
よい。具体例において、この配列は“pro"断片中３〜42
位のアミノ酸についてコードする部分、即ちAla−Pro−
Gly−Leu−Leu−Phe−Ile−Asn−Thr−Thr−Ile−Ala−
Ser−Ile−Ala−Ala−Lys−Glu−Glu−Gly−Val−Ser−
Leu−Aspについてコードする配列の欠失後に用いられ
る。断片ｂ′）を形成させるため、後者のDNA配列の後
に（１）タンパク質分解開裂部位を含むペプチド又は
（２）タンパク質分解開裂部位についてコードする配列
を続けるが、後者の態様が好ましい。最も詳しくは、後
者の開裂部位はLys−Arg又はArg−Argであるが、これは
KEX2遺伝子でコードされかつジペプチドLys−Arg又はAr
g−ArgのＣ末端で切断する酵母yscFエンドペプチダーゼ
で認識される。要するに、具体的断片ｂ′）はAla−Pro
−Gly−Leu−Leu−Phe−Ile−Asn−Thr−Thr−Ile−Ala
−Ser−Ile−Ala−Ala−Lys−Glu−Glu−Gly−Val−Ser
−Leu−Asp−Lys−Argについてコードする。
配列ａ）は、断片ｃ）でコードされる異種タンパク質
を合成する上で望ましい細胞内で機能性であるプロモー
ター、好ましくは酵母内で機能性であるプロモーターを
特に含んでいる。例えば、PGK、ENO1及びMFα１プロモ
ーター又はPHO5及びGAL1のような誘導プロモーターのよ
うに、異種タンパク質についてコードする遺伝子の転写
で機能性が確認された酵母の構成プロモーターが挙げら
れる。例えば酵母のMFα１遺伝子の要素が発現カセット
で用いられる場合には、MFα１遺伝子のプロモーターが
使用可能である。
を合成する上で望ましい細胞内で機能性であるプロモー
ター、好ましくは酵母内で機能性であるプロモーターを
特に含んでいる。例えば、PGK、ENO1及びMFα１プロモ
ーター又はPHO5及びGAL1のような誘導プロモーターのよ
うに、異種タンパク質についてコードする遺伝子の転写
で機能性が確認された酵母の構成プロモーターが挙げら
れる。例えば酵母のMFα１遺伝子の要素が発現カセット
で用いられる場合には、MFα１遺伝子のプロモーターが
使用可能である。
最後に、発現カセットは好ましくは酵母内で機能性で
ある転写終結シグナルを含むDNA断片ｄ）、例えばPGK遺
伝子の断片も含むことができる。
ある転写終結シグナルを含むDNA断片ｄ）、例えばPGK遺
伝子の断片も含むことができる。
一般的に言えば、本発明の発現カセットは原核又は真
核細胞、好ましくは哺乳動物又は酵母細胞のような真核
細胞中に導入されるが、酵母細胞が特に最も好ましい。
この導入は酵母のゲノムに直接導入される組込み用構造
中に又は自己複製プラスミド中にカセットを入れて、双
方のケースで形質転換細胞を得るように実施してもよ
い。
核細胞、好ましくは哺乳動物又は酵母細胞のような真核
細胞中に導入されるが、酵母細胞が特に最も好ましい。
この導入は酵母のゲノムに直接導入される組込み用構造
中に又は自己複製プラスミド中にカセットを入れて、双
方のケースで形質転換細胞を得るように実施してもよ
い。
プラスミドが自律的である場合には、分布及び複製の
ための要素、例えば酵母の２μプラスミドの場合のよう
な複製源を含む。加えて、プラスミドはura3又はleu2酵
母を補完するURA3又はLEU2遺伝子のような選択要素を含
んでいてもよい。特に、欠失されたそのプロモーターか
らのURA3遺伝子（URA3−ｄ）が有利に用いられる。
ための要素、例えば酵母の２μプラスミドの場合のよう
な複製源を含む。加えて、プラスミドはura3又はleu2酵
母を補完するURA3又はLEU2遺伝子のような選択要素を含
んでいてもよい。特に、欠失されたそのプロモーターか
らのURA3遺伝子（URA3−ｄ）が有利に用いられる。
これらのプラスミドは、プラスミドがシャトルプラス
ミドでなければならない場合、細菌内でそれらを複製す
るための要素、例えばpBR322の場合のような複製源、Am
pRのような選択マーカー遺伝子及び／又は当業者に公知
の他の要素も含んでいてよい。
ミドでなければならない場合、細菌内でそれらを複製す
るための要素、例えばpBR322の場合のような複製源、Am
pRのような選択マーカー遺伝子及び／又は当業者に公知
の他の要素も含んでいてよい。
前記のように、本発明はプラスミドに挿入された又は
細胞のゲノムに組込まれたいずれかの（１）本発明のDN
A断片又は（２）本発明の発現カセットにより形質転換
された細胞にも関する。
細胞のゲノムに組込まれたいずれかの（１）本発明のDN
A断片又は（２）本発明の発現カセットにより形質転換
された細胞にも関する。
プロモーターがMFα１遺伝子の場合であるとき、形質
転換された酵母細胞はMATα接合型であることが好まし
い。例えば、適切な選択圧力で酵母内にプラスミドを維
持するためプラスミドで補完された遺伝子型ura3又はle
u2の株が用いられる。
転換された酵母細胞はMATα接合型であることが好まし
い。例えば、適切な選択圧力で酵母内にプラスミドを維
持するためプラスミドで補完された遺伝子型ura3又はle
u2の株が用いられる。
最後に、本発明の主題は本発明の細胞が培養されてタ
ンパク質が培地から回収されることを特徴とする異種タ
ンパク質の製造方法である。このプロセスはいかなる異
種タンパク質の製造にも適用される。これらのタンパク
質の中では、ヒルジン又はデフェンシン類、例えばデフ
ェンシンＡが特に挙げられる。
ンパク質が培地から回収されることを特徴とする異種タ
ンパク質の製造方法である。このプロセスはいかなる異
種タンパク質の製造にも適用される。これらのタンパク
質の中では、ヒルジン又はデフェンシン類、例えばデフ
ェンシンＡが特に挙げられる。
更に詳しくは、本発明は本発明の形質転換酵母株から
の成熟形ヒルジンの分泌方法に関する。
の成熟形ヒルジンの分泌方法に関する。
本発明は最も具体的にはヒルジンの産生にうまく適用
され、この理由から本発明について説明する例の１つは
このタンパク質に関する。実際上、主供給源が医用ヒル
の唾液腺であるヒルジンがトロンビンの非常に特異的か
つ非常に有効な阻害剤である。したがって、それは、臨
床的使用上非常に高純度の産物を要求し、このため遺伝
子工学産生用の有利な候補である、非常に有利な治療剤
である。
され、この理由から本発明について説明する例の１つは
このタンパク質に関する。実際上、主供給源が医用ヒル
の唾液腺であるヒルジンがトロンビンの非常に特異的か
つ非常に有効な阻害剤である。したがって、それは、臨
床的使用上非常に高純度の産物を要求し、このため遺伝
子工学産生用の有利な候補である、非常に有利な治療剤
である。
HV1、HV2及びHV3と命名されたヒルジンのいくつかの
自然変異体が同定された。次いで、これらの自然変異体
及び他の類似体が例えば本出願人名の欧州特許公開EP−
Ａ−200,655号及びEP−Ａ−273,800号明細書で記載され
ているように種々の宿主細胞中で遺伝子工学によって産
生された。大腸菌〔Escherichia coli（E.coli）〕及び
S.セレビシアエ属の酵母で合成されたヒルジンの比較で
は、大腸菌で合成されたヒルジンが細胞内に留まり、こ
のため非常に多数の大腸菌ポリペプチドから精製されね
ばならないことを示した。したがって、成熟形で分泌さ
れるヒルジンを得るように酵母内でヒルジン遺伝子を発
現させ、ヒトに対して発熱原性又は毒性の物質を酵母で
産生させないことが特に有利である。
自然変異体が同定された。次いで、これらの自然変異体
及び他の類似体が例えば本出願人名の欧州特許公開EP−
Ａ−200,655号及びEP−Ａ−273,800号明細書で記載され
ているように種々の宿主細胞中で遺伝子工学によって産
生された。大腸菌〔Escherichia coli（E.coli）〕及び
S.セレビシアエ属の酵母で合成されたヒルジンの比較で
は、大腸菌で合成されたヒルジンが細胞内に留まり、こ
のため非常に多数の大腸菌ポリペプチドから精製されね
ばならないことを示した。したがって、成熟形で分泌さ
れるヒルジンを得るように酵母内でヒルジン遺伝子を発
現させ、ヒトに対して発熱原性又は毒性の物質を酵母で
産生させないことが特に有利である。
このため本発明はすべてのヒルジン分子、即ちヒルジ
ンの自然変異体自体又は１以上の変異を生じたが抗血栓
活性を留めたヒルジンにも関するが、後者のタイプの変
異体はアナログと称される。下記例は既に記載された特
許公開EP−Ａ−273,8000号明細書で記載されているrHV2
Lys47（47位のアミノ酸Aspがアミノ酸Lysに変異した組
換え変異体HV2）と命名されたアナログについて更に詳
細に関する。
ンの自然変異体自体又は１以上の変異を生じたが抗血栓
活性を留めたヒルジンにも関するが、後者のタイプの変
異体はアナログと称される。下記例は既に記載された特
許公開EP−Ａ−273,8000号明細書で記載されているrHV2
Lys47（47位のアミノ酸Aspがアミノ酸Lysに変異した組
換え変異体HV2）と命名されたアナログについて更に詳
細に関する。
本発明はデフェンシン類の産生にも関する。フォルミ
シン類としても知られるデフェンシン類は、グラム陽性
微生物に対して殺菌活性を有するある昆虫双翅類の血リ
ンパから本来抽出されるペプチドである。これらのデフ
ェンシン類は欧州特許出願EP−Ａ−349,451号明細書で
更に詳細に記載されている。デフェンシンＡはその配列
としてAla−Thr−Cys−Asp−Leu−Leu−Ser−Gly−Thr
−Gly−Ile−Asn−His−Ser−Ala−Cys−Ala−Ala−His
−Cys−Leu−Leu−Arg−Gly−Asn−Arg−Gly−Gly−Tyr
−Cys−Asn−Gly−Lys−Gly−Val−Cys−Val−Cys−Arg
−Asnを有する基本ペプチドである。デフェンシンＢは3
2位のアミノ酸のみがデフェンシンＡと異なり、アルギ
ニンがグリシンに代わっている。
シン類としても知られるデフェンシン類は、グラム陽性
微生物に対して殺菌活性を有するある昆虫双翅類の血リ
ンパから本来抽出されるペプチドである。これらのデフ
ェンシン類は欧州特許出願EP−Ａ−349,451号明細書で
更に詳細に記載されている。デフェンシンＡはその配列
としてAla−Thr−Cys−Asp−Leu−Leu−Ser−Gly−Thr
−Gly−Ile−Asn−His−Ser−Ala−Cys−Ala−Ala−His
−Cys−Leu−Leu−Arg−Gly−Asn−Arg−Gly−Gly−Tyr
−Cys−Asn−Gly−Lys−Gly−Val−Cys−Val−Cys−Arg
−Asnを有する基本ペプチドである。デフェンシンＢは3
2位のアミノ酸のみがデフェンシンＡと異なり、アルギ
ニンがグリシンに代わっている。
下記例で本発明の他の特徴及び利点を明らかにでき
る。これらの例は下記図面で説明される。
る。これらの例は下記図面で説明される。
−図１はプラスミドpTG2958の概略構造について示す。
−図２はベクターM13TG3839及びM13TG3841の概略構造に
ついて示す。M13TG3839の場合に端部の斜線枠はM13TG10
3、M13TG3841の場合はM13TG3149に相当する。
ついて示す。M13TG3839の場合に端部の斜線枠はM13TG10
3、M13TG3841の場合はM13TG3149に相当する。
−図３はベクターM13TG3845の概略構造について示す。
斜線枠はM13TG3149に相当する。
斜線枠はM13TG3149に相当する。
−図４はプラスミドpTG3828の概略構造について示す。
−図５はプラスミドpTG3864の概略構造について示す。
例1:ヒルジン発現用ベクターpTG3864、pTG3867、pTG389
4及びpTG3884の組立て A.ベクターM13TG3845の組立て プラスミドpTG2958（図１）は欧州特許公開EP−Ａ−2
52,854号明細書で記載されたプラスミドpTG1833とほと
んど異ならず、rHV2Asp47に関するコード配列を有す
る。プラスミドpTG2958は人工的に導入されるHind III
制限部位を含んでいない。プラスミドpTG2958は以下を
含んでいる： −MFα１遺伝子の５′領域に相当する1217塩基対（プロ
モーター、シグナルペプチドについてコードする配列、
“pro"領域及びペプチドLys−Argについてコードする配
列を含む）及び４塩基対（Bgl II゜部位；クレノウ処
理）の断片 −rHV2Lys47の相補的DNAを含む234塩基対の断片 −酵母のPGKターミネーターを含む243塩基対の断片 −特にこのプラスミドの複製源及びアンピシリン耐性遺
伝子を含むpBR322のPvu II−EcoR I断片（2292塩基対） −Pst I部位に挿入された欠失形として酵母のLEU2遺伝
子を含む酵母（Ｂ形）の２μプラスミドのEcoR I−Hind
III断片 −酵母のURA3遺伝子のHind III−Sma I断片 LEU−2d、２μ及びURA3配列を有するベクターpTG2958
のNco I−Nco I断片を欧州特許公開EP−Ａ−268,501号
明細書で記載されたpTG2800のNco I−Nco I断片で置き
換えるが、これはプロモーターが欠失されたURA3遺伝子
（URA3−ｄ）及び２μプラスミドの配列を有しており、
pTG2877を生じる。
4及びpTG3884の組立て A.ベクターM13TG3845の組立て プラスミドpTG2958（図１）は欧州特許公開EP−Ａ−2
52,854号明細書で記載されたプラスミドpTG1833とほと
んど異ならず、rHV2Asp47に関するコード配列を有す
る。プラスミドpTG2958は人工的に導入されるHind III
制限部位を含んでいない。プラスミドpTG2958は以下を
含んでいる： −MFα１遺伝子の５′領域に相当する1217塩基対（プロ
モーター、シグナルペプチドについてコードする配列、
“pro"領域及びペプチドLys−Argについてコードする配
列を含む）及び４塩基対（Bgl II゜部位；クレノウ処
理）の断片 −rHV2Lys47の相補的DNAを含む234塩基対の断片 −酵母のPGKターミネーターを含む243塩基対の断片 −特にこのプラスミドの複製源及びアンピシリン耐性遺
伝子を含むpBR322のPvu II−EcoR I断片（2292塩基対） −Pst I部位に挿入された欠失形として酵母のLEU2遺伝
子を含む酵母（Ｂ形）の２μプラスミドのEcoR I−Hind
III断片 −酵母のURA3遺伝子のHind III−Sma I断片 LEU−2d、２μ及びURA3配列を有するベクターpTG2958
のNco I−Nco I断片を欧州特許公開EP−Ａ−268,501号
明細書で記載されたpTG2800のNco I−Nco I断片で置き
換えるが、これはプロモーターが欠失されたURA3遺伝子
（URA3−ｄ）及び２μプラスミドの配列を有しており、
pTG2877を生じる。
ベクターM13TG3839（図２）をM13TG103〔Kieny,M.P.,
et al.（1983）Gene,26,91−99〕から誘導し、pTG2877
のHind III−Hind III断片を同部位に導入する。Sal I
制限部位を下記オリゴヌクレオチド:5′CAATGAAAAATGGT
CGACTATCAATCATAGを用いた特定変異誘発によりrHV2Lys4
7についてコードする領域の翻訳終結コドンから下流で
このベクター内に導入し、M13TG3839Sal Iを得る。次い
でSph I制限部位を下記オリゴヌクレオチド:5′GACGGCC
AGTAGAATTGGCATGCTATTGATAAGATTTAAAGを用いた特定変異
誘発により発現カセットから上流で導入すると同時にUR
A3−ｄ配列を除き、M13TG3840を得る。
et al.（1983）Gene,26,91−99〕から誘導し、pTG2877
のHind III−Hind III断片を同部位に導入する。Sal I
制限部位を下記オリゴヌクレオチド:5′CAATGAAAAATGGT
CGACTATCAATCATAGを用いた特定変異誘発によりrHV2Lys4
7についてコードする領域の翻訳終結コドンから下流で
このベクター内に導入し、M13TG3839Sal Iを得る。次い
でSph I制限部位を下記オリゴヌクレオチド:5′GACGGCC
AGTAGAATTGGCATGCTATTGATAAGATTTAAAGを用いた特定変異
誘発により発現カセットから上流で導入すると同時にUR
A3−ｄ配列を除き、M13TG3840を得る。
ベクターM13TG131〔Kieny,M.P.,et al.（1983）Gene,
26,91−99〕をPst Iで開裂させ、末端をDNAポリメラー
ゼＩのクレノウ断片による処理でブラント化し、しかる
後それを自らと再結合させ、M13TG3160を得る。次いで
このベクターをSma I及びEcoR Vで開裂し、しかる後再
結合させ、M13TG3149を得る。
26,91−99〕をPst Iで開裂させ、末端をDNAポリメラー
ゼＩのクレノウ断片による処理でブラント化し、しかる
後それを自らと再結合させ、M13TG3160を得る。次いで
このベクターをSma I及びEcoR Vで開裂し、しかる後再
結合させ、M13TG3149を得る。
rHV2Lys47発現カセット（転写終結配列なし）を有す
るM13TG3840（前記）のSph I−Sph I断片をM13TG3149の
Sph I−Sph I部位に導入し、M13TG3841を得る（図
２）。
るM13TG3840（前記）のSph I−Sph I断片をM13TG3149の
Sph I−Sph I部位に導入し、M13TG3841を得る（図
２）。
MFα１の前駆体の“pro"断片における３〜42位のアミ
ノ酸についてコードする配列を特定変異誘発でM13TG314
9から除去し、Sma I制限部位を下記オリゴヌクレオチ
ド:5′CTCCGCATTAGCTGCTCCCGGGTTATTGTTTATAAATを用い
て導入し、欠失“pro"配列と以下称されるものを得る。
M13TG3842をこれにより得る。α因子の前駆体のATGを破
壊するBamH I制限部位を下記オリゴヌクレオチド:5′AA
TATAAACGATTAAAAGGATCCGATTTCCTTCAATTTTTAでの特定変
異誘発によりこのベクター内に導入する。これでM13TG3
843を得る。リン酸化後、下記オリゴヌクレオチド： BamH I及びSma Iで切断されたベクターM13TG3843内に挿
入し、それによってATGのない配列XIを導入する。ATGを
復元するため、BamH I部位を下記オリゴヌクレオチド:
5′AATATAAACGATTAAAAGAATGCGTTTCTCTACTACAGTCを用い
た特定変異誘発により除去し、以下を含むベクターM13T
G3845（図３）を得る： −断片ａ）としてMFα１遺伝子のプロモーター、次いで
ATGコドン −断片ｂ）として配列XI −断片ｂ′）としてMFα１遺伝子の欠失“pro"配列、次
いでLys−Argについてコードするコドン −断片ｃ）としてrHV2Lys47についてコードする配列 −ベクターM13TG3149の一部 B.プラスミドpTG3864の組立て 欧州特許公開EP−Ａ−252,854号明細書で記載された
プラスミドpTG848をBgl IIで切断し、しかる後再結合さ
せ、pTG2886を得る。pTG2886の大Hind III−EcoR I断片
をT4リガーゼの存在下でS.セレビシアエの２μプラスミ
ドの配列を有するプラスミドpFL1〔Parent,S.A.et al.
（1985）Yeast,1,83−138〕の2.1kb Hind III−EcoR I
断片に結合させ、プラスミドpTG2886LEU2−ｄ、URA3−
ｄを得る。次いで欧州特許公開EP−Ａ−258,501号明細
書で記載されたURA3−ｄ遺伝子を有するプラスミドpTG2
800の0.9kb Hind III断片をこのプラスミドのHind III
部位に挿入し、pTG2886URA3−ｄ、デルタLEU2−ｄを得
る。次いでいくつかの制限部位を有するM13TG131〔Kien
y,M.P.,et al.（1983）Gene,26,91−99〕のSma I−Bgl
II断片をこのプラスミドに導入し、以下を有するpTG382
8（図４）を得る： −プロモーターが欠失したURA3遺伝子の配列（URA3−
ｄ） −本ケースにおいて異種タンパク質rHV2Lys47の発現用
要素を挿入しうるM13TG131由来の制限部位 −酵母のPGK遺伝子の転写ターミネーター −大腸菌内で複製及び選択しうるpBR322の断片 −酵母内での複製及び***エネルギー等分配に必要な構
造要素を有する２μプラスミドの断片 ベクターM13TG3845（図３）のSph I−Sal I断片をSph
I及びSal Iで消化されたプラスミドpTG3828に導入し、
発現ベクターpTG3864を得る（図５）。
ノ酸についてコードする配列を特定変異誘発でM13TG314
9から除去し、Sma I制限部位を下記オリゴヌクレオチ
ド:5′CTCCGCATTAGCTGCTCCCGGGTTATTGTTTATAAATを用い
て導入し、欠失“pro"配列と以下称されるものを得る。
M13TG3842をこれにより得る。α因子の前駆体のATGを破
壊するBamH I制限部位を下記オリゴヌクレオチド:5′AA
TATAAACGATTAAAAGGATCCGATTTCCTTCAATTTTTAでの特定変
異誘発によりこのベクター内に導入する。これでM13TG3
843を得る。リン酸化後、下記オリゴヌクレオチド： BamH I及びSma Iで切断されたベクターM13TG3843内に挿
入し、それによってATGのない配列XIを導入する。ATGを
復元するため、BamH I部位を下記オリゴヌクレオチド:
5′AATATAAACGATTAAAAGAATGCGTTTCTCTACTACAGTCを用い
た特定変異誘発により除去し、以下を含むベクターM13T
G3845（図３）を得る： −断片ａ）としてMFα１遺伝子のプロモーター、次いで
ATGコドン −断片ｂ）として配列XI −断片ｂ′）としてMFα１遺伝子の欠失“pro"配列、次
いでLys−Argについてコードするコドン −断片ｃ）としてrHV2Lys47についてコードする配列 −ベクターM13TG3149の一部 B.プラスミドpTG3864の組立て 欧州特許公開EP−Ａ−252,854号明細書で記載された
プラスミドpTG848をBgl IIで切断し、しかる後再結合さ
せ、pTG2886を得る。pTG2886の大Hind III−EcoR I断片
をT4リガーゼの存在下でS.セレビシアエの２μプラスミ
ドの配列を有するプラスミドpFL1〔Parent,S.A.et al.
（1985）Yeast,1,83−138〕の2.1kb Hind III−EcoR I
断片に結合させ、プラスミドpTG2886LEU2−ｄ、URA3−
ｄを得る。次いで欧州特許公開EP−Ａ−258,501号明細
書で記載されたURA3−ｄ遺伝子を有するプラスミドpTG2
800の0.9kb Hind III断片をこのプラスミドのHind III
部位に挿入し、pTG2886URA3−ｄ、デルタLEU2−ｄを得
る。次いでいくつかの制限部位を有するM13TG131〔Kien
y,M.P.,et al.（1983）Gene,26,91−99〕のSma I−Bgl
II断片をこのプラスミドに導入し、以下を有するpTG382
8（図４）を得る： −プロモーターが欠失したURA3遺伝子の配列（URA3−
ｄ） −本ケースにおいて異種タンパク質rHV2Lys47の発現用
要素を挿入しうるM13TG131由来の制限部位 −酵母のPGK遺伝子の転写ターミネーター −大腸菌内で複製及び選択しうるpBR322の断片 −酵母内での複製及び***エネルギー等分配に必要な構
造要素を有する２μプラスミドの断片 ベクターM13TG3845（図３）のSph I−Sal I断片をSph
I及びSal Iで消化されたプラスミドpTG3828に導入し、
発現ベクターpTG3864を得る（図５）。
C.発現ベクターpTG3867の組立て MFα１遺伝子の前駆体についてコードする配列を完全
に除去するため、下記オリゴヌクレオチド:5′GCCTCCCA
AGTTTCAGCTATTACGTATACAGACTGCを用いた特定変異誘発を
M13TG3845（図３）で行い、ベクターM13TG3846を得る。
このベクターのSph I−Sal I断片をSph I及びSal Iで消
化されたプラスミドpTG3828（図４）に導入して、発現
ベクターpTG3867を得る。このベクターでは、配列XI及
びrHV2Lys47についてコードする配列が隣接している。
このプラスミドの概略構造を得るためには、図５におい
てMFα１の欠失“pro"配列を除去するだけでよい。
に除去するため、下記オリゴヌクレオチド:5′GCCTCCCA
AGTTTCAGCTATTACGTATACAGACTGCを用いた特定変異誘発を
M13TG3845（図３）で行い、ベクターM13TG3846を得る。
このベクターのSph I−Sal I断片をSph I及びSal Iで消
化されたプラスミドpTG3828（図４）に導入して、発現
ベクターpTG3867を得る。このベクターでは、配列XI及
びrHV2Lys47についてコードする配列が隣接している。
このプラスミドの概略構造を得るためには、図５におい
てMFα１の欠失“pro"配列を除去するだけでよい。
D.発現ベクターpTG3894の組立て Sma I部位を、下記オリゴヌクレオチド:5′TCCGCATTA
GCTGCTCCCGGGAACACTACAACAGAAによるM13TG3841（図２）
での特定変異誘発でα因子の前駆体の“pro"断片につい
てコードする配列内に作成し、M13TG3869を得る。次い
でこのベクターをSph I及びSma Iで消化し、小断片を単
離し、M13TG3845（図３）の大Sph I−Sma I断片に結合
させ、ベクターM13TG3891を得る。このベクターのSph I
−Sal I断片をSph I及びSal I部位で開かれたプラスミ
ドpTG3828（図４）に導入して、α因子の前駆体の変異
“pro"配列を含んだ発現ベクターpTG3894を得る。この
プラスミドの概略構造を得るためには、図５においてMF
α１の欠失“pro"配列を変異“pro"配列に代えるだけで
よい。
GCTGCTCCCGGGAACACTACAACAGAAによるM13TG3841（図２）
での特定変異誘発でα因子の前駆体の“pro"断片につい
てコードする配列内に作成し、M13TG3869を得る。次い
でこのベクターをSph I及びSma Iで消化し、小断片を単
離し、M13TG3845（図３）の大Sph I−Sma I断片に結合
させ、ベクターM13TG3891を得る。このベクターのSph I
−Sal I断片をSph I及びSal I部位で開かれたプラスミ
ドpTG3828（図４）に導入して、α因子の前駆体の変異
“pro"配列を含んだ発現ベクターpTG3894を得る。この
プラスミドの概略構造を得るためには、図５においてMF
α１の欠失“pro"配列を変異“pro"配列に代えるだけで
よい。
E.発現ベクターpTG3884の組立て 配列XIを下記オリゴヌクレオチド:5′GTTTCTCTACTACA
CTCGCTACTGCを用いたM13TG3845での特定変異誘発により
修正する。単一塩基の修正で配列XIIを得、シグナルペ
プチドのアミノ酸R4としてバリンからロイシンへの置換
えを誘導する。それによりバクテリオファージM13TG384
6を得る。M13TG3846のSph I−Sal I断片をSph I及びSal
I部位で開かれたプラスミドpTG3828（図４）に導入し
て、以下を含む発現ベクターpTG3884を得る： −プロモーターが欠失したURA3遺伝子の配列（URA3−
ｄ） −断片ａ）としてMFα１のプロモーター、次いでATGコ
ドン −断片ｂ）として配列XII −断片ｂ′）としてMFα１遺伝子の欠失“pro"配列、次
いでLys−Argについてコードするコドン −断片ｃ）としてrHV2Lys47についてコードする配列 −酵母のPGKについてコードする遺伝子のターミネータ
ー −pBR322の断片 −２μプラスミドの断片 例2:用いられるプラスミドに関する培養上澄でのrHV2Ly
s47の産生 遺伝子型MATα、ura3−251、−373、−328、leu2−
３、−112、his3、pep4−３のサッカロミセス・セレビ
シアエ種の酵母株を酢酸リチウム法〔Ito,H.et al.,J.B
acteriol.（1983）153:163〕によりプラスミドpTG386
4、pTG3867、pTG3894及びpTG3884で形質転換させ、Ura+
原栄養体を選択する。次いでそれらをエルレンマイヤー
中の選択培地（酵母窒素ベース0.7％、カサミノ酸0.5％
及びグルコース１％）上30℃で培養する。48時間の培養
後、細胞及び上澄を遠心で分離し、トロンビン阻害活性
を比色試験〔ベーリンガー・マンハイム（Boehringer M
annheim）の合成基質クロモザイムTHでのタンパク質分
解活性〕により上澄で調べる。表１はアッセイの結果に
ついて示すが、各値は２回の独立実験の平均値に相当す
る。rHV2Lys47活性はATU/ml上澄で示されている。
CTCGCTACTGCを用いたM13TG3845での特定変異誘発により
修正する。単一塩基の修正で配列XIIを得、シグナルペ
プチドのアミノ酸R4としてバリンからロイシンへの置換
えを誘導する。それによりバクテリオファージM13TG384
6を得る。M13TG3846のSph I−Sal I断片をSph I及びSal
I部位で開かれたプラスミドpTG3828（図４）に導入し
て、以下を含む発現ベクターpTG3884を得る： −プロモーターが欠失したURA3遺伝子の配列（URA3−
ｄ） −断片ａ）としてMFα１のプロモーター、次いでATGコ
ドン −断片ｂ）として配列XII −断片ｂ′）としてMFα１遺伝子の欠失“pro"配列、次
いでLys−Argについてコードするコドン −断片ｃ）としてrHV2Lys47についてコードする配列 −酵母のPGKについてコードする遺伝子のターミネータ
ー −pBR322の断片 −２μプラスミドの断片 例2:用いられるプラスミドに関する培養上澄でのrHV2Ly
s47の産生 遺伝子型MATα、ura3−251、−373、−328、leu2−
３、−112、his3、pep4−３のサッカロミセス・セレビ
シアエ種の酵母株を酢酸リチウム法〔Ito,H.et al.,J.B
acteriol.（1983）153:163〕によりプラスミドpTG386
4、pTG3867、pTG3894及びpTG3884で形質転換させ、Ura+
原栄養体を選択する。次いでそれらをエルレンマイヤー
中の選択培地（酵母窒素ベース0.7％、カサミノ酸0.5％
及びグルコース１％）上30℃で培養する。48時間の培養
後、細胞及び上澄を遠心で分離し、トロンビン阻害活性
を比色試験〔ベーリンガー・マンハイム（Boehringer M
annheim）の合成基質クロモザイムTHでのタンパク質分
解活性〕により上澄で調べる。表１はアッセイの結果に
ついて示すが、各値は２回の独立実験の平均値に相当す
る。rHV2Lys47活性はATU/ml上澄で示されている。
表１ プラスミド ATU/ml pTG3894 40 pTG3864 50 pTG3867 130 pTG3884 125 すべてのケースにおいて、抗トロンビン活性が検出さ
れる。このため酵母から産生されるrHV2Lys47タンパク
質は上澄中に放出されている。更に、それは活性形で分
泌される。最良の結果はpTG3884及びpTG3867で形質転換
された株で得られる。
れる。このため酵母から産生されるrHV2Lys47タンパク
質は上澄中に放出されている。更に、それは活性形で分
泌される。最良の結果はpTG3884及びpTG3867で形質転換
された株で得られる。
上澄のタンパク質含量はHPLCで分析する。得られる主
ピークはrHV2Lys47（その65アミノ酸形として）の場合
にぴったりと一致し、Ｎ末端配列の決定で正確に合成さ
れた分子の産生を確認しうる。
ピークはrHV2Lys47（その65アミノ酸形として）の場合
にぴったりと一致し、Ｎ末端配列の決定で正確に合成さ
れた分子の産生を確認しうる。
例3:昆虫デフェンシンＡ発現用ベクターpTG4826の組立
て A.昆虫デフェンシンＡについてコードするDNA配列の合
成 合成はKpn I付着端により組立てられた２つのブロッ
クで行う。第一ブロックは１〜３と番号付けられた３つ
のオリゴヌクレオチドからなり、第二ブロックは４〜９
と番号付けられた６つのオリゴヌクレオチドからなる。
それらオリゴヌクレオチドの配列及び位置（表の最後の
ライン；円はオリゴヌクレオチドの５′部分を表す）は
表２で示されている。
て A.昆虫デフェンシンＡについてコードするDNA配列の合
成 合成はKpn I付着端により組立てられた２つのブロッ
クで行う。第一ブロックは１〜３と番号付けられた３つ
のオリゴヌクレオチドからなり、第二ブロックは４〜９
と番号付けられた６つのオリゴヌクレオチドからなる。
それらオリゴヌクレオチドの配列及び位置（表の最後の
ライン；円はオリゴヌクレオチドの５′部分を表す）は
表２で示されている。
得られた配列は下記のとおりである： 第一ブロックの合成ではオリゴヌクレオチド４、５、
６、７、８及び９を用い、下記方法で行う： −オリゴヌクレオチド５、６、７及び８を最初それらの
５′末端でリン酸化して、組立て時のポリマー形成を回
避する。これらオリゴヌクレオチドの各々につき100pmo
lを32P標識ATPγ3.3pmol（5000Ci/mmol）を含有したpH
7.5の60μＭトリスHCl、10μM MgCl2及び８μＭジチオ
スレイトール（リン酸緩衝液）の最終容量20μ中ポリ
ヌクレオチドキナーゼ２単位で処理する。37℃で15分間
のインキュベート後、未標識ATP5μmolを加える。
６、７、８及び９を用い、下記方法で行う： −オリゴヌクレオチド５、６、７及び８を最初それらの
５′末端でリン酸化して、組立て時のポリマー形成を回
避する。これらオリゴヌクレオチドの各々につき100pmo
lを32P標識ATPγ3.3pmol（5000Ci/mmol）を含有したpH
7.5の60μＭトリスHCl、10μM MgCl2及び８μＭジチオ
スレイトール（リン酸緩衝液）の最終容量20μ中ポリ
ヌクレオチドキナーゼ２単位で処理する。37℃で15分間
のインキュベート後、未標識ATP5μmolを加える。
−37℃で30分間のインキュベート後、75pmolのオリゴヌ
クレオチド５、６、７及び８を混合し、95℃で３分間加
熱し、しかる後オリゴヌクレオチド４及び９を最終容量
90μmolの前記リン酸緩衝液に加える。混合液を95℃で
３分間加熱し、しかる後２時間かけて37℃まで徐々に冷
却させる。
クレオチド５、６、７及び８を混合し、95℃で３分間加
熱し、しかる後オリゴヌクレオチド４及び９を最終容量
90μmolの前記リン酸緩衝液に加える。混合液を95℃で
３分間加熱し、しかる後２時間かけて37℃まで徐々に冷
却させる。
−これらのハイブリッド形成オリゴヌクレオチド25pmol
を15℃で１時間T4リガーゼ処理に付す。次いでこの反応
混合液（1pmol）をEcoR I及びKpn Iで処理（15℃で１時
間）されたバクテリオファージM13TG131〔Kieny,M.P.et
al.（1983）Gene,26,91−99〕50ngに加える。結合混合
物を大腸菌株JM103〔Messing,J.et al.（1981）Nucleic
Acid Res.,9,309〕のコンピテント細胞を形質転換させ
るために用いる。望ましい配列を有するクローンを単離
するが、これはM13TG3821と称される。
を15℃で１時間T4リガーゼ処理に付す。次いでこの反応
混合液（1pmol）をEcoR I及びKpn Iで処理（15℃で１時
間）されたバクテリオファージM13TG131〔Kieny,M.P.et
al.（1983）Gene,26,91−99〕50ngに加える。結合混合
物を大腸菌株JM103〔Messing,J.et al.（1981）Nucleic
Acid Res.,9,309〕のコンピテント細胞を形質転換させ
るために用いる。望ましい配列を有するクローンを単離
するが、これはM13TG3821と称される。
第二ブロックの合成ではオリゴヌクレオチド１、２及
び３を用い、第一ブロックの合成に関して記載された場
合と同様の操作に従い行う。このケースにおいては、オ
リゴヌクレオチド２のみをその５′末端でリン酸化させ
る。
び３を用い、第一ブロックの合成に関して記載された場
合と同様の操作に従い行う。このケースにおいては、オ
リゴヌクレオチド２のみをその５′末端でリン酸化させ
る。
この第二ブロックをバクテリオファージM13TG3821のH
ind IIIとKpn Iとの間の部位に組込んでクローニング
し、デフェンシンＡについてコードするDNA配列（図
５）を有するクローンを単離するが、これはM13TG3849
と称される。
ind IIIとKpn Iとの間の部位に組込んでクローニング
し、デフェンシンＡについてコードするDNA配列（図
５）を有するクローンを単離するが、これはM13TG3849
と称される。
B.デフェンシンＡ発現用プラスミドpTG4839の組立て 前記バクテリオファージM13TG3846（例１のＥ）の104
5塩基対のSph I−Sma I断片を既にSph I及びSma Iで消
化された前記ベクターM13TG3869（例１のＤ）に移す。
以下を有するベクターM13TG4803: −MFα１遺伝子のプロモーター、次いでATGコドン −配列XII −XFα１遺伝子の変異“pro"配列、次いでLys−Argにつ
いてコードするコドン −rHV2Lys47についてコードする配列 をそれによって得る。
5塩基対のSph I−Sma I断片を既にSph I及びSma Iで消
化された前記ベクターM13TG3869（例１のＤ）に移す。
以下を有するベクターM13TG4803: −MFα１遺伝子のプロモーター、次いでATGコドン −配列XII −XFα１遺伝子の変異“pro"配列、次いでLys−Argにつ
いてコードするコドン −rHV2Lys47についてコードする配列 をそれによって得る。
−rHV2Lys47についてコードする配列を昆虫デフェンシ
ンＡについてコードする配列で置換えるため、Hind III
部位を下記配列のオリゴヌクレオチド:5′GAAGGGGTAAGC
TTGGATAAAを用いてMFα１の変異“pro"についてコード
する配列中に導入する。次いでデフェンシンＡについて
コードする合成配列を有する前記M13TG3849のHind III
−BamH I断片を既にHind III及びBamH Iで処理されたこ
のベクター中に導入して、rHV2Lys47についてコードす
る配列を除去する。
ンＡについてコードする配列で置換えるため、Hind III
部位を下記配列のオリゴヌクレオチド:5′GAAGGGGTAAGC
TTGGATAAAを用いてMFα１の変異“pro"についてコード
する配列中に導入する。次いでデフェンシンＡについて
コードする合成配列を有する前記M13TG3849のHind III
−BamH I断片を既にHind III及びBamH Iで処理されたこ
のベクター中に導入して、rHV2Lys47についてコードす
る配列を除去する。
M13TG4813のSph I−Sal I断片をSph I及びSal I部位
で開かれたプラスミドpTG3828（図４）中に導入して、
以下を含む発現ベクターpTG4839を得る： −プロモーターが欠失したURA3遺伝子の配列（URA3−
ｄ） −MFα１遺伝子のプロモーター、次いでATG −配列XII −MFα１遺伝子の変異“pro"配列、次いでLys−Argにつ
いてコードするコドン −昆虫デフェンシンＡについてコードする合成配列 −酵母のPGKについてコードする遺伝子のターミネータ
ー −pBR322の断片 −２μプラスミドの断片 例4:培養上澄におけるデフェンシンＡの産生 遺伝子型MATα、ura3−251、−373、−328、leu2−
３、−112、his3、pep4−３のサッカロミセス・セレビ
シアエ種の酵母株を酢酸リチウム法〔Ito,H.et al.,J.B
acteriol.（1983）153:163〕によりプラスミドpTG4839
で形質転換させ、Ura+原栄養体を選択する。次いでそれ
らをエルレンマイヤー中の選択培地（酵母窒素ベース0.
7％、カサミノ酸0.5％及びグルコース１％）上30℃で培
養する。48時間の培養後、細胞及び上澄を遠心で分離
し、上澄を22μフィルターで濾過し、しかる後セプ・パ
ク（Sep−Pak）C18カートリッジに通す。結合物質を水
中60％アセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸で溶出
し、真空下で乾燥させる。次いで、デフェンシンＡ抗菌
活性をLambert et al.（1989）PNAS,86:262−266で記載
された操作に従い細菌微生物〔ミクロコッカス・ルテウ
ス（Micrococcus luteus）〕で播種された寒天又はアガ
ロース上でプレーティング（plating）試験により調べ
る。
で開かれたプラスミドpTG3828（図４）中に導入して、
以下を含む発現ベクターpTG4839を得る： −プロモーターが欠失したURA3遺伝子の配列（URA3−
ｄ） −MFα１遺伝子のプロモーター、次いでATG −配列XII −MFα１遺伝子の変異“pro"配列、次いでLys−Argにつ
いてコードするコドン −昆虫デフェンシンＡについてコードする合成配列 −酵母のPGKについてコードする遺伝子のターミネータ
ー −pBR322の断片 −２μプラスミドの断片 例4:培養上澄におけるデフェンシンＡの産生 遺伝子型MATα、ura3−251、−373、−328、leu2−
３、−112、his3、pep4−３のサッカロミセス・セレビ
シアエ種の酵母株を酢酸リチウム法〔Ito,H.et al.,J.B
acteriol.（1983）153:163〕によりプラスミドpTG4839
で形質転換させ、Ura+原栄養体を選択する。次いでそれ
らをエルレンマイヤー中の選択培地（酵母窒素ベース0.
7％、カサミノ酸0.5％及びグルコース１％）上30℃で培
養する。48時間の培養後、細胞及び上澄を遠心で分離
し、上澄を22μフィルターで濾過し、しかる後セプ・パ
ク（Sep−Pak）C18カートリッジに通す。結合物質を水
中60％アセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸で溶出
し、真空下で乾燥させる。次いで、デフェンシンＡ抗菌
活性をLambert et al.（1989）PNAS,86:262−266で記載
された操作に従い細菌微生物〔ミクロコッカス・ルテウ
ス（Micrococcus luteus）〕で播種された寒天又はアガ
ロース上でプレーティング（plating）試験により調べ
る。
プラスミドpTG4839で形質転換された酵母の上澄にお
いて、抗菌活性が実際に検出される。このためその酵母
から産生されたデフェンシンＡタンパク質は上澄中に排
出されている。更に、それは活性形で分泌される。
いて、抗菌活性が実際に検出される。このためその酵母
から産生されたデフェンシンＡタンパク質は上澄中に排
出されている。更に、それは活性形で分泌される。
上澄のタンパク質含量はHPLCで分析する。得られた主
ピークは昆虫デフェンシンＡの場合にぴったりと一致
し、タンパク質配列の決定で正確に合成された分子の産
生を確認しうる。
ピークは昆虫デフェンシンＡの場合にぴったりと一致
し、タンパク質配列の決定で正確に合成された分子の産
生を確認しうる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 レシャール，ジャン―マルク フランス国ストラストブール、リュ、ド ゥ ロッテルダム、34 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ (54)【発明の名称】 組換え酵母による成熟タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドについてコードする配列とし て新規ＤＮＡ断片の適用、発現カセット、形質転換酵母及びそれに対応するタンパク質の製造方 法
Claims (25)
- 【請求項１】下記アミノ酸配列（III）： 〔上記式中R1はArg及びLysから選択されるアミノ酸であ
る;R2及びR6は各々独立してAla、Asn、Cys、Gln、Gly、
His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及
びValから選択されるアミノ酸である;R3及びR5は各々独
立してAsp、Gly、Asn、Pro及びSerから選択されるアミ
ノ酸である;R4はVal、Leu、Ala、Cys、Phe、Ile及びMet
から選択されるアミノ酸である〕 を含むペプチドについてコードする単離されたDNA断
片。 - 【請求項２】下記アミノ酸配列（IV）： 〔上記式中R1はArg及びLysから選択されるアミノ酸であ
る;R2及びR6は各々独立してAla、Asn、Cys、Gln、Gly、
His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及
びValから選択されるアミノ酸である;R3及びR5は各々独
立してAsp、Gly、Asn、Pro及びSerから選択されるアミ
ノ酸である;R4はVal、Leu、Ala、Cys、Phe、Ile及びMet
から選択されるアミノ酸である;R7はタンパク質分解配
列R8−R9−R10（上記式中R8はAla、Val、Ser、Cys、Gl
y、Ile、Leu及びThrから選択されるアミノ酸である;R9
はAla、Arg、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ph
e、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及びValから選択されるア
ミノ酸である;R10はAla、Cys、Gly、Leu、Pro、Gln、Se
r及びThrから選択されるアミノ酸である）である〕 を含むペプチドについてコードする単離されたDNA断
片。 - 【請求項３】R8がAla及びValから選択されるアミノ酸で
あり、R10がAlaである、請求項２に記載のDNA断片。 - 【請求項４】下記アミノ酸配列（Ｖ）及び（VI）： から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドについてコ
ードする単離されたDNA断片。 - 【請求項５】下記式（VII）及び（VIII）のアミノ酸配
列： 〔式中R7はタンパク質分解配列R8−R9−R10（上記式中R
8はAla、Val、Ser、Cys、Gly、Ile、Leu及びThrから選
択されるアミノ酸である;R9はAla、Arg、Cys、Gln、Gl
y、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Ty
r及びValから選択されるアミノ酸である;R10はAla、Cy
s、Gly、Leu、Pro、Gln、Ser及びThrから選択されるア
ミノ酸である）である〕；及び 〔式中R7はタンパク質分解配列R8−R9−R10（上記式中R
8はAla、Val、Ser、Cys、Gly、Ile、Leu及びThrから選
択されるアミノ酸である;R9はAla、Arg、Cys、Gln、Gl
y、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Ty
r及びValから選択されるアミノ酸である;R10はAla、Cy
s、Gly、Leu、Pro、Gln、Ser及びThrから選択されるア
ミノ酸である）である〕； から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドについてコ
ードする、請求項２又は３に記載のDNA断片。 - 【請求項６】R7がVal−Ser−Alaである式（VII）及び
（VIII）のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を
含むペプチドについてコードする、請求項５に記載のDN
A断片。 - 【請求項７】異種タンパク質が合成される細胞での異種
タンパク質の分泌に関して、請求項１〜６のいずれか一
項で記載のDNA断片を使用する方法。 - 【請求項８】DNA断片が、異種タンパク質が合成される
酵母細胞での異種タンパク質の分泌に関して有用なシグ
ナルペプチドについてコードする、請求項７に記載のDN
A断片を使用する方法。 - 【請求項９】少なくとも： ａ）転写及び翻訳開始シグナルを含むDNA断片； ｂ）請求項１〜６のいずれか一項で記載されたDNA断
片；及び ｃ）成熟異種タンパク質についてコードするDNA断片； を含んだ異種タンパク質の発現用カセット。 - 【請求項１０】“pro"ペプチド断片についてコードする
DNA断片ｂ′）を更に含む、請求項９に記載のカセッ
ト。 - 【請求項１１】配列としてAla−Pro−Gly−Leu−Leu−P
he−Ile−Asn−Thr−Thr−Ile−Ala−Ser−Ile−Ala−A
la−Lys−Glu−Glu−Gly−Val−Ser−Leu−Asp−Lys−A
rgを有する“pro"ペプチド断片についてコードするDNA
断片ｂ′）を含む、請求項10に記載のカセット。 - 【請求項１２】断片ａ）が酵母細胞で機能性のプロモー
ター及びATG翻訳開始コドンを含む、請求項９〜11のい
ずれか一項に記載のカセット。 - 【請求項１３】DNA断片ｃ）がヒルジンについてコード
する、請求項９〜12のいずれか一項に記載の発現カセッ
ト。 - 【請求項１４】DNA断片ｃ）がヒルジン変異体rHV2Lys47
についてコードする、請求項13に記載の発現カセット。 - 【請求項１５】DNA断片ｃ）が昆虫デフェンシンについ
てコードする、請求項９〜12のいずれか一項に記載の発
現カセット。 - 【請求項１６】DNA断片ｃ）がデフェンシンＡについて
コードする、請求項15に記載の発現カセット。 - 【請求項１７】請求項９〜16のいずれかで記載された発
現カセットを含むプラスミドベクター。 - 【請求項１８】酵母の２μプラスミドの断片を含む、請
求項17に記載のプラスミドベクター。 - 【請求項１９】選択遺伝子としてプロモーターが欠失さ
れたURA3遺伝子を含む、請求項17又は18に記載のプラス
ミドベクター。 - 【請求項２０】請求項17〜19のいずれか一項に記載のプ
ラスミドベクターで形質転換された又は請求項９〜16の
いずれか一項に記載の発現カセットをゲノム中に組み込
んだ細胞。 - 【請求項２１】請求項20に記載の酵母細胞。
- 【請求項２２】請求項20又は21で記載された細胞が培養
され、タンパク質が培地から回収される、異種タンパク
質の製造方法。 - 【請求項２３】細胞が酵母細胞である、請求項22に記載
の方法。 - 【請求項２４】タンパク質がヒルジンである、請求項22
又は23に記載の方法。 - 【請求項２５】タンパク質が昆虫デフェンシンである、
請求項22又は23に記載の方法。
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